特開 2024-178850 化合物、酵素活性測定用試薬、酵素活性測定用キット、及び酵素活性測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024178850

(43)【公開日】2024-12-25

(54)【発明の名称】化合物、酵素活性測定用試薬、酵素活性測定用キット、及び酵素活性測定方法

(51)【国際特許分類】

   C07C 229/36 20060101AFI20241218BHJP

   C07D 215/233 20060101ALI20241218BHJP

   A61K 31/47 20060101ALI20241218BHJP

   A61K 31/136 20060101ALI20241218BHJP

   A61K 31/196 20060101ALI20241218BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20241218BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241218BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20241218BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241218BHJP

   C12Q 1/26 20060101ALI20241218BHJP

【ＦＩ】

C07C229/36

C07D215/233 CSP

A61K31/47

A61K31/136

A61K31/196

A61P25/18

A61P25/00

A61P21/00

A61P35/00

C12Q1/26

【審査請求】未請求

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023097318

(22)【出願日】2023-06-13

(71)【出願人】

【識別番号】599055382

【氏名又は名称】学校法人東邦大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】坂本 達弥

(72)【発明者】

【氏名】福島 健

(72)【発明者】

【氏名】小野里 磨優

【テーマコード（参考）】

4B063

4C086

4C206

4H006

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ23

4B063QR41

4B063QS28

4B063QX02

4C086AA02

4C086AA03

4C086BC28

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA18

4C086ZA22

4C086ZB26

4C206AA02

4C206AA03

4C206FA31

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZA02

4C206ZA18

4C206ZA22

4C206ZB26

4H006AA01

4H006AA03

4H006AB80

4H006AB81

4H006AC22

4H006AC80

4H006BR10

4H006BS10

4H006BU30

4H006BU46

(57)【要約】      （修正有）

【課題】本発明の目的は、アミノ酸酸化酵素の酵素活性を良好に評価することができる新規化合物、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用試薬、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用キット、及びアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定方法を提供することである。
【解決手段】本実施形態は、式（１）で表される化合物又はその塩若しくは溶媒和物である。

（Ｒ_１～Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（１）で表される化合物又はその塩若しくは溶媒和物：

【化1】

（式（１）において、Ｒ_１～Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）。

【請求項2】

下記式（１－Ｄ）及び（１－Ｌ）のいずれかで表される、請求項１に記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物：

【化2】

（式（１－Ｄ）及び（１－Ｌ）において、Ｒ_１～Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）。

【請求項3】

下記式のいずれかで表される、請求項１に記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物：

【化3】

【請求項4】

請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物を含む、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用試薬。

【請求項5】

請求項４に記載のアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用試薬を少なくとも含む、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用キット。

【請求項6】

請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物を用いてアミノ酸酸化酵素の酵素活性を測定することを含む、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定方法。

【請求項7】

アミノ酸酸化酵素のスクリーニングにおいて用いられる、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

アミノ酸酸化酵素の酵素活性阻害剤のスクリーニングにおいて用いられる、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

下記式（２）で表される化合物又はその塩若しくは溶媒和物：

【化4】

（式（２）において、Ｒ_１～Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）。

【請求項10】

下記式のいずれかで表される、請求項９に記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物：

【化5】

【請求項11】

請求項９又は１０に記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物の蛍光を検出することを含む、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定方法。

【請求項12】

アミノ酸酸化酵素のスクリーニングにおいて用いられる、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

アミノ酸酸化酵素の酵素活性阻害剤のスクリーニングにおいて用いられる、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アミノ酸酸化酵素の酵素活性の測定に好適な化合物、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用試薬、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用キット、及びアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｄ－アミノ酸酸化酵素（以下、「ＤＡＯ」と称することがある。）及びＬ－アミノ酸酸化酵素（以下、「ＬＡＯ」と称することがある。）は共に重要な酵素である。ＤＡＯは、統合失調症や筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などとの関連が示唆され、ＤＡＯ阻害剤がそれらの治療薬として開発されている。ＬＡＯは、ヘビ毒ＬＡＯが、がん細胞選択的に細胞死を引き起こすことから、ＬＡＯを用いた新たな抗がん療法が研究されている。そのため、ＤＡＯ及びＬＡＯの活性研究や酵素活性阻害剤の探索に用いることができるプローブ分子が強く求められている。

【0003】

従来、これらの酵素活性の測定には、２段階反応による方法が用いられてきた。１段階目の反応として、Ｄ－アミノ酸又はＬ－アミノ酸を前記酵素により反応させる。２段階目の反応は、１段階目の反応で生じた過酸化水素を、ペルオキシダーゼ及び発色又は発蛍光基質と反応させる。これにより生じた発色又は蛍光を用いてＤＡＯやＬＡＯの酵素活性を測定することができる。

【0004】

しかしながら、この方法は煩雑であり、また、ペルオキシダーゼを用いる酵素反応を伴うために、ペルオキシダーゼの活性を阻害する物質やペルオキシダーゼにより分解してしまう化合物の場合には、ＬＡＯやＤＡＯに対する阻害活性を評価することができず、新たな酵素活性阻害剤のスクリーニングができないという問題がある。また、ペルオキシダーゼは細胞内に移行しないため、細胞内での酵素活性イメージング研究への展開ができないという問題もある。

【0005】

一方、非特許文献１では、キヌレニン（以下、「ＫＹＮ」と称することがある。）を用いることで、ＬＡＯやＤＡＯとの反応により蛍光物質であるキヌレン酸が生成することが報告されている。前記報告によれば、１段階の酵素反応でＬＡＯやＤＡＯの酵素活性を測定し得る。

【0006】

しかしながら、前記キヌレン酸は弱蛍光であるために、亜鉛イオンを添加し、強蛍光の錯体形成反応が必要である。また、亜鉛イオンを添加し、錯体を形成させ、強蛍光とすることはできるものの、細胞内の亜鉛は蛍光錯体の形成に十分な濃度ではなく、２段階反応の場合と同様に、細胞内での酵素活性イメージング研究への展開への障害がある。

【0007】

そこで、酵素反応後に十分な蛍光を発することができ、複雑な２段階反応を用いることなく、１段階反応でＬＡＯ又はＤＡＯの酵素活性を評価することができるプローブ分子の開発が求められ、特許文献１では、そのようなプローブ分子として、所定の構造式（１）及び（２）のいずれかで表されることを特徴とする化合物（ＭｅＳ－Ｄ－ＫＹＮ又はＭｅＳ－Ｌ－ＫＹＮ）が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２０２３－２２６６２号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｓｏｎｇ Ｙ，Ｏｇａｙａ Ｔ，Ｉｓｈｉｉ Ｋ，Ｉｃｈｉｂａ Ｈ，Ｉｉｚｕｋａ Ｈ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｔ．Ｊ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉ ２０１０； ５６，３４１－３４６．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

上述の通り、特許文献１には、１段階反応でＬＡＯ又はＤＡＯの酵素活性を評価することができるプローブ分子として、所定の構造式（１）又は（２）で表される化合物（ＭｅＳ－Ｄ－ＫＹＮ又はＭｅＳ－Ｌ－ＫＹＮ）が開示されているが、ＬＡＯ又はＤＡＯの酵素活性研究、酵素阻害剤の研究又は酵素活性イメージング研究などへの展開を考慮すると、さらに検出感度に優れた新規化合物の開発が求められる。

【0011】

そこで、本発明の目的は、アミノ酸酸化酵素（Ｄ－アミノ酸酸化酵素又はＬ－アミノ酸酸化酵素）の酵素活性を良好に評価することができる新規化合物、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用試薬、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用キット、及びアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、式（１）で表される化合物又はその塩若しくは溶媒和物を用いることにより、アミノ酸酸化酵素の酵素活性を高い蛍光強度で検出することができることを知見し、本発明に至った。

【0013】

そこで、本発明の態様例は、以下の通りである。
（１） 下記式（１）で表される化合物又はその塩若しくは溶媒和物：

【化1】

（式（１）において、Ｒ_１～Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）。
（２） 下記式（１－Ｄ）及び（１－Ｌ）のいずれかで表される、（１）に記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物：

【化2】

（式（１－Ｄ）及び（１－Ｌ）において、Ｒ_１～Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）。
（３） 下記式のいずれかで表される、（１）に記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物：

【化3】

（４） （１）～（３）のいずれか１つに記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物を含む、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用試薬。
（５） （１）～（３）のいずれか１つに記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物或いは（４）に記載のアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用試薬を少なくとも含む、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用キット。
（６） （１）～（３）のいずれか１つに記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物、（４）に記載のアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用試薬、又は（５）に記載のアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用キットを用いてアミノ酸酸化酵素の酵素活性を測定することを含む、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定方法。
（７） アミノ酸酸化酵素のスクリーニングにおいて用いられる、（６）に記載の方法。
（８） アミノ酸酸化酵素の酵素活性阻害剤のスクリーニングにおいて用いられる、（６）に記載の方法。
（９） 下記式（２）で表される化合物又はその塩若しくは溶媒和物：

【化4】

（式（２）において、Ｒ_１～Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）。
（１０） 下記式のいずれかで表される、（９）に記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物：

【化5】

（１１） （９）又は（１０）に記載の化合物又はその塩若しくは溶媒和物の蛍光を検出することを含む、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定方法。
（１２） アミノ酸酸化酵素のスクリーニングにおいて用いられる、（１１）に記載の方法。
（１３） アミノ酸酸化酵素の酵素活性阻害剤のスクリーニングにおいて用いられる、（１１）に記載の方法。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、アミノ酸酸化酵素の酵素活性を良好に評価することができる新規化合物、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用試薬、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用キット、及びアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、実施例の化合物３ａ～３ｄ及び比較化合物（ＭｅＳ－ＫＹＮＡ）について測定した蛍光量子収率を示すグラフである。

【図2】図２は、実施例の化合物３ｂの相対蛍光強度を示すグラフである。

【図3】図３は、実施例の化合物３ｂを用いた場合における、ＤＡＯ又はＬＡＯ濃度（酵素活性）と蛍光強度の関係を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

（化合物）
本実施形態に係る化合物は、下記式（１）で表される化合物又はその塩若しくは溶媒和物である：

【化6】

（式（１）において、Ｒ_１～Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）。

【0017】

本実施形態に係る化合物は、アミノ酸酸化酵素の酵素活性の蛍光プローブとして用いることができ、当該酵素活性の検出・測定に良好に用いることができる。本実施形態に係る化合物は、アミノ酸酸化酵素の酵素活性を測定するための酵素活性測定用試薬として好適に用いることができる。本実施形態に係る化合物は、ラセミ体であってもよく、鏡像異性体（Ｄ体又はＬ体）であってもよい。

【0018】

本実施形態に係る化合物は、塩形態で存在し得る。塩としては、特に制限されるものではないが、例えば、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、ナトリウム塩、又はカリウム塩などが挙げられる。

【0019】

本実施形態に係る化合物は、溶媒和形態及び非溶媒和形態で存在し得る。用語「溶媒和物」は、例えば、水素結合による、本実施形態に係る化合物と１つ以上の溶媒分子との物理的な会合を意味する。溶媒和物中の溶媒分子は、規則的な配列及び/又は非規則的な配列で存在し得る。溶媒和物は、化学量論量又は非化学量論量のどちらか一方の溶媒分子を含むことができる。「溶媒和物」は、溶液相と分離可能な溶媒和物の両方を包含する。本実施形態に係る化合物は、水(すなわち、水和物)又は一般有機溶媒との溶媒和物を形成することができる。溶媒和の方法は、一般に、当分野で公知である。

【0020】

式（１）において、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基は、炭素数が１～４個のアルキル基を意味し、アルキル基は、直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、又はブチル基などが挙げられる。

【0021】

本実施形態に係る化合物は、好ましくは、下記式（１－Ｄ）及び（１－Ｌ）のいずれかで表される、化合物又はその塩若しくは溶媒和物である：

【化7】

（式（１－Ｄ）及び（１－Ｌ）において、Ｒ_１～Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）。

【0022】

式（１－Ｄ）及び（１－Ｌ）において、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基は、炭素数が１～４個のアルキル基を意味し、アルキル基は、直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、又はブチル基などが挙げられる。

【0023】

式（１－Ｄ）又は（１－Ｌ）で表される化合物は、光学活性体である。本明細書における光学活性体とは、ラセミ体ではない（ｎｏｎ－ｒａｃｅｍｉｃ）という意味で使用する。本実施形態に係る光学活性体は、式（１－Ｄ）で表されるＤ体又は式（１－Ｌ）で表されるＬ体であり、Ｄ体又はＬ体のいずれか一方の光学異性体比率は９０％以上であることが好ましい。本実施形態に係る化合物として光学活性体を用いることにより、ＤＡＯ又はＬＡＯの酵素活性を直接的に検出・測定することができるため、検出感度を向上することができる。

【0024】

本実施形態に係る化合物は、より好ましくは、下記式のいずれかで表される、化合物又はその塩若しくは溶媒和物である：

【化8】

【0025】

本実施形態に係る化合物は、下記式（２）で表される化合物又はその塩若しくは溶媒和物である：

【化9】

（式（２）において、Ｒ_１～Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）。

【0026】

本実施形態に係る化合物は、アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定において検出対象としての蛍光体として採用することができ、当該酵素活性の検出・測定に良好に用いることができる。また、強い蛍光強度を有するため、生体内物質などの物質の標識に用いることも可能である。

【0027】

式（２）において、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基は、炭素数が１～４個のアルキル基を意味し、アルキル基は、直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、又はブチル基などが挙げられる。

【0028】

本実施形態に係る化合物は、好ましくは、下記式のいずれかで表される、化合物又はその塩若しくは溶媒和物である：

【化10】

【0029】

本実施形態に係る化合物の製造方法としては、特に制限はなく、公知の化学合成方法を適宜選択することができ、例えば、後述する［実施例］の項目に記載の方法などで製造することができる。

【0030】

なお、後述する［実施例］の項目に記載の方法は一例である。また、化学合成における反応温度や反応時間などの反応条件や、用いる化合物及びその使用量、溶媒、精製方法などは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

【0031】

得られた化合物が式（１）又は式（２）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができる。分析方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、質量分析法、紫外分光法、赤外分光法、プロトン核磁気共鳴分光法、炭素１３核磁気共鳴分光法、元素分析法などが挙げられる。分析方法は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。なお、前記各分析方法による測定値には、多少の誤差が生じることがあるが、当業者であれば、化合物が式（１）又は式（２）で表される構造を有することは容易に同定することが可能である。

【0032】

（アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用試薬）
本実施形態のアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用試薬は、本実施形態に係る化合物（式（１）の化合物）を少なくとも含む。本実施形態に係る酵素活性測定用試薬は、本実施形態に係る化合物に加え、必要に応じて添加剤を更に含み得る。

【0033】

後述する［実施例］の項目にて示されるように、式（１）で表される化合物は、アミノ酸酸化酵素の活性測定に用いることができる。また、式（１－Ｄ）で表される化合物は、Ｄ－アミノ酸酸化酵素（ＥＣ番号：１．４．３．３）の活性測定に用いることができ、式（１－Ｌ）で表される化合物は、Ｌ－アミノ酸酸化酵素（ＥＣ番号：１．４．３．２）の活性測定に用いることができる。ＤＡＯ及びＬＡＯの由来の種としては、特に制限されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、ＤＡＯ及びＬＡＯは天然物から取得したものであってもよいし、生合成などにより合成したものであってもよい。

【0034】

本実施形態の式（１－Ｄ）の化合物はＤ－アミノ酸酸化酵素と反応することにより、式（１－Ｌ）で表される化合物はＬ－アミノ酸酸化酵素と反応することにより、蛍光を発する化合物（蛍光物質）が生成される。前記蛍光を測定することにより、各酵素の活性を評価することができる。本実施形態に係る化合物（式（１）で表される化合物）は、蛍光物質（式（２）で表される化合物）の前駆体であり得る。

【0035】

本実施形態に係る酵素活性測定用試薬は、本実施形態に係る化合物から実質的に構成されていてもよいし、本実施形態に係る化合物に加えて、添加剤を更に含んで構成されていてもよい。

【0036】

本明細書において、「～から実質的に構成される」とは、本実施形態に係る化合物以外は、不純物であることを意味することが好ましく、具体的には、本実施形態に係る化合物の試薬中の含有量が、９５質量％以上であることを意味することが好ましく、９６質量％以上であることを意味することが好ましく、９７質量％以上であることを意味することが好ましく、９８質量％以上であることを意味することが好ましく、９９質量％以上であることを意味することが好ましく、９９．５質量％以上であることを意味することが好ましい。

【0037】

添加剤としては、特に制限されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。添加剤としては、例えば、安定化剤などが挙げられる。添加剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0038】

本実施形態に係る酵素活性測定用試薬によれば、複雑な２段階反応を用いることなく、迅速かつ簡易にアミノ酸酸化酵素の酵素活性を効率的に測定することができる。

【0039】

（アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用キット）
本実施形態のアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定用キットは、本実施形態に係る化合物（式（１）で表される化合物）又は本実施形態に係る酵素活性測定用試薬を少なくとも含む。本実施形態に係る酵素活性測定用キットは、本実施形態に係る化合物又は酵素活性測定用試薬に加え、必要に応じてその他の材料を含み得る。その他の材料は、酵素活性測定に必要なものを意味し、例えば、溶媒、溶解補助剤、ビタミン、補酵素、ｐＨ調整剤、緩衝剤、ラジカル捕捉剤、等張化剤が挙げられる。その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

【0040】

本実施形態に係る酵素活性測定用キットにおいて、本実施形態に係る化合物又は本実施形態に係る酵素活性測定用試薬と、その他の材料とは、別々の容器に分けられており、使用時にそれぞれを混合する態様であることが好ましい。また、その他の材料についても、それぞれが別々の容器に分けられていてもよく、また、それらの少なくとも２つが混合されて同じ容器に入れられていてもよい。

【0041】

本実施形態に係る酵素活性測定用キットによれば、複雑な２段階反応を用いることなく、迅速かつ簡易にアミノ酸酸化酵素の酵素活性を効率的に測定することができる。

【0042】

（アミノ酸酸化酵素の酵素活性測定方法）
本実施形態のアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定方法は、本実施形態に係る化合物（式（１）で表される化合物）、本実施形態に係る酵素活性測定用試薬、又は本実施形態に係る酵素活性測定用キットを用いてアミノ酸酸化酵素の酵素活性を測定する工程を少なくとも含む。本実施形態に係る酵素活性測定方法は、必要に応じて更にその他の工程を含んでもよい。

【0043】

本実施形態における測定工程は、本実施形態に係る化合物を用いてアミノ酸酸化酵素の酵素活性を測定する工程である。

【0044】

測定工程における反応液の組成は、特に制限されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。

【0045】

例えば、Ｄ－アミノ酸酸化酵素の酵素活性を測定する場合には、Ｄ－アミノ酸酸化酵素、フラビンアデニンジヌクレオチド、牛血清アルブミン、グルタチオン、及び本実施形態に係る化合物を含む反応液とすることができる。また、Ｌ－アミノ酸酸化酵素の酵素活性を測定する場合には、Ｌ－アミノ酸酸化酵素、牛血清アルブミン、グルタチオン、及び本実施形態に係る化合物を含む反応液とすることができる。

【0046】

反応液における各成分の量は、特に制限されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。

【0047】

反応条件は、特に制限されるものではなく、アミノ酸酸化酵素の酵素活性などに応じて適宜選択することができ、例えば、３７℃、６０分間などが挙げられる。

【0048】

反応後の反応液の蛍光を測定することにより、アミノ酸酸化酵素の酵素活性を測定することができる。蛍光の測定は、例えば、公知の装置を用いることができ、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４１８ｎｍにて行うことができる。

【0049】

その他の工程は、特に制限されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。

【0050】

本実施形態のアミノ酸酸化酵素の酵素活性測定方法は、公知の他の方法と組み合わせて行うこともできる。

【0051】

本実施形態に係る酵素活性測定方法によれば、複雑な２段階反応を用いることなく、迅速かつ簡易にアミノ酸酸化酵素の酵素活性を効率的に測定することができる。また、Ｄ－アミノ酸酸化酵素及びＬ－アミノ酸酸化酵素の活性を選択的に測定することができる。また、酵素反応により生じる蛍光波長は可視領域にあるため、蛍光イメージング研究にも適用可能である。

【0052】

本実施形態に係る酵素活性測定方法は、例えば、アミノ酸酸化酵素、特に高い酵素活性を有するアミノ酸酸化酵素のスクリーニング、アミノ酸酸化酵素の酵素活性阻害剤のスクリーニングなどにおいて好適に用いることができる。

【0053】

アミノ酸酸化酵素のスクリーニングとしては、例えば、抗がん療法などに利用できる活性が高いＬ－アミノ酸酸化酵素のスクリーニングなどが挙げられる。スクリーニングは、活性測定の対象となるＬ－アミノ酸酸化酵素を上記した反応液に含有させて反応を行うことにより実施することができる。活性測定の対象となるＬ－アミノ酸酸化酵素は、天然物由来のものであってもよいし、生合成などにより合成したものであってもよい。

【0054】

アミノ酸酸化酵素の酵素活性阻害剤のスクリーニングとしては、例えば、統合失調症やＡＬＳなどの治療薬に利用できる阻害活性が高い物質（以下、「候補物質」と称することがある。）のスクリーニングなどが挙げられる。スクリーニングは、候補物質を上記した反応液に含有させて反応を行うことにより実施することができる。候補物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然物由来のものであってもよいし、化学合成や生合成などにより合成したものであってもよい。

【実施例0055】

以下に本実施形態の試験例及び製造例を説明するが、本発明は、これらの試験例及び製造例に何ら限定されるものではない。

【0056】

［実験例１：強蛍光キヌレン酸化合物の探索］
より強い蛍光を発するキヌレン酸誘導体の探索を行った。

【0057】

（フェニル置換キヌレン酸化合物の合成）
スキームＳ１：フェニル置換キヌレン酸化合物（蛍光体）の合成経路

【化11】

【0058】

化合物１：エチル６－ブロモキヌレネート（Ethyl 6-bromokynurenate）

【化12】

【0059】

ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に溶解した４－ブロモアニリン（３９．７ｍｍｏｌ）の溶液にアセチレンジカルボン酸ジエチル（４０．１ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、混合物を６５℃で０．５時間撹拌した。溶媒を減圧留去した。残渣をジフェニルエーテル（１００ｍＬ）に再溶解し、２５０℃にて１時間加熱した。溶液を室温に冷却し、ヘキサン（２００ｍＬ）で希釈して沈殿させた。沈殿物を濾過し、ヘキサンで洗浄し、熱エタノールから再結晶して、化合物１を灰色の結晶性固体として得た（収率５３％）。

【0060】

m/z 295.99402 (calced for [M+H] 295.99223); m.p. 246-251℃; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 12.21 (s, 1H, OH), 8.14 (d, J = 2.1 Hz, 1H, ArH), 7.90-7.83 (m, 2H, ArH), 6.68 (s, 1H, ArH), 4.41 (q, J = 7.1 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 1.35 (t, J = 7.1 Hz, 3H, OCH₂CH₃); 13C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ 176.3, 161.9, 138.9, 138.1, 135.3, 127.2, 126.8, 122.1, 116.9, 110.4, 62.7, 13.9.

【0061】

化合物２：６－ブロモキヌレン酸（6-Bromokynurenic acid）（Ｂｒ－ＫＹＮＡ）

【化13】

【0062】

化合物１（１０．０ｍｍｏｌ）と水酸化カリウム（４５．０ｍｍｏｌ）を５０％水／エタノール（４０ｍＬ）に溶解し、２時間室温で攪拌した。この溶液を２Ｍ塩酸で酸性化し、化合物２を析出させた。沈殿物をろ過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させて、淡いオレンジ色の固体を得た（収率８９％）。

【0063】

m/z 267.96456 (calced for [M+H] 267.96093); m.p. 283-286℃; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 12.16 (s, 1H, OH), 8.14 (d, J = 2.3 Hz, 1H, ArH), 7.91 (d, J = 8.9 Hz, 1H, ArH), 7.86-7.83 (m, 1H, ArH), 6.65 (s, 1H, ArH); 13C-NMR (101 MHz, 5% NaOD-D2O) δ 174.9, 172.8, 156.7, 147.4, 132.5, 129.4, 127.4, 125.4, 116.9, 107.1.

【0064】

化合物３ａ：６－フェニルキヌレン酸（6-Phenylkynurenic acid）（Ｐｈ－ＫＹＮＡ）

【化14】

【0065】

化合物２（Ｂｒ－ＫＹＮＡ）（１．０２ｍｍｏｌ）、フェニルボロン酸（１．１４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．０５ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）に溶解した。触媒量（約５ｍｇ）の酢酸パラジウムを添加し、３時間攪拌した。その溶液を１Ｍ塩酸で酸性化し、得られた沈殿物を濾過、水で洗浄し、減圧下で乾燥させて、白色固体を得た（収率９６％）。

【0066】

m/z 266.07989 (calced for [M+H] 266.08172); m.p. 271-273℃; 1H-NMR (400 MHz, 5% NaOD-D2O) δ 7.98 (s, 1H, ArH), 7.48 (s, 2H, ArH), 7.32 (d, J = 7.3 Hz, 2H, ArH), 7.07 (t, J = 7.7 Hz, 2H, ArH), 6.97 (t, J = 7.3 Hz, 1H, ArH), 6.53 (s, 1H, ArH); 13C-NMR (101 MHz, 5% NaOD-D2O) δ 175.0, 174.0, 156.4, 148.2, 140.0, 135.5, 129.1, 128.6, 128.1, 127.5, 126.8, 126.3, 120.7, 106.9.

【0067】

化合物３ｂ：６－（２－メチルフェニル）キヌレン酸（6-(2-Methylphenyl)kynurenic acid）（２－ＭｅＰｈ－ＫＹＮＡ）

【化15】

【0068】

化合物２（Ｂｒ－ＫＹＮＡ）（２．００ｍｍｏｌ）、２－メチルフェニルボロン酸（２．１９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１０．６ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に酢酸パラジウム（１０．３μｍｏｌ）を加え、１時間加熱還流下で反応させた。得られた反応溶液を１Ｍ ＨＣｌで酸性化し、沈殿物を濾過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させ、白色固体を得た（収率８５％）。

【0069】

m/z 280.09846 (calced for [M+H] 280.09737); m.p. 255-259℃; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 12.06 (s, 1H, OH), 8.01 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 7.96 (d, J = 2.1 Hz, 1H, ArH), 7.71 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H, ArH), 7.32-7.23 (m, 4H, ArH), 6.66 (s, 1H, ArH), 2.23 (s, 3H, CH₃); 13C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ 177.6, 163.8, 140.4, 139.8, 139.0, 136.8, 134.8, 133.5, 130.5, 129.7, 127.6, 126.1, 125.6, 124.3, 119.6, 109.8, 20.2.

【0070】

化合物３ｃ：６－（４－メチルフェニル）キヌレン酸（6-(4-Methylphenyl)kynurenic acid）（４－ＭｅＰｈ－ＫＹＮＡ）

【化16】

【0071】

化合物２（Ｂｒ－ＫＹＮＡ）（１．００ｍｍｏｌ）、４－メチルフェニルボロン酸（１．３２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．３４ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）に溶解させた。その溶液に、触媒量（約５ｍｇ）の酢酸パラジウムを加え、その後１時間攪拌した。得られた溶液を１Ｍ ＨＣｌで酸性化し、沈殿物を濾過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させて、白色固体（収率１００％）を得た。

【0072】

m/z 280.09906 (calced for [M+H] 280.09737); m.p. 274-278℃; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 12.03 (s, 1H, OH), 8.24 (t, J = 1.1 Hz, 1H, ArH), 7.99 (s, 2H, ArH), 7.61 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.27 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 6.62 (s, 1H, ArH), 2.32 (s, 3H, CH₃); 13C-NMR (101 MHz, 10% METHAOL-D4/PYRIDINE-D5) δ 179.8, 165.5, 148.9, 142.1, 139.9, 137.4, 131.4, 130.0, 127.0, 127.0, 124.0, 123.1, 120.0, 110.7, 20.7.

【0073】

化合物３ｄ：６－（３，５－ジメチルフェニル）キヌレン酸（6-(3,5-Dimethylphenyl)kynurenic acid）（３，５－ｄｉＭｅＰｈ－ＫＹＮＡ）

【化17】

【0074】

化合物２（Ｂｒ－ＫＹＮＡ）（０．９９６ ｍｍｏｌ）、３，５－ジメチルフェニルボロン酸（１．０４ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（２．７６ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）に溶解させた。触媒量（約５ｍｇ）の酢酸パラジウムを溶液に加え、還流下で１時間撹拌した後、１Ｍ ＨＣｌで酸性化した。沈殿物を濾過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させて、淡黄色固体を得た（収率８９％）。

【0075】

m/z 294.11384 (calced for [M+H] 294.11302); m.p. 273-275℃; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 12.06 (s, 1H, OH), 8.27 (t, J = 1.4 Hz, 1H, ArH), 8.01 (d, J = 1.4 Hz, 2H, ArH), 7.33 (s, 2H, ArH), 7.01 (s, 1H, ArH), 6.65 (s, 1H, ArH), 2.35 (s, 6H, CH3); 13C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ 163.7, 139.1, 138.1, 135.8, 131.2, 129.1, 124.5, 121.7, 21.0

【0076】

［評価］
（フェニル置換キヌレン酸化合物の蛍光量子収率の測定）
各フェニル置換キヌレン酸化合物溶液（化合物３ａ～３ｄ）（ＤＭＳＯ溶液、１０ｍＭ）１０μＬをＰＢＳで１０μＭに希釈し、試料溶液とした。これらの溶液を測定して、各キヌレン酸化合物のＰＢＳ中での蛍光量子収率（Φ_ＫＹＮＡ）を１０μＭ硫酸キニーネ（５０ｍＭ硫酸溶液）の蛍光量子収率（Φ_Quinine）に対する相対蛍光量子収率として算出した。

【0077】

相対蛍光量子収率の算出に用いた式は以下の通りである。Φ_Quinineの値は０．５５として算出した。

【0078】

【数1】

ＦＬ＿ａｒｅａ：キヌレン酸化合物又は硫酸キニーネの３５０ｎｍで励起された蛍光スペクトル下の面積
Ａ：３５０ｎｍにおけるキヌレン酸化合物又はキニーネの吸光度
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水

【0079】

各化合物３ａ～３ｄについて蛍光量子収率を測定した結果を図１に示す。また、比較として、下記式で表される化合物（ＭｅＳ－ＫＹＮＡ）について蛍光量子収率を測定した結果も合わせて図１に示す。なお、当該化合物は、特許文献１（特開２０２３－２２６６２号公報）に記載の方法により合成したものを用いた。

【化18】

【0080】

図１に示されるように、化合物３ａ～３ｄのフェニル置換キヌレン酸化合物の蛍光量子収率は、ＭｅＳ－ＫＹＮＡよりも高い数値を示した。

【0081】

［実施例２：フェニル置換キヌレニン化合物の合成］
実施例１において、最も強い蛍光を示した化合物３ｂのキヌレン酸誘導体の前駆体となる、本実施形態に係る化合物としての２－ＭｅＰｈ－Ｄ，Ｌ－ＫＹＮ（２－ＭｅＰｈ－Ｄ－ＫＹＮ又は２－ＭｅＰｈ－Ｌ－ＫＹＮ）を下記の方法により合成した。

【0082】

（２－ＭｅＰｈ－Ｄ，Ｌ－ＫＹＮの合成）
スキームＳ２：２－ＭｅＰｈ－Ｄ，Ｌ－ＫＹＮの合成経路

【化19】

【0083】

化合物４：１－（２－アミノ－５－ブロモフェニル）－２－クロロエタン－１－オン（1-(2-Amino-5-bromophenyl)-2-chloroethan-1-one）

【化20】

【0084】

４－ブロモアニリン（６６．３ｍｍｏｌ）のトルエン（７２ｍＬ）溶液に、三塩化ホウ素（約１Ｍ、ジクロロメタン溶液、７２ｍＬ）、無水塩化アルミニウム（７５．１ｍｍｏｌ）及びクロロアセトニトリル（５ｍＬ）を室温で添加した。その後、混合物をアルゴン雰囲気下、還流温度で１６時間加熱した。反応液を室温まで冷却した後、０．５Ｍ 塩酸（１００ｍＬ）を添加した。目的化合物をクロロホルム（２００ｍＬ×３）へ抽出した。次に、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥材を濾過後、溶媒を留去した。残留物にトルエン（５０ｍＬ）及びヘキサン（２００ｍＬ）を加え、固化させた。上澄みを廃棄し、残った固体を減圧下で乾燥させ、化合物４を茶色固体として得た（収率１４％）。

【0085】

m/z 247.95136 (calced for [M+H] 247.94778); m.p. 129-132℃; 1H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 7.72 (d, J = 2.3 Hz, 1H, ArH), 7.36 (dd, J = 8.8, 2.2 Hz, 1H, ArH), 6.60 (d, J = 8.9 Hz, 1H, ArH), 6.35 (s, 2H, NH₂), 4.64 (s, 2H, CH₂); 13C-NMR (101 MHz, CHLOROFORM-D) δ 191.6, 149.9, 137.9, 132.7, 119.3, 116.2, 106.8, 46.3.

【0086】

化合物５：２－アセタミド－４－（２－アミノ－５－ブロモフェニル）－４－オキソブタン酸（2-Acetamido-4-(2-amino-5-bromophenyl)-4-oxobutanoic acid）

【化21】

【0087】

化合物４（３７．１ｍｍｏｌ）、アセトアミドマロン酸ジエチル（３８．０ｍｍｏｌ）、ナトリウムエトキシド（７７．６ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（３．９６ｍｍｏｌ）及び１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（３ｍＬ）をエタノール（１００ｍＬ）に溶解させた。溶液を還流下で３時間撹拌し、分液ロートに移し、飽和重曹水（１００ｍＬ）を添加、クロロホルム（１００ｍＬ×３）へ抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥材をろ過除去後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル、５０％酢酸エチルＡｃＯＥｔ／ヘキサン）で粗精製し、粗中間体及び水酸化ナトリウム（１０３ｍｍｏｌ）を水（１００ｍＬ）に溶解させた。混合物を３０分間加熱還流し、その後氷酢酸（１０ｍＬ）を加えた、さらに１．５時間加熱還流した。反応後、混合物を分液ロートに移し、酢酸エチル（１００ｍＬ×４）へ抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥材をろ過除去後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー（ＯＤＳカラム、酢酸／水／メタノール［０．１：５０：５０］）で精製し、さらに熱水より再結晶して、化合物５（収率９．５％）を得た。

【0088】

m/z 329.01680 (calced for [M+H] 329.01369); m.p. 177-180℃; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 12.59 (s, 1H, CO₂H), 8.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H, ArH), 7.84 (d, J = 2.3 Hz, 1H, ArH), 7.36 (dd, J = 8.9, 2.3 Hz, 1H, ArH), 7.32 (s, 2H, NH₂), 6.75 (d, J = 8.9 Hz, 1H, NHAc), 4.70-4.65 (m, 1H, α-CH₂), 3.35-3.33 (m, 2H, β-CH₂), 1.81 (s, 3H, Ac); 13C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ 197.5, 173.1, 169.1, 150.2, 136.8, 132.9, 119.4, 117.5, 104.6, 48.0, 40.3, 22.4.

【0089】

化合物６：２－アセタミド－４－（４－アミノ－２’－メチル－［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－４－オキソブタン酸（2-Acetamido-4-(4-amino-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-yl)-4-oxobutanoic acid）

【化22】

【0090】

化合物５（２．０９ｍｍｏｌ）、２－メチルフェニルボロン酸（２．２４ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（４．２０ｍｍｏｌ）を５０％水／メタノール（２０ｍＬ）に溶解し、触媒量（約５ｍｇ）の酢酸パラジウムを溶液に添加した。混合物を室温１時間、還流温度でさらに２時間撹拌した。反応液を塩酸で酸性ｐＨに調整し、ＯＤＳクロマトグラフィーカラム（移動相として水／メタノール［１：１］）で精製した。カラム後、目的画分を濃縮し、化合物６を白色固体として得た（収率５９％）。

【0091】

m/z 341.14693 (calced for [M+H] 341.15013); m.p. 177-180℃; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 12.55 (s, 1H, CO₂H), 8.10 (d, J = 7.8 Hz, 1H, AcNH), 7.64 (d, J = 2.1 Hz, 1H, ArH), 7.29-7.24 (m, 4H, ArH), 7.23-7.21 (m, 2H, NH₂), 7.21-7.18 (m, 1H, ArH), 6.84 (d, J = 8.7 Hz, 1H, NHAc), 4.74-4.69 (m, 1H, α-CH), 3.43-3.33 (m, 2H, β-CH₂), 2.26 (s, 3H, PhCH₃), 1.81 (s, 3H, Ac); 13C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ 198.3, 173.2, 169.1, 150.1, 140.8, 135.2, 134.8, 131.2, 130.3, 129.5, 127.3, 126.8, 126.0, 116.9, 115.9, 48.0, 40.3, 22.4, 20.4.

【0092】

５－（２－メチルフェニル）－Ｄ，Ｌ－キヌレニン（5-(2-Methylphenyl)-D, L-kynurenine）（２－ＭｅＰｈ－Ｄ，Ｌ－ＫＹＮ）

【化23】

【0093】

化合物６（１．１１ｍｍｏｌ）、Ｄ－アミノアシラーゼ（１０５ｍｇ）及び塩化コバルト６水和物（１２．７ｍｇ）を５０ｍＬのリン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ８．４）に溶解し、３７℃にて１８５時間攪拌した。次に、得られた溶液をクロマトグラフィー（ＯＤＳ、酢酸／水／メタノール、０．１：５０：５０）にて精製し、２－ＭｅＰｈ－Ｄ－ＫＹＮと化合物６のＬ－異性体を含むフラクションを得た。前者を濃縮し、水で再結晶し、純粋な２－ＭｅＰｈ－Ｄ－ＫＹＮを淡黄色固体として得た（収率４５％）。後者を濃縮乾固し、５０ｍＬのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．４）に溶解し、アシラーゼＩ（１０１ｍｇ）及び塩化コバルト６水和物（１２．１ｍｇ）を加え、４５℃で１８時間撹拌した。その後、２－ＭｅＰｈ－Ｄ－ＫＹＮと同様の方法で精製し、２－ＭｅＰｈ－Ｌ－ＫＹＮを得た（収率５１％）。

【0094】

［２－ＭｅＰｈ－Ｄ－ＫＹＮ］：m/z 299.13497 (calced for [M+H] 299.13957); m.p.214-216℃; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 7.60 (d, J = 2.1 Hz, 1H, ArH), 7.28-7.19 (m, 7H, ArH and NH₂), 6.84 (d, J = 8.7 Hz, 1H, ArH), 3.63 (dd, J = 8.6, 3.5 Hz, 1H, α-CH), 3.52 (dd, J = 17.9, 3.7 Hz, 1H, β-CH₂), 3.29 (dd, J = 17.9, 8.5 Hz, 1H, β-CH₂), 2.25 (s, 3H, CH₃); 13C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ 199.3, 169.2, 150.0, 140.7, 135.1, 134.8, 131.0, 130.3, 129.4, 127.3, 126.7, 126.0, 116.8, 116.1, 49.9, 20.3;
［２－ＭｅＰｈ－Ｌ－ＫＹＮ］：m/z 299.14318 (calced for [M+H] 299.13957); m.p.214-215℃; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 7.60 (d, J = 2.1 Hz, 1H, ArH), 7.29-7.17 (m, 7H, ArH and NH₂), 6.84 (d, J = 8.5 Hz, 1H, ArH), 3.61 (dd, J = 8.6, 3.5 Hz, 1H, α-CH), 3.52 (dd, J = 17.7, 3.5 Hz, 1H, β-CH₂), 3.27 (q, J = 8.8 Hz, 1H, β-CH₂), 2.25 (s, 3H, CH₃); 13C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ 199.4, 169.1, 150.0, 140.7, 135.1, 134.8, 131.0, 130.3, 129.4, 127.3, 126.7, 126.0, 116.8, 116.1, 49.9, 20.3.

【0095】

［評価］
（２－ＭｅＰｈ－ＫＹＮプローブを用いた酵素アッセイ法の一般的手順）
＜ＤＡＯアッセイ法＞
ＦＡＤ溶液（１０ｍＭ，１０μＬ）、ＢＳＡ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ，１０μＬ）、ＧＳＨ溶液（１ｍＭ，１０μＬ）、及びｐｋＤＡＯ溶液（溶媒：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３），１０μＬ）を、４５０μＬのアッセイバッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３），４５０μＬ）に加えて混合液を調製し、３７℃で１５分間プレインキュベートした。その後、２－ＭｅＰｈ－Ｄ－ＫＹＮ溶液（溶媒：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３），１０ｍＭ，１０μＬ）を混合液に添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。得られた溶液を加熱（９５℃で５分間）し、沈殿したタンパク質を遠心分離（１８００×ｇ、５分）により除去した。上清０．５ｍＬを水１．５ｍＬで希釈し、その一定量を１ｃｍ角の石英セルに移し、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４１８ｎｍで蛍光測定を実施した。

【0096】

＜ＬＡＯアッセイ法＞
２－ＭｅＰｈ－Ｄ－ＫＹＮの代わりに２－ＭｅＰｈ－Ｌ－ＫＹＮを用い、且つｐｋＤＡＯの代わりにｓｖＬＡＯを用いたこと以外は、上記ＤＡＯアッセイ法と同様の方法でＬＡＯ活性を測定した。

【0097】

ＦＡＤ；フラビンアデニンジヌクレオチド
ＢＳＡ；牛血清アルブミン
ＧＳＨ；グルタチオン
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩
ｐｋＤＡＯ；Ｄ－アミノ酸酸化酵素（ブタ腎由来）
ｓｖＬＡＯ；Ｌ－アミノ酸酸化酵素（ヒガシダイヤガラガラヘビ由来）

【0098】

得られた蛍光強度について、比較対象のＭｅＳ－Ｄ－ＫＹＮ又はＭｅＳ－Ｌ－ＫＹＮの蛍光強度（励起波長３６４ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）に対する２－ＭｅＰｈ－Ｄ－ＫＹＮ又は２－ＭｅＰｈ－Ｌ－ＫＹＮの相対蛍光強度（励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４１８ｎｍ）の相対値を図２に示す。

【0099】

図２の結果から、新規蛍光プローブとしての２－ＭｅＰｈ－Ｄ－ＫＹＮ及び２－ＭｅＰｈ－Ｌ－ＫＹＮは、それぞれ、ＭｅＳ－Ｄ－ＫＹＮ及びＭｅＳ－Ｌ－ＫＹＮと比べて、ＤＡＯを約６０倍、ＬＡＯを約５倍の感度で検出可能であった。したがって、本願化合物は、検出感度に優れていることが確認された。

【0100】

＜検量線作成・直線性確認＞
試料溶液としての各種濃度のｐｋＤＡＯ溶液（０．５０、１．０、２．５、５．０Ｕ／ｍＬ）又はｓｖＬＡＯ溶液（０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．１０Ｕ／ｍＬ）を用い、２－ＭｅＰｈ－ＫＹＮプローブを用いた酵素アッセイ法の一般的手順に記載の手順で蛍光測定を行い、検量線を作成した。

【0101】

結果を図３に示す。図３に示されるように、酵素活性と蛍光強度との間には、高い直線関係が見られた（Ｒ２＝０．９９８７又は０．９９３４）。

【0102】

本明細書中に記載した数値範囲の上限値及び／又は下限値は、それぞれ任意に組み合わせて好ましい範囲を規定することができる。例えば、数値範囲の上限値及び下限値を任意に組み合わせて好ましい範囲を規定することができ、数値範囲の上限値同士を任意に組み合わせて好ましい範囲を規定することができ、また、数値範囲の下限値同士を任意に組み合わせて好ましい範囲を規定することができる。

【0103】

この記載した開示に続く特許請求の範囲は、本明細書においてこの記載した開示に明示的に組み込まれ、各請求項は個別の実施形態として独立している。本開示は独立請求項をその従属請求項によって置き換えたもの全てを含む。さらに、独立請求項及びそれに続く従属請求項から誘導される追加的な実施形態も、この記載した明細書に明示的に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】