特開 2024-180146 胃幹細胞培養用培地、培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024180146

(43)【公開日】2024-12-26

(54)【発明の名称】胃幹細胞培養用培地、培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/00 20060101AFI20241219BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20241219BHJP

【ＦＩ】

C12N5/00

C12N5/074

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023099622

(22)【出願日】2023-06-16

(71)【出願人】

【識別番号】504143441

【氏名又は名称】国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学

(72)【発明者】

【氏名】栗崎 晃

(72)【発明者】

【氏名】高田 仁実

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BB04

4B065BB19

4B065BD25

4B065BD39

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】動物血清や細胞培養上清などの未確認成分を含まない胃の幹細胞の増殖培地を提供する。また、培養した増殖細胞の不均一性を解決する胃の幹細胞の増殖培地を提供する。さらに、これらの培地を用いた胃培養幹細胞の製造方法を提供する。
【解決手段】ＮＦ－κＢシグナル経路の活性化因子及びＥＧＦ－Ｅｒｋシグナル阻害剤のうちの少なくとも一種を含む胃幹細胞増殖培地。該培地を用いた胃培養幹細胞の製造方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

NF-κBシグナル経路の活性化因子及びEGF－Erkシグナル阻害剤のうちの少なくとも一種を含む胃幹細胞増殖培地。

【請求項2】

NF-κBシグナル経路の活性化因子が、TNFファミリーの遺伝子組換えタンパク質、インターロイキンファミリーの遺伝子組換えタンパク質、Betulinic acid、Prostratin、PMA、Calcimycin (A23187)からなる群から選択される、請求項１記載の胃幹細胞増殖培地。

【請求項3】

NF-κBシグナル経路の活性化因子が、TNFSF1(TNF-α)、TNFSF2(TNF-β、LT-α)、TNFSF3（LT-β）、TNFSF4（OX40L、CD252、gp34)、TNFSF5（CD40L、CD154、gp39)、TNFSF6（FasL、CD95L、Apo1L)、TNFSF7（CD27L、CD70)、TNFSF8（CD30L、CD153)、TNFSF9（4-1BBL、APCs)、TNFSF10（TRAIL、Apo2L)、TNFSF11（RANKL、TRANCE、OPGL、ODF)、TNFSF12（TWEAK、Apo3L)、TNFSF13（APRIL、TALL-2, TRDL-1)、TNFSF13B（BAFF、BLYS, THANK)、TNFSF14（LIGHT、HVEML、LT-γ)、TNFSF15（VEGI、TL1A)、TNFSF18（GITRL）、EDA-A1、EDA-A2からなる群から選択される、 請求項１記載の胃幹細胞増殖培地。

【請求項4】

NF-κBシグナル経路の活性化因子が、TNFSF10（TRAIL、Apo2L)、TNFSF12（TWEAK、 Apo3L)からなる群から選択される、請求項１記載の胃幹細胞増殖培地。

【請求項5】

EGF－Erkシグナル阻害剤がEGF受容体キナーゼ阻害剤または Erk阻害剤である請求項１～４記載の胃幹細胞増殖培地。

【請求項6】

EGF－Erkシグナル阻害剤がエルロチニブ、または、SCH７７９２８４である請求項１～４記載の胃幹細胞増殖培地。

【請求項7】

請求項１～６の胃幹細胞増殖培地を用いた胃培養幹細胞の製造方法

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、胃幹細胞培養用培地、培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

胃は、食物を強酸性条件下でプロテアーゼにより分解するとともに付着菌を殺菌し、下流の腸管での栄養分の吸収を促進する特殊化した消化器官である。胃の内腔は複雑に入り組んだ胃腺と呼ばれる上皮細胞集団で覆われており、胃腺の上部に存在する表層粘液細胞はムチンと呼ばれる糖たんぱく質を大量に分泌して粘液層を形成し、胃液と隔離することで強酸性のタンパク質分解酵素液から胃組織を守っている。この表層粘液細胞はその下部に存在する頸部の幹細胞から常時供給されている。表層粘液細胞は、幹細胞から次々と分化して成熟化し、数日間で役目を終えて胃腺上部から脱落し新しい表層粘液細胞と入れ代る。胃は胃酸や消化酵素を分泌する胃体部と主にホルモンや粘液を分泌する幽門前庭部に区別されるが、胃体部の幹細胞は、頸部粘液細胞や胃酸を分泌する壁細胞、消化酵素を分泌する主細胞などにも分化すると考えられている。

【0003】

長年にわたる疾患研究では、永久に増殖するがん細胞株や短期間のみ培養可能な、増殖能が限られた成体組織の初代培養細胞が使用されてきた。ところが、小腸組織でLgr5陽性の幹細胞を試験管内で増殖させる培養条件が発見されたことを契機に（非特許文献１、特許文献１）、癌などの疾患臓器や正常組織から組織細胞を生体の外に取り出して、長期間増殖培養させて解析する新たな培養技術が開発されてきた。特に成体組織の増殖性の細胞を3次元培養で培養して増殖させることで、「オルガノイド」とよばれる生体ミニ組織を試験管内で培養により作り出す技術が急速に発達している。正常組織や疾患組織から様々な幹細胞を含む細胞を取り出して、試験管内で増やして分化させ、ミニ組織を作り出して詳細に解析すること、さらには治療薬を探索することが可能になってきた。小腸組織を試験管内で増殖させる培養条件が最適化され、また、Lgr5陽性細胞が他の組織にも存在することから、類似の培地で様々な組織がオルガノイドとして試験管内で培養される技術が開発されてきている。

【0004】

胃の幹細胞に関してもこのような培養方法が報告されている（非特許文献２－４）。具体的には、細胞増殖因子のWntやR-Spondin、FGF10、また、ペプチドホルモンであるガストリンなどが含まれている。しかし、これらの培地の多くは、動物血清や細胞培養上清を含んだ未確認成分を多く含む培地であり、ロット管理の面からも問題点が指摘されていた。また、培養で増殖させると自発的に分化して複数種の細胞が混在するようになり、その不均一性も培養上の課題と考えられていた。さらに、胃の幹細胞に特化した培地でないため、製造される幹細胞を選択的に増殖させる培地が存在しないことも課題となっていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】WO2010/090513

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Sato T et al. Nature, 459, 259-262, 2009

【非特許文献2】Baker N et al. Cell Stem Cell 6, 25-36, 2010

【非特許文献3】Huebner AJ et al. Nature Cell Biology 25, 390-403, 2023

【非特許文献4】Mahe, M. M. et al. Curr Protoc Mouse Biology 3, 217-240, 2013

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の課題は、動物血清や細胞培養上清などの未確認成分を含まない胃の幹細胞の増殖培地を提供することにある。また、製造される幹細胞を選択的に増殖させることで、培養した増殖細胞の不均一性を解決する胃の幹細胞増殖培地を提供することにある。さらに、これらの培地を用いた胃培養幹細胞の製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、化学成分と遺伝子組換え精製タンパク質のみを含む胃幹細胞増殖培地を見出し、本発明を完成させた。特に本発明は、幹細胞性を維持する因子としてTnfsf12やTNFαなどのNF-κBシグナル経路を活性化する因子を含む胃幹細胞増殖培地を提供する。また本発明は、幹細胞が表層粘液細胞へと分化するのを抑制するEGF-Erkシグナル阻害剤を含む胃幹細胞増殖培地を提供する。さらに本発明は、胃組織から作製された胃培養幹細胞を提供する。

【0009】

すなわち、本発明は以下の態様を含む。
[1] NF-κBシグナル経路の活性化因子及びEGF－Erkシグナル阻害剤のうちの少なくとも一種を含む胃幹細胞増殖培地。
[2] NF-κBシグナル経路の活性化因子が、TNFファミリーの遺伝子組換えタンパク質、インターロイキンファミリーの遺伝子組換えタンパク質、Betulinic acid、Prostratin、PMA、Calcimycin (A23187)からなる群から選択される、[1]記載の胃幹細胞増殖培地。
[3] NF-κBシグナル経路の活性化因子が、TNFSF1(TNF-α)、TNFSF2(TNF-β、LT-α)、TNFSF3（LT-β）、TNFSF4（OX40L、CD252、gp34)、TNFSF5（CD40L、CD154、gp39)、TNFSF6（FasL、CD95L、Apo1L)、TNFSF7（CD27L、CD70)、TNFSF8（CD30L、CD153)、TNFSF9（4-1BBL、APCs)、TNFSF10（TRAIL、Apo2L)、TNFSF11（RANKL、TRANCE、OPGL、ODF)、TNFSF12（TWEAK、Apo3L)、TNFSF13（APRIL、TALL-2, TRDL-1)、TNFSF13B（BAFF、BLYS, THANK)、TNFSF14（LIGHT、HVEML、LT-γ)、TNFSF15（VEGI、TL1A)、TNFSF18（GITRL）、EDA-A1、EDA-A2からなる群から選択される、 [1]記載の胃幹細胞増殖培地。
[4] NF-κBシグナル経路の活性化因子が、TNFSF10（TRAIL、Apo2L)、TNFSF12（TWEAK、 Apo3L)からなる群から選択される、[1]記載の胃幹細胞増殖培地。
[5] EGF－Erkシグナル阻害剤がEGF受容体キナーゼ阻害剤または Erk阻害剤である[1]-[4]記載の胃幹細胞増殖培地。
[6] EGF－Erkシグナル阻害剤がエルロチニブまたはSCH７７２９８４である[1]-[4]記載の胃幹細胞増殖培地。
[7] [1]-[6]の胃幹細胞増殖培地を用いた胃培養幹細胞の製造方法

【発明の効果】

【0010】

本発明の増殖培地により、胃の幹細胞を化学的に特定された成分のみを含む培地で幹細胞を安定かつ未分化な状態で長期に培養し増殖させることが可能となる。従って動物血清由来の未知の成分の混入に伴うロット管理の問題を克服し、市販培地として安定供給が容易となる

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１Aは、実施例１において、TNFSF12を添加したSTO培地、TNSFS12を含まないSTO培地で培養して作製した胃上皮細胞オルガノイドの顕微鏡写真である。図１B-Eは、作製した胃幹細胞オルガノイドにおけるKi67（図１B）, Gkn2（図１C）, Muc5ac（図１D）, Aqp3（図１E）の遺伝子発現を示す図である。図１Fは、作製した胃上皮細胞オルガノイドの凍結切片の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

【図2】図２Aは、実施例２において、TNFαを添加したSTO培地、TNFαを含まないSTO培地で培養して作製した胃上皮細胞オルガノイドの顕微鏡写真である。図２B-Eは、作製した胃幹細胞オルガノイドにおけるKi67（図２B）, Gkn2（図２C）, Muc5ac（図２D）, Aqp3（図２E）の遺伝子発現を示す図である。図２Fは、作製した胃上皮細胞オルガノイドの凍結切片の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

【図3】図３Aは、実施例３において、erlotinibを添加したSTO培地、erlotinibを含まないSTO培地で培養して作製した胃上皮細胞オルガノイドの顕微鏡写真である。図３B-Eは、作製した胃幹細胞オルガノイドにおけるKi67（図３B）, Gkn2（図３C）, Muc5ac（図３D）, Aqp3（図３E）の遺伝子発現を示す図である。図３Fは、作製した胃上皮細胞オルガノイドの凍結切片の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

【図4】図４Aは、実施例４において、SCH772984を添加したSTO培地、SCH772984を含まないSTO培地で培養して作製した胃上皮細胞オルガノイドの顕微鏡写真である。図４B-Eは、作製した胃幹細胞オルガノイドにおけるKi67（図４B）, Gkn2（図４C）, Muc5ac（図４D）, Aqp3（図４E）の遺伝子発現を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。

【0013】

本発明の第１態様に係る胃幹細胞増殖培地は、NF-κB（Nuclear factor-kappa B）シグナル経路の活性化因子及びEGF－Erk（Epidermal growth factor- Extracellular signal-regulated kinase）シグナル阻害剤のうちの少なくとも一種を含む。

【0014】

前記NF-κBシグナル経路の活性化因子は、TNF（Tumor Necrosis Factor）ファミリーの遺伝子組換えタンパク質やインターロイキンファミリーの遺伝子組換えタンパク質、またBetulinic acid、Prostratin、PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate）、Calcimycin (A23187)などの低分子化合物からなる群から選ばれるNF-κBのアクチベーターのいずれか1つを使用すればよい。

【0015】

前記TNFファミリーの遺伝子組換えタンパク質は、TNFSF1(TNF-α)、TNFSF2(TNF-β、LT-α)、TNFSF3（LT-β）、TNFSF4（OX40L、CD252、gp34)、TNFSF5（CD40L、CD154、gp39)、TNFSF6（FasL、CD95L、Apo1L)、TNFSF7（CD27L、CD70)、TNFSF8（CD30L、CD153)、TNFSF9（4-1BBL、APCs)、TNFSF10（TRAIL、Apo2L)、TNFSF11（RANKL、TRANCE、OPGL、ODF)、TNFSF12（TWEAK、Apo3L)、TNFSF13（APRIL、TALL-2、TRDL-1)、TNFSF13B（BAFF、BLYS、THANK)、TNFSF14（LIGHT、HVEML、LT-γ)、TNFSF15（VEGI、TL1A)、TNFSF18（GITRL）、EDA-A1、EDA-A2が挙げられ、好ましくはTNFSF10（TRAIL、Apo2L)、TNFSF12（TWEAK、Apo3L)であり、さらに好ましくはTNFSF12（TWEAK、Apo3L)である。

【0016】

前記インターロイキンファミリーの遺伝子組換えタンパク質としては、IL-1A、IL-1B、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-36、IL-37、IL-38、L-39が挙げられる。

【0017】

上記第１態様に係る胃幹細胞増殖培地のEGF－Erkシグナル阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのEGF活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上の阻害活性を有する。EGF－Erkシグナル阻害活性は、当業者にとって公知の方法（参考文献： Chen et al., Kidney International 82(1):45-52, ２０１２.）を用いて、EGF受容体やERKタンパク質のリン酸化状態をウエスタンブロッティング等により測定することによって、評価することができる。

【0018】

本実施形態の胃幹細胞増殖培地に含まれるEGF－Erkシグナル阻害剤としては、選択性の高い阻害剤であることが好ましく、例えば、EGF受容体キナーゼ阻害剤であるゲフィチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ（Erlotinib）やErk阻害剤であるラボキセルチニブ（ＧＤＣ０９９４）、ＳＣＨ９００３５３（ＭＫ８３５３）、ウリキセルチニブ、ＡＺＤ０３６４（ＡＴＧ０１７）、ＶＸ－１１ｅ（ＶＴＸ－１１３）、ＣＣ－９０００３、ＬＹ３２１４９９６、ＦＲ１８０２０４、ＡＳＮ００７、ＤＥＬ－２２３７９、ＶＸ－１１ｅ（ＴＣＳ ＥＲＫ １１ｅ）、ＥＲＫ５－ＩＮ－１、ＸＭＤ８－９２、ＳＣ１ (プルリポチン(pluripotin))、ＢＩＸ ０２１８９、SCH772984、ＨＥＲ２阻害薬であるラパチニブ、トラスツズマブ等が挙げられる。

【0019】

本実施形態の胃幹細胞増殖培地に含まれるEGF－Erkシグナル阻害剤の濃度は、1ｎM以上１００μM以下であることが好ましく、５ｎM以上２０μM以下であることがより好ましく、２０ｎM以上１０μM以下であることがさらに好ましい。幹細胞の培養中、３日毎に増殖培地を新鮮なものに交換してEGF－Erkシグナル阻害剤を増殖培地に添加することが好ましい。

【0020】

本実施形態の胃幹細胞増殖培地に含まれる NF-κBシグナル経路の活性化因子としてTNFファミリーの遺伝子組換えタンパク質を用いる場合、TNFファミリーの遺伝子組換えタンパク質の濃度は、１ｎｇ/mL以上３０００ｎｇ/mL以下であることが好ましく、３ｎｇ/mL以上１０００ｎｇ/mL以下であることがより好ましく、１０ｎｇ/mL以上３００ｎｇ/mL以下であることがさらに好ましい。幹細胞の培養中、３日毎に増殖培地を新鮮なものに交換してTNFファミリーの遺伝子組換えタンパク質を増殖培地に添加することが好ましい。

【0021】

本実施形態の胃幹細胞増殖培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、これらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。

【0022】

本実施形態の胃幹細胞増殖培地には、血清代替物を含有することができる。血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができ、また市販品を利用してもよい。市販の血清代替物としては、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（ＴＭ） Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＴＭ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｂ２７（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、１×Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等が挙げられる。

【0023】

本実施形態の胃幹細胞増殖培地には、Ｗｎｔシグナル増強剤を更に含んでいてもよい。Ｗｎｔシグナル増強剤としては、例えば、Ｗｎｔファミリータンパク質、R-spondinファミリータンパク質、及びCHIR99021などのＧＳＫ－３β阻害剤が挙げられる。

【0024】

前記Ｗｎｔファミリータンパク質としては、各種生物由来のＷｎｔタンパク質を用いることができる。生物由来のＷｎｔタンパク質中でも、哺乳類動物由来のＷｎｔタンパク質であることが好ましい。哺乳類動物のＷｎｔタンパク質としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６等が挙げられる。中でもＷｎｔ３ａが好ましい。

【0025】

本実施形態の胃幹細胞増殖培地には、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ／ＢＭＰ）阻害剤を更に含んでいてもよい。

【0026】

前記BMP阻害剤は、BMP受容体セリンスレオニンキナーゼ阻害剤であるK02288、LDN-214117、LDN-193189、ML347、LDN-212854、Dorsomorphin、DMH1からなる群から選ばれる少なくとも一種であってもよい。あるいは、BMPシグナルを阻害するBMP結合タンパク質であるコーディンドメインを含むコーディン様タンパク質（ノギン、グレムリン、コーディン）に加えて、フォリスタチンやフォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、ＤＡＮやＤＡＮシステインノットドメインを含むＤＡＮ様タンパク質、スクレロスチン／ＳＯＳＴ、及びα－２マクログロブリンからなる群から選ばれる少なくとも一種であってもよい。

【0027】

本実施形態の胃幹細胞増殖培地は、線維芽細胞増殖因子ファミリー由来の増殖因子（ＦＧＦ、例えばＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ９、または、ＦＧＦ１０）、Y-27632などのROCK阻害剤、Ｎ－アセチルシステイン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ガストリン、の1つまたは複数（またはすべて）をさらに含んでもよい。

【0028】

本発明の第２態様に係る胃培養幹細胞の製造方法は、NF-κBシグナル経路の活性化因子及びEGF－Erkシグナル阻害剤のうちの少なくとも一種を含む増殖培地で胃組織を培養する工程を含む。本発明に係る胃幹細胞増殖培地は、胃幹細胞を安定かつ未分化な状態で長期に培養し、増殖させることが可能となるものである。本発明に係る胃培養幹細胞の製造方法は、本発明に係る胃幹細胞増殖培地を用いるほかは、非特許文献２－４に開示されるような、定法にしたがって行えばよい。

【実施例0029】

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0030】

［実施例１］
（1-1）胃幹細胞培地の調製
非特許文献４に記載の消化管上皮細胞増殖培地に各種細胞増殖因子や低分子阻害剤等を添加して胃幹細胞培地を調製した。具体的には、市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、１/１００量のN2（Nacalai tesque）と１/１００量のNeuroBrew-21（Miltenyi Biotec）、終濃度１０ｍMとなるようにHEPESを添加し、終濃度１００U/mL penicillinと終濃度１００μg/mL streptomycinとなるようにそれぞれを添加した。さらに、以下の細胞増殖因子の遺伝子組換えタンパク質を各記載の終濃度となるよう添加した。100 ng/mL Wnt3aタンパク質（R&D Systems）、1 mg/mL R-spondin1タンパク質、100 ng/mL FGF10、10 nM gastrin（Sigma）。さらにBMPシグナル阻害剤であるLDN-193189（Hello Bio）を終濃度0.1 μMとなるように添加し、終濃度1 mM N-acetylcysteine（Sigma Aldrich）、終濃度10 μM Y-27632（BLD Pharm）となるよう各低分子化合物を添加して、「STO培地」を作製した。

【0031】

(1-2)TNFSF12添加培地の作製
実施例(1-1)に記載のSTO培地にTNFSF12を添加した培地を作製した。また、コントロールとしてTNFSF12を含まない培地を用意した。

【0032】

(1-3)TNFSF12添加培地による胃上皮細胞オルガノイドの培養
非特許文献４に記載の方法に従って、C57BL/6Jの成体マウス（日本SLC）の胃組織から胃腺を回収し、マトリゲル(Corning社製)に包埋した。胃腺を含むマトリゲルは24ウェルプレートに播種し、(実施例1-2)で調製した、TNFSF12添加したSTO培地で6日間培養して胃上皮細胞オルガノイドを作製した。また、ネガティブコントロールとして、TNSFS12を含まないSTO培地で同様に培養した(図1A)。

【0033】

作製した胃幹細胞オルガノイドの性状を確認するため、オルガノイドからRNAを抽出し、遺伝子発現を定量的RT-PCRにて確認した。その結果、TNFSF12添加STO培地で培養した胃上皮細胞オルガノイドは、コントロールと比較して、胃の幹細胞マーカーであるKi67の発現が上昇しており(図1B)、分化した表層粘液細胞マーカーであるGkn2やMuc5ac、Aqp3の発現が減少していた(図1C、D、E)。

【0034】

また、作製した胃上皮細胞オルガノイドの凍結切片を作製し、KI67の特異的抗体を用いて免疫蛍光染色を行ったところ、TNFSF12添加STO培地で培養した胃上皮オルガノイドは、KI67陽性の幹細胞の数が増加することが示された(図１F)。以上のことから、本発明のTNFSF12を添加した幹細胞増殖培地は、胃組織幹細胞の分化を抑制し、幹細胞を選択的に増殖させる培地であることが明らかとなった。

【0035】

なお、RT-qPCRに用いたプライマー配列は以下の通りである。
Muc5ac Fw: CAGGACTCTCTGAAATCGTACCA
Muc5ac Rv: AAGGCTCGTACCACAGGGA
Gkn2 Fw: ATGAAACCCCTCGTGGCATTT
Gkn2 Rv: TGTCTCCTGGATATTGCCTCC
Ki67 Fw: ATCATTGACCGCTCCTTTAGGT
Ki67 Rv: GCTCGCCTTGATGGTTCCT
Stmn1 Fw: TCTGTCCCCGATTTCCCCC
Stmn1 Rv: AGCTGCTTCAAGACTTCCGC

【0036】

［実施例２］
(2-1) TNFα添加培地の作製
実施例(1-1)に記載のSTO培地に、TNFαを添加した培地を用意した。また、ネガティブコントロールとしてTNFαを含まないSTO培地を用意した。

【0037】

(2-2) TNFα添加培地による胃上皮細胞オルガノイドの培養
非特許文献４に記載の方法に従って、C57BL/6Jの成体マウス胃組織から胃腺を回収し、マトリゲルに包埋した。胃腺を含むマトリゲルは24ウェルプレートに播種し、(2-1)で作製したTNFαを添加したSTO培地で6日間培養して胃上皮細胞オルガノイドを作製した。また、ネガティブコントロールとして、TNFαを含まないSTO培地で同様に培養した(図2A)。

【0038】

作製した胃上皮細胞オルガノイドの遺伝子発現を定量的RT-PCRにて確認した。使用したプライマーは(1-2)に記載したものと同じである。その結果、TNFαを添加したSTO培地で培養した胃上皮オルガノイドは、コントロールと比較して、胃の幹細胞マーカーであるKi67の発現が上昇し (図2B)、分化した表層粘液細胞マーカーであるGkn2やMuc5ac、Aqp3の発現が減少していた(図2C、D、E)。また、胃上皮細胞オルガノイドの凍結切片を作製し、KI67の特異的抗体を用いて免疫抗体染色を行った結果、TNFαを添加したSTO培地で培養した胃上皮オルガノイドではKI67陽性の細胞数が増加することが明らかになった(図２F)。すなわち、本発明のTNFαを添加した細胞増殖培地は、胃組織幹細胞の分化を抑制し、選択的に幹細胞を増殖させることが明らかになった。

【0039】

［実施例３］
(3-1)EGFR阻害剤erlotinib添加培地の作製
実施例(1-1)に記載のSTO培地に、EGFR阻害剤であるerlotinibを添加した培地を用意した。また、ネガティブコントロールとしてerlotinibを含まないSTO培地を用意した。

【0040】

(3-2)EGFR阻害剤erlotinib添加培地による胃上皮オルガノイドの培養
非特許文献４に記載の方法に従って、C57BL/6Jの成体マウス胃組織から胃腺を回収し、マトリゲルに包埋した。胃腺を含むマトリゲルは24ウェルプレートに播種し、(3-1)で作製したerlotinibを添加したSTO培地で6日間培養して胃上皮オルガノイドを作製した。また、ネガティブコントロールとして、erlotinibを含まないSTO培地で同様に培養した(図3A)。

【0041】

作製した胃上皮細胞オルガノイドの遺伝子発現を定量的RT-PCRにて解析した。使用したプライマーは(1-2)に記載したものと同じである。その結果、erlotinibを添加した培地で培養した胃上皮細胞オルガノイドは、コントロールと比較して、胃の幹細胞マーカーであるKi67の発現が上昇しており(図3B)、分化した表層粘液細胞マーカーであるGkn2やMac5ac、Aqp3の発現が減少していた(図3C、D、E)。続いて、胃上皮細胞オルガノイドの凍結切片を作製し、KI67の特異的抗体で免疫蛍光染色を行ったところ、erlotinibを添加したSTO培地で培養した胃上皮細胞オルガノイドでは、KI67陽性の細胞数が増加することが明らかになった(図３F)。すなわち、本発明のerlotinibを添加したSTO培地は、胃腺の幹細胞の分化を抑制することが明らかになった。

【0042】

(実施例４)
(4-1)ERK阻害剤SCH772984添加培地の作製
実施例(1-1)に記載のSTO培地に、ERK阻害剤であるSCH772984を添加した培地を用意した。また、ネガティブコントロールとしてSCH772984を含まない培地を用意した。

【0043】

(4-2)ERK阻害剤SCH772984添加培地による胃上皮細胞オルガノイドの培養
非特許文献４に記載の方法に従って、C57BL/6Jの成体マウス胃組織から胃腺を回収し、マトリゲルに包埋した。胃腺を含むマトリゲルは24ウェルプレートに播種し、(4-1)で作製したSCH772984を添加したSTO培地で6日間培養して胃上皮細胞オルガノイドを作製した。また、コントロールとして、SCH779284を含まないSTO培地で同様に培養した(図4A)。

【0044】

作製した胃上皮細胞オルガノイドの遺伝子発現を定量的RT-PCRにて解析した。使用したプライマーは(1-2)に記載したものと同じである。その結果、erlotinibを添加した培地で培養した胃上皮細胞オルガノイドは、コントロールと比較して、胃の幹細胞マーカーであるKi67の発現が上昇しており(図4B)、分化した表層粘液細胞マーカーであるGkn2やMuc5ac、Aqp3の発現が減少していた(図4C、D、E)。すなわち、本発明のSCH772984を添加したSTO培地は、胃腺の幹細胞の分化を抑制することが明らかになった。

【産業上の利用可能性】

【0045】

本発明の胃幹細胞増殖培地を使用することにより、幹細胞を安定かつ未分化な状態で長期に培養し増殖させることが可能となる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【手続補正書】

【提出日】2023-12-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0035】

なお、RT-qPCRに用いたプライマー配列は以下の通りである。
Muc5ac Fw: CAGGACTCTCTGAAATCGTACCA （配列番号１）
Muc5ac Rv: AAGGCTCGTACCACAGGGA （配列番号２）
Gkn2 Fw: ATGAAACCCCTCGTGGCATTT （配列番号３）
Gkn2 Rv: TGTCTCCTGGATATTGCCTCC （配列番号４）
Ki67 Fw: ATCATTGACCGCTCCTTTAGGT （配列番号５）
Ki67 Rv: GCTCGCCTTGATGGTTCCT （配列番号６）
Stmn1 Fw: TCTGTCCCCGATTTCCCCC （配列番号７）
Stmn1 Rv: AGCTGCTTCAAGACTTCCGC （配列番号８）

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

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