特開 2024-180153 角化促進用医薬組成物、及びザクロ種子エキスを含有する角化促進用医薬組成物の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024180153

(43)【公開日】2024-12-26

(54)【発明の名称】角化促進用医薬組成物、及びザクロ種子エキスを含有する角化促進用医薬組成物の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/185 20060101AFI20241219BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241219BHJP

【ＦＩ】

A61K36/185

A61P17/00

A61P17/02

A61P43/00 105

【審査請求】有

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023099632

(22)【出願日】2023-06-16

(71)【出願人】

【識別番号】397021235

【氏名又は名称】株式会社サニープレイス

(74)【代理人】

【識別番号】100123652

【弁理士】

【氏名又は名称】坂野 博行

(72)【発明者】

【氏名】向井 信人

(72)【発明者】

【氏名】西本 壮吾

(72)【発明者】

【氏名】湊 律子

【テーマコード（参考）】

4C088

【Ｆターム（参考）】

4C088AB12

4C088AC04

4C088CA03

4C088CA04

4C088CA05

4C088CA06

4C088CA07

4C088CA08

4C088CA09

4C088CA11

4C088MA63

4C088NA14

4C088NA20

4C088ZA89

4C088ZB21

(57)【要約】

【課題】
本発明の目的は、廃棄されるザクロ種子の有効活用及び付加価値化をめざして角化を促進する作用を有する組成物を提供することにある。
【解決手段】
本発明の角化促進用医薬組成物は、ザクロ種子エキスを含有することを特徴とする。また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、ケラチンタンパク質のｍRNA発現レベルを増加することにより、角化を促進することを特徴とする。また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、前記ケラチンタンパク質は、KRT-１、又はKRT-１０であることを特徴とする。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ザクロ種子エキスを含有する角化促進用医薬組成物。

【請求項2】

ケラチンタンパク質のｍRNA発現レベルを増加することにより、角化を促進することを特徴とする請求項1記載の角化促進用医薬組成物。

【請求項3】

前記ケラチンタンパク質は、KRT-１、又はKRT-１０であることを特徴とする請求項1又は２に記載の角化促進用医薬組成物。

【請求項4】

さらに、角化膜の形成を促進することを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の角化促進用医薬組成物。

【請求項5】

さらに、角化膜形成関連遺伝子のｍRNA発現レベルを増加することを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の角化促進用医薬組成物。

【請求項6】

前記角化膜形成関連遺伝子は、INV遺伝子（インボルクリン遺伝子）、LOR遺伝子（ロリクリン遺伝子）、TGM-1遺伝子（トランスグルタミナーゼ-１遺伝子）からなる群から選択される少なくとも1種であることを特徴とする請求項１～5のいずれか一項に記載の角化促進用医薬組成物。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物を有効成分とすることを特徴とする医薬部外品。

【請求項8】

ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物を溶媒中に浸漬した後、上清を分取する工程と、前記上清を分取することによりザクロ種子エキスを得る工程と、得られたザクロ種子エキスを有効的な量に調整する工程と、を有することを特徴とするザクロ種子エキスを含有することを特徴とする角化促進用医薬組成物の製造方法。

【請求項9】

溶媒が、酢酸エチル、酢酸エチル-ヘキサン、酢酸エチル-メタノール、エタノール、メタノール、ヘキサン、水からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項８記載の方法。

【請求項10】

溶媒がエタノールであり、前記エタノールで抽出したザクロ種子エタノールエキスを、さらに、酢酸エチルと水で分配して、前記酢酸エチル層を減圧濃縮して、酢酸エチル画分としてザクロ種子エキスを得ることを特徴とする請求項６記載の方法。

【請求項11】

さらに、前記酢酸エチル画分を、ヘキサンとメタノールで分配して、酢酸エチル-ヘキサン画分及び酢酸エチル-メタノール画分として、ザクロ種子エキスを得る請求項１０記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、角化促進用医薬組成物、及び角化促進用医薬組成物の製造方法に関し、特に、真皮における、ザクロ種子エキスを含有する角化促進用医薬組成物、及び角化促進用医薬組成物の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ザクロは果実全体に対して種子がかなりの割合を占める果実であるが、原則として、搾汁後に残る種子は廃棄されている。ザクロ種子を利用した少ない例として、ザクロ種子エキスを用いたサプリメント提案システムであって、提案サプリメント演算手段が、希望事項情報が美容の場合には、提案サプリメントとして、マルチビタミン、マルチミネラル、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＰ、ナイアシン、ビオチン、コラーゲン、エラスチン、ポリフェノール、パントテン酸、ヒアルロン酸、アセチルグルコサミン、イノシトール、コエンザイムＱ１０、αカロチン、βカロチン、大豆サポニン、ロイヤルゼリー、ツイントース、葉酸、バラ花弁エキス、ザクロ種子エキス、ブラックコホッシュエキス、大豆イソフラボン、葛イソフラボンスクワレン、ビール酵母、コロハエキス、カルシウム、マグネシウム、銅、鉄、亜鉛、マンガン、とから成る群の少なくとも１つを出力するサプリメント提案システムが知られている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１１-２３２９８９

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、現在のところ多くの場合、ザクロ種子は原則として、廃棄物として処理されており、前記特許文献以外は、有効に利用されていないのが現状である。一方で、廃棄物の有効利用が見直されている。

【0005】

また、近年、アトピー性皮膚炎（AD）が、角化関連遺伝子であるフィラグリン（FLG）の機能欠失変異によって生じることが判明し、皮膚バリア機能の重要性が注目されている。かかる状況下、廃棄物たるザクロ種子が種々の疾患に対して効果的であれば、より有益となる。

【0006】

したがって、本発明の目的は、廃棄されるザクロ種子の有効活用及び付加価値化をめざして角化を促進する作用を有する組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記目的を達成するために、本発明者らは、ザクロ種子の有効活用について鋭意検討した結果、本発明を見出すに至った。

【0008】

すなわち、本発明の角化促進用医薬組成物は、ザクロ種子エキスを含有することを特徴とする。

【0009】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、ケラチンタンパク質のｍRNA発現レベルを増加することにより、角化を促進することを特徴とする。

【0010】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、前記ケラチンタンパク質は、KRT-１、又はKRT-１０であることを特徴とする。

【0011】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、さらに、角化膜の形成を促進することを特徴とする。

【0012】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、さらに、角化膜形成関連遺伝子のｍRNA発現レベルを増加することを特徴とする。

【0013】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、前記角化膜形成関連遺伝子は、INV遺伝子（インボルクリン遺伝子）、LOR遺伝子（ロリクリン遺伝子）、TGM-1遺伝子（トランスグルタミナーゼ-１遺伝子）からなる群から選択される少なくとも1種であることを特徴とする。

【0014】

また、本発明の医薬部外品は、本発明の角化促進用医薬組成物を有効成分とすることを特徴とする。

【0015】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の製造方法は、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物を溶媒中に浸漬した後、上清を分取する工程と、前記上清を分取することによりザクロ種子エキスを得る工程と、得られたザクロ種子エキスを有効的な量に調整する工程と、を有することを特徴とするザクロ種子エキスを含有することを特徴とする。

【0016】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の製造方法の好ましい実施態様において、溶媒が、酢酸エチル、酢酸エチル-ヘキサン、酢酸エチル-メタノール、エタノール、メタノール、ヘキサン、水からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。

【0017】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の製造方法の好ましい実施態様において、溶媒がエタノールであり、前記エタノールで抽出したザクロ種子エタノールエキスを、さらに、酢酸エチルと水で分配して、前記酢酸エチル層を減圧濃縮して、酢酸エチル画分としてザクロ種子エキスを得ることを特徴とする。

【0018】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の製造方法の好ましい実施態様において、さらに、前記酢酸エチル画分を、ヘキサンとメタノールで分配して、酢酸エチル-ヘキサン画分及び酢酸エチル-メタノール画分として、ザクロ種子エキスを得ることを特徴とする。

【発明の効果】

【0019】

本発明の角化促進用医薬組成物によれば、従来廃棄物として処理されていたザクロ種子を有効利用することが可能であるという有利な効果を奏する。また、本発明の角化促進用医薬組成物によれば、角化を促進する作用を有し、ひいては角化膜を促進する作用をも有するという有利な効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、HaCaTにおけるKRT-1のmRNA発現レベルを示す。（n=3、平均値±標準誤差、*p < 0.05 vs Control）

【図2】図２は、HaCaTにおけるKRT-10のmRNA発現レベルを示す。（n=3、平均値±標準誤差、*p < 0.05、**p < 0.01 vs Control）

【図3】図３は、HaCaTにおけるKRT-6のmRNA発現レベルを示す。（n=3、平均値±標準誤差）

【図4】図４は、HaCaTにおけるCE形成評価を示す。（n=3、平均値±標準誤差、*p < 0.05、**p < 0.01 vs Control）

【図5】図５は、HaCaTにおけるLORのmRNA発現レベルを示す。（n=3、平均値±標準誤差、*p < 0.05 vs Control）

【図6】図６は、HaCaTにおけるIVNのmRNA発現レベルを示す。（n=3、平均値±標準誤差、*p < 0.05 vs Control）

【図7】図７は、HaCaTにおけるTGM-1のmRNA発現レベルを示す。（n=3、平均値±標準誤差、*p < 0.05 vs Control）

【図8】図８は、画分調製のフローチャートと収率を示す。Ｆ１～Ｆ４は、収量の多いＰＳＥ-ＥＡ-Ｈを分配して得られたものである。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本発明の角化促進用医薬組成物は、ザクロ種子エキスを含有することを特徴とする。ザクロ種子エキスは、ザクロの種子由来のエキスである。本発明に適用するザクロ種子エキスは、ザクロの種子由来である限り、総てのザクロ種子エキスを対象とする。

【0022】

また、対象となる細胞としては、特に限定されないが、特に有効に作用するのは、皮膚の細胞である。したがって、本明細書において主として皮膚の細胞について説明するがこれらに限定される意図ではない。

【0023】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、ケラチンタンパク質のｍRNA発現レベルを増加することにより、角化を促進することを特徴とする。また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、前記ケラチンタンパク質は、KRT-１、又はKRT-１０であることを特徴とする。

【0024】

ヒトの上皮細胞系において、細胞骨格蛋白としてケラチンが産生されている。ケラチンには現時点で21種類のタイプが判明しており、一部例外除いて分子量の比較的大きな塩基性ないしtypeIIケラチン群（KRT-1～8）と分子量が比較的小さな酸性ないしtypeIケラチン群（KRT-9～21）が特定のペアで二量体を形成することで中間径繊維となるとされている。ヒトケラチノサイトにおいて角化（分化）が進行すると、発現されるケラチンのタイプが変化し、基底細胞（未分化状態）では主に KRT-5、14から成るところ、分化した有棘細胞では KRT-1、10のペアが発現されるようになる（終末角化に至るとこれらは一部プロテアーゼにより分解され、細かな蛋白となり角質細胞を形成する）。

【0025】

本発明においては、後述する実施例からも明らかなように、驚くべきことに、ザクロ種子エキスが存在することにより、ケラチンタンパク質のｍRNA発現レベル、例えば、KRT-1、10等のmRNA発現レベルを増加させることが可能であり、ひいては、角化を促進することが可能であることが判明したものである。

【0026】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、皮膚のバリア機能を向上するという観点から、さらに、角化膜の形成を促進することを特徴とする。

【0027】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、皮膚のバリア機能を向上するという観点から、さらに、角化膜形成関連遺伝子のｍRNA発現レベルを増加することを特徴とする。

【0028】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、前記角化膜形成関連遺伝子は、INV遺伝子（インボルクリン遺伝子）、LOR遺伝子（ロリクリン遺伝子）、TGM-1遺伝子（トランスグルタミナーゼ-１遺伝子）からなる群から選択される少なくとも1種であることを特徴とする。

【0029】

ケラチノサイトでは角化が進むにつれ角化膜（Cornified Envelope：CE）の形成も進行していくが、驚くべきことに、本発明においては、ザクロ種子エキスが存在することにより、角化膜形成関連遺伝子のｍRNA発現レベル、例えば、INV遺伝子（インボルクリン遺伝子）、LOR遺伝子（ロリクリン遺伝子）、TGM-1遺伝子（トランスグルタミナーゼ-１遺伝子）等のmRNA発現レベルを増加させることが可能であり、ひいては、角化膜形成を促進することが可能であることが判明したものである。

【0030】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物を、酢酸エチル、酢酸エチル-ヘキサン、酢酸エチル-メタノール、エタノール、メタノール、水、ヘキサンからなる群から選択される少なくとも1種の溶媒に浸漬して、上清を分取して前記ザクロ種子エキスを得たことを特徴とする。例えば、振とう抽出させることができる。振とう抽出において、例えば、約4℃等の低温室にてローテーターにセットして回転させながら抽出することができる。また、本発明の表皮における角化促進用医薬組成物の好ましい実施態様において、前記溶媒は、エタノールであることを特徴とする。

【0031】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の製造方法は、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物を溶媒中に浸漬した後、上清を分取する工程と、前記上清を分取することによりザクロ種子エキスを得る工程と、得られたザクロ種子エキスを有効的な量に調整する工程と、を有することを特徴とするザクロ種子エキスを含有することを特徴とする。

【0032】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の製造方法の好ましい実施態様において、溶媒が、酢酸エチル、酢酸エチル-ヘキサン、酢酸エチル-メタノール、エタノール、メタノール、ヘキサン、水からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。

【0033】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の製造方法の好ましい実施態様において、食品への応用・適用を想定する観点から、エタノールで抽出したザクロ種子エタノールエキスを、さらに、酢酸エチルと水で分配して、前記酢酸エチル層を減圧濃縮して、酢酸エチル画分としてザクロ種子エキスを得ることを特徴とする。

【0034】

また、本発明の角化促進用医薬組成物の製造方法の好ましい実施態様において、活性成分を同定するという観点から、さらに、前記酢酸エチル画分を、ヘキサンとメタノールで分配して、酢酸エチル-ヘキサン画分及び酢酸エチル-メタノール画分として、ザクロ種子エキスを得ることを特徴とする。

【0035】

なお、酢酸エチル-ヘキサン画分（ＰＳＥ－ＥＡ－Ｈ）、及び酢酸エチル-メタノール画分（ＰＳＥ－ＥＡ－Ｍｅ）とは、以下の通りである。すなわち、エタノールで抽出したザクロ種子エタノール抽出物（ＰＳＥ）を、分液漏斗を用いて酢酸エチルと水で分配し、酢酸エチル層の溶媒をエバポレーターにより減圧濃縮し、酢酸エチル画分（ＰＳＥ-ＥＡ）として、水層は溶媒を凍結乾燥し、水画分（ＰＳＥ-Ｗ）とした場合、ＰＳＥ-ＥＡ をヘキサンとメタノールで分配後、溶媒をそれぞれエバポレーターで減圧濃縮し、得られた画分を、酢酸エチル-ヘキサン画分（ＰＳＥ-ＥＡ-Ｈ）及び酢酸エチル-メタノール画分（ＰＳＥ-ＥＡ-Ｍｅ）とすることができる。

【0036】

ここで、まず、ザクロ種子エキスの調製方法の一例について説明する。まず、ザクロ種子を準備する。ザクロ種子は、必要に応じて洗浄し、乾燥する。乾燥は十分に行なうのが好ましい。後の粉砕を均質に行なうためである。

【0037】

次に、ザクロ種子を粉砕する。粉砕の方法は特に限定されず、ボールミル、ハンマーミル、ローラーミル、ロッドミル、サンプルミル、スタンプミル、ディスインテグレーター、乳鉢、冷却装置付きブレンダーなどの公知の粉砕機を用いることができる。なお、粉砕時における発熱により、ザクロ種子組成物の分解等が発生することも考えられることより、粉砕時間を数秒とし、十数回繰り返すことができる。

【0038】

次いで、ザクロ種子を粉砕し粉砕物を得た後、各種溶媒に前記粉砕物を浸漬する。この場合の溶媒は、特に限定されず、所望とする効果に対応して適宜溶媒を設定することができる。また、本発明のザクロ種子エキスの製造方法の好ましい実施態様において、溶媒が、酢酸エチル、酢酸エチル-ヘキサン、酢酸エチル-メタノール、エタノール、メタノール、ヘキサン、水からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。溶媒としては、酢酸エチル、酢酸エチル-ヘキサン、酢酸エチル-メタノール、エタノール、メタノール、水、へキサン、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンなどの極性、非極性溶媒を問わず挙げることができる。好ましくは、酢酸エチル、酢酸エチル-ヘキサン、酢酸エチル-メタノール、メタノール、エタノール、水等を挙げることができる。

【0039】

浸漬は、緩やかな攪拌下で行なうことができる。各種溶媒に前記粉砕物を浸漬して各種溶液を得る。各種溶液について、溶液の状態に応じて攪拌を行い、場合によりそのまま溶液を放置しても良い。攪拌する場合には、特に限定されないが、１０時間～４８時間、好ましくは、およそ1日（24時間）攪拌を持続させることができる。

【0040】

その後、上清を分取することによりザクロ種子エキスを得ることができる。必要に応じて、上清を蒸発乾固する。蒸発乾固は、エバポレーターを用いて、２０℃～６０℃、好ましくは、３７℃～４０℃の温浴上で行なうことができる。蒸発乾固することにより、ザクロ種子エキスを長期間保存することができる。

【0041】

ザクロ種子中に含まれる成分は、ザクロ種子を極性の異なる溶媒を用いて抽出することにより、その物性により振り分けられる。したがって、使用した溶媒により、ザクロ種子エキスの成分の種類及び含有量は異なる。

【0042】

また、本発明の医薬部外品は、本発明の組成物を有効成分とすることを特徴とする。本発明に適用可能な医薬部外品については、本発明の角化促進用医薬組成物を有効成分とする限り、特に限定されない。

【0043】

＜有効量＞
本発明による組成物は、有効的な量のザクロ種子エキス、及び適当な投与形態の形で調製される。

【0044】

本発明の組成物におけるザクロ種子エキスの投与量は、投与対象患者の病態及びその重篤度、投薬形態、選択した投与経路及び１日当たりの投与回数等により変更することができる。

【0045】

本発明の組成物におけるザクロ種子エキスの投与量は、マウスで実施する時、1000 mg/kg/day投与量に設定することができ、ヒトにおいては感受性の相違等により、更に低い量であることが好ましい。

【0046】

また、投与形態は、経口剤(タブレット、カプセル、被膜タブレット、顆粒、溶液、シロップ)、塗布のための軟膏やクリームなどを挙げることができる。投与対象患者は、皮膚の水分補給及びバリア機能という観点から、女性、男性、大人、子供等を問わず、対象とすることが可能である。

【0047】

投与形態には、従来の他の成分、例えば、安定保存剤、甘味料、着色剤、芳香料などを含むことができる。

【0048】

＜急性毒性試験＞
ザクロ種子エキスの含有成分については、リノレン酸も含まれる成分であるため毒性は認められないと考えられている。

【0049】

なお、略号については、以下の通りである。
・FBS：Fetal Bovine Serum
・F1：PSE-Ethyl Acetate-Hexane-Fraction 1 画分
・F2：PSE-Ethyl Acetate-Hexane-Fraction 2 画分
・F3：PSE-Ethyl Acetate-Hexane-Fraction 3 画分
・F4：PSE-Ethyl Acetate-Hexane-Fraction 4 画分
・HA：Hyaluronic Acid
・HABP：Hyaluronic Acid Binding Protein
・HAS：Hyaluronic Acid Synthase
・PBS：Phosphate Buffered Saline
・PSE：Punica gtanatum Seed Ethanol extract（ザクロ種子エタノール抽出物）
・PSE-Bu-Me：PSE-Butanol-Methanol 画分
・PSE-EA：PSE-Ethyl Acetate 画分
・PSE-EA-H：PSE-Ethyl Acetate-Hexane 画分
・PSE-EA-Me：PSE-Ethyl Acetate-Methanol 画分
・PSE-W：PSE-Water 画分
・UV：Ultraviolet

【実施例0050】

以下では本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されるものではない。

【0051】

実施例１
＜ザクロ種子抽出物の調製＞
＜試料＞
ザクロ種子：株式会社サニープレイスより入手
＜機器＞
ミルサー：岩谷産業株式会社製
ロータリーエバポレーター：EYELA 東京理化器械株式会社製
凍結乾燥機 FDU-1200：EYELA 東京理化器械株式会社製
＜試薬＞
100% Ethanol：和光純薬工業株式会社製
酢酸エチル：和光純薬工業株式会社製
ヘキサン：和光純薬工業株式会社製
メタノール：和光純薬工業株式会社製
シリカゲル（Wakasil（登録商標）60, 64-210μm）：和光純薬工業株式会社製
ＭｉｌｌｉＱ 水
＜器具＞
クロマトカラム フィルター付き (30φ×300mm)：コスモスビード製

【0052】

まず、溶媒として、エタノールを用いて、ザクロ種子エキスの調製を試みた。ザクロ種子を粉砕し、100%エタノールで振とう抽出した。これらを濃縮乾固して再溶解し、ザクロ種子エタノール抽出物として実験に供した。さらに、エタノールで抽出したザクロ種子エタノール抽出物（以下、ＰＳＥともいう。）を、分液漏斗を用いて酢酸エチルと水で分配し、酢酸エチル層の溶媒をエバポレーターにより減圧濃縮し、酢酸エチル画分（PSE-EA）として、水層は溶媒を凍結乾燥し、水画分（PSE-W）とした場合、PSE-EA をヘキサンとメタノールで分配後、溶媒をそれぞれエバポレーターで減圧濃縮し、得られた画分を、酢酸エチル-ヘキサン画分（以下、PSE-EA-Hともいう。）及び酢酸エチル-メタノール画分（以下、PSE-EA-Meともいう。）とした。具体的には、以下の通りである。

【0053】

＜PSE（Punica granatum Seed Ethanol extract）の調製方法＞
乾燥ザクロ種子をミルサーで粉末化し、10 倍量 100% エタノール（和光純薬工業株式会社製）を加え、4℃、24 時間で低温振盪抽出を行った。24 時間後、室温、3,000 rpm で 20 分間遠心分離を行い、上清を回収した。上清を減圧濃縮して得られた濃縮物をザクロ種子エタノール抽出物（PSE : Punica granatum Seed Ethanol extract）とした。

【0054】

＜酢酸エチル-ヘキサン画分（PSE-EA-H）及び酢酸エチル-メタノール画分（PSE-EA-Me）の調整方法＞
PSE 2.00gを、分液漏斗を用いて酢酸エチル（100ml×3）とMiliQ 水(100 ml）で分配し、酢酸エチル層の溶媒をエバポレーターにより減圧濃縮し、酢酸エチル画分（PSE-EA）とした。水層は溶媒を凍結乾燥し、水画分（PSE-W）とした。さらにPSE-EAをヘキサン（100ml×3）とメタノール（100ml）で分配後、溶媒をそれぞれエバポレーターで減圧濃縮し、酢酸エチル-ヘキサン画分（PSE-EA-H）と酢酸エチル-メタノール画分（PSE-EA-Me）を得た。収量の多いPSE-EA-Hをヘキサン（100ml）、ヘキサンと酢酸エチルの混合物（ヘキサン:酢酸エチル=９:１の場合（ヘキサン９０ｍＬ、酢酸エチル１０ｍＬ）、ヘキサン:酢酸エチル=８:２の場合（ヘキサン８０ｍＬ、酢酸エチル２０ｍＬ）、ヘキサン:酢酸エチル=６:４の場合（ヘキサン４０ｍＬ、酢酸エチル６０ｍＬ））、酢酸エチル（100ml）、メタノール（100ml）の順でカラム（30φ×300mm）に流し、分配した。下記の式より、画分の収率を算出し、画分調製のフローチャートを図３に示した。

【0055】

収率（％）＝（画分の質量（ｇ）/ PSEの質量（ｇ））×１００

【0056】

調製した抽出物は実験に使用するまで-20℃で冷凍保存した。

【0057】

このようにして得られたザクロ種子抽出物を使用して、皮膚機能性に関する研究として、表皮分化促進及びCE形成について調べた。

【0058】

＜研究概要＞
表皮基底層における細胞増殖の活性化は、ケラチノサイトの角化を促進し、ターンオーバー周期の短縮へと繋がる。PSEによる表皮角化細胞（HaCaT）の増殖を受け、細胞の角化促進に関わる遺伝子の発現について評価を実施した。

【0059】

ヒトの上皮細胞系において、細胞骨格蛋白としてケラチンが産生されている。ケラチンには現時点で21種類のタイプが判明しており、一部例外除いて分子量の比較的大きな塩基性ないしtypeIIケラチン群（KRT-1～8）と分子量が比較的小さな酸性ないしtypeIケラチン群（KRT-9～21）が特定のペアで二量体を形成することで中間径繊維となるとされている。ヒトケラチノサイトにおいて角化（分化）が進行すると、発現されるケラチンのタイプが変化し、基底細胞（未分化状態）では主に KRT-5、14から成るところ、分化した有棘細胞では、KRT-1、10のペアが発現されるようになる（終末角化に至るとこれらは一部プロテアーゼにより分解され、細かな蛋白となり角質細胞を形成する）。このことから本試験では角化マーカーとしてKRT-1、10のmRNA発現レベルを評価し、PSEが存在することによりこれらの発現が増強されるか検討した。また加えて、外傷等の刺激に晒された際に発現する KRT-6、16および17のうちKRT-6についても同様に評価を実施した。

【0060】

また、ケラチノサイトでは角化が進むにつれ角化膜（Cornified Envelope：CE）の形成も進行していく。表皮細胞は最終的に細胞膜を失い、角質細胞として生命活動を終了して剥がれ落ちる（ターンオーバー）が、細胞膜を裏打ちする形で徐々に角化膜を形成することで皮膚のバリア機能が維持されている。CEは外部刺激や細菌の侵入を防ぐために必要不可欠であるが、加齢やストレス、外部刺激によりその形成能は低下してしまうことから、CE 形成能の維持向上、回復は皮膚を健康状態に保つために非常に重要であるといえる。本試験では、PSE存在下の細胞における CE形成率を測定し、CE形成能の促進活性について検討した後、CEの構成成分であるロリクリン、インボルクリンの遺伝子（LOR、INV）とこれらのタンパク質を架橋する働きを担うトランスグルタミナーゼ-1の遺伝子（TGM-1）について発現評価を実施した。これらの遺伝子はケラチノサイトの角化マーカーとしても利用されている。

【0061】

＜実験方法＞
・遺伝子解析：PSE添加培養終了後、細胞をPBSで洗浄して回収し、RNA抽出、cDNA合成を行い、リアルタイムPCRを実施した。HaCaTの内在性コントロールには、GAPDH、KMST-6の内在性コントロールには、MRPL19を選択した。

【0062】

・CE 形成評価：PSE添加培養終了後、細胞を回収し、2%SDSを加えボルテックスミキサーにより細胞膜を破砕した。破砕液を90℃で10分加熱して310nmの透過率を測定し、Controlの値と比較することでCE形成率を算出した。

【0063】

＜実験結果＞
KRT-1 の遺伝子発現評価の結果を図１、KRT-10の結果を図２、KRT-6の結果を図３に示した。PSE存在下の細胞において、KRT-1、10の遺伝子発現レベル増加、KRT-6の発現増加傾向が見られた。KRT-1、10について、最も発現が増加したPSE 濃度はともに10μg/mLであり、増加幅はともに２倍以上であった。

【0064】

また、CE形成評価の結果を図４に示した。8μg/mL以上のPSE存在下で培養した細胞でCE形成の促進が確認された。CE関連遺伝子LORの発現評価結果を図５、INVの結果を図６、TGM-1の結果を図７に示した。遺伝子発現評価においては、LOR、INV、TGM-1の3種ともにPSE添加による遺伝子発現レベル増加が確認された。CE の構成成分であるロリクリン、インボルクリンの合成を促進させ、更にそれらを架橋させるトランスグルタミナーゼの発現を増強することにより、CE 形成が促進されたと考えられる。

【0065】

ケラチン系角化マーカーKRT-1、KRT-10、CE系角化マーカーLOR、INV、TGM-1の発現を増加させたことから、PSEはヒトケラチノサイトの角化を遺伝子レベルで促進させることが判明し、ターンオーバーの活性化を促す可能性が示唆された。加えて、創傷治癒に関与するタイプのケラチン（KRT-6）発現を増加させたことから、PSEによる傷の治癒促進への関与が示唆された。

【0066】

また、図８は、画分調製のフローチャートと収率を示す。Ｆ１～Ｆ４は、収量の多いＰＳＥ-ＥＡ-Ｈを分配して得られたものである。なお、PSE-EA-Hをさらに分画し、F1～F4が得られたとは、F1はヘキサンと酢酸エチルの8：2の混合物、F2はヘキサンと酢酸エチルの6：4の混合物、F3は酢酸エチル 100%、F4はメタノール100%でカラムを流した後、得られたものという意味である。これらのザクロ種子エキスにおいても同様の効果が得られた。

【産業上の利用可能性】

【0067】

本発明によると、医療業界の分野への貢献はもとより、廃棄物の有効利用等、社会的貢献度が高く、広範囲において利用価値が高い。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】