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特開2024-180376化合物、免疫増強剤、ワクチン組成物及び粘膜ワクチン組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024180376
(43)【公開日】2024-12-26
(54)【発明の名称】化合物、免疫増強剤、ワクチン組成物及び粘膜ワクチン組成物
(51)【国際特許分類】
C07H 15/04 20060101AFI20241219BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20241219BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20241219BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241219BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20241219BHJP
【ＦＩ】
C07H15/04 E
A61K39/39
A61P31/12
A61P37/04
A61K39/145
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024097222
(22)【出願日】2024-06-17
(31)【優先権主張番号】P 2023099628
(32)【優先日】2023-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2023099629
(32)【優先日】2023-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504258527
【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100168114
【弁理士】
【氏名又は名称】山中 生太
(74)【代理人】
【識別番号】100162259
【弁理士】
【氏名又は名称】末富 孝典
(74)【代理人】
【識別番号】100146916
【弁理士】
【氏名又は名称】廣石 雅紀
(72)【発明者】
【氏名】若尾 雅広
(72)【発明者】
【氏名】新地 浩之
(72)【発明者】
【氏名】隅田 泰生
【テーマコード（参考）】
4C057
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C057AA30
4C057BB02
4C057BB03
4C057BB04
4C057CC03
4C057DD01
4C057JJ09
4C085AA38
4C085BA55
4C085BB12
4C085CC08
4C085EE01
4C085FF14
4C085GG10
(57)【要約】
【課題】免疫細胞への高い移行性を有し、より効果的に免疫細胞を活性化することができる化合物を提供する。
【解決手段】化合物は、Ｃ型レクチン受容体に結合する複数の第１リガンド部分と、Ｔｏｌｌ様受容体に結合する第２リガンド部分と、複数の第１リガンド部分及び第２リガンド部分の各々が末端に結合した分岐構造を有するリンカーと、を有する。
【選択図】図２
【解決手段】化合物は、Ｃ型レクチン受容体に結合する複数の第１リガンド部分と、Ｔｏｌｌ様受容体に結合する第２リガンド部分と、複数の第１リガンド部分及び第２リガンド部分の各々が末端に結合した分岐構造を有するリンカーと、を有する。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃ型レクチン受容体に結合する複数の第１リガンド部分と、
Ｔｏｌｌ様受容体に結合する第２リガンド部分と、
前記複数の第１リガンド部分及び前記第２リガンド部分の各々が末端に結合した分岐構造を有するリンカーと、
を有する化合物。
Ｔｏｌｌ様受容体に結合する第２リガンド部分と、
前記複数の第１リガンド部分及び前記第２リガンド部分の各々が末端に結合した分岐構造を有するリンカーと、
を有する化合物。
【請求項2】
式（１）
（式（１）において、ＲＣは前記第１リガンド部分を有し、ＲＴは前記第２リガンド部分を有し、ｐ１～ｐ３は、それぞれ独立して０以上６以下の整数である。）
に示される構造を有する、
請求項１に記載の化合物。
【化1】
に示される構造を有する、
請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
前記第１リガンド部分の構造は、
グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される単糖が前記リンカーに結合した構造、又は
グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される１種若しくは複数種からなるオリゴ糖若しくは多糖が前記リンカーに結合した構造である、
請求項１又は２に記載の化合物。
グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される単糖が前記リンカーに結合した構造、又は
グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される１種若しくは複数種からなるオリゴ糖若しくは多糖が前記リンカーに結合した構造である、
請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
前記第２リガンド部分は、
Ｔｏｌｌ様受容体４、Ｔｏｌｌ様受容体７及びＴｏｌｌ様受容体８からなる群から選択される少なくとも１つに結合する、
請求項１又は２に記載の化合物。
Ｔｏｌｌ様受容体４、Ｔｏｌｌ様受容体７及びＴｏｌｌ様受容体８からなる群から選択される少なくとも１つに結合する、
請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項5】
前記第２リガンド部分の構造は、
１Ｖ２０９が前記リンカーに結合した構造である、
請求項１又は２に記載の化合物。
１Ｖ２０９が前記リンカーに結合した構造である、
請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項6】
Ｃ型レクチン受容体に結合する複数の第１リガンド部分と、
Ｔｏｌｌ様受容体に結合する第２リガンド部分と、
前記複数の第１リガンド部分及び前記第２リガンド部分の各々が末端に結合した分岐構造を有するリンカーと、
を有する化合物を含む、
免疫増強剤。
Ｔｏｌｌ様受容体に結合する第２リガンド部分と、
前記複数の第１リガンド部分及び前記第２リガンド部分の各々が末端に結合した分岐構造を有するリンカーと、
を有する化合物を含む、
免疫増強剤。
【請求項7】
ワクチン用アジュバントである、
請求項６に記載の免疫増強剤。
請求項６に記載の免疫増強剤。
【請求項8】
粘膜免疫増強剤である、
請求項６に記載の免疫増強剤。
請求項６に記載の免疫増強剤。
【請求項9】
粘膜ワクチン用アジュバントである、
請求項８に記載の免疫増強剤。
請求項８に記載の免疫増強剤。
【請求項10】
請求項７に記載の免疫増強剤と、
抗原と、
を含む、ワクチン組成物。
抗原と、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項11】
請求項９に記載の免疫増強剤と、
抗原と、
を含む、粘膜ワクチン組成物。
抗原と、
を含む、粘膜ワクチン組成物。
【請求項12】
鼻粘膜投与用である、
請求項１１に記載の粘膜ワクチン組成物。
請求項１１に記載の粘膜ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、化合物、免疫増強剤、ワクチン組成物及び粘膜ワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
新興性感染症又は再興性感染症に対するワクチン及びがん免疫療法薬の開発では、免疫システムを増強又は調節する薬剤が求められている。免疫システムは、自然免疫と獲得免疫から成り立っている。自然免疫の活性化が初期応答の起点となる。自然免疫は、自然免疫受容体（パターン認識受容体ともいう）が特定の分子パターンを認識することによって活性化される。自然免疫の活性化は、細胞性免疫、液性免疫等の獲得免疫を誘導することから、生体の免疫応答全般において重要である。自然免疫受容体は、免疫細胞の細胞表層及びエンドソームに発現している。自然免疫を活性化する様々な自然免疫受容体のリガンドは免疫制御薬として用いることができる。また、自然免疫受容体のリガンドは、ワクチン製剤に添加することで、免疫応答の有効性を高めるアジュバントとしても使用することができる。
【0003】
従来、自然免疫受容体のリガンドとして、病原因子関連分子の構造をもとに、糖類、脂質類、タンパク質類、核酸類等が用いられてきた。例えば、自然免疫受容体の１つであるＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）を活性化できる糖脂質（モノホスホリルリピッドＡ：ＭＰＬＡ、非特許文献１参照）又は核酸類（ＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＣｐＧ ＯＤＮ等、非特許文献２参照）をアジュバントとして利用する粘膜ワクチンが開発されている。
【0004】
抗原を粘膜に投与する粘膜ワクチンは、非侵襲的かつ簡便に投与できることに加え、粘膜系の局所免疫応答だけでなく全身性の免疫応答も誘導できることから、次世代型ワクチンとして期待されている（非特許文献３参照）。粘膜ワクチン用アジュバントとして、例えば、増粘作用のある糖類及び脂質、コレラトキシン等の毒素タンパク質、アルミニウム塩等の無機塩類が用いられてきた。これらは、拡散して粘膜組織の免疫細胞に取り込まれ免疫応答を誘導するが、免疫細胞の自然免疫受容体の活性化能を持たない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Rhea N. Coler, et al., Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant, PLoS One 6 (2011) e16333.
【非特許文献2】Neslihan Kayraklioglu et al., CpG Oligonucleotides as Vaccine Adjuvants, Methods in Molecular Biology 2197 (2021) 51-85
【非特許文献3】Marian R. Neutra and Pamela A. Kozlowski, Mucosal vaccines: the promise and the challenge, Nat. Rev. Immunol., 6, (2006) 148-158
【非特許文献4】Akihito Baba, et al., Synthesis and immunostimulatory activity of sugar-conjugated TLR7 ligands, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 30 (2020) 126840
【非特許文献5】R. L. Miller, et al., Imiquimod applied topically: a novel immune response modifier and new class of drug, Int. J. Immunopharmacol. 21 (1999) 1-14
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかし、糖類、脂質類、タンパク質類及び核酸類は、不均一であるため製剤化が難しいうえ、免疫細胞に対する移行性が低い。これに対し、非特許文献４では、疎水性のＴＬＲ７リガンドである１Ｖ２０９を糖と結合させることで、親水性が高まるとともに１Ｖ２０９の細胞内への取り込みが増加し、樹状細胞等の免疫細胞におけるサイトカインの分泌が、糖と結合していない１Ｖ２０９で処理した細胞よりも増強されることが報告されている。
【0007】
一方、臨床応用されている、自然免疫受容体を活性化できる薬剤には、ＭＰＬＡ、イミキモド（非特許文献５参照）等がある。ＭＰＬＡは脂溶性でエマルジョン製剤であるため、製剤の安定性に課題がある。また、イミキモドは局所投与に限られており、その適用範囲が非常に限られている。なお、ワクチンのアジュバントとして汎用されている薬剤としてアルム、スクワレン等があるが、これらはほとんど自然免疫受容体を活性化しない。
【0008】
また、粘膜ワクチンの開発では、粘膜組織下に存在する免疫細胞に対して、抗原を効率良く輸送し、免疫細胞を活性化するアジュバントの添加が不可欠である。これら両作用を有するアジュバントは、万能なユニバーサルアジュバントとして利用できるため、精力的に研究されているが、実用化には至っていない。
【0009】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、免疫細胞への高い移行性を有し、より効果的に免疫細胞を活性化することができる化合物及び免疫増強剤を提供することを目的とする。また、免疫細胞に対して、抗原を効率良く輸送し、免疫細胞を活性化することができるワクチン組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、粘膜組織下に存在する免疫細胞に対して、抗原を効率良く輸送し、免疫細胞を活性化することができる免疫増強剤及び粘膜ワクチン組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
（化合物）
本発明に記載された化合物は、
Ｃ型レクチン受容体に結合する複数の第１リガンド部分と、
Ｔｏｌｌ様受容体に結合する第２リガンド部分と、
前記複数の第１リガンド部分及び前記第２リガンド部分の各々が末端に結合した分岐構造を有するリンカーと、
を有する。
本発明に記載された化合物は、
Ｃ型レクチン受容体に結合する複数の第１リガンド部分と、
Ｔｏｌｌ様受容体に結合する第２リガンド部分と、
前記複数の第１リガンド部分及び前記第２リガンド部分の各々が末端に結合した分岐構造を有するリンカーと、
を有する。
【0011】
上記本発明に記載された化合物は、
式（１）
（式（１）において、ＲＣは前記第１リガンド部分を有し、ＲＴは前記第２リガンド部分を有し、ｐ１～ｐ３は、それぞれ独立して０以上６以下の整数である。）
に示される構造を有することとしてもよい。
式（１）
【化1】
に示される構造を有することとしてもよい。
【0012】
前記第１リガンド部分の構造は、
グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される単糖が前記リンカーに結合した構造、又は
グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される１種若しくは複数種からなるオリゴ糖若しくは多糖が前記リンカーに結合した構造であることとしてもよい。
グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される単糖が前記リンカーに結合した構造、又は
グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される１種若しくは複数種からなるオリゴ糖若しくは多糖が前記リンカーに結合した構造であることとしてもよい。
【0013】
前記第２リガンド部分は、
Ｔｏｌｌ様受容体４、Ｔｏｌｌ様受容体７及びＴｏｌｌ様受容体８からなる群から選択される少なくとも１つに結合することとしてもよい。
Ｔｏｌｌ様受容体４、Ｔｏｌｌ様受容体７及びＴｏｌｌ様受容体８からなる群から選択される少なくとも１つに結合することとしてもよい。
【0014】
前記第２リガンド部分の構造は、
１Ｖ２０９が前記リンカーに結合した構造であることとしてもよい。
１Ｖ２０９が前記リンカーに結合した構造であることとしてもよい。
【0015】
（免疫増強剤）
本発明に記載された免疫増強剤は、
Ｃ型レクチン受容体に結合する複数の第１リガンド部分と、
Ｔｏｌｌ様受容体に結合する第２リガンド部分と、
前記複数の第１リガンド部分及び前記第２リガンド部分の各々が末端に結合した分岐構造を有するリンカーと、
を有する化合物を含む。
本発明に記載された免疫増強剤は、
Ｃ型レクチン受容体に結合する複数の第１リガンド部分と、
Ｔｏｌｌ様受容体に結合する第２リガンド部分と、
前記複数の第１リガンド部分及び前記第２リガンド部分の各々が末端に結合した分岐構造を有するリンカーと、
を有する化合物を含む。
【0016】
本発明に記載された上記免疫増強剤は、
ワクチン用アジュバントであることとしてもよい。
ワクチン用アジュバントであることとしてもよい。
【0017】
本発明に記載された上記免疫増強剤は、
粘膜免疫増強剤であることとしてもよい。
粘膜免疫増強剤であることとしてもよい。
【0018】
本発明に記載された上記免疫増強剤は、
粘膜ワクチン用アジュバントであることとしてもよい。
粘膜ワクチン用アジュバントであることとしてもよい。
【0019】
（ワクチン組成物）
本発明に記載されたワクチン組成物は、
本発明に記載された上記免疫増強剤と、
抗原と、
を含む。
本発明に記載されたワクチン組成物は、
本発明に記載された上記免疫増強剤と、
抗原と、
を含む。
【0020】
（粘膜ワクチン組成物）
本発明に記載された粘膜ワクチン組成物は、
本発明に記載された上記免疫増強剤と、
抗原と、
を含む。
本発明に記載された粘膜ワクチン組成物は、
本発明に記載された上記免疫増強剤と、
抗原と、
を含む。
【0021】
本発明に記載された上記粘膜ワクチン組成物は、
鼻粘膜投与用であることとしてもよい。
鼻粘膜投与用であることとしてもよい。
【発明の効果】
【0022】
本発明に係る化合物及び免疫増強剤は、免疫細胞への高い移行性を有し、より効果的に免疫細胞を活性化することができる。本発明に係るワクチン組成物は、免疫細胞に対して、抗原を効率良く輸送し、免疫細胞を活性化することができる。本発明に係る免疫増強剤及び粘膜ワクチン組成物は、粘膜組織下に存在する免疫細胞に対して、抗原を効率良く輸送し、免疫細胞を活性化することができる。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】試験例１におけるマウス骨髄由来樹状細胞の糖鎖ＴＬＲリガンド複合体による処理で培養培地に実質的に添加されたＴｏｌｌ様受容体７リガンドの濃度に対するＩＬ－６の産生量を示す図である。
【図2】試験例２におけるオボアルブミン（ＯＶＡ）に対する糖鎖ＴＬＲリガンド複合体による免疫増強活性を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＯＶＡに対するＩｇＡ抗体産生価を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＯＶＡに対するＩｇＧ抗体産生価を示す。
【図3】試験例２におけるマウスの脾臓重量を示す図である。
【図4】試験例３におけるインフルエンザウイルス由来ヘマグルチニン（ＨＡ）に対する糖鎖ＴＬＲリガンド複合体による免疫増強活性を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＨＡに対するＩｇＡ抗体産生価を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＨＡに対するＩｇＧ抗体産生価を示す。
【図5】試験例４におけるインフルエンザワクチンＨＡに対する糖鎖ＴＬＲリガンド複合体による免疫増強活性を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＨＡに対するＩｇＡ抗体産生価を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＨＡに対するＩｇＧ抗体産生価を示す。
【図6】試験例５における鼻腔粘膜に産生された抗体のウイルス中和活性評価の結果を示す図である。
【図7】試験例６におけるマウスを用いたインフルエンザウイルス感染防御試験の結果を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ感染後のマウスの体重の経時変化及び生存率を示す。
【図8】試験例７におけるマウスを用いたインフルエンザウイルス感染防御試験の結果を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ感染後のマウスの体重の経時変化及び生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。各図面においては、同一又は同等の部分には同一の符号が付される。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。
【0025】
本実施の形態に係る免疫増強剤は化合物を含む。当該化合物は、Ｃ型レクチン受容体（以下、“ＣＬＲ”ともいう）に結合する第１リガンド部分としてのＣＬＲリガンド部分と、ＴＬＲに結合する第２リガンド部分としてのＴＬＲリガンド部分と、を有する。分子構造内においてＴＬＲリガンド部分はＣＬＲリガンド部分にリンカーを介して連結されている。ＣＬＲリガンド部分とＴＬＲリガンド部分とがリンカーを介して連結されているとは、ＣＬＲリガンドを構成する少なくとも１つの原子及びＴＬＲリガンドを構成する少なくとも１つの原子それぞれがリンカーを構成する原子に結合又は置換していることをいう。ＣＬＲリガンド部分とは、ＣＬＲリガンドを構成する原子のうち、リンカーとの結合に供されていない残りの原子からなる原子団をいう。同様に、ＴＬＲリガンド部分とは、ＴＬＲリガンドを構成する原子のうち、リンカーとの結合に供されていない残りの原子からなる原子団をいう。
【0026】
例えば、上記化合物の構造は、下記式（２）に示される。
ＬＣ－Ｌ－ＬＴ 式（２）
式（２）において、ＬＣはＣＬＲリガンド部分を示す。Ｌはリンカーを示す。ＬＴはＴＬＲリガンド部分を示す。
ＬＣ－Ｌ－ＬＴ 式（２）
式（２）において、ＬＣはＣＬＲリガンド部分を示す。Ｌはリンカーを示す。ＬＴはＴＬＲリガンド部分を示す。
【0027】
好ましくは、上記化合物は、１分子あたり複数のＣＬＲリガンド部分を有する。複数のＣＬＲリガンド部分は、すべて同じであってもよいし、互いに構造が異なるＣＬＲリガンド部分であってもよい。化合物が１分子あたり複数のＣＬＲリガンド部分を有する場合、例えば、複数のＣＬＲリガンド部分をＬＣ１及びＬＣ２とすると、当該化合物の構造は、下記式（３）に示される。
ＬＣ１－Ｌ（－ＬＣ２）－ＬＴ 式（３）
式（３）において、Ｌはリンカーを示す。ＬＴはＴＬＲリガンド部分を示す。式（２）及び式（３）において、ＬＣ、ＬＣ１及びＬＣ２はそれぞれＣＬＲリガンドを構成する少なくとも１つの原子がリンカーを構成する原子に置換している構造である。式（２）及び式（３）において、ＬＴはＴＬＲリガンドを構成する少なくとも１つの原子がリンカーを構成する原子に置換している構造である。言い換えると、ＣＬＲリガンド部分及びＴＬＲリガンド部分は、リンカーとの結合によって、本実施の形態に係る化合物の構造にそれぞれＣＬＲリガンドに由来する構造及びＴＬＲリガンドに由来する構造として含まれる。
ＬＣ１－Ｌ（－ＬＣ２）－ＬＴ 式（３）
式（３）において、Ｌはリンカーを示す。ＬＴはＴＬＲリガンド部分を示す。式（２）及び式（３）において、ＬＣ、ＬＣ１及びＬＣ２はそれぞれＣＬＲリガンドを構成する少なくとも１つの原子がリンカーを構成する原子に置換している構造である。式（２）及び式（３）において、ＬＴはＴＬＲリガンドを構成する少なくとも１つの原子がリンカーを構成する原子に置換している構造である。言い換えると、ＣＬＲリガンド部分及びＴＬＲリガンド部分は、リンカーとの結合によって、本実施の形態に係る化合物の構造にそれぞれＣＬＲリガンドに由来する構造及びＴＬＲリガンドに由来する構造として含まれる。
【0028】
ＣＬＲリガンドは、ＣＬＲに対して結合能を有する分子であれば、特に限定されない。これまでに、Ｃ型レクチン様ドメインを有する１８種類のＣＬＲのグループが見出されている。それぞれのＣＬＲは、病原体又は内在性の糖鎖構造を認識すると考えられている。ＣＬＲリガンドとしては、例えば、単糖及び糖鎖が挙げられる。
【0029】
単糖とはこれ以上加水分解されない最小単位の糖である。単糖又は糖鎖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、マルトース、アラビノース、キシロース、ラムノース、イソマルトース、イドース、ラクトース、パノース、セロビオース、メリビオース、アラビノビオース、イソプリメベロース、ゲンチオビオース、マンノオリゴ糖鎖、キトオリゴ糖鎖、ラミナリオリゴ糖鎖、グルコサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、グルクロン酸、シクロデキストリン、アミノシクロデキストリン、アミロペクチン、アミロース、アラビナン、アラビノキシラン、カードラン、デキストラン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、マンナン、プルラン、ザイモサン、キシラン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、カラギーナン、フコイダン、ポリグルロン酸、ポリマンヌロン酸、キトサン、キチン等が挙げられる。単糖として、シアリルラクトース等のシアル酸を有する糖、及びデキストラン硫酸等の硫酸化糖（硫酸基を有する糖）を用いてもよい。好適には、単糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される。
【0030】
糖鎖は、複数の単糖を有する限り、糖鎖におけるその他の構成は特に限定されない。糖鎖は、複数の上記単糖がグリコシド結合によって結合した化合物であってもよく、例えば、オリゴ糖及び多糖である。オリゴ糖及び多糖は、環状であってもよいし、枝分かれした構造（分枝構造）を有していてもよい。
【0031】
糖鎖が、オリゴ糖又は多糖である場合、同一の単糖からなる単一オリゴ糖又は多糖であってもよいし、種々の単糖又はその誘導体からなる複合糖であってもよい。糖鎖を構成する単糖は、いずれも、自然界から単離及び精製して得られる種々の天然の糖であってもよいし、人工的に合成された糖であってもよい。上記単糖及びオリゴ糖は、多糖を分解して得られたものであってもよい。
【0032】
具体的には糖鎖としては、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、Ａｒａ、Ｘｙｌ、Ｒｈａ、Ｇｌｃα１－４Ｇｌｃ、Ｇｌｃα１－４Ｇｌｃα１－４Ｇｌｃ、Ｇｌｃα１－６Ｇｌｃ、Ｇｌｃα１－６Ｇｌｃα１－６Ｇｌｃ、Ａｒａα１－５Ａｒａ、Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃ、Ｇｌｃβ１－４Ｇｌｃ、Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃ、Ｇａｌα１－６Ｇｌｃ、Ｇａｌα１－４Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１－６Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１－４［Ｆｕｃα１－２］ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、Ｍａｎα１－２Ｍａｎ、Ｍａｎα１－３Ｍａｎα１－６Ｍａｎ、Ｍａｎα１－６Ｍａｎ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、Ｆｕｃα１－６Ｇｌｃ、Ｆｕｃβ１－６Ｇｌｃ、Ｘｙｌβ１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃα１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃα１－６Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃβ１－３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－６Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－６Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＳ６Ｓα１－４ＩｄｏＡ２Ｓβ１－６Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＧａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－６Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－６Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＡβ１－３ＧａｌＮＡｃ４Ｓβ１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＡβ１－３ＧａｌＮＡｃ６Ｓβ１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＡ２Ｓβ１－３ＧａｌＮＡｃ６Ｓβ１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＡβ１－３ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓβ１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＳ６Ｓα１－４ＩｄｏＡ２Ｓα１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＳα１－４ＩｄｏＡ２Ｓα１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＳ６Ｓα１－４ＧｌｃＡ２Ｓβ１－６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＳα１－４ＧｌｃＡβ１－６Ｇｌｃ、αＣＤ、βＣＤ、γＣＤ等を挙げることができる。
【0033】
なお、本明細書において、“Ｇｌｃ”はグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）を、“Ｇａｌ”はガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を、“Ｍａｎ”はマンノース（Ｍａｎｎｏｓｅ）を、“Ｆｕｃ”はフコース（Ｆｕｃｏｓｅ）を、“Ｘｙｌ”はキシロース（Ｘｙｌｏｓｅ）を、“Ａｒａ”はアラビノース（Ａｒａｂｉｎｏｓｅ）を、“Ｒｈａ”はラムノース（Ｒｈａｍｎｏｓｅ）を、“ＮＡｃ”はＮ－アセチル（Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ）を、“Ｉｄｏ”はイドース（Ｉｄｏｓｅ）を、“Ｎｅｕ５Ａｃ”はＮ－アセチルノイラミン酸（Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を、“ＧｌｃＡ”はグルクロン酸（Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を、“ＩｄｏＡ”はイズロン酸（Ｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｉｄ）を、“ＣＤ”はシクロデキストリン（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）を、糖鎖の化学式中に表される“Ｓ”はスルフォニル（硫酸基）をそれぞれ表す。例えば、ＧｌｃＡβ１－３ＧａｌＮＡｃ４Ｓβ１－６Ｇｌｃにおける“４Ｓ”は４－Ｏ－硫酸を表す。
【0034】
また、糖鎖の化学式における“α”又は“β”は、還元末端側の糖の水酸基がα又はβの立体構造で隣り合う糖の水酸基と結合していることを示す。例えば、“α１－４”は還元末端側の糖の１位水酸基がαの立体構造で隣り合う糖の４位の水酸基と結合していることを示す。
【0035】
好ましくは、単糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される。多糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される１種若しくは複数種からなるオリゴ糖若しくは多糖である。
【0036】
単糖及び糖鎖は、還元末端、非還元末端を有していてもよいし、又は側鎖にアルキルアミン、アミノ基、カルボキシ基、アジド基、アルキン基等を有していてもよい。“還元末端を有する糖鎖”は、例えば、アノマー炭素原子が置換を受けていない糖鎖などである。還元末端を有する糖鎖は、還元糖であるともいえる。
【0037】
ＣＬＲリガンドがアミノ糖又は酸性糖を含む糖鎖である場合、糖鎖のアミノ基（例えば－ＮＨ２基）又はカルボキシ基（－ＣＯＯＨ基）を介したアミド結合によって、ＣＬＲリガンド部分がリンカーと結合していてもよい。なお、上記化合物は、１種類のみの糖鎖を含んでいてもよいし、２種類以上の糖鎖を組み合わせて含んでいてもよい。
【0038】
本実施の形態に係る化合物におけるＣＬＲリガンド部分の構造は、グルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される単糖がリンカーに結合した構造、又はグルコース、ガラクトース、マンノース、アミノ糖及び酸性糖からなる群から選択される１種若しくは複数種からなるオリゴ糖若しくは多糖がリンカーに結合した構造である。
【0039】
ＴＬＲリガンドとは、ＴＬＲに対して結合能を有する化合物又は分子である。ヒトでは、ＴＬＲ１からＴＬＲ１０の１０種類のＴＬＲが同定されている。それぞれのＴＬＲに対して、同一の、又は異なるＴＬＲリガンドが存在する。
【0040】
ＴＬＲリガンドとして、いずれのＴＬＲに対するリガンドも使用できる。ＴＬＲリガンドとしては、微生物、ウイルス及びＴＬＲを発現している生物由来のリガンドである天然由来のＴＬＲリガンドであってもよいし、合成されたＴＬＲリガンドであってもよい。ＴＬＲリガンドとしては、公知のリガンドを用いることができる。
【0041】
好ましくは、ＴＬＲリガンド部分は、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７又はＴＬＲ８に結合して、ＴＬＲの活性を誘起する。すなわち、好適には、ＴＬＲリガンド部分は、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８からなる群から選択される少なくとも１つに結合する。ＴＬＲ４又はＴＬＲ７に対する結合能を有し、ＴＬＲの活性を誘起するＴＬＲリガンドがより好ましく、ＴＬＲ７に対する結合能を有し、ＴＬＲ７に結合して、ＴＬＲの活性を誘起するＴＬＲリガンドがさらに好ましい。
【0042】
より具体的には、ＴＬＲリガンドとしては、（ｉ）ＴＬＲ４に対するＴＬＲリガンド（以下、“ＴＬＲ４リガンド”ともいう）であるモノホスホリルリピッドＡ（式（４））、ピリミドインドール体（式（５））、４－（（３－ニトロ－５－フェノキフェニル）アミノ）キナゾリン－２－カルボキシ酸（4-((3-nitro-5-phenoxyphenyl)amino)quinazoline-2-carboxylic acid、式（６））、（ｉｉ）ＴＬＲ７に対するＴＬＲリガンド（以下、“ＴＬＲ７リガンド”ともいう）である１Ｖ２０９（式（７））、（ｉｉｉ）ＴＬＲ８に対するＴＬＲリガンド（以下、“ＴＬＲ８リガンド”ともいう）であるＶＴＸ－２３３７（式（８））、並びに（ｉｖ）ＴＬＲ７及びＴＬＲ８に対するＴＬＲリガンドであるＲ８４８（式（９））が挙げられる。ＴＬＲリガンドとして、特に１Ｖ２０９が好ましい。
【0043】
【化2】
【0044】
好ましくは、ＴＬＲリガンド部分の構造は、１Ｖ２０９がリンカーに結合した構造である。本実施の形態に係る化合物は、１種類のＴＬＲリガンドに由来する構造を含んでいてもよく、２種類以上のＴＬＲリガンドそれぞれに由来する構造を含んでいてもよい。ＴＬＲリガンドが、例えばアミノ基、ヒドロキシ基又はカルボキシ基を有する場合、ＴＬＲリガンドのアミノ基、ヒドロキシ基又はカルボキシ基を介して、ＴＬＲリガンド部分がリンカーと結合していてもよい。
【0045】
上記化合物が１分子あたり複数のＣＬＲリガンド部分を有する場合、好ましくは、リンカーは、複数のＣＬＲリガンド部分及びＴＬＲリガンド部分の各々が末端に結合した分岐構造を有する。例えば、リンカーが分岐構造を有する化合物の構造は下記式（１）に例示される。
【0046】
【化3】
【0047】
式（１）において、ＲＣはＣＬＲリガンド部分を有し、ＲＴはＴＬＲリガンド部分を有する。ｐ１～ｐ３は、それぞれ独立して０以上６以下の整数である。
【0048】
本実施の形態に係る化合物の構造は、例えば、下記の式（１０）、式（１１）及び式（１２）に示される。
【0049】
【化4】
【0050】
本実施の形態に係る化合物は、公知の方法で製造することができる。当該化合物は、ＣＬＲリガンドに結合させた第１リンカー化合物と、ＴＬＲリガンド又はＴＬＲリガンドに結合させた第２リンカー化合物とを連結することで合成されてもよいし、ＣＬＲリガンドと、ＴＬＲリガンドに結合させた第２リンカー化合物とを連結することで合成されてもよい。
【0051】
第１リンカー化合物は、例えば、ＣＬＲリガンドと結合し得るアミノ基、カルボキシ基、アジド基又はアルキン基を一端に有し、他端にアミノ基、カルボキシ基、アジド基又はアルキン基を含む炭化水素構造を有する炭化水素鎖又は炭化水素誘導鎖である。炭化水素鎖及び炭化水素誘導鎖は、炭素及び水素からなる炭化水素鎖又は一部の炭素若しくは水素が、他の原子又は置換基に置換されてもよい。例えば、炭化水素誘導鎖及び炭化水素誘導鎖は、主鎖である炭素－炭素結合（Ｃ－Ｃ結合）の一部が、炭素－窒素結合（Ｃ－Ｎ結合）、炭素－酸素結合（Ｃ－Ｏ結合）、アミド結合（ＣＯ－ＮＨ結合）等に置き換わっていてもよい。
【0052】
上記他端の炭化水素構造とは、炭素及び水素からなる炭化水素構造であってもよく、一部の炭素若しくは水素が、他の原子又は置換基に置換されてもよい。当該炭化水素構造は、直鎖又は分岐鎖であってもよいし、環状であってもよいし、鎖状及び環状の両方の構造の組み合わせであってもよい。
【0053】
例えば、第１リンカー化合物としては、上述のＣＬＲリガンドと結合し得る一端をＸ１、他端をＹ１として下記の式（１３）で表される構造を有する化合物が挙げられる。
【0054】
【化5】
【0055】
式（１３）において、ｍ及びｎは、それぞれ独立して０以上６以下の整数であり、Ｘ１及びＹ１は、それぞれ独立して、末端にアミノ基、カルボキシ基、アジド基又はアルキン基を有する。
【0056】
好ましくは、第１リンカー化合物は、Ｘ１にアミノ基を有し、Ｙ１にアジド基を有する。Ｘ１にアミノ基を有する場合、当該アミノ基を介して、ＣＬＲリガンドを第１リンカー化合物に簡便に結合させることができる。当該アミノ基は、未修飾のアミノ基の他、例えばメチル基、ホルミル基などのアルキル基で修飾されたアミノ基であってもよいし、芳香環に結合したアミノ基であってもよい。より具体的には、Ｘ１にアミノ基を有する第１リンカー化合物として、下記の式（１４）で表される構造を有する化合物が例示される。
【0057】
【化6】
【0058】
式（１４）において、ｍ及びｎは、それぞれ独立して０以上６以下の整数であり、Ｙ１は、それぞれ独立して、末端にアミノ基、カルボキシ基、アジド基又はアルキン基を有する。
【0059】
好ましくは、ＣＬＲリガンドと第１リンカー化合物との還元アミノ化反応によって、ＣＬＲリガンドが、例えば式（１３）におけるＸ１に導入される。還元アミノ化反応の最適条件であるｐＨ３～４においては、アミノ基がプロトン化されないことが必要である。そのため、Ｘ１に含まれるアミノ基は、式（１４）に示すように、芳香族との共役によってｐＨ３～４でも非共有電子対が窒素原子上に存在する芳香環に結合したアミノ基が好ましい。
【0060】
第１リンカー化合物は、例えば、式（１３）及び式（１４）におけるＹ１の末端にアジド基を有することが好ましい。当該アジド基とＴＬＲリガンドに結合した第２リンカー化合物が有するアルキン基とを介して、ＣＬＲリガンドとＴＬＲリガンドとを複合体化することができる。言い換えると、第１リンカー化合物のＹ１がアジド基を有する場合、当該アジド基と、ＴＬＲリガンドに結合した第２リンカー化合物が有するアルキン基とをクリック反応に供することができる。クリック反応は、例えば、銅触媒を用いて行われる。
【0061】
なお、第１リンカー化合物は、Ｙ１の末端にアルキン基を有していてもよい。当該アルキン基とＴＬＲリガンドに結合した第２リンカー化合物が有するアジド基とを介したクリック反応によってＣＬＲリガンドとＴＬＲリガンドとを連結し複合体化することができる。
【0062】
第２リンカー化合物は、例えば、一端にＴＬＲリガンドと結合し得るアミノ基、カルボキシ基、アジド基又はアルキン基を有し、他端にアミノ基、カルボキシ基、アジド基、アルキン基又はｔｅｒｔ－ブチル基等のアルキン基に変換可能な基を含む炭化水素構造を有する炭化水素鎖又は炭化水素誘導鎖である。炭化水素鎖及び炭化水素誘導鎖は、上述の第１リンカー化合物における炭化水素鎖及び炭化水素誘導鎖と同様である。
【0063】
例えば、第２リンカー化合物としては、上述のＴＬＲリガンドと結合し得る一端をＹ２、他端をＸ２として下記の式（１５）で表される構造を有する化合物が挙げられる。
【0064】
【化7】
【0065】
式（１５）において、ｍ及びｎは、それぞれ独立して０以上６以下の整数であり、Ｘ２及びＹ２は、それぞれ独立して、末端にアミノ基、カルボキシ基、アジド基又はアルキン基を有する。Ｘ２は、末端にアミノ基、カルボキシ基、アジド基、アルキン基又はアルキン基に変換可能な基を有するとともに、主鎖として炭素－炭素結合、炭素－酸素結合、炭素－窒素結合等を有していてもよい炭化水素鎖又は炭化水素誘導鎖を、直鎖で、あるいは、分岐構造で有してもよい。Ｘ２が有する炭化水素鎖又は炭化水素誘導鎖が分岐構造を有する場合、分岐の数は特に限定されないが、好ましくは、Ｘ２は、２鎖又は３鎖からなる分岐構造を有する。なお、Ｘ２に含まれるアミノ基、カルボキシ基、アジド基又はアルキン基は、炭化水素のみで構成されていてもよいし、炭素以外の元素を含む複素環であってもよい。
【0066】
好ましくは、Ｘ２は、下記の式（１６）又は式（１７）で表される構造を有する。
【0067】
【化8】
【0068】
式（１６）及び式（１７）において、ｐ１～ｐ５は、それぞれ独立して０以上６以下の整数である。またＺは、末端にアミノ基、カルボキシ基、アジド基、アルキン基又はアルキン基に変換可能な基を有するとともに、主鎖に炭素－炭素結合、炭素－酸素結合、炭素－窒素結合を有していてもよい炭化水素鎖又は炭化水素誘導鎖である。
【0069】
Ｘ２が分岐構造を有する場合、第２リンカー化合物を用いて合成された上記化合物におけるリンカーは、それぞれがＣＬＲリガンド部分を有する分岐構造を有し、上記化合物は、１分子あたり複数のＣＬＲリガンド部分を有する。なお、Ｘ２に含まれるアミノ基、カルボキシ基、アジド基又はアルキン基は、炭化水素のみで構成されていてもよいし、炭素以外の元素を含む複素環であってもよい。
【0070】
好ましくは、第２リンカー化合物は、Ｘ２の末端にアジド基を有し、Ｙ２の末端にアミノ基を有する。当該アミノ基は、未修飾のアミノ基の他、例えばメチル基、ホルミル基などのアルキル基で修飾されたアミノ基であってもよいし、芳香環に結合したアミノ基であってもよい。Ｙ２にアミノ基を有する場合、当該アミノ基を介して、例えばカルボキシ基を有するＴＬＲリガンドを第２リンカー化合物に縮合剤等を用いて簡便に導入することができる。カルボキシ基を有するＴＬＲリガンドは例えば１Ｖ２０９である。ＴＬＲリガンドと第２リンカー化合物との縮合反応（アミド化反応）に用いる縮合剤は、特に限定されず、例えば、ＨＡＴＵ、ＣＯＭＵ、ＰｙＢＯＰ、ＥＤＣ等が挙げられる。なお、“カルボキシ基を有するＴＬＲリガンド”とは、第２リンカー化合物との結合後、ＴＬＲへの結合親和性を失わないものである。カルボキシ基を有するＴＬＲリガンドは、分子末端にカルボキシ基を有するＴＬＲリガンドであってもよいし、ＴＬＲへの結合親和性を失わない範囲で、分子末端にカルボキシ基を導入した化合物であってもよい。
【0071】
第２リンカー化合物は、Ｙ２にカルボキシ基を有していてもよい。Ｙ２にカルボキシ基を有する場合、当該カルボキシ基を介して、例えばアミノ基を有するＴＬＲリガンドを第２リンカー化合物に簡便に導入することができる。ＴＬＲリガンドを導入後、当該カルボキシ基は、ＴＬＲリガンドと結合したカルボニル基となる。“アミノ基を有するＴＬＲリガンド”とは、第２リンカー化合物との結合後、ＴＬＲへの結合親和性を失わないものである。アミノ基を有するＴＬＲリガンドは、分子末端にアミノ基を有するＴＬＲリガンドであってもよいし、ＴＬＲへの結合親和性を失わない範囲で、分子末端にアミノ基を導入した化合物であってもよい。
【0072】
好ましくは、Ｘ２は、末端にアルキン基を有する下記の式（１８）で表される構造を有する。
【0073】
【化9】
【0074】
式（１８）において、ｐ１～ｐ３はそれぞれ独立して１以上６以下の整数である。
【0075】
より具体的には、Ｘ２にアルキン基を有する第２リンカー化合物として、下記の式（１９）で表される構造を有する化合物が例示される。
【0076】
【化10】
【0077】
式（１９）において、ｍ及びｎは、それぞれ独立して０以上６以下の整数である。式（１９）におけるＹ２は、上記式（１５）おけるＹ２と同じである。
【0078】
第２リンカー化合物がＸ２の末端にアルキン基を有することで、当該アルキン基とＣＬＲリガンドに結合した第１リンカー化合物が有するアジド基とを介して、上述のクリック反応によって、ＣＬＲリガンドとＴＬＲリガンドとを複合体化することができる。なお、Ｘ２が末端にカルボキシ基を有する場合、当該カルボキシ基とＣＬＲリガンドが有するアミノ基とを縮合反応によって結合してもよい。なお、Ｘ２が末端に、アルキン基に変換可能な基を有する場合、ＴＬＲリガンドと第２リンカー化合物とを結合した後で、アルキン基に変換可能な基をアルキン基に変換してもよい。
【0079】
本実施の形態に係る化合物の合成経路を以下に例示する。上記第１リンカー化合物及び第２リンカー化合物は、それぞれ“架橋基”として、ＣＬＲリガンド及びＴＬＲリガンドに付加されたものとする。
【0080】
【化11】
【0081】
スキーム１に示した合成経路では、末端にカルボキシ基を有する第２リンカー化合物が導入されたことによってカルボキシ基を有する架橋基が結合したＴＬＲリガンド部分と、ＣＬＲリガンドとしての糖鎖（アミノ糖）のアミノ基とを脱水縮合させて、酸アミド結合（ペプチド結合）を介してＴＬＲリガンド部分とＣＬＲリガンド部分とが連結される。この場合、リンカーは酸アミド結合及び架橋基を含む部分である。
【0082】
スキーム２に示した合成経路では、まず、末端にアミノ基を有する第１リンカー化合物と、ＣＬＲリガンドとしての糖鎖（還元糖）のヒドロキシ基とを脱水縮合させて、糖鎖に架橋基を付加する。続いて、架橋基を介してＴＬＲリガンドと糖鎖とを結合させることでＴＬＲリガンド部分とＣＬＲリガンド部分とが連結される。
【0083】
スキーム３に示した合成経路では、末端にアジド基を有する第１リンカー化合物が導入されたことによってアジド基を有する架橋基が結合したＣＬＲリガンド部分と、末端にアルキン基を有する第２リンカー化合物が導入されたことによってアルキン基が結合したＴＬＲリガンド部分とを、クリック反応に供する。これにより、ＴＬＲリガンド部分とＣＬＲリガンド部分とが連結される。
【0084】
上記化合物は塩の態様で本実施の形態に係る免疫増強剤に含まれてもよい。化合物の塩は、免疫増強活性を示し、かつ薬理学的に許容される塩であれば特に限定されない。塩は特に限定されず、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；並びに酢酸塩、プロピオン酸塩、ヘキサン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、グリコール酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、ｏ－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸塩、桂皮酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、１，２－エタンジスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－クロロベンゼンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩、４－メチルビシクロ［２．２．２］オクト－２－エン－１－カルボン酸塩、グルコヘプタン酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、トリメチル酢酸塩、第三級ブチル酢酸塩、ラウリル硫酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、ムコン酸塩等の有機酸塩である。
【0085】
本実施の形態に係る免疫増強剤は、既知の方法で製造され、有効成分として０．０００００１～９９．９質量％、０．００００１～９９．８質量％、０．０００１～９９．７質量％、０．００１～９９．６質量％、０．０１～９９．５質量％、０．１～９９質量％、０．５～６０質量％、１～５０質量％又は１～２０質量％の上記化合物を含む。免疫増強剤は、固形製剤であっても、液状製剤であってもよい。
【0086】
免疫増強剤は上記化合物に加え、薬理学的に許容される任意の成分を含んでもよい。任意の成分は、例えば、担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等である。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物が免疫増強剤に配合されてもよい。
【0087】
本実施の形態に係る免疫増強剤の投与量は、投与対象の性別、年齢、体重、症状、抗原等によって適宜決定される。当該免疫増強剤は、上記化合物が有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要な上記化合物の量であり、免疫増強活性をもたらすのに必要な量である。
【0088】
免疫増強剤の投与量は、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。免疫増強剤を分割して投与する場合、免疫増強剤は、１日に１～４回投与される。また、免疫増強剤は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週、１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
【0089】
免疫増強剤の投与経路は特に限定されない。免疫増強剤は、例えば非経口で投与されてもよいし、経口で投与されてもよい。非経口投与の場合、静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、経皮投与、経粘膜投与、経肺投与、経腸投与等であってもよい。免疫増強剤は、点滴を介して投与されてもよい。
【0090】
免疫増強剤は、任意の形態の製剤とすることができる。経口投与の場合、免疫増強剤は、糖衣錠、バッカル錠、コーティング錠、チュアブル錠等の錠剤；トローチ剤、丸剤、散剤、ソフトカプセルを含むカプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、ドライシロップを含むシロップ剤、エリキシル剤等の液剤であってもよい。非経口投与の場合、免疫増強剤は、注射剤、吸入剤、経皮吸収テープ、エアゾール剤、坐剤等であってもよい。
【0091】
免疫増強剤は任意の対象に投与される。例えば、免疫増強剤の投与対象は、ヒト及びヒト以外の動物であって、好ましくは哺乳動物である。対象は、例えばヒト、チンパンジー等の霊長類、ラット、マウス、ウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜動物、イヌ、ネコ等の愛玩動物である。
【0092】
本実施の形態に係る免疫増強剤は、免疫細胞への高い移行性を有し、より効果的に免疫細胞を活性化することができる。当該免疫増強剤はＣＬＲリガンド部分とＴＬＲリガンド部分とを有するため、下記実施例に示すように、自然免疫応答を増強する作用を有する。
【0093】
また、下記試験例３で示されたように、本実施の形態に係る免疫増強剤はウイルス感染防御効果を有する。このため、免疫増強剤は抗ウイルス薬としても使用できる。
【0094】
なお、生体内では、当該化合物が代謝されることがあるため、ＣＬＲリガンド部分とＴＬＲリガンド部分とが解離して、それぞれＣＬＲ及びＴＬＲに結合することで、免疫応答が誘導又は増強されてもよい。また、当該化合物が免疫細胞に輸送された後、ＣＬＲリガンド部分とＴＬＲリガンド部分とが解離してもよい。
【0095】
また、下記試験例２～７で示されたように、本実施の形態に係る免疫増強剤は粘膜を介して投与される粘膜免疫増強剤としても有用である。粘膜免疫増強剤の投与部位は、粘膜であれば特に限定されない。好ましくは、粘膜免疫増強剤は、公知の方法で鼻の粘膜から投与される。粘膜免疫増強剤は、粘膜組織下に存在する免疫細胞に対して、抗原を効率良く輸送し、免疫細胞を活性化することができる。当該粘膜免疫増強剤は、ＣＬＲリガンド部分及びＴＬＲリガンド部分を有する化合物を含むため、ＣＬＲ及びＴＬＲを介した自然免疫応答をより効果的に誘導可能である。
【0096】
本実施の形態に係る免疫増強剤は、ワクチン用アジュバントであってもよい。当該ワクチン用アジュバントは、上記化合物の他に、溶媒を含有してもよい。溶媒としては、例えば、水、生理食塩水、グリセロール等が挙げられる。溶媒は、上記化合物の溶解度、反応速度等を考慮して適宜選択できる。
【0097】
ワクチン用アジュバントにおける溶媒の含有量は、特に限定されないが、例えば、化合物１質量部に対して、溶媒が１～５００質量部又は２０～２００質量部である。ワクチン用アジュバントは、上記化合物及び溶媒以外のその他の成分を、必要に応じて含んでもよい。その他の成分としては、ワクチン用アジュバントによる免疫応答の誘起を妨げない限り特に制限されないが、例えば、緩衝剤、界面活性剤、乾燥剤、防腐剤、粘膜付着剤等が挙げられる。
【0098】
本実施の形態に係るワクチン用アジュバントは、抗原と併用されて対象に投与される。抗原には、ワクチン用に精製された、又は市販の細菌由来抗原、ウイルス抗原、トキソイド等のタンパク質、糖タンパク質、アレルゲン、糖質、核酸等を使用することができる。抗原は、例えば、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、ウエストナイルウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、豚熱ウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、豚流行性下痢ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、牛伝染性リンパ腫ウイルス、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌、コレラ菌、マラリア病原体等に対するワクチン用の抗原である。抗原として、好ましくは、インフルエンザウイルス等のスパイクタンパク質であるＨＡ、肺炎球菌及びインフルエンザウイルスの莢膜多糖体等を用いることができる。抗原は、不活性化又は弱毒化した抗原であってもよい。抗原は、１種類であってもよい、複数種類であってもよい。
【0099】
本実施の形態に係るワクチン用アジュバントは、がん免疫療法用ワクチンとしても有用である。がん免疫療法用ワクチンにおけるワクチン用アジュバントとして使用する場合、抗原は、例えば、がん細胞に特異的に、又は正常細胞に比べて過剰に発現する遺伝子又はタンパク質（がん抗原）である。がん抗原としては、例えば、ＭＡＧＥＡ１～４，ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ２、ＣＴ８３、ＣＤ１９、ＧＰ１００、ＭＡＲＴ１、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＷＴ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＣＥＡ、サバイビン、サイクリンＢ１、ＥＧＦＲ、メソテリン、テロメラーゼ、ＭＵＣ１Ｔ、ＬＳＰ１、ＢＣＲ－ＡＢＬ１、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ等が挙げられる。がん免疫療法用ワクチンは、ペプチドワクチンの他、遺伝子ワクチン及び樹状細胞（ＤＣ）ワクチンであってもよい。
【0100】
“併用”とは、ワクチン用アジュバントである免疫増強剤と抗原とを含むワクチン組成物を対象に投与することはもちろんのこと、当該免疫増強剤と抗原とを別々に同時に投与すること、及び別々に連続して投与することも包含する。抗原の投与経路は、当該免疫増強剤の投与経路と同じであってもよいし、別の投与経路であってもよい。
【0101】
ワクチン用アジュバントの投与部位は特に限定されない。好ましくは、ワクチン用アジュバントは、公知の方法で投与される。ワクチン用アジュバントの投与量は、投与対象の性別、年齢、体重、症状、抗原の種類等に応じて適宜決定される。ワクチン用アジュバントは、上記化合物が有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要な化合物の量であり、特には、免疫応答を誘起できる量である。
【0102】
なお、本実施の形態に係る粘膜免疫増強剤である免疫増強剤は、粘膜ワクチン用アジュバントとしても有用である。
【0103】
別の実施の形態では、ワクチン組成物が提供される。ワクチン組成物は、上記実施の形態に係るワクチン用アジュバントである免疫増強剤と、抗原と、を含む。別の実施の形態では、粘膜ワクチン組成物が提供される。粘膜ワクチン組成物は、上述の粘膜ワクチン用アジュバントである免疫増強剤と、抗原と、を含む。好ましくは、当該粘膜ワクチン組成物は鼻粘膜投与用である。
【0104】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例0105】
［製造例１：１Ｖ２０９を有する一本鎖リンカー成分の合成］
下記に示すように１Ｖ２０９とプロパルギルアミン（第２リンカー化合物）との縮合反応により、１Ｖ２０９一本鎖誘導体（4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)-N-(prop-2-yn-1-yl)benzamide、式（２０））を６２％の収率で合成した。
下記に示すように１Ｖ２０９とプロパルギルアミン（第２リンカー化合物）との縮合反応により、１Ｖ２０９一本鎖誘導体（4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)-N-(prop-2-yn-1-yl)benzamide、式（２０））を６２％の収率で合成した。
【0106】
【化12】
【0107】
詳細には、アルゴン雰囲気下で１Ｖ２０９（１０４ｍｇ，２８８μｍｏｌ）とＨＡＴＵ（１９０ｍｇ，５００μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、プロパルギルアミン（４７．６ｍｇ，８６４μｍｏｌ）を加え０℃で２４時間撹拌した。反応溶液にクロロホルムと蒸溜水を加えてクロロホルムに抽出した。有機層を蒸溜水で１回、飽和食塩水で１回洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去してエバポレーターで減圧濃縮し、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製して１Ｖ２０９一本鎖誘導体（式（２０））を白色固体（７１．０ｍｇ，６２％）として得た。なお、１Ｖ２０９は文献（Michael Chan, et al., Synthesis and Characterization of PEGylated Toll Like Receptor 7 Ligands, Bioconjugate Chem., 22 (2011) 445-454）に記載の合成経路で合成した。
【0108】
1H-NMR(400MHz,DMSO(d6))δ10.03(1H,s),8.90(1H,dd,J=5.5,5.5Hz),7.81(2H,d,J=8.2Hz),7.37(2H,d,J=8.2Hz),6.51(2H,s),4.92(2H,s),4.26(2H,dd,J=5.5,4.1Hz),4.05(2H,dd,J=5.5,2.7Hz),3.58(2H,t,J=4.6Hz),3.12(1H,dd,J=2.5Hz),2.52-2.50(1H,m).
13C-NMR(100MHz,DMSO(d6))δ165.6,159.8,152.2,149.1,147.7,140.4,132.9,128.6,127.5,127.3,120.4,98.3,81.3,72.8,70.2,65.3,58.1,42.1,28.4.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 397.1624[(M+H)+],Calcd.For C19H20N6O4:397.1619.
13C-NMR(100MHz,DMSO(d6))δ165.6,159.8,152.2,149.1,147.7,140.4,132.9,128.6,127.5,127.3,120.4,98.3,81.3,72.8,70.2,65.3,58.1,42.1,28.4.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 397.1624[(M+H)+],Calcd.For C19H20N6O4:397.1619.
【0109】
［製造例２：１Ｖ２０９を有する三分岐鎖リンカー成分の合成］
下記に示すように１Ｖ２０９三分岐誘導体（4-(2-(4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)benzamido)acetamido)-4-(3-oxo-3-(prop-2-yn-1-ylamino)propyl)-N1,N7-di(prop-2-yn-1-yl)heptanediamide、式（２１））を５８％の収率で合成した。１Ｖ２０９三分岐誘導体では、文献（Yasuo Suda, et al., Immobilization and Clustering of Structurally Defined Oligosaccharides for Sugar Chips: An Improved Method for Surface Plasmon Resonance Analysis of Protein-Carbohydrate Interactions, Bioconjugate Chem., 17 (2006) 1125-1135）の合成経路で合成したベンジルオキシカルボニル体（Ｚ体、ａ）を接触還元により、第２リンカー化合物としてのアミン体（ｂ）へと誘導し、その後、ＨＡＴＵを用いて１Ｖ２０９と縮合した（ｃ）。続いて、ｔｅｒｔ－ブチル基をＴＦＡで処理して除去し、ＨＡＴＵ及びプロパルギルアミンを用いて縮合反応を行った。
下記に示すように１Ｖ２０９三分岐誘導体（4-(2-(4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)benzamido)acetamido)-4-(3-oxo-3-(prop-2-yn-1-ylamino)propyl)-N1,N7-di(prop-2-yn-1-yl)heptanediamide、式（２１））を５８％の収率で合成した。１Ｖ２０９三分岐誘導体では、文献（Yasuo Suda, et al., Immobilization and Clustering of Structurally Defined Oligosaccharides for Sugar Chips: An Improved Method for Surface Plasmon Resonance Analysis of Protein-Carbohydrate Interactions, Bioconjugate Chem., 17 (2006) 1125-1135）の合成経路で合成したベンジルオキシカルボニル体（Ｚ体、ａ）を接触還元により、第２リンカー化合物としてのアミン体（ｂ）へと誘導し、その後、ＨＡＴＵを用いて１Ｖ２０９と縮合した（ｃ）。続いて、ｔｅｒｔ－ブチル基をＴＦＡで処理して除去し、ＨＡＴＵ及びプロパルギルアミンを用いて縮合反応を行った。
【0110】
【化13】
【0111】
詳細には、アルゴン雰囲気下で１Ｖ２０９（７１．８ｍｇ，２００μｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（１１６ｍｇ，３００μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、アミン体を加え氷冷下で１２時間撹拌した。反応溶液にクロロホルムと蒸溜水を加えてクロロホルム層に抽出した。有機層を蒸溜水で１回、飽和食塩水で１回洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去してエバポレーターで減圧濃縮し、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製し黄色固体（１１９ｍｇ，７５％）を得た。
【0112】
1H-NMR(600MHz,CDCI3)δ7.83(2H,d),7.50(2H,d),5.04(2H,s),4.42(2H,t),3.72(2H,t),3.40(3H,s),2.22(6H,t),1.96(6H,t),1.41(27H,s).
13C-NMR(100MHz,CDCI3)δ172.7,172.6,170.1,167.9,160.5,153.9,149.4,147.9,140.4,132.6,128.6,127.9,99.4,80.8,80.6,70.7,66.2,59.0,58.2,39.8,30.0,29.8,29.6,28.1,28.0.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 814.4345[(M+H)+],Calcd.for C40H60N7O11:814.4345.
13C-NMR(100MHz,CDCI3)δ172.7,172.6,170.1,167.9,160.5,153.9,149.4,147.9,140.4,132.6,128.6,127.9,99.4,80.8,80.6,70.7,66.2,59.0,58.2,39.8,30.0,29.8,29.6,28.1,28.0.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 814.4345[(M+H)+],Calcd.for C40H60N7O11:814.4345.
【0113】
上記黄色固体（１１５ｍｇ，１４１μｍｏｌ）をＴＦＡ：ＣＨ２ＣＩ２：Ｈ２Ｏ＝１：１：０．１の溶液に溶解させ、２４時間撹拌した。その後、減圧濃縮を行って白色固体（１１５ｍｇ）定量的に得た。得られた白色固体（４７．１ｍｇ，７３．０μｍｏｌ）とＨＡＴＵ（９０．１ｍｇ，２３７μｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解させ、プロパルギルアミン（２７．０ｍｇ，４９０μｍｏｌ）を加え氷冷下で２４時間撹拌した。反応溶液にクロロホルムと蒸溜水を加えてクロロホルム層に抽出した。有機層を蒸溜水で１回、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去してエバポレーターで減圧濃縮し、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製して１Ｖ２０９三分岐誘導体（式（２１））を黄色固体（２１．４ｍｇ，５８％）として得た。
【0114】
1H-NMR(400MHz,DMSO(d6))δ8.31(3H,dd,J=5.5,2.7Hz),7.85(2H,d,J=8.2Hz),7.36(3H,d,J=8.2Hz),6.80(2H,s),4.91(2H,s),4.25(2H,t,J=5.0Hz),3.82(6H,dd,J=5.5,2.3Hz),3.58(2H,dd,J=6.0,3.0Hz),3.08(3H,t,J=2.5Hz),2.06-2.03(5H,m),1.82-1.79(6H,m).
13C-NMR(100MHz,DMSO(d6))δ171.9,168.1,166.3,159.9,152.1,149.0,147.9,140.4,133.1,127.6,127.2,98.5,81.3,79.4,79.6,77.6,72.9,70.2,65.3,58.1,56.9,30.0,29.3,28.3,27.9.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 779.3236[(M+Na)+],Calcd.for C37H44N10O8Na:779.3236.
13C-NMR(100MHz,DMSO(d6))δ171.9,168.1,166.3,159.9,152.1,149.0,147.9,140.4,133.1,127.6,127.2,98.5,81.3,79.4,79.6,77.6,72.9,70.2,65.3,58.1,56.9,30.0,29.3,28.3,27.9.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 779.3236[(M+Na)+],Calcd.for C37H44N10O8Na:779.3236.
【0115】
［製造例３：アジドアミンの合成］
下記に示すように、ｍ－フェニレンジアミンとモノクロロ酢酸との縮合反応及びクロロ基とアジ化物イオンとの置換反応により、第１リンカー化合物としてのアジドアミン（Ｎ－（３－アミノフェニル）－２－アジドアセトアミド、式（２２））を６０％の収率で合成した。
下記に示すように、ｍ－フェニレンジアミンとモノクロロ酢酸との縮合反応及びクロロ基とアジ化物イオンとの置換反応により、第１リンカー化合物としてのアジドアミン（Ｎ－（３－アミノフェニル）－２－アジドアセトアミド、式（２２））を６０％の収率で合成した。
【0116】
【化14】
【0117】
詳細には、ｍ－フェニレンジアミン（２１１ｍｇ，２．２４ｍｍｏｌ）とモノクロロ酢酸（２４０ｍｇ，２．２２ｍｍｏｌ）とを、縮合剤に１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）（４２７ｍｇ，２．４２ｍｍｏｌ）を用いて、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，１０ｍＬ）中氷冷下で作用させて４時間反応させた。その後、アジ化ナトリウム（２８１ｍｇ，４．３１ｍｍｏｌ）を加えて、６０℃で２４時間撹拌した。蒸溜水を加えて反応を停止させ、蒸溜水で１回、飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤を濾去後、エバポレーターで濃縮した。残渣をクロロホルムメタノール溶液に溶解させ、少量のシリカゲルに吸着させた。中圧シリカゲルクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝３：２）で精製し、アジドアミン（式（２２））を黄色固体（２６０ｍｇ，６０％）として得た。
【0118】
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ6.92(2H,dd,J=10.7,4.9Hz),6.70(1H,d,J=7.3Hz),6.38(1H,d,J=7.3Hz),3.84(2H,s).
13C-NMR(400MHz,CD3OD)δ168.2,149.4,139.8,130.4,112.9,111.1,108.4,53.2.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 214.0643[(M+Na)+],Calcd.for C8H9N5ONa:214.0699.
13C-NMR(400MHz,CD3OD)δ168.2,149.4,139.8,130.4,112.9,111.1,108.4,53.2.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 214.0643[(M+Na)+],Calcd.for C8H9N5ONa:214.0699.
【0119】
［製造例４：アジド基を有する糖鎖の合成］
下記に示すように、アジドアミン（式（２２））と糖鎖成分との還元アミノ化反応によりαＧｌｃ４－Ｎ３（2-azido-N-({[(α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)]amino}phenyl)acetamide、式（２３））を８３％の収率で調製した。αＧｌｃ４－Ｎ３の合成では、マルトースとアジドアミンとを混合した後、シアノホウ素化水素ナトリウムを用いて還元アミノ化反応を行った。
下記に示すように、アジドアミン（式（２２））と糖鎖成分との還元アミノ化反応によりαＧｌｃ４－Ｎ３（2-azido-N-({[(α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)]amino}phenyl)acetamide、式（２３））を８３％の収率で調製した。αＧｌｃ４－Ｎ３の合成では、マルトースとアジドアミンとを混合した後、シアノホウ素化水素ナトリウムを用いて還元アミノ化反応を行った。
【0120】
【化15】
【0121】
詳細には、マルトース（１０３ｍｇ，２８４μｍｏｌ）を蒸溜水（４ｍＬ）に溶解させ、酢酸（０．８ｍＬ）を加えｐＨ４～５に調整し、アジドアミン（１６）（５５．６ｍｇ，２９０μｍｏｌ）を溶解させたメタノール（４ｍＬ）を加え５０℃で６時間撹拌した。その後、シアノホウ素化水素ナトリウム（１８．２ｍｇ，２．９０ｍｍｏｌ）を加え２４時間撹拌した。溶液を減圧濃縮させることで残渣を回収し、中圧ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（蒸溜水：メタノール＝５：５）で精製し、αＧｌｃ４－Ｎ３を白色固体（１１８ｍｇ，８３％）として得た。
【0122】
1H-NMR(600MHz,D2O)δ7.18(1H,dd,J=8.4,8.4Hz),6.86(1H,s),6.74(1H,d,J=8.4Hz),6.61(1H,d,J=8.4Hz),5.03(1H,d,J=4.8Hz),4.06(2H,s),3.93-3.91(1H,m),3.88(1H,dt,J=7.5,4.0Hz),3.84-3.80(3H,m),3.77(1H,dd,J=12.2,2.0Hz),3.71(1H,dd,J=12.2,4.0Hz),3.67-3.66(2H,m),3.56(1H,dd,J=12.2,7.5Hz),3.49(1H,dd,J=9.9,4.0Hz),3.37(1H,dd,J=4.0,9.5Hz),3.27(1H,dd,J=13.6,4.8Hz),3.17(1H,dd,J=13.6,8.2Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O)δ169.6,149.2,137.9,130.7,112.6,112.4,108.0,101.1,82.6,73.5,73.1,73.0,72.2,71.9,69.9,69.5,62.7,60.9,52.8,47.1.ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 540.1907[(M+Na)+],Calcd.for C20H31N5O11Na:540.1912.
13C-NMR(150MHz,D2O)δ169.6,149.2,137.9,130.7,112.6,112.4,108.0,101.1,82.6,73.5,73.1,73.0,72.2,71.9,69.9,69.5,62.7,60.9,52.8,47.1.ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 540.1907[(M+Na)+],Calcd.for C20H31N5O11Na:540.1912.
【0123】
αＧｌｃ４－Ｎ３と糖鎖成分が異なる、下記に示すアジド基を有する糖鎖を、糖鎖成分を代えてαＧｌｃ４－Ｎ３と同様の操作で合成した。
βＧｌｃ６－Ｎ３（2-azido-N-({[(β-D-glucopyranosyl)-(1→6)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)]amino}phenyl)acetamide、収率８４％）
1H-NMR(400MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.07(1H,t,J=7.8Hz),6.78(1H,dd,J=1.8,2.3Hz),6.67(1H,dd,J=2.3,8.4Hz),6.48(1H,dd,J=1.8,8.2Hz),4.23(1H,d,J=7.8Hz),3.95(2H,s),3.92(1H,dd,J=2.7,11.4Hz),3.83-3.56(6H,m),3.51(1H,dd,J=4.6,11.9Hz),3.29(1H,dd,J=8.7,9.1Hz),3.24-3.14(3H,m),3.12(1H,dd,J=8.7,9.1Hz),2.97(1H,dd,J=8.2,13.7Hz).
13C-NMR(100MHz,D2O)δ170.0,150.3,139.1,131.6,112.8,112.6,109.0,104.4,77.3,77.1,74.7,72.9,72.6,72.0,71.3,71.0,62.1,53.6,47.5
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 540.1907[(M+Na)+],Calcd.for C20H31N5O11Na:540.1912.
βＧｌｃ６－Ｎ３（2-azido-N-({[(β-D-glucopyranosyl)-(1→6)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)]amino}phenyl)acetamide、収率８４％）
1H-NMR(400MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.07(1H,t,J=7.8Hz),6.78(1H,dd,J=1.8,2.3Hz),6.67(1H,dd,J=2.3,8.4Hz),6.48(1H,dd,J=1.8,8.2Hz),4.23(1H,d,J=7.8Hz),3.95(2H,s),3.92(1H,dd,J=2.7,11.4Hz),3.83-3.56(6H,m),3.51(1H,dd,J=4.6,11.9Hz),3.29(1H,dd,J=8.7,9.1Hz),3.24-3.14(3H,m),3.12(1H,dd,J=8.7,9.1Hz),2.97(1H,dd,J=8.2,13.7Hz).
13C-NMR(100MHz,D2O)δ170.0,150.3,139.1,131.6,112.8,112.6,109.0,104.4,77.3,77.1,74.7,72.9,72.6,72.0,71.3,71.0,62.1,53.6,47.5
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 540.1907[(M+Na)+],Calcd.for C20H31N5O11Na:540.1912.
【0124】
βＧｌｃ４－Ｎ３（2-azido-N-({[(β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)]amino}phenyl)acetamide、収率：８８％）
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.06(1H,ddd,J=2.0,7.5,8.2Hz),6.78(1H,d,J=2.0Hz),6.65(1H,dd,J=2.0.7.5Hz),6.50(1H,dd,J=2.0,8.2Hz),4.35(1H,d,J=8.2Hz),3.95(2H,s),3.92-3.87(1H,m),3.76-3.70(2H,m),3.68-3.63(2H,m),3.57-3.51(2H,m),3.47(1H,dd,J=4.1,12.2Hz),3.27(1H,ddd,J=1.4,9.5,10.2Hz),3.24-3.18(2H,m),3.17-3.08(2H,m),2.95(1H,dd,J=8.2,12.2Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6))δ169.3,150.0,138.1,131.0,112.3,107.7,109.0,103.2,80.0,76.3,76.1,74.90,71.5,71.2,71.0,70.1,62.6,60.9,52.8,46.9.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 540.1902[(M+Na)+],Calcd.for C20H31N5O11Na:540.1912
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.06(1H,ddd,J=2.0,7.5,8.2Hz),6.78(1H,d,J=2.0Hz),6.65(1H,dd,J=2.0.7.5Hz),6.50(1H,dd,J=2.0,8.2Hz),4.35(1H,d,J=8.2Hz),3.95(2H,s),3.92-3.87(1H,m),3.76-3.70(2H,m),3.68-3.63(2H,m),3.57-3.51(2H,m),3.47(1H,dd,J=4.1,12.2Hz),3.27(1H,ddd,J=1.4,9.5,10.2Hz),3.24-3.18(2H,m),3.17-3.08(2H,m),2.95(1H,dd,J=8.2,12.2Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6))δ169.3,150.0,138.1,131.0,112.3,107.7,109.0,103.2,80.0,76.3,76.1,74.90,71.5,71.2,71.0,70.1,62.6,60.9,52.8,46.9.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 540.1902[(M+Na)+],Calcd.for C20H31N5O11Na:540.1912
【0125】
βＧａｌ４－Ｎ３（2-azido-N-({[(β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)]amino}phenyl)acetamide、収率：９１％）
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.28(1H,t,J=8.4Hz),6.96(1H,s),6.86(1H,d,J=8.4Hz),6.72(1H,d,J=8.4Hz),4.51(1H,d,J=7.5Hz),4.14(2H,s),4.12(1H,t,J=3.9Hz),3.97-3.95(1H,m),3.93(1H,dd,J=10.2,3.4Hz),3.90-3.87(2H,m),3.76(1H,dd,J=11.9,6.4Hz),3.67(1H,dd,J=6.5,6.1Hz),3.64(1H,dd,J=3.4,3.2Hz),3.62(1H,d,J=6.1Hz),3.58(1H,dd,J=9.5,7.0Hz),3.40(1H,dd,J=12.9,4.7Hz),3.16(1H,dd,J=12.9,8.2Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6))δ169.5,149.5,137.9,130.6,112.6,112.5,108.1,103.7,80.2,75.6,73.1,71.7,71.6,71.1,70.6,69.1,62.6,61.3,52.8,47.0.
ESI-TOF/MS;Found:m/z 540.1912[(M+Na)+],Calcd.For C20H31N5O11Na:540.1912.
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.28(1H,t,J=8.4Hz),6.96(1H,s),6.86(1H,d,J=8.4Hz),6.72(1H,d,J=8.4Hz),4.51(1H,d,J=7.5Hz),4.14(2H,s),4.12(1H,t,J=3.9Hz),3.97-3.95(1H,m),3.93(1H,dd,J=10.2,3.4Hz),3.90-3.87(2H,m),3.76(1H,dd,J=11.9,6.4Hz),3.67(1H,dd,J=6.5,6.1Hz),3.64(1H,dd,J=3.4,3.2Hz),3.62(1H,d,J=6.1Hz),3.58(1H,dd,J=9.5,7.0Hz),3.40(1H,dd,J=12.9,4.7Hz),3.16(1H,dd,J=12.9,8.2Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6))δ169.5,149.5,137.9,130.6,112.6,112.5,108.1,103.7,80.2,75.6,73.1,71.7,71.6,71.1,70.6,69.1,62.6,61.3,52.8,47.0.
ESI-TOF/MS;Found:m/z 540.1912[(M+Na)+],Calcd.For C20H31N5O11Na:540.1912.
【0126】
αＧａｌ６－Ｎ３（2-azido-N-({[(α-D-galactopyranosyl)-(1→6)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)]amino}phenyl)acetamide、収率：５４％）
ESI-TOF/MS;Found:m/z 540.1902[(M+Na)+],Calcd.For C20H31N5O11:540.1912.
ESI-TOF/MS;Found:m/z 540.1902[(M+Na)+],Calcd.For C20H31N5O11:540.1912.
【0127】
αＦｕｃ２－βＧａｌ４－Ｎ３（2-azido-N-({[(α-D-fucosyl)-(1→2)-(β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)]amino}phenyl)acetamide、収率：８５％）
1H-NMR(400MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.11(1H,dd,J=7.9,8.2Hz),6.79(1H,dd,J=1.8,2.3Hz),6.70(1H,dd,J=1.8,7.9Hz),6.56(1H,dd,J=2.3,8.2Hz),5.16(1H,d,J=3.2Hz),4.42(1H,d,J=8.2Hz),4.09(1H,dd,J=5.9,12.8Hz),4.00(2H,s),3.84(1H,ddd,J=4.9,4.8,8.8Hz),3.99-3.93(1H,m),3.79-3.60(10H,m),3.57-3.46(5H,m),3.25(1H,dd,J=3.7,12.8Hz),2.98(1H,dd,J=8.2,13.6Hz),1.04(3H,d,J=6.4Hz).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 664.2672[(M+Na)+],Calcd.for C20H31N5O11Na:664.2678.
1H-NMR(400MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.11(1H,dd,J=7.9,8.2Hz),6.79(1H,dd,J=1.8,2.3Hz),6.70(1H,dd,J=1.8,7.9Hz),6.56(1H,dd,J=2.3,8.2Hz),5.16(1H,d,J=3.2Hz),4.42(1H,d,J=8.2Hz),4.09(1H,dd,J=5.9,12.8Hz),4.00(2H,s),3.84(1H,ddd,J=4.9,4.8,8.8Hz),3.99-3.93(1H,m),3.79-3.60(10H,m),3.57-3.46(5H,m),3.25(1H,dd,J=3.7,12.8Hz),2.98(1H,dd,J=8.2,13.6Hz),1.04(3H,d,J=6.4Hz).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 664.2672[(M+Na)+],Calcd.for C20H31N5O11Na:664.2678.
【0128】
αＸｙｌ６－Ｎ３（2-azido-N-({[(α-D-xylopyranosyl)-(1→6)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)]amino}phenyl)acetamide、収率：７４％）
1H-NMR(400MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.11(1H,dd,J=8.2,8.2Hz),6.79(1H,dd,J=1.4,2.0Hz),6.69(1H,dd,J=1.4,8.2Hz),6.54(1H,dd,J=2.0,8.2Hz),4.71(1H,d,J=3.4Hz),4.00(2H,s),3.84(1H,ddd,J=4.9,4.8,8.8Hz),3.77(1H,ddd,J=2.7,4.8,7.5Hz),3.74-3.69(2H,m),3.63(1H,dd,J=2.7,8.2Hz),3.55-3.48(2H,m),3.48-3.39(3H,m),3.38(1H,dd,J=4.1,9.5Hz),3.24(1H,dd,J=4.8,13.6Hz),3.02(1H,dd,J=7.5,13.6Hz).
13C-NMR(100MHz,D2O-DMSO(d6))δ170.0,150.3,139.1,131.6,112.8,112.6,109.0,104.4,77.3,77.1,74.7,72.9,72.6,72.0,71.3,71.0,62.1,53.6,47.5
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 510.1807[(M+Na)+],Calcd.for C19H29N5O10Na:510.1807
1H-NMR(400MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.11(1H,dd,J=8.2,8.2Hz),6.79(1H,dd,J=1.4,2.0Hz),6.69(1H,dd,J=1.4,8.2Hz),6.54(1H,dd,J=2.0,8.2Hz),4.71(1H,d,J=3.4Hz),4.00(2H,s),3.84(1H,ddd,J=4.9,4.8,8.8Hz),3.77(1H,ddd,J=2.7,4.8,7.5Hz),3.74-3.69(2H,m),3.63(1H,dd,J=2.7,8.2Hz),3.55-3.48(2H,m),3.48-3.39(3H,m),3.38(1H,dd,J=4.1,9.5Hz),3.24(1H,dd,J=4.8,13.6Hz),3.02(1H,dd,J=7.5,13.6Hz).
13C-NMR(100MHz,D2O-DMSO(d6))δ170.0,150.3,139.1,131.6,112.8,112.6,109.0,104.4,77.3,77.1,74.7,72.9,72.6,72.0,71.3,71.0,62.1,53.6,47.5
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 510.1807[(M+Na)+],Calcd.for C19H29N5O10Na:510.1807
【0129】
αＡｒａ５－Ｎ３（2-azido-N-({[(α-D-arabinopyranosyl)-(1→5)-(1-deoxy-D-arabinitol-1-yl)]amino}phenyl)acetamide、収率：６５％）
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.10(1H,dd,J=8.2Hz),6.80(1H,dd,J=1.3,2.0Hz),6.69(1H,dd,J=1.3,8.2Hz),6.51(1H,dd,J=2.0,8.2Hz),4.88(1H,brs),4.00(2H,s),3.96-3.87(3H,m),3.78(1H,dd,J=2.7,6.1Hz),3.74-3.70(2H,m),3.65(1H,dd,J=3.4,12.9Hz),3.60(1H,dd,J=4.8,13.6Hz),3.54(1H,dd,J=4.8,12.9Hz),3.47(1H,dd,J=1.3,7.5Hz),3.18(1H,dd,J=4.8,13.6Hz),3.10(1H,dd,J=8.2,13.6Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6))δ169.7,150.4,138.8,131.6,113.8,112.8,108.9,102.1,85.3,82.4,78.0,72.4,70.8,70.4,69.1,62.7,56.5,53.6.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 480.1701[(M+Na)+],Calcd.for C18H27N5O9Na:480.1701
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.10(1H,dd,J=8.2Hz),6.80(1H,dd,J=1.3,2.0Hz),6.69(1H,dd,J=1.3,8.2Hz),6.51(1H,dd,J=2.0,8.2Hz),4.88(1H,brs),4.00(2H,s),3.96-3.87(3H,m),3.78(1H,dd,J=2.7,6.1Hz),3.74-3.70(2H,m),3.65(1H,dd,J=3.4,12.9Hz),3.60(1H,dd,J=4.8,13.6Hz),3.54(1H,dd,J=4.8,12.9Hz),3.47(1H,dd,J=1.3,7.5Hz),3.18(1H,dd,J=4.8,13.6Hz),3.10(1H,dd,J=8.2,13.6Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6))δ169.7,150.4,138.8,131.6,113.8,112.8,108.9,102.1,85.3,82.4,78.0,72.4,70.8,70.4,69.1,62.7,56.5,53.6.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 480.1701[(M+Na)+],Calcd.for C18H27N5O9Na:480.1701
【0130】
αＭａｎ６－Ｎ３（2-azido-N-(α-D-mannopyranosyl)-(1→6)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino(phenyl)acetamide、収率：８４％）
1H-NMR(600MHz,D2O)δ7.09(1H,t,J=8.4Hz),6.77(1H,s),6.67(1H,d,J=7.5Hz),6.53(1H,d,J=8.2Hz),3.97(2H,s),3.83(1H,ddd,J=7.8,7.8,4.0Hz),3.80(1H,dd,J=4.0,1.4Hz),3.75(2H,tt,J=8.2,2.6Hz),3.71(1H,s),3.71-3.67(3H,m),3.66(1H,d,J=2.6Hz),3.61-3.58(2H,m),3.54-3.52(1H,m),3.50-3.47(2H,m),3.20(1H,dd,J=13.6,4.1Hz),3.00(1H,dd,J=13.6,7.8Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O)δ169.6,149.2,137.9,130.7,112.6,112.4,108.0,101.1,82.6,73.4,73.0,73.0,72.2,71.9,69.9,69.5,62.7,60.9,52.8,47.1.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 540.1907[(M+Na)+],Calcd. for C20H31N5O11Na:540.1912.
1H-NMR(600MHz,D2O)δ7.09(1H,t,J=8.4Hz),6.77(1H,s),6.67(1H,d,J=7.5Hz),6.53(1H,d,J=8.2Hz),3.97(2H,s),3.83(1H,ddd,J=7.8,7.8,4.0Hz),3.80(1H,dd,J=4.0,1.4Hz),3.75(2H,tt,J=8.2,2.6Hz),3.71(1H,s),3.71-3.67(3H,m),3.66(1H,d,J=2.6Hz),3.61-3.58(2H,m),3.54-3.52(1H,m),3.50-3.47(2H,m),3.20(1H,dd,J=13.6,4.1Hz),3.00(1H,dd,J=13.6,7.8Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O)δ169.6,149.2,137.9,130.7,112.6,112.4,108.0,101.1,82.6,73.4,73.0,73.0,72.2,71.9,69.9,69.5,62.7,60.9,52.8,47.1.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 540.1907[(M+Na)+],Calcd. for C20H31N5O11Na:540.1912.
【0131】
（βＧｌｃＮＡｃ４）４－Ｎ３（2-azido-N-[(2-acetamido-1-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(2-acetamido-1-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(2-acetoamido-1-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(2-acetamido-1-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(2-acetamido-1,2-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino(phenyl)]acetamide、収率：５８％）
1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ7.19(1H,dd,J=8.4,8.4Hz),6.93(1H,s),6.80(1H,d,J=8.4Hz),6.61(1H,d,J=8.4Hz),4.57-4.51(4H,m),4.31(1H,dd,J=12.2,6.7Hz),4.11(3H,d,J=7.8Hz),3.90(2H,d,J=12.2Hz),3.83(2H,d,J=10.1Hz),3.76-3.74(4H,m),3.70-3.55(13H,m),3.53-3.51(6H,m),3.41(1H,t,J=9.2Hz),3.36-3.33(1H,m),3.22(1H,dd,J=14.3,7.5Hz),2.04(3H,s),2.04(3H,s),2.04(3H,s),2.01(3H,s),1.97(3H,s).
13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ174.6,169.0,130.8,115.2,111.9,111.5,107.0,104.3,104.0,86.2,86.2,80.9,77.5,77.1,77.0,75.8,74.9,74.6,74.5,74.5,72.0,71.9,71.8,71.0,69.9,64.1,62.1,62.0,53.2,49.6,49.4,49.3,49.0,49.0,48.9,48.7,48.6,46.8.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found: m/z 1231.4810[(M+Na)+],Calcd.for C48H76N10O26Na:1231.4824.
1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ7.19(1H,dd,J=8.4,8.4Hz),6.93(1H,s),6.80(1H,d,J=8.4Hz),6.61(1H,d,J=8.4Hz),4.57-4.51(4H,m),4.31(1H,dd,J=12.2,6.7Hz),4.11(3H,d,J=7.8Hz),3.90(2H,d,J=12.2Hz),3.83(2H,d,J=10.1Hz),3.76-3.74(4H,m),3.70-3.55(13H,m),3.53-3.51(6H,m),3.41(1H,t,J=9.2Hz),3.36-3.33(1H,m),3.22(1H,dd,J=14.3,7.5Hz),2.04(3H,s),2.04(3H,s),2.04(3H,s),2.01(3H,s),1.97(3H,s).
13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ174.6,169.0,130.8,115.2,111.9,111.5,107.0,104.3,104.0,86.2,86.2,80.9,77.5,77.1,77.0,75.8,74.9,74.6,74.5,74.5,72.0,71.9,71.8,71.0,69.9,64.1,62.1,62.0,53.2,49.6,49.4,49.3,49.0,49.0,48.9,48.7,48.6,46.8.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found: m/z 1231.4810[(M+Na)+],Calcd.for C48H76N10O26Na:1231.4824.
【0132】
（βＧｌｃ３）４－Ｎ３（2-azido-N-[(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino(phenyl)]acetamide、収率：５２％）
1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ7.16(1H,dd,J=8.4,8.4Hz),6.94(1H,s),6.84(1H,d,J=8.4Hz),6.59(1H,d,J=8.4Hz),4.81-4.78(5H,m),4.74-4.69(3H,m),4.25-4.21(1H,m),4.07(2H,s),4.04(1H,d,J=6.6Hz),4.00-3.94(5H,m),3.83(1H,dd,J=11.6,2.7Hz),3.71-3.61(10H,m),3.56(1H,t,J=8.5Hz),3.51(2H,m),3.47-3.39(10H,m),3.43-3.38(2H,m),3.16(1H,dd,J=13.6,8.2Hz).
13C-NMR(600 MHz, CD3OD)δ174.6,169.0,130.8,115.2,111.9,111.5,107.0,104.3,104.0,86.2,86.2,80.9,77.5,77.1,77.0,75.8,74.9,74.6,74.5,74.4,72.0,71.9,71.8,71.0,69.9,64.1,62.1,62.0,53.2,49.6,49.4,49.3,49.1,49.0,48.9,48.7,48.6,46.8.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 1026.3483[(M+Na)+],Calcd.for C38H61N5O26Na:1026.3497.
1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ7.16(1H,dd,J=8.4,8.4Hz),6.94(1H,s),6.84(1H,d,J=8.4Hz),6.59(1H,d,J=8.4Hz),4.81-4.78(5H,m),4.74-4.69(3H,m),4.25-4.21(1H,m),4.07(2H,s),4.04(1H,d,J=6.6Hz),4.00-3.94(5H,m),3.83(1H,dd,J=11.6,2.7Hz),3.71-3.61(10H,m),3.56(1H,t,J=8.5Hz),3.51(2H,m),3.47-3.39(10H,m),3.43-3.38(2H,m),3.16(1H,dd,J=13.6,8.2Hz).
13C-NMR(600 MHz, CD3OD)δ174.6,169.0,130.8,115.2,111.9,111.5,107.0,104.3,104.0,86.2,86.2,80.9,77.5,77.1,77.0,75.8,74.9,74.6,74.5,74.4,72.0,71.9,71.8,71.0,69.9,64.1,62.1,62.0,53.2,49.6,49.4,49.3,49.1,49.0,48.9,48.7,48.6,46.8.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 1026.3483[(M+Na)+],Calcd.for C38H61N5O26Na:1026.3497.
【0133】
（αＧｌｃ６）ｎ－Ｎ３（2-azido-N-(dextran)amino(phenyl)]acetamide、ＭＷ１７，０００）
1H-NMR(400MHz,D2O)δ7.24(1H,dd,J=7.8,8.2Hz),6.89(1H,brs),6.85(1H,d,J=8.2Hz),6.69(1H,d,J=7.8Hz),5.04-4.90(~75H,m),4.10-3.36(~450H,m).
1H-NMR(400MHz,D2O)δ7.24(1H,dd,J=7.8,8.2Hz),6.89(1H,brs),6.85(1H,d,J=8.2Hz),6.69(1H,d,J=7.8Hz),5.04-4.90(~75H,m),4.10-3.36(~450H,m).
【0134】
（αＧｌｃ６）ｎ－Ｎ３（2-azido-N-(dextran)amino(phenyl)]acetamide、ＭＷ４０，０００）
1H-NMR(400MHz,D2O)δ7.15-7.05(1H,br),6.82-6.67(2H,m),6.59-6.52(1H,m),4.92-4.74(~150H,m),3.97-3.22(~900H,m).
1H-NMR(400MHz,D2O)δ7.15-7.05(1H,br),6.82-6.67(2H,m),6.59-6.52(1H,m),4.92-4.74(~150H,m),3.97-3.22(~900H,m).
【0135】
［製造例５：クリック反応による糖鎖ＴＬＲリガンド複合体の合成］
下記に示すように糖鎖ＴＬＲリガンド複合体であるαＧｌｃ４－１Ｖ２０９（4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)-N-(α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino(phenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)benzamide、式（１０））を合成した。αＧｌｃ４－１Ｖ２０９の合成では、αＧｌｃ４－Ｎ３（式（２３））と１Ｖ２０９一本鎖誘導体（式（２０））とを混合した後、硫酸銅とアスコルビン酸ナトリウム存在下、クリック反応を行って、αＧｌｃ４－１Ｖ２０９（式（１０））を４９％の収率で調製した。
下記に示すように糖鎖ＴＬＲリガンド複合体であるαＧｌｃ４－１Ｖ２０９（4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)-N-(α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino(phenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)benzamide、式（１０））を合成した。αＧｌｃ４－１Ｖ２０９の合成では、αＧｌｃ４－Ｎ３（式（２３））と１Ｖ２０９一本鎖誘導体（式（２０））とを混合した後、硫酸銅とアスコルビン酸ナトリウム存在下、クリック反応を行って、αＧｌｃ４－１Ｖ２０９（式（１０））を４９％の収率で調製した。
【0136】
【化16】
【0137】
詳細には、αＧｌｃ４－Ｎ３（１５．２ｍｇ，３８．３μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、硫酸銅五水和物（４．７８ｍｇ，１９．２μｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウムを加え、その後、蒸溜水（１ｍＬ）に溶かしておいた１Ｖ２０９一本鎖誘導体（αＧｌｃ４－１Ｖ２０９，１４．２ｍｇ，２７．４μｍｏｌ）を加え５０℃で２４時間撹拌した。エバポレーターで濃縮し残渣を回収、中圧ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（蒸溜水：メタノール＝５：５）で精製し、αＧｌｃ４－１Ｖ２０９を白色固体（１２．２ｍｇ，４９％）として得た。
【0138】
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6))δ7.97(1H,s),7.83(2H,d,J=8.2Hz),7.37(2H,d,J=8.2Hz),7.00(1H,dd,J=8.2Hz),6.86(1H,s),6.74(1H,d,J=8.2Hz),6.35(1H,d,J=8.2Hz),5.24(2H,s),4.93(2H,s),4.85(1H,d,J=4.1Hz),4.53(2H,s),4.25(2H,dd,J=6.1,4.7Hz),3.73(3H,dd,J=12.2,6.5Hz),3.62(3H,d,J=9.5Hz),3.57(2H,t,J=4.4Hz),3.51(1H,dd,J=12.2,3.4Hz),3.47(1H,dd,J=11.9,5.8Hz),3.41(2H,dt,J=11.9,9.5Hz),3.28(1H,dd,J=9.5,4.1Hz),3.25(3H,s),3.13-3.11(2H,m),3.01(1H,dd,J=12.6,6.5Hz),1.97(2H,s).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6))δ170.5,166.4,164.1,160.2,152.6,149.7,149.4,148.0,145.2,140.7,139.2,133.5,132.0,129.6,127.9,127.6,124.9,108.5,107.2,103.1,101.4,101.3,98.4,84.4,73.5,73.4,72.3,72.2,71.6,70.5,70.0,68.9,65.7,62.5,60.8,58.4,52.4,46.6,42.4.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 936.3436[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6))δ170.5,166.4,164.1,160.2,152.6,149.7,149.4,148.0,145.2,140.7,139.2,133.5,132.0,129.6,127.9,127.6,124.9,108.5,107.2,103.1,101.4,101.3,98.4,84.4,73.5,73.4,72.3,72.2,71.6,70.5,70.0,68.9,65.7,62.5,60.8,58.4,52.4,46.6,42.4.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 936.3436[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
【0139】
αＧｌｃ４－１Ｖ２０９と糖鎖成分が異なる、下記に示す糖鎖ＴＬＲリガンド複合体を、糖鎖を代えてαＧｌｃ４－１Ｖ２０９と同様の操作で合成した。
【0140】
βＧａｌ４－１Ｖ２０９（4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)-N-(β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino(phenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)benzamide、収率：８７％）
1H-NMR(600MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.93(1H,s),7.79(2H,d,J=8.4Hz),7.33(2H,d,J=8.4Hz),6.96(1H,dd,J=8.4Hz),6.81(1H,s),6.72(1H,d,J=8.2Hz),6.33(1H,d,J=8.2Hz),5.21(2H,s),4.89(2H,s),4.49(2H,s),4.26(1H,d,J=7.5Hz),4.22(2H,t,J=4.4Hz),3.79-3.76(1H,m),3.68-3.64(3H,m),3.56-3.52(4H,m),3.50-3.48(2H,m),3.43(1H,dd,J=10.5,6.5Hz),3.37(1H,dd,J=6.1Hz),3.32(1H,dd,J=8.5Hz),3.29(1H,dd,J=10.5,3.1Hz),3.22(3H,s),3.12(1H,dd,J=12.5,5.8Hz),2.93(1H,dd,J=12.9,6.5Hz),2.49(2H,t,J=1.7Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6)(1:40))δ166.4,164.1,160.2,152.7,149.8,149.4,148.0,145.2,140.7,139.2,133.4,129.5,127.8,127.6.124.9.108.7,107.3,104.5,104.5,103.2,99.8,98.6,82.8,75.6,73.3,71.5,71.3,70.8,70.5,69.3,68.2,65.7,62.2,60.4,58.4,52.5,52.4,46.4,42.4.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 936.3410[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
1H-NMR(600MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.93(1H,s),7.79(2H,d,J=8.4Hz),7.33(2H,d,J=8.4Hz),6.96(1H,dd,J=8.4Hz),6.81(1H,s),6.72(1H,d,J=8.2Hz),6.33(1H,d,J=8.2Hz),5.21(2H,s),4.89(2H,s),4.49(2H,s),4.26(1H,d,J=7.5Hz),4.22(2H,t,J=4.4Hz),3.79-3.76(1H,m),3.68-3.64(3H,m),3.56-3.52(4H,m),3.50-3.48(2H,m),3.43(1H,dd,J=10.5,6.5Hz),3.37(1H,dd,J=6.1Hz),3.32(1H,dd,J=8.5Hz),3.29(1H,dd,J=10.5,3.1Hz),3.22(3H,s),3.12(1H,dd,J=12.5,5.8Hz),2.93(1H,dd,J=12.9,6.5Hz),2.49(2H,t,J=1.7Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6)(1:40))δ166.4,164.1,160.2,152.7,149.8,149.4,148.0,145.2,140.7,139.2,133.4,129.5,127.8,127.6.124.9.108.7,107.3,104.5,104.5,103.2,99.8,98.6,82.8,75.6,73.3,71.5,71.3,70.8,70.5,69.3,68.2,65.7,62.2,60.4,58.4,52.5,52.4,46.4,42.4.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 936.3410[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
【0141】
ｔｒｉ－βＧａｌ４－１Ｖ２０９（4-[2-(4-{[6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl]methyl}benzamido)acetamido]-N1,N7-bis[(1-{2-[(3-{(β-D-galacopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino}phenyl)amino]-2-oxoethyl}-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]-4-[3-({[1-(2-{(3-[(β-D-galacopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino]phenyl)amino}-2-oxoethyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl]methyl}amino)-3-oxopropyl]heptanediamide、収率：５０％）
13C-NMR(100MHz,D2O-DMSO(d6))δ.
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:1))δ7.76(3H,s),7.58(2H,d,J=8.4Hz),7.23(2H,d,J=8.4Hz),6.95(3H,dd,J=8.4Hz),6.73(3H,s),6.65(3H,d,J=8.4Hz),6.36(3H,d,J=8.4Hz),5.12(6H,s),4.81(2H,s),4.27(4H,d,J=7.5Hz),4.20(9H,d,J=17.7Hz),3.81(4H,s),3.73(2H,s),3.68(9H,s),3.63(9H,dd,J=18.4,2.7Hz),3.58(4H,d,J=10.2Hz),3.51(7H,dd,J=10.8,4.1Hz),3.46(8H,d,J=6.1Hz),3.38(5H,dd,J=4.7Hz),3.36(3H,d,J=2.7Hz),3.32(4H,dd,J=8.5Hz),3.12(2H,s),2.91(3H,dd,J=10.2,6.8Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6))δ174.3,164.3,153.0,148.9,144.3,137.8,129.6,127.5,127.3,127.3,124.7,108.9,108.8,104.2104.2,102.8,79.6,74.7,72.2,70.8,70.6,70.1,69.9,68.0,65.5,61.5,60.2,57.8,52.0,45.7,33.9,29.3.
ESI-TOF/MS(positive mode); Found: m/z 1176.9612[(M+2Na)2+],Calcd.for C97H137N25O41Na2:2353.9188.
13C-NMR(100MHz,D2O-DMSO(d6))δ.
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:1))δ7.76(3H,s),7.58(2H,d,J=8.4Hz),7.23(2H,d,J=8.4Hz),6.95(3H,dd,J=8.4Hz),6.73(3H,s),6.65(3H,d,J=8.4Hz),6.36(3H,d,J=8.4Hz),5.12(6H,s),4.81(2H,s),4.27(4H,d,J=7.5Hz),4.20(9H,d,J=17.7Hz),3.81(4H,s),3.73(2H,s),3.68(9H,s),3.63(9H,dd,J=18.4,2.7Hz),3.58(4H,d,J=10.2Hz),3.51(7H,dd,J=10.8,4.1Hz),3.46(8H,d,J=6.1Hz),3.38(5H,dd,J=4.7Hz),3.36(3H,d,J=2.7Hz),3.32(4H,dd,J=8.5Hz),3.12(2H,s),2.91(3H,dd,J=10.2,6.8Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6))δ174.3,164.3,153.0,148.9,144.3,137.8,129.6,127.5,127.3,127.3,124.7,108.9,108.8,104.2104.2,102.8,79.6,74.7,72.2,70.8,70.6,70.1,69.9,68.0,65.5,61.5,60.2,57.8,52.0,45.7,33.9,29.3.
ESI-TOF/MS(positive mode); Found: m/z 1176.9612[(M+2Na)2+],Calcd.for C97H137N25O41Na2:2353.9188.
【0142】
βＧｌｃ６－１Ｖ２０９（4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)-N-(β-D-glucopyranosyl)-(1→6)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino(phenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)benzamide、収率：４７％）
1H-NMR(400MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.92(1H,s),7.76(2H,d,J=8.2Hz),7.33(2H,d,J=8.2Hz),7.00(1H,dd,J=7.8,8.2Hz),6.83(1H,brs),6.68(1H,d,J=7.8Hz),6.34(1H,d,J=8.2Hz),5.19(2H,s),4.90(2H,s),4.50(2H,s),4.26-4.19(2H,m),4.15(1H,d,J=8.2Hz),3.75-3.69(1H,m),3.69-3.60(2H,m),3.57-3.50(2H,m),3.48-3.38(2H,m),3.24-2.96(7H,m),2.94-2.86(2H,m).
13C-NMR(100MHz, D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ171.8,167.3,164.6,160.7,153.3,150.0,149.8,145.6,141.2,139.4,133.7,130.1,128.3,128.2,128.1,125.5,109.4,108.2,104.8,104.0,98.9,77.1,76.6,74.1,72.5,72.4,71.6,70.8,70.5,70.5,70.2,66.2,61.5,58.8,52.9,46.4,42.9,35.4.
ESI-TOF/MS (positive mode);Found:m/z936.3457[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
1H-NMR(400MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.92(1H,s),7.76(2H,d,J=8.2Hz),7.33(2H,d,J=8.2Hz),7.00(1H,dd,J=7.8,8.2Hz),6.83(1H,brs),6.68(1H,d,J=7.8Hz),6.34(1H,d,J=8.2Hz),5.19(2H,s),4.90(2H,s),4.50(2H,s),4.26-4.19(2H,m),4.15(1H,d,J=8.2Hz),3.75-3.69(1H,m),3.69-3.60(2H,m),3.57-3.50(2H,m),3.48-3.38(2H,m),3.24-2.96(7H,m),2.94-2.86(2H,m).
13C-NMR(100MHz, D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ171.8,167.3,164.6,160.7,153.3,150.0,149.8,145.6,141.2,139.4,133.7,130.1,128.3,128.2,128.1,125.5,109.4,108.2,104.8,104.0,98.9,77.1,76.6,74.1,72.5,72.4,71.6,70.8,70.5,70.5,70.2,66.2,61.5,58.8,52.9,46.4,42.9,35.4.
ESI-TOF/MS (positive mode);Found:m/z936.3457[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
【0143】
βＧｌｃ４－１Ｖ２０９（4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)-N-(β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino(phenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)benzamide、収率：４５％）
1H-NMR(400MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.97(1H,s),7.82(2H,d,J=8.2Hz),7.39(2H,d,J=8.2Hz),7.04(1H,dd,J=7.8,8.2Hz),6.90(1H,brs),6.74(1H,d,J=7.8Hz),6.41(1H,d,J=8.2Hz),5.25(2H,s),4.96(2H,s),4.56(2H,s),4.38(1H,d,J=6.9Hz),4.32-4.24(2H,m),3.89-3.81(1H,m),3.81-3.64(4H,m),3.64-3.52(4H,m),3.47(1H,dd,J=5.5,11.0Hz),3.26(3H,s),3.25-2.96(7H,m).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 936.3457[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
1H-NMR(400MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.97(1H,s),7.82(2H,d,J=8.2Hz),7.39(2H,d,J=8.2Hz),7.04(1H,dd,J=7.8,8.2Hz),6.90(1H,brs),6.74(1H,d,J=7.8Hz),6.41(1H,d,J=8.2Hz),5.25(2H,s),4.96(2H,s),4.56(2H,s),4.38(1H,d,J=6.9Hz),4.32-4.24(2H,m),3.89-3.81(1H,m),3.81-3.64(4H,m),3.64-3.52(4H,m),3.47(1H,dd,J=5.5,11.0Hz),3.26(3H,s),3.25-2.96(7H,m).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 936.3457[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
【0144】
αＧａｌ６－１Ｖ２０９（4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)-N-(α-D-galactopyranosyl)-(1→6)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino(phenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)benzamide、収率：３６％）
1H-NMR(400MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.97(1H,s),7.82(2H,d,J=7.8Hz),7.39(2H,d,J=7.8Hz),7.05(1H,dd,J=7.3,8.2Hz),6.88(1H,brs),6.73(1H,d,J=8.2Hz),6.39(1H,d,J=7.3Hz),5.24(2H,s),4.96(2H,s),4.71(1H,d,J=2.3Hz),4.55(2H,s),4.31-4.24(2H,m),3.82-3.66(6H,m),3.65-3.43(8H,m),3.26(3H,s),3.21(1H,dd,J=6.0,12.8Hz),2.97(1H,dd,J=6.9,12.8Hz).
13C-NMR(100MHz, D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ167.3.,164.6,160.7,153.3,150.0,149.8,145.6,141.2,139.4,133.7,130.2,128.3,128.1,125.5,108.2,104.6,103.9,99.3,98.9,74.4,72.4,71.8,70.8,70.2,70.0,69.8, 69.5,69.2,66.2,61.2,58.8,46.4,42.9,35.3.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 936.3476[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
1H-NMR(400MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.97(1H,s),7.82(2H,d,J=7.8Hz),7.39(2H,d,J=7.8Hz),7.05(1H,dd,J=7.3,8.2Hz),6.88(1H,brs),6.73(1H,d,J=8.2Hz),6.39(1H,d,J=7.3Hz),5.24(2H,s),4.96(2H,s),4.71(1H,d,J=2.3Hz),4.55(2H,s),4.31-4.24(2H,m),3.82-3.66(6H,m),3.65-3.43(8H,m),3.26(3H,s),3.21(1H,dd,J=6.0,12.8Hz),2.97(1H,dd,J=6.9,12.8Hz).
13C-NMR(100MHz, D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ167.3.,164.6,160.7,153.3,150.0,149.8,145.6,141.2,139.4,133.7,130.2,128.3,128.1,125.5,108.2,104.6,103.9,99.3,98.9,74.4,72.4,71.8,70.8,70.2,70.0,69.8, 69.5,69.2,66.2,61.2,58.8,46.4,42.9,35.3.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 936.3476[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
【0145】
αＦｕｃ２－βＧａｌ４－１Ｖ２０９（4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)-N-(α-D-fucosyl)-(1→2)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino(phenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)benzamide、収率：４０％）
1H-NMR(400MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.93(1H,s),7.82(2H,d,J=7.8Hz),7.39(2H,d,J=7.8Hz),7.04(1H,dd,J=7.8,7.8Hz),6.88(1H,brs),6.77(1H,d,J=7.8Hz),6.42(1H,d,J=7.8Hz),5.26(2H,s),5.09(1H,s),4.96(2H,s),4.55(2H,s),4.47(1H,d,J=6.8Hz),4.32-4.25(2H,m),3.91-3.83(1H,m),3.81-3.67(3H,m),3.67-3.40(12H,m),3.26(3H,s),3.26-3.18(1H,m),3.01-2.92(1H,m),1.07(3H,d,J=6.4).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 000.0000[(M+Na)+],Calcd.for C45H61N11O19Na:1082.4037.
1H-NMR(400MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.93(1H,s),7.82(2H,d,J=7.8Hz),7.39(2H,d,J=7.8Hz),7.04(1H,dd,J=7.8,7.8Hz),6.88(1H,brs),6.77(1H,d,J=7.8Hz),6.42(1H,d,J=7.8Hz),5.26(2H,s),5.09(1H,s),4.96(2H,s),4.55(2H,s),4.47(1H,d,J=6.8Hz),4.32-4.25(2H,m),3.91-3.83(1H,m),3.81-3.67(3H,m),3.67-3.40(12H,m),3.26(3H,s),3.26-3.18(1H,m),3.01-2.92(1H,m),1.07(3H,d,J=6.4).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 000.0000[(M+Na)+],Calcd.for C45H61N11O19Na:1082.4037.
【0146】
αＸｙｌ６－１Ｖ２０９（4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)-N-(α-D-xylopyranosyl)-(1→6)- (1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino(phenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)benzamide、収率：４０％）
1H-NMR(400MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.97(1H,s),7.82(2H,d,J=7.8Hz),7.38(2H,d,J=7.8Hz),7.03(1H,dd,J=7.8,8.2Hz),6.87(1H,brs),6.75(1H,d,J=1.8,7.8Hz),6.38(1H,d,J=2.2,8.2Hz),5.24(2H,s),4.94(2H,s),4.63(1H,d,J=3.2Hz),4.55(2H,s),4.47(1H,d,J=6.8Hz),4.32-4.25(2H,m),3.91-3.83(1H,m),3.81-3.67(3H,m),3.67-3.40(12H,m),3.26(3H,s),3.26-3.18(1H,m),3.01-2.92(1H,m),1.07(3H,d,J=6.4).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 906.3458[(M+Na)+],Calcd.for C38H49N11O14Na:906.3353.
1H-NMR(400MHz,D2O(1滴)-DMSO(d6)(1:40))δ7.97(1H,s),7.82(2H,d,J=7.8Hz),7.38(2H,d,J=7.8Hz),7.03(1H,dd,J=7.8,8.2Hz),6.87(1H,brs),6.75(1H,d,J=1.8,7.8Hz),6.38(1H,d,J=2.2,8.2Hz),5.24(2H,s),4.94(2H,s),4.63(1H,d,J=3.2Hz),4.55(2H,s),4.47(1H,d,J=6.8Hz),4.32-4.25(2H,m),3.91-3.83(1H,m),3.81-3.67(3H,m),3.67-3.40(12H,m),3.26(3H,s),3.26-3.18(1H,m),3.01-2.92(1H,m),1.07(3H,d,J=6.4).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 906.3458[(M+Na)+],Calcd.for C38H49N11O14Na:906.3353.
【0147】
αＡｒａ５－１Ｖ２０９（4-((6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl)-N-(α-D-arabinopyranosyl)-(1→5)-(1-deoxy-D-arabinitol-1-yl)amino(phenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)benzamide、収率：１６％）
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 876.3247[(M+Na)+],Calcd.for C37H47N11O13Na:876.3247.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 876.3247[(M+Na)+],Calcd.for C37H47N11O13Na:876.3247.
【0148】
αＭａｎ６－１Ｖ２０９（4-[{6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl}methyl]-N-[(1-{2-([3-{(α-D-mannopyranosyl)-(1→6)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)-amino}phenyl]amino]-2-oxoethyl}-1H-1,2,3-triazol-4-yl}methyl]benzamide、収率：４８％）
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:40))δ7.97(1H,s),7.82(2H,d,J=8.2Hz),7.38(2H,d,J=8.2Hz),7.02(1H,dd,J=8.2Hz),6.87(1H,s),6.74(1H,d,J=8.2Hz),6.37(1H,d,J=8.2Hz),5.24(2H,s),4.94(2H,s),4.64(1H,d,J=4.1Hz),4.54(2H,s),4.20(2H,d,J=4.1Hz),3.78(1H,s),3.69(1H,t,J=5.4Hz)3.64-3.34(18H,m),3.22-3.17(4H,m),3.12(1H,dd,J=12.9Hz),2.88(1H,dd,J=12.6,4.6Hz),2.04(2H,s).
13C-NMR:(150MHz,D2O-DMSO(d6)(1:40))δ166.4,165.8,163.6,152.9,149.1,148.4,145.0,144.6,140.5,139.0,133.3,129.1,127.5,127.3,124.6,108.8,108.4,106.8,106.6,102.7,102.4,99.5,99.3,73.0,72.7,72.5,70.8,70.5,70.2,69.5,68.7,68.6,66.5,66.1,60.5,57.9,51.2,46.4,42.1.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 936.3471[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:40))δ7.97(1H,s),7.82(2H,d,J=8.2Hz),7.38(2H,d,J=8.2Hz),7.02(1H,dd,J=8.2Hz),6.87(1H,s),6.74(1H,d,J=8.2Hz),6.37(1H,d,J=8.2Hz),5.24(2H,s),4.94(2H,s),4.64(1H,d,J=4.1Hz),4.54(2H,s),4.20(2H,d,J=4.1Hz),3.78(1H,s),3.69(1H,t,J=5.4Hz)3.64-3.34(18H,m),3.22-3.17(4H,m),3.12(1H,dd,J=12.9Hz),2.88(1H,dd,J=12.6,4.6Hz),2.04(2H,s).
13C-NMR:(150MHz,D2O-DMSO(d6)(1:40))δ166.4,165.8,163.6,152.9,149.1,148.4,145.0,144.6,140.5,139.0,133.3,129.1,127.5,127.3,124.6,108.8,108.4,106.8,106.6,102.7,102.4,99.5,99.3,73.0,72.7,72.5,70.8,70.5,70.2,69.5,68.7,68.6,66.5,66.1,60.5,57.9,51.2,46.4,42.1.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 936.3471[(M+Na)+],Calcd.for C39H51N11O15Na:936.3458.
【0149】
（βＧｌｃＮＡｃ４）４－１Ｖ２０９（4-[{6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl}methyl]-N-[(1-{2-[(3-{(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(2-acetamido-1,2-deoxy-D-glucitol-1-yl)-amino}phenyl)amino]-2-oxoethyl}-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]benzamide、収率：３８％）
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 1627.6375[(M+Na)+],Calcd.for C67H96N16O30Na:1627.6370.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 1627.6375[(M+Na)+],Calcd.for C67H96N16O30Na:1627.6370.
【0150】
（βＧｌｃ３）４－１Ｖ２０９（4-[{6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl}methyl]-N-[(1-{2-[(3-{(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)-amino}phenyl)amino]-2-oxoethyl}-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]benzamide、収率：８４％）
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:40))δ7.85(1H,s),7.65(3H,d,J=8.2Hz),7.29(4H,d,J=8.2Hz),6.98(1H,dd,J=8.2Hz),6.75(1H,s),6.64(1H,d,J=8.2Hz),6.37(1H,d,J=8.2Hz),5.14(2H,s),4.87(4H,s),4.51-4.43(6H,m),4.42-4.40(5H,m),4.36-4.34(1H,m),4.21-4.17(4H,m),3.93-3.87(2H,m),3.81-3.78(1H,m),3.69-3.60(7H,m),3.59-3.55(1H,m),3.52-3.29(19H,m),3.29-3.13(9H,m),3.06-3.04(3H,m),2.95-2.93(1H,m),2.51(2H,d,J=3.6Hz).
ESI-TOF/MS(positive mode)Found:m/z 1422.5053[(M+Na)+],Calcd.for C57H81N11O30Na:1422.5043.
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:40))δ7.85(1H,s),7.65(3H,d,J=8.2Hz),7.29(4H,d,J=8.2Hz),6.98(1H,dd,J=8.2Hz),6.75(1H,s),6.64(1H,d,J=8.2Hz),6.37(1H,d,J=8.2Hz),5.14(2H,s),4.87(4H,s),4.51-4.43(6H,m),4.42-4.40(5H,m),4.36-4.34(1H,m),4.21-4.17(4H,m),3.93-3.87(2H,m),3.81-3.78(1H,m),3.69-3.60(7H,m),3.59-3.55(1H,m),3.52-3.29(19H,m),3.29-3.13(9H,m),3.06-3.04(3H,m),2.95-2.93(1H,m),2.51(2H,d,J=3.6Hz).
ESI-TOF/MS(positive mode)Found:m/z 1422.5053[(M+Na)+],Calcd.for C57H81N11O30Na:1422.5043.
【0151】
ｔｒｉ－αＭａｎ６－１Ｖ２０９（4-[2-(4-{[6-Amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl]methyl}benzamido)acetamido]-N1,N7-bis[(1-{2-[(3-{(α-D-mannopyranosyl)-(α1→6)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino}phenyl)amino]-2-oxoethyl}-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]-4-[3-({[1-(2-{(3-[(α-D-mannopyranosyl)-(1→6)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino]phenyl)amino}-2-oxoethyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl]methyl}amino)-3-oxopropyl]heptanediamide、収率：３０％）
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:1))δ7.75(3H,s),7.58(2H,d,J=8.4Hz),7.23(1H,d,J=8.4Hz),6.96(2H,dd,J=8.4Hz),6.73(3H,d,J=8.4Hz),6.64(3H,d,J=8.4Hz),6.35(3H,d,J=8.4Hz),5.11(6H,s),4.83(2H,d,J=10.9Hz),4.61(4H,s),4.21(8H,d,J=10.4Hz),3.72(6H,s),3.68(5H,s),3.64(6H,dd,J=7.5Hz),3.61(9H,s),3.57(5H,dd,J=10.2,2.7Hz),3.51(7H,dd,J=11.6,4.8Hz),3.46(9H,dd,J=8.5Hz),3.43(6H,s),3.40(3H,d,J=10.2Hz),3.12(4H,dd,J=10.2,4.8Hz),2.91(3H,dd,J=10.2,8.1Hz).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 1176.9563[(M+2Na)2+],Calcd.for C97H137N25O41Na2:2353.9188.
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:1))δ7.75(3H,s),7.58(2H,d,J=8.4Hz),7.23(1H,d,J=8.4Hz),6.96(2H,dd,J=8.4Hz),6.73(3H,d,J=8.4Hz),6.64(3H,d,J=8.4Hz),6.35(3H,d,J=8.4Hz),5.11(6H,s),4.83(2H,d,J=10.9Hz),4.61(4H,s),4.21(8H,d,J=10.4Hz),3.72(6H,s),3.68(5H,s),3.64(6H,dd,J=7.5Hz),3.61(9H,s),3.57(5H,dd,J=10.2,2.7Hz),3.51(7H,dd,J=11.6,4.8Hz),3.46(9H,dd,J=8.5Hz),3.43(6H,s),3.40(3H,d,J=10.2Hz),3.12(4H,dd,J=10.2,4.8Hz),2.91(3H,dd,J=10.2,8.1Hz).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 1176.9563[(M+2Na)2+],Calcd.for C97H137N25O41Na2:2353.9188.
【0152】
ｔｒｉ－αＧｌｃ４－１Ｖ２０９（4-[2-(4-{[6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl]methyl}benzamido)acetamido]-N1,N7-bis[(1-{2-[(3-{(α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino}phenyl)amino]-2-oxoethyl}-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]-4-[3-({[1-(2-{(3-[(α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino]phenyl)amino}-2-oxoethyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl]methyl}amino)-3-oxopropyl]heptanediamide、収率：２８％）
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:1))δ7.73(3H,s),7.55(2H,d,J=8.4Hz),7.21(2H,d,J=8.4Hz),6.94(3H,dd,J=8.4Hz),6.71(3H,s),6.60(3H,d,J=8.4Hz),6.33(3H,d,J=8.4Hz),5.10(6H,s),4.85(3H,d,J=3.4Hz),4.79(2H,s),4.23-4.15(9H,m),3.71-3.67(10H,m),3.67-3.64(8H,m),3.63(3H,dd,J=5.4,2.0Hz),3.62-3.58(6H,m),3.52-3.45(14H,m),3.39(4H,dd,J=11.6,6.8Hz),3.31(4H,dd,J=10.2,5.4Hz),3.17(3H,d,J=9.6Hz),3.14(3H,d,J=3.4Hz),3.08(3H,dd,J=12.9,4.0Hz),2.97(3H,dd,J=12.9,7.4Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6)(1:1))δ176.2,166.1,154.9,150.4,146.1,139.4,131.3,129.0,126.4,111.4,110.6,106.6,106.0,102.0,101.9,100.0,84.9,83.8,74.3,73.9,73.7,72.5,71.6,70.7,70.4,70.3,65.4,63.5,61.8,59.5,59.4,53.7,47.7,35.7,31.0.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 1176.9616[(M+2Na)2+],Calcd.for C97H137N25O41Na2:2353.9188.
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:1))δ7.73(3H,s),7.55(2H,d,J=8.4Hz),7.21(2H,d,J=8.4Hz),6.94(3H,dd,J=8.4Hz),6.71(3H,s),6.60(3H,d,J=8.4Hz),6.33(3H,d,J=8.4Hz),5.10(6H,s),4.85(3H,d,J=3.4Hz),4.79(2H,s),4.23-4.15(9H,m),3.71-3.67(10H,m),3.67-3.64(8H,m),3.63(3H,dd,J=5.4,2.0Hz),3.62-3.58(6H,m),3.52-3.45(14H,m),3.39(4H,dd,J=11.6,6.8Hz),3.31(4H,dd,J=10.2,5.4Hz),3.17(3H,d,J=9.6Hz),3.14(3H,d,J=3.4Hz),3.08(3H,dd,J=12.9,4.0Hz),2.97(3H,dd,J=12.9,7.4Hz).
13C-NMR(150MHz,D2O-DMSO(d6)(1:1))δ176.2,166.1,154.9,150.4,146.1,139.4,131.3,129.0,126.4,111.4,110.6,106.6,106.0,102.0,101.9,100.0,84.9,83.8,74.3,73.9,73.7,72.5,71.6,70.7,70.4,70.3,65.4,63.5,61.8,59.5,59.4,53.7,47.7,35.7,31.0.
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 1176.9616[(M+2Na)2+],Calcd.for C97H137N25O41Na2:2353.9188.
【0153】
ｔｒｉ－（βＧｌｃ３）４－１Ｖ２０９（4-[2-(4-{(6-amino-8-hydroxy-2-(2-methoxyethoxy)-9H-purin-9-yl)methyl}benzamido)acetamido]-N1,N7-bis[(1-{2-[(3-{(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino}phenyl)amino]-2-oxoethyl}-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]-4-[3-({[1-(2-{(3-[(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-(1-deoxy-D-glucitol-1-yl)amino]phenyl)amino}-2-oxoethyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl]methyl}amino)-3-oxopropyl]heptanediamide、収率：２９％）
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:1))δ7.75(3H,s),7.57(2H,d,J=8.4Hz),7.23(2H,d,J=8.4Hz),6.96(3H,dd,J=8.4Hz),6.72(3H,s),6.65(3H,d,J=8.4Hz),6.37(3H,d,J=8.4Hz),5.11(6H,s),4.56-4.43(13H,m),4.25-4.18(10H,m),3.92(3H,brs),3.83-3.80(4H,m),3.72-3.65(19H,m),3.64-3.58(5H,m),3.52-3.35(48H,m),3.33-3.29(10H,m),3.27-3.16(30H,m),3.15-3.08(14H,m).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 1897.7229[(M+Na)+],Calcd.for C160H245N25O77Na:1897.7904.
1H-NMR(600MHz,D2O-DMSO(d6)(1:1))δ7.75(3H,s),7.57(2H,d,J=8.4Hz),7.23(2H,d,J=8.4Hz),6.96(3H,dd,J=8.4Hz),6.72(3H,s),6.65(3H,d,J=8.4Hz),6.37(3H,d,J=8.4Hz),5.11(6H,s),4.56-4.43(13H,m),4.25-4.18(10H,m),3.92(3H,brs),3.83-3.80(4H,m),3.72-3.65(19H,m),3.64-3.58(5H,m),3.52-3.35(48H,m),3.33-3.29(10H,m),3.27-3.16(30H,m),3.15-3.08(14H,m).
ESI-TOF/MS(positive mode);Found:m/z 1897.7229[(M+Na)+],Calcd.for C160H245N25O77Na:1897.7904.
【0154】
（αＧｌｃ６）ｎ－１Ｖ２０９（ＭＷ１７，０００）
1H-NMR(400MHz,D2O)δ7.83(1H,br),7.46(2H,br),7.11(2H,br),6.94(1H,br),6.69(1H,br),6.56(1H,br),6.39(1H,br),4.96-4.76(~100H,m),4.01-3.03(~600H,m).
1H-NMR(400MHz,D2O)δ7.83(1H,br),7.46(2H,br),7.11(2H,br),6.94(1H,br),6.69(1H,br),6.56(1H,br),6.39(1H,br),4.96-4.76(~100H,m),4.01-3.03(~600H,m).
【0155】
（αＧｌｃ６）ｎ－１Ｖ２０９（ＭＷ４０，０００）
1H-NMR(400MHz,D2O)δ7.88(1H,br),7.56(2H,br),7.21(2H,br),7.04(1H,br),6.78(1H,br),6.65(1H,br),6.48(1H,br),4.90-4.77(~160H,m),4.03-3.08(~960H,m).
1H-NMR(400MHz,D2O)δ7.88(1H,br),7.56(2H,br),7.21(2H,br),7.04(1H,br),6.78(1H,br),6.65(1H,br),6.48(1H,br),4.90-4.77(~160H,m),4.03-3.08(~960H,m).
【0156】
［試験例１：糖鎖ＴＬＲリガンド複合体の免疫増強活性の測定］
製造例５で調製した糖鎖ＴＬＲリガンド複合体の免疫増強活性を評価した。免疫増強活性の評価では、マウス骨髄由来樹状細胞（ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、以下、“ｍＢＭＤＣ”とする）において糖鎖ＴＬＲリガンド複合体によって誘導されたサイトカイン（ＩＬ－６）の産生量をＥＬＩＳＡ法で定量した。まず、９６ウェルプレートに、１ウェルあたりの細胞数が１×１０５個になるように細胞懸濁液を１５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。
製造例５で調製した糖鎖ＴＬＲリガンド複合体の免疫増強活性を評価した。免疫増強活性の評価では、マウス骨髄由来樹状細胞（ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、以下、“ｍＢＭＤＣ”とする）において糖鎖ＴＬＲリガンド複合体によって誘導されたサイトカイン（ＩＬ－６）の産生量をＥＬＩＳＡ法で定量した。まず、９６ウェルプレートに、１ウェルあたりの細胞数が１×１０５個になるように細胞懸濁液を１５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。
【0157】
次に、糖鎖ＴＬＲリガンド複合体の濃度が８μＭになるように調整した。得られた糖鎖ＴＬＲリガンド複合体溶液を、４倍ずつ連続希釈し、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。ここで、（ｉ）糖鎖と複合体化していないＴＬＲリガンド（１Ｖ２０９）の水溶液（８μＭ）を４倍ずつ連続希釈した溶液も、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。
【0158】
続いて、以下の手順に沿って、ＥＬＩＳＡ法を行った。まず、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートにＣｏａｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで２５０倍希釈した抗マウスＩＬ－６抗体５０μＬを加え、４℃で１８時間インキュベートした。抗体溶液を除去後、Ｔｗｅｅｎ２０を１％含むＰＢＳ溶液（以下、“１％ＰＢＳ／Ｔ”とする。）３００μＬで各ウェルを３回洗浄した。その後、１％ウシ血清アルブミン－ＰＢＳ溶液（以下、“ブロッキングバッファーとする。）３００μＬをウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを除去後、３００μＬの１％ＰＢＳ／Ｔで各ウェルを３回洗浄した。
【0159】
次に、培養上清１５０μＬを別の９６ウェルプレートに移し、そのうち５０μＬを抗ＩＬ－６抗体が固定化されたＥＬＩＳＡプレートに移した。ＥＬＩＳＡプレートを４℃で２時間インキュベート後、培養上清を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含有するＰＢＳ（以下、“０．０５％ＰＢＳ／Ｔ”という）溶液で各ウェルを３回洗浄した。その後、ブロッキングバッファーで１０００倍希釈したビオチン標識抗ＩＬ－６抗体を各ウェルに５０μＬずつ加え、室温で２時間インキュベートした。抗体溶液を除去後、３００μＬの１％ＰＢＳ／Ｔで各ウェルを３回洗浄し、ブロッキングバッファーで１０００倍希釈したＨＲＰ修飾ストレプトアビジン溶液５０μＬを加えた。室温で１時間インキュベート後、１％ＰＢＳ／Ｔで各ウェルを５回洗浄した。その後、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ナカライテスク社製）を５０μＬ加え、化学発光を観察後、１Ｍのｏ－Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ Ａｃｉｄ溶液を５０μＬ加えて化学発光を停止した。その後、速やかに、ＥＬＩＳＡプレートをプレートリーダーに供し、４５０ｎｍの吸光度で測定した。培養上清中のＩＬ－６の産生量は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアを用いて解析した。なお、濃度既知の組み換えマウスＩＬ－６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、同様にＥＬＩＳＡを行い、検量線を作成した。
【0160】
（結果）
図１は糖鎖ＴＬＲリガンド複合体溶液のｍＢＭＤＣへの添加によって産生されたＩＬ－６の産生量を示す図である。図１に示されたＴＬＲ７リガンドの量（μＭ）は、添加した糖鎖ＴＬＲリガンド複合体の濃度から算出され、実質的に添加された量を示す。ＴＬＲリガンド複合体では、ＴＬＲ７リガンドの濃度依存的なＩＬ－６の産生の増大が確認された。
図１は糖鎖ＴＬＲリガンド複合体溶液のｍＢＭＤＣへの添加によって産生されたＩＬ－６の産生量を示す図である。図１に示されたＴＬＲ７リガンドの量（μＭ）は、添加した糖鎖ＴＬＲリガンド複合体の濃度から算出され、実質的に添加された量を示す。ＴＬＲリガンド複合体では、ＴＬＲ７リガンドの濃度依存的なＩＬ－６の産生の増大が確認された。
【0161】
表１は糖鎖ＴＬＲリガンド複合体溶液のｍＢＭＤＣへの添加によって産生されたＩＬ－６の産生量から得られた５０％効果濃度（ＥＣ５０）を示す。ＥＣ５０が低いほど免疫増強効果が高い。ＴＬＲリガンド複合体の免疫増強効果は１Ｖ２０９より高いことが確認された。
【0162】
【表1】
【0163】
［試験例２：ニワトリ由来ＯＶＡと糖鎖ＴＬＲリガンド複合体とを用いた免疫増強活性の測定］
上記非特許文献３に記載の方法で調製した、下記に示す糖鎖ＴＬＲリガンド複合体（３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９、式（２４））のｉｎ ｖｉｖｏでの免疫増強活性を、ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（７週齢、雌）を用いて評価した。ＯＶＡをモデル抗原とし、ＯＶＡ（２０μｇ）と３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９（２ｎｍｏｌ又は２０ｎｍｏｌ）とを混合した溶液（２０μＬ）を、０、７、１４日目にマウスに３回経鼻投与した（１群４匹又は８匹）。コントロールには、１Ｖ２０９（２ｎｍｏｌ）及びＣｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ（５μｇ）を用いた。
上記非特許文献３に記載の方法で調製した、下記に示す糖鎖ＴＬＲリガンド複合体（３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９、式（２４））のｉｎ ｖｉｖｏでの免疫増強活性を、ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（７週齢、雌）を用いて評価した。ＯＶＡをモデル抗原とし、ＯＶＡ（２０μｇ）と３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９（２ｎｍｏｌ又は２０ｎｍｏｌ）とを混合した溶液（２０μＬ）を、０、７、１４日目にマウスに３回経鼻投与した（１群４匹又は８匹）。コントロールには、１Ｖ２０９（２ｎｍｏｌ）及びＣｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ（５μｇ）を用いた。
【0164】
【化17】
【0165】
免疫開始２１日目に、血液、鼻腔洗浄液及び脾臓を採取した。血液はセボフルラン吸入麻酔下で眼窩静脈叢から採取した。得られた血液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）し、血清層を回収した。鼻腔洗浄液は、大塚蒸留水（３００μＬ）を食道付近からシリンジ（２７Ｇ×３／４’）で注入して回収した。血清層を再度遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）し、上清を回収した。鼻腔洗浄液及び血清中のＩｇＡ及びＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡで評価した。
【0166】
ＥＬＩＳＡでは、まず、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルにＰＢＳで希釈したタンパク質溶液（ＯＶＡ：５μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を加え、４℃で１８時間インキュベートした。タンパク質溶液を除去後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含むＰＢＳ溶液（以下、“ＰＢＳ／Ｔ”とする、３００μＬ／ウェル）で各ウェルを３回洗浄した。その後、ブロッキングバッファー（３００μＬ／ウェル）を加え、プレートシェイカー（４００ｒｐｍ、室温）上で２時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを除去後、ＰＢＳ／Ｔ（３００μＬ／ウェル）で各ウェルを３回洗浄した。続いて、ブロッキングバッファーで希釈した血清溶液又は鼻腔洗浄液（５０μＬ／ウェル）を加えて、プレートシェイカー（４００ｒｐｍ、室温）で２時間インキュベートした。この際、血清の場合は、１ドース目にブロッキングバッファーで２５倍希釈した血清溶液（５０μＬ／ウェル）を加え、２ドース目から８ドース目は４倍ずつ連続希釈した溶液（５０μＬ／ウェル）を加えた。鼻腔洗浄液の場合は、１ドース目はブロッキングバッファーで２倍希釈した鼻腔洗浄液（５０μＬ／ウェル）を加え、２ドース目から８ドース目は２倍ずつ連続希釈した溶液（５０μＬ／ウェル）を加えた。血清溶液又は鼻腔洗浄液を除去後、プレートをＰＢＳ／Ｔで５回洗浄し、ブロッキングバッファーで１００００倍希釈したヤギ抗マウスＩｇＡα鎖（ＨＲＰ）、又は５０００倍希釈した抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ鎖）（マウス）ｐＡｂ－ＨＲＰ（５０μＬ／ウェル）を加え、プレートシェイカー（４００ｒｐｍ、室温）で１．５時間インキュベートした。抗体溶液を除去後、プレートをＰＢＳ／Ｔで５回洗浄した。その後、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（５０μＬ／ウェル）を加え、化学発光を観察後、ｏ－Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ Ａｃｉｄ溶液（１Ｍ、５０μＬ／ウェル）を加えて反応を停止した。その後、速やかにプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７を用いた。
【0167】
（結果）
図２（Ａ）及び図２（Ｂ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＯＶＡに対するＩｇＡ抗体産生価を示す。図２（Ｃ）及び図２（Ｄ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＯＶＡに対するＩｇＧ抗体産生価を示す。３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９の混合液を投与した群において、ＯＶＡに対するＩｇＡ及びＩｇＧの抗体産生能が１０倍から１００倍向上することが示された。
図２（Ａ）及び図２（Ｂ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＯＶＡに対するＩｇＡ抗体産生価を示す。図２（Ｃ）及び図２（Ｄ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＯＶＡに対するＩｇＧ抗体産生価を示す。３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９の混合液を投与した群において、ＯＶＡに対するＩｇＡ及びＩｇＧの抗体産生能が１０倍から１００倍向上することが示された。
【0168】
群間で体重に有意な差はなく、図３に示すように群間における脾臓重量にも有意な差はなかった。
【0169】
［試験例３：インフルエンザウイルス由来ＨＡと糖鎖ＴＬＲリガンド複合体（３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９）を用いた免疫増強活性の測定］
インフルエンザウイルスのスパイクタンパク質抗原である組換えＨＡ（Ａ／Ｐｕｅｒｕｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４、以下“Ｆｌｕ ＨＡ”ともいう）を用いて、試験例２と同様に免疫増強活性を評価した（１群６匹）。免疫増強活性の評価では、試験例２と同様の免疫スケジュールで、Ｆｌｕ ＨＡ（５μｇ）と３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９（２０ｎｍｏｌ）との混合液（２０μＬ）を経鼻投与した。免疫開始２１日目に、血液及び鼻腔洗浄液を採取した。鼻腔洗浄液及び血清中のＩｇＡ及びＩｇＧ抗体を、５μｇ／ｍＬのＯＶＡに代えて５μｇ／ｍＬのＦｌｕ ＨＡを含むタンパク質溶液を使用する点を除いて試験例２と同様にＥＬＩＳＡで定量した。
インフルエンザウイルスのスパイクタンパク質抗原である組換えＨＡ（Ａ／Ｐｕｅｒｕｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４、以下“Ｆｌｕ ＨＡ”ともいう）を用いて、試験例２と同様に免疫増強活性を評価した（１群６匹）。免疫増強活性の評価では、試験例２と同様の免疫スケジュールで、Ｆｌｕ ＨＡ（５μｇ）と３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９（２０ｎｍｏｌ）との混合液（２０μＬ）を経鼻投与した。免疫開始２１日目に、血液及び鼻腔洗浄液を採取した。鼻腔洗浄液及び血清中のＩｇＡ及びＩｇＧ抗体を、５μｇ／ｍＬのＯＶＡに代えて５μｇ／ｍＬのＦｌｕ ＨＡを含むタンパク質溶液を使用する点を除いて試験例２と同様にＥＬＩＳＡで定量した。
【0170】
（結果）
図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＨＡに対するＩｇＡ抗体産生価を示す。図４（Ｃ）及び図４（Ｄ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＦｌｕ ＨＡに対するＩｇＧ抗体産生価を示す。ＨＡと３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９との混合液を投与した群では、鼻腔洗浄液及び血清の両方で、ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体の抗体価がＦｌｕ ＨＡ単独投与群に比べて１０倍から１０００倍向上することが示された。
図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＨＡに対するＩｇＡ抗体産生価を示す。図４（Ｃ）及び図４（Ｄ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＦｌｕ ＨＡに対するＩｇＧ抗体産生価を示す。ＨＡと３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９との混合液を投与した群では、鼻腔洗浄液及び血清の両方で、ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体の抗体価がＦｌｕ ＨＡ単独投与群に比べて１０倍から１０００倍向上することが示された。
【0171】
［試験例４：インフルエンザワクチンと糖鎖ＴＬＲリガンド複合体（３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９）を用いた免疫増強活性の測定］
市販のインフルエンザワクチン（デンカ生研、Ａ型２種、Ｂ型２種、以下“Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅ”ともいう）を用いて、試験例３と同様に免疫増強活性を評価した（１群６匹）。試験例３と同様の免疫スケジュールでＦｌｕ ｖａｃｃｉｎｅ（総ＨＡ量約５μｇ）と３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９（２０ｎｍｏｌ）との混合溶液（５０μＬ）を経鼻投与した。免疫開始２１日目に、血液及び鼻腔洗浄液を採取した。鼻腔洗浄液及び血清中のＩｇＡ及びＩｇＧ抗体を、試験例３と同様にＥＬＩＳＡで評価した。
市販のインフルエンザワクチン（デンカ生研、Ａ型２種、Ｂ型２種、以下“Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅ”ともいう）を用いて、試験例３と同様に免疫増強活性を評価した（１群６匹）。試験例３と同様の免疫スケジュールでＦｌｕ ｖａｃｃｉｎｅ（総ＨＡ量約５μｇ）と３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９（２０ｎｍｏｌ）との混合溶液（５０μＬ）を経鼻投与した。免疫開始２１日目に、血液及び鼻腔洗浄液を採取した。鼻腔洗浄液及び血清中のＩｇＡ及びＩｇＧ抗体を、試験例３と同様にＥＬＩＳＡで評価した。
【0172】
Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅ（１ｍｌ中インフルエンザウイルスのＨＡ画分１株あたり３０μｇ以上、４０μＬ）とＰＢＳ（１０μＬ）又は３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９（２０ｎｍｏｌ、２ｍＭ、１０μＬ）とを混合し、ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（７週齢、雌）に０日目、７日目、１４日目に経鼻投与した。免疫開始２１日目に血液及び鼻腔洗浄液を採取した。鼻腔洗浄液及び血清中のＩｇＡ及びＩｇＧ抗体を試験例３と同様にＥＬＩＳＡで定量した。
【0173】
（結果）
図５（Ａ）及び図５（Ｂ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＨＡに対するＩｇＡ抗体産生価を示す。図５（Ｃ）及び図５（Ｄ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＨＡに対するＩｇＧ抗体産生価を示す。Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅと３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９との混合溶液を投与した群では、Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅ単独投与群に比べて、ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体の抗体価が５～３０倍向上することが示された。
図５（Ａ）及び図５（Ｂ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＨＡに対するＩｇＡ抗体産生価を示す。図５（Ｃ）及び図５（Ｄ）は、それぞれ鼻腔洗浄液及び血清中のＨＡに対するＩｇＧ抗体産生価を示す。Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅと３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９との混合溶液を投与した群では、Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅ単独投与群に比べて、ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体の抗体価が５～３０倍向上することが示された。
【0174】
［試験例５：鼻腔粘膜に産生された抗体のウイルス中和活性評価］
ウイルスの感染を阻害できるか評価するために、試験例４で回収した鼻腔洗浄液を用いて、インフルエンザウイルスＢ型（野外分離株）を用いた中和活性試験を行った。細胞には、ＭＤＣＫ細胞株を用いた。インフルエンザウイルスＢ型と鼻腔洗浄液とを混合し、細胞溶液に加えて４日間培養後、細胞をクリスタルバイオレットで染色して、感染阻害効果を評価した。クリスタルバイオレット染色では、ウイルス感染が阻害され細胞が生存している場合に染色され、ウイルス感染によって細胞が死滅すると染色されないため、ウイルス感染の有無を評価することができる。
ウイルスの感染を阻害できるか評価するために、試験例４で回収した鼻腔洗浄液を用いて、インフルエンザウイルスＢ型（野外分離株）を用いた中和活性試験を行った。細胞には、ＭＤＣＫ細胞株を用いた。インフルエンザウイルスＢ型と鼻腔洗浄液とを混合し、細胞溶液に加えて４日間培養後、細胞をクリスタルバイオレットで染色して、感染阻害効果を評価した。クリスタルバイオレット染色では、ウイルス感染が阻害され細胞が生存している場合に染色され、ウイルス感染によって細胞が死滅すると染色されないため、ウイルス感染の有無を評価することができる。
【0175】
９６ウェルプレートにＭＤＣＫ細胞（３×１０４個／ウェル）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。次に、ウイルス溶液（６０μＬ、１２０ＴＣＩＤ５０／６０μＬ）と鼻腔洗浄液（６０μＬ、原液から１０倍ずつＥ－ＭＥＭ感染培地で段階希釈）とを混合し、３４℃、５％ＣＯ２の条件下で１時間インキュベートした。細胞の培養液を除去し、ＰＢＳで２回、Ｅ－ＭＥＭ感染培地で１回洗浄後、鼻腔洗浄液（５０μＬ）とウイルス溶液（５０μＬ）の混合溶液（上記の１時間インキュベートしたサンプル）を加えて、３４℃、５％ＣＯ２の条件下で４日間培養した。その後、培養上清を除去し、ＰＢＳで洗浄した。７０％エタノール（５分）で細胞を固定し、７０％エタノールを除去後、０．４％クリスタルバイオレット溶液（１００μＬ）を加えて、室温で３０分間インキュベートした後、クリスタルバイオレットを除去し水で洗浄した。
【0176】
（結果）
図６に示すように、Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅの単独投与群では、中和活性を有する抗体は一部のマウスでしか誘導されなかった。一方、３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９とＦｌｕ ｖａｃｃｉｎｅとの混合溶液を投与した群では、すべてのマウスで中和活性を有する抗体の産生が誘導された。したがって、３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９は、インフルエンザウイルスに対する感染阻害活性を有する抗体の産生を増強することが示された。
図６に示すように、Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅの単独投与群では、中和活性を有する抗体は一部のマウスでしか誘導されなかった。一方、３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９とＦｌｕ ｖａｃｃｉｎｅとの混合溶液を投与した群では、すべてのマウスで中和活性を有する抗体の産生が誘導された。したがって、３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９は、インフルエンザウイルスに対する感染阻害活性を有する抗体の産生を増強することが示された。
【0177】
［試験例６：マウスを用いたインフルエンザウイルス感染防御試験］
ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（７週齢・雌、１群５匹）を用いてインフルエンザウイルスに対する感染防御効果について評価した。インフルエンザウイルスには、Ａ型Ｈ１Ｎ１プエルトリコ株（Ａ／Ｐｕｅｒｕｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）を用いた。
ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（７週齢・雌、１群５匹）を用いてインフルエンザウイルスに対する感染防御効果について評価した。インフルエンザウイルスには、Ａ型Ｈ１Ｎ１プエルトリコ株（Ａ／Ｐｕｅｒｕｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）を用いた。
【0178】
Ｆｌｕ ＨＡについては試験例３、Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅについては試験例４と同様の免疫スケジュールで免疫し、最終免疫の７日後、致死量のインフルエンザウイルス（５０μＬ、片鼻２５μＬずつ、１×１０４ＴＣＩＤ５０／５０μＬ）を、麻酔下で経鼻感染させた。ウイルス感染後は２週間、体重と体温を測定した。ウイルス感染後１４日後に麻酔下で頸椎脱臼によってマウスを安楽死させた。また、エンドポイント（ウイルス感染前と比較して２０％以上の低体重、７日間で２５％以上の体重減少、沈鬱状態又は給餌・給水が困難な状態が認められた場合）に達したマウスも安楽死させ、生存率を評価した。
【0179】
（結果）
図７（Ａ）及び図７（Ｂ）は、それぞれ感染後の体重の経時変化及び生存率を示す。３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９を混合投与した群（３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９＋Ｆｌｕ ＨＡ及び３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９＋Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅ）では、ほとんど体重が減少せず、死亡が確認されたかった。一方、３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９未投与群（ＰＢＳ、ＰＢＳ＋Ｆｌｕ ＨＡ及びＰＢＳ＋Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅ）は、体重が減少し、全例が死亡した。これらの結果から、糖鎖ＴＬＲリガンド複合体が粘膜ワクチン用アジュバントとして有用であることが示された。
図７（Ａ）及び図７（Ｂ）は、それぞれ感染後の体重の経時変化及び生存率を示す。３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９を混合投与した群（３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９＋Ｆｌｕ ＨＡ及び３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９＋Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅ）では、ほとんど体重が減少せず、死亡が確認されたかった。一方、３ＮＨ－αＣＤ－１Ｖ２０９未投与群（ＰＢＳ、ＰＢＳ＋Ｆｌｕ ＨＡ及びＰＢＳ＋Ｆｌｕ ｖａｃｃｉｎｅ）は、体重が減少し、全例が死亡した。これらの結果から、糖鎖ＴＬＲリガンド複合体が粘膜ワクチン用アジュバントとして有用であることが示された。
【0180】
［試験例７：マウスを用いたインフルエンザウイルス感染防御試験］
ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（７週齢・雌、１群５匹）を用いて、製造例５で得られたｔｒｉ－βＧａｌ４－１Ｖ２０９（上記式（１２））のｉｎ ｖｉｖｏでの免疫増強活性によるインフルエンザウイルスに対する感染防御効果について評価した。インフルエンザウイルスには、Ａ型Ｈ１Ｎ１プエルトリコ株（Ａ／Ｐｕｅｒｕｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）を用いた。
ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（７週齢・雌、１群５匹）を用いて、製造例５で得られたｔｒｉ－βＧａｌ４－１Ｖ２０９（上記式（１２））のｉｎ ｖｉｖｏでの免疫増強活性によるインフルエンザウイルスに対する感染防御効果について評価した。インフルエンザウイルスには、Ａ型Ｈ１Ｎ１プエルトリコ株（Ａ／Ｐｕｅｒｕｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）を用いた。
【0181】
インフルエンザウイルスのスパイクタンパク質抗原である組換えＨＡ（Ａ／Ｐｕｅｒｕｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４、以下“Ｆｌｕ ＨＡ”ともいう、５μｇ）とｔｒｉ－βＧａｌ４－１Ｖ２０９（２０ｎｍｏｌ）とを混合した溶液（２０μＬ）を、マウスに２回経鼻投与した。最終免疫の２２日後、致死量のインフルエンザウイルス（５０μＬ、片鼻２５μＬずつ、１×１０４ＴＣＩＤ５０／５０μＬ）を、麻酔下で経鼻感染させた。ウイルス感染後は２週間、体重と体温を測定した。ウイルス感染後１４日後に麻酔下で頸椎脱臼によってマウスを安楽死させた。また、エンドポイント（ウイルス感染前と比較して２０％以上の低体重、７日間で２５％以上の体重減少、沈鬱状態又は給餌・給水が困難な状態が認められた場合）に達したマウスも安楽死させ、生存率を評価した。
【0182】
（結果）
図８（Ａ）及び図８（Ｂ）は、それぞれ感染後の体重の経時変化及び生存率を示す。ｔｒｉ－βＧａｌ４－１Ｖ２０９を混合投与した群（ｔｒｉ－βＧａｌ４－１Ｖ２０９＋Ｆｌｕ ＨＡ）では、ほとんど体重が減少せず、死亡が確認されたかった。一方、ｔｒｉ－βＧａｌ４－１Ｖ２０９未投与群（ＰＢＳ及びＰＢＳ＋Ｆｌｕ ＨＡ）は、体重が減少し、全例が死亡した。これらの結果から、糖鎖ＴＬＲリガンド複合体がワクチン用アジュバントとして有用であることが示された。
図８（Ａ）及び図８（Ｂ）は、それぞれ感染後の体重の経時変化及び生存率を示す。ｔｒｉ－βＧａｌ４－１Ｖ２０９を混合投与した群（ｔｒｉ－βＧａｌ４－１Ｖ２０９＋Ｆｌｕ ＨＡ）では、ほとんど体重が減少せず、死亡が確認されたかった。一方、ｔｒｉ－βＧａｌ４－１Ｖ２０９未投与群（ＰＢＳ及びＰＢＳ＋Ｆｌｕ ＨＡ）は、体重が減少し、全例が死亡した。これらの結果から、糖鎖ＴＬＲリガンド複合体がワクチン用アジュバントとして有用であることが示された。
【0183】
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【0184】
本発明はワクチン組成物、特には粘膜ワクチン組成物に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
