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特開2024-18971イネ科植物リポキシゲナーゼ３の製造方法、及び組換え酵母
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024018971
(43)【公開日】2024-02-08
(54)【発明の名称】イネ科植物リポキシゲナーゼ３の製造方法、及び組換え酵母
(51)【国際特許分類】
C12N 9/02 20060101AFI20240201BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20240201BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240201BHJP
A21D 2/26 20060101ALI20240201BHJP
A21D 8/04 20060101ALI20240201BHJP
【ＦＩ】
C12N9/02 ZNA
C12N15/29
C12N1/19
A21D2/26
A21D8/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023095744
(22)【出願日】2023-06-09
(31)【優先権主張番号】P 2022119855
(32)【優先日】2022-07-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】800000068
【氏名又は名称】学校法人東京電機大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106002
【弁理士】
【氏名又は名称】正林 真之
(72)【発明者】
【氏名】高橋 俊介
(72)【発明者】
【氏名】椎葉 究
【テーマコード（参考）】
4B032
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B032DB02
4B032DG02
4B032DK51
4B032DK54
4B032DL01
4B032DP17
4B032DP33
4B032DP40
4B065AA72X
4B065AA89Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA28
4B065CA42
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、イネ科植物リポキシゲナーゼ３の効率的な製造技術を提供することである。
【解決手段】本発明は、イネ科植物リポキシゲナーゼ３の製造方法であって、前記製造方法が、イネ科植物リポキシゲナーゼ３遺伝子のコドンを最適化し、コドン最適化配列を取得するコドン最適化工程と、前記コドン最適化配列を酵母内で発現させる発現工程と、
を含み、前記コドン最適化配列が、所定の（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たす、製造方法を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、イネ科植物リポキシゲナーゼ３の製造方法であって、前記製造方法が、イネ科植物リポキシゲナーゼ３遺伝子のコドンを最適化し、コドン最適化配列を取得するコドン最適化工程と、前記コドン最適化配列を酵母内で発現させる発現工程と、
を含み、前記コドン最適化配列が、所定の（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たす、製造方法を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
イネ科植物リポキシゲナーゼ３の製造方法であって、
前記製造方法が、
イネ科植物リポキシゲナーゼ３遺伝子のコドンを最適化し、コドン最適化配列を取得するコドン最適化工程と、
前記コドン最適化配列を酵母内で発現させる発現工程と、
を含み、
前記コドン最適化配列が、下記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たす、
製造方法。
（要件Ａ）コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれかを満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
（要件Ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
（要件Ｃ）ＧＣ含有率が３５％以上６０％以下である。
（要件Ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
（要件Ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
前記製造方法が、
イネ科植物リポキシゲナーゼ３遺伝子のコドンを最適化し、コドン最適化配列を取得するコドン最適化工程と、
前記コドン最適化配列を酵母内で発現させる発現工程と、
を含み、
前記コドン最適化配列が、下記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たす、
製造方法。
（要件Ａ）コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれかを満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
（要件Ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
（要件Ｃ）ＧＣ含有率が３５％以上６０％以下である。
（要件Ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
（要件Ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
【請求項2】
前記イネ科植物リポキシゲナーゼ３が、製パン用である、請求項１記載の製造方法。
【請求項3】
イネ科植物リポキシゲナーゼ３遺伝子に由来し、かつ、下記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たすコドン最適化配列が導入された、組換え酵母。
（要件Ａ）コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれかを満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
（要件Ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
（要件Ｃ）ＧＣ含有率が３０％以上６０％以下である。
（要件Ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
（要件Ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
（要件Ａ）コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれかを満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
（要件Ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
（要件Ｃ）ＧＣ含有率が３０％以上６０％以下である。
（要件Ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
（要件Ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、イネ科植物リポキシゲナーゼ３の製造方法、及び組換え酵母に関する。
【背景技術】
【0002】
製パン等の、イネ科植物由来穀物（小麦粉等）の加工においては、粘弾性の調整等が、製品の品質に影響を与え得る。このような粘弾性に関連する穀物中成分として、グルテン、グルテニン等が挙げられる。
【0003】
グルテニンは、ジスルフィド結合を介して架橋されたポリペプチド鎖を有する高分子であり、弾性に富むという性質を有する。
近年、グルテニン間の架橋による構造変化が、グルテンの粘弾性に大きな影響を与え得ることが報告されている。
グルテニン間の架橋を促進する酸化酵素として、リポキシゲナーゼが同定されている。
小麦のリポキシゲナーゼには、３種類のアイソザイムが存在する。各リポキシゲナーゼは、リノール酸の過酸化反応に関与する。
近年、グルテニン間の架橋による構造変化が、グルテンの粘弾性に大きな影響を与え得ることが報告されている。
グルテニン間の架橋を促進する酸化酵素として、リポキシゲナーゼが同定されている。
小麦のリポキシゲナーゼには、３種類のアイソザイムが存在する。各リポキシゲナーゼは、リノール酸の過酸化反応に関与する。
【0004】
本発明者らは、リポキシゲナーゼのアイソザイムのうち、「リポキシゲナーゼ３」（以下、「リポキシゲナーゼＩＩＩ」、「ＬＯＸＩＩＩ」、又は「ＬＯＸ３」ともいう。）が、他のアイソザイムよりも活性が高く、製パン等における、体積の増大、弾力性の向上、及び白色化効果等に良好な影響を与えることを見出した（例えば、非特許文献１）。
そのため、ＬＯＸ３の活用は、高品質な穀物製品（パン等）の製造に有効であり得る。
そのため、ＬＯＸ３の活用は、高品質な穀物製品（パン等）の製造に有効であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｋ．Ｓｈｉｉｂａら、“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｉｓｏｚｙｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ”、Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ ６８：１１５－１２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかし、従来、ＬＯＸ３の主な製造方法は、小麦胚芽からの単離であったため、ＬＯＸ３は希少な成分であった。
【0007】
さらに、ＬＯＸ３は分子量が大きく（９０～１００ｋＤａ程度）、大腸菌等を用いた系において正しく折り畳み構造を維持しにくいため、実用可能なＬＯＸ３発現技術が確立できていなかった。
【0008】
本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、イネ科植物リポキシゲナーゼ３の効率的な製造技術の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らが検討した結果、所定の指標に基づき最適化されたイネ科植物ＬＯＸ３遺伝子配列を酵母内で発現させることによって上記課題を解決できる点を見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下を提供する。
【0010】
（１） イネ科植物リポキシゲナーゼ３の製造方法であって、
前記製造方法が、
イネ科植物リポキシゲナーゼ３遺伝子のコドンを最適化し、コドン最適化配列を取得するコドン最適化工程と、
前記コドン最適化配列を酵母内で発現させる発現工程と、
を含み、
前記コドン最適化配列が、下記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たす、
製造方法。
（要件Ａ）コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれかを満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
（要件Ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
（要件Ｃ）ＧＣ含有率が３５％以上６０％以下である。
（要件Ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
（要件Ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
前記製造方法が、
イネ科植物リポキシゲナーゼ３遺伝子のコドンを最適化し、コドン最適化配列を取得するコドン最適化工程と、
前記コドン最適化配列を酵母内で発現させる発現工程と、
を含み、
前記コドン最適化配列が、下記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たす、
製造方法。
（要件Ａ）コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれかを満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
（要件Ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
（要件Ｃ）ＧＣ含有率が３５％以上６０％以下である。
（要件Ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
（要件Ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
【0011】
（２） 前記イネ科植物リポキシゲナーゼ３が、製パン用である、（１）記載の製造方法。
【0012】
（３） イネ科植物リポキシゲナーゼ３遺伝子に由来し、かつ、下記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たすコドン最適化配列が導入された、組換え酵母。
（要件Ａ）コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれかを満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
（要件Ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
（要件Ｃ）ＧＣ含有率が３０％以上６０％以下である。
（要件Ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
（要件Ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
（要件Ａ）コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれかを満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
（要件Ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
（要件Ｃ）ＧＣ含有率が３０％以上６０％以下である。
（要件Ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
（要件Ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、イネ科植物リポキシゲナーゼ３の効率的な製造技術が提供される。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。
【0015】
＜イネ科植物リポキシゲナーゼ３の製造方法＞
本発明に係るイネ科植物ＬＯＸ３の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）は、以下の要件を全て満たす。
・イネ科植物リポキシゲナーゼ３遺伝子のコドンを最適化し、コドン最適化配列を取得するコドン最適化工程と、コドン最適化配列を酵母内で発現させる発現工程と、を含む。
・コドン最適化配列が、下記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たす。
（要件Ａ）コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれかを満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
（要件Ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
（要件Ｃ）ＧＣ含有率が３５％以上６０％以下である。
（要件Ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
（要件Ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
本発明に係るイネ科植物ＬＯＸ３の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）は、以下の要件を全て満たす。
・イネ科植物リポキシゲナーゼ３遺伝子のコドンを最適化し、コドン最適化配列を取得するコドン最適化工程と、コドン最適化配列を酵母内で発現させる発現工程と、を含む。
・コドン最適化配列が、下記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たす。
（要件Ａ）コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれかを満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
（要件Ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
（要件Ｃ）ＧＣ含有率が３５％以上６０％以下である。
（要件Ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
（要件Ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
【0016】
目的タンパク質の発現効率を高める観点から、発現させようとする遺伝子配列のコドンを最適化することは従来知られている。
しかし、その指標には様々なものがあり、実際に発現効率を実現できる遺伝子配列の設計には多くの試行錯誤を要する。
しかし、その指標には様々なものがあり、実際に発現効率を実現できる遺伝子配列の設計には多くの試行錯誤を要する。
【0017】
本発明者らが鋭意検討した結果、上記要件を全て満たすことで、イネ科植物ＬＯＸ３を特に好適に酵母内で発現できることを見出した。
また、本発明者らは、得られたイネ科植物ＬＯＸ３が、良好な酵素活性を有し、製パン等の分野において実用可能である点も確認した。
また、本発明者らは、得られたイネ科植物ＬＯＸ３が、良好な酵素活性を有し、製パン等の分野において実用可能である点も確認した。
【0018】
「リポキシゲナーゼ３（ＬＯＸ３）」とは、酸化還元酵素の１種であり、リノール酸の９位の炭素に酸素分子を導入する作用を有する。
【0019】
本発明において、「イネ科植物（Ｐｏａｃｅａｅ）」とは、イネ科に属する任意の植物を包含するが、好ましくは食用の植物である。
イネ科植物としては、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、イネ等が挙げられる。これらのうち、本発明の効果が特に得られやすいという観点から、小麦が好ましい。
イネ科植物としては、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、イネ等が挙げられる。これらのうち、本発明の効果が特に得られやすいという観点から、小麦が好ましい。
【0020】
本発明において、「イネ科植物ＬＯＸ３を効率的に製造できる」とは、イネ科植物ＬＯＸ３を酵母内で発現でき、かつ、得られたＬＯＸ３が充分な酵素活性を有していることを包含する。
【0021】
ＬＯＸ３の酵素活性は、例えば、実施例に示したリノール酸の過酸化反応等によって評価できる。
充分な酵素活性を有するＬＯＸ３によれば、例えば、製パンにおいて、グルテニン間の架橋によるタンパク質の増加に伴う、パンの焼き上がり体積の増大、パンの白色化等がもたらされ得る。
充分な酵素活性を有するＬＯＸ３によれば、例えば、製パンにおいて、グルテニン間の架橋によるタンパク質の増加に伴う、パンの焼き上がり体積の増大、パンの白色化等がもたらされ得る。
【0022】
以下、本発明の製造方法の詳細について説明する。
【0023】
（１）コドン最適化工程
コドン最適化工程は、イネ科植物ＬＯＸ３遺伝子におけるコドンを最適化し、コドン最適化配列を取得する工程である。得られたコドン最適化配列は、上記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たす。
コドン最適化工程は、イネ科植物ＬＯＸ３遺伝子におけるコドンを最適化し、コドン最適化配列を取得する工程である。得られたコドン最適化配列は、上記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たす。
【0024】
本発明において、「コドンの最適化」とは、酵母内でタンパク質（イネ科植物ＬＯＸ３）を効率的に発現させるために、イネ科植物ＬＯＸ３遺伝子を、酵母の内在性タンパク質に近い配列へ変換することを包含する。
【0025】
本発明者らが鋭意検討した結果、酵母内でのイネ科植物ＬＯＸ３の効率的な発現の観点から、上記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を満たすことが重要であることを見出した。
上記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）は互いに密接に関連しており、これらのうちいずれかの要件を満たさない場合は、酵母のコドン使用頻度とイネ科植物ＬＯＸ３遺伝子のコドンとの大きなギャップが生じ得るため、酵母内でのイネ科植物ＬＯＸ３の発現を妨げる可能性がある。
上記（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）は互いに密接に関連しており、これらのうちいずれかの要件を満たさない場合は、酵母のコドン使用頻度とイネ科植物ＬＯＸ３遺伝子のコドンとの大きなギャップが生じ得るため、酵母内でのイネ科植物ＬＯＸ３の発現を妨げる可能性がある。
【0026】
本発明の要件を満たすコドン最適化配列を取得する方法は適宜選択できる。
例えば、イネ科植物ＬＯＸ３遺伝子配列に基づき、公知のコドン最適化ツールを用いて各指標を調整し、コドン最適化配列を取得することができる。
コドン最適化ツールとしては、例えば、「ＣＯＵＳＩＮ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｕｓｉｎ．ｉｒｄ．ｆｒ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）、「Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ＯｎＬｉｎｅ （ＣＯＯＬ）」（Ｃｈｉｎ， Ｊ． Ｘ．， ｅｔ ａｌ．， （２０１４）． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ３０（１５）， ２２１０－２２１２）等が挙げられる。
例えば、イネ科植物ＬＯＸ３遺伝子配列に基づき、公知のコドン最適化ツールを用いて各指標を調整し、コドン最適化配列を取得することができる。
コドン最適化ツールとしては、例えば、「ＣＯＵＳＩＮ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｕｓｉｎ．ｉｒｄ．ｆｒ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）、「Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ＯｎＬｉｎｅ （ＣＯＯＬ）」（Ｃｈｉｎ， Ｊ． Ｘ．， ｅｔ ａｌ．， （２０１４）． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ３０（１５）， ２２１０－２２１２）等が挙げられる。
【0027】
本発明の要件を満たす、小麦リポキシゲナーゼ３に由来するコドン最適化配列としては、配列番号１、配列番号６に記載された配列が挙げられる。
なお、小麦リポキシゲナーゼ３に由来するコドン最適化配列は、小麦リポキシゲナーゼ３の遺伝子配列の全体に由来する配列からなるものであってもよく、小麦リポキシゲナーゼ３の遺伝子配列の一部に由来する配列からなるものであってもよい。
配列番号１は、小麦リポキシゲナーゼ３の遺伝子配列の全体に由来する配列からなるコドン最適化配列である。
配列番号６は、小麦リポキシゲナーゼ３の遺伝子配列の一部（小麦リポキシゲナーゼ３のＮ末端をトランケートしたＣ末端）に由来する配列からなるコドン最適化配列である。
なお、小麦リポキシゲナーゼ３に由来するコドン最適化配列は、小麦リポキシゲナーゼ３の遺伝子配列の全体に由来する配列からなるものであってもよく、小麦リポキシゲナーゼ３の遺伝子配列の一部に由来する配列からなるものであってもよい。
配列番号１は、小麦リポキシゲナーゼ３の遺伝子配列の全体に由来する配列からなるコドン最適化配列である。
配列番号６は、小麦リポキシゲナーゼ３の遺伝子配列の一部（小麦リポキシゲナーゼ３のＮ末端をトランケートしたＣ末端）に由来する配列からなるコドン最適化配列である。
【0028】
（１－１）（要件Ａ）について
コドン最適化配列は、コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれか、好ましくは両方を満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
コドン最適化配列は、コドン適応インデックス（ＣＡＩ）又はコドン使用類似度インデックス（ＣＯＵＳＩＮ）が、以下の（要件Ａ－１）及び（要件Ａ－２）のうち少なくともいずれか、好ましくは両方を満たす。
（要件Ａ－１）ＣＡＩが０．６０以上１．００以下である。
（要件Ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．７０以上１．２０以下である。
【0029】
（１－１－１）（要件Ａ－１）について
「コドン適応インデックス（Ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ、ＣＡＩ）」とは、配列特徴量の１つであり、コドン使用頻度のバイアスの指標である。
「コドン適応インデックス（Ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ、ＣＡＩ）」とは、配列特徴量の１つであり、コドン使用頻度のバイアスの指標である。
【0030】
ＣＡＩは、０～１の数値で示される。
ＣＡＩは、遺伝子配列のコドン使用パターンが、宿主生物（本発明においては酵母）の内在性遺伝子におけるコドン使用パターンとどのくらい適合しているかを示す。遺伝子配列のＣＡＩが高いほど、宿主生物における使用頻度の少ないコドン（レアコドン）が少ないことを意味する。
ＣＡＩは、遺伝子配列のコドン使用パターンが、宿主生物（本発明においては酵母）の内在性遺伝子におけるコドン使用パターンとどのくらい適合しているかを示す。遺伝子配列のＣＡＩが高いほど、宿主生物における使用頻度の少ないコドン（レアコドン）が少ないことを意味する。
【0031】
ＣＡＩの算出式は、“Ｍｏｒｉｙａｍａ， Ｅｓｔｕｋｏ Ｎ．， “Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ” （２００３）． Ｐａｐｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ４．”等で定義されている。
【0032】
ＣＡＩの下限は、０．６０以上、好ましくは０．６５以上、より好ましくは０．７０以上である。
【0033】
ＣＡＩの上限は、１．００以下、好ましくは０．９５以下、より好ましくは０．９０以下である。
【0034】
（１－１－２）（要件Ａ－２）について
「コドン使用類似度インデックス（ＣＯｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ＩＮｄｅｘ、ＣＯＵＳＩＮ）」とは、ＣＡＩを改良したものであり、コドン使用頻度のバイアスの指標である。
「コドン使用類似度インデックス（ＣＯｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ＩＮｄｅｘ、ＣＯＵＳＩＮ）」とは、ＣＡＩを改良したものであり、コドン使用頻度のバイアスの指標である。
【0035】
ＣＯＵＳＩＮ１８は、０～１の数値で示される。
【0036】
ＣＯＵＳＩＮ５９は、０～１の数値で示される。
【0037】
ＣＯＵＳＩＮの算出式は、“Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， Ｖｏｌｕｍｅ １１， Ｉｓｓｕｅ １２， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１９， Ｐａｇｅｓ ３５２３－３５２８”等で定義されている。
【0038】
ＣＯＵＳＩＮ１８の下限は、０．７０以上、好ましくは０．７５以上、より好ましくは０．８０以上である。
【0039】
ＣＯＵＳＩＮ１８の上限は、１．２０以下、好ましくは１．１０以下、より好ましくは１．００以下である。
【0040】
ＣＯＵＳＩＮ５９の下限は、０．７０以上、好ましくは０．７５以上、より好ましくは０．８０以上である。
【0041】
ＣＯＵＳＩＮ５９の上限は、１．２０以下、好ましくは１．１０以下、より好ましくは１．００以下である。
【0042】
ＣＯＵＳＩＮ５９はＣＯＵＳＩＮ１８よりも高ければ特に限定されない。
両者の差は、好ましくは０．１０以上０．５０以下、より好ましくは０．２０以上０．４０以下である。
両者の差は、好ましくは０．１０以上０．５０以下、より好ましくは０．２０以上０．４０以下である。
【0043】
（１－２）（要件Ｂ）について
コドン最適化配列は、コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
コドン最適化配列は、コドン有効数（ＥＮＣ）が４５．０以上である。
【0044】
「コドン有効数（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｏｄｏｎｓ、ＥＮＣ）」とは、配列特徴量の１つであり、コドン使用頻度のバイアスの指標である。
【0045】
ＥＮＣは、２０～６１の数値で示される。
遺伝子配列のＥＮＣが高いほど、コドン使用頻度のバイアスが少ないことを意味する。
遺伝子配列のＥＮＣが高いほど、コドン使用頻度のバイアスが少ないことを意味する。
【0046】
ＥＮＣの算出式は、“Ｍｏｒｉｙａｍａ， Ｅｓｔｕｋｏ Ｎ．， “Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ” （２００３）． Ｐａｐｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ４．”等で定義されている。
【0047】
ＥＮＣの下限は、４５．０以上、好ましくは４７．５以上、より好ましくは５０．０以上である。
【0048】
ＥＮＣの上限は、６１．０以下である。
【0049】
（１－３）（要件Ｃ）について
コドン最適化配列は、ＧＣ含有率が３５％以上６０％以下である。
コドン最適化配列は、ＧＣ含有率が３５％以上６０％以下である。
【0050】
「ＧＣ含有率」とは、遺伝子配列におけるグアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の割合（単位：％）である。
【0051】
酵母の遺伝子配列におけるＧＣ含有率は低値（約３８％）であり、発現させようとする遺伝子配列のＧＣ含有率が高いほど、酵母内でのタンパク質発現を損なう可能性がある。
かかる点を踏まえ、本発明者らは、酵母内でのイネ科植物ＬＯＸ３の安定的発現を実現する観点から、ＧＣ含有率を上記範囲に調整することを見出した。
かかる点を踏まえ、本発明者らは、酵母内でのイネ科植物ＬＯＸ３の安定的発現を実現する観点から、ＧＣ含有率を上記範囲に調整することを見出した。
【0052】
ＧＣ含有率の算出式は、“Ｍｏｒｉｙａｍａ， Ｅｓｔｕｋｏ Ｎ．， “Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ” （２００３）． Ｐａｐｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ４．”等で定義されている。
【0053】
ＧＣ含有率の下限は、３５％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは４５％以上である。
【0054】
ＧＣ含有率の上限は、６０％以下、好ましくは５５％以下、より好ましくは５０％以下である。
【0055】
（１－４）（要件Ｄ）について
コドン最適化配列は、最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
コドン最適化配列は、最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．３０以上０．６０以下である。
【0056】
「最適コドン使用頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ、ＦＯＰ）」とは、配列特徴量の１つであり、遺伝子配列における同義コドン選択の最適化レベルの指標である。
【0057】
ＦＯＰは、「最適コドン／（最適コドン＋非最適コドン）」に基づき算出され、０超～１の数値で示される。
本発明においては他の要件を満たしつつ（例えば、ＥＮＣ値を上げつつ）、ＦＯＰを０．４０以上０．５５以下とすることで、コドン使用頻度の偏りを抑制しながら、使用頻度の高い最適コドンの割合を高め、酵母内でのイネ科植物ＬＯＸ３の安定的発現を実現できる。
本発明においては他の要件を満たしつつ（例えば、ＥＮＣ値を上げつつ）、ＦＯＰを０．４０以上０．５５以下とすることで、コドン使用頻度の偏りを抑制しながら、使用頻度の高い最適コドンの割合を高め、酵母内でのイネ科植物ＬＯＸ３の安定的発現を実現できる。
【0058】
ＦＯＰの算出式は、“Ｍｏｒｉｙａｍａ， Ｅｓｔｕｋｏ Ｎ．， “Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ” （２００３）． Ｐａｐｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ４．”等で定義されている。
【0059】
ＦＯＰの下限は、０．３０以上、好ましくは０．３５以上、より好ましくは０．４０以上である。
【0060】
ＦＯＰの上限は、０．６０以下、好ましくは０．５５以上、より好ましくは０．５０以上である。
【0061】
（１－５）（要件Ｅ）について
コドン最適化配列は、コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
コドン最適化配列は、コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
【0062】
「コドンバイアス指数（Ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ ｉｎｄｅｘ、ＣＢＩ）」とは、配列特徴量の１つであり、遺伝子配列において最適なコドンのサブセットが使用される程度を示す指標である。
【0063】
ＣＢＩは、０超～１の数値で示される。
極端にコドンバイアスのある遺伝子配列では、ＣＢＩは１．０に近い値となる。他方で、ランダムなコドン使用のある遺伝子配列では、その程度に応じて、ＣＢＩは０．０に近い値となる。
本発明においては、他の要件を満たしつつ、ＣＢＩを０．１５以上とすることで、コドン使用頻度の偏りを抑制しながら、ランダムなコドン使用のある遺伝子配列を設計でき、酵母内でのイネ科植物ＬＯＸ３の安定的発現を実現できる。
極端にコドンバイアスのある遺伝子配列では、ＣＢＩは１．０に近い値となる。他方で、ランダムなコドン使用のある遺伝子配列では、その程度に応じて、ＣＢＩは０．０に近い値となる。
本発明においては、他の要件を満たしつつ、ＣＢＩを０．１５以上とすることで、コドン使用頻度の偏りを抑制しながら、ランダムなコドン使用のある遺伝子配列を設計でき、酵母内でのイネ科植物ＬＯＸ３の安定的発現を実現できる。
【0064】
ＣＢＩの算出式は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １０， ｐａｇｅｓ１０３－１０６ （１９９８）”等で定義されている。
【0065】
ＣＢＩの下限は、０．１５以上、好ましくは０．２０以上、より好ましくは０．２５以上である。
【0066】
ＣＢＩの上限は、１．００以下、好ましくは０．９０以下、より好ましくは０．８０以下である。
【0067】
（２）発現工程
発現工程は、得られたコドン最適化配列を酵母内で発現させる工程である。
発現工程は、得られたコドン最適化配列を酵母内で発現させる工程である。
【0068】
発現工程においては、酵母を用いたタンパク質の製造方法として知られる任意の方法によって製造できる。
このような方法として、実施例に示した、プラスミドベクターを用いた方法等が挙げられる。得られたタンパク質（イネ科植物ＬＯＸ３）は、適宜精製等を行ってもよい。
このような方法として、実施例に示した、プラスミドベクターを用いた方法等が挙げられる。得られたタンパク質（イネ科植物ＬＯＸ３）は、適宜精製等を行ってもよい。
【0069】
＜イネ科植物リポキシゲナーゼ３の用途＞
本発明の製造方法によって得られたイネ科植物ＬＯＸ３は、従来知られるＬＯＸ３と同様の用途や方法で利用できる。
本発明の製造方法によって得られたイネ科植物ＬＯＸ３は、従来知られるＬＯＸ３と同様の用途や方法で利用できる。
【0070】
イネ科植物ＬＯＸ３の好ましい用途として、製パン（生地へのＬＯＸ３の添加等）等が挙げられる。
【0071】
イネ科植物ＬＯＸ３が所望の酵素活性を有しているかどうかは、実施例に示した酵素活性評価方法によって特定できる。
【0072】
＜組換え酵母＞
本発明は、上記コドン最適化配列が導入された組換え酵母、すなわち、イネ科植物リポキシゲナーゼタンパク質３遺伝子に由来し、かつ、（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たすコドン最適化配列が導入された組換え酵母も包含する。
本発明は、上記コドン最適化配列が導入された組換え酵母、すなわち、イネ科植物リポキシゲナーゼタンパク質３遺伝子に由来し、かつ、（要件Ａ）乃至（要件Ｅ）を全て満たすコドン最適化配列が導入された組換え酵母も包含する。
【0073】
本発明の組換え酵母は、製パン等において好ましく利用できる。
例えば、生地に本発明の組換え酵母を添加しそのまま発酵させることで、精製ＬＯＸ３の添加が不要となるため、より効率的に高品質なパンを製造できる（ただし、本発明において、製パン時に精製ＬＯＸ３を添加する態様は排除されない。）。
例えば、生地に本発明の組換え酵母を添加しそのまま発酵させることで、精製ＬＯＸ３の添加が不要となるため、より効率的に高品質なパンを製造できる（ただし、本発明において、製パン時に精製ＬＯＸ３を添加する態様は排除されない。）。
【実施例0074】
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0075】
＜試験１：小麦リポキシゲナーゼ３の製造＞
以下の方法により、小麦（イネ科植物に相当する。）リポキシゲナーゼタンパク質３を製造した。なお、以下、「小麦リポキシゲナーゼ３」を「小麦ＬＯＸ３」、「ＬＯＸＩＩＩ」ともいう。
以下の方法により、小麦（イネ科植物に相当する。）リポキシゲナーゼタンパク質３を製造した。なお、以下、「小麦リポキシゲナーゼ３」を「小麦ＬＯＸ３」、「ＬＯＸＩＩＩ」ともいう。
【0076】
（１）コドン最適化工程
コドン最適化ツールである、「ＣＯＵＳＩＮ」のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｕｓｉｎ．ｉｒｄ．ｆｒ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）を使用して、酵母のコドン使用頻度へ最適化した小麦ＬＯＸ３遺伝子配列（コドン最適化配列に相当する。）を設計した。
コドン最適化ツールである、「ＣＯＵＳＩＮ」のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｕｓｉｎ．ｉｒｄ．ｆｒ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）を使用して、酵母のコドン使用頻度へ最適化した小麦ＬＯＸ３遺伝子配列（コドン最適化配列に相当する。）を設計した。
【0077】
得られたコドン最適化配列（配列番号１、表１）は、以下の要件を全て満たす。
（要件ａ－１）ＣＡＩが０．７０以上０．９０以下である。
（要件ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．８０以上１．２０以下である。
（要件ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が５０．０以上である。
（要件ｃ）ＧＣ含有率が４０％以上５５％以下である。
（要件ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．４０以上０．５５以下である。
（要件ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
（要件ａ－１）ＣＡＩが０．７０以上０．９０以下である。
（要件ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．８０以上１．２０以下である。
（要件ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が５０．０以上である。
（要件ｃ）ＧＣ含有率が４０％以上５５％以下である。
（要件ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．４０以上０．５５以下である。
（要件ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
【0078】
【表1】
【0079】
（２）発現工程
以下の方法により、小麦ＬＯＸ３の分子クローニング、及び酵母への形質転換を行った。
以下の方法により、小麦ＬＯＸ３の分子クローニング、及び酵母への形質転換を行った。
【0080】
（２－１）小麦ＬＯＸ３の分子クローニング
得られたコドン最適化配列の人工合成遺伝子を、ツイストバイオサイエンス社による受託合成によって製造した。
次いで、「Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い、「ＬＯＸ３ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号２）、「ＬＯＸ３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号３）を使用して、小麦ＬＯＸ３の遺伝子配列を増幅した。
ＰＣＲ増幅産物（小麦ＬＯＸ３の遺伝子配列）と、２Ａ自己切断ペプチド配列と、蛍光タンパク質ｍＣｌｏｖｅｒ３（ＦＰ）の遺伝子配列と、を含む酵母－大腸菌シャトルベクター（ｐ２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター）を作製し、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素で切断した。切断後、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用いて精製を行った。
得られた精製物（インサートＤＮＡ、ＬＯＸ３遺伝子）及びベクターＤＮＡ（ｐ２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター）を混合することで混合ＤＮＡ溶液を調製し、さらに「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を加え（混合ＤＮＡ溶液：「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」＝１：１）、ＤＮＡライゲーション反応溶液を作製した。
得られたＤＮＡライゲーション反応溶液を、恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製）に入れ、１６℃で、１時間～終夜静置し、ＤＮＡライゲーション反応を行った。
反応終了後、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い、形質転換を行った後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養した。この工程により、「ｐＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター」を得た。
得られたコドン最適化配列の人工合成遺伝子を、ツイストバイオサイエンス社による受託合成によって製造した。
次いで、「Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い、「ＬＯＸ３ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号２）、「ＬＯＸ３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号３）を使用して、小麦ＬＯＸ３の遺伝子配列を増幅した。
ＰＣＲ増幅産物（小麦ＬＯＸ３の遺伝子配列）と、２Ａ自己切断ペプチド配列と、蛍光タンパク質ｍＣｌｏｖｅｒ３（ＦＰ）の遺伝子配列と、を含む酵母－大腸菌シャトルベクター（ｐ２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター）を作製し、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素で切断した。切断後、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用いて精製を行った。
得られた精製物（インサートＤＮＡ、ＬＯＸ３遺伝子）及びベクターＤＮＡ（ｐ２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター）を混合することで混合ＤＮＡ溶液を調製し、さらに「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を加え（混合ＤＮＡ溶液：「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」＝１：１）、ＤＮＡライゲーション反応溶液を作製した。
得られたＤＮＡライゲーション反応溶液を、恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製）に入れ、１６℃で、１時間～終夜静置し、ＤＮＡライゲーション反応を行った。
反応終了後、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い、形質転換を行った後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養した。この工程により、「ｐＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター」を得た。
【0081】
（２－２）プラスミド抽出
「ｐＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター」による大腸菌の形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に３７℃で終夜培養した。
得られた菌体培養液を遠心で集菌し、「ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い、大腸菌からクローン化ＤＮＡを抽出及び精製した。
「ｐＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター」による大腸菌の形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に３７℃で終夜培養した。
得られた菌体培養液を遠心で集菌し、「ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い、大腸菌からクローン化ＤＮＡを抽出及び精製した。
【0082】
（２－３）ＤＮＡシーケンシング解析
「シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬」（関東化学社製）を用いて、添付の説明書に従い、大腸菌コロニーからＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付の説明書に従い、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号４）、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号５）を用いることで、目的ＤＮＡ（小麦ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子）配列を増幅した。
ＰＣＲ反応の条件は、以下のように設定した。：「９５℃、２分」の後、サイクル「９５℃、２０秒；５５℃、３０秒；７２℃、２分」を３０サイクル行う。
ＰＣＲ反応産物溶液を、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い精製した。
得られた精製物について、ジーンウィズ社による受託解析によって評価した結果、設計通りのリポキシゲナーゼ３の遺伝子配列を含むクローン化ＤＮＡ（ｐＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター）が得られた。
「シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬」（関東化学社製）を用いて、添付の説明書に従い、大腸菌コロニーからＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付の説明書に従い、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号４）、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号５）を用いることで、目的ＤＮＡ（小麦ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子）配列を増幅した。
ＰＣＲ反応の条件は、以下のように設定した。：「９５℃、２分」の後、サイクル「９５℃、２０秒；５５℃、３０秒；７２℃、２分」を３０サイクル行う。
ＰＣＲ反応産物溶液を、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い精製した。
得られた精製物について、ジーンウィズ社による受託解析によって評価した結果、設計通りのリポキシゲナーゼ３の遺伝子配列を含むクローン化ＤＮＡ（ｐＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター）が得られた。
【0083】
（２－４）コドン最適化配列発現酵母の取得
「Ｙｅａｓｔｍａｒｋｅｒ（商標） Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２」（ＴａＫａＲａ社製）による酢酸リチウム法を用いて、添付の説明書に従い、出芽酵母へ「ｐＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター」を導入し、形質転換を行った。
酵母の形質転換体を、ヒスチジンを含まない選択寒天培地に広げて、３０℃で終夜培養した。
得られた形質転換体（「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」ともいう。）から、「シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬ＳＴ」（関東化学社製）を用いて、添付の説明書に従い、ＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付の説明書に従い、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号４）、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号５）を用いることで、目的ＤＮＡ（小麦ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子）配列の増幅を確認した。
さらに、「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」における蛍光タンパク質の蛍光を、「ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標） ＬＡＳ ４０００」（ｃｙｔｉｖａ）によって解析し、該酵母内で発現した蛍光タンパク質の蛍光を確認した。
「Ｙｅａｓｔｍａｒｋｅｒ（商標） Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２」（ＴａＫａＲａ社製）による酢酸リチウム法を用いて、添付の説明書に従い、出芽酵母へ「ｐＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子ベクター」を導入し、形質転換を行った。
酵母の形質転換体を、ヒスチジンを含まない選択寒天培地に広げて、３０℃で終夜培養した。
得られた形質転換体（「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」ともいう。）から、「シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬ＳＴ」（関東化学社製）を用いて、添付の説明書に従い、ＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付の説明書に従い、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号４）、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号５）を用いることで、目的ＤＮＡ（小麦ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子）配列の増幅を確認した。
さらに、「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」における蛍光タンパク質の蛍光を、「ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標） ＬＡＳ ４０００」（ｃｙｔｉｖａ）によって解析し、該酵母内で発現した蛍光タンパク質の蛍光を確認した。
【0084】
以上の工程によって、コドン最適化配列が酵母内で発現していることを確認した。
【0085】
【表2】
【0086】
（３）小麦ＬＯＸ３の抽出
以下の方法により、酵母内で小麦ＬＯＸ３を発現させ、小麦ＬＯＸ３の単離を行った。
まず、「ＬＯＸＩＩＩ－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」を、ヒスチジンを含まない選択液体培地に植菌し、３０℃で１日間程度前培養した。
その後、新たに準備したヒスチジンを含まない選択液体培地（１００～３００ｍＬ）に前培養液を加え、１６℃で４～７日間培養することで、小麦ＬＯＸ３、及び蛍光タンパク質（ｍＣｌｏｖｅｒ３）を共発現させ、菌体培養液を得た。
得られた菌体培養液から遠心で集菌した菌体に対して、菌体溶解緩衝液を加え、超音波破砕装置によって菌体を破壊した。
次いで、菌体培養液を、遠心で可溶性画分及び不溶性画分に分離した。可用性画分における蛍光タンパク質の蛍光を、「ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標） ＬＡＳ ４０００」（ｃｙｔｉｖａ）で解析することで、「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」で発現した蛍光タンパク質の蛍光を確認した。
以上の結果に基づき、可溶性画分を、「小麦ＬＯＸ３含有画分」として回収した。
以下の方法により、酵母内で小麦ＬＯＸ３を発現させ、小麦ＬＯＸ３の単離を行った。
まず、「ＬＯＸＩＩＩ－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」を、ヒスチジンを含まない選択液体培地に植菌し、３０℃で１日間程度前培養した。
その後、新たに準備したヒスチジンを含まない選択液体培地（１００～３００ｍＬ）に前培養液を加え、１６℃で４～７日間培養することで、小麦ＬＯＸ３、及び蛍光タンパク質（ｍＣｌｏｖｅｒ３）を共発現させ、菌体培養液を得た。
得られた菌体培養液から遠心で集菌した菌体に対して、菌体溶解緩衝液を加え、超音波破砕装置によって菌体を破壊した。
次いで、菌体培養液を、遠心で可溶性画分及び不溶性画分に分離した。可用性画分における蛍光タンパク質の蛍光を、「ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標） ＬＡＳ ４０００」（ｃｙｔｉｖａ）で解析することで、「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」で発現した蛍光タンパク質の蛍光を確認した。
以上の結果に基づき、可溶性画分を、「小麦ＬＯＸ３含有画分」として回収した。
【0087】
＜試験２：小麦ＬＯＸ３の活性評価＞
以下の方法により、小麦ＬＯＸ３（小麦ＬＯＸ３含有画分）を用いて、酵素活性評価を行った。
以下の方法により、小麦ＬＯＸ３（小麦ＬＯＸ３含有画分）を用いて、酵素活性評価を行った。
【0088】
（１）基質の準備
リポキシゲナーゼの基質として、リノール酸エマルションを準備した。
リノール酸エマルションは、Ｓｕｒｒｅｙ（１９６４）の方法に基づいて調整した。
具体的には、Ｔｗｅｅｎ２０（０．１２ｍＬ）、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５、２．５ｍＬ）、及び１．０ｍＭ水酸化ナトリウム（０．３２ｍＬ）の混合物に、リノール酸（１００μｌ）を溶解させた。リノール酸が溶解した後、混合物を、５０ｍＭ酢酸バッファーで、５０ｍＬまで希釈した。該希釈物を基質として用いた。
基質は、窒素下で密封し、使用するまで４℃の暗所で保存した。
リポキシゲナーゼの基質として、リノール酸エマルションを準備した。
リノール酸エマルションは、Ｓｕｒｒｅｙ（１９６４）の方法に基づいて調整した。
具体的には、Ｔｗｅｅｎ２０（０．１２ｍＬ）、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５、２．５ｍＬ）、及び１．０ｍＭ水酸化ナトリウム（０．３２ｍＬ）の混合物に、リノール酸（１００μｌ）を溶解させた。リノール酸が溶解した後、混合物を、５０ｍＭ酢酸バッファーで、５０ｍＬまで希釈した。該希釈物を基質として用いた。
基質は、窒素下で密封し、使用するまで４℃の暗所で保存した。
【0089】
（２）酵素反応
「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」から抽出したＬＯＸ３（ｒ ＬＯＸ３（小麦ＬＯＸ３含有画分））、及び、組換えされていない野生型出芽酵母から抽出したＬＯＸ３（ＷＴ）を準備した。
各ＬＯＸ３（１０μｌ）、上記で得られた基質（９０μｌ）、及び５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５、２．５ｍＬ）を混合し、酵素反応を行った。
この酵素反応において、「酵素活性の１Ｕ」は、２３４ｎｍでの吸光度で、１分間当たりに生成されるペルオキシド１Ｍの酵素量として定義した。
各ＬＯＸ３の酵素活性を表３に示す。
「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」から抽出したＬＯＸ３（ｒ ＬＯＸ３（小麦ＬＯＸ３含有画分））、及び、組換えされていない野生型出芽酵母から抽出したＬＯＸ３（ＷＴ）を準備した。
各ＬＯＸ３（１０μｌ）、上記で得られた基質（９０μｌ）、及び５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５、２．５ｍＬ）を混合し、酵素反応を行った。
この酵素反応において、「酵素活性の１Ｕ」は、２３４ｎｍでの吸光度で、１分間当たりに生成されるペルオキシド１Ｍの酵素量として定義した。
各ＬＯＸ３の酵素活性を表３に示す。
【0090】
表３に示されるとおり、「ｒ ＬＯＸ３」の活性は、「ＷＴ」と比較して約１８８倍高かった。
【0091】
【表3】
【0092】
＜試験３：可溶性グルテニンタンパク質の測定＞
以下の方法により、製パンにおいて、「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」によって生じる可溶性グルテニンタンパク質の量を測定した。
以下の方法により、製パンにおいて、「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」によって生じる可溶性グルテニンタンパク質の量を測定した。
【0093】
小麦粉（５０ｇ）に対し、水（３０ｍＬ）、及び、酵母（１ｇ、「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」、又は組換えされていない野生型出芽酵母のいずれか）を加え、ミキサー（「Ｍｉｃｒｏ－Ｍｉｘｅｒ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ ＭＦＣ社製）で５分間こねて、生地を得た。
生地を丸め、オーブンで３０℃、９０分間発酵を行った。
発酵後、生地（３ｇ）を取り、２００ｍＭ酢酸水溶液（１５ｍＬ）中で、ホモジナイザーを用いて、８０００ｒｐｍで１０分間粉砕した。
粉砕物を５０ｍＬ遠沈管に回収し、４℃、３５００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行った。
遠心分離後、上清を回収し、メスシリンダーで測定した。次いで、上清にエタノールを加え、エタノール７０％に調整した（式「上清の液量／３×７」によってエタノール量を算出した。）。
エタノール沈殿後、遠心分離を行い、上清を捨てて沈殿物を回収した。
沈殿物中の可溶性グルテニンタンパク質の量をローリー法で測定した。
各ＬＯＸ３によって生じた可溶性グルテニンタンパク質の量を表４に示す。
生地を丸め、オーブンで３０℃、９０分間発酵を行った。
発酵後、生地（３ｇ）を取り、２００ｍＭ酢酸水溶液（１５ｍＬ）中で、ホモジナイザーを用いて、８０００ｒｐｍで１０分間粉砕した。
粉砕物を５０ｍＬ遠沈管に回収し、４℃、３５００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行った。
遠心分離後、上清を回収し、メスシリンダーで測定した。次いで、上清にエタノールを加え、エタノール７０％に調整した（式「上清の液量／３×７」によってエタノール量を算出した。）。
エタノール沈殿後、遠心分離を行い、上清を捨てて沈殿物を回収した。
沈殿物中の可溶性グルテニンタンパク質の量をローリー法で測定した。
各ＬＯＸ３によって生じた可溶性グルテニンタンパク質の量を表４に示す。
【0094】
表４に示されるとおり、「ＷＴ」と比較して、「ｒ ＬＯＸ３」では、可溶性グルテニン量が約４８％増加していた。
このことから、「ｒ ＬＯＸ３」は、グルテン構造の変化に対して良好に寄与していることがわかった。
このことから、「ｒ ＬＯＸ３」は、グルテン構造の変化に対して良好に寄与していることがわかった。
【0095】
【表4】
【0096】
＜試験４：「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」を用いた製パン評価＞
以下の方法により、「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」を用いて、ストレート法に基づく製パン試験を行った。
以下の方法により、「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」を用いて、ストレート法に基づく製パン試験を行った。
【0097】
試験３と同様の方法で、生地を作製し、その発酵を行った。
発酵後、オーブンで、２００℃、２０分間、生地の焼成を行った。
焼成後、パンのボリュームを、菜種置換法を用いて測定した。
各パンのボリュームを表５に示す。
発酵後、オーブンで、２００℃、２０分間、生地の焼成を行った。
焼成後、パンのボリュームを、菜種置換法を用いて測定した。
各パンのボリュームを表５に示す。
【0098】
表５に示されるとおり、各パンのボリューム（体積）に大きな差はなかった。このことから、「ＬＯＸ３－２Ａ－ＦＰ遺伝子発現酵母」は、製パンにおいて、従来の酵母と同様に使用できることがわかった。
【0099】
【表5】
【0100】
＜試験５：ミニ小麦リポキシゲナーゼ３の製造＞
以下の方法により、小麦（イネ科植物に相当する。）ミニリポキシゲナーゼタンパク質３を製造した。なお、以下、「ミニ小麦リポキシゲナーゼ３」を「小麦ミニＬＯＸ３」、「ｍｉｎｉＬＯＸ３」等ともいう。「ミニ（ｍｉｎｉ）」とは、小麦リポキシゲナーゼ３のＮ末端をトランケートしたＣ末端のみを含む小麦リポキシゲナーゼ３タンパク質であることを意味する。
以下の方法により、小麦（イネ科植物に相当する。）ミニリポキシゲナーゼタンパク質３を製造した。なお、以下、「ミニ小麦リポキシゲナーゼ３」を「小麦ミニＬＯＸ３」、「ｍｉｎｉＬＯＸ３」等ともいう。「ミニ（ｍｉｎｉ）」とは、小麦リポキシゲナーゼ３のＮ末端をトランケートしたＣ末端のみを含む小麦リポキシゲナーゼ３タンパク質であることを意味する。
【0101】
（１）コドン最適化工程
上記「試験１」と同様の方法により、酵母のコドン使用頻度へ最適化した小麦ミニＬＯＸ３遺伝子配列（コドン最適化配列に相当する。）を設計した。
上記「試験１」と同様の方法により、酵母のコドン使用頻度へ最適化した小麦ミニＬＯＸ３遺伝子配列（コドン最適化配列に相当する。）を設計した。
【0102】
得られたコドン最適化配列（配列番号６、表６）は、以下の要件を全て満たす。
（要件ａ－１）ＣＡＩが０．７０以上０．９０以下である。
（要件ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．８０以上１．２０以下である。
（要件ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が５０．０以上である。
（要件ｃ）ＧＣ含有率が４０％以上５５％以下である。
（要件ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．４０以上０．５５以下である。
（要件ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
（要件ａ－１）ＣＡＩが０．７０以上０．９０以下である。
（要件ａ－２）ＣＯＵＳＩＮ５９がＣＯＵＳＩＮ１８よりも高く、かつ、ＣＯＵＳＩＮ５９及びＣＯＵＳＩＮ１８がそれぞれ０．８０以上１．２０以下である。
（要件ｂ）コドン有効数（ＥＮＣ）が５０．０以上である。
（要件ｃ）ＧＣ含有率が４０％以上５５％以下である。
（要件ｄ）最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）が０．４０以上０．５５以下である。
（要件ｅ）コドンバイアス指数（ＣＢＩ）が０．１５以上である。
【0103】
【表6】
【0104】
（２）発現工程
以下の方法により、小麦ミニＬＯＸ３の分子クローニング、及び酵母への形質転換を行った。
以下の方法により、小麦ミニＬＯＸ３の分子クローニング、及び酵母への形質転換を行った。
【0105】
（２－１）小麦ミニＬＯＸ３の分子クローニング
「Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い、「ｍｉｎｉＬＯＸ３ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号７）、「ｍｉｎｉＬＯＸ３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号８）を使用して、小麦ミニＬＯＸ３の遺伝子配列を増幅した。
ＰＣＲ増幅産物（小麦ミニＬＯＸ３の遺伝子配列）を含む、酵母－大腸菌シャトルベクター（ｐＧＫ４２３ベクター）を作製し、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素で切断した。切断後、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用いて精製を行った。
得られた精製物（インサートＤＮＡ、ミニＬＯＸ３遺伝子）及びベクターＤＮＡ（ｐＧＫ４２３ベクター）を混合することで混合ＤＮＡ溶液を調製し、さらに「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を加え（混合ＤＮＡ溶液：「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」＝１：１）、ＤＮＡライゲーション反応溶液を作製した。
得られたＤＮＡライゲーション反応溶液を、恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製）に入れ、１６℃で、１時間～終夜静置し、ＤＮＡライゲーション反応を行った。
反応終了後、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い、形質転換を行った後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養した。この工程により、「ｐミニＬＯＸ３ベクター」を得た。
「Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い、「ｍｉｎｉＬＯＸ３ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号７）、「ｍｉｎｉＬＯＸ３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号８）を使用して、小麦ミニＬＯＸ３の遺伝子配列を増幅した。
ＰＣＲ増幅産物（小麦ミニＬＯＸ３の遺伝子配列）を含む、酵母－大腸菌シャトルベクター（ｐＧＫ４２３ベクター）を作製し、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素で切断した。切断後、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用いて精製を行った。
得られた精製物（インサートＤＮＡ、ミニＬＯＸ３遺伝子）及びベクターＤＮＡ（ｐＧＫ４２３ベクター）を混合することで混合ＤＮＡ溶液を調製し、さらに「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を加え（混合ＤＮＡ溶液：「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」＝１：１）、ＤＮＡライゲーション反応溶液を作製した。
得られたＤＮＡライゲーション反応溶液を、恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製）に入れ、１６℃で、１時間～終夜静置し、ＤＮＡライゲーション反応を行った。
反応終了後、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い、形質転換を行った後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養した。この工程により、「ｐミニＬＯＸ３ベクター」を得た。
【0106】
（２－２）プラスミド抽出
「ｐミニＬＯＸ３ベクター」による大腸菌の形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に３７℃で終夜培養した。
得られた菌体培養液を遠心で集菌し、「ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い、大腸菌からクローン化ＤＮＡを抽出及び精製した。
「ｐミニＬＯＸ３ベクター」による大腸菌の形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に３７℃で終夜培養した。
得られた菌体培養液を遠心で集菌し、「ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い、大腸菌からクローン化ＤＮＡを抽出及び精製した。
【0107】
（２－３）ＤＮＡシーケンシング解析
「シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬」（関東化学社製）を用いて、添付の説明書に従い、大腸菌コロニーからＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付の説明書に従い、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号４）、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号５）を用いることで、目的ＤＮＡ（小麦ミニＬＯＸ３遺伝子）配列を増幅した。
ＰＣＲ反応の条件は、以下のように設定した。：「９５℃、２分」の後、サイクル「９５℃、２０秒；５５℃、３０秒；７２℃、２分」を３０サイクル行う。
ＰＣＲ反応産物溶液を、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い精製した。
得られた精製物について、ジーンウィズ社による受託解析によって評価した結果、設計通りのミニリポキシゲナーゼ３の遺伝子配列を含むクローン化ＤＮＡ（ｐミニＬＯＸ３ベクター）が得られた。
「シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬」（関東化学社製）を用いて、添付の説明書に従い、大腸菌コロニーからＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付の説明書に従い、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号４）、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号５）を用いることで、目的ＤＮＡ（小麦ミニＬＯＸ３遺伝子）配列を増幅した。
ＰＣＲ反応の条件は、以下のように設定した。：「９５℃、２分」の後、サイクル「９５℃、２０秒；５５℃、３０秒；７２℃、２分」を３０サイクル行う。
ＰＣＲ反応産物溶液を、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い精製した。
得られた精製物について、ジーンウィズ社による受託解析によって評価した結果、設計通りのミニリポキシゲナーゼ３の遺伝子配列を含むクローン化ＤＮＡ（ｐミニＬＯＸ３ベクター）が得られた。
【0108】
（２－４）ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母の取得
「Ｙｅａｓｔｍａｒｋｅｒ（商標） Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２」（ＴａＫａＲａ社製）による酢酸リチウム法を用いて、添付の説明書に従い、出芽酵母へ「ｐミニＬＯＸ３ベクター」を導入し、形質転換を行った。
酵母の形質転換体を、ヒスチジンを含まない選択寒天培地に広げて、３０℃で終夜培養した。
得られた形質転換体（「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」ともいう。）から、「シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬ＳＴ」（関東化学社製）を用いて、添付の説明書に従い、ＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付の説明書に従い、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号４）、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号５）を用いることで、目的ＤＮＡ（小麦ミニＬＯＸ３遺伝子）配列の増幅を確認した。
「Ｙｅａｓｔｍａｒｋｅｒ（商標） Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２」（ＴａＫａＲａ社製）による酢酸リチウム法を用いて、添付の説明書に従い、出芽酵母へ「ｐミニＬＯＸ３ベクター」を導入し、形質転換を行った。
酵母の形質転換体を、ヒスチジンを含まない選択寒天培地に広げて、３０℃で終夜培養した。
得られた形質転換体（「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」ともいう。）から、「シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬ＳＴ」（関東化学社製）を用いて、添付の説明書に従い、ＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付の説明書に従い、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号４）、「ＬＯＸ３－ＳＥＱ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ」（配列番号５）を用いることで、目的ＤＮＡ（小麦ミニＬＯＸ３遺伝子）配列の増幅を確認した。
【0109】
以上の工程によって、コドン最適化配列が酵母内で発現していることを確認した。
【0110】
【表7】
【0111】
（３）小麦ミニＬＯＸ３の抽出
以下の方法により、酵母内で小麦ミニＬＯＸ３を発現させ、小麦ミニＬＯＸ３の単離を行った。
まず、「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」を、ヒスチジンを含まない選択液体培地に植菌し、３０℃で１日間程度前培養した。
その後、新たに準備したヒスチジンを含まない選択液体培地（１００～３００ｍＬ）に前培養液を加え、１６℃で４～７日間培養することで、小麦ミニＬＯＸ３を発現させ、菌体培養液を得た。
得られた菌体培養液から遠心で集菌した菌体に対して、菌体溶解緩衝液を加え、ビーズ破砕装置によって菌体を破壊した。
次いで、菌体培養液を、遠心で可溶性画分及び不溶性画分に分離した。
以上の結果に基づき、可溶性画分を、「小麦ミニＬＯＸ３含有画分」として回収した。
以下の方法により、酵母内で小麦ミニＬＯＸ３を発現させ、小麦ミニＬＯＸ３の単離を行った。
まず、「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」を、ヒスチジンを含まない選択液体培地に植菌し、３０℃で１日間程度前培養した。
その後、新たに準備したヒスチジンを含まない選択液体培地（１００～３００ｍＬ）に前培養液を加え、１６℃で４～７日間培養することで、小麦ミニＬＯＸ３を発現させ、菌体培養液を得た。
得られた菌体培養液から遠心で集菌した菌体に対して、菌体溶解緩衝液を加え、ビーズ破砕装置によって菌体を破壊した。
次いで、菌体培養液を、遠心で可溶性画分及び不溶性画分に分離した。
以上の結果に基づき、可溶性画分を、「小麦ミニＬＯＸ３含有画分」として回収した。
【0112】
＜試験６：小麦ミニＬＯＸ３の活性評価＞
以下の方法により、小麦ミニＬＯＸ３（小麦ミニＬＯＸ３含有画分）を用いて、酵素活性評価を行った。
以下の方法により、小麦ミニＬＯＸ３（小麦ミニＬＯＸ３含有画分）を用いて、酵素活性評価を行った。
【0113】
（１）基質の準備
リポキシゲナーゼの基質として、リノール酸エマルションを準備した。
リノール酸エマルションは、Ｓｕｒｒｅｙ（１９６４）の方法に基づいて調整した。
具体的には、Ｔｗｅｅｎ２０（０．１２ｍＬ）、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５、２．５ｍＬ）、及び１．０ｍＭ水酸化ナトリウム（０．３２ｍＬ）の混合物に、リノール酸（１００μｌ）を溶解させた。リノール酸が溶解した後、混合物を、５０ｍＭ酢酸バッファーで、５０ｍＬまで希釈した。該希釈物を基質として用いた。
基質は、窒素下で密封し、使用するまで４℃の暗所で保存した。
リポキシゲナーゼの基質として、リノール酸エマルションを準備した。
リノール酸エマルションは、Ｓｕｒｒｅｙ（１９６４）の方法に基づいて調整した。
具体的には、Ｔｗｅｅｎ２０（０．１２ｍＬ）、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５、２．５ｍＬ）、及び１．０ｍＭ水酸化ナトリウム（０．３２ｍＬ）の混合物に、リノール酸（１００μｌ）を溶解させた。リノール酸が溶解した後、混合物を、５０ｍＭ酢酸バッファーで、５０ｍＬまで希釈した。該希釈物を基質として用いた。
基質は、窒素下で密封し、使用するまで４℃の暗所で保存した。
【0114】
（２）酵素反応
「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」から抽出したミニＬＯＸ３（ｒ ｍｉｎｉＬＯＸ３（小麦ミニＬＯＸ３含有画分））、及び、組換えされていない野生型出芽酵母からの抽出物（ＷＴ）を準備した。
各ミニＬＯＸ３（１０μｌ）、上記で得られた基質（９０μｌ）、及び５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５、２．５ｍＬ）を混合し、酵素反応を行った。
この酵素反応において、「酵素活性の１Ｕ」は、２３４ｎｍでの吸光度で、１分間当たりに生成されるペルオキシド１Ｍの酵素量として定義した。
各ミニＬＯＸ３の酵素活性を表８に示す。
「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」から抽出したミニＬＯＸ３（ｒ ｍｉｎｉＬＯＸ３（小麦ミニＬＯＸ３含有画分））、及び、組換えされていない野生型出芽酵母からの抽出物（ＷＴ）を準備した。
各ミニＬＯＸ３（１０μｌ）、上記で得られた基質（９０μｌ）、及び５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５、２．５ｍＬ）を混合し、酵素反応を行った。
この酵素反応において、「酵素活性の１Ｕ」は、２３４ｎｍでの吸光度で、１分間当たりに生成されるペルオキシド１Ｍの酵素量として定義した。
各ミニＬＯＸ３の酵素活性を表８に示す。
【0115】
表８に示されるとおり、「ｒ ｍｉｎｉＬＯＸ３」の活性は、「ＷＴ」と比較して約２１６倍高かった。
【0116】
【表8】
【0117】
＜試験７：可溶性グルテニンタンパク質の測定＞
以下の方法により、製パンにおいて、「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」によって生じる可溶性グルテニンタンパク質の量を測定した。
以下の方法により、製パンにおいて、「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」によって生じる可溶性グルテニンタンパク質の量を測定した。
【0118】
小麦粉（５０ｇ）に対し、水（３０ｍＬ）、及び、酵母（１ｇ、「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」、又は組換えされていない野生型出芽酵母のいずれか）を加え、ミキサー（「Ｍｉｃｒｏ－Ｍｉｘｅｒ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ ＭＦＣ社製）で５分間こねて、生地を得た。
生地を丸め、オーブンで３０℃、９０分間発酵を行った。
発酵後、生地（３ｇ）を取り、２００ｍＭ酢酸水溶液（１５ｍＬ）中で、ホモジナイザーを用いて、８０００ｒｐｍで１０分間粉砕した。
粉砕物を５０ｍＬ遠沈管に回収し、４℃、３５００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行った。
遠心分離後、上清を回収し、メスシリンダーで測定した。次いで、上清にエタノールを加え、エタノール７０％に調整した（式「上清の液量／３×７」によってエタノール量を算出した。）。
エタノール沈殿後、遠心分離を行い、上清を捨てて沈殿物を回収した。
沈殿物中の可溶性グルテニンタンパク質の量をローリー法で測定した。
各ミニＬＯＸ３によって生じた可溶性グルテニンタンパク質の量を表９に示す。
生地を丸め、オーブンで３０℃、９０分間発酵を行った。
発酵後、生地（３ｇ）を取り、２００ｍＭ酢酸水溶液（１５ｍＬ）中で、ホモジナイザーを用いて、８０００ｒｐｍで１０分間粉砕した。
粉砕物を５０ｍＬ遠沈管に回収し、４℃、３５００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行った。
遠心分離後、上清を回収し、メスシリンダーで測定した。次いで、上清にエタノールを加え、エタノール７０％に調整した（式「上清の液量／３×７」によってエタノール量を算出した。）。
エタノール沈殿後、遠心分離を行い、上清を捨てて沈殿物を回収した。
沈殿物中の可溶性グルテニンタンパク質の量をローリー法で測定した。
各ミニＬＯＸ３によって生じた可溶性グルテニンタンパク質の量を表９に示す。
【0119】
表９に示されるとおり、「ＷＴ」と比較して、「ｒ ｍｉｎｉＬＯＸ３」では、可溶性グルテニン量が約８.３３倍増加していた。
このことから、「ｒ ｍｉｎｉＬＯＸ３」は、グルテン構造の変化に対して良好に寄与していることがわかった。
このことから、「ｒ ｍｉｎｉＬＯＸ３」は、グルテン構造の変化に対して良好に寄与していることがわかった。
【0120】
【表9】
【0121】
＜試験８：「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」を用いた製パン評価＞
以下の方法により、「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」を用いて、ストレート法に基づく製パン試験を行った。
以下の方法により、「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」を用いて、ストレート法に基づく製パン試験を行った。
【0122】
試験７と同様の方法で、生地を作製し、その発酵を行った。
発酵後、オーブンで、２００℃、２０分間、生地の焼成を行った。
焼成後、パンのボリュームを、菜種置換法を用いて測定した。
各パンのボリュームを表１０に示す。
発酵後、オーブンで、２００℃、２０分間、生地の焼成を行った。
焼成後、パンのボリュームを、菜種置換法を用いて測定した。
各パンのボリュームを表１０に示す。
【0123】
表１０に示されるとおり、各パンのボリューム（体積）に大きな差はなかった。このことから、「ミニＬＯＸ３遺伝子発現酵母」は、製パンにおいて、従来の酵母と同様に使用できることがわかった。
【0124】
【表10】
【配列表】