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特開2024-19132ＥＣＬベース電極、ＥＣＬベース電極の製造方法、ＥＣＬセンサ、ＥＣＬセンサの製造方法、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法、及び核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法に用いられる核酸修飾検出用キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024019132
(43)【公開日】2024-02-08
(54)【発明の名称】ＥＣＬベース電極、ＥＣＬベース電極の製造方法、ＥＣＬセンサ、ＥＣＬセンサの製造方法、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法、及び核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法に用いられる核酸修飾検出用キット
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20240201BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240201BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20240201BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240201BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240201BHJP
C07K 16/44 20060101ALN20240201BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A ZNA
G01N33/53 M
G01N33/543 575
C12Q1/68 100Z
C12Q1/6876 Z
C07K16/44
【審査請求】未請求
【請求項の数】32
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023122747
(22)【出願日】2023-07-27
(31)【優先権主張番号】202210897954.1
(32)【優先日】2022-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】594164542
【氏名又は名称】キヤノンメディカルシステムズ株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】515190906
【氏名又は名称】南京大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001771
【氏名又は名称】弁理士法人虎ノ門知的財産事務所
(72)【発明者】
【氏名】ファン ハオ
(72)【発明者】
【氏名】シュ チチ
(72)【発明者】
【氏名】ウー シァオティン
(72)【発明者】
【氏名】ヂィー フアンシィェン
(72)【発明者】
【氏名】ウー ヂィエ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QR50
4B063QR54
4B063QR58
4B063QS33
4B063QS39
4B063QX04
4H045AA11
4H045DA76
4H045EA50
(57)【要約】
【課題】感度が高く、特異性が高く、検出限界が低い核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法を提供することである。
【解決手段】実施形態に係るＥＣＬ（Electrochemiluminescence）ベース電極の製造方法は、電気触媒溶液と金属ナノ粒子を混合した後、混合した粒子懸濁液を電極の表面に滴下して、電気触媒－金属ナノ粒子で共修飾されたベース電極を得る工程を含む。
【選択図】図１
【解決手段】実施形態に係るＥＣＬ（Electrochemiluminescence）ベース電極の製造方法は、電気触媒溶液と金属ナノ粒子を混合した後、混合した粒子懸濁液を電極の表面に滴下して、電気触媒－金属ナノ粒子で共修飾されたベース電極を得る工程を含む。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
電気触媒溶液と金属ナノ粒子を混合した後、混合した粒子懸濁液を電極の表面に滴下して、電気触媒－金属ナノ粒子で共修飾されたベース電極を得る工程を含む、
ＥＣＬ（Electrochemiluminescence）ベース電極の製造方法。
ＥＣＬ（Electrochemiluminescence）ベース電極の製造方法。
【請求項2】
前記電気触媒は、遷移金属化合物である、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記電気触媒は、二セレン化モリブデン（ＭｏＳｅ２）である、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項4】
前記金属ナノ粒子は、金（Ａｕ）ナノ粒子、銀（Ａｇ）ナノ粒子、白金（Ｐｔ）ナノ粒子、銅（Ｃｕ）ナノ粒子、コバルト（Ｃｏ）ナノ粒子、鉄（Ｆｅ）ナノ粒子、ニッケル（Ｎｉ）ナノ粒子及びそれらの多元合金ナノ粒子のうちの少なくとも一つである、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項5】
前記金属ナノ粒子は、金（Ａｕ）ナノ粒子である、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項6】
前記電極は、ガラス炭素電極、ＩＴＯ（Indium Tin Oxide）電極、及びスクリーン印刷電極のうちの一つである、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項7】
前記電極は、ガラス炭素電極である、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項8】
前記電気触媒の剥離時間は、５時間以上である、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項9】
前記電気触媒の剥離時間は、５時間以上２５時間未満である、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項10】
前記電気触媒と前記金属ナノ粒子との混合比率は、３．５ｍｇ／ｍＬのＭｏＳｅ２と０．５ｍｇ／ｍＬのＡｕＮＰｓとの体積比で１：１～１：９である、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項11】
前記電気触媒と前記金属ナノ粒子との混合比率は、３．５ｍｇ／ｍＬのＭｏＳｅ２と０．５ｍｇ／ｍＬのＡｕＮＰｓとの体積比で１：５～１：７である、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項12】
電気触媒溶液と金属ナノ粒子で共修飾された界面
を有する、ＥＣＬベース電極。
を有する、ＥＣＬベース電極。
【請求項13】
電気触媒溶液と金属ナノ粒子を混合した後、混合した粒子懸濁液を電極の表面に滴下して、電気触媒－金属ナノ粒子で共修飾されたベース電極を得る工程を含むＥＣＬベース電極の製造方法によりＥＣＬベース電極を製造する工程と、
末端修飾された捕捉核酸を前記ベース電極の表面に結合させる工程と、
を含む、ＥＣＬセンサの製造方法。
末端修飾された捕捉核酸を前記ベース電極の表面に結合させる工程と、
を含む、ＥＣＬセンサの製造方法。
【請求項14】
前記末端修飾された捕捉核酸は、メルカプト修飾された捕捉核酸、アミノ修飾された捕捉核酸、又はビオチン修飾された捕捉核酸である、
請求項１３に記載の製造方法。
請求項１３に記載の製造方法。
【請求項15】
前記末端修飾された捕捉核酸は、メルカプト修飾された捕捉核酸である、
請求項１４に記載の製造方法。
請求項１４に記載の製造方法。
【請求項16】
前記捕捉核酸を結合した電極の表面をブロッキング剤でブロッキングする工程をさらに含む、
請求項１３に記載の製造方法。
請求項１３に記載の製造方法。
【請求項17】
前記ブロッキング剤は、小分子ブロッキング剤及びタンパク質ブロッキング剤のうち少なくとも一つである、
請求項１６に記載の製造方法。
請求項１６に記載の製造方法。
【請求項18】
前記小分子ブロッキング剤は、６－メルカプト－１－ヘキサノール（ＭＣＨ）である、
請求項１７に記載の製造方法。
請求項１７に記載の製造方法。
【請求項19】
前記タンパク質ブロッキング剤は、ウシ血清アルブミンである、
請求項１７に記載の製造方法。
請求項１７に記載の製造方法。
【請求項20】
電気触媒溶液と金属ナノ粒子で共修飾された界面を有するＥＣＬベース電極と、
前記ＥＣＬベース電極の表面に結合され、末端修飾された捕捉核酸と、
を有する、ＥＣＬセンサ。
前記ＥＣＬベース電極の表面に結合され、末端修飾された捕捉核酸と、
を有する、ＥＣＬセンサ。
【請求項21】
電気触媒溶液と金属ナノ粒子で共修飾された界面を有するＥＣＬベース電極と、前記ＥＣＬベース電極の表面に結合され、末端修飾された捕捉核酸とを有するＥＣＬセンサの表面に被験試料を滴下し、捕捉核酸により標的核酸を前記ＥＣＬセンサの表面に捕捉する第１工程と、
抗核酸修飾抗体を滴下し、前記標的核酸上の核酸特異的サイトに結合させる第２工程と、
ＥＣＬナノプローブを添加し、前記標的核酸を検出信号標識する第３工程と、
第３工程で得られたＥＣＬセンサを、共反応剤を含む検出溶液に浸してＥＣＬ信号測定を行う第４工程と
を含む、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法。
抗核酸修飾抗体を滴下し、前記標的核酸上の核酸特異的サイトに結合させる第２工程と、
ＥＣＬナノプローブを添加し、前記標的核酸を検出信号標識する第３工程と、
第３工程で得られたＥＣＬセンサを、共反応剤を含む検出溶液に浸してＥＣＬ信号測定を行う第４工程と
を含む、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法。
【請求項22】
前記ＥＣＬナノプローブは、二次抗体修飾済の金属ドープ無機酸化物ナノ粒子であり、
前記二次抗体は、前記抗核酸修飾抗体と親和結合するものである、
請求項２１に記載の検出方法。
前記二次抗体は、前記抗核酸修飾抗体と親和結合するものである、
請求項２１に記載の検出方法。
【請求項23】
前記無機酸化物ナノ粒子は、二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化亜鉛、又は酸化鉄が被覆されているナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、二酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛ナノ粒子、又は酸化鉄ナノ粒子である、
請求項２２に記載の検出方法。
請求項２２に記載の検出方法。
【請求項24】
前記無機酸化物ナノ粒子は、二酸化ケイ素ナノ粒子である、
請求項２２に記載の検出方法。
請求項２２に記載の検出方法。
【請求項25】
前記金属ドープ無機酸化物ナノ粒子は、金属ドープ無機酸化物ナノ粒子がトリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体イオン（Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋）でドープされている二酸化ケイ素ナノ粒子である、
請求項２２に記載の検出方法。
請求項２２に記載の検出方法。
【請求項26】
前記共反応剤は、トリプロピルアミンである、
請求項２１に記載の検出方法。
請求項２１に記載の検出方法。
【請求項27】
前記核酸修飾は、核酸のメチル化修飾、メチロール化修飾、又はホルミル化修飾である、
請求項２１に記載の検出方法。
請求項２１に記載の検出方法。
【請求項28】
検出溶液のｐＨは、６．０以上であり、
捕捉核酸の濃度は、１ｎＭ～４００ｎＭであり、
捕捉核酸のインキュベーション時間は、５分以上であり、
標的核酸のインキュベーション時間は、５分以上であり、
抗核酸修飾抗体の濃度は、１μｇ／ｍＬ以上であり、
抗核酸修飾抗体のインキュベーション時間は、５分以上であり、
ＥＣＬナノプローブの濃度は、１μｇ／ｍＬ以上であり、
ＥＣＬナノプローブのインキュベーション時間は、５分以上である、
請求項２１に記載の検出方法。
捕捉核酸の濃度は、１ｎＭ～４００ｎＭであり、
捕捉核酸のインキュベーション時間は、５分以上であり、
標的核酸のインキュベーション時間は、５分以上であり、
抗核酸修飾抗体の濃度は、１μｇ／ｍＬ以上であり、
抗核酸修飾抗体のインキュベーション時間は、５分以上であり、
ＥＣＬナノプローブの濃度は、１μｇ／ｍＬ以上であり、
ＥＣＬナノプローブのインキュベーション時間は、５分以上である、
請求項２１に記載の検出方法。
【請求項29】
検出溶液のｐＨは、６．５～８．５であり、
捕捉核酸の濃度は、２０ｎＭ～１００ｎＭであり、
捕捉核酸のインキュベーション時間は、１０分以上であり、
標的核酸のインキュベーション時間は、１０分以上であり、
抗核酸修飾抗体の濃度は、２μｇ／ｍＬ以上であり、
抗核酸修飾抗体のインキュベーション時間は、１０分以上であり、
ＥＣＬナノプローブの濃度は、２μｇ／ｍＬ以上であり、
ＥＣＬナノプローブのインキュベーション時間は、１０分以上である、
請求項２１に記載の検出方法。
捕捉核酸の濃度は、２０ｎＭ～１００ｎＭであり、
捕捉核酸のインキュベーション時間は、１０分以上であり、
標的核酸のインキュベーション時間は、１０分以上であり、
抗核酸修飾抗体の濃度は、２μｇ／ｍＬ以上であり、
抗核酸修飾抗体のインキュベーション時間は、１０分以上であり、
ＥＣＬナノプローブの濃度は、２μｇ／ｍＬ以上であり、
ＥＣＬナノプローブのインキュベーション時間は、１０分以上である、
請求項２１に記載の検出方法。
【請求項30】
電気触媒溶液と金属ナノ粒子で共修飾された界面を有するＥＣＬベース電極と、
前記ＥＣＬベース電極の表面に結合され、末端修飾された捕捉核酸と、
抗核酸修飾抗体と、
ＥＣＬナノプローブと、
検出溶液と
を含む、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法に用いられる核酸修飾検出用キット。
前記ＥＣＬベース電極の表面に結合され、末端修飾された捕捉核酸と、
抗核酸修飾抗体と、
ＥＣＬナノプローブと、
検出溶液と
を含む、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法に用いられる核酸修飾検出用キット。
【請求項31】
電気触媒と金属ナノ粒子で共修飾された、
ＥＣＬベース電極。
ＥＣＬベース電極。
【請求項32】
グラフェンを含まない、
請求項３１に記載のＥＣＬベース電極。
請求項３１に記載のＥＣＬベース電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書及び図面に開示の実施形態は、ＥＣＬベース電極、ＥＣＬベース電極の製造方法、ＥＣＬセンサ、ＥＣＬセンサの製造方法、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法、及び核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法に用いられる核酸修飾検出用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
核酸、例えばＤＮＡ及びＲＮＡに大量の化学修飾が存在し、これらの化学修飾は核酸配列を変更しない前提で、調節メカニズムとして遺伝子の発現を動的に調節する。
【0003】
ＤＮＡメチル化（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）はシトシンの５番目の炭素原子に発生し、安定的に遺伝できる見かけの修飾であり、動植物ゲノムに広く存在する。ＤＮＡメチル化は哺乳動物の成長発育過程において、遺伝子サイレンシング、ゲノムインプリンティング（ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）、Ｘ染色体不活性化及び疾患の発生等を含む様々な生理学的過程に広く関与する。
【0004】
一部の腫瘍の発生は特定の遺伝子の高メチル化イベントに伴い、かつ遺伝子の局所的な高メチル化イベントは細胞の悪性増殖より早く発生するため、特定の遺伝子のメチル化レベルの検出は腫瘍早期予測及び診断の重要な根拠の一つとすることができる。例えば、早期の結腸癌（ＣＲＣ：colorectal cancer）スクリーニング検出は見かけの遺伝的バイオマーカーに基づいて行われ、ＦＤＡ（Food and Drug Administration）は既に特定遺伝子プロモーターＣｐＧメチル化の増加を検出することによりＣＲＣの早期スクリーニング及び補助診断を行うことを許可した（非特許文献１参照）。また、異なる腫瘍種類は、高メチル化を発生する癌抑制遺伝子が異なり、例えば卵巣癌において、癌抑制遺伝子であるＲＡＳＳＦ１Ａ、ＢＲＣＡ１、ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ等が高メチル化状態を呈し、乳癌において、癌抑制遺伝子であるＰＣＤＨＢ１５、ＷＢＳＣＲＦ１７、ＩＧＦ１、ＧＹＰＣ等が高メチル化状態を呈する（非特許文献２参照）。これらの特定の腫瘍抑制遺伝子のメチル化レベルを検出することにより、特定の腫瘍のスクリーニング及び診断を強化することだけでなく、腫瘍に対する決定的治療の効果評価及び予後観察にも役立つ。
【0005】
現在、ＤＮＡメチル化検出の標準方法は亜硫酸水素塩処理（バイサルファイト処理）であり、具体的に、亜硫酸水素塩、例えば亜硫酸水素ナトリウムでＤＮＡを処理することにより、ＤＮＡ中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換することができる。これに対し、メチル化された５－メチルシトシン（５－ｍＣ）は変化しないように保持され、これにより次のＰＣＲ又はシークエンシングにより５－ｍＣとＣを区別することができ、メチル化ＤＮＡの検出を実現できる。
【0006】
しかし、亜硫酸水素塩処理はストリンジェントな化学的及び温度条件下で核酸の前処理を行う必要があり、かつＰＣＲ又はシークエンシングの検出操作が複雑であり、専門技術者及び専門的な装置を必要とし、それにより該検出方法の効率が低く、時間がかかり、コストが高くなる。したがって、簡単で、迅速で、高感度のメチル化ＤＮＡ検出方法を開発する必要がある。
【0007】
最近では、特異的抗体がメチル化部位を認識することによるメチル化ＤＮＡ検出方法が注目されている。このような検出方法は核酸の前処理を必要とせず、かつ特異的抗体に異なるプローブを標識することにより、電気化学的に（例えば非特許文献３）、蛍光等の検出を行うことができる。
【0008】
近年開発されたＥＣＬ（Electrochemiluminescence）技術は既に生物学的分析、例えば腫瘍タンパク質標識物質の検出に広く応用されている（例えば非特許文献４）。ＥＣＬ技術は電気化学的原理を利用して電極表面で電気化学反応を行って励起状態を生成して特異的な発光を引き起こす方法である。ＥＣＬはエレクトロルミネセンスであるため、蛍光と比べて、励起光源を追加する必要がなく、かつ光退色及び光干渉等の影響がないため、装置が簡単であり、コストが低く、背景信号が低く、検出感度が高いなどの利点を有する。
【0009】
しかしながら、現在のＥＣＬ検出方法の感度、特異性などの検出性能をさらに向上する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Yvette N Lamb et al.，Epi proColon 2.0 CE：A Blood-Based Screening Test for Colorectal Cancer，Mol Diagn Ther. 2017 Apr; 21(2): 225-232
【非特許文献2】Tingting Hong, Selective detections of epigenetic modification in DNA, Wuhan University, 2017, Ph.D dissertation
【非特許文献3】Eloy Povedano et al.,Amperometric Bioplatforms To Detect Regional DNA Methylation with Single-Base Sensitivity,Anal. Chem,2020,92,5604-12
【非特許文献4】Xiaoming Zhou et al.,Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2`-bipyridyl)Ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe,Nat Protoc 2014 May;9(5)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本明細書及び図面に開示の実施形態が解決しようとする課題の一つは、ＥＣＬナノプローブを採用して、特異的抗体のメチル化サイトに対する識別反応を組み合わせて、核酸特異的サイト修飾に対する、簡単で、高感度で、迅速でかつ汎用の電気化学発光検出方法を提供することである。これに基づいて、発明者らは、さらにＥＣＬ検出信号を増強し、検出感度及び特異性を向上させる等の面で鋭意研究を行った結果、電極表面をナノ機能化修飾することにより、界面増強効果を有するＥＣＬベース電極、センサを製造することができ、ＥＣＬ検出の感度を向上させた。
【0012】
即ち、本実施形態は、界面増強及びナノプローブに基づくＥＣＬ技術により、感度が高く、特異性が高く、検出限界が低い核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【0013】
実施形態に係るＥＣＬベース電極の製造方法は、電気触媒溶液と金属ナノ粒子を混合した後、混合した粒子懸濁液を電極の表面に滴下して、電気触媒－金属ナノ粒子で共修飾されたベース電極を得る工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、図面を参照して具体的な実施形態を詳細に説明する。なお、以下の説明は本実施形態の発明構想を説明するためだけであり、本実施形態を限定するものではない。
【0016】
本実施形態は、界面増強及びナノプローブに基づく核酸特異的サイト修飾の電気化学発光（ＥＣＬ）検出方法、ＥＣＬ検出方法に用いられるベース電極、センサ及びそれらの製造方法、並びにキット等を提供する。
【0017】
本実施形態に係る核酸特異的サイト修飾の検出は、核酸のハイブリダイゼーション捕捉及び特異的抗体の修飾サイト、例えばメチル化サイトに対する識別・標識により実現されるため、従来の検出方法にある核酸の前処理及びＰＣＲ増幅過程を必要とせず、方法が簡単であり、検出効率が高い。また、本実施形態は電気触媒と金属ナノ粒子でベース電極を共修飾しＥＣＬ増強界面を構築するため、ＥＣＬ信号を有効に向上させた。また、本実施形態は界面増強とナノプローブとを組み合わせた二重増幅ポリシにより、ＥＣＬ方法の検出感度を大幅に向上させ、核酸特異的サイト修飾に対する検出限界はｆＭレベルまでに達することができる。また、本実施形態は核酸特異的サイト修飾の検出に汎用性を有し、異なる捕捉核酸及び異なる特異的抗体を設計することにより、異なる標的核酸特異的サイト修飾を検出することができる。
【0018】
（ＥＣＬベース電極及びＥＣＬセンサ）
一つの実施態様は、電気触媒溶液と金属ナノ粒子を混合した後、混合した粒子懸濁液を電極の表面に滴下して、電気触媒－金属ナノ粒子で共修飾されたベース電極を得る工程を含む、ＥＣＬベース電極の製造方法に関する。
一つの実施態様は、電気触媒溶液と金属ナノ粒子を混合した後、混合した粒子懸濁液を電極の表面に滴下して、電気触媒－金属ナノ粒子で共修飾されたベース電極を得る工程を含む、ＥＣＬベース電極の製造方法に関する。
【0019】
本実施形態に用いられる電気触媒としては、特に限定されず、二次元ナノ材料を使用することができる。二次元ナノ材料は、良好な機械的、熱、電子性能及び高い触媒活性を有するため注目されている。二次元ナノ材料として、具体的に、遷移金属化合物であってもよく、例えば遷移金属二硫化物である。遷移金属二硫化物として、具体的には、二硫化モリブデン（ＭｏＳ２）、二硫化タングステン（ＷＳ２）、二セレン化モリブデン（ＭｏＳｅ２）、二セレン化タングステン（ＷＳｅ２）などが挙げられる。その中で、好ましくは二セレン化モリブデン（ＭｏＳｅ２）を使用する。
【0020】
本実施形態に用いられる金属ナノ粒子としては、特に限定されず、例えば金（Ａｕ）ナノ粒子、銀（Ａｇ）ナノ粒子、白金（Ｐｔ）ナノ粒子、銅（Ｃｕ）ナノ粒子、コバルト（Ｃｏ）ナノ粒子、鉄（Ｆｅ）ナノ粒子、ニッケル（Ｎｉ）ナノ粒子及びそれらの多元合金ナノ粒子のうちの少なくとも一つである。その中で、好ましくは金（Ａｕ）ナノ粒子を使用する。
【0021】
なお、本実施形態で用いられる電気触媒と金属ナノ粒子は、ベース電極を製造する時に製造することができ、市販品をそのまま使用することもできる。
【0022】
本実施形態に用いられる電極としては、特に限定されず、ＥＣＬ検出における一般的な電極、例えばガラス炭素電極（ＧＣＥ）、ＩＴＯ（Indium Tin Oxide）電極、及びスクリーン印刷電極（ＳＰＥ）等のうちの一つを使用することができる。その中で、好ましくはガラス炭素電極（ＧＣＥ）を使用し、より好ましくは白金ワイヤ電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極及びガラス炭素作用電極（ＧＣＥ）が配置されている標準三電極システムを使用する。
【0023】
より高いＥＣＬ信号強度を得る点から、好ましくはベース電極の界面の構築条件、例えば電気触媒の剥離時間、電気触媒と金属ナノ粒子との混合比率などを最適化する。
【0024】
電気触媒の剥離時間とは、合成された遷移金属二硫化物を二次元ナノシート状の構造までに超音波で分散する時間をいう。電気触媒の剥離時間について、特に限定されず、均一な遷移金属二硫化物の二次元ナノシートを得ることができればよく、特に限定されない。例えば５時間以上であってもよく、好ましくは５～２５時間であり、より好ましくは１０～２０時間であり、特に好ましくは１０時間である。
【0025】
電気触媒と金属ナノ粒子との混合比率について、本実施形態のＥＣＬベース電極を得ることができれば、特に限定されない。例えば３．５ｍｇ／ｍＬのＭｏＳｅ２と０．５ ｍｇ／ｍＬのＡｕＮＰｓとの体積比で、１：１～１：９であってもよく、好ましくは１：５～１：７であり、より好ましくは１：６である。
【0026】
これにより、本実施形態はさらに上記製造方法により製造されたＥＣＬベース電極に関する。当該ＥＣＬベース電極は、電気触媒と金属ナノ粒子で共修飾されたものである。本実施形態において、電気触媒は、二次元ナノシート状の構造に分散することによりＥＣＬ電極に直接に結合することができる。言い換えると、本実施形態において、電気触媒は、他の層状構造、例えばグラフェンを介することなくＥＣＬ電極に直接に結合することができる。したがって、本実施形態は、ＥＣＬ検出用ベース電極をより簡便かつ容易に得ることができる。
【0027】
一つの実施態様はさらに、上記製造方法によりＥＣＬベース電極を製造する工程と、修飾された捕捉核酸を前記ベース電極の表面に結合させる工程と、を含むＥＣＬセンサの製造方法に関する。言い換えると、ＥＣＬセンサの製造方法は、電気触媒溶液と金属ナノ粒子を混合した後、混合した粒子懸濁液を電極の表面に滴下して、電気触媒－金属ナノ粒子で共修飾されたベース電極を得る工程を含むＥＣＬベース電極の製造方法によりＥＣＬベース電極を製造する工程と、末端修飾された捕捉核酸を前記ベース電極の表面に結合させる工程とを含む。
【0028】
前記捕捉核酸は標的核酸に対して設計され、標的核酸と相補的な核酸配列を有し、両者が安定で特異的にハイブリダイゼーションすることができる。該捕捉核酸は本分野の一般的な方法により合成することができ、市販の市販品をそのまま使用することもできる。
【0029】
捕捉核酸を修飾するのは、捕捉核酸が修飾基を介して前記ベース電極に固定できるようにさせるためである。修飾方式としては、本分野の一般的な様々な修飾方式を採用することができ、特に限定されず、例えばメルカプト修飾、アミノ修飾、ビオチン化修飾などを採用することができる。その中で、メルカプト修飾は最も慣用であるため、好ましい。言い換えると、末端修飾された捕捉核酸は、メルカプト修飾された捕捉核酸、アミノ修飾された捕捉核酸、又はビオチン修飾された捕捉核酸である。
【0030】
本実施形態のＥＣＬセンサの製造方法は、前記捕捉核酸を結合した電極の表面をブロッキング剤でブロッキングする工程をさらに含んでいてもよい。具体的には、捕捉核酸を前記電極に結合させた後に、ブロッキング剤で電極の表面上の非特異的サイトをブロッキングする。前記ブロッキング剤として、本分野の一般的なブロッキング剤を採用することができ、特に限定されず、本分野の一般的なＤＮＡセンサの表面及びタンパク質センサの表面を構築する方法との点から、好ましくは小分子ブロッキング剤及びタンパク質ブロッキング剤のうち少なくとも一つを使用する。小分子ブロッキング剤としては、例えば６－メルカプト－１－ヘキサノール（ＭＣＨ）、メルカプトエチレングリコール（ＨＳ－（ＣＨ２）１１－ＥＧ２－ＯＨ、ＯＥＧ）、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などを用いることができる。その中で、好ましくは６－メルカプト－１－ヘキサノール（ＭＣＨ）を使用する。タンパク質ブロッキング剤として、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、動物血清、脱脂乳粉、ヘパリン、サケ精子ＤＮＡ等を使用することができる。その中で、好ましくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
【0031】
図１は、本実施形態のＥＣＬベース電極及びＥＣＬセンサの製造を示す模式図であり、二セレン化モリブデン（ＭｏＳｅ２）を電気触媒として、金（Ａｕ）ナノ粒子（ＡｕＮＰｓ）を金属ナノ粒子として使用する製造例である。
【0032】
図１に示すように、まず二セレン化モリブデン（ＭｏＳｅ２）及び金（Ａｕ）ナノ粒子（Ａｕ ＮＰｓ）を準備し、両者を混合した後に電極に滴下することにより、ＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓで共修飾されたベース電極を得る。
【0033】
さらに、ＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓで共修飾されたベース電極の表面に修飾された捕捉核酸を添加し、捕捉核酸を前記ベース電極の表面に結合させることにより、捕捉核酸が結合されているＥＣＬベース電極、すなわち本実施形態のＥＣＬセンサを得る。つまり、ＥＣＬセンサは、電気触媒溶液と金属ナノ粒子で共修飾された界面を有するＥＣＬベース電極と、前記ＥＣＬベース電極の表面に結合され、末端修飾された捕捉核酸とを有する。
【0034】
上記のように得られたＥＣＬセンサの表面をさらにブロッキング剤、例えば小分子ブロッキング剤であるＭＣＨ及び／又はタンパク質ブロッキング剤であるＢＳＡでブロッキングしてもよい。好ましくは順次に両者を用いてブロッキングをする。
【0035】
本実施形態のＥＣＬベース電極及びＥＣＬセンサは検出する前に製造されてもよく、検出する時に製造されてもよい。
【0036】
本実施形態において、上記電気触媒と金属ナノ粒子との界面増強設計により、電気化学発光システムにおける電極表面の電子移動を効果的に促進し、ＥＣＬ検出信号を増強することができる。本実施形態の後述する実施例に示すように、二セレン化モリブデンナノ材料（ＭｏＳｅ２）／金ナノ粒子（Ａｕ ＮＰｓ）は電子移動を効果的に促進することができ、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体イオン－トリプロピルアミン（Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋－ＴＰｒＡ）システムにはＥＣＬ増強効果を有し、それによりセンサの検出感度を向上させることができる。
【0037】
これにより、一つの実施態様は、上記製造方法により製造されるＥＣＬセンサに関する。
【0038】
（核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法）
一つの実施態様は、上記製造方法により製造されるＥＣＬセンサを使用し、且つ、前記ＥＣＬセンサの表面に被験試料を滴下し、捕捉核酸により標的核酸を前記センサの表面に捕捉する工程１と、抗核酸修飾抗体を滴下し、前記標的核酸上の核酸特異的サイトに結合させる工程２と、ＥＣＬナノプローブを添加し、前記標的核酸を検出信号標識する工程３と、工程３で得られたセンサを、共反応剤を含む検出溶液に入れてＥＣＬ信号測定を行う工程４とを含む、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法に関する。つまり、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法は、電気触媒溶液と金属ナノ粒子で共修飾された界面を有するＥＣＬベース電極と、前記ＥＣＬベース電極の表面に結合され、末端修飾された捕捉核酸とを有するＥＣＬセンサの表面に被験試料を滴下し、捕捉核酸により標的核酸を前記ＥＣＬセンサの表面に捕捉する第１工程と、抗核酸修飾抗体を滴下し、前記標的核酸上の核酸特異的サイトに結合させる第２工程と、ＥＣＬナノプローブを添加し、前記標的核酸を検出信号標識する第３工程と、第３工程で得られたＥＣＬセンサを、共反応剤を含む検出溶液に浸してＥＣＬ信号測定を行う第４工程とを含む。
一つの実施態様は、上記製造方法により製造されるＥＣＬセンサを使用し、且つ、前記ＥＣＬセンサの表面に被験試料を滴下し、捕捉核酸により標的核酸を前記センサの表面に捕捉する工程１と、抗核酸修飾抗体を滴下し、前記標的核酸上の核酸特異的サイトに結合させる工程２と、ＥＣＬナノプローブを添加し、前記標的核酸を検出信号標識する工程３と、工程３で得られたセンサを、共反応剤を含む検出溶液に入れてＥＣＬ信号測定を行う工程４とを含む、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法に関する。つまり、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法は、電気触媒溶液と金属ナノ粒子で共修飾された界面を有するＥＣＬベース電極と、前記ＥＣＬベース電極の表面に結合され、末端修飾された捕捉核酸とを有するＥＣＬセンサの表面に被験試料を滴下し、捕捉核酸により標的核酸を前記ＥＣＬセンサの表面に捕捉する第１工程と、抗核酸修飾抗体を滴下し、前記標的核酸上の核酸特異的サイトに結合させる第２工程と、ＥＣＬナノプローブを添加し、前記標的核酸を検出信号標識する第３工程と、第３工程で得られたＥＣＬセンサを、共反応剤を含む検出溶液に浸してＥＣＬ信号測定を行う第４工程とを含む。
【0039】
本実施形態は、電気化学発光法により核酸特異的サイト修飾を検出し、前記核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡである。前記核酸特異的サイト修飾は特に限定されず、例えば核酸のメチル化修飾、メチロール化修飾、又はホルミル化修飾であってもよく、具体的に、例えば、ＤＮＡのメチル化修飾（例えば５－メチルシトシンのメチル化、以下、５ｍＣとも記す）、メチロール化修飾（例えば５－メチルシトシンのメチロール化、以下５ｈｍＣとも記す）、ホルミル化修飾（例えば５－シトシンのホルミル化、以下５ｆｍＣとも記す）、ＲＮＡのメチル化修飾（例えばアデニンの６番目のＮのメチル化、以下にｍ６Ａとも記す）等である。
【0040】
電気化学発光システムは、発光試薬に応じて主に二種類に分ける：（１）金属錯体電気化学発光システム、（２）縮合環芳香族炭化水素類及びヒドラジド類を含む有機化合物電気化学発光システム。常用の電気化学発光金属錯体は、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｒｅ、Ｉｒ、Ｃｒ、Ｐｄ、Ａｌ、Ｃｄ、Ｐｔ、Ｍｏ、Ｔｂ、Ｅｕ等の金属イオン錯体を含む。そのうち、Ｒｕ、Ｉｒ、Ｏｓ、Ｒｅの金属錯体が良好な電気化学発光特性を有するため注目されている。
【0041】
Ｒｕの金属錯体において、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体イオン（Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋）は水溶性が高く、化学的性能が安定し、酸化還元が可逆的で、発光効率が高く、応用できるｐＨ範囲が広く、電気化学的に再生でき、励起状態寿命が長いなどの特徴により広く応用されている。ここで、Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋は、共反応剤であるトリプロピルアミン（ＴＰｒＡ）との反応により低電位条件下でのＥＣＬ検出が可能となり、Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋とトリプロピルアミンＴＰｒＡとの反応式は以下のとおりである。
【0042】
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【0043】
本実施形態の電気化学発光検出方法は、好ましくはルテニウム（ＩＩ）錯体イオン系により行われるが、他の金属錯体イオン系、例えばイリジウム（ＩＩＩ）錯体イオン体系などを用いて行うこともできる。
【0044】
前記抗核酸修飾抗体は、標的核酸の特異的サイト修飾に対する特異的抗体（以下一次抗体とも記す）であり、当該抗体は特異的サイト修飾に応じて本分野の抗体の一般的な調製方法により調製されてもよく、市販品を直接に使用してもよい。前記一次抗体は、例えば、ＤＮＡのメチル化シトシン（５ｍＣ）又はメチロールシトシン（５ｈｍＣ）に対する抗体である。
【0045】
電気化学発光（ＥＣＬ）ナノプローブとして、本分野で使用される様々なＥＣＬナノプローブを使用することができるが、好ましくは出願人がこの前に提出した中国特許出願２０２２１０５９２３４３．６に記載の電気化学発光ナノプローブ（以下、ＥＣＬナノプローブとも記す）、すなわち二次抗体で修飾された金属ドープ無機酸化物ナノ粒子を使用する。
【0046】
前記ＥＣＬナノプローブの調製方法は、金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加し、金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させ、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得て、前記二次抗体は前記抗核酸修飾抗体と親和結合するものである工程と、を含む。
【0047】
前記ＥＣＬナノプローブの調製には、ナノ材料がキャリアとして使用される。ナノ材料は、巨大な表面積又は多孔質構造を有するため、大量の発光体を搭載して超感度検出に用いられることができる。高安定性、低コスト、及び修飾しやすさという点から、本実施形態に用いられるナノ材料は無機酸化物ナノ粒子を使用することが好ましい。無機酸化物ナノ粒子として、具体的に、二酸化ケイ素ナノ粒子、二酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、又は表面に二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄等が被覆されているナノ粒子が挙げられる。そのうち、二酸化ケイ素ナノ粒子がより好ましいである。つまり、前記無機酸化物ナノ粒子は、二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化亜鉛、又は酸化鉄が被覆されているナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、二酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛ナノ粒子、又は酸化鉄ナノ粒子である。
【0048】
前記ＥＣＬナノプローブの調製方法は、金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加する工程を含む。添加方法としては、本分野の常用添加方法、例えば電気化学法、ゾルゲル法、イオン交換法、加水分解沈殿法などを用いることができるが、これに限定されず、金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加できる任意の方法を用いることができる。
【0049】
前記ＥＣＬナノプローブの調製方法は、二次抗体を金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させ、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程をさらに含む。ここで、二次抗体と金属添加無機酸化物ナノ粒子との結合方式は、好ましくは共有結合方式により行われるが、他の方式、例えば静電吸着等を使用することもできる。共有結合を形成する結合の方式としては、具体的に、カルボキシ－アミノ結合、アルデヒド基－アミノ結合等が挙げられる。共有結合を形成する反応について、特に限定されないが、好ましくは室温で反応でき、かつ反応が迅速で、結合効率が高い共有結合反応である。
【0050】
図２は、本実施形態に用いられるＥＣＬナノプローブの製造を示す模式図である。図２において、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体イオン（Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋）を例とし、ＥＤＣ／ＮＨＳ系（１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩）／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド系）を用いて二次抗体（以下Ａｂ２とも記す）を金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させる。具体的に、Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋を二酸化ケイ素ナノ粒子に添加し、ルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子（以下、Ｒｕ＠ＳｉＯ２とも記す）を得る。次に、Ｒｕ＠ＳｉＯ２をカルボキシル化させ、カルボキシル化ルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子（以下、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２とも記す）を形成する。次に、ＥＤＣ／ＮＨＳ系を用いて二次抗体をＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２に結合させ、二次抗体修飾されたルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子（以下、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２とも記す）を形成する。
【0051】
前記ＥＣＬナノプローブでは、一つのナノビーズ当たりにいずれも大量の金属錯体イオンを結合させることができるため、電気化学信号を顕著に増幅することができ、それによりＥＣＬ検出の感度を大幅に向上させることができる。
【0052】
また、前記ＥＣＬナノプローブにおいて、１つのナノビーズ当たりにいずれも複数の二次抗体分子を結合させることができ、それによりナノプローブと一次抗体との結合効率を向上させることができる。
【0053】
上記方法により調製されたＥＣＬナノプローブが、貯蔵安定性に優れ、例えば常温の保存条件下で１０日間以上保存することができる。そのため、本実施形態に用いられるＥＣＬナノプローブは、調製後にそのまま使用することができるが、一定の時間を保存した後に必要な時に使用することもできる。
【0054】
前記二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する一次抗体を識別する。当該二次抗体は、好ましくは一次抗体と核酸特異的サイト修飾との結合特異的部分に対して設計されるものではなく、一次抗体の汎用部分に対して設計されるものである。即ち、本実施形態に用いられる二次抗体は、好ましくは一次抗体の汎用部分を識別するタンパク質である。前記二次抗体は特に限定されず、本分野の一般的な抗体の調製方法により調製することができ、市販品を直接に使用することもできる。なお、汎用部分は、定常領域とも呼ばれる。
【0055】
これにより、本実施形態は界面増強とナノプローブとを組み合わせた二重増幅ポリシにより、ＥＣＬ方法の検出感度を大幅に向上させ、核酸特異的サイト修飾の検出限界はｆＭレベルまでに低減することができる。
【0056】
図３は、本実施形態のＥＣＬセンサを使用した核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出を示す模式図である。
【0057】
図３に示すように、標的核酸を含有する可能性のある被験試料を本実施形態のＥＣＬセンサに滴下し、捕捉核酸が特異的ハイブリダイゼーションにより標的核酸を前記センサのベース電極の表面に捕捉する。次に、抗核酸修飾抗体を添加し、該抗体は前記標的核酸上の核酸特異的サイトと結合する。次に、センサ界面にＥＣＬナノプローブを添加し、ナノプローブにおける二次抗体の上記抗核酸修飾抗体への識別により、標的核酸を検出信号標識する。以上のようにして得られたセンサを、共反応剤を含む検出溶液に入れてＥＣＬ信号測定を行う。
【0058】
高いＥＣＬ信号を得る点から、好ましくはＥＣＬ検出条件を最適化する。ＥＣＬ検出条件としては、例えばＥＣＬ検出溶液のｐＨ、捕捉核酸の濃度、捕捉核酸のインキュベーション時間、標的核酸のインキュベーション時間、一次抗体の濃度、一次抗体のインキュベーション時間、ＥＣＬナノプローブの濃度、ＥＣＬナノプローブのインキュベーション時間などが挙げられる。
【0059】
ＥＣＬ検出溶液のｐＨとして、６．０以上であってもよく、好ましくは６．５～８．５であり、より好ましくは７．５～８．０であり、具体的には例えば６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５等であってもよい。
【0060】
捕捉核酸の濃度として、１ ｎＭ～４００ ｎＭであってもよく、好ましくは２０ ｎＭ～１００ ｎＭであり、より好ましくは３０ ｎＭであり、具体的には例えば１ ｎＭ、１０ ｎＭ、３０ ｎＭ、４０ ｎＭ、５０ ｎＭ、６０ ｎＭ、７０ ｎＭ、８０ ｎＭ、９０ ｎＭ、１００ ｎＭ、２００ ｎＭ、３００ ｎＭ、４００ ｎＭ等であってもよい。
【0061】
捕捉核酸インキュベーション時間としては、５分間以上であってもよく、好ましくは１０分間以上であり、より好ましくは２０分間以上であり、さらに好ましくは５０分間であり、具体的には例えば１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間等であってもよい。
【0062】
標的核酸のインキュベーション時間としては、５分間以上であってもよく、好ましくは１０分間以上であり、より好ましくは２０分間以上であり、さらに好ましくは３０分間であり、具体的には例えば１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間等であってもよい。
【0063】
一次抗体の濃度としては、１μｇ／ｍＬ以上であってもよく、好ましくは２μｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは３μｇ／ｍＬであり、具体的には例えば１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、７μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ等であってもよい。
【0064】
一次抗体のインキュベーション時間としては、５分間以上であってもよく、好ましくは１０分間以上であり、より好ましくは２０分間以上であり、さらに好ましくは４０分間であり、具体的には例えば５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間等であってもよい。
【0065】
ＥＣＬナノプローブの濃度として、１μｇ／ｍＬ以上であってもよく、好ましくは２μｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは６μｇ／ｍＬ～１２μｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは８μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは８μｇ／ｍＬであり、具体的には例えば２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、７μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１１μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ等であってもよい。
【0066】
ＥＣＬナノプローブのインキュベーション時間として、５分間以上であってもよく、好ましくは１０分間以上であり、より好ましくは２０分間以上であり、さらに好ましくは３０分間以上であり、具体的には例えば１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間等であってもよい。
【0067】
本実施形態において、ＥＣＬナノプローブ及びＥＣＬセンサを利用することにより、ＥＣＬの検出信号を増強し、ＥＣＬの検出感度を大幅に向上させることができる。本実施形態の実施例に示すように、本実施形態の発明者らは本実施形態のＥＣＬ界面増強のメカニズムを鋭意研究し、且つそのメカニズムを以下のように推測する。
【0068】
図４は、本実施形態のＥＣＬ界面増強のメカニズムを示す模式図である。図４に示すように、センサ界面上のＡｕＮＰｓはＲｕ（ｂｐｙ）３
２＋とベース電極の電子伝達を促進することにより、Ｒｕ（ｂｐｙ）３
３＋の酸化生成を促進することができる。一方では、センサ界面上のＭｏＳｅ２はＴＰｒＡの酸化準位を低下させ、ＴＰｒＡが電子を失うことを促進してラジカル（ＴＰｒＡ・）を生成する。したがって、Ｒｕ（ｂｐｙ）３
３＋及びＴＰｒＡ・はセンサ界面で効率的に生成され、Ｒｕ（ｂｐｙ）３
３＋及びＴＰｒＡ・はさらに反応して励起状態のＲｕ（ｂｐｙ）３
２＋を生成し、ＥＣＬ信号を生成することができる。ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥセンシング電極におけるＲｕ（ｂｐｙ）３
３＋及びＴＰｒＡ・の効率的な生成に役立ち、Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋も効率的に生成することができ、最終的に増強されたＥＣＬ信号を得る。
【0069】
また、一つの実施態様は、本実施形態のＥＣＬベース電極、又はＥＣＬセンサと、必要に応じて修飾された捕捉核酸と、抗核酸修飾抗体と、ＥＣＬナノプローブと、検出溶液を含む、本実施形態のＥＣＬ検出方法に用いられる核酸修飾検出用キットに関する。
【0070】
キットには、上述のＥＣＬベース電極、ＥＣＬセンサ、抗核酸修飾抗体及びＥＣＬナノプローブに加え、使用目的に応じて必要な各種の試薬、例えばブロッキング剤及び取扱説明書等を含むことができる。つまり、核酸特異的サイト修飾のＥＣＬ検出方法に用いられる核酸修飾検出用キットは、電気触媒溶液と金属ナノ粒子で共修飾された界面を有するＥＣＬベース電極と、前記ＥＣＬベース電極の表面に結合され、末端修飾された捕捉核酸と、抗核酸修飾抗体と、ＥＣＬナノプローブと、検出溶液とを含む。
【0071】
ＥＣＬ信号の有無及び強度に基づいて検出される試料の核酸特異的サイト修飾に対して定性及び定量分析を行うことができ、例えば反応系においてＥＣＬ信号が検出されない場合、検出される試料に核酸特異的サイト修飾が含まれなく、上記複合物が形成されずに電気化学発光信号を生成することができないと判断する。また、本実施形態の実施例において検証されているように、電気化学発光の強度とメチル化ＤＮＡ濃度の対数が線形関係を呈するため、電気化学発光の強度に基づいてメチル化ＤＮＡを定量分析することができる。
【0072】
（実施例）
以下に実施例を挙げて本実施形態を具体的に説明するが、これらの実施例は例示に過ぎず、本実施形態はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下に実施例を挙げて本実施形態を具体的に説明するが、これらの実施例は例示に過ぎず、本実施形態はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0073】
本実施例で使用されている全ての試薬はいずれも分析純度レベルであり、その販売先及び略語は以下のとおりである。
【0074】
トリス（２,２’－ビピリジン）ジクロロルテニウム（ＩＩ）六水和物（Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）及び２－（Ｎ－モルホリン）エタノールスルホン酸（ＭＥＳ）はＳｉｇｍａ（中国、上海）から購入される。
【0075】
カルボキシエチルシラントリオール塩（Ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅｔｒｉｏｌ Ｎａ ｓａｌｔ、ＣＴＥＳ）、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びトリ－ｎ－プロピルアミン（ＴＰｒＡ）はＪ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（中国、上海）から購入される。
【0076】
シクロヘキサンはＡｌａｄｄｉｎ（中国、上海）から購入される。
【0077】
ｎ－ヘキサノールはＴＣＩ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（中国、上海）から購入される。
【0078】
アンモニア水はＭａｃｋｌｉｎ（中国、上海）から購入される。
【0079】
アセトンは国薬（中国、上海）から購入される。
【0080】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）はＫｅｙＧＥＮ ＢｉｏＴＥＣＨ（中国、江蘇）から購入される。
【0081】
抗５－メチルシトシン抗体（製品番号：ａｂ１０８０５、Ａｂ－５ｍＣ）、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（製品番号：ａｂ ６７０９、Ａｂ２）はＡｂｃａｍ（中国、上海）から購入される。
【0082】
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法タンパク質定量検出キットはＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（中国、上海）から購入される。
【0083】
超純水は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の水浄化システム（抵抗率≧１８ ＭΩ・ｃｍ）から得られる。
【0084】
（実施例１：ＥＣＬナノプローブ（Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２）の調製）
以下のステップに従い、Ｒｕ＠ＳｉＯ２、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２をそれぞれ調製する。
以下のステップに従い、Ｒｕ＠ＳｉＯ２、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２をそれぞれ調製する。
【0085】
まず、５０ ｍＬ丸底フラスコを磁気撹拌器上に置き、高速磁気撹拌を行い、順に７．５０ ｍＬのシクロヘキサン、１．８０ ｍＬのｎ－ヘキサノール及び１．７７ ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加し、１５分間混合・撹拌する。次に、上記混合物に３４０μＬの４０ ｍＭの［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋水溶液を添加し、３０分間混合・撹拌する。その後、１００μＬのＴＥＯＳを入れて３０分間撹拌した。次に、６０μＬのアンモニア水（２８－３０％ｗｔ）を該混合物に添加し、遮光条件下２４ ｈ撹拌し、Ｒｕ＠ＳｉＯ２を得た。
【0086】
続いて、５０μＬのＣＴＥＳ（カルボキシル基修飾用）を添加し、遮光条件下７ｈ反応させ、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を得た。その後、アセトンで沈殿（１００００ ｒｐｍ、１０分間）を分離し、遠心分離して上清を捨て、沈殿物をそれぞれエタノールと超純水で二回洗浄し、超音波で分散し、遠心分離して上清を除去した。最後に、得られた沈殿物を超純水に分散させ、一部を取って乾燥し重量を秤量し、残りを４°Ｃ、遮光条件下で保存する。
【0087】
１０μＬの５０ ｍｇ／ｍＬのＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２溶液を１．５ ｍＬの遠心管に入れ、５００μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ溶液（ＥＤＣ及びＮＨＳ溶液がいずれも５０ ｍｇ／ｍＬであり、２５ ｍＭのｐＨ５．５のＭＥＳ緩衝液に調製される）を添加し、室温で３５分間振動した後、遠心分離して上清を除去し、次に１０ ｍＭのＰＨ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝液：ＮａＨ２ＰＯ４及びＮａ２ＨＰＯ４で調製される）で遠心し洗浄する（１２０００ ｒｐｍ、５分間）。その後、カルボキシル化されたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を１ ｍＬの１０ ｍＭのＰＢＳに分散させ、２０μＬの２ ｍｇ／ｍＬのＡｂ２を添加し、揺動床（６０ ｒｐｍ）に置き、室温で４ ｈ反応させる。その後に、順に２５ ｍＭのＭＥＳ及び１０ ｍＭのＰＢＳを用いて４℃で遠心し洗浄し（１２０００ ｒｐｍ、５分間）、上清を捨て、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を得た。最後に、それを２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する１０ ｍＭ ＰＨ７．４のＰＢＳに分散させ、４℃遮光条件下保存する。
【0088】
（実施例２：実施例１で製造されたＥＣＬナノプローブの特徴づけ）
（１）ナノプローブの形態の特徴づけ
透過型電子顕微鏡、動的光散乱法、Ｚｅｔａ電位測定及び赤外線（ＦＴ－ＩＲ）分光法を用いて、実施例１で得られたＲｕ＠ＳｉＯ２、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノプローブの形態をそれぞれ測定し、その結果を図５Ａ～５Ｄに示す。図５Ａ～５Ｄは、実施例１で製造されたＥＣＬナノプローブの形態の特徴づけ結果を示す図である。図５Ａには、実施例１で得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＴＥＭ写真を示す。図５Ｂには、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＤＬＳ粒径分布を示す。図５Ｃには、実施例１で製造されたＲｕ＠ＳｉＯ２、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＺｅｔａ電位の測定結果を示す。図５Ｄには、実施例１で製造された製造されたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ａ）及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ｂ）のＦＴ－ＩＲスペクトルの測定結果を示す。
（１）ナノプローブの形態の特徴づけ
透過型電子顕微鏡、動的光散乱法、Ｚｅｔａ電位測定及び赤外線（ＦＴ－ＩＲ）分光法を用いて、実施例１で得られたＲｕ＠ＳｉＯ２、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノプローブの形態をそれぞれ測定し、その結果を図５Ａ～５Ｄに示す。図５Ａ～５Ｄは、実施例１で製造されたＥＣＬナノプローブの形態の特徴づけ結果を示す図である。図５Ａには、実施例１で得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＴＥＭ写真を示す。図５Ｂには、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＤＬＳ粒径分布を示す。図５Ｃには、実施例１で製造されたＲｕ＠ＳｉＯ２、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＺｅｔａ電位の測定結果を示す。図５Ｄには、実施例１で製造された製造されたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ａ）及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ｂ）のＦＴ－ＩＲスペクトルの測定結果を示す。
【0089】
Ａ：ＴＥＭによるＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２形成の確認
実施例１で得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノ粒子をＪＥＭ－２１００透過電子顕微鏡（日本、ＪＥＯＬ）で撮影した。得られた透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を図５Ａに示す。
実施例１で得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノ粒子をＪＥＭ－２１００透過電子顕微鏡（日本、ＪＥＯＬ）で撮影した。得られた透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を図５Ａに示す。
【0090】
図５Ａに示すように、得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノ粒子は、均一に分散し、大きさが均一で、直径が約３０ｎｍの球状粒子である。
【0091】
Ｂ：動的光散乱（ＤＬＳ）法によるＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２形成の確認
９０ Ｐｌｕｓ／ＢＩ－ＭＡＳ機器（米国、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）法を用いてそれぞれＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の水和粒径を測定した。粒径分布の結果を図５Ｂに示す。
９０ Ｐｌｕｓ／ＢＩ－ＭＡＳ機器（米国、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）法を用いてそれぞれＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の水和粒径を測定した。粒径分布の結果を図５Ｂに示す。
【0092】
図５Ｂに示すように、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ａ）の水和粒径は５０ｎｍ程度で分布し、粒径分布が狭く、サイズが均一であり、かつ単分散性を有する。Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ｂ）の水和粒径は約７０ｎｍであり、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２より僅かに大きく、Ａｂ２とＲｕ＠ＳｉＯ２とのカップリングが成功し、分散性が高く、凝集現象が発生しないことを示す。
【0093】
Ｃ：ゼータ電位測定によるＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２形成の確認
９０ Ｐｌｕｓ／ＢＩ－ＭＡＳ機器（米国、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）を用いて実施例１で製造されたＲｕ＠ＳｉＯ２、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノプローブのＺｅｔａ電位を測定し、その結果を図５Ｃに示す。
９０ Ｐｌｕｓ／ＢＩ－ＭＡＳ機器（米国、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）を用いて実施例１で製造されたＲｕ＠ＳｉＯ２、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノプローブのＺｅｔａ電位を測定し、その結果を図５Ｃに示す。
【0094】
Ｚｅｔａ電位の変化はＲｕ＠ＳｉＯ２がカルボキシル化及び抗体結合を発生したことを示す。図５Ｃに示すように、Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＺｅｔａ電位値は－２．１ ｍＶであり、カルボキシル官能基は負電荷を有するため、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の電位は－１１．６ ｍＶである。また、抗体は負電荷を有するため、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＺｅｔａ電位値は－２５．５ ｍＶまで増加し、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２が成功に製造されたことを示す。
【0095】
Ｄ：赤外線スペクトルによるＲｕ＠ＳｉＯ２カルボキシル化修飾の確認
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｎｉｃｏｌｅｔ ６７００フーリエ赤外線分光計（米国、Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて実施例１で製造されたＲｕ＠ＳｉＯ２とＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の赤外線（ＦＴ－ＩＲ）スペクトルを測定し、その結果を図５Ｄに示す。
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｎｉｃｏｌｅｔ ６７００フーリエ赤外線分光計（米国、Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて実施例１で製造されたＲｕ＠ＳｉＯ２とＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の赤外線（ＦＴ－ＩＲ）スペクトルを測定し、その結果を図５Ｄに示す。
【0096】
Ｒｕ＠ＳｉＯ２とＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の赤外線スペクトルの変化はＲｕ＠ＳｉＯ２がカルボキシル化修飾されていることを示す。図５Ｄに示すように、Ｒｕ＠ＳｉＯ２とＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２は１０９０ ｃｍ－１付近にいずれも強いピークがあり、これがＳｉ－Ｏ－Ｓｉ引張振動の特徴ピークである。またＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２は１５６０ ｃｍ－１に新たなカルボキシル基による吸収ピークがある。
【0097】
（２）ＥＣＬナノプローブのＥＣＬ性能特徴づけ
電気化学サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）法を用いて、実施例１で製造されたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２およびＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を以下のようにＥＣＬ検出を行った。
電気化学サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）法を用いて、実施例１で製造されたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２およびＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を以下のようにＥＣＬ検出を行った。
【0098】
１０μＬのＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２をそれぞれガラス炭素電極（ＧＣＥ）に置き、乾燥させた後に三電極システムを用いてＥＣＬ検出溶液（０．１Ｍ ＰＨ７．４ ＰＢＳ、１０ ｍＭ ＴＰｒＡを含む）において、０ Ｖから＋１．３ Ｖまでの間に電気化学サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を行い、かつ光電子増倍管（ＰＭＴ）からＥＣＬ強度を取得し、その結果を図６に示す。なお、電気化学サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）の実験はＣＨＩ ６３０ Ｄ電気化学ワークステーション（中国、上海辰華）で行う。図６は、実施例１で製造されたＥＣＬナノプローブのＥＣＬ性能の特徴づけ結果を示す図である。
【0099】
図６に示すように、ベアＧＣＥではＥＣＬピークが現れないが、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２／ＧＣＥでは＋１．１ Ｖで強い陽極ＥＣＬ信号を取得し、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２がＴＰｒＡと反応してＥＣＬ信号を生成することができることを示す。ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２／ＧＣＥに比べて、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２／ＧＣＥのＥＣＬ開始ピークの電位がわずかに正にシフトし、ＥＣＬピークの形状がほとんど変化せず、依然としてＴＰｒＡと反応して強いＥＣＬ信号を生成することができる。この結果はＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２が優れたＥＣＬ性能を有し、ＥＣＬナノプローブとすることができることを示す。
【0100】
なお、実施例部分において、ＥＣＬはいずれもＭＰＩ－Ａ多機能電気化学発光分析システム（中国、西安Ｒｅｍｅｘ）、標準三電極システムの電解セルで測定した。前記標準三電極システムに白金ワイヤ電極と、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極と、直径が５ｍＭのガラス炭素作用電極（ＧＣＥ）が配置されている。三電極システムを用いてＥＣＬ検出電解液（０．１Ｍ ＰＨ７．４ ＰＢＳ、１０ｍＭ ＴＰｒＡを含む）でＥＣＬ応答を記録する。また、全てのＥＣＬ測定はいずれも室温で行い、以下も同様である。
【0101】
（３）ＥＣＬナノプローブの保存安定性の特徴づけ
実施例１で調製されたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の保存安定性を以下のように測定した。
実施例１で調製されたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の保存安定性を以下のように測定した。
【0102】
実施例１で得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２は水中での分散性が良く、チンダル効果（Ｔｙｎｄａｌｌ ｅｆｆｅｃｔ）があり、水中で五週間以上安定に分散でき、且つ凝集・沈殿しにくい。
【0103】
ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を水に分散させ、４℃遮光条件下保存し、７日間ごとにＥＣＬ信号を一回測定し、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を１％ＢＳＡ含有水中に４°Ｃ遮光条件下に置いて保存し、５日間ごとにＥＣＬ信号を測定し、その結果を図７Ａ～７Ｂに示す。図７Ａ～７Ｂは、実施例１で製造されたＥＣＬナノプローブの保存安定性の測定結果を示す図である。図７ＡにはＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の測定結果を示す。図７ＢにはＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の測定結果を示す。
【0104】
図７Ａに示すように、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＥＣＬ強度は２８日以内にほとんど変化せず、ＥＣＬ性質が安定することを示す。その良好な保存安定性は、正電荷を有する［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋と負電荷を有するシリカナノ粒子との間の強い静電作用に起因すると推測される。また、図７ＢはＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＥＣＬ強度が２０日間内にほとんど変化せず、それも良好な保存安定性を示す。
【0105】
（４）Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２に結合されているルテニウム分子の個数及び二次抗体の個数の確認
まず、ＴＥＭ特徴付けの結果（直径が３０ｎｍである）から、単一のＲｕ＠ＳｉＯ２の平均体積（ＶＲｕ＠ＳｉＯ２）：ＶＲｕ＠ＳｉＯ２＝（４／３）π・ｒ３＝（４／３）π・（１５×１０－９）３＝１．４１×１０－２３ｍ３を得た。
まず、ＴＥＭ特徴付けの結果（直径が３０ｎｍである）から、単一のＲｕ＠ＳｉＯ２の平均体積（ＶＲｕ＠ＳｉＯ２）：ＶＲｕ＠ＳｉＯ２＝（４／３）π・ｒ３＝（４／３）π・（１５×１０－９）３＝１．４１×１０－２３ｍ３を得た。
【0106】
簡単にするために、ＳｉＯ２に孔隙がないと仮定し、シリカ密度（δ）＝２．２ ｋｇ／ｄｍ３であるため、単一のＳｉＯ２の重量はｍＳｉＯ２＝ＶＳｉＯ２・δ＝３．１１×１０－２０ｋｇである。
【0107】
単一のＲｕ＠ＳｉＯ２に結合されているルテニウム分子の個数を得るために、実施例１で得られたＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２をＮａｎｏｄｒｏｐ－２０００Ｃ紫外可視分光光度計（米国、Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて紫外可視スペクトル（ＵＶ）による定量分析を行う。その結果を図８Ａ～８Ｃに示す。図８Ａ～８Ｃは、実施例１で製造されたＥＣＬナノプローブ上に結合されているルテニウム分子の個数及び二次抗体の個数の分析結果を示す図である。図８Ａは、異なる濃度の［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋標準溶液とＥＣＬナノプローブの紫外可視スペクトルであり、ａはＲｕ＠ＳｉＯ２の吸光度曲線を示し、ｂはＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の吸光度曲線を示し、その他の線は異なる濃度の［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋の吸光度曲線を示す。図８Ｂは［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋の４５７ｎｍにおける濃度検量線を示す。図８ＣはＢＳＡ標準品の６２０ｎｍにおける濃度検量線を示す。
【0108】
図８Ａに示すように、１００μｇ／ｍＬのＲｕ＠ＳｉＯ２の４５７ｎｍにおける吸光度Ａは０．２６であり、図８Ｂの［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋の４５７ｎｍにおける濃度検量線から、１００μｇ／ｍＬのＲｕ＠ＳｉＯ２における［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋の濃度は１２．３６μｇ／ｍＬであることを得た。これにより、１ｍＬの１００μｇ／ｍＬのＲｕ＠ＳｉＯ２の個数ＮＲｕ＠ＳｉＯ２＝ｍ総ＳｉＯ２／ｍＳｉＯ２＝３．２２×１０１２、［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋の個数Ｎ［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋＝ＮＡ・ｎ＝ＮＡ・ｍＲｕ／ＭＲｕ＝９．９３×１０１５（ＭＲｕ＝７４８．６２）。
【0109】
したがって、単一のＲｕ＠ＳｉＯ２に含まれている［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋分子の個数は約Ｎ［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋／ＮＲｕ＠ＳｉＯ２＝３×１０３である。
【0110】
プレートリーダー用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法タンパク質定量キットを用い、実施例１で得られたＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２におけるＡｂ２の６２０ｎｍにおける吸光度を測定した結果、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２におけるＡｂ２の吸光度Ａ６２０は０．６３である。
【0111】
図８ＣのＢＳＡ標準品の６２０ ｎｍにおける濃度検量線から、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２におけるＡｂ２の濃度が７５．４９μｇ／ｍＬであることを得た。これにより、１ ｍＬのＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２におけるＡｂ２の個数ＮＡｂ２＝ＮＡ・ｎ＝ＮＡ・ｍＡｂ２／ＭＡｂ２＝３×１０１４（ＭＡｂ２＝１５０ ＫＤ＝１．５×１０５ｇ／ｍｏｌ）。
【0112】
調製されたＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を５倍希釈した後に紫外線定量を行い、４５７ ｎｍでの吸光度ＡＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２＝０．５３である。１００μｇ／ｍＬ Ｒｕ＠ＳｉＯ２の４５７ ｎｍ吸光度Ａ＝０．２６、Ｒｕ＠ＳｉＯ２個数ＮＲｕ＠ＳｉＯ２＝３×１０１２／ｍＬであるため、１ ｍＬの５倍希釈後のＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２におけるＲｕ＠ＳｉＯ２の個数がＮ２＝６×１０１２／ｍＬである。
【0113】
１ ｍＬの５倍希釈後のＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２におけるＡｂ２の個数Ｎ３＝６×１０１３であり、単一のＲｕ＠ＳｉＯ２に結合されている抗体の個数＝Ｎ３／Ｎ２＝６×１０１３／６×１０１２＝１０であると推定することができる。
【0114】
以上より、一つのＲｕ＠ＳｉＯ２では約３×１０３個の［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋分子を含むことができ、一つのＲｕ＠ＳｉＯ２では約１０個の抗体を結合することができる。したがって、単一のＲｕ＠ＳｉＯ２では、上千個の［Ｒｕ（ｂｙｐ）３］２＋分子を担持して信号を増幅させることができる。
【0115】
（実施例３：メチル化ＤＮＡのＥＣＬ検出方法）
まず、以下のようにして本実施形態のＥＣＬセンサを製造し且つＥＣＬ検出を行う。
まず、以下のようにして本実施形態のＥＣＬセンサを製造し且つＥＣＬ検出を行う。
【0116】
（１）電気触媒（ＭｏＳｅ２）及び金属ナノ粒子（Ａｕ ＮＰｓ）の調製
（ＡｕＮＰｓの調製）
三口フラスコに４９ ｍＬの脱イオン水を加え、加熱して沸騰させた後、１ ｍＬのＨＡｕＣｌ４（１ ｗｔ％）を添加した直後に２ ｍＬのクエン酸（２ ｗｔ％）を添加し、１５分間撹拌し、色がスイカ赤色になるまで加熱を停止させ、かつ室温まで自然冷却し、最後に４℃で貯蔵する。
（ＡｕＮＰｓの調製）
三口フラスコに４９ ｍＬの脱イオン水を加え、加熱して沸騰させた後、１ ｍＬのＨＡｕＣｌ４（１ ｗｔ％）を添加した直後に２ ｍＬのクエン酸（２ ｗｔ％）を添加し、１５分間撹拌し、色がスイカ赤色になるまで加熱を停止させ、かつ室温まで自然冷却し、最後に４℃で貯蔵する。
【0117】
（ＭｏＳｅ２の調製）
０．５ ｍｍｏｌ（ＮＨ４）２ＭｏＯ４及び１．０ ｍｍｏｌ Ｓｅ粉末を１８ ｍＬのオレイン酸／エタノール（１：１（Ｖ／Ｖ））混合液に添加し、混合し、かつポリテトラフルオロエチレンライナーの高圧釜に転移する。オートクレーブを封止し、オーブン内に置き、１６０～２００℃で７２ ｈ加熱し、室温まで冷却する。その後に、生成物をエタノールで３回遠心洗浄し（１００００ ｒｐｍ、１０分間）、６０℃で１２ ｈ真空乾燥する。さらに、アルゴンガスを用いて５００℃で１～２ ｈアニーリングし、表面における未反応のセレン粉末及び界面活性剤オレイン酸を除去する。最後に、３．５ ｍｇのＭｏＳｅ２を称量して１ ｍＬの脱イオン水に入れて、１０ ｈ超音波剥離（３５ＨＺ）を行い、再度遠心分離し（１２０００ ｒｐｍ、１０分間）、微量の不純物及び完全に剥離しないＭｏＳｅ２を除去し、上清を取り、ＭｏＳｅ２水溶液（３．５ ｍｇ／ｍＬ）を得た。
０．５ ｍｍｏｌ（ＮＨ４）２ＭｏＯ４及び１．０ ｍｍｏｌ Ｓｅ粉末を１８ ｍＬのオレイン酸／エタノール（１：１（Ｖ／Ｖ））混合液に添加し、混合し、かつポリテトラフルオロエチレンライナーの高圧釜に転移する。オートクレーブを封止し、オーブン内に置き、１６０～２００℃で７２ ｈ加熱し、室温まで冷却する。その後に、生成物をエタノールで３回遠心洗浄し（１００００ ｒｐｍ、１０分間）、６０℃で１２ ｈ真空乾燥する。さらに、アルゴンガスを用いて５００℃で１～２ ｈアニーリングし、表面における未反応のセレン粉末及び界面活性剤オレイン酸を除去する。最後に、３．５ ｍｇのＭｏＳｅ２を称量して１ ｍＬの脱イオン水に入れて、１０ ｈ超音波剥離（３５ＨＺ）を行い、再度遠心分離し（１２０００ ｒｐｍ、１０分間）、微量の不純物及び完全に剥離しないＭｏＳｅ２を除去し、上清を取り、ＭｏＳｅ２水溶液（３．５ ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【0118】
（２）センサの構築
まず、上記製造された３．５ ｍｇ／ｍＬのＭｏＳｅ２溶液と０．５０ ｍｇ／ｍＬのＡｕＮＰｓを体積比１：６で混合し、３０分間超音波振動し、ＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓ溶液を製造した。１０μＬの該ＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓ溶液を研磨処理されたガラス炭素電極の表面に置き、真空下で乾燥させる。次に、１０μＬの３０ ｎＭのメルカプト修飾された捕捉核酸（以下ＳＨ－ＤＮＡとも記す）を、Ｂ＆Ｗ緩衝液（０．０１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌと、１ ｍＭのＥＤＴＡと、２ ＭのＮａＣｌとを含有し、ｐＨが７．５である））に溶解して電極の表面に滴下し、３７℃で、５５０ ｒｐｍで、５０分間インキュベートした。きれいに洗い流した後にさらに電極の表面に１０μＬの１ ｍＭのＭＣＨを滴下し、３７℃で、５００ ｒｐｍで、３０分間インキュベートし、きれいに洗い流した後にさらに電極の表面に１０μＬの２％ＢＳＡを滴下し、３０ ｍｉｎインキュベートし、洗浄した後にＥＣＬセンサを得た。
まず、上記製造された３．５ ｍｇ／ｍＬのＭｏＳｅ２溶液と０．５０ ｍｇ／ｍＬのＡｕＮＰｓを体積比１：６で混合し、３０分間超音波振動し、ＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓ溶液を製造した。１０μＬの該ＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓ溶液を研磨処理されたガラス炭素電極の表面に置き、真空下で乾燥させる。次に、１０μＬの３０ ｎＭのメルカプト修飾された捕捉核酸（以下ＳＨ－ＤＮＡとも記す）を、Ｂ＆Ｗ緩衝液（０．０１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌと、１ ｍＭのＥＤＴＡと、２ ＭのＮａＣｌとを含有し、ｐＨが７．５である））に溶解して電極の表面に滴下し、３７℃で、５５０ ｒｐｍで、５０分間インキュベートした。きれいに洗い流した後にさらに電極の表面に１０μＬの１ ｍＭのＭＣＨを滴下し、３７℃で、５００ ｒｐｍで、３０分間インキュベートし、きれいに洗い流した後にさらに電極の表面に１０μＬの２％ＢＳＡを滴下し、３０ ｍｉｎインキュベートし、洗浄した後にＥＣＬセンサを得た。
【0119】
（３）標的核酸の検出
本実施例においてメチル化されたＰＣＤＨＧＢ７遺伝子を標的核酸配列とする。なお、本実施例で使用されているＤＮＡ配列はいずれも上海Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成・精製された。使用する配列を具体的に表１に示す。
本実施例においてメチル化されたＰＣＤＨＧＢ７遺伝子を標的核酸配列とする。なお、本実施例で使用されているＤＮＡ配列はいずれも上海Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成・精製された。使用する配列を具体的に表１に示す。
【0120】
【表1】
【0121】
表１において、Ｃ（Ｍ）は５－メチルシトシン（５－ｍＣ）を示し、ＳＨ－ＤＮＡは検出対象となる標的核酸ＰＣＤＨＧＢ７遺伝子（Ｔ）の３´末端配列と２８個の相補的な塩基を有する。
【0122】
以下のように標的核酸の検出を行う。つまり、１０μＬの標的核酸溶液（１０ ｍＭ ＰＢＳ中に調製された）を上記製造されたＥＣＬセンサに滴下し、３０分間インキュベートし（３７℃、５００ ｒｐｍ）、洗浄した後に１０μＬの３μｇ／ｍＬのＡｂ－５ｍＣを滴下し、４０分間インキュベートし、次にセンシング電極の表面を洗い流しかつ１０μＬの８μｇ／ｍＬ Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を滴下して、３０分間インキュベートする。センシング電極は洗浄された後にＡｇ／ＡｇＣｌ及びＰｔワイヤ電極と三電極システムを構成して検出溶液（０．１Ｍ ＰＨ７．４ ＰＢＳ、１０ ｍＭ ＴＰｒＡを含む）でＥＣＬ応答を記録した。サイクリックボルタンメトリーを用いて０から＋１．２ Ｖまで走査し、走査速度が１００ ｍＶ／ｓであり、光電子増倍管（ＰＭＴ）の電圧が６００ Ｖに設定される。
【0123】
（実施例４：実施例３で得られたＥＣＬセンサの特徴づけ）
（１）センサ界面の特徴づけ
Ａ：ＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓの特徴づけ
実施例３で得られたＭｏＳｅ２及びＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＪＳＭ－７８００Ｆ、ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．、Ｊａｐａｎ）を用いて電子走査し、得られたＳＥＭ画像をそれぞれ図９Ａ及び図９Ｂに示す。図９Ａ及び図９Ｂには、それぞれＭｏＳｅ２及びＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓのＳＥＭ画像を示す。また、図９Ｃには、ＡｕＮＰｓのＤＬＳ粒径分布図を示す。図９Ａ～９Ｃは、実施例３で製造されたＥＣＬセンサの界面におけるナノ材料の特徴づけ結果を示す図である。
（１）センサ界面の特徴づけ
Ａ：ＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓの特徴づけ
実施例３で得られたＭｏＳｅ２及びＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＪＳＭ－７８００Ｆ、ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．、Ｊａｐａｎ）を用いて電子走査し、得られたＳＥＭ画像をそれぞれ図９Ａ及び図９Ｂに示す。図９Ａ及び図９Ｂには、それぞれＭｏＳｅ２及びＭｏＳｅ２／ＡｕＮＰｓのＳＥＭ画像を示す。また、図９Ｃには、ＡｕＮＰｓのＤＬＳ粒径分布図を示す。図９Ａ～９Ｃは、実施例３で製造されたＥＣＬセンサの界面におけるナノ材料の特徴づけ結果を示す図である。
【0124】
【0125】
９０ Ｐｌｕｓ／ＢＩ－ＭＡＳ機器（米国、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）法を用いてＡｕＮＰｓの粒径分布を測定し、その結果を図９Ｃに示す。
図９Ｃに示すように、ＡｕＮＰｓの粒径は３０ ｎｍ程度である。
図９Ｃに示すように、ＡｕＮＰｓの粒径は３０ ｎｍ程度である。
【0126】
（実施例５：ＥＣＬ強度に対するセンサ界面の構築条件の影響）
実施例３で得られたＥＣＬセンサを用いて、ＥＣＬ強度に対する異なる構築条件の影響を研究し、その結果を図１０Ａ～１０Ｂに示す。図１０Ａ～１０Ｂは、センサ界面の構築条件を最適化させた結果を示す図である。図１０ＡはＥＣＬ強度に対する異なるＭｏＳｅ２の剥離時間の影響を示す。図１０ＢはＥＣＬ強度に対するＭｏＳｅ２とＡｕＮＰｓの異なる混合比の影響を示す。
実施例３で得られたＥＣＬセンサを用いて、ＥＣＬ強度に対する異なる構築条件の影響を研究し、その結果を図１０Ａ～１０Ｂに示す。図１０Ａ～１０Ｂは、センサ界面の構築条件を最適化させた結果を示す図である。図１０ＡはＥＣＬ強度に対する異なるＭｏＳｅ２の剥離時間の影響を示す。図１０ＢはＥＣＬ強度に対するＭｏＳｅ２とＡｕＮＰｓの異なる混合比の影響を示す。
【0127】
（１）ＥＣＬ強度に対する異なるＭｏＳｅ２剥離時間の影響
３．５ ｍｇのＭｏＳｅ２を秤量して１ ｍＬの脱イオン水に入れて異なる時間で超音波剥離（３５ＨＺ）を行い、これらの異なる超音波剥離の時間で得られたＭｏＳｅ２溶液をそれぞれＧＣＥに滴下し、乾燥させた後にさらにＲｕ＠ＳｉＯ２を滴下し、乾燥させた後にさらに１０ ｍＭのＴＰｒＡのＰＢＳ ｐＨ７．４の検出溶液に置いてＥＣＬ測定を行い、その測定結果を図１０Ａに示す。
３．５ ｍｇのＭｏＳｅ２を秤量して１ ｍＬの脱イオン水に入れて異なる時間で超音波剥離（３５ＨＺ）を行い、これらの異なる超音波剥離の時間で得られたＭｏＳｅ２溶液をそれぞれＧＣＥに滴下し、乾燥させた後にさらにＲｕ＠ＳｉＯ２を滴下し、乾燥させた後にさらに１０ ｍＭのＴＰｒＡのＰＢＳ ｐＨ７．４の検出溶液に置いてＥＣＬ測定を行い、その測定結果を図１０Ａに示す。
【0128】
図１０Ａから分かるように、剥離時間が増加するにつれて、ＥＣＬ強度が増加し、１０時間の時に最大の安定値に達した。これは、ＭｏＳｅ２が１０時間剥離された後に安定した二次元シート層構造を得ることができることを示す。そのため、次にＭｏＳｅ２剥離時間を１０時間とする。
【0129】
（２）ＥＣＬ強度に対するＭｏＳｅ２とＡｕＮＰｓとの異なる混合比率の影響
０．５ ｍｇ／ｍＬのＡｕＮＰｓと１ ｍＬの３．５ ｍｇ／ｍＬのＭｏＳｅ２を異なる体積で混合した後に電極を修飾し、乾燥した後にさらにＲｕ＠ＳｉＯ２を滴下し、ＥＣＬ検出を行い、その検出結果を図１０Ｂに示す。
０．５ ｍｇ／ｍＬのＡｕＮＰｓと１ ｍＬの３．５ ｍｇ／ｍＬのＭｏＳｅ２を異なる体積で混合した後に電極を修飾し、乾燥した後にさらにＲｕ＠ＳｉＯ２を滴下し、ＥＣＬ検出を行い、その検出結果を図１０Ｂに示す。
【0130】
図１０Ｂに示すように、６ ｍＬのＡｕＮＰｓは１ ｍＬのＭｏＳｅ２と混合した後に修飾された電極では最も高いＥＣＬ応答を示す。そのため、体積比で１：６のＭｏＳｅ２：ＡｕＮＰｓを選択してセンサ界面を製造する。
【0131】
（実施例６：ＥＣＬ界面増強のメカニズムの予備研究）
本実施例において、本実施形態のＥＣＬ界面増強のメカニズムを研究した。その結果を図１１Ａ～１１Ｄに示す。図１１Ａ～１１Ｄは、異なる修飾電極における電気化学サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）及びＥＣＬ測定結果を示す図である。図１１Ａは０．１Ｍ ＰＢＳでの測定結果である。図１１Ａにおいて、ａはＲｕ＠ＳｉＯ２／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｂはＲｕ＠ＳｉＯ２／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥを示し、ｃはＲｕ＠ＳｉＯ２／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し，ｄはＲｕ＠ＳｉＯ２／ＧＣＥを示し、ｅはＧＣＥを示す。図１１Ｂは１０ｍＭ ＴＰｒＡを含む０．１Ｍ ＰＢＳでの測定結果である。図１１Ｃ及び図１１Ｄはそれぞれ異なる修飾電極のＲｕ＠ＳｉＯ２／ＴＰｒＡ体系でのＣＶ及びＥＣＬ強度を示す。図１１Ｃ及び図１１Ｄにおいて、ａはＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｂはＡｕＮＰｓ／ＧＣＥを示し、ｃはＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｄはＧＣＥを示す。
本実施例において、本実施形態のＥＣＬ界面増強のメカニズムを研究した。その結果を図１１Ａ～１１Ｄに示す。図１１Ａ～１１Ｄは、異なる修飾電極における電気化学サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）及びＥＣＬ測定結果を示す図である。図１１Ａは０．１Ｍ ＰＢＳでの測定結果である。図１１Ａにおいて、ａはＲｕ＠ＳｉＯ２／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｂはＲｕ＠ＳｉＯ２／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥを示し、ｃはＲｕ＠ＳｉＯ２／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し，ｄはＲｕ＠ＳｉＯ２／ＧＣＥを示し、ｅはＧＣＥを示す。図１１Ｂは１０ｍＭ ＴＰｒＡを含む０．１Ｍ ＰＢＳでの測定結果である。図１１Ｃ及び図１１Ｄはそれぞれ異なる修飾電極のＲｕ＠ＳｉＯ２／ＴＰｒＡ体系でのＣＶ及びＥＣＬ強度を示す。図１１Ｃ及び図１１Ｄにおいて、ａはＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｂはＡｕＮＰｓ／ＧＣＥを示し、ｃはＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｄはＧＣＥを示す。
【0132】
ベアＧＣＥ、Ｒｕ＠ＳｉＯ２を滴下したＧＣＥ（Ｒｕ＠ＳｉＯ２／ＧＣＥ）、Ｒｕ＠ＳｉＯ２を滴下したＭｏＳｅ２修飾ＧＣＥ（Ｒｕ＠ＳｉＯ２／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥ）、Ｒｕ＠ＳｉＯ２を滴下したＡｕＮＰｓ修飾ＧＣＥ（Ｒｕ＠ＳｉＯ２／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥ）、Ｒｕ＠ＳｉＯ２を滴下したＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２修飾ＧＣＥ（Ｒｕ＠ＳｉＯ２／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥ）を０．１Ｍ ｐＨ７．４ ＰＢＳで、電気化学サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）実験を行い、その実験結果を図１１Ａに示す。
【0133】
図１１Ａに示すように、Ｒｕ＠ＳｉＯ２を滴下した異なる電極は、電位１．１ ＶにいずれもＲｕ（ｂｐｙ）３
３＋の酸化ピークが現れ、ＭｏＳｅ２又はＡｕＮＰｓ単独での修飾はいずれもＲｕ（ｂｐｙ）３
３＋の酸化ピークを増加させることができるが、ＭｏＳｅ２とＡｕＮＰｓとの共修飾はＲｕ（ｂｐｙ）３
３＋の酸化を相乗的に促進し、より高い酸化電流を示すことができる。
【0134】
また、上記ベアＧＣＥ、ＭｏＳｅ２修飾ＧＣＥ（ＭｏＳｅ２／ＧＣＥ）、ＡｕＮＰｓ修飾ＧＣＥ（Ａｕ ＮＰｓ／ＧＣＥ）、ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２修飾ＧＣＥ（Ａｕ ＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥ）のＴＰｒＡに対する応答状況をさらに考察し、その結果を図１１Ｂに示す。
【0135】
図１１Ｂからも分かるように、ＭｏＳｅ２とＡｕＮＰｓの共修飾はＴＰｒＡの酸化を相乗的に促進することができる。したがって、Ｒｕ＠ＳｉＯ２／ＴＰｒＡ系において、ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥも同様に最も高い酸化電流（図１１Ｃ）と最大のＥＣＬ応答（図１１Ｄ）を示す。
【0136】
以上の結果から分かるように、ＡｕＮＰｓとＭｏＳｅ２で界面を共修飾することはＲｕ＠ＳｉＯ２／ＴＰｒＡ系に対してＥＣＬ信号増強作用を明らかに有する。言い換えると、ＥＣＬベース電極は、電気触媒溶液と金属ナノ粒子で共修飾された界面を有する。
【0137】
（実施例７：本実施形態のＥＣＬ検出）
本実施例では、実施例３で得られたＥＣＬセンサを用いてＥＣＬ検出の研究を行う。
本実施例では、実施例３で得られたＥＣＬセンサを用いてＥＣＬ検出の研究を行う。
【0138】
（１）電気化学的特徴づけ
ベアＧＣＥから、ＧＣＥでの各ステップによる修飾及び反応に対して電気化学的インピーダンススペクトル（ＥＩＳ）を測定し、その結果を図１２に示す。図１２は、異なる修飾電極の５ｍＭ ［Ｆｅ（ＣＮ）６］３－／４－を含む０．１Ｍ ＫＣｌにおけるＥＩＳ特徴づけ結果を示す図である。図１２において、ａはベアＧＣＥを示し、ｂはＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｃはＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｄはＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｅはＭＣＨ／ＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｆはＢＳＡ／ＭＣＨ／ＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｇはＴ５ｍｃ／ＢＳＡ／ＭＣＨ／ＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｈはＡｂ－５ｍＣ／Ｔ５ｍｃ／ＢＳＡ／ＭＣＨ／ＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｉはＡｂ２・Ｒｕ＠ＳｉＯ２／Ａｂ－５ｍＣ／Ｔ５ｍｃ／ＢＳＡ／ＭＣＨ／ＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示す。ここで、電気化学インピーダンススペクトル（ＥＩＳ）の試験はＤＨ ７０００（中国、江蘇東華）で行った。
ベアＧＣＥから、ＧＣＥでの各ステップによる修飾及び反応に対して電気化学的インピーダンススペクトル（ＥＩＳ）を測定し、その結果を図１２に示す。図１２は、異なる修飾電極の５ｍＭ ［Ｆｅ（ＣＮ）６］３－／４－を含む０．１Ｍ ＫＣｌにおけるＥＩＳ特徴づけ結果を示す図である。図１２において、ａはベアＧＣＥを示し、ｂはＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｃはＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｄはＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｅはＭＣＨ／ＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｆはＢＳＡ／ＭＣＨ／ＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｇはＴ５ｍｃ／ＢＳＡ／ＭＣＨ／ＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｈはＡｂ－５ｍＣ／Ｔ５ｍｃ／ＢＳＡ／ＭＣＨ／ＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示し、ｉはＡｂ２・Ｒｕ＠ＳｉＯ２／Ａｂ－５ｍＣ／Ｔ５ｍｃ／ＢＳＡ／ＭＣＨ／ＳＨ－ＤＮＡ／ＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２／ＧＣＥを示す。ここで、電気化学インピーダンススペクトル（ＥＩＳ）の試験はＤＨ ７０００（中国、江蘇東華）で行った。
【0139】
図１２に示すように、ＧＣＥのＡｕＮＰｓ／ＭｏＳｅ２、ＳＨ－ＤＮＡ、ＭＣＨ、ＢＳＡ、Ｔ５ｍＣ、Ａｂ－５ｍｃ、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２による修飾につれて、インピーダンスが徐々に増加し、電極表面の各ステップでの反応が成功したことを示す。
【0140】
（２）検出条件の最適化
最適なＥＣＬ検出性能を得るために、異なる検出条件、例えばＥＣＬ検出溶液のｐＨ、捕捉核酸ＳＨ－ＤＮＡの濃度及びインキュベーション時間、標的核酸のインキュベーション時間、Ａｂ－５ｍｃ及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の濃度及びインキュベーション時間でのＥＣＬ応答状況を研究し、その結果を図１３Ａ～１３Ｈに示す。図１３Ａ～１３Ｈは、実施例３で製造されたセンサの異なるＥＣＬ検出条件でのＥＣＬ応答状況を示す図である。図１３Ａは異なるＳＨ－ＤＮＡ濃度とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｂは異なるＳＨ－ＤＮＡのインキュベーション時間とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｃは異なるｐＨの検出溶液とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｄは、異なるＴ５ｍｃのインキュベーション時間とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｅは異なるＡｂ－５ｍｃ濃度とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｆは異なるＡｂ－５ｍｃのインキュベーション時間とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｇは異なるＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２濃度とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｈは異なるＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のインキュベーション時間とＥＣＬ強度との関係を示す図である。最適条件の選択原則は、ＥＣＬ応答の最大値（又は最大値ランド期間）に対応する条件を最適条件とすることである。
最適なＥＣＬ検出性能を得るために、異なる検出条件、例えばＥＣＬ検出溶液のｐＨ、捕捉核酸ＳＨ－ＤＮＡの濃度及びインキュベーション時間、標的核酸のインキュベーション時間、Ａｂ－５ｍｃ及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の濃度及びインキュベーション時間でのＥＣＬ応答状況を研究し、その結果を図１３Ａ～１３Ｈに示す。図１３Ａ～１３Ｈは、実施例３で製造されたセンサの異なるＥＣＬ検出条件でのＥＣＬ応答状況を示す図である。図１３Ａは異なるＳＨ－ＤＮＡ濃度とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｂは異なるＳＨ－ＤＮＡのインキュベーション時間とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｃは異なるｐＨの検出溶液とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｄは、異なるＴ５ｍｃのインキュベーション時間とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｅは異なるＡｂ－５ｍｃ濃度とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｆは異なるＡｂ－５ｍｃのインキュベーション時間とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｇは異なるＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２濃度とＥＣＬ強度との関係を示す図である。図１３Ｈは異なるＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のインキュベーション時間とＥＣＬ強度との関係を示す図である。最適条件の選択原則は、ＥＣＬ応答の最大値（又は最大値ランド期間）に対応する条件を最適条件とすることである。
【0141】
図１３Ａに示すように、ＳＨ－ＤＮＡ濃度は１ ｎＭ～４００ ｎＭの間にある場合にいずれも良好なＥＣＬ強度を得ることができ、最大ＥＣＬという選択原則に基づいて、ＳＨ－ＤＮＡ濃度は好ましくは３０ ｎＭである。
【0142】
図１３Ｂに示すように、ＳＨ－ＤＮＡのインキュベーション時間は１０ ｍｉｎ以上である場合にいずれも良好なＥＣＬ強度を得ることができ、最大ＥＣＬという選択原則に基づいて、ＳＨ－ＤＮＡのインキュベーション時間は好ましくは５０ ｍｉｎである。
【0143】
図１３Ｃに示すように、ＥＣＬ検出溶液のｐＨが６．０～８．５である場合にいずれも良好なＥＣＬ強度を得ることができ、最大ＥＣＬという選択原則に基づいて、ＥＣＬ検出溶液のｐＨが好ましくは７．５である。
【0144】
図１３Ｄに示すように、Ｔ５ｍＣのインキュベーション時間が１０ ｍｉｎ以上である場合にいずれも良好なＥＣＬ強度を得ることができ、最大ＥＣＬという選択原則に基づいて、Ｔ５ｍＣのインキュベーション時間は好ましくは３０ ｍｉｎである。
【0145】
図１３Ｅに示すように、Ａｂ－５ｍｃの濃度が１μｇ／ｍＬ以上である場合にいずれも良好なＥＣＬ強度が得られ、最大ＥＣＬという選択原則に基づいて、Ａｂ－５ ｍｃの濃度は好ましくは３μｇ／ｍＬである。
【0146】
図１３Ｆに示すように、Ａｂ－５ｍｃのインキュベーション時間は１０ ｍｉｎ以上である場合にいずれも良好なＥＣＬ強度を得ることができ、最大ＥＣＬという選択原則に基づいて、Ａｂ－５ｍｃのインキュベーション時間は好ましくは４０ ｍｉｎである。
【0147】
図１３Ｇに示すように、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の濃度が２μｇ／ｍＬ以上である場合にいずれも良好なＥＣＬ強度が得られ、最大ＥＣＬという選択原則に基づいて、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の濃度は好ましくは８μｇ／ｍＬである。
【0148】
図１３Ｈに示すように、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のインキュベーション時間が１０ ｍｉｎ以上である場合にいずれも良好なＥＣＬ強度を得ることができ、最大ＥＣＬという選択原則に基づいて、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のインキュベーション時間は好ましくは３０ ｍｉｎである。
【0149】
（３）検出性能の検討
以下のように線形及び感度を検出する研究を行う。つまり、上記好ましい条件で、構築されたＥＣＬセンサを用いてメチル化ＤＮＡ（メチル化されたＰＣＤＨＧＢ７遺伝子、Ｔ５ｍｃ）を検出し、その結果を図１４Ａ～１４Ｂに示す。図１４Ａ～１４Ｂは、最適条件で標的核酸をＥＣＬ検出した結果を示す図である。図１４Ａには異なる濃度Ｔ５ｍｃに対するＥＣＬ応答曲線を示す。図１４Ａにおいて、各線ａ～ｉの濃度はそれぞれ０、１ ｆＭ、１０ ｆＭ、１００ ｆＭ、１ ｐＭ、１０ ｐＭ、１００ ｐＭ、１ ｎＭ、１０ ｎＭである。図１４ＢにはＥＣＬ強度とｌｇＣＴとの１ ｆＭ～１０ ｎＭの濃度範囲内の線形関係を示す。
以下のように線形及び感度を検出する研究を行う。つまり、上記好ましい条件で、構築されたＥＣＬセンサを用いてメチル化ＤＮＡ（メチル化されたＰＣＤＨＧＢ７遺伝子、Ｔ５ｍｃ）を検出し、その結果を図１４Ａ～１４Ｂに示す。図１４Ａ～１４Ｂは、最適条件で標的核酸をＥＣＬ検出した結果を示す図である。図１４Ａには異なる濃度Ｔ５ｍｃに対するＥＣＬ応答曲線を示す。図１４Ａにおいて、各線ａ～ｉの濃度はそれぞれ０、１ ｆＭ、１０ ｆＭ、１００ ｆＭ、１ ｐＭ、１０ ｐＭ、１００ ｐＭ、１ ｎＭ、１０ ｎＭである。図１４ＢにはＥＣＬ強度とｌｇＣＴとの１ ｆＭ～１０ ｎＭの濃度範囲内の線形関係を示す。
【0150】
図１４Ａに示すように、異なる濃度のＴ５ｍｃの条件下でＥＣＬ検出を行う場合、ＥＣＬの強度（Ｉ）がＴ５ｍｃ濃度の増加につれて増加することが分かる。
【0151】
図１４ＢにＥＣＬ強度（Ｉ）とＴ５ｍｃ濃度の対数関係を示し、Ｉとｌｇ ＣＴが１ ｆＭ～１０ ｎＭの範囲内で良好な線形関係を呈し、相関係数が０．９９に達することが分かる。
【0152】
（４）検出の選択性テスト
本実施形態のＥＣＬ検出方法を採用して異なるサンプル溶液、純粋なバックグラウンド溶液（Ｂｌａｎｋ）、メチル化無しのＰＣＤＨＧＢ７配列（Ｔ０）を含む溶液、メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ配列（ＴＲ）を含む溶液及びメチル化ＰＣＤＨＧＢ７配列（Ｔ５ｍＣ）を含む溶液をテストした。ここで、Ｔ０、ＴＲ及びＴ５ｍＣの濃度がいずれも１ ｐＭであり、その結果を図１５に示す。図１５は、本実施形態のＥＣＬ検出方法により異なる試料溶液をＥＣＬ検出した結果を示す図である。図１５において、「Ｂｌａｎｋ」は純粋なバックグラウンド溶液の結果を示し、「Ｔ０」はメチル化無しのＰＣＤＨＧＢ７配列を含む溶液の結果を示し、「ＴＲ」はメチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ配列を含む溶液の結果を示し、「Ｔ５ｍＣ」はメチル化ＰＣＤＨＧＢ７配列を含む溶液の結果を示す。
本実施形態のＥＣＬ検出方法を採用して異なるサンプル溶液、純粋なバックグラウンド溶液（Ｂｌａｎｋ）、メチル化無しのＰＣＤＨＧＢ７配列（Ｔ０）を含む溶液、メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ配列（ＴＲ）を含む溶液及びメチル化ＰＣＤＨＧＢ７配列（Ｔ５ｍＣ）を含む溶液をテストした。ここで、Ｔ０、ＴＲ及びＴ５ｍＣの濃度がいずれも１ ｐＭであり、その結果を図１５に示す。図１５は、本実施形態のＥＣＬ検出方法により異なる試料溶液をＥＣＬ検出した結果を示す図である。図１５において、「Ｂｌａｎｋ」は純粋なバックグラウンド溶液の結果を示し、「Ｔ０」はメチル化無しのＰＣＤＨＧＢ７配列を含む溶液の結果を示し、「ＴＲ」はメチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ配列を含む溶液の結果を示し、「Ｔ５ｍＣ」はメチル化ＰＣＤＨＧＢ７配列を含む溶液の結果を示す。
【0153】
図１５に示すように、Ｔ５ｍＣを含有するサンプル溶液のみでは明らかなＥＣＬ信号を有し、Ｔ０及びＴＲを含有する溶液では純粋なバックグラウンド溶液と類似するバックグラウンドＥＣＬを示す。これは、本検出方法がメチル化されたＰＣＤＨＧＢ７配列に対する検出が良好な選択性を有することを示す。
【0154】
（５）検出の安定性テスト
本実施形態の検出方法の安定性を評価するために、１０ ｐＭの標的核酸に対して、異なるバッチで製造された複数本のセンサを利用して検出を行った。ここで、各バッチで４本のセンサ（ｎ＝４）を製造し、その検出結果を図１６に示す。図１６は、異なるバッチで製造されたセンサにより１０ｐＭの標的核酸を繰り返し検出した結果を示す図である。図１６において、１～４はそれぞれ４個のバッチを示す。
本実施形態の検出方法の安定性を評価するために、１０ ｐＭの標的核酸に対して、異なるバッチで製造された複数本のセンサを利用して検出を行った。ここで、各バッチで４本のセンサ（ｎ＝４）を製造し、その検出結果を図１６に示す。図１６は、異なるバッチで製造されたセンサにより１０ｐＭの標的核酸を繰り返し検出した結果を示す図である。図１６において、１～４はそれぞれ４個のバッチを示す。
【0155】
図１６に示すように、ＥＣＬ強度の標準偏差（ＲＳＤ）が５％以内であるは、高い検出の安定性を有することを示す。
【0156】
以上、実施形態に基づいてＥＣＬベース電極、センサ及びそれらの製造方法、及び界面増強及びナノプローブに基づく核酸特異的サイト修飾の電気化学発光（ＥＣＬ）検出方法等を説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限り、実施の形態に当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態や、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される他の形態も、本発明の範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【図13G】
【図13H】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16】
【配列表】