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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024019894
(43)【公開日】2024-02-14
(54)【発明の名称】ガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240206BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240206BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240206BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240206BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240206BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240206BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240206BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240206BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20240206BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P1/00 ZNA
A61P35/00
A61K31/713
A61K48/00
C12N15/09 Z
C12N15/12
C12N15/113 Z
C07K14/47
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022122649
(22)【出願日】2022-08-01
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000173924
【氏名又は名称】公益財団法人野口研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100194973
【弁理士】
【氏名又は名称】尾崎 祐朗
(72)【発明者】
【氏名】井手尾 浩子
(72)【発明者】
【氏名】土肥 明子
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼田 美生
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZB261
4C084ZB262
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA66
4C086ZB26
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA41
4H045DA80
4H045EA28
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、胃がんに有効な治療薬を提供することである。
【解決手段】前記課題は、本発明のガレクチン－４阻害剤を有効成分として含む、ガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物によって解決することができる。
【選択図】なし
【解決手段】前記課題は、本発明のガレクチン－４阻害剤を有効成分として含む、ガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物によって解決することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ガレクチン－４阻害剤を有効成分として含む、ガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物。
【請求項2】
前記ガレクチン－４阻害剤が、遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸である、請求項１に記載の胃がん治療用医薬組成物。
【請求項3】
前記胃がんが、腹膜播種能を有する胃がんである、請求項１又は２に記載の胃がん治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
日本において、胃がんは年間罹患数が約１３万人、そして年間死亡者数が約５万人であり、癌の中で第３位と頻度が高い。特に、転移や再発をきたし切除することができない場合は、非常に予後が悪い癌である。胃がんの予後に大きく関わる転移として、腹膜播種、リンパ節転移、血行性転移という３つの経路が存在する。現在、転移を有する胃がんは癌診療ガイドライン上でも「ステージＩＶ胃がん」として扱われている。例えば腹膜播種を起こす胃がんにおいて、ガレクチン－４との関連が報告されている（非特許文献１～３）。しかしながら、それぞれの転移経路に特異的な診断マーカーや分子標的治療薬は存在しない。従って、化学療法と外科的な癌組織切除とを組み合わせた治療が行われている。転移が無い限局性の癌では５年生存率が９５％あるが、活発に転移し全身に拡散する遠隔転移性の胃がんでは５年生存率は３％と言われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【非特許文献1】「キャンサー・リサーチ（Cancer research）」（米国）２００１年、第６１巻、ｐ．８８９－８９５
【非特許文献2】町田尚子「胃癌腹膜播種関連遺伝子galectin-４に関する機能解析」博士論文（授与年月日：平成１５年３月２８日、東京大学）国立国会図書館オンライン
【非特許文献3】浅野秀斗「スキルス胃癌の腹膜転移においてGalectin 4が果たす役割の解明」第１３９回薬学会年会、２０１９年、２２ＰＯ－ａｍ３６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、胃がんに有効な治療薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、胃がんに有効な治療薬について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ガレクチン－４の阻害剤によって、胃がんを効率的に治療できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ガレクチン－４阻害剤を有効成分として含む、ガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物、
［２］前記ガレクチン－４阻害剤が、遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸である、［１］に記載の胃がん治療用医薬組成物、及び
［３］前記胃がんが、腹膜播種能を有する胃がんである、［１］又は［２］に記載の胃がん治療用医薬組成物、
に関する。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ガレクチン－４阻害剤を有効成分として含む、ガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物、
［２］前記ガレクチン－４阻害剤が、遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸である、［１］に記載の胃がん治療用医薬組成物、及び
［３］前記胃がんが、腹膜播種能を有する胃がんである、［１］又は［２］に記載の胃がん治療用医薬組成物、
に関する。
【発明の効果】
【0006】
本発明の医薬組成物によれば、ガレクチン－４陽性胃がんを効率的に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】ノックアウト細胞株、ＫＯ－１ａ、ＫＯ－１ｂ、及びＫＯ－２におけるガレクチン－４遺伝子の欠失領域を示した図（ａ）である。ノックアウト細胞株の各クローンにおいてガレクチン－４タンパク質の発現の欠失をウェスタンブロット法によって示した図（ｂ）である。
【図2】ノックアウト細胞株（ＫＯ－２株）及び親株（Ｗｉｌｄ）の増殖カーブを示したグラフである。
【図3】ノックアウト細胞株の接着非依存性増殖能をＧＩＬＡアッセイで測定し、超低吸着プレートで培養した細胞のＡＴＰ量（Ｌｏｗ）を、細胞培養用プレートで培養した細胞のＡＴＰ量（Ｈｉｇｈ）で割って、比を示した図である。
【図4】免疫不全マウスに、ＮＵＧＣ４細胞の親株、対照株Ｃ１、ノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－２を腹腔内に移植して３９日後の腫瘍重量（ａ）、及び親株ならびにノックアウト株ＫＯ－２の腸間膜の写真（ｂ）である。
【図5】親株、ノックアウト細胞株（ＫＯ－１ａ、ＫＯ－１ｂ、及びＫＯ－２）、再発現株Ｒ３におけるｃＭＥＴの発現をウェスタンブロット法で調べ、β－アクチンで補正したグラフである。
【図6】ＨＧＦの存在有無の条件で、親株、ノックアウト細胞株（ＫＯ－１ａ、及びＫＯ－２）、再発現株Ｒ３でのｐＭＥＴの発現をウェスタンブロット法で調べ、ガレクチン－４の染色と共に示した図である。
【図7】親株、ノックアウト細胞株（ＫＯ－１ａ、及びＫＯ－２）、再発現株Ｒ３でのＣＤ４４の発現をウェスタンブロット法で調べた結果である。
【図8】ＮＵＧＣ４細胞の親株及びノックアウト株ＫＯ－２に対し、ガレクチン－４とｐＭＥＴのＰＬＡを行った図である。
【図9】ＭＫＮ４５細胞でＮＧＩ－１の添加の有無でガレクチン－４とｐＭＥＴのＰＬＡを行った図と、ガレクチン－４とＣＤ４４のＰＬＡを行った図である。
【図10】ＭＫＮ４５細胞及びＮＵＧＣ４細胞に抗ガレクチン－４抗体ＨＲＰを用いてＳＰＰＬＡＴ法による標識を行い、ビオチン標識物及びｐＭＥＴ、ＣＤ４４の検出を行った図である。
【図11】ｓｉＲＮＡによるガレクチン－４のノックダウンを行ったＭＫＮ４５細胞及びＮＵＧＣ４細胞に対して、ウェスタンブロット法でガレクチン－４、ｃＭＥＴ、ｐＭＥＴの検出を行った図である。
【図12】ｓｉＲＮＡによるガレクチン－４のノックダウンを行ったＭＫＮ４５細胞及びＮＵＧＣ４細胞の増殖能を調べたグラフである。
【図13】ｓｉＲＮＡによるガレクチン－４のノックダウンを行ったＭＫＮ４５細胞に対して、ガレクチン－４とｐＭＥＴのＰＬＡを行った図である。
【図14】免疫不全マウスにＭＫＮ４５細胞を腹腔内に投与した後ｓｉＲＮＡを投与して、２８日後に剖検し測定した腫瘍重量のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0008】
《医薬組成物》
本発明のガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物は、ガレクチン－４阻害剤を有効成分として含む。ガレクチン－４阻害剤としては、特に限定されるものではないが、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分が挙げられる。
本発明のガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物は、ガレクチン－４阻害剤を有効成分として含む。ガレクチン－４阻害剤としては、特に限定されるものではないが、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分が挙げられる。
【0009】
（ガレクチン－４）
ガレクチンは、β－ガラクトシドを認識するレクチンであり、１５種類のガレクチンファミリーが知られている。ガレクチン－４は、２つの糖結合領域を有するタンデムリピート型のガレクチンである。ガレクチン－４は、小腸及び大腸で強く発現していることが報告されているが、大腸がんにおいて、ガレクチン－４の発現が低下することが報告されている。
ガレクチンは、β－ガラクトシドを認識するレクチンであり、１５種類のガレクチンファミリーが知られている。ガレクチン－４は、２つの糖結合領域を有するタンデムリピート型のガレクチンである。ガレクチン－４は、小腸及び大腸で強く発現していることが報告されているが、大腸がんにおいて、ガレクチン－４の発現が低下することが報告されている。
【0010】
本発明の医薬組成物の対象となる胃がんは、ガレクチン－４陽性の胃がんである。ガレクチン－４が陽性であることによって、ガレクチン－４阻害剤によって、癌細胞の増殖を抑制することができる。ガレクチン－４陽性の胃がん細胞は、胃に限局した胃がん細胞、リンパ節転移を示す胃がん細胞、又は血行性転移を示す胃がん細胞、が挙げられる。限定されるものではないが、ガレクチン－４陽性の胃がんとしては、腹膜播種能を有する胃がんが多い。
【0011】
（ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分）
ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分としては、例えばガレクチン－４タンパク質と結合して、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分が挙げられる。このような成分としては、限定されるものではないが、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸が挙げられる。
ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分としては、例えばガレクチン－４タンパク質と結合して、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分が挙げられる。このような成分としては、限定されるものではないが、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸が挙げられる。
【0012】
（ガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分）
ガレクチン－４遺伝子（配列番号１）の機能を抑制する成分としては、限定されるものではないが、ガレクチン－４遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する阻害性核酸としてｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ－ＲＮＡ、および人工ｍｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡが挙げられる。
前記二本鎖核酸は、ガレクチン－４遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸であり、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖核酸領域を含む核酸分子を意味し、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）であることが好ましい。
ガレクチン－４遺伝子（配列番号１）の機能を抑制する成分としては、限定されるものではないが、ガレクチン－４遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する阻害性核酸としてｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ－ＲＮＡ、および人工ｍｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡが挙げられる。
前記二本鎖核酸は、ガレクチン－４遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸であり、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖核酸領域を含む核酸分子を意味し、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）であることが好ましい。
【0013】
（センス鎖及びアンチセンス鎖）
前記二本鎖核酸は、２３塩基からなる配列番号１のいずれかの標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含む。
ここで、「標的配列に対応する塩基配列」とは、標的配列と同一の塩基配列であるか、あるいは、前記標的配列において１若しくは数個（例えば、２～３個）の塩基が置換された塩基配列を意味する。二本鎖核酸がｓｉＲＮＡである場合、１～数塩基のミスマッチを含んでいても、ＲＮＡｉ効果が得られることが知られている。本発明では、標的配列と同一の塩基配列だけでなく、ＲＮＡｉ効果が得られる限り、ミスマッチを含む塩基配列であってもよい。
前記二本鎖核酸は、２３塩基からなる配列番号１のいずれかの標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含む。
ここで、「標的配列に対応する塩基配列」とは、標的配列と同一の塩基配列であるか、あるいは、前記標的配列において１若しくは数個（例えば、２～３個）の塩基が置換された塩基配列を意味する。二本鎖核酸がｓｉＲＮＡである場合、１～数塩基のミスマッチを含んでいても、ＲＮＡｉ効果が得られることが知られている。本発明では、標的配列と同一の塩基配列だけでなく、ＲＮＡｉ効果が得られる限り、ミスマッチを含む塩基配列であってもよい。
【0014】
また、アンチセンス鎖における「センス鎖に相補的な塩基配列」とは、センス鎖とハイブリダイズすることができる程度に相補的な塩基配列であればよく、センス鎖に完全に相補的な塩基配列であるか、あるいは、前記センス鎖に完全に相補的な塩基配列において１若しくは数個（例えば、２～３個）の塩基が置換された塩基配列であることができる。
【0015】
（核酸の種類と修飾）
二本鎖核酸を構成する核酸の種類は、特に限定されるものではなく、適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ型二本鎖核酸を挙げることができる。キメラ型はＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡの一部をＤＮＡに換えたものであり、血清中での安定性が高く、免疫応答誘導性が低いことが知られている。
また、二本鎖核酸は、例えば、２’－ＯＨ基の修飾、バックボーンのホスホロチオエートによる置換やボラノホスフェート基による修飾、リボースの２位と４位が架橋されたＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の導入などによって、ヌクレアーゼに対する耐性や安定化を高めることもできる。あるいは、細胞への導入効率を高める等の目的から、二本鎖核酸のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、例えば、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。
二本鎖核酸を構成する核酸の種類は、特に限定されるものではなく、適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ型二本鎖核酸を挙げることができる。キメラ型はＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡの一部をＤＮＡに換えたものであり、血清中での安定性が高く、免疫応答誘導性が低いことが知られている。
また、二本鎖核酸は、例えば、２’－ＯＨ基の修飾、バックボーンのホスホロチオエートによる置換やボラノホスフェート基による修飾、リボースの２位と４位が架橋されたＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の導入などによって、ヌクレアーゼに対する耐性や安定化を高めることもできる。あるいは、細胞への導入効率を高める等の目的から、二本鎖核酸のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、例えば、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。
【0016】
（ｓｉＲＮＡ）
二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（キメラ型を含む）であることが好ましい。ここで、「ｓｉＲＮＡ」とは、１８塩基長～２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖）と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
前記ｓｉＲＮＡは、先述したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、かつ所望のＲＮＡｉ効果を示すものであれば、その末端構造に特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、前記ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。中でも、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端が２塩基～６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。
二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（キメラ型を含む）であることが好ましい。ここで、「ｓｉＲＮＡ」とは、１８塩基長～２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖）と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
前記ｓｉＲＮＡは、先述したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、かつ所望のＲＮＡｉ効果を示すものであれば、その末端構造に特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、前記ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。中でも、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端が２塩基～６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。
【0017】
本発明のｓｉＲＮＡとしては、例えば、配列番号１を標的配列とする配列番号３（5’-CCGGACAUUGCCAUCAACAGCUGAA-3’）のセンス鎖と配列番号４（5’-UUCAGCUGUUGAUGGCAAUGUCCGG-3’）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡを挙げることができる。
【0018】
（製造方法）
前記二本鎖ＲＮＡ（特にはｓｉＲＮＡ）は、従来公知の手法に基づき作製することができる。
例えば、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する１８塩基長～２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、それぞれ既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。
前記二本鎖ＲＮＡ（特にはｓｉＲＮＡ）は、従来公知の手法に基づき作製することができる。
例えば、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する１８塩基長～２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、それぞれ既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。
【0019】
（ＤＮＡ、発現ベクター）
ＤＮＡは、先述した、前記二本鎖核酸（特にはｓｉＲＮＡ）をコードする塩基配列を含むことを特徴とするＤＮＡであり、発現ベクターは、前記ＤＮＡを含むことを特徴とする発現ベクターである。
ＤＮＡは、先述した、前記二本鎖核酸（特にはｓｉＲＮＡ）をコードする塩基配列を含むことを特徴とするＤＮＡであり、発現ベクターは、前記ＤＮＡを含むことを特徴とする発現ベクターである。
【0020】
（ＤＮＡ）
前記ＤＮＡとしては、先述した、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列を含むＤＮＡであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列の上流（５’側）に、前記二本鎖核酸の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター等のｐｏｌ ＩＩ系プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター等のｐｏｌ ＩＩＩ系プロモーターなどが挙げられる。
前記ＤＮＡとしては、先述した、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列を含むＤＮＡであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列の上流（５’側）に、前記二本鎖核酸の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター等のｐｏｌ ＩＩ系プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター等のｐｏｌ ＩＩＩ系プロモーターなどが挙げられる。
【0021】
また、更に、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列の下流（３’側）に、前記二本鎖核酸の転写を終結させるためのターミネーター配列が連結されていることがより好ましい。前記ターミネーター配列としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0022】
前記プロモーター配列、前記二本鎖核酸をコードするヌクレオチド配列、及び前記ターミネーター配列を含む転写ユニットは、前記ＤＮＡにおける好ましい一態様である。なお、前記転写ユニットは、従来公知の手法を用いて構築することができる。
【0023】
（発現ベクター）
前記ベクターとしては、前記ＤＮＡを含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。前記ベクターは、前記二本鎖核酸（特にｓｉＲＮＡ）を発現可能な発現ベクターであることが好ましい。
前記二本鎖核酸の発現様式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば二本鎖核酸としてｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法（タンデム型）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）として一本鎖ＲＮＡを発現させる方法（ヘアピン型）等が挙げられる。ここで、ｓｈＲＮＡとは、１８塩基～２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３塩基～９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであるが、ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
前記ベクターとしては、前記ＤＮＡを含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。前記ベクターは、前記二本鎖核酸（特にｓｉＲＮＡ）を発現可能な発現ベクターであることが好ましい。
前記二本鎖核酸の発現様式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば二本鎖核酸としてｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法（タンデム型）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）として一本鎖ＲＮＡを発現させる方法（ヘアピン型）等が挙げられる。ここで、ｓｈＲＮＡとは、１８塩基～２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３塩基～９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであるが、ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
【0024】
前記タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを含み、かつ、各鎖をコードするＤＮＡ配列の上流（５’側）にプロモーター配列がそれぞれ連結され、また、各鎖をコードするＤＮＡ配列の下流（３’側）にターミネーター配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含む。
【0025】
また、前記ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とが逆向きに配置され、前記センス鎖ＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＤＮＡ配列とがループ配列を介して接続されており、かつ、それらの上流（５’側）にプロモーター配列が、また、下流（３’側）にターミネーター配列が連結されたＤＮＡを含む。
前記各ベクターは、従来公知の手法を用いて構築することができ、例えば、前記ＤＮＡを、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結（ライゲーション）することにより構築することができる。
前記各ベクターは、従来公知の手法を用いて構築することができ、例えば、前記ＤＮＡを、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結（ライゲーション）することにより構築することができる。
【0026】
前記ＤＮＡ又は前記ベクターを細胞に導入（トランスフェクト）することにより、プロモーターが活性化され、前記二本鎖核酸を生成することができる。例えば、前記タンデム型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、センス鎖及びアンチセンス鎖が生成され、それらがハイブリダイズすることによりｓｉＲＮＡが生成される。前記ヘアピン型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、まずヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が生成され、次いで、ダイサーによるプロセシングにより、ｓｉＲＮＡが生成される。
【0027】
（ｍｉＲＮＡ）
本発明の医薬組成物は、ｍｉＲＮＡを含むことができる。ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）は、２０～２５塩基長の１本鎖ＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡ）であり、遺伝子の転写後発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡの産生過程では、初めにＲＮＡポリメラーゼIIによる転写産物（Ｐｒｉｍａｒｙ－ｍｉＲＮＡ；Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）が生じ、次にＰｒｉ－ｍｉＲＮＡは切断されステムループ配列を有するｍｉＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を生じ、さらにＤｉｃｅｒで切断されることにより成熟ｍｉＲＮＡが生じる。このｍｉＲＮＡを補充する方法として、内在性ｍｉｃｒｏＲＮＡの機能を効果的に模倣し機能増加するようにデザインされた化学合成したｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃを使用する方法、ｍｉＲＮＡ発現プラスミドを使用する方法等を用いることができる。
本発明の医薬組成物は、ｍｉＲＮＡを含むことができる。ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）は、２０～２５塩基長の１本鎖ＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡ）であり、遺伝子の転写後発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡの産生過程では、初めにＲＮＡポリメラーゼIIによる転写産物（Ｐｒｉｍａｒｙ－ｍｉＲＮＡ；Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）が生じ、次にＰｒｉ－ｍｉＲＮＡは切断されステムループ配列を有するｍｉＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を生じ、さらにＤｉｃｅｒで切断されることにより成熟ｍｉＲＮＡが生じる。このｍｉＲＮＡを補充する方法として、内在性ｍｉｃｒｏＲＮＡの機能を効果的に模倣し機能増加するようにデザインされた化学合成したｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃを使用する方法、ｍｉＲＮＡ発現プラスミドを使用する方法等を用いることができる。
【0028】
（アンチセンスオリゴ）
本発明の医薬組成物は、アンチセンスオリゴを含むことができる。アンチセンスオリゴは標的と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡやＲＮＡで、タンパク質への発現を抑制するはたらきを持つ。核酸に様々な化学修飾を導入することで、安定性や機能などを追加することができる。その一つの例としてモルフォリノアンチセンスオリゴは、モルフォリノ環を有するオリゴＤＮＡであり、ＲＮＡに対する親和性が高く、そしてＤＮＡ分解酵素に対して抵抗性を有する。ガレクチン－４の５′非翻訳領域、またはエキソンとイントロンとの境界領域に相同性をもつように設計することによって、ガレクチン－４のｍＲＮＡからの翻訳やスプライシングを抑制することができる。
本発明の医薬組成物は、アンチセンスオリゴを含むことができる。アンチセンスオリゴは標的と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡやＲＮＡで、タンパク質への発現を抑制するはたらきを持つ。核酸に様々な化学修飾を導入することで、安定性や機能などを追加することができる。その一つの例としてモルフォリノアンチセンスオリゴは、モルフォリノ環を有するオリゴＤＮＡであり、ＲＮＡに対する親和性が高く、そしてＤＮＡ分解酵素に対して抵抗性を有する。ガレクチン－４の５′非翻訳領域、またはエキソンとイントロンとの境界領域に相同性をもつように設計することによって、ガレクチン－４のｍＲＮＡからの翻訳やスプライシングを抑制することができる。
【0029】
本発明のガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物は、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分（例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクター）を有効成分として含み、更に必要に応じてその他の成分を含むことができる。
【0030】
（剤形、投与方法）
前記医薬組成物の剤型としては、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
また、有効成分以外のその他の成分として、所望の医薬添加物、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を含むことができる。
前記医薬組成物の剤型としては、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
また、有効成分以外のその他の成分として、所望の医薬添加物、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を含むことができる。
【0031】
前記医薬組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬組成物の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与においては、前記医薬を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。前記注入には、注射等の従来公知の手法を適宜利用することができる。また、全身投与（例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等）においては、前記医薬の有効成分が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。
【0032】
前記医薬組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、例えば二本鎖核酸の量として、１ｍｇ～１００ｍｇが好ましい。
また、前記医薬組成物の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
また、前記医薬組成物の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
【0033】
《ガレクチン－４陽性胃がんの治療方法》
本発明は、ガレクチン－４陽性胃がんの治療の必要がある対象に、その有効量でガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分（例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクター）を投与することを含む、ガレクチン－４陽性胃がんの治療または予防方法を提供する。
本発明は、ガレクチン－４陽性胃がんの治療の必要がある対象に、その有効量でガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分（例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクター）を投与することを含む、ガレクチン－４陽性胃がんの治療または予防方法を提供する。
【0034】
《ガレクチン－４陽性胃がん用医薬組成物の製造への使用》
本発明は、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分（例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクター）の、ガレクチン－４陽性胃がんの治療用医薬組成物の製造に使用することができる。
本発明は、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分（例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクター）の、ガレクチン－４陽性胃がんの治療用医薬組成物の製造に使用することができる。
【0035】
《ガレクチン－４陽性胃がん治療用のガレクチン－４阻害剤》
本発明は、ガレクチン－４陽性胃がん治療用のガレクチン－４阻害剤に関する。ガレクチン－４阻害剤としては、前記の通りガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分（例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクター）が挙げられる。
本発明は、ガレクチン－４陽性胃がん治療用のガレクチン－４阻害剤に関する。ガレクチン－４阻害剤としては、前記の通りガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分（例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクター）が挙げられる。
【0036】
《作用》
本発明の医薬組成物が、ガレクチン－４陽性胃がんの治療、特に増殖を抑制できる理由は、詳細には検討されていない。しかしながら、以下のように推定することができる。但し、本発明は以下の推定によって、限定されるものではない。
ガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分は、ガレクチン－４のｍＲＮＡの発現を抑制することによって、癌細胞の増殖を抑制すると考えられる。ガレクチン－４陽性胃がん細胞の増殖には、ガレクチン－４の発現が関与していると考えられ、ガレクチン－４の発現をｍＲＮＡのレベルで抑制することによって、ガレクチン－４陽性胃がん細胞の増殖を抑制できると推定される。
一方、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分は、ガレクチン－４タンパク質に結合することによって、ガレクチン－４陽性胃がん細胞の増殖を抑制できると考えられる。ガレクチン－４は癌細胞の悪性度に関係する分子群（例えばｃＭＥＴ、ＣＤ４４等）に糖結合ドメインを通じて結合することによって、細胞表面への局在を安定化し、ガレクチン－４が－複合糖鎖（糖タンパク質または糖脂質）格子を形成し、格子内に存在する受容体の側方拡散を拘束することにより、受容体の凝集や情報伝達を起こす閾値を高めることが推定される。ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分は、ガレクチン－４に結合することでガレクチン－４によって発現や局在が制御されている分子への結合を阻害することができる。具体的には、ガレクチン－４の結合阻害によってｃＭＥＴの活性化を阻害する（すなわちｐＭＥＴの抑制）ことにより増殖を抑制していると考えられる。
本発明の医薬組成物が、ガレクチン－４陽性胃がんの治療、特に増殖を抑制できる理由は、詳細には検討されていない。しかしながら、以下のように推定することができる。但し、本発明は以下の推定によって、限定されるものではない。
ガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分は、ガレクチン－４のｍＲＮＡの発現を抑制することによって、癌細胞の増殖を抑制すると考えられる。ガレクチン－４陽性胃がん細胞の増殖には、ガレクチン－４の発現が関与していると考えられ、ガレクチン－４の発現をｍＲＮＡのレベルで抑制することによって、ガレクチン－４陽性胃がん細胞の増殖を抑制できると推定される。
一方、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分は、ガレクチン－４タンパク質に結合することによって、ガレクチン－４陽性胃がん細胞の増殖を抑制できると考えられる。ガレクチン－４は癌細胞の悪性度に関係する分子群（例えばｃＭＥＴ、ＣＤ４４等）に糖結合ドメインを通じて結合することによって、細胞表面への局在を安定化し、ガレクチン－４が－複合糖鎖（糖タンパク質または糖脂質）格子を形成し、格子内に存在する受容体の側方拡散を拘束することにより、受容体の凝集や情報伝達を起こす閾値を高めることが推定される。ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分は、ガレクチン－４に結合することでガレクチン－４によって発現や局在が制御されている分子への結合を阻害することができる。具体的には、ガレクチン－４の結合阻害によってｃＭＥＴの活性化を阻害する（すなわちｐＭＥＴの抑制）ことにより増殖を抑制していると考えられる。
【実施例0037】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0038】
《実施例１》
本実施例では、ガレクチン－４陽性胃がん細胞（ＮＵＧＣ４細胞）のガレクチン－４をノックアウトした細胞を取得した。
ガレクチン－４遺伝子のノックアウトは、ホライゾンディスカバリー社のＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｅｄｉｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集試薬システムによるゲノム編集ツールを利用して行った。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含んだＥｄｉｔ－Ｒ ｈＣＭＶ－ＰｕｒｏＲ－Ｃａｓ９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ、Ｅｄｉｔ－Ｒ Ｈｕｍａｎ ＬＧＡＬＳ４（３９６０） ｃｒＲＮＡ（ＣＭ－０１２２３２－０５）とＥｄｉｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｒａｃｒＲＮＡをＤｈａｒｍａＦＥＣＴ Ｄｕｏ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＮＵＧＣ４細胞に共導入した。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを培地に添加することによりノックアウト細胞を濃縮し、さらにコロニーをピックアップして、ガレクチン－４の発現細胞が混入していないクローンを蛍光免疫染色法で選別した。ガレクチン－４の発現が認められないノックアウト株クローン、ＫＯ－１ａ、ＫＯ－１ｂ、及びＫＯ－２を選択した。ノンコーディング遺伝子に対してデザインされたＥｄｉｔ－Ｒ ｃｒＲＮＡ Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＃１をガレクチン－４用にデザインされたｃｒＲＮＡの代わりに用いて同様の操作を行い、対照株Ｃ１を樹立した。
本実施例では、ガレクチン－４陽性胃がん細胞（ＮＵＧＣ４細胞）のガレクチン－４をノックアウトした細胞を取得した。
ガレクチン－４遺伝子のノックアウトは、ホライゾンディスカバリー社のＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｅｄｉｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集試薬システムによるゲノム編集ツールを利用して行った。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含んだＥｄｉｔ－Ｒ ｈＣＭＶ－ＰｕｒｏＲ－Ｃａｓ９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ、Ｅｄｉｔ－Ｒ Ｈｕｍａｎ ＬＧＡＬＳ４（３９６０） ｃｒＲＮＡ（ＣＭ－０１２２３２－０５）とＥｄｉｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｒａｃｒＲＮＡをＤｈａｒｍａＦＥＣＴ Ｄｕｏ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＮＵＧＣ４細胞に共導入した。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを培地に添加することによりノックアウト細胞を濃縮し、さらにコロニーをピックアップして、ガレクチン－４の発現細胞が混入していないクローンを蛍光免疫染色法で選別した。ガレクチン－４の発現が認められないノックアウト株クローン、ＫＯ－１ａ、ＫＯ－１ｂ、及びＫＯ－２を選択した。ノンコーディング遺伝子に対してデザインされたＥｄｉｔ－Ｒ ｃｒＲＮＡ Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＃１をガレクチン－４用にデザインされたｃｒＲＮＡの代わりに用いて同様の操作を行い、対照株Ｃ１を樹立した。
【0039】
ノックアウト細胞各クローンからＲＮＡを抽出し逆転写してｃＤＮＡを取得後、塩基配列を調べた結果を図１に示す。
ノックアウト細胞株ではターゲットとしたｃｒＲＮＡ部位近傍に塩基対の欠失が確認された。ノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－１ｂは同じ遺伝子配列を持ち、ノックアウト株ＫＯ－２の欠失範囲はＫＯ－１ａやＫＯ－１ｂよりも狭かった。
図１ａのように遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列の欠失はそれぞれ４５アミノ酸及び１２アミノ酸である。ウェスタンブロット法で、ガレクチン－４の発現を調べたところ、それぞれのクローンは、ガレクチン－４タンパク質の発現は認められなかった（図１ｂ）。
ノックアウト細胞株ではターゲットとしたｃｒＲＮＡ部位近傍に塩基対の欠失が確認された。ノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－１ｂは同じ遺伝子配列を持ち、ノックアウト株ＫＯ－２の欠失範囲はＫＯ－１ａやＫＯ－１ｂよりも狭かった。
図１ａのように遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列の欠失はそれぞれ４５アミノ酸及び１２アミノ酸である。ウェスタンブロット法で、ガレクチン－４の発現を調べたところ、それぞれのクローンは、ガレクチン－４タンパク質の発現は認められなかった（図１ｂ）。
【0040】
（ノックアウト細胞株の増殖能）
前記ノックアウト細胞株の増殖能を、細胞倍化時間によって測定した。
前記ノックアウト細胞株の増殖能を、細胞倍化時間によって測定した。
【0041】
【表1】
【0042】
表１に示すように、ノックアウト株の細胞倍化時間は親株、対照株に比べ長く、増殖能が低下していた。また、親株（Ｗｉｌｄ）とＫＯ－２株の増殖カーブを図２に示す。ＫＯ－２株の増殖カーブは、親株と比較して、有意に低下していた。図中の＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊は２つのグループの間で統計学的に著しく有意な差があることを示している。
【0043】
（ノックアウト細胞株の接着非依存性増殖能）
ノックアウト細胞株の接着非依存性増殖能をＧＩＬＡアッセイで測定した。接着非依存性増殖能とは細胞外基質に接着しなくても生存し増殖できる細胞の性質である。
ＧＩＬＡアッセイは、細胞培養用９６ウェルプレート（Ｎｏ．３７０４、コーニング社）及び超低吸着９６ウェルプレート（Ｎｏ．３４７４、コーニング社）に１０００個／ｗｅｌｌで細胞を播種し、５日間培養後、それぞれのプレートの生細胞に由来するＡＴＰ量を測定した。ＡＴＰ量は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０試薬（プロメガ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加後、反応液を９６ウェル白プレート（Ｎｏ．３３６２、コーニング社）に移し、発光量をＴｒｉｓｔａｒ２ ＬＢ９４２プレートリーダー（ベルトールド社）で測定した。超低吸着プレート上の細胞のＡＴＰ量と細胞培養用プレート上の細胞のＡＴＰ量の比をＬｏｗ／Ｈｉｇｈ比とした。
図３に示すように、対照株Ｃ１に比較して、ノックアウト細胞株ではＬｏｗ／Ｈｉｇｈ比が低下し、接着非依存性増殖能が低下していることが示された。
ノックアウト細胞株の接着非依存性増殖能をＧＩＬＡアッセイで測定した。接着非依存性増殖能とは細胞外基質に接着しなくても生存し増殖できる細胞の性質である。
ＧＩＬＡアッセイは、細胞培養用９６ウェルプレート（Ｎｏ．３７０４、コーニング社）及び超低吸着９６ウェルプレート（Ｎｏ．３４７４、コーニング社）に１０００個／ｗｅｌｌで細胞を播種し、５日間培養後、それぞれのプレートの生細胞に由来するＡＴＰ量を測定した。ＡＴＰ量は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０試薬（プロメガ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加後、反応液を９６ウェル白プレート（Ｎｏ．３３６２、コーニング社）に移し、発光量をＴｒｉｓｔａｒ２ ＬＢ９４２プレートリーダー（ベルトールド社）で測定した。超低吸着プレート上の細胞のＡＴＰ量と細胞培養用プレート上の細胞のＡＴＰ量の比をＬｏｗ／Ｈｉｇｈ比とした。
図３に示すように、対照株Ｃ１に比較して、ノックアウト細胞株ではＬｏｗ／Ｈｉｇｈ比が低下し、接着非依存性増殖能が低下していることが示された。
【0044】
（マウス腹膜播種モデルを用いた解析）
ノックアウト細胞株で腹膜播種を、マウスモデルを用いて解析した。免疫不全マウス（ＢＡＬＢｃ ｎｕ／ｎｕ、オス、６週齢）に、１×１０６個のヒト胃癌細胞株ＮＵＧＣ４細胞を腹腔内に移植し、３９日間飼育後開腹し腫瘍の数及び重量を計測した。
ＮＵＧＣ４細胞親株投与群は２匹、ＮＵＧＣ４対照株Ｃ１投与群は２匹、ノックアウト株ＫＯ－１ａ投与群は３匹、ノックアウト株ＫＯ－２投与群は３匹を使用し、各細胞を個体当たり１×１０６個／１００～２００μＬ ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍで腹腔内に移植した。３９日後に剖検を行った結果と、剖検時に腫瘍重量を測定した。
ノックアウト細胞株で腹膜播種を、マウスモデルを用いて解析した。免疫不全マウス（ＢＡＬＢｃ ｎｕ／ｎｕ、オス、６週齢）に、１×１０６個のヒト胃癌細胞株ＮＵＧＣ４細胞を腹腔内に移植し、３９日間飼育後開腹し腫瘍の数及び重量を計測した。
ＮＵＧＣ４細胞親株投与群は２匹、ＮＵＧＣ４対照株Ｃ１投与群は２匹、ノックアウト株ＫＯ－１ａ投与群は３匹、ノックアウト株ＫＯ－２投与群は３匹を使用し、各細胞を個体当たり１×１０６個／１００～２００μＬ ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍで腹腔内に移植した。３９日後に剖検を行った結果と、剖検時に腫瘍重量を測定した。
【0045】
【表2】
【0046】
表２及び図４に示すように、ＮＵＧＣ４胃癌細胞親株投与群及び対照株Ｃ１投与群はどちらも腹水の貯留が認められ、腹腔内に多数の腫瘍が観察されたが、ノックアウト株投与群のマウスにはどちらも腹腔内に腫瘍は認められなかった。図中の＊はｐ＜０．０５を示し、＊は２つのグループの間で腫瘍重量に統計学的に有意な差があることを示している。
【0047】
《実施例２》
本実施例では、ガレクチン－４の発現と相関する分子を探索した。具体的には、親株、ノックアウト細胞株（ＫＯ－１ａ株、ＫＯ－２株）、及び再発現株Ｒ３のｃＭＥＴの発現をウェスタンブロット法で調べた。再発原株Ｒ３は、ＫＯ－２株にＦＬＡＧガレクチン－４発現プラスミドを導入し、ガレクチン－４を再発現させた細胞株である。
図５に示すように、ｃＭＥＴの発現はノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－２両方で低下していた。一方、再発現株Ｒ３では、対照株及び親株とほぼ同じ程度まで回復しており、ガレクチン－４の発現がｃＭＥＴの発現に影響を与えている可能性が示唆された。
本実施例では、ガレクチン－４の発現と相関する分子を探索した。具体的には、親株、ノックアウト細胞株（ＫＯ－１ａ株、ＫＯ－２株）、及び再発現株Ｒ３のｃＭＥＴの発現をウェスタンブロット法で調べた。再発原株Ｒ３は、ＫＯ－２株にＦＬＡＧガレクチン－４発現プラスミドを導入し、ガレクチン－４を再発現させた細胞株である。
図５に示すように、ｃＭＥＴの発現はノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－２両方で低下していた。一方、再発現株Ｒ３では、対照株及び親株とほぼ同じ程度まで回復しており、ガレクチン－４の発現がｃＭＥＴの発現に影響を与えている可能性が示唆された。
【0048】
（ガレクチン－４の発現の変化とｐＭＥＴの発現）
ガレクチン－４の発現に相関してｃＭＥＴの発現が変化していることから、ｃＭＥＴと結合して活性化させる分子ＨＧＦの有無で、ｃＭＥＴの活性化体であるｐＭＥＴの発現を調べた。
前日に１２ウェルプレートに４×１０５個／ｗｅｌｌで撒いた各細胞（対照株Ｃ１、ノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－２）を、ＰＢＳ洗浄後０．１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、４時間後ＨＧＦを含まない培地（－）あるいは５０ｎｇ／ｍＬの濃度でＨＧＦを含む培地（＋）を添加して３０分反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファーを加えて回収した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに添加、泳動後ＰＶＤＦ膜に転写し、実施例２で使用したガレクチン－４抗体、ｃＭＥＴ抗体、β－アクチン抗体、ｐＭＥＴ抗体（Ｙ１２３４／１２３５）（Ｄ２６）ＸＰ（登録商標） Ｒａｂｂｉｔ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で染色を行った。結果を図６に示す。
ノックアウト細胞株は、両クローン共にＨＧＦの存在の有無に関わらず、親株や再発現株Ｒ３に比べてｐＭＥＴのレベルは極めて低かった。このことから、ガレクチン－４の発現がｃＭＥＴの活性化とも相関することが明らかになった。
ガレクチン－４の発現に相関してｃＭＥＴの発現が変化していることから、ｃＭＥＴと結合して活性化させる分子ＨＧＦの有無で、ｃＭＥＴの活性化体であるｐＭＥＴの発現を調べた。
前日に１２ウェルプレートに４×１０５個／ｗｅｌｌで撒いた各細胞（対照株Ｃ１、ノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－２）を、ＰＢＳ洗浄後０．１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、４時間後ＨＧＦを含まない培地（－）あるいは５０ｎｇ／ｍＬの濃度でＨＧＦを含む培地（＋）を添加して３０分反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファーを加えて回収した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに添加、泳動後ＰＶＤＦ膜に転写し、実施例２で使用したガレクチン－４抗体、ｃＭＥＴ抗体、β－アクチン抗体、ｐＭＥＴ抗体（Ｙ１２３４／１２３５）（Ｄ２６）ＸＰ（登録商標） Ｒａｂｂｉｔ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で染色を行った。結果を図６に示す。
ノックアウト細胞株は、両クローン共にＨＧＦの存在の有無に関わらず、親株や再発現株Ｒ３に比べてｐＭＥＴのレベルは極めて低かった。このことから、ガレクチン－４の発現がｃＭＥＴの活性化とも相関することが明らかになった。
【0049】
（ガレクチン－４の発現の変化とＣＤ４４の発現）
次に、親株、ノックアウト細胞株（ＫＯ－１ａ株、ＫＯ－２株）、再発現株Ｒ３でのＣＤ４４の発現をウェスタンブロット法で調べた。
図７に示すように、ＣＤ４４の発現はノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－２の両方で低下していた。一方、再発現株Ｒ３では、対照株及び親株とほぼ同じ程度まで回復しており、ガレクチン－４の発現がＣＤ４４の発現に影響を与えている可能性が示唆された。
次に、親株、ノックアウト細胞株（ＫＯ－１ａ株、ＫＯ－２株）、再発現株Ｒ３でのＣＤ４４の発現をウェスタンブロット法で調べた。
図７に示すように、ＣＤ４４の発現はノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－２の両方で低下していた。一方、再発現株Ｒ３では、対照株及び親株とほぼ同じ程度まで回復しており、ガレクチン－４の発現がＣＤ４４の発現に影響を与えている可能性が示唆された。
【0050】
《実施例３》
本実施例では、ｐＭＥＴの発現とガレクチン－４の発現とを、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）によって解析した。
ＰＬＡはＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標） ＰＬＡ試薬（シグマアルドリッチ社）の蛍光法のマニュアルに従って行った。ＮＵＧＣ４細胞の親株及びノックアウト株ＫＯ－２を室温で１５分間４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、ＰＢＳを用いて洗浄し、浸透処理バッファー（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＰＢＳ）中で５分間浸透処理した後、３７℃で３０分間ＰＬＡ用ブロッキングバッファーを用いてブロッキングした。１次抗体として抗ｐＭＥＴ抗体及び抗ガレクチン－４抗体（ＡＦ１２２７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）と４℃で終夜インキュベートした。
洗浄後、希釈ＰＬＡ二次抗体－ＰＬＡプローブ溶液［抗ウサギ（＋）および抗ヤギ（－）］を加え、３７℃で１時間加湿チャンバー内にてスライドをインキュベートした。洗浄後、ライゲーション反応を実施し、グリーンキットを用いて増幅反応を実施した。反応後の細胞をＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標） Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩを用いて封入し、透明なネイルポリッシュ硬化剤で周囲を密封し、蛍光顕微鏡で観察した。
ＰＬＡでは各抗体の結合する分子が４０ｎｍ以内に近接して位置する時は、ライゲーション反応によって環状ＤＮＡ鋳型が形成し、それに続く増幅反応によってハイブリダイズする蛍光オリゴプローブを使用して、局在増幅ＤＮＡを視覚化する。
図８で示されるように親株では細胞膜の近傍付近にＰＬＡシグナルが観察され、ガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接が観察された。一方、ノックアウト細胞株ＫＯ－２ではＰＬＡシグナルが観察されないことから、親株で認められたＰＬＡシグナルが特異的であることが確かめられた。
本実施例では、ｐＭＥＴの発現とガレクチン－４の発現とを、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）によって解析した。
ＰＬＡはＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標） ＰＬＡ試薬（シグマアルドリッチ社）の蛍光法のマニュアルに従って行った。ＮＵＧＣ４細胞の親株及びノックアウト株ＫＯ－２を室温で１５分間４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、ＰＢＳを用いて洗浄し、浸透処理バッファー（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＰＢＳ）中で５分間浸透処理した後、３７℃で３０分間ＰＬＡ用ブロッキングバッファーを用いてブロッキングした。１次抗体として抗ｐＭＥＴ抗体及び抗ガレクチン－４抗体（ＡＦ１２２７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）と４℃で終夜インキュベートした。
洗浄後、希釈ＰＬＡ二次抗体－ＰＬＡプローブ溶液［抗ウサギ（＋）および抗ヤギ（－）］を加え、３７℃で１時間加湿チャンバー内にてスライドをインキュベートした。洗浄後、ライゲーション反応を実施し、グリーンキットを用いて増幅反応を実施した。反応後の細胞をＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標） Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩを用いて封入し、透明なネイルポリッシュ硬化剤で周囲を密封し、蛍光顕微鏡で観察した。
ＰＬＡでは各抗体の結合する分子が４０ｎｍ以内に近接して位置する時は、ライゲーション反応によって環状ＤＮＡ鋳型が形成し、それに続く増幅反応によってハイブリダイズする蛍光オリゴプローブを使用して、局在増幅ＤＮＡを視覚化する。
図８で示されるように親株では細胞膜の近傍付近にＰＬＡシグナルが観察され、ガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接が観察された。一方、ノックアウト細胞株ＫＯ－２ではＰＬＡシグナルが観察されないことから、親株で認められたＰＬＡシグナルが特異的であることが確かめられた。
【0051】
（ＭＫＮ４５細胞のＰＬＡ）
本実施例では、ＮＵＧＣ４細胞に代えて、ＭＫＮ４５細胞を用いて、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を行った。ＭＫＮ４５細胞もガレクチン－４を発現している胃がん細胞である。
図９で示されるように無処理（－）の細胞では細胞膜の近傍付近にガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接を示すＰＬＡシグナルが観察された。また、Ｎ－結合型糖鎖合成阻害剤（ＮＧＩ－１）を１０μＭの濃度で培地に３日間添加した場合、ＰＬＡシグナルは大幅に減弱したことから、ガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接に糖鎖が関係している可能性が示唆された。抗ｐＭＥＴウサギ抗体の代わりに非免疫ウサギＩｇＧを使用した場合では、極少量のＰＬＡシグナルしか観察されなかった。
また、ガレクチン－４ウサギ抗体とＣＤ４４マウス抗体を使用し、ＰＬＡ二次抗体－ＰＬＡプローブ溶液［抗ウサギ（＋）および抗マウス（－）］を使用し同様の近接ライゲーションアッセイを行ったところ、膜近傍にＰＬＡシグナルが観察された。このことから、ＣＤ４４とガレクチン－４との近接も示唆された。
本実施例では、ＮＵＧＣ４細胞に代えて、ＭＫＮ４５細胞を用いて、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を行った。ＭＫＮ４５細胞もガレクチン－４を発現している胃がん細胞である。
図９で示されるように無処理（－）の細胞では細胞膜の近傍付近にガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接を示すＰＬＡシグナルが観察された。また、Ｎ－結合型糖鎖合成阻害剤（ＮＧＩ－１）を１０μＭの濃度で培地に３日間添加した場合、ＰＬＡシグナルは大幅に減弱したことから、ガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接に糖鎖が関係している可能性が示唆された。抗ｐＭＥＴウサギ抗体の代わりに非免疫ウサギＩｇＧを使用した場合では、極少量のＰＬＡシグナルしか観察されなかった。
また、ガレクチン－４ウサギ抗体とＣＤ４４マウス抗体を使用し、ＰＬＡ二次抗体－ＰＬＡプローブ溶液［抗ウサギ（＋）および抗マウス（－）］を使用し同様の近接ライゲーションアッセイを行ったところ、膜近傍にＰＬＡシグナルが観察された。このことから、ＣＤ４４とガレクチン－４との近接も示唆された。
【0052】
《実施例４》
本実施例では、近接標識法の１つであるＳＰＰＬＡＴ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ Ｔｙｒａｍｉｄｅ）法を用いて、ＭＫＮ４５及びＮＵＧＣ４細胞表面のガレクチン－４の近接分子の同定を行った。
本実施例では、近接標識法の１つであるＳＰＰＬＡＴ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ Ｔｙｒａｍｉｄｅ）法を用いて、ＭＫＮ４５及びＮＵＧＣ４細胞表面のガレクチン－４の近接分子の同定を行った。
【0053】
（ビオチン－ＰＥＧ４－チラミド調製]
チラミン塩酸塩（ナカライ社）を０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．８）で１．５５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、２ｍｇのＥＺＬｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ｂｉｏｔｉｎ Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ（登録商標） Ｆｏｒｍａｔ（Ａ３９２５９、サーモフィッシャー社）を０．３４ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。調製したチラミン塩酸溶液とＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン溶液を０．３４ｍＬずつ混和し、遮光して１６時間反応させた。その後、０．２２μｍフィルターでろ過した後、分注し、使用時まで－３０℃フリーザーで凍結保存した。
チラミン塩酸塩（ナカライ社）を０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．８）で１．５５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、２ｍｇのＥＺＬｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ｂｉｏｔｉｎ Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ（登録商標） Ｆｏｒｍａｔ（Ａ３９２５９、サーモフィッシャー社）を０．３４ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。調製したチラミン塩酸溶液とＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン溶液を０．３４ｍＬずつ混和し、遮光して１６時間反応させた。その後、０．２２μｍフィルターでろ過した後、分注し、使用時まで－３０℃フリーザーで凍結保存した。
【0054】
（ＳＰＰＬＡＴ法による細胞表面標識）
培養した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ標識した抗体をＰＢＳに溶解した１％ＢＳＡ溶液に加え、細胞と４℃で１時間反応させた。反応後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、６ｃｍ培養ディッシュの場合は１ｍＬの５０ｍＭトリス塩酸あたり６．２５μＬのビオチン－ＰＥＧ４－チラミド溶液、０．０３％の過酸化水素を加えて調製した溶液と５分反応させた。反応後、１ｍＬのカタラーゼ溶液（２００Ｕ／ｍＬ）を加え反応を停止させた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（登録商標） Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロシュ社）、ＰｈｏｓＳＴＯＰ（登録商標）（ロシュ社）及び４ｍＭ １，１０－フェナントロリン（ナカライ社）を含む０．５ｍＬのＥｚＲｉｐａ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｔｔｏ社）を添加しスクレーパーで回収し、－３０℃で凍結保存した。
培養した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ標識した抗体をＰＢＳに溶解した１％ＢＳＡ溶液に加え、細胞と４℃で１時間反応させた。反応後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、６ｃｍ培養ディッシュの場合は１ｍＬの５０ｍＭトリス塩酸あたり６．２５μＬのビオチン－ＰＥＧ４－チラミド溶液、０．０３％の過酸化水素を加えて調製した溶液と５分反応させた。反応後、１ｍＬのカタラーゼ溶液（２００Ｕ／ｍＬ）を加え反応を停止させた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（登録商標） Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロシュ社）、ＰｈｏｓＳＴＯＰ（登録商標）（ロシュ社）及び４ｍＭ １，１０－フェナントロリン（ナカライ社）を含む０．５ｍＬのＥｚＲｉｐａ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｔｔｏ社）を添加しスクレーパーで回収し、－３０℃で凍結保存した。
【0055】
（ビオチン標識分子の回収）
凍結保存した細胞溶解液を解凍後、超音波処理を行い、４０００Ｇで５分遠心した。上清にＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｍａｇｎｅ（登録商標） ストレプトアビジンビーズ（Ｖ７８２０、プロメガ社）を添加し、４℃、１６時間ローテーションしながら反応させた。遠心及び磁気ビーズ分離ラックでストレプトアビジンビーズを分離しＲｉｐａ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファーでビーズから標識分子を回収した。
凍結保存した細胞溶解液を解凍後、超音波処理を行い、４０００Ｇで５分遠心した。上清にＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｍａｇｎｅ（登録商標） ストレプトアビジンビーズ（Ｖ７８２０、プロメガ社）を添加し、４℃、１６時間ローテーションしながら反応させた。遠心及び磁気ビーズ分離ラックでストレプトアビジンビーズを分離しＲｉｐａ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファーでビーズから標識分子を回収した。
【0056】
（ガレクチン－４抗体による標識分子）
ＳＰＰＬＡＴ法でＨＲＰ標識ガレクチン－４抗体（ａＧ４）及びＨＲＰ標識ウサギＩｇＧ（Ｃ）で細胞表面を標識した結果を図１０ａに示す。ガレクチン－４抗体（ａＧ４）の代わりにウサギＩｇＧ（Ｃ）を反応させた細胞の溶解液にみられるいくつかのバンド（＊）は細胞に存在するアビジン結合分子である。ガレクチン－４抗体（ａＧ４）特異的に多くの分子がビオチン標識された。
ストレプトアビジンビーズで回収されたビオチン標識分子の中にｐＭＥＴ及びＣＤ４４が染色されたことから、これらの分子がガレクチン－４に近接して存在することがＳＰＰＬＡＴ法でも明らかになった。
ＨＲＰ標識ガレクチン－４抗体の代わりにＨＲＰ標識ガレクチン－４を用い、標識時、５０ｍＭの濃度でスクロース（Ｓｕｃ）またはラクトース（Ｌａｃ）、あるいは１ｍｇ／ｍＬの濃度でアシアロフェチュイン（ＡＦ）を共存させてＳＰＰＬＡＴ法で細胞表面を標識した結果を図１０ｂに示す。ガレクチン－４でビオチン標識される分子は、ガレクチン－４の結合阻害活性の無いスクロースに比べ、ガレクチン－４の結合阻害活性を有するラクトースやアシアロフェチュインの共存で大幅に減少した。
ストレプトアビジンビーズで回収したビオチン標識分子の中にウェスタンブロットでｐＭＥＴ及びＣＤ４４が染色されたことから、これらの分子がガレクチン－４に近接して存在することが明らかになった。ｐＭＥＴ及びＣＤ４４の染色も阻害糖の存在で大幅に減少したことから、これらの分子とガレクチン－４の近接に糖鎖が関与していることが明らかになった。
ＳＰＰＬＡＴ法でＨＲＰ標識ガレクチン－４抗体（ａＧ４）及びＨＲＰ標識ウサギＩｇＧ（Ｃ）で細胞表面を標識した結果を図１０ａに示す。ガレクチン－４抗体（ａＧ４）の代わりにウサギＩｇＧ（Ｃ）を反応させた細胞の溶解液にみられるいくつかのバンド（＊）は細胞に存在するアビジン結合分子である。ガレクチン－４抗体（ａＧ４）特異的に多くの分子がビオチン標識された。
ストレプトアビジンビーズで回収されたビオチン標識分子の中にｐＭＥＴ及びＣＤ４４が染色されたことから、これらの分子がガレクチン－４に近接して存在することがＳＰＰＬＡＴ法でも明らかになった。
ＨＲＰ標識ガレクチン－４抗体の代わりにＨＲＰ標識ガレクチン－４を用い、標識時、５０ｍＭの濃度でスクロース（Ｓｕｃ）またはラクトース（Ｌａｃ）、あるいは１ｍｇ／ｍＬの濃度でアシアロフェチュイン（ＡＦ）を共存させてＳＰＰＬＡＴ法で細胞表面を標識した結果を図１０ｂに示す。ガレクチン－４でビオチン標識される分子は、ガレクチン－４の結合阻害活性の無いスクロースに比べ、ガレクチン－４の結合阻害活性を有するラクトースやアシアロフェチュインの共存で大幅に減少した。
ストレプトアビジンビーズで回収したビオチン標識分子の中にウェスタンブロットでｐＭＥＴ及びＣＤ４４が染色されたことから、これらの分子がガレクチン－４に近接して存在することが明らかになった。ｐＭＥＴ及びＣＤ４４の染色も阻害糖の存在で大幅に減少したことから、これらの分子とガレクチン－４の近接に糖鎖が関与していることが明らかになった。
【0057】
《実施例５》
本実施例では、ｓｉＲＮＡを用いて、ガレクチン－４陽性細胞のガレクチン－４の発現を阻害した。すなわち、ガレクチン－４高発現胃癌細胞株（ＮＵＧＣ４、ＭＫＮ４５）を用いてガレクチン－４遺伝子の発現阻害（ノックダウン）実験を行い、ノックアウトと同様のフェノタイプが見られ、腹膜播種が阻害されるか調べた。
ノックダウン実験には、インビトロジェン社のｓｉＲＮＡを用いた。ガレクチン－４用のデザイン済みＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ（登録商標） ｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡ）＃３（5’-CCGGACAUUGCCAUCAACAGCUGAA-3’）、及びコントロールとしてＮｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｈｉｇｈ ＧＣ（１２９３５４００）のＳｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡを用いた。
細胞へのｓｉＲＮＡの導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（インビトロジェン社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。前日に撒き替えた細胞に、一定の濃度になるようにＯｐｔｉＭＥＭ培地で希釈したｓｉＲＮＡとＲＮＡｉＭａｘのコンプレックスを加え数日間培養後に試験に用いた。
本実施例では、ｓｉＲＮＡを用いて、ガレクチン－４陽性細胞のガレクチン－４の発現を阻害した。すなわち、ガレクチン－４高発現胃癌細胞株（ＮＵＧＣ４、ＭＫＮ４５）を用いてガレクチン－４遺伝子の発現阻害（ノックダウン）実験を行い、ノックアウトと同様のフェノタイプが見られ、腹膜播種が阻害されるか調べた。
ノックダウン実験には、インビトロジェン社のｓｉＲＮＡを用いた。ガレクチン－４用のデザイン済みＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ（登録商標） ｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡ）＃３（5’-CCGGACAUUGCCAUCAACAGCUGAA-3’）、及びコントロールとしてＮｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｈｉｇｈ ＧＣ（１２９３５４００）のＳｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡを用いた。
細胞へのｓｉＲＮＡの導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（インビトロジェン社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。前日に撒き替えた細胞に、一定の濃度になるようにＯｐｔｉＭＥＭ培地で希釈したｓｉＲＮＡとＲＮＡｉＭａｘのコンプレックスを加え数日間培養後に試験に用いた。
【0058】
（ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡによる関連分子の発現への影響）
ｓｉＲＮＡによって、ｃＭＥＴ及びｐＭＥＴタンパク質の発現が低下するか調べた。ＮＵＧＣ４細胞へは１０ｎＭ、ＭＫＮ４５細胞へは２５ｎＭの濃度でｓｉＲＮＡを導入し、ＳＤＳサンプルバッファーで回収し、両分子の発現をウェスタンブロットで調べた。
図１１に示すように、４８時間後に回収した細胞で、ガレクチン－４をノックダウンした細胞（Ｇｉ）ではコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞（Ｃｉ）に比べ、ＮＵＧＣ４細胞及びＭＫＮ４５細胞の両方でガレクチン－４タンパク質の発現低下が認められ、ノックアウトと同様にノックダウンでも特にｐＭＥＴタンパク質の低下が認められた。
ｓｉＲＮＡによって、ｃＭＥＴ及びｐＭＥＴタンパク質の発現が低下するか調べた。ＮＵＧＣ４細胞へは１０ｎＭ、ＭＫＮ４５細胞へは２５ｎＭの濃度でｓｉＲＮＡを導入し、ＳＤＳサンプルバッファーで回収し、両分子の発現をウェスタンブロットで調べた。
図１１に示すように、４８時間後に回収した細胞で、ガレクチン－４をノックダウンした細胞（Ｇｉ）ではコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞（Ｃｉ）に比べ、ＮＵＧＣ４細胞及びＭＫＮ４５細胞の両方でガレクチン－４タンパク質の発現低下が認められ、ノックアウトと同様にノックダウンでも特にｐＭＥＴタンパク質の低下が認められた。
【0059】
（ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ導入による増殖能への影響）
ｓｉＲＮＡの導入によって、胃がん細胞の増殖能に与える影響を調べた。前日に細胞を９６ウェルプレートに播種し、ｓｉＲＮＡ添加から７２時間後の生細胞をＷＳＴ－８法で調べ、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較した。
図１２に示すように、ガレクチン－４をノックダウンした細胞（Ｇｉ）では、無処理の細胞及びコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞（Ｃｉ）に比べ、増殖能の低下が認められた。ＭＫＮ４５細胞の方が、増殖抑制効果が高いのは、ＭＫＮ４５細胞の方がよりその増殖にｃＭＥＴ経路の関与する割合が高い為と考えられた。
ｓｉＲＮＡの導入によって、胃がん細胞の増殖能に与える影響を調べた。前日に細胞を９６ウェルプレートに播種し、ｓｉＲＮＡ添加から７２時間後の生細胞をＷＳＴ－８法で調べ、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較した。
図１２に示すように、ガレクチン－４をノックダウンした細胞（Ｇｉ）では、無処理の細胞及びコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞（Ｃｉ）に比べ、増殖能の低下が認められた。ＭＫＮ４５細胞の方が、増殖抑制効果が高いのは、ＭＫＮ４５細胞の方がよりその増殖にｃＭＥＴ経路の関与する割合が高い為と考えられた。
【0060】
（ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ導入細胞のＰＬＡ）
ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ導入細胞でｐＭＥＴとガレクチン－４のＰＬＡを行った。図１３で示されるように無処理の細胞及びコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞（Ｃｉ）で、膜の近傍付近にＰＬＡシグナルが観察され、ガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接が観察された。一方、ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ導入細胞（Ｇｉ）ではＰＬＡが減弱し、膜の近傍でのシグナルが観察されなかった。このことから、ガレクチン－４のノックダウンによって、膜近傍でのガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接が大きく抑制されることが示唆された。
ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ導入細胞でｐＭＥＴとガレクチン－４のＰＬＡを行った。図１３で示されるように無処理の細胞及びコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞（Ｃｉ）で、膜の近傍付近にＰＬＡシグナルが観察され、ガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接が観察された。一方、ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ導入細胞（Ｇｉ）ではＰＬＡが減弱し、膜の近傍でのシグナルが観察されなかった。このことから、ガレクチン－４のノックダウンによって、膜近傍でのガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接が大きく抑制されることが示唆された。
【0061】
《実施例６》
本実施例では、ｓｉＲＮＡの投与によって腹膜播種が抑制されるかを、マウスモデルを用いて解析した。
免疫不全マウス（ＢＡＬＢｃ ｎｕ／ｎｕ、オス、６週齢）に、ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５細胞３×１０６個を腹腔内に移植し、腹膜播種モデルとした。８０μｇのｓｉＲＮＡ溶解液、８０μＬのｉｎ ｖｉｖｏ実験用トランスフェクション試薬（ＬＥＯ－１０、北海道システム・サイエンス株式会社）、５％ブドウ糖液の計２５０μＬを腫瘍細胞投与後、１、４、７、１１、１４、１８、２１日目に計７回腹腔内に投与した。
動物試験に用いたガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ及びコントロールｓｉＲＮＡは、実施例５と同じ配列で、かつｉｎ ｖｉｖｏ用に調製されたもの（インビトロジェン社）を用いた。両ｓｉＲＮＡ腹腔内投与群とも、４匹ずつのマウスで実験を行った。また、２匹のマウスは腫瘍細胞のみを投与し、無処置群とした。
２８日後に開腹、剖検し、腫瘍重量を測定した結果を図１４に示す。無処置群＋対照ｓｉＲＮＡ投与群（Ｃｉ）とガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ投与群（Ｇｉ）で統計処理を行うとｐ＝０．０１７となり、有意水準５％でガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡによる腫瘍重量の抑制が認められ、ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡによって腹膜播種を抑制できると考えられる。
本実施例では、ｓｉＲＮＡの投与によって腹膜播種が抑制されるかを、マウスモデルを用いて解析した。
免疫不全マウス（ＢＡＬＢｃ ｎｕ／ｎｕ、オス、６週齢）に、ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５細胞３×１０６個を腹腔内に移植し、腹膜播種モデルとした。８０μｇのｓｉＲＮＡ溶解液、８０μＬのｉｎ ｖｉｖｏ実験用トランスフェクション試薬（ＬＥＯ－１０、北海道システム・サイエンス株式会社）、５％ブドウ糖液の計２５０μＬを腫瘍細胞投与後、１、４、７、１１、１４、１８、２１日目に計７回腹腔内に投与した。
動物試験に用いたガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ及びコントロールｓｉＲＮＡは、実施例５と同じ配列で、かつｉｎ ｖｉｖｏ用に調製されたもの（インビトロジェン社）を用いた。両ｓｉＲＮＡ腹腔内投与群とも、４匹ずつのマウスで実験を行った。また、２匹のマウスは腫瘍細胞のみを投与し、無処置群とした。
２８日後に開腹、剖検し、腫瘍重量を測定した結果を図１４に示す。無処置群＋対照ｓｉＲＮＡ投与群（Ｃｉ）とガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ投与群（Ｇｉ）で統計処理を行うとｐ＝０．０１７となり、有意水準５％でガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡによる腫瘍重量の抑制が認められ、ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡによって腹膜播種を抑制できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【0062】
本発明の医薬組成物は、ガレクチン－４陽性胃がん細胞の増殖を抑制し、胃がんの抗がん剤として用いることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】