特開 2024-20392 特定の遺伝子のＣＰＧメチル化変化を利用した肝癌診断用組成物およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024020392

(43)【公開日】2024-02-14

(54)【発明の名称】特定の遺伝子のＣＰＧメチル化変化を利用した肝癌診断用組成物およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6886 20180101AFI20240206BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20240206BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20240206BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6886 Z

C12Q1/6837 Z

C12Q1/6844 Z

【審査請求】有

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023193944

(22)【出願日】2023-11-14

(62)【分割の表示】P 2022522772の分割

【原出願日】2020-10-08

(31)【優先権主張番号】10-2019-0127218

(32)【優先日】2019-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(71)【出願人】

【識別番号】515288362

【氏名又は名称】ジェンキュリクス インク

【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＣＵＲＩＸ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001999

【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】チョ、サン レ

(72)【発明者】

【氏名】ムン、ユン ホ

(72)【発明者】

【氏名】ハン、チン イル

(57)【要約】      （修正有）

【課題】特定の遺伝子のＣＰＧメチル化変化を利用した肝癌診断用組成物およびその使用を提供する。
【解決手段】本発明は、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを検出することにより肝癌を診断することができる組成物、キット、核酸チップおよび方法に関することであり、肝癌を正確かつ迅速に診断することができるだけでなく、早期に診断することもできる。
【選択図】図１４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＡＫ１遺伝子のＣｐＧ部位メチル化レベルを測定するための製剤を含む肝癌診断用組成物。

【請求項2】

前記組成物が、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する製剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ＣｐＧ部位が遺伝子の転写開始部位から＋／－２０００塩基（２ｋｂ）の間に位置することを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定するための製剤が、非メチル化サイトシンまたはメチル化サイトシン塩基を変形させる化合物；前記遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化された配列に特異的なプライマー；及び、非メチル化配列に特異的なプライマーからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１ないし請求項３のうち何れか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記非メチル化サイトシン塩基を変形させる化合物はビサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）又はその塩であり、及び、前記メチル化サイトシン塩基を変形させる化合物はＴｅｔタンパク質であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

ＰＡＫ１遺伝子のＣｐＧ部位を含む断片を増幅するためのプライマー対を含む、肝癌診断用キット。

【請求項7】

前記キットが、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位を含む断片を増幅するためのプライマー対をさらに含む、請求項６に記載のキット。

【請求項8】

ＰＡＫ１遺伝子のＣｐＧ部位を含む断片とハイブリダイゼーションができるプローブが固定されている、肝癌診断用核酸チップ。

【請求項9】

前記拡散チップが、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位を含む断片とハイブリダイゼーションができるプローブがさらに固定されている、請求項８に記載の肝癌診断用核酸チップ。

【請求項10】

肝癌診断用製剤を調製するためのＰＡＫ１遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する製剤の使用。

【請求項11】

前記ＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定するための製剤が、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する製剤をさらに含む、請求項１０に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを検出することにより肝癌を診断することができる組成物、キット、核酸チップおよび方法に関することである。

【背景技術】

【0002】

本出願は、2019年10月14日に出願された大韓民国特許出願第10-2019-0127218号を優先権として主張し、前記明細書全文は本出願の参考文献である。

【0003】

肝癌は世界的に発症率の高い一種の癌である。韓国における肝癌死亡率は、人口１０万人当たり２３人で非常に高い方であり、韓国人の総死亡率の約１０％は肝炎、肝硬変及び肝癌に関連がある。肝癌は発生初期の知覚症状がないため、早期診断が難しい。通常的に、ほとんどの肝癌は適切な治療をすることができない進行性癌腫であり、進行の状態で発見されるため、治療が非常に制限的であり、予後も極めて悪い。肝癌は診断の当時における癌の進行状態によって予後が大きく変わるため、肝癌患者の早期発見は肝癌患者の生存率を高めるのに非常に重要である。

【0004】

一方、エピジェネティクスは、ＤＮＡの塩基配列が変化しない状態で行われる遺伝子の発現調節を研究する分野である。エピジェネティクスは、ＤＮＡメチル化、ｍｉＲＮＡまたはヒストンのアセチル化、メチル化、リン酸化およびユビキチン化などのエピジェネティックな変異による遺伝子の発現調節を研究する。
二重ＤＮＡメチル化が最も多くの研究ができているエピジェネティックな変異である。エピジェネティックな変異は、遺伝子機能の変異および腫瘍細胞への変化をもたらし得る。よって、ＤＮＡメチル化は、細胞内疾患調節遺伝子の発現（または抑制および誘導）に関連しており、最近、ＤＮＡメチル化測定による癌診断方法が提示されている。特に、前癌段階の組織においても癌特異的メチル化現象があらかじめ発生することもあるため、癌特異的メチル化の検出は癌の診断に利用される可能性が高い。

【0005】

よって、肝癌のリスク予測が可能である効果的な肝癌特異的メチル化マーカーの開発が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ここで、本発明者らは、肝癌において特定の遺伝子ＣｐＧ部位が過メチル化された状態であることを見出し、前記メチル化レベルを検出することにより肝癌を診断することができる組成物、キット、核酸チップ及び方法を開発して本発明を完成した。

【0007】

よって、本発明の目的は、特定の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する製剤を含む肝癌診断用組成物を提供することである。

【0008】

また、本発明の他の目的は、特定の遺伝子のＣｐＧ部位を含む断片を増幅するためのＰＣＲプライマー対と前記プライマー対によって増幅されたＰＣＲ産物をパイロシーケンスするためのシーケンシングプライマー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）を含有する肝癌診断用キットを提供することである。

【0009】

また、本発明のさらに他の目的は、特定の遺伝子のＣｐＧ部位を含む断片と、厳しい条件下でハイブリダイゼーションができるプローブが固定されている肝癌診断用核酸チップを提供することである。

【0010】

また、本発明のさらに他の目的は、それぞれ異なる試料から特定の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定し比較することを含む肝癌診断方法を提供することである。

【0011】

また、本発明のさらに他の目的は、肝癌診断用製剤を製造するための遺伝子ＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する製剤の使用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

前記の目的を達成するために、本発明は、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する製剤を含む肝癌診断用組成物を提供する。

【0013】

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位を含む断片を増幅するためのプライマー対を含む肝癌診断用キットを提供する。

【0014】

また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位を含む断片とハイブリダイゼーションができるプローブが固定されている肝癌診断用核酸チップを提供する。

【0015】

また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、肝臓癌の発生が疑われる患者の試料からＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する段階；及び
前記測定されたメチル化レベルを正常対照試料の前記の同一の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルと比較する段階；を含む、肝癌の診断方法を提供する。

【0016】

また、本発明は、さらに他の目的を達成するために、肝癌診断用製剤を製造するためのＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する製剤の使用が提供される。

【0017】

他の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、当業者らによって通常に理解できる同一の意味を有する。以下の参考文献は、本発明の明細書において使用された複数の用語らの一般的な定義を有する技術（ｓｋｉｌｌ）の１つを提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＴＹ（2th ed. 1994）；ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮ
Ｄ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Walkered．、1988）;及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ
ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ．

【0018】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0019】

本発明は、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する薬剤を含む肝癌診断用組成物を提供する。

【0020】

本発明において、「メチル化」とは、ＤＮＡを構成する塩基にメチル基が付着することを意味する。好ましくは、本発明におけるメチル化の有無は、特定の遺伝子の特定のＣｐＧ部位のサイトシンで起こるメチル化の有無を意味する。メチル化が起こった場合、それによって転写因子の結合が妨げられ、特定の遺伝子の発現が抑制され、逆に、非メチル化または低メチル化が起こると、特定の遺伝子の発現が増加する。
哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡには、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴに加え、サイトシンリングの５番目の炭素にメチル基が付着された５－メチルサイトシン（５－メチルシトシン、５－ｍＣ）という５番目の塩基が存在する。５－メチルシトシンのメチル化はＣｐＧと呼ばれるＣＧジヌクレオチド（５’－ｍＣＧ－３’）のＣでのみ起こり、ＣｐＧのメチル化はａｌｕまたはトランスポゾンとゲノムの反復配列が発現されることを抑制する。また、前記ＣｐＧの５－ｍＣが自然に脱アミノ化してチミン（Ｔ）になりやすいので、ＣｐＧは、哺乳動物細胞においてほとんどの厚生遺伝学的変化が頻繁に起こる部位である。

【0021】

本発明において、用語「メチル化レベルの測定」とは、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定することであり、ビサルファイト処理による検出法またはビサルファイト非依存性検出法により測定することができる。メチル化レベルの測定は、メチル化特異的ＰＣＲ、例えば、メチル化特異的ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＭＳＰ）、リアルタイム・メチル化特異的ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ、または定量ＰＣＲなどにより測定することができる。また、パイロシーケンシングおよびビサルファイトシーケンシングのような自動塩基分析にて測定することができるが、これに限定されるものではない。また、ビサルファイト非依存性検出法として、ＴＥＴタンパク質（ｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いた検出法を利用して測定することができる（Nature Biotechnology, volume 37, pages 424-429 (2019)を参照）。前記ＴＥＴタンパク質はＤＮＡに作用する酵素であり、塩基の化学的変化に関与し、ビサルファイトを処理する場合、メチル化されたＣを除く全てのＣがＴ塩基に変わるのとは異なり、Ｔｅｔタンパク質はメチル化されたＣのみがＴに変わり、より効率的な検出が可能である。

【0022】

好ましくは、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位とは、前記遺伝子のＤＮＡ上に存在するＣｐＧ部位を意味する。前記遺伝子のＤＮＡは、前記遺伝子が発現するのに必要であり、互いに作動可能に連結されている一連の構成単位を全て含む概念であり、例えば、プロモーター領域、タンパク質コーディング領域（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）及びターミネーター領域を含む。よって、ＦＡＭ
１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６及びＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位は、該当遺伝子のプロモーター領域、タンパク質コーディング領域またはターミネータ領域などに存在してもよい。

【0023】

好ましくは、本発明において、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６及びＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定することは、下記の表１に記載の遺伝子のＣｐＧ部位のサイトシンのメチル化レベルを測定することを意味してもよい。

【0024】

【表1】

【0025】

本発明において、前記ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６及びＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位は遺伝子の転写開始部位（トランスポート開始サイト（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ，ＴＳＳ）から＋／－２０００塩基（２ｋｂ）の間に位置することを特徴とする。

【0026】

本発明において、ヒトゲノム染色体部位の塩基配列は、Ｔｈｅ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９ Ｈｕｍａｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＧＲＣｈ３７）に従って表現したが、前記ヒトゲノム染色体部位の具体的な配列は、ゲノム配列の研究結果が更新されるにつれてその表現が多少変更されることもあり、このような変更によって、本発明の前記ヒトゲノム染色体部位の表現が異なることもある。よって、本発明のＴｈｅ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９ Ｈｕｍａｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＧＲＣｈ３７）に従って発現されたヒトゲノム染色体部位は、本発明の出願日の以後、ヒト標準塩基配列（ｈｕｍａｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が更新され、前記ヒトゲノム染色体部位の表現が今のことと異なるように変更されるとしても、本発明の範囲が前記変更されたヒトゲノム染色体部位に及ぼすことは自明である。このような変更内容は、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者であれば誰でも容易に知ることができ
る事項である。

【0027】

本発明において、前記ＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する製剤は、サイトシン塩基を修飾する化合物またはメチル化感受性制限酵素、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のメチル化された対立形質の配列に特異的なプライマー、および非メチル化された対立形質の配列に特異的なプライマーを含んでもよい。

【0028】

前記シトシン塩基を変形させる化合物とは、非メチル化サイトシンまたはメチル化サイトシンを変形させる化合物であり、非メチル化サイトシンを変形させるビサルファイトまたはその塩、好ましくは、ナトリウムビサルファイトであるか、またはメチル化サイトシンを変形させるＴＥＴタンパク質であってもよいが、これらに限定されない。このようなサイトシン塩基を変形させてＣｐＧ部位がメチル化されるかされないかを検出する方法は、当該業界に広く公知となっている（ＷＯ０１／２６５３６；ＵＳ２００３／０１４８３２６Ａ１）。
また、前記メチル化感受性制限酵素とは、ＣｐＧ部位のメチル化を特異的に検出することができる制限酵素であり、制限酵素の認識部位としてＣＧを含有する制限酵素であってもよい。例えば、ＳｍａＩ、ＳａｃＩＩ、ＥａｇＩ、ＨｐａＩＩ、ＭｓｐＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ、ＮｏｔＩなどがあり、これらに限定されない。前記制限酵素認識部位のＣにおけるメチル化または非メチル化によって制限酵素による切断の有無が異なり、これをＰＣＲまたはサザンブロット分析により検出することができるようになる。前記制限酵素以外の他のメチル化感受性制限酵素は当該業界によく知られている。
前記プライマーは、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のメチル化された対立形質の配列に特異的なプライマー、及び非メチル化された対立形質の配列に特異的なプライマーを含めることができる。
本発明において、用語「プライマー」とは、短い遊離の３’末端水酸化基を有する核酸配列で相補的なテンプレートと塩基対を形成することができ、テンプレート鎖コピーのための開始点として機能する短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液および温度において、重合反応（すなわち、ＤＮＡ重合酵素または逆転写酵素）のための試薬および異なる４つのヌクレオシド三リン酸の存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。また、プライマーは、７個～５０個のヌクレオチド配列を有するセンスおよびアンチセンス核酸として、ＤＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの基本的性質を変化させない追加的特徴を組み込んでもよい。
本発明のプライマーは、メチル化の有無を分析する対象となる特定のＣｐＧ部位の配列に応じて好ましくデザインすることができ、より好ましくは、メチル化されてビサルファイトにより変形されなかったサイトシンを特異的に増幅することができるプライマー対、メチル化されず、ビサルファイトにより変形されたサイトシンを特異的に増幅できるプライマー対、メチル化されてＴｅｔ系のタンパク質によって変形されたサイトシンを特異的に増幅することができるプライマー対、およびメチル化されなかったことにより、Ｔｅｔ系のタンパク質によって変形されなかったサイトシンを特異的に増幅することができるプライマー対からなる群から選択されるいずれか１つ以上でもよい。

【0029】

よって、本発明は、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位を含む断片を増幅するためのプライマー対を含む肝癌診断用キットを提供する。

【0030】

前記組成物及びキットには、前記製剤のほかにも、重合酵素アガロース、電気泳動に必要な緩衝溶液等が追加的に含まれてもよい。

【0031】

また、本発明は、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位を含む断片とハイブリダイゼーションをすることができるプローブが固定されている肝癌診断用核酸チップを提供する。

【0032】

本発明における用語「核酸」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドを意味するか、またはそれらの断片、一本鎖または二本鎖のゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、センス、またはアンチセンス鎖のゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸、ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、または天然起源または合成起源のＤＮＡ量またはＲＮＡ量の物質を意味する。核酸がＲＮＡである場合、デオキシヌクレオチドのＡ、Ｇ、ＣおよびＴの代わりに、それぞれリボヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＵに置換されることは、当該分野の通常の知識を有する者に自明である。

【0033】

メチル化は、遺伝子の調節部位の外郭から始まって内部に進行するため、調節部位の外郭でメチル化を検出することで、細胞形質転換に関与する遺伝子を早期診断することができる。
よって、前記メチル化遺伝子マーカーを用いて肝癌を形成する可能性のある細胞の早期診断が可能である。癌細胞でメチル化されると確認された遺伝子が臨床的または形態学的に正常に見える細胞においてメチル化されると、前記正常に見える細胞は癌化が進行しているものである。よって、正常に見える細胞における肝癌特異的遺伝子のメチル化を確認することにより、肝癌を早期診断することができる。

【0034】

また、本発明は、肝癌の発生が疑われる患者の試料からＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する段階；及び
前記測定されたメチル化レベルを正常対照試料の前記同一の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルと比較する段階；を含む、肝癌の診断方法を提供する。

【0035】

前記メチル化レベルを測定する方法はＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（ｒｅａｌ
ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ、メチル化感受性制限酵素を使用したメチル化の有無測定、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップ、パイロシーケンシングおよびビサルファイトシーケンシングからなる群から選択されてもよいが、これらに限定されない。

【0036】

具体的には、メチル化特異的ＰＣＲの方法は、試料ＤＮＡを重亜硫酸塩処理した後、ＰＣＲを行うプライマーをＣｐＧジヌクレオチドのメチル化の有無によって異なる種類のプライマーをデザインして使用する方法である。プライマー結合部位がメチル化されている場合、メチル化されたプライマーによりＰＣＲが進行し、メチル化されていない場合、正常プライマーによってＰＣＲが進行される。つまり、試料ＤＮＡを重亜硫酸塩処理した後、２種類のプライマーを同時に用いてＰＣＲを行った後、結果を比較する方法である。

【0037】

リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲは、メチル化特異的ＰＣＲ方法をリアルタイム測定方法に切り替えたことであり、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩処理した後、メチル化された場
合に該当するＰＣＲプライマーをデザインし、これらのプライマーを利用してリアルタイムＰＣＲを行うことである。この場合、増幅された塩基配列と相補的なＴａｎＭａｎプローブを用いて検出する方法と、Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎを使用して検出する２種類の方法がある。よって、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲは、メチル化されたＤＮＡのみを選択的に定量分析することができる。この場合、体外メチル化ＤＮＡ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ）サンプルを用いて標準曲線を作成し、標準化のために塩基配列内に５’－ＣｐＧ－３’配列のない遺伝子を陰性対照群にて一緒に増幅し、メチル化度を定量分析する方法である。

【0038】

メチル化感受性制限酵素を用いてメチル化の有無を測定する方法において、メチル化感受性制限酵素はＣｐＧジヌクレオチドを作用部位とし、この部位がメチル化された場合は、酵素として作用することができない。よって、試料ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で処理した後、酵素標的部位を含むようにＰＣＲで増幅すると、メチル化された場合は制限酵素が作用せずにＰＣＲ増幅されるが、メチル化されていない正常部位は制限酵素による切断によってＰＣＲが増幅されないので、特定のＤＮＡ部位のメチル化の有無を測定することができる。

【0039】

メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲまたはＤＮＡチップ法は、メチル化ＤＮＡのみに特異的に結合するタンパク質をＤＮＡに混合すると、メチル化ＤＮＡのみに特異的にタンパク質が結合するため、メチル化ＤＮＡのみを選択的に分離することができる。ゲノムＤＮＡをメチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質と混ぜた後、メチル化されたＤＮＡのみを選択的に分離する。これらの分離されたＤＮＡをイントロン部位に該当するＰＣＲプライマーを用いて増幅した後、アガロース電気泳動でメチル化の有無を測定する方法である。また、定量ＰＣＲ法でもメチル化の有無を測定することができ、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質で分離したメチル化ＤＮＡは、蛍光色素で標識し、相補的なプローブが集積されたＤＮＡチップにハイブリダイゼーションすることによりメチル化の有無を測定することができる。ここで、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質はＭＢＤ２ｂｔに限定されない。

【0040】

また、重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡのパイロシーケンシングは、以下の原理に基づく。ＣｐＧジヌクレオチド部位にメチル化が発生すると、５－メチルシトシン（５－ｍＣ）が形成される。この変形された塩基は重亜硫酸塩処理した場合にウラシルに変化する。試料から抽出したＤＮＡを重亜硫酸塩処理する場合、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化された場合、シトシンとして保存され、残りのメチル化されていないシトシンはウラシルに変化する。重亜硫酸塩処理されたＤＮＡの配列分析は、好ましくは、パイロシーケンシング法を用いて行うことができる。パイロシーケンシングの詳細な説明は先行文献に知られている。［Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ Ｊｕｌ １７， ２８１（５３７５），３６３－３６５；Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６ Ｎｏｖ １，２４２（１），８４－９；Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００ Ｎｏｖ １５， ２８６（２）：２８２－２８８；Ｎｙｒ，Ｐ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｍｏｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００７，３７３，１１４]。

【0041】

一方、Ｔｅｔタンパク質を用いたビサルファイト非依存性検出法として、Ｔｅｔタンパク質を用いてメチル化されたＣのみがＴに変換してメチル化部位の塩基を検出することもできる（ＬＩＵ，Ｙｉｂｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ３７，ｐａｇｅｓ ４２４－４２９（２０１９）を参照）。
ＣｐＧジヌクレオチド部位においてメチル化が発生し、シトシンが５－メチルシトシン（５－ｍＣ）が形成された場合、Ｔｅｔ（ｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）タンパク質を処理する場合、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていると、ウ
ラシルに変化し、メチル化されていないシトシンは保存される。Ｔｅｔ処理されたＤＮＡの配列分析は、パイロシーケンシング法のみに限定されず、メチル化感受性ＰＣＲ（ＭＳＰ）、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）、次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）などの方法を用いて分析することができる。

【0042】

好ましくは、本発明の肝癌診断方法は、ａ）個体から試料を収得する段階と、ｂ）試料中のゲノムＤＮＡを収得する段階と、ｃ）収得したゲノムＤＮＡをメチル化されてないシトシン塩基を変形する化合物を処理する段階と、ｄ）前記処理されたＤＮＡを、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上のＣｐＧ部位を増幅することができるプライマーを用いてＰＣＲにより増幅することによってＰＣＲ産物を得る段階と、ｅ）前記ＰＣＲ産物のメチル化度を測定する段階とを含むことを特徴とする方法によって行われてもよい。

【0043】

前記ｂ）段階のゲノムＤＮＡの収得は、当該業界において通常に用いられるフェノール／クロロホルム抽出法、ＳＤＳ抽出法（Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ．８：２９７－３０３，１９９０）、ＣＴＡＢ分離法（Ｃｅｔｙｌ Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ；Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃ．Ｒｅｓ．、４３２１－４３２５、１９８０）または商業的に販売のＤＮＡ抽出キットを用いて行うことができる。

【0044】

本発明において、用語「試料」とは、遂行される分析の種類に応じて、個々人、体液、細胞株、組織培養などから得られる全ての生物学的体液を含む幅広い範囲の体液を意味する。哺乳動物から体液および組織生検を獲得する方法は通常に広く知られており、本発明において、前記試料は、好ましくは、組織、細胞、血液、血漿、血清、糞便および小便を含む人体由来物質からなる群から選択されてもよい。癌組織の異常なメチレーションの変化は、細胞、全血、血清、血漿、唾液、喀痰、脳脊髄液または尿のような生物学的試料から得られたゲノムＤＮＡのメチレーションの変化と相当な類似性を示すため、本発明のマーカーを用いる場合、肝癌の発生予測に対して、血液や体液などによる簡単な診断が可能であるという利点がある。

【0045】

また、本発明は、肝癌診断用製剤を調製するためのＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子ＣｐＧ部位のメチル化を測定する製剤の使用を提供する。

【発明の効果】

【0046】

上述したように、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位の過メチル化は、肝癌において特異的に示されるため、本発明による組成物、キット、チップまたは方法を用いて肝癌を正確かつ迅速に診断することができ、さらに早期に診断することができる。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】図１は、総３３種の癌タイプにおけるＦＡＭ１１０Ａ遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図2】図２は、総３３種の癌型におけるＦＡＲ１遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図3】図３は、総３３種の癌タイプにおけるＶＩＭ遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図4】図４は、総３３種の癌型におけるＬＤＨＢ遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図5】図５は、総３３種の癌型におけるＬＩＰＥ遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図6】図６は、総３３種の癌型におけるＩＮＡＦＭ１遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図7】図７は、総３３種の癌型におけるＡＴＬ１遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図8】図８は、総３３種の癌型におけるＣＥＬＦ６遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図9】図９は、総３３種の癌型におけるＭＴＨＦＤ２遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図10】図１０は、総３３種の癌型におけるＰＡＫ１遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図11】図１１は、総３３種の癌型におけるＮＸＰＥ３遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図12】図１２は、総３３種の癌タイプにおけるＳＬＣ２５Ａ３６遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図13】図１３は、総３３種の癌型におけるＶＡＮＧＬ２遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【図14】図１４は、本発明により選別された総１４種類の遺伝子における肝細胞癌の診断精度を確認した結果である。

【図15】図１５は、腫瘍組織（ｔｕｍｏｒ）細胞株群と非腫瘍組織（ｏｔｈｅｒｓ）細胞株群の間のメチル化の差異を確認した結果である。

【図16】図１６ａ及び図１６ｂは、肝癌組織及び正常周辺組織におけるＦＡＲ１、ＰＡＫ１、ＡＴＬ１、ＬＩＰＥ遺伝子のメチル化度をｑＭＳＰした後、ΔＣｔ＋１０値にて提示した結果である。

【図17】図１７は比較例であり、ＧＲＡＳＰ遺伝子のメチル化情報を確認した結果である。

【実施例0048】

以下、本発明の理解を補うために好ましい実施例を提示する。しかしながら、以下の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、これによって本発明の内容が限定されるものではない。

【0049】

実施例１：肝細胞癌特異的メチル化遺伝子の選別
肝細胞癌に特異的に見られるメチル化遺伝子を選別するために、３つの大規模メチレーションマイクロアレイチップ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｃｈｉｐ）のデータを用いて大腸直腸癌患者の癌手術から得られた癌組織と正常組織の大規模メチル化の比較研究を行った（表２を参照）。当該研究において使用された腫瘍組織（ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ）は肝細胞癌の癌組織を意味し、非腫瘍組織（ｎｏｎ－ｔｕｍｏｒ
ｔｉｓｓｕｅ）は正常肝組織を含む癌組織以外の組織を意味する。

【0050】

【表2】

【0051】

肝細胞癌特異的メチル化遺伝子選択のために、各組織からＤＮＡを抽出し、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ Ｂｅａｄｃｈｉｐ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いて遺伝子部位のメチル化度を確認した。
各組織から抽出されたＤＮＡは、ビサルファイト処理によって変換される。これにより、ＤＮＡ部位のメチル化の有無に応じてサイトシン塩基の変形が行われる。当該マイクロアレイ実験に使用されるプローブは、遺伝子のメチル化部位のサイトシン塩基の変形を確認するために、メチル化、非メチル化（ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）に特異的にデザインされた。
当該マイクロアレイ実験は、それぞれの遺伝子のメチル化部位を示す約４５万個（４５０ｋ）のプローブを介して遺伝子のメチル化度を測定し、試験によって導出された各プローブの結果はβ値にて示される。β値は０から１までの値を有し、１に近いほど当該遺伝部位のメチル化度が高いと判断した。
腫瘍群と非腫瘍群の間の差別的メチル化部位（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ，ＤＭＲｓ）を確認するために、経験ベイズｔ検定（empirical Bayes t-test）であるリンマ（Ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ、Ｌｉｍｍａ）法を用いた群同士の統計的に有意なメチル化の差を示す遺伝子部位を確認した。
Ｌｉｍｍａ法は、群同士の差異を確認する複数のメチル化統計分析法の中で最も異常値（ｏｕｔｌｉｎｅｒ）により少ない影響を受けることが知られている。よって、一部のサンプルの異常な測定値より影響を少なく受け、癌特異的マーカーを見出すのに適した方法である。本実験においては、Ｌｉｍｍａ法により導出された補正型ｐ値（ａｄｊｕｓｔｅｄ ｐ－ｖａｌｕｅ）値が少ないほど、両群の間に有意なメチル化差があると判断した。
特に、腫瘍特異的メチル化部位の探索をするために、腫瘍群と非腫瘍群の間に有意なβ値の差がある遺伝子部位のうち、非腫瘍より腫瘍組織にてより高いメチル化を部位をがん特異的バイオマーカー候補に選定した。
その結果、３つのデータセット（ｄａｔａｓｅｔ）のそれぞれにおけるｌｉｍｍａ分析の結果、非腫瘍群に比べて腫瘍群同士の比較時に有意に低いｐ値を有し、群間β値が０．２以上の大きな差を示す遺伝子部位を腫瘍特異的過メチル化部位（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙａｌｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ）として選別した。これにより、約４５万個の遺伝部位のうち、全てのデータセットが共通的に腫瘍特異的過メチル化を示す１，７７７個の遺伝部位をバイオマーカー候補として選別した。

【0052】

実施例２：肝細胞癌特異的過メチル化遺伝子の選別
前記実施例１で確認した１，７７７個のバイオマーカーの遺伝部位において、肝細胞癌以外の腫瘍における各該当部位のメチル化度を確認して比較し、バイオマーカーのうち肝癌特異的な遺伝部位を見出した。癌遺伝子公共データベースであるＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）のＤＮＡ ｍｅｔｈｙａｌｔｉｏｎ ４５０ｋ
ａｒｒａｙの実験結果を分析した結果、３３種類の癌タイプ（ｃａｎｃｅｒ ｔｙｐｅ）に該当する遺伝部位のメチル化情報を確認することができた。このうち肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ， ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒと名付ける）およびその他の３２種類の癌に対比肝癌で有意に高いβ値を示す遺伝部位を確認した結果、
１，７７７個の遺伝部位のうち４２個の遺伝部位に肝癌特異的メチル化が発生したことが確認できた。

【0053】

前記遺伝子に対する腫瘍組織（ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ、肝細胞癌の癌組織）および非腫瘍組織（ｎｏｎ－ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ、正常肝組織を含む癌組織以外の組織）に対する前記マイクロアレイ実験による遺伝子のメチル化度は、図１５と同様である。メチル化度は、試験により導出された各プローブの結果をβ値で示し、β値は０から１までの値を有し、１に近いほど該当遺伝部位のメチル化度が高いと判断した。

【0054】

一方、肝癌の腫瘍組織と非腫瘍組織の比較時にメチル化の差が観察される遺伝部位の場合、肝癌以外の他の癌に対してもメチル化が発生することができる。すなわち、肝癌特異的メチル化が確認されていないことである。

【0055】

例えば、ＧＲＡＳＰ（ホスホイノシチド１関連足場タンパク質のための一般的受容体、ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅｓ １
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の場合、前記実施例１で確認した１，７７７個の遺伝部位のうち、最も大きい腫瘍組織と非腫瘍組織の間のメチル化の差が確認された部位の１つであったが、図１６に示すように、肝癌において高いメチル化が現れると同時に、前立腺がん、直腸がん、胃がんなどをはじめとする様々な癌腫でも高いメチル化が発生することを確認した。

【0056】

前記３３種類の癌は以下のとおりである。急性骨髄性白血病（Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、副腎皮質癌（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胆道癌（Ｂｉｌｅ Ｄｕｃｔ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（Ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜がん（Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｉｄ Ｃａｎｃｅｒ）、食道がん（Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ｃａｎｃｅｒ）、膠芽腫（Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、頭頸部がん（Ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓嫌色素性がん（Ｋｉｄｎｅｙ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ）、腎細胞がん（Ｋｉｄｎｅｙ Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎乳頭様細胞癌（Ｋｉｄｎｅｙ Ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨大Ｂ細胞リンパ腫（Ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、肝癌（Ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、低等級膠腫（Ｌｏｗｅｒ Ｇｒａｄｅ Ｇｌｉｏｍａ）、肺腺癌（Ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色腫（Ｍｅｌａｎｏｍａ）、中皮腫（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、眼の黒色腫（Ｏｃｕｌａｒ ｍｅｌａｎｏｍａｓ）、卵巣癌（Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、茶色細胞腫瘍＆副腎結節腫（Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ＆ｐａｒａｇａｎｇｌｉｏｍａ）、前立腺癌（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌（Ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肉腫（Ｓａｒｃｏｍａ）、胃癌（Ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌（Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）、胸腺腫（Ｔｈｙｍｏｍａ）、甲状腺癌（Ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、子宮肉腫（Ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｓａｒｃｏｍａ）。

【0057】

これらの遺伝子部位のうち、偽遺伝子（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）ではなく、該当部位がＣｐＧ島（ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ）部位に存在し、遺伝子の転写開始部位（TSS）から＋／－２０００塩基（２ｋｂ）の間に選別された遺伝部位にあり、常染色体に存在する場合は、肝細胞癌特異的過メチル化遺伝子で選別した。その結果、以下の表３に示したように、総１３個の遺伝子が選択された（図１～図１３参照）。

【0058】

【表3】

【0059】

特に、ＦＡＲ１（図２）、ＬＩＰＥ（図５）、ＭＴＨＦＤ２（図１０）、ＮＸＰＥ３（図１２）の場合、他の癌腫対比肝癌（Ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）に対して明確な特異的過メチル化を示した。

【0060】

実施例３：細胞株における選別遺伝子の肝癌特異性の確認
選別された１３個の遺伝子が他の癌と区別される肝癌特異的メチル化を示すかを確認するために、公共データベースを活用し、大きく１４個の組織に由来の１，０２２個の癌細胞株（ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）におけるメチル化パターンを分析した。当該データは、各細胞株から抽出したＤＮＡを標準化した製造社のメチル化分析試験過程に従ってＩｎｆｉｎｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ Ｂｅａｄｃｈｉｐ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ実験を行った。

【0061】

遂行した実験の結果値は、前記実施例１のように、約４５万個のプローブを介して遺伝子メチル化度を測定し、各プローブのメチル化値はβ値として示される。β値は０から１までの値を有し、１に近いほど該当遺伝部位のメチル化度が高いと判断する。
前記１４個の組織は以下のとおりである。呼吸消化管（ａｅｒｏｄｉｇｅｓｔｉｖｅ
ｔｒａｃｔ）、血液、骨、乳房、消化器系（ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ）、腎臓、肺、神経系、膵臓、皮膚、軟組織、甲状腺、泌尿生殖器系（ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ ｓｙｓｔｅｍ）、その他の組織。

【0062】

選別された１４個の遺伝子の肝臓癌特異的メチル化を確認するために、１，０２２個の細胞株に由来のメチェル化データは、大きく肝癌細胞株群（ｎ＝１９）と非肝癌細胞株群（ｎ＝１，００３）に分類した。

【0063】

分類された両群間の差別的なメチル化部位（ＤＭＲｓ）を確認するために経験ベイズｔ検定であるリンマ（Ｌｉｍｍａ）法を用い、群間の統計的に有意なメチル化の差異を示す遺伝子部位を確認した。

【0064】

【表4】

【0065】

特に、先に実際の患者検体において他の癌対比肝癌に対して明らかな特異的過メチル化を示したＦＡＲ１、ＬＩＰＥ、ＭＴＨＦＤ２、ＮＸＰＥ３の場合、細胞株を用いた分析においても、他の癌細胞株に比べて肝癌細胞株でも確実に低い補正型ｐ値を有するため、肝癌特異的であることが確認できる。他にも、ＬＤＨＢ、ＰＡＫ１のような遺伝子が他の細胞株対比肝癌の細胞株において明らかなメチル化を示すことが確認できた。

【0066】

実施例４：肝癌診断マーカー候補の診断性能評価
選別された遺伝子の肝細胞癌における診断マーカーとしての有用性を確認するために、メチル化度による肝細胞癌診断の精度を評価した。

【0067】

診断の精度を評価するには、感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）と特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を使用する。連続する診断検査測定値の可能な切断値（ｃｕｔ－ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）に対する感度と特異度の値の計算を通じて切断値による感度と特異度の変化を提示するＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線を示すことができる。診断の精度は、ＲＯＣ曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ
ｔｈｅ ＲＯＣ ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）によって測定することができる。ＡＵＣ値は０．５から１の間の値を有し、その値が大きいほど診断精度が高いと評価する。ＡＵＣ値が
１の場合、診断結果は完全に正確な検査であることを意味するが、０.５の場合は無作為結果と同じであると判断する。

【0068】

選別された遺伝子を用いた非腫瘍組織と腫瘍組織の間のメチル化度による癌分類精度を収集したメチレーションデータセットを用いて分析した結果、図１４に示したように、全ての選択された遺伝子は０．８６０以上のＡＵＣ値を有し、高い診断精度を示し、選択された遺伝子が肝細胞癌の診断に有用であることを確認した。

【0069】

実施例５：選別された遺伝子の肝癌組織ｑＭＳＰ基盤のメチル化の測定
選別された１３個の遺伝子のうち、非腫瘍組織と腫瘍組織の間のメチル化度の差が大きく、腫瘍組織の平均的メチル化数値が高いＦＡＲ１、ＰＡＫ１、ＡＴＬ１、ＬＩＰＥの４つの遺伝子に対して癌組織を用いた追加の検証試験を遂行した。選別された４つの遺伝子の肝癌特異的メチル化を癌組織で確認するために、メチル化特異的ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ，ｑＭＳＰ）技法を用いて癌組織と非癌組織の間のメチル化の差を測定した。このために、癌２期から４期まで各病期ごとに５人ずつ、総１５名の肝癌患者癌組織と癌周辺組織対からゲノムＤＮＡを分離し、ビサルファイト処理した後、一般化したｑＭＳＰ実験方法に従ってＦＡＲ１、ＰＡＫ１、ＡＴＬ１、ＬＩＰＥのそれぞれを特異的遺伝部位の増幅およびメチル化度を観察した。

【0070】

また、ビサルファイトに変換した遺伝部位に特異的に結合して増幅し、当該部位の増幅された値を標準化するためにメチル化と関係ないＡＣＴＢ遺伝子を内部標準として使用した。
前記ビサルファイトに変換されたＤＮＡをＰＣＲで増幅させたメチル化レベルは、内部標準として使用したＡＣＴＢのＣｔ（Ｃｙｃｌｅ ｏｆ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値で補正した値であるΔＣｔ＋１０で示す。ΔＣｔ＋１０は以下のように定義する。
ΔＣｔ＋１０＝（ＡＣＴＢ遺伝子のＣｔ値－検出対象遺伝子のＣｔ値）＋１０

【0071】

図１６ａ及び１６Ｂに示したように、ＦＡＲ１、ＡＴＬ１、ＰＡＫ１、ＬＩＰＥの各遺伝子のメチル化は、癌周辺正常組織と比較し、大腸癌組織における病期にかかわらず相対的に高いΔＣｔ＋１０値を示し、肝癌においてＦＡＲ１、ＡＴＬ１、ＰＡＫ１、ＬＩＰＥという４つの遺伝子が過メチル化（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）されたことが確認できた。これは、選別されたＦＡＲ１、ＡＴＬ１、ＰＡＫ１、ＬＩＰＥ遺伝子のメチル化が肝癌の診断、特に早期診断のバイオマーカーとして効果的であることを実際に示した結果である。
このような結果から、選別された遺伝子が肝癌の診断にも利用できることが分かった。

【産業上の利用可能性】

【0072】

上述したように、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＲ１、ＶＩＭ、ＬＤＨＢ、ＬＩＰＥ、ＩＮＡＦＭ１、ＡＴＬ１、ＣＥＬＦ６、ＭＴＨＦＤ２、ＰＡＫ１、ＮＸＰＥ３、ＳＬＣ２５Ａ３６およびＶＡＮＧＬ２からなる群から選択されたいずれか１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位の過メチル化は、肝癌において特異的に示されるので、本発明による組成物、キット、チップまたは方法を利用し、肝癌を正確かつ迅速に診断することができるだけでなく、早期に診断することもできる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0073】

【特許文献1】国際公開第０１／２６５３６号

【特許文献2】米国特許出願公開第２００３／０１４８３２６ Ａ１号明細書

【非特許文献】

【0074】

【非特許文献1】Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＴＹ（2th ed. 1994）

【非特許文献2】ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Walkered．、1988）

【非特許文献3】Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ

【非特許文献4】Nature Biotechnology, volume 37, pages 424-429 (2019)

【非特許文献5】Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ Ｊｕｌ １７， ２８１（５３７５），３６３－３６５

【非特許文献6】Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６ Ｎｏｖ １，２４２（１），８４－９

【非特許文献7】Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００ Ｎｏｖ １５， ２８６（２）：２８２－２８８

【非特許文献8】Ｎｙｒ，Ｐ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｍｏｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００７，３７３，１１４

【非特許文献9】ＬＩＵ，Ｙｉｂｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ３７，ｐａｇｅｓ ４２４－４２９（２０１９）

【非特許文献10】Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ．８：２９７－３０３，１９９０

【非特許文献11】Ｃｅｔｙｌ Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ；Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃ．Ｒｅｓ．、４３２１－４３２５、１９８０

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】