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特開2024-22034プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法、決定部を備える装置及び決定ステップを含む情報処理プログラム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024022034
(43)【公開日】2024-02-16
(54)【発明の名称】プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法、決定部を備える装置及び決定ステップを含む情報処理プログラム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240208BHJP
G01N 21/17 20060101ALI20240208BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240208BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20240208BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240208BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240208BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240208BHJP
G01N 21/45 20060101ALI20240208BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
G01N21/17 A
G01N33/15 Z
G01N33/48 M
G01N33/50 Z
C12M1/00 A
C12M1/34 B
G01N21/45 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022125334
(22)【出願日】2022-08-05
(71)【出願人】
【識別番号】000236436
【氏名又は名称】浜松ホトニクス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100113435
【弁理士】
【氏名又は名称】黒木 義樹
(74)【代理人】
【識別番号】100140442
【弁理士】
【氏名又は名称】柴山 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100126653
【弁理士】
【氏名又は名称】木元 克輔
(72)【発明者】
【氏名】竹内 康造
(72)【発明者】
【氏名】安彦 修
【テーマコード（参考）】
2G045
2G059
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045AA40
2G045CB01
2G045CB02
2G045FA19
2G045GB01
2G045JA01
2G045JA07
2G059AA05
2G059BB09
2G059BB14
2G059EE01
2G059EE04
2G059EE07
2G059EE09
2G059FF01
2G059JJ13
2G059JJ22
2G059KK04
2G059MM01
2G059MM05
2G059MM09
2G059MM10
4B029AA07
4B029BB11
4B029CC02
4B029FA11
4B029FA15
4B029GA01
4B029GB06
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA20
4B063QQ08
4B063QS39
4B063QX01
(57)【要約】
【課題】観察対象物中の死細胞領域、特にプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を、非侵襲的に決定する方法を提供すること。
【解決手段】観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法、装置及び情報処理プログラム。
【選択図】なし
【解決手段】観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法、装置及び情報処理プログラム。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法。
【請求項2】
プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定が、屈折率分布データに含まれるピクセル又はボクセルにおける屈折率の空間変化量に基づいて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定が、前記屈折率の空間変化量と閾値の大小関係に基づいて行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記プログラムされた細胞死がアポトーシスである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記観察対象物が細胞塊である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記屈折率分布データが所定の方向における屈折率断層データである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定が、参照観察対象物のプログラムされた細胞死領域データと、前記プログラムされた細胞死領域データに対応する参照観察対象物の屈折率分布データとを含む教師データを用いて学習した学習モデルに、観察対象物の屈折率分布データを入力することによって行われる、請求項１に記載の方法であって、前記学習モデルが利用する特徴量が、屈折率分布データに含まれるピクセル又はボクセルにおける屈折率の空間変化量を含む、方法。
【請求項8】
前記プログラムされた細胞死がアポトーシスである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記観察対象物が細胞塊である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記屈折率分布データが所定の方向における屈折率断層データである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
観察対象物の屈折率分布データを取得する工程と、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によってプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する工程と、を備える、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法。
【請求項12】
前記観察対象物が細胞塊であって、細胞塊に薬物を添加するステップと、細胞塊の屈折率分布データを取得するステップと、請求項１～４、６～８又は１０のいずれか１項に記載の方法によってプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定するステップと、を含む、薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響を解析する方法。
【請求項13】
前記細胞塊が正常細胞塊であって、前記薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響が、薬物の有する細胞毒性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞塊ががん細胞塊であって、前記薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響が、薬物の有する抗がん活性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
観察対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によって観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定部と、を備える、プログラムされた細胞死を起こした細胞領域の決定装置。
【請求項16】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によって観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定ステップをコンピュータに実行させる情報処理プログラム。
【請求項17】
観察対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によって観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定ステップと、をコンピュータに実行させる情報処理プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法、決定部を備える装置及び決定ステップを含む情報処理プログラムに関する。
【背景技術】
【0002】
細胞死には、ネクローシスに代表される外的な要因によって偶発的に引き起こされる細胞死に加えて、アポトーシスに代表されるプログラムされた細胞死と呼ばれる細胞死が存在し、特定の条件下で高度に制御されたプロセスによって細胞が自壊することで、形態形成及び恒常性維持に必要不可欠な役割果たしている。プログラムされた細胞死は、典型的には、適切な形状の組織形成のために淘汰されるべき上皮細胞並びにバクテリア及びウイルス等の微生物に感染した細胞等において生じる。
【0003】
一般に、細胞を個別観察可能な条件下においては、外観から死細胞を判定することは比較的容易である。例えば、２次元培養された接着細胞は、細胞死を起こすと培養容器への接着性を失い、浮遊する。また、浮遊細胞は、細胞死を起こすと形態変化を起こすことが多い。したがって、これらの外観の変化により、死細胞を判定することができる。
【0004】
他方、細胞塊のような３次元的に細胞が密集した環境下においては、死細胞の浮遊又は形態変化が生じづらく、また生じた外観の変化を一細胞単位で詳細観察することは容易でない。細胞塊内部の細胞死の判定は、薬物の細胞死に対する影響の解析方法及び再生医療分野における細胞塊自体の評価方法などとしての応用が期待されており、特に細胞死領域の非侵襲的な決定方法の開発が望まれている。
【0005】
細胞死領域の非侵襲的な決定に関し、例えば特許文献１には、スフェロイドの３次元構造及び光照射した際のピクセル毎の平均輝度情報に基づいて、光照射位置からの距離が異なる複数のスフェロイド断面画像を、光照射位置から測定位置までの距離による信号強度減衰を考慮して補正することによって、スフェロイドの内部の細胞死状態を解析する細胞解析方法が開示されている。また特許文献２には、スフェロイドの領域の輪郭、光学濃度、円形度及び鮮明度の情報に基づいて、スフェロイドを撮像した画像からスフェロイドの崩壊度を評価するスフェロイドの評価方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許第６７９２６１６号公報
【特許文献2】特許第６１２２８１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
既存の細胞死領域の非侵襲的な決定方法は、一細胞単位の高い分解能で死細胞領域を決定することは困難であり、ましてや細胞が起こした細胞死についてその種類を判定することは非常に困難である。このような高分解能かつ細胞死の種類まで特定した細胞死領域の判定には通常蛍光染色が用いられるが、標識が必要となり、かつ透明化処理など煩雑な処理を施さない限り深部観察が困難である。
【0008】
したがって、本開示の目的は、観察対象物中の死細胞領域、特にプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を、非侵襲的に決定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
発明者らは、観察対象物の屈折率分布データを用いると、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定可能であることを見出した。
【0010】
すなわち、本開示の一側面は、観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法である。
【0011】
本開示の他の一側面は、観察対象物の屈折率分布データを取得する工程と、屈折率分布データを用いてプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する工程と、を備える、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法である。
【0012】
本開示の他の一側面は、細胞塊に薬物を添加するステップと、細胞塊の屈折率分布データを取得するステップと、屈折率分布データを用いてプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定するステップと、を含む、薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響を解析する方法である。
【0013】
本開示の他の一側面は、観察対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、屈折率分布データを用いて観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定部と、を備える、プログラムされた細胞死を起こした細胞領域の決定装置である。
【0014】
本開示の他の一側面は、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定ステップをコンピュータに実行させる情報処理プログラムである。
【0015】
本開示の他の一側面は、観察対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定ステップと、をコンピュータに実行させる情報処理プログラムである。
【0016】
より詳細には、本開示は以下の［１］～［２２］に関する。
［１］観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法。
［２］プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定が、屈折率分布データに含まれるピクセル又はボクセルにおける屈折率の空間変化量に基づいて行われる、［１］に記載の方法。
［３］プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定が、上記屈折率の空間変化量と閾値の大小関係に基づいて行われる、［２］に記載の方法。
［４］上記プログラムされた細胞死を起こした細胞が、アポトーシス、ネクロプトーシス、フェロトーシス、パイロトーシス、パータナトス、エントーシス、ネトーシス及びオートファジー細胞死からなる群より選択される１以上の細胞死を起こした細胞を含む、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］上記プログラムされた細胞死を起こした細胞が、アポトーシス、フェロトーシス、パイロトーシス、パータナトス、エントーシス、ネトーシス及びオートファジー細胞死からなる群より選択される１以上の細胞死を起こした細胞を含む、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［６］上記プログラムされた細胞死がアポトーシスである、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［７］上記観察対象物が細胞塊である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］上記屈折率分布データが所定の方向における屈折率断層データである、［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定が、参照観察対象物のプログラムされた細胞死領域データと、前記プログラムされた細胞死領域データに対応する参照観察対象物の屈折率分布データとを含む教師データを用いて学習した学習モデルに、観察対象物の屈折率分布データを入力することによって行われる、［１］に記載の方法。
［１０］プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定が、参照観察対象物のプログラムされた細胞死領域データと、上記プログラムされた細胞死領域データに対応する参照観察対象物の屈折率分布データとを含む教師データを用いて学習した学習モデルに、観察対象物の屈折率分布データを入力することによって行われる、［１］に記載の方法であって、上記学習モデルが利用する特徴量が、屈折率分布データに含まれるピクセル又はボクセルにおける屈折率の空間変化量を含む、方法。
［１１］上記プログラムされた細胞死を起こした細胞が、アポトーシス、ネクロプトーシス、フェロトーシス、パイロトーシス、パータナトス、エントーシス、ネトーシス及びオートファジー細胞死からなる群より選択される１以上の細胞死を起こした細胞を含む、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１２］上記プログラムされた細胞死を起こした細胞が、アポトーシス、フェロトーシス、パイロトーシス、パータナトス、エントーシス、ネトーシス及びオートファジー細胞死からなる群より選択される１以上の細胞死を起こした細胞を含む、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１３］上記プログラムされた細胞死がアポトーシスである、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１４］上記観察対象物が細胞塊である、［９］～［１３］のいずれか１つに記載の方法。
［１５］上記屈折率分布データが所定の方向における屈折率断層データである、［９］～［１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］観察対象物の屈折率分布データを取得する工程と、［１］～［１５］のいずれか１つに記載の方法によってプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する工程と、を備える、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法。
［１７］上記観察対象物が細胞塊であって、細胞塊に薬物を添加するステップと、細胞塊の屈折率分布データを取得するステップと、［１］～［６］、［８］～［１３］又は［１５］のいずれか１つに記載の方法によってプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定するステップと、を含む、薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響を解析する方法。
［１８］上記細胞塊が正常細胞塊であって、上記薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響が、薬物の有する細胞毒性である、［１７］に記載の方法。
［１９］上記細胞塊ががん細胞塊であって、上記薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響が、薬物の有する抗がん活性である、［１７］に記載の方法。
［２０］観察対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定部と、を備える、プログラムされた細胞死を起こした細胞領域の決定装置。
［２１］［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定ステップをコンピュータに実行させる情報処理プログラム。
［２２］観察対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定ステップと、をコンピュータに実行させる情報処理プログラム。
［１］観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法。
［２］プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定が、屈折率分布データに含まれるピクセル又はボクセルにおける屈折率の空間変化量に基づいて行われる、［１］に記載の方法。
［３］プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定が、上記屈折率の空間変化量と閾値の大小関係に基づいて行われる、［２］に記載の方法。
［４］上記プログラムされた細胞死を起こした細胞が、アポトーシス、ネクロプトーシス、フェロトーシス、パイロトーシス、パータナトス、エントーシス、ネトーシス及びオートファジー細胞死からなる群より選択される１以上の細胞死を起こした細胞を含む、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］上記プログラムされた細胞死を起こした細胞が、アポトーシス、フェロトーシス、パイロトーシス、パータナトス、エントーシス、ネトーシス及びオートファジー細胞死からなる群より選択される１以上の細胞死を起こした細胞を含む、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［６］上記プログラムされた細胞死がアポトーシスである、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［７］上記観察対象物が細胞塊である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］上記屈折率分布データが所定の方向における屈折率断層データである、［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定が、参照観察対象物のプログラムされた細胞死領域データと、前記プログラムされた細胞死領域データに対応する参照観察対象物の屈折率分布データとを含む教師データを用いて学習した学習モデルに、観察対象物の屈折率分布データを入力することによって行われる、［１］に記載の方法。
［１０］プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定が、参照観察対象物のプログラムされた細胞死領域データと、上記プログラムされた細胞死領域データに対応する参照観察対象物の屈折率分布データとを含む教師データを用いて学習した学習モデルに、観察対象物の屈折率分布データを入力することによって行われる、［１］に記載の方法であって、上記学習モデルが利用する特徴量が、屈折率分布データに含まれるピクセル又はボクセルにおける屈折率の空間変化量を含む、方法。
［１１］上記プログラムされた細胞死を起こした細胞が、アポトーシス、ネクロプトーシス、フェロトーシス、パイロトーシス、パータナトス、エントーシス、ネトーシス及びオートファジー細胞死からなる群より選択される１以上の細胞死を起こした細胞を含む、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１２］上記プログラムされた細胞死を起こした細胞が、アポトーシス、フェロトーシス、パイロトーシス、パータナトス、エントーシス、ネトーシス及びオートファジー細胞死からなる群より選択される１以上の細胞死を起こした細胞を含む、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１３］上記プログラムされた細胞死がアポトーシスである、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１４］上記観察対象物が細胞塊である、［９］～［１３］のいずれか１つに記載の方法。
［１５］上記屈折率分布データが所定の方向における屈折率断層データである、［９］～［１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］観察対象物の屈折率分布データを取得する工程と、［１］～［１５］のいずれか１つに記載の方法によってプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する工程と、を備える、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法。
［１７］上記観察対象物が細胞塊であって、細胞塊に薬物を添加するステップと、細胞塊の屈折率分布データを取得するステップと、［１］～［６］、［８］～［１３］又は［１５］のいずれか１つに記載の方法によってプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定するステップと、を含む、薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響を解析する方法。
［１８］上記細胞塊が正常細胞塊であって、上記薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響が、薬物の有する細胞毒性である、［１７］に記載の方法。
［１９］上記細胞塊ががん細胞塊であって、上記薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響が、薬物の有する抗がん活性である、［１７］に記載の方法。
［２０］観察対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定部と、を備える、プログラムされた細胞死を起こした細胞領域の決定装置。
［２１］［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定ステップをコンピュータに実行させる情報処理プログラム。
［２２］観察対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する決定ステップと、をコンピュータに実行させる情報処理プログラム。
【発明の効果】
【0017】
本開示によれば、観察対象物中の死細胞領域のうち、特にプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を、非侵襲的に決定することができる方法、装置及び情報処理プログラムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図36】図３６は、本開示の一実施形態に係る閾値法を用いたプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法が、さらに生細胞領域であると決定された領域の細胞ごとの区分化を行うステップと、生細胞単位での屈折率の空間変化量を計算するステップと、計算結果に基づいて生細胞領域及びプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を補正するステップと、を含む場合の、典型的な決定のフローを示す図である。
【図37】図３７は、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法が機械学習法である場合の、プログラムされた細胞死領域データが参照観察対象物の蛍光データから作成される場合の学習ステップにおけるモデルの典型的な学習フローを示す図である。
【図38】図３８は、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法が機械学習法である場合の、プログラムされた細胞死領域データが参照観察対象物の蛍光データから作成される場合の推論ステップにおける典型的な推論フローを示す図である。
【図39】図３９は、本開示の一側面に係る、薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響を解析する方法について、細胞塊に異なる濃度の薬物を添加し、同じ時間培養した後のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域から評価する一例を示した図である。
【図40】図４０は、本開示の一側面に係る、薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響を解析する方法について、細胞塊を一定濃度の薬物の存在下で培養した場合の、時間依存的なプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の推移から評価する一例を示した図である。
【図41】図４１は、実施例１において、スタウロスポリンを添加したＡ５４９細胞塊のうち、観察対象物として用いた６つの細胞塊について、添加したスタウロスポリンの濃度と観察対象物とした細胞塊の直径との関係をプロットした図である。
【図42】図４２は、実施例１において、スタウロスポリンを添加したＡ５４９細胞塊のうち、観察対象物として用いた６つの細胞塊について、添加したスタウロスポリンの濃度と観察対象物とした細胞塊の体積との関係をプロットした図である。
【図45】図４５は、実施例２において、スタウロスポリンを終濃度０，２００及び１０００ｎＭとなるように添加したＡ５４９細胞塊について、閾値法を用いてプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定した場合の、ある断層面におけるプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域（死細胞領域）及び非分断領域（生細胞領域）を示した図である。
【図47】図４７は、実施例３において、スタウロスポリンを添加したＨｅｐＧ２細胞塊のうち、観察対象物として用いた６つの細胞塊について、添加したスタウロスポリンの濃度と観察対象物とした細胞塊の直径との関係をプロットした図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、実施の形態について図面を参照しながら具体的に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。実際の形態は、これらの例示に限定されるものではない。
【0020】
プログラムされた細胞死とは、広義の概念として、細胞死を（Ｉ）偶発的な細胞死（Ａｃｃｉｄｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ、ＡＣＤ）及び（ＩＩ）プログラムされた細胞死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ、ＰＣＤ）あるいは制御された細胞死（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ、ＲＣＤ）の２群に大別した場合に、後者に属する細胞死のことである。プログラムされた細胞死としては、例えば、アポトーシス、ネクロプトーシス、フェロトーシス、パイロトーシス、パータナトス、エントーシス、ネトーシス及びオートファジー細胞死などが知られている。
【0021】
アポトーシスは、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死であり、厳密に制御されたプログラムされた細胞死の態様である。Ｉ型細胞死とも呼ばれ、多細胞生物の形態形成及び恒常性維持において必要不可欠な役割を果たしている。アポトーシスを起こした細胞は、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞膜のブレッビング及び細胞質の凝縮等の形態により特徴づけられる。アポトーシスは、抗悪性腫瘍薬（以下では、抗がん剤とも記載する。）のがん細胞殺傷メカニズムの１つである。すなわち、ある種の抗がん剤は、がん細胞特異的な反応又は環境を利用して、がん細胞選択的なアポトーシスを誘導する。一方で、任意の薬効を有する薬物がアポトーシスを誘導する作用を有することは副作用の原因となる可能性があり、特に神経細胞のアポトーシスを誘導する場合には神経毒性の原因となりうる。また、酸化ストレスにさらされた細胞においては、低酸素誘導因子（ＨＩＦ１α）の分解が抑制され、アポトーシスが誘導されることが知られている。
【0022】
ネクロプトーシスは、ネクローシス（壊死）と類似した形態を示すプログラムされた細胞死であり、例えば、アポトーシスが阻害された場合に活性化される細胞の自己破壊のプロセスである。ネクロプトーシスを起こした細胞は、ネクローシスを起こした細胞同様、細胞の膨張及び細胞膜の崩壊等の形態により特徴づけられる一方で、アポトーシスのような顕著な染色体凝縮は見られない。
【0023】
フェロトーシスは、鉄イオン依存性のプログラムされた細胞死であり、高濃度の遊離鉄（ＩＩ）イオン存在下においてグルタチオンによる抗酸化機構が崩壊し、過酸化脂質が異常蓄積することによって引き起こされる細胞死である。フェロトーシスを起こした細胞は、ミトコンドリアの縮小、ミトコンドリアのクリステの減少及びミトコンドリアの膜密度の増加等の形態により特徴づけられる。
【0024】
パイロトーシスは、細菌やウイルス等に感染した細胞が自発的に引き起こすことで知られるプログラムされた細胞死である。パイロトーシスにおいてはインフラマソームの活性化が生じ、最終的には細胞膜に生じた小孔から水が流入することにより細胞が破裂して細胞死が誘導される。パイロトーシスを起こした細胞は、膨張を伴わない細胞膜の崩壊等の形態により特徴づけられる一方で、アポトーシスのような顕著な染色体凝縮は見られない。
【0025】
パータナトスは、酸化ストレスにより生じたＤＮＡ損傷及び虎斑融解（クロマトライシス）により誘起される、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）依存性のプログラムされた細胞死である。同じく酸化ストレスにより誘起されるアポトーシスと異なり、パータナトスにおいてはＤＮＡの断片化は見られない。パータナトスを起こした細胞は、クロマチンの凝縮及び細胞膜のインテグリティの消失等の形態により特徴づけられる。
【0026】
エントーシスは、１つの細胞が他の細胞の細胞死を誘導する、いわば細胞の共食いとも言うべきプログラムされた細胞死の態様である。一般にエントーシスは上皮組織のがん細胞において生じ、例えば異常増殖状態、飢餓状態及び着状態等において見られる。エントーシスを起こした細胞は、細胞の中に細胞が存在する形態（Ｃｅｌｌ－ｉｎ－ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）により特徴づけられる。
【0027】
ネトーシスは、損傷状態又は感染状態に置かれた細胞が、ＮＥＴと呼ばれるＤＮＡとタンパク質のネット様の複合体の放出を伴って自壊するプログラムされた細胞死の態様であり、典型的には好中球において見られる。放出されたＮＥＴは、バクテリアやウイルス等を捕捉してこれらの貪食を促進する作用を有する。ＮＥＴは核内に存在するクロマチン及びＤＮＡを構成要素として含むため、ネトーシスを起こした細胞は、細胞膜の崩壊及び核膜の崩壊等の形態によって特徴づけられる。
【0028】
オートファジー細胞死は、オートファジーの異常活性化に由来するプログラムされた細胞死の態様である。オートファジーの異常活性化に由来する細胞死には、例えば鉄イオン結合性タンパク質の異常分解による鉄イオン（ＩＩ）濃度上昇を伴ったフェロトーシスや、アポトーシス制御関連タンパク質の異常分解によるアポトーシスも存在するが、狭義の意味でのオートファジー細胞死は、オートファジーの異常活性化によって生じる栄養欠乏、又は異常なタンパク分解によって生じたペプチド断片によるＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰアーゼ阻害による細胞死である。オートファジー細胞死を起こした細胞は、小胞体構造の断片化若しくは消失、核周囲の局所的な膨張及びオートファジーの基質と細胞間の強固な接着に特徴づけられる。
【0029】
本開示の一実施形態において、プログラムされた細胞死を起こした細胞は、アポトーシス、ネクロプトーシス、フェロトーシス、パイロトーシス、パータナトス、エントーシス、ネトーシス及びオートファジー細胞死からなる群より選択される１以上の細胞死を起こした細胞であり、他の一実施形態において、プログラムされた細胞死を起こした細胞は、アポトーシス、フェロトーシス、パイロトーシス、パータナトス、エントーシス、ネトーシス及びオートファジー細胞死からなる群より選択される１以上の細胞死を起こした細胞である。一実施形態において、プログラムされた細胞死は、アポトーシスである。
【0030】
本開示の一実施形態に係る観察対象物は、細胞を主成分として構成される物体であるが、細胞の他にも組織試料に含有されることがあるコンポーネント、例えば細胞外マトリックス及び中性脂肪など、を含んでいてもよい。本開示の一実施形態に係る観察対象物は、再現性の高さ及び試料調製の容易性を両立する観点から、細胞の培養体であってもよく、さらに生理的環境に近い環境も並立する観点から、細胞塊であってもよい。観察対象物が細胞塊である場合には、外観を指標としては評価することができない細胞塊内部のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定することが可能である。すなわち、一実施形態に係る観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域は、細胞塊内部のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域であってもよい。細胞塊内部とは、細胞塊を形成する細胞のうち、細胞塊の表面に露出していない細胞を意味する。観察対象物が細胞の培養体である場合、培養体は１種の細胞からなってもよく、２種以上の細胞を含んでもよい。観察対象物が細胞塊である場合、その最大径は１００～２００μｍであってもよい。
【0031】
屈折率分布データとは、観察対象物を含む空間中のボクセル毎の屈折率の３次元分布を示すデータ又は観察対象物を含む空間の所定の方向における断層面内のピクセル毎の屈折率の２次元分布を示すデータである。また、屈折率断層データとは、屈折率分布データのうち、観察対象物を含む空間の所定の方向における断層面内のピクセル毎の屈折率の２次元分布を示すデータである。
【0032】
本開示の一実施形態に係る屈折率分布データを取得する方法（以下、「屈折率分布測定方法」ともいう。）は特に限定されないが、方法について以下に詳述する。観察対象物の屈折率分布を非染色・非侵襲で測定する方法として、光回折トモグラフィ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＯＤＴ）が知られている。ＯＤＴは、定量位相イメージング（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｈａｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ、ＱＰＩ）を３次元イメージング可能な技術に発展させたものであり、観察対象物の３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。
【0033】
以下に説明する屈折率分布測定方法Ａ～Ｃが用いられる。屈折率分布測定方法Ａには屈折率分布測定方法Ａ１～Ａ３の態様がある。屈折率分布測定方法Ａ１～Ａ３を総称して屈折率分布測定方法Ａという。これらの屈折率分布測定方法Ａ～Ｃは、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響が低減された３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。
【0034】
なお、他の染色・非侵襲のイメージング技術として、光コヒーレンス・トモグラフィ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＯＣＴ）も知られている。しかし、ＯＣＴの分解能は１０μｍ程度であるのに対して、ＯＤＴ及び屈折率分布測定方法Ａ～Ｃの分解能は１μｍ程度である。また、ＯＣＴは、屈折率分布を求めるものではなく、イメージングにより得られた信号の生物学的な解釈が難しい。これらの点で、ＯＤＴ及び屈折率分布測定方法Ａ～Ｃは、ＯＣＴより優位である。
【0035】
【0036】
図Ａ０１は、観察装置１Ａの構成を示す図である。この観察装置１Ａは、光源１１、レンズ１２、レンズ２１、ミラー２２、レンズ２３、コンデンサレンズ２４、対物レンズ２５、ビームスプリッタ４１、レンズ４２、撮像部４３及び解析部５０などを備える。
【0037】
光源１１は、空間的・時間的にコヒーレントな光を出力するものであり、レーザ光源であってもよい。レンズ１２は、光源１１と光学的に接続されており、光源１１から出力された光を光ファイバ１４の光入射端１３に集光して、その光を光入射端１３に入射させる。光ファイバ１４は、レンズ１２により光入射端１３に入射された光をファイバカプラ１５へ導光する。ファイバカプラ１５は、光ファイバ１４と光ファイバ１６，１７との間で光を結合するものであり、光ファイバ１４により導光されて到達した光を２分岐して、一方の分岐光を光ファイバ１６により導光させ、他方の分岐光を光ファイバ１７によりさせる。光ファイバ１６により導光された光は光出射端１８から発散光として出射される。光ファイバ１７により導光された光は光出射端１９から発散光として出射される。
【0038】
レンズ２１は、光出射端１８と光学的に接続されており、光出射端１８から発散光として出力された光をコリメートする。ミラー２２は、レンズ２１と光学的に接続されており、レンズ２１から到達した光をレンズ２３へ反射させる。ミラー２２の反射面の方位は可変である。レンズ２３は、ミラー２２と光学的に接続されている。コンデンサレンズ２４は、レンズ２３と光学的に接続されている。レンズ２３及びコンデンサレンズ２４は、４ｆ光学系を構成してもよい。レンズ２３及びコンデンサレンズ２４は、ミラー２２の反射面の方位に応じた光照射方向から観察対象物Ｓに対して光を照射する。対物レンズ２５は、コンデンサレンズ２４と光学的に接続されている。対物レンズ２５とコンデンサレンズ２４との間に観察対象物Ｓが配置される。対物レンズ２５は、コンデンサレンズ２４から出力されて観察対象物Ｓを経た光（物体光）を入力し、その光をビームスプリッタ４１へ出力する。
【0039】
ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５と光学的に接続され、また、光出射端１９とも光学的に接続されている。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、光出射端１９から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光をレンズ４２へ出力する。レンズ４２は、ビームスプリッタ４１と光学的に接続されており、ビームスプリッタ４１から到達した物体光及び参照光それぞれをコリメートして撮像部４３へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２と光学的に接続されており、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は傾斜している。ビームスプリッタ４１により物体光と参照光とが合波される位置は、結像レンズより後段であってもよいが、収差の影響を考慮すると、図に示されるように対物レンズ２５とレンズ４２との間であるのが望ましい。
【0040】
解析部５０は、撮像部４３と電気的に接続されており、撮像部４３により撮像された干渉強度画像を入力する。解析部５０は、その入力した干渉強度画像を処理することにより、観察対象物Ｓの３次元屈折率分布を算出する。解析部５０は、コンピュータであってよい。解析部５０は、干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５、屈折率分布算出部５６、表示部５７及び記憶部５８を備える。
【0041】
干渉強度画像取得部５１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。また、干渉強度画像取得部５１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。干渉強度画像取得部５１は、ＣＰＵを含み、ミラー２２の反射面の方位を変化させる為の制御信号を出力する出力ポートを有し、また、撮像部４３から干渉強度画像を入力する入力ポートを有する。対物レンズ２５を光軸方向に移動させる必要はない。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。
【0042】
第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５及び屈折率分布算出部５６は、干渉強度画像に基づいて処理を行うものであり、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＤＳＰ又はＦＰＧＡ等の処理装置を含む。表示部５７は、処理すべき画像、処理途中の画像及び処理後の画像などを表示するものであり、例えば液晶ディスプレイを含む。記憶部５８は、各種の画像のデータを記憶するものであり、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭ及びＲＯＭ等を含む。第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５、屈折率分布算出部５６及び記憶部５８は、クラウドコンピューティングによって構成されてもよい。
【0043】
記憶部５８は、干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５及び屈折率分布算出部５６に各処理を実行させるためのプログラムをも記憶する。このプログラムは、観察装置１Ａの製造時又は出荷時に記憶部５８に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部５８に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部５８に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ＢＤ－ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。
【0044】
干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５及び屈折率分布算出部５６それぞれの処理の詳細については後述する。
【0045】
【0046】
レンズ３１は、光出射端１９と光学的に接続されており、光出射端１９から発散光として出力された光（参照光）をコリメートする。ミラー３２は、レンズ３１と光学的に接続されており、レンズ３１から到達した光をレンズ３４へ反射させる。レンズ３４は、ミラー３２と光学的に接続されており、ミラー３２から到達した光をビームスプリッタ４１へ出力する。レンズ３４から出力された光は、ビームスプリッタ４１の手前で一旦集光された後、発散光としてビームスプリッタ４１に入力される。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、レンズ３４から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光を同軸にしてレンズ４２へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は平行である。
【0047】
駆動部３３は、ミラー３２の反射面に垂直な方向にミラー３２を移動させる。駆動部３３は例えばピエゾアクチュエータである。このミラー３２の移動により、ファイバカプラ１５における光分岐からビームスプリッタ４１における合波に至るまでの物体光及び参照光それぞれの光路長の差（位相差）を変化させる。この光路長差が異なると、撮像部４３により撮像される干渉強度画像も異なる。
【0048】
観察装置は、図Ａ０１及び図Ａ０２の構成例に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。観察装置１Ａ及び観察装置１Ｂの構成では観察対象物Ｓを透過した物体光を観察したが、以下に説明する観察装置１Ｃの構成のように観察対象物Ｓで反射された物体光を観察してもよい。
【0049】
図Ａ０３は、観察装置１Ｃの構成を示す図である。観察装置１Ｃは、光源１１、レンズ１２、レンズ２１、ミラー２２、レンズ２３、対物レンズ２５、ビームスプリッタ４１、レンズ４２、撮像部４３及び解析部５０などを備える。以下では、観察装置１Ａ（図Ａ０１）と相違する点について主に説明する。
【0050】
レンズ２１は、光ファイバ１６の光出射端１８と光学的に接続されており、光出射端１８から発散光として出力された光をコリメートする。ミラー２２は、レンズ２１と光学的に接続されており、レンズ２１から到達した光をレンズ２３へ反射させる。ミラー２２の反射面の方位は可変である。レンズ２３は、ミラー２２と光学的に接続されている。対物レンズ２５は、レンズ２３と光学的に接続されている。レンズ２３と対物レンズ２５との間にビームスプリッタ４１が配置されている。レンズ２３及び対物レンズ２５は、４ｆ光学系を構成してもよい。レンズ２３及び対物レンズ２５は、ミラー２２の反射面の方位に応じた光照射方向から観察対象物Ｓに対して光を照射する。対物レンズ２５は、観察対象物Ｓで反射された光（物体光）を入力し、その光をビームスプリッタ４１へ出力する。
【0051】
ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５と光学的に接続され、また、光ファイバ１７の光出射端１９とも光学的に接続されている。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、光出射端１９から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光をレンズ４２へ出力する。レンズ４２は、ビームスプリッタ４１と光学的に接続されており、ビームスプリッタ４１から到達した物体光及び参照光それぞれをコリメートして撮像部４３へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２と光学的に接続されており、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は傾斜している。ビームスプリッタ４１により物体光と参照光とが合波される位置は、結像レンズより後段であってもよいが、収差の影響を考慮すると、図に示されるように対物レンズ２５とレンズ４２との間であるのが望ましい。
【0052】
観察装置１Ｃ（図Ａ０３）の構成において、観察装置１Ｂ（図Ａ０２）と同様に参照光の光路長を変化させる機構（図Ａ０２中のレンズ３１、ミラー３２、駆動部３３及びレンズ３４）を設けて、ファイバカプラ１５における光分岐からビームスプリッタ４１における合波に至るまでの物体光及び参照光それぞれの光路長の差（位相差）を変化させてもよい。この場合、撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は平行であってよい。
【0053】
図Ａ０４は、屈折率分布測定方法Ａのフローチャートである。この屈折率分布測定方法Ａは、観察装置１Ａ～１Ｃの何れを用いた場合においても可能なものである。この屈折率分布測定方法Ａは、干渉強度画像取得ステップＳ１、第１複素振幅画像生成ステップＳ２、第２複素振幅画像生成ステップＳ３、２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５及び屈折率分布算出ステップＳ６を備える。
【0054】
干渉強度画像取得ステップＳ１の処理は干渉強度画像取得部５１により行われる。第１複素振幅画像生成ステップＳ２の処理は第１複素振幅画像生成部５２により行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ３の処理は第２複素振幅画像生成部５３により行われる。２次元位相画像生成ステップＳ４の処理は２次元位相画像生成部５４により行われる。３次元位相画像生成ステップＳ５の処理は３次元位相画像生成部５５により行われる。屈折率分布算出ステップＳ６の処理は屈折率分布算出部５６により行われる。
【0055】
干渉強度画像取得ステップＳ１において、干渉強度画像取得部５１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。そして、干渉強度画像取得部５１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。
【0056】
図Ａ０１～図Ａ０３それぞれにおいて説明の便宜のためにｘｙｚ直交座標系が示されている。ｚ軸は対物レンズ２５の光軸に対し平行である。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。この位置をｚ＝０とする。観察対象物Ｓへの光照射方向は、その照射光の波数ベクトル（ｋｘ，ｋｙ，ｋｚ）のうちのｋｘ及びｋｙにより表すことができる。
【0057】
図Ａ０５（ａ）～（ｃ）は、干渉強度画像取得ステップＳ１における観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。この図では、横軸をｋｘとし縦軸をｋｙとしたｋｘｋｙ平面において各々の丸印の位置が光照射方向を表している。光照射方向の走査は、図Ａ０５（ａ）に示されるようにｋｘｋｙ平面において矩形格子状に配置されるようなものであってもよいし、図Ａ０５（ｂ）に示されるようにｋｘｋｙ平面において同心の複数の円それぞれの周上に配置されるようなものであってもよいし、また、図Ａ０５（ｃ）に示されるようにｋｘｋｙ平面において螺旋状に配置されるようなものであってもよい。何れの場合にも、コンデンサレンズ２４の開口数（ＮＡ：Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ａｐｅｒｔｕｒｅ）の許す限りで光照射方向の走査が可能である。ラスタスキャン及びランダムスキャンの何れであってもよい。ラスタスキャンの場合には、戻りスキャンが有ってもよいし無くてもよい。
【0058】
第１複素振幅画像生成ステップＳ２において、第１複素振幅画像生成部５２は、複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像取得部５１により取得された基準位置の干渉強度画像に基づいて、基準位置の複素振幅画像を生成する。観察装置１Ａ（図Ａ０１）及び観察装置１Ｃ（図Ａ０３）の場合には、第１複素振幅画像生成部５２は、フーリエ縞解析法により、１枚の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。観察装置１Ｂ（図Ａ０２）の場合には、第１複素振幅画像生成部５２は、位相シフト法により、物体光と参照光との間の光路長差（位相差）が互いに異なる３枚以上の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。
【0059】
第２複素振幅画像生成ステップＳ３において、第２複素振幅画像生成部５３は、複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成部５２により生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する。基準位置の複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，０）の２次元フーリエ変換をＵ（ｋｘ，ｋｙ，０）とすると、ｚ＝ｄの位置の複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，ｄ）、及び、この複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，ｄ）の２次元フーリエ変換Ｕ（ｋｘ，ｋｙ，ｄ）は、下記式で表される。ｉは虚数単位であり、ｋ０は観察対象物中における光の波数である。
【0060】
【数1】
【0061】
【数2】
【0062】
２次元位相画像生成ステップＳ４において、２次元位相画像生成部５４は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部５３により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。ここで生成される２次元位相画像は、フォーカスを合わせたｚ方向位置を中心とする位相画像に相当する。２次元位相画像生成ステップＳ４の詳細については後述する。
【0063】
なお、第２複素振幅画像生成ステップＳ３において複数の光照射方向それぞれについて複数の位置それぞれの複素振幅画像を全て生成した後に、２次元位相画像生成ステップＳ４以降の処理を行ってもよい。また、第２複素振幅画像生成ステップＳ３において複数の光照射方向それぞれについて或る１つのｚ方向位置の複素振幅画像を生成し、該位置の２次元位相画像を２次元位相画像生成ステップＳ４において生成する処理を単位として、ｚ方向位置を走査しながら当該単位処理を繰り返し行ってもよい。後者の場合には、記憶部５８が記憶しておくべき画像データの容量を小さくすることができる。
【0064】
３次元位相画像生成ステップＳ５において、３次元位相画像生成部５５は、２次元位相画像生成部５４により生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する。ここで生成される３次元位相画像は、２次元位相画像中での位置ｘ，ｙ及び該２次元位相画像の位置ｚを変数とする画像である。
【0065】
屈折率分布算出ステップＳ６において、屈折率分布算出部５６は、３次元位相画像生成部５５により生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより観察対象物の３次元屈折率分布を求める。観察対象物の屈折率分布をｎ（ｘ，ｙ，ｚ）とし、電気感受率分布をｆ（ｘ，ｙ，ｚ）とし、背景の媒質の屈折率をｎｍとすると、両者の間には下記（３）式の関係がある。３次元位相画像生成部５５により生成された３次元位相画像Φ（ｘ，ｙ，ｚ）は、下記（４）式のとおり、カーネル関数ｇ（ｘ，ｙ，ｚ）と電気感受率分布ｆ（ｘ，ｙ，ｚ）とのコンボリューションで表される。したがって、観察対象物の３次元屈折率分布ｎ（ｘ，ｙ，ｚ）は、３次元位相画像Φ（ｘ，ｙ，ｚ）に基づいてデコンボリューションにより求めることができる。
【0066】
【数3】
【0067】
【数4】
なお、カーネル関数ｇは、波動方程式の解に対応するグリーン関数に基づくものである。図Ａ０６は、カーネル関数ｇを説明する図である。この図において、カーネル関数ｇの値が最も大きい中心位置が原点であり、縦方向がｚ軸であり、横方向がｚ軸に垂直な方向である。
【0068】
また、第１複素振幅画像生成ステップＳ２、第２複素振幅画像生成ステップＳ３、２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５及び屈折率分布算出ステップＳ６の各処理は、所定の数の光照射方向それぞれの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得される度に行われてもよいし（図Ａ０７）、１つの光照射方向の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得される度に行われてもよい（図Ａ０８）。
【0069】
図Ａ０７及び図Ａ０８は、干渉強度画像取得ステップＳ１における観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。これらの図では、横軸をｋｘとし縦軸をｋｙとしたｋｘｋｙ平面において各々の丸印の位置が光照射方向を表している。これらの図に示される光照射方向の走査の例では、光照射方向を順次変更していき、第（Ｎ＋ｎ）の干渉強度画像取得時の光照射方向を第ｎの干渉強度画像取得時の光照射方向と一致させている。ｎは正の整数であり、Ｎは２以上の整数である。
【0070】
図Ａ０７に示される例では、第１～第Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第１～第Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図Ａ０７（ａ））。次に、第（Ｎ＋１）～第２Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第（Ｎ＋１）～第２Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図Ａ０７（ｂ））。次に、第（２Ｎ＋１）～第３Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第（２Ｎ＋１）～第３Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる。以降も同様である。
【0071】
図Ａ０８に示される例では、第１～第Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第１～第Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図Ａ０８（ａ））。次に、第（Ｎ＋１）の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、この第（Ｎ＋１）の干渉強度画像を含む直近のＮ枚の干渉強度画像（第２～第（Ｎ＋１）の干渉強度画像）に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図Ａ０８（ｂ））。次に、第（Ｎ＋２）の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、この第（Ｎ＋２）の干渉強度画像を含む直近のＮ枚の干渉強度画像（第３～第（Ｎ＋２）の干渉強度画像）に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図Ａ０８（ｃ））。以降も同様にして、第（Ｎ＋ｎ）の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、この第（Ｎ＋ｎ）の干渉強度画像を含む直近のＮ枚の干渉強度画像（第（１＋ｎ）～第（Ｎ＋ｎ）の干渉強度画像）に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる。
【0072】
図Ａ０７に示された例と比較すると、図Ａ０８に示された例では、１つの光照射方向の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得される度に、その干渉強度画像を含む直近の複数の干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われるので、ステップＳ２～Ｓ６の各処理により単位時間当たりに得られる各画像の数が多い。
【0073】
次に、屈折率分布測定方法Ａにおける２次元位相画像生成ステップＳ４の詳細について説明する。２次元位相画像生成ステップＳ４において、２次元位相画像生成部５４は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部５３により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。２次元位相画像生成ステップＳ４は、屈折率分布測定方法Ａ１～Ａ３の何れであるかによって異なる。
【0074】
図Ａ０９は、屈折率分布測定方法Ａ１における２次元位相画像生成ステップＳ４のフローチャートである。屈折率分布測定方法Ａ１における２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ１１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、ステップＳ１２において、この複素振幅総和画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
【0075】
ステップＳ１１の処理は、ＣＡＳＳ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（Ｓｕｎｇｓａｍ Ｋａｎｇ， ｅｔ ａｌ， “Ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｅｐ ｗｉｔｈｉｎ ａ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｕｓｉｎｇ ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｃａｔｔｅｒｅｄ ｗａｖｅｓ，” ＮＡＴＵＲＥ ＰＨＯＴＯＮＩＣＳ， Ｖｏｌ．９， ｐｐ．２５３－２５８ （２０１５）．）技術によるものである。或る光照射方向に沿って対象物に照射されて該対象物を経た光のうち、対象物と一回のみ相互作用した単一散乱光の空間周波数分布は光照射方向に応じてシフトしているのに対して、対象物と複数回相互作用した多重散乱光の空間周波数分布は光照射方向によってランダムに変化する。ＣＡＳＳ技術は、このような単一散乱光及び多重散乱光それぞれの空間周波数分布の光照射方向依存性の相違を利用する。
【0076】
すなわち、ステップＳ１１では、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正する（つまり、空間周波数領域において複素振幅画像の空間周波数分布を光照射方向に応じて平行移動する）ことにより、複素振幅画像のうちの単一散乱光成分の空間周波数分布を光照射方向に依存しない形状及び配置とし、その一方で、複素振幅画像のうちの多重散乱光成分の空間周波数分布をランダムな形状及び配置とする。そして、ステップＳ１１では、これら補正後の複数の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成する（つまり、合成開口処理をする）ことにより、複素振幅画像のうちの単一散乱光成分をコヒーレントに足し合わせ、その一方で、複素振幅画像のうちの多重散乱光成分を互いに相殺させる。
【0077】
したがって、ステップＳ１１で生成される複素振幅総和画像は、多重散乱光の影響が低減されたものとなる。そして、最終的に屈折率分布算出ステップＳ６で得られる３次元屈折率分布も、多重散乱光の影響が低減されて、スペックルが抑制され、単一散乱－多重散乱比（Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｔｏ Ｍｕｌｔｉ－ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｒａｔｉｏ、ＳＭＲ）が改善されたものとなる。
【0078】
図Ａ１０は、屈折率分布測定方法Ａ２における２次元位相画像生成ステップＳ４のフローチャートである。屈折率分布測定方法Ａ２における２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ２１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ２２において、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ２３において、位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
【0079】
ｚ＝ｄの位置の複素振幅画像をｕ（ｘ，ｙ，ｄ）とすると、ステップＳ２１で生成される複素微分干渉画像ｑ（ｘ，ｙ，ｄ）は下記（５）式で表される。δｘ及びδｙのうち少なくとも一方は非０である。δｘ≠０，δｙ＝０であれば、ｘ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。δｘ＝０，δｙ≠０であれば、ｙ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。δｘ≠０，δｙ≠０であれば、ｘ方向及びｙ方向の何れとも異なる方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。なお、複素微分干渉画像ｑ（ｘ，ｙ，ｄ）は、複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，ｄ）を下記（６）式のように変換した後に（５）式で求めてもよい。
【0080】
【数5】
【0081】
【数6】
複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像ｑの総和をｑｓｕｍ（ｘ，ｙ，ｄ）とすると、ステップＳ２２で生成される位相微分画像φ（ｘ，ｙ，ｚ）は、ｑｓｕｍ（ｘ，ｙ，ｄ）の位相として下記（７）式で表される。ステップＳ２３では、この位相微分画像φ（ｘ，ｙ，ｚ）を積分又はデコンボリューションすることにより、２次元位相画像を生成することができる。
【0082】
【数7】
なお、ステップＳ２１において、複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成してもよい。この場合、２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ２１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ２２において、複数のシアー方向それぞれについて、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ２３において、複数のシアー方向それぞれの位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
【0083】
ステップＳ２２で複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて生成される位相微分画像は、多重散乱光の影響が低減されたものとなる。そして、最終的に屈折率分布算出ステップＳ６で得られる３次元屈折率分布も、多重散乱光の影響が低減されて、スペックルが抑制されたものとなる。また、ステップＳ２１において複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成する場合には、ステップＳ２３で得られる２次元位相画像にライン状のノイズが現れるのを抑制することができる。
【0084】
ここでは、ステップＳ２３において位相微分画像を積分又はデコンボリューションすることにより２次元位相画像を生成する場合を説明した。しかし、位相微分画像を２次元位相画像として扱うこともできる。この場合、ステップＳ２３を行うことなく、屈折率分布算出ステップＳ６７のデコンボリューションにおいて、ステップＳ２３のデコンボリューションで用いたカーネルを含むカーネル（図Ａ１１）を用いることにより、ステップＳ２２で生成された位相微分画像（２次元位相画像）から観察対象物の３次元屈折率分布を求めることができる。図Ａ１１に示されるカーネルは、図Ａ０６に示したカーネルとステップＳ２３のデコンボリューションで用いるカーネルとを畳み込み積分することにより得られる。
【0085】
図Ａ１２は、屈折率分布測定方法Ａ３における２次元位相画像生成ステップＳ４のフローチャートである。屈折率分布測定方法Ａ３における２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ３１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分し、複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、ステップＳ３２において、複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ３３において、複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ３４において、位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
【0086】
屈折率分布測定方法Ａ３のステップＳ３１の処理は、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分した上で、複数のバッチそれぞれについて屈折率分布測定方法Ａ１のステップＳ１１の処理を行うことに相当する。屈折率分布測定方法Ａ３のステップＳ３２，Ｓ３３の処理は、複数のバッチそれぞれについて屈折率分布測定方法Ａ２のステップＳ２１，Ｓ２２の処理を行うことに相当する。屈折率分布測定方法Ａ３のステップＳ３４の処理は、屈折率分布測定方法Ａ２のステップＳ２３の処理を行うことに相当する。
【0087】
なお、ステップＳ３２において、複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成してもよい。この場合、２次元位相画像生成ステップＳ４は、ステップＳ３２において、複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ３３において、複数のシアー方向それぞれについて、複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ３４において、複数のシアー方向それぞれの位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
【0088】
屈折率分布測定方法Ａ３におけるスペックルの抑制は、屈折率分布測定方法Ａ１及び屈折率分布測定方法Ａ２と同程度である。屈折率分布測定方法Ａ３におけるＳＭＲの改善は、屈折率分布測定方法Ａ１と屈折率分布測定方法Ａ２との中間の程度である。
【0089】
ここでも、ステップＳ３４において位相微分画像を積分又はデコンボリューションすることにより２次元位相画像を生成する場合を説明した。しかし、位相微分画像を２次元位相画像として扱うこともできる。この場合、ステップＳ３４を行うことなく、屈折率分布算出ステップＳ６のデコンボリューションにおいて、ステップＳ３４のデコンボリューションで用いたカーネルを含むカーネルを用いることにより、ステップＳ３３で生成された位相微分画像（２次元位相画像）から観察対象物の３次元屈折率分布を求めることができる。
【0090】
次に、屈折率分布測定方法Ｂについて説明する。図Ｂ０１～図Ｂ０３は、屈折率分布測定方法Ｂによる屈折率分布を測定する際に用いることができる観察装置１Ｄ～１Ｆの各構成を示す図である。図Ｂ０１に示される観察装置１Ｄは、図Ａ０１に示された観察装置１Ａの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部６０を備える点で相違する。図Ｂ０２に示される観察装置１Ｅは、図Ａ０２に示された観察装置１Ｂの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部６０を備える点で相違する。図Ｂ０３に示される観察装置１Ｆは、図Ａ０３に示された観察装置１Ｃの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部６０を備える点で相違する。
【0091】
解析部６０は、撮像部４３と電気的に接続されており、撮像部４３により撮像された干渉強度画像を入力する。解析部６０は、その入力した干渉強度画像を処理することにより、観察対象物Ｓの３次元屈折率分布を算出する。解析部６０は、コンピュータであってよい。解析部６０は、干渉強度画像取得部６１、第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６、屈折率分布算出部６７、表示部６８及び記憶部６９を備える。
【0092】
干渉強度画像取得部６１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。また、干渉強度画像取得部６１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。干渉強度画像取得部６１は、ＣＰＵを含み、ミラー２２の反射面の方位を変化させる為の制御信号を出力する出力ポートを有し、また、撮像部４３から干渉強度画像を入力する入力ポートを有する。対物レンズ２５を光軸方向に移動させる必要はない。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。
【0093】
第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６及び屈折率分布算出部６７は、干渉強度画像に基づいて処理を行うものであり、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＤＳＰ又はＦＰＧＡ等の処理装置を含む。表示部６８は、処理すべき画像、処理途中の画像及び処理後の画像などを表示するものであり、例えば液晶ディスプレイを含む。記憶部６９は、各種の画像のデータを記憶するものであり、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭ及びＲＯＭ等を含む。第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６、屈折率分布算出部６７及び記憶部６９は、クラウドコンピューティングによって構成されてもよい。
【0094】
記憶部６９は、干渉強度画像取得部６１、第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６及び屈折率分布算出部６７に各処理を実行させるためのプログラムをも記憶する。このプログラムは、観察装置１Ｄ～１Ｆの製造時又は出荷時に記憶部６９に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部６９に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部６９に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ＢＤ－ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。
【0095】
干渉強度画像取得部６１、第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６及び屈折率分布算出部６７それぞれの処理の詳細については後述する。
【0096】
図Ｂ０４は、屈折率分布測定方法Ｂのフローチャートである。この屈折率分布測定方法Ｂは、観察装置１Ｄ～１Ｆの何れを用いた場合においても可能なものである。この屈折率分布測定方法Ｂは、干渉強度画像取得ステップＳ６１、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３、位相共役演算ステップＳ６４、２次元位相画像生成ステップＳ６５、３次元位相画像生成ステップＳ６６及び屈折率分布算出ステップＳ６７を備える。
【0097】
干渉強度画像取得ステップＳ６１の処理は干渉強度画像取得部６１により行われる。第１複素振幅画像生成ステップＳ６２の処理は第１複素振幅画像生成部６２により行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理は第２複素振幅画像生成部６３により行われる。位相共役演算ステップＳ６４の処理は位相共役演算部６４により行われる。２次元位相画像生成ステップＳ６５の処理は２次元位相画像生成部６５により行われる。３次元位相画像生成ステップＳ６６の処理は３次元位相画像生成部６６により行われる。屈折率分布算出ステップＳ６７の処理は屈折率分布算出部６７により行われる。
【0098】
干渉強度画像取得ステップＳ６１において、干渉強度画像取得部６１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。そして、干渉強度画像取得部６１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。
【0099】
第１複素振幅画像生成ステップＳ６２において、第１複素振幅画像生成部６２は、複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像取得部６１により取得された基準位置の干渉強度画像に基づいて、基準位置の複素振幅画像を生成する。観察装置１Ｄ（図Ｂ０１）及び観察装置１Ｆ（図Ｂ０３）の場合には、第１複素振幅画像生成部６２は、フーリエ縞解析法により、１枚の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。観察装置１Ｅ（図Ｂ０２）の場合には、第１複素振幅画像生成部６２は、位相シフト法により、物体光と参照光との間の光路長差（位相差）が互いに異なる３枚以上の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。
【0100】
第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、第２複素振幅画像生成部６３は、複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成部６２により生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する。
【0101】
屈折率分布測定方法Ｂにおける干渉強度画像取得ステップＳ６１、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２及び第２複素振幅画像生成ステップＳ６３は、それぞれ、屈折率分布測定方法Ａにおける干渉強度画像取得ステップＳ１、第１複素振幅画像生成ステップＳ２及び第２複素振幅画像生成ステップＳ３と同様の処理を行う。
【0102】
位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の後に行われる。位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の前に行われてもよい（後述）。また、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３が基準位置の複素振幅画像から複数段階を経て或るｚ位置の複素振幅画像を生成する場合には、その複数段階のうちの或る段階と次の段階との間において位相共役演算ステップＳ６４が行われてもよい（後述）。位相共役演算ステップＳ６４において、位相共役演算部６４は、複数の照射方向それぞれの複素振幅画像に対して位相共役演算を行って、観察対象物に対する光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する。
【0103】
なお、位相共役演算は、位相共役法（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）に基づく複素振幅画像に対する演算であり、対象物における光照射と光出力との関係を表すトランスミッション行列を計算し、その逆行列計算と座標変換と含む演算である。位相共役法は、位相共役（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、時間反転法（ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｍｅｔｈｏｄ）、時間反転（ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓａｌ）、デジタル位相共役（ｄｉｇｉｔａｌ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、デジタル位相共役法（ｄｉｇｉｔａｌ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）等と呼ばれる場合もある。詳細については後述する。
【0104】
２次元位相画像生成ステップＳ６５において、２次元位相画像生成部６５は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部６３又は位相共役演算部６４により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。ここで生成される２次元位相画像は、フォーカスを合わせたｚ方向位置を中心とする位相画像に相当する。
【0105】
２次元位相画像生成ステップＳ６５において、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う前の複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第１位相画像とし、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行って求められた複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第２位相画像としたとき、複数の位置のうち、撮像部に対し相対的に近い位置については主として第１位相画像に基づいて２次元位相画像を生成し、撮像部に対し相対的に遠い位置については主として第２位相画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
【0106】
なお、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において複数の光照射方向それぞれについて複数の位置それぞれの複素振幅画像を全て生成した後に、位相共役演算ステップＳ６４以降の処理を行ってもよい。また、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において複数の光照射方向それぞれについて或る１つのｚ方向位置の複素振幅画像を生成し、該位置の２次元位相画像を２次元位相画像生成ステップＳ６５において生成する処理を単位として、ｚ方向位置を走査しながら当該単位処理を繰り返し行ってもよい。後者の場合には、記憶部６９が記憶しておくべき画像データの容量を小さくすることができる。
【0107】
３次元位相画像生成ステップＳ６６において、３次元位相画像生成部６６は、２次元位相画像生成部６５により生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する。ここで生成される３次元位相画像は、２次元位相画像中での位置ｘ，ｙ及び該２次元位相画像の位置ｚを変数とする画像である。
【0108】
屈折率分布算出ステップＳ６７において、屈折率分布算出部６７は、３次元位相画像生成部６６により生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより観察対象物の３次元屈折率分布を求める。
【0109】
屈折率分布測定方法Ｂにおける２次元位相画像生成ステップＳ６５、３次元位相画像生成ステップＳ６６及び屈折率分布算出ステップＳ６７は、それぞれ、屈折率分布測定方法Ａにおける２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５及び屈折率分布算出ステップＳ６と同様の処理を行う。
【0110】
図Ｂ０５は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３及び２次元位相画像生成ステップＳ６５の各処理の順序及び画像を説明する図である。この図は、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行わない態様を示す。この態様では、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（１）式及び（２）式の自由伝搬の式により、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ１，ｚ２，ｚ３）それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。
【0111】
図Ｂ０６～図Ｂ０８は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３、位相共役演算ステップＳ６４及び２次元位相画像生成ステップＳ６５の各処理の順序及び画像を説明する図である。これらの図は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の前、途中又は後で位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う態様を示す。
【0112】
図Ｂ０６に示される第１態様は、図Ｂ０４のフローチャートに対応するものである。この第１態様では、位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の後に行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（１）式及び（２）式の自由伝搬の式により、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ１，ｚ２，ｚ３）それぞれの複素振幅画像が生成される。
【0113】
第１態様では、続いて、位相共役演算ステップＳ６４において、複数の位置それぞれについて、複数の照射方向それぞれの複素振幅画像に対して位相共役演算が行われて、観察対象物に対する光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、位相共役演算ステップＳ６４で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。
【0114】
図Ｂ０７に示される第２態様では、位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の前に行われる。位相共役演算ステップＳ６４において、複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に対して位相共役演算が行われて、観察対象物に対する光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像が生成される。
【0115】
第２態様では、続いて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（１）式及び（２）式の自由伝搬の式により、位相共役演算ステップＳ６４で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ１，ｚ２，ｚ３）それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。
【0116】
図Ｂ０８に示される第３態様では、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３が基準位置の複素振幅画像から２つの段階を経て複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する場合に、その２つの段階のうちの第１段階と第２段階との間において位相共役演算ステップＳ６４が行われる。
【0117】
第３態様では、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の第１段階において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（１）式及び（２）式の自由伝搬の式により、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ１，ｚ３，ｚ５）それぞれの複素振幅画像が生成される。続いて、位相共役演算ステップＳ６４において、複数の照射方向それぞれの複素振幅画像に対して位相共役演算が行われて、観察対象物に対する光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像が生成される。
【0118】
第３態様では、更に続いて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の第２段階において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（１）式及び（２）式の自由伝搬の式により、位相共役演算ステップＳ６４で生成されたｚ方向位置（ｚ＝ｚ１，ｚ３，ｚ５）の複素振幅画像に基づいて、ｚ方向位置（ｚ＝ｚ２，ｚ４，ｚ６）それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。
【0119】
これらの第１態様、第２態様及び第３態様の間では、位相共役演算ステップＳ６４における複素振幅画像に対する位相共役演算の回数が異なる。位相共役演算ステップＳ６４の全体の処理時間は、第１態様より第３態様の方が短く、第２態様では更に短い。
【0120】
図Ｂ０９は、３次元位相画像生成ステップＳ６６及び屈折率分布算出ステップＳ６７の各処理の順序及び画像を説明する図である。３次元位相画像生成ステップＳ６６において、２次元位相画像生成ステップＳ６５で生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像が生成される。このとき、撮像部に対し相対的に近い位置については、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う前の複素振幅画像に基づいて生成された２次元位相画像（図Ｂ０５の態様で生成された２次元位相画像）が主として採用される。一方、撮像部に対し相対的に遠い位置については、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行った後の複素振幅画像に基づいて生成された２次元位相画像（図Ｂ０６～図Ｂ０８の何れかの態様で生成された２次元位相画像）が主として採用される。続いて、屈折率分布算出ステップＳ６７において、３次元位相画像生成ステップＳ６６で生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより観察対象物の３次元屈折率分布が求められる。なお、３次元屈折率分布を構成する各屈折率分布データ（例えば、図Ｂ０９において、３次元屈折率分布を構成する２次元の屈折率分布データ）は、屈折率断層データとなりえる。
【0121】
ｚ方向の各位置の２次元位相画像の生成は、次のような３つの態様がある。位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う前の複素振幅画像に基づいて生成される位相画像（図Ｂ０５の態様で生成される位相画像）を第１位相画像φ１とする。位相共役演算ステップＳ６４の処理を行った後の複素振幅画像に基づいて生成される位相画像（図Ｂ０６～図Ｂ０８の何れかの態様で生成される位相画像）を第２位相画像φ２とする。光伝搬経路に沿った撮像部からの距離を表す変数ｚに対する微係数が０以下である重み関数αを用いる。重み関数の値は０以上１以下である。
【0122】
第１態様では、重み関数αは、ｚが閾値ｚｔｈ以下である範囲において正値（例えば１）であり、それ以外の範囲において値が０であるとする。すなわち、２次元位相画像は下記（８）式で表される。
【0123】
【数8】
第２態様では、重み関数αは、ｚ方向の少なくとも一部範囲において連続的に値が変化するものとする。すなわち、２次元位相画像は下記（９）式で表される。
【0124】
【数9】
第３態様では、重み関数αは、光軸（ｚ方向）に直交する面における位置（ｘ，ｙ）に応じた値を有するものとする。すなわち、２次元位相画像は下記（１０）式で表される。
【0125】
【数10】
【0126】
【0127】
図Ｂ１０は、撮像部により干渉強度画像を撮像するときの入力光Ｕｉｎ（ｋｉｎ）及び出力光ｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ）を示す図である。Ｕｉｎ（ｋｉｎ）は、観察対象物へ照射される光の波数ｋｉｎの複素振幅を表す。ｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ）は、観察対象物から出力される光の位置ｒｏｕｔの複素振幅を表す。Ｕｉｎ（ｋｉｎ）とｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ）との間の関係は、下記（１１）式で表される。列ベクトルＵｉｎの第ｎ要素Ｕｉｎ（ｋｉｎ
ｎ）は、波数ｋｉｎ
ｎの平面波の複素振幅を表す。列ベクトルｕｏｕｔの第ｎ要素ｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ
ｎ）は、位置ｒｏｕｔ
ｎで観測される光の複素振幅を表す。Ｎ行Ｎ列の行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）は、Ｕｉｎ（ｋｉｎ）とｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ）との間の線形な関係を表すものであって、トランスミッション行列と呼ばれる。このようなトランスミッション行列により、観察対象物における光の散乱過程を表すことができる。行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）の第ｎ１行第ｎ２列の要素Ｔｎ１，ｎ２は、波数ｋｉｎ
ｎ２で振幅１の平面波が入力されたときに位置ｒｏｕｔ
ｎ１で観測される光の複素振幅を表す。
【0128】
【数11】
図Ｂ１１は、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の入力光Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ）及び出力光ｕｉｎ（ｒｉｎ）を示す図である。この場合、Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ）は、観察対象物へ照射される光の波数ｋｏｕｔの複素振幅を表す。ｕｉｎ（ｒｉｎ）は、観察対象物から出力される光の位置ｒｉｎの複素振幅を表す。Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ）とｕｉｎ（ｒｉｎ）との間の関係は、下記（１２）式で表される。列ベクトルＵｏｕｔの第ｎ要素Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ ｎ）は、波数ｋｏｕｔ ｎの平面波の複素振幅を表す。列ベクトルｕｉｎの第ｎ要素ｕｉｎ（ｒｉｎ ｎ）は、位置ｒｉｎ ｎで観測される光の複素振幅を表す。Ｎ行Ｎ列の行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）は、Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ）とｕｉｎ（ｒｉｎ）との間の線形な関係を表すものであって、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列である。
【0129】
【数12】
Ｕｉｎ（ｋｉｎ）は、下記（１３）式のようにｕｉｎ（ｒｉｎ）のフーリエ変換で表される。Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ）は、下記（１４）式のようにｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ）のフーリエ変換で表される。（１１）式～（１４）式を用いると、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）は、逆フーリエ変換を表す行列とトランスミッション行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）を用いて下記（１５）式で表される。
【0130】
【数13】
【0131】
【数14】
【0132】
【数15】
【0133】
位相共役演算ステップＳ６４では、まず、複素振幅画像に基づいて、撮像部により干渉強度画像を撮像したときのトランスミッション行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）を求める。次に、このトランスミッション行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）及び上記（１５）式に基づいて、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）を求める。そして、このトランスミッション行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）に基づいて、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複素振幅画像を求める。
【0134】
複数の光照射方向それぞれについて撮像部により干渉強度画像を撮像するときの第ｎの光照射方向の入力光のベクトルＵｉｎ
ｎ（ｋｉｎ）は、下記（１６）式で表され、第ｎ要素の値のみが１であって、他の要素の値が０である。この入力光Ｕｉｎ
ｎ（ｋｉｎ）に対して、出力光ｕｏｕｔ
ｎ（ｒｏｕｔ）は、下記（１７）式で表される。この（１７）式は、第ｎの光照射方向の際に得られた複素振幅に対応する。
【0135】
【数16】
【0136】
【数17】
この（１６）式及び上記（１１）式から、下記（１８）式が得られる。そして、複数の光照射方向それぞれについて同様に求めると、下記（１９）式が得られる。このようにして、トランスミッション行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）を求めることができる。さらに、この（１９）式及び上記（１５）式から、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）を求めることができる。
【0137】
【数18】
【0138】
【数19】
光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複数の光照射方向のうちの第ｎの光照射方向の入力光Ｕｏｕｔ ｎ（ｋｏｕｔ）は、下記（２０）式で表され、第ｎ要素の値のみが１であって、他の要素の値が０である。この式から、この入力光Ｕｏｕｔ ｎ（ｋｏｕｔ）に対する出力光ｕｉｎ ｎ（ｒｉｎ）は、下記（２１）式で表される。この（２１）式は、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複素振幅を表す。このようにして、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複素振幅画像を求めることができる。
【0139】
【数20】
【0140】
【数21】
【0141】
光照射及び撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）を求める際に、上記（１５）式に示されるとおり、トランスミッション行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）の逆行列を計算する必要がある。したがって、トランスミッション行列Ｔは、行要素の数と列要素の数とが互いに等しい正方行列であることが必要である。すなわち、干渉強度画像取得ステップＳ６１の際の観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元（ｍａｔｒｉｘ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）と、複素振幅画像の画素数とは、互いに等しいことが必要である。
【0142】
両者を互いに等しくするには、干渉強度画像取得ステップＳ６１の際の観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元を画素数に一致させるか、撮像部により得られた画像のうち一部範囲の画像のみを爾後の処理に用いるかすればよい。しかし、一般には、撮像部により得られる画像の画素数は例えば１０２４×１０２４であることから、観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元を画素数と同じにすることは容易ない。また、撮像部により得られた画像のうち一部範囲の画像のみを爾後の処理に用いることは、解像度の低下につながる。
【0143】
そこで、図Ｂ１２に示されるように、位相共役演算ステップＳ６４において、観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元と同じ画素数を各々有する複数の部分画像に複素振幅画像を分割し、これら複数の部分画像それぞれに対して位相共役演算を行い、その後に複数の部分画像を結合するのがよい。このとき、複数の部分画像のうち何れか２以上の部分画像が共通の領域を有していてもよい。
【0144】
次に、屈折率分布測定方法Ｃについて説明する。図Ｃ０１～図Ｃ０３は、屈折率分布測定方法Ｃによる屈折率分布を測定する際に用いることができる観察装置１Ｇ～１Ｉの各構成を示す図である。図Ｃ０１に示される観察装置１Ｇは、図Ａ０１に示された観察装置１Ａの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部７０を備える点で相違する。図Ｃ０２に示される観察装置１Ｈは、図Ａ０２に示された観察装置１Ｂの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部７０を備える点で相違する。図Ｃ０３に示される観察装置１Ｉは、図Ａ０３に示された観察装置１Ｃの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部７０を備える点で相違する。
【0145】
解析部７０は、撮像部４３と電気的に接続されており、撮像部４３により撮像された干渉強度画像を入力する。解析部７０は、その入力した干渉強度画像を処理することにより、観察対象物Ｓの３次元屈折率分布を算出する。解析部７０は、コンピュータであってよい。解析部７０は、干渉強度画像取得部７１、第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６、第３複素振幅画像生成部７７、表示部７８及び記憶部７９を備える。
【0146】
干渉強度画像取得部７１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。また、干渉強度画像取得部７１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。干渉強度画像取得部７１は、ＣＰＵを含み、ミラー２２の反射面の方位を変化させる為の制御信号を出力する出力ポートを有し、また、撮像部４３から干渉強度画像を入力する入力ポートを有する。対物レンズ２５を光軸方向に移動させる必要はない。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。
【0147】
第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６及び第３複素振幅画像生成部７７は、干渉強度画像に基づいて処理を行うものであり、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＤＳＰ又はＦＰＧＡ等の処理装置を含む。表示部７８は、処理すべき画像、処理途中の画像及び処理後の画像などを表示するものであり、例えば液晶ディスプレイを含む。記憶部７９は、各種の画像のデータを記憶するものであり、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭ及びＲＯＭ等を含む。第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６、第３複素振幅画像生成部７７及び記憶部７９は、クラウドコンピューティングによって構成されてもよい。
【0148】
記憶部７９は、干渉強度画像取得部７１、第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６及び第３複素振幅画像生成部７７に各処理を実行させるためのプログラムをも記憶する。このプログラムは、観察装置１Ｇ～１Ｉの製造時又は出荷時に記憶部７９に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部７９に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部７９に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ＢＤ－ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。
【0149】
干渉強度画像取得部７１、第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５及び屈折率分布算出部７６及び第３複素振幅画像生成部７７それぞれの処理の詳細については後述する。
【0150】
図Ｃ０４及び図Ｃ０５は、屈折率分布測定方法Ｃのフローチャートである。図Ｃ０５は、図Ｃ０４のフローチャートの一部を示す。この屈折率分布測定方法Ｃは、観察装置１Ｇ～１Ｉの何れを用いた場合においても可能なものである。この屈折率分布測定方法Ｃは、干渉強度画像取得ステップＳ７１、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７を備える。
【0151】
干渉強度画像取得ステップＳ７１の処理は干渉強度画像取得部７１により行われる。第１複素振幅画像生成ステップＳ７２の処理は第１複素振幅画像生成部７２により行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ７３の処理は第２複素振幅画像生成部７３により行われる。２次元位相画像生成ステップＳ７４の処理は２次元位相画像生成部７４により行われる。３次元位相画像生成ステップＳ７５の処理は３次元位相画像生成部７５により行われる。屈折率分布算出ステップＳ７６の処理は屈折率分布算出部７６により行われる。第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の処理は第３複素振幅画像生成部７７により行われる。
【0152】
干渉強度画像取得ステップＳ７１において、干渉強度画像取得部７１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。そして、干渉強度画像取得部７１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。
【0153】
第１複素振幅画像生成ステップＳ７２において、第１複素振幅画像生成部７２は、複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像取得部７１により取得された干渉強度画像に基づいて、複素振幅画像を生成する。観察装置１Ｇ（図Ｃ０１）及び観察装置１Ｉ（図Ｃ０３）の場合には、第１複素振幅画像生成部７２は、フーリエ縞解析法により、１枚の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。観察装置１Ｈ（図Ｃ０２）の場合には、第１複素振幅画像生成部７２は、位相シフト法により、物体光と参照光との間の光路長差（位相差）が互いに異なる３枚以上の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。第１複素振幅画像生成ステップＳ７２において生成される複素振幅画像は、干渉強度画像と同じ基準位置のものであってもよいし、基準位置の複素振幅画像に基づいて生成された他の位置のものであってもよい。
【0154】
第２複素振幅画像生成ステップＳ７３において、第２複素振幅画像生成部７３は、複数の光照射方向それぞれについて、光伝搬経路に沿った撮像部４３からの距離に関し第１位置の複素振幅画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する。
【0155】
２次元位相画像生成ステップＳ７４において、２次元位相画像生成部７４は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部７３により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。ここで生成される２次元位相画像は、フォーカスを合わせたｚ方向位置を中心とする位相画像に相当する。
【0156】
３次元位相画像生成ステップＳ７５において、３次元位相画像生成部７５は、２次元位相画像生成部７４により生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の３次元位相画像を生成する。ここで生成される３次元位相画像は、２次元位相画像中での位置ｘ，ｙ及び該２次元位相画像の位置ｚを変数とする画像である。
【0157】
屈折率分布算出ステップＳ７６において、屈折率分布算出部７６は、３次元位相画像生成部７５により生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより、第１位置から第２位置までの間の観察対象物の３次元屈折率分布を求める。
【0158】
屈折率分布測定方法Ｃにおける干渉強度画像取得ステップＳ７１、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５及び屈折率分布算出ステップＳ７６は、それぞれ、屈折率分布測定方法Ａにおける干渉強度画像取得ステップＳ１、第１複素振幅画像生成ステップＳ２、第２複素振幅画像生成ステップＳ３、２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５及び屈折率分布算出ステップＳ６と略同様の処理を行う。
【0159】
第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、第３複素振幅画像生成部７７は、複数の光照射方向それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３で用いた第１位置の複素振幅画像、及び、屈折率分布算出ステップＳ７６で算出した第１位置から第２位置までの間の観察対象物の３次元屈折率分布に基づいて、第２位置の複素振幅画像を生成する。
【0160】
第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５及び屈折率分布算出ステップＳ７６を含むステップＳ８３では、光伝搬経路に沿った撮像部４３からの距離に関し第１位置の複素振幅画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の観察対象物の３次元屈折率分布を求める。ステップＳ８３及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の各処理は繰り返し行われる。このことについて、図Ｃ０４～図Ｃ０７を用いて説明する。
【0161】
図Ｃ０６は、観察対象物を含む領域と第１～第Ｊのブロックとの関係を説明する図である。この図に示されるように、光伝搬経路（ｚ方向）に沿った撮像部からの距離に基づいて観察対象物を含む領域を順に第１～第Ｊのブロックに区分する。この図では、Ｊ＝３としている。第１～第Ｊのブロックのうちの第ｊブロックは、ｚ＝ｚｊ－１からｚ＝ｚｊまでの領域である。各第ｊブロックにおいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚｊ－１の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚｊの位置（遠端）を第２位置とする。
【0162】
図Ｃ０７は、第１～第Ｊのブロックにおける処理の手順を説明する図である。この図に示されるように、各第ｊブロックについて、ステップＳ８３で、第１位置の複素振幅画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像及び２次元位相画像を生成し、第１位置から第２位置までの間の３次元位相画像を生成し更に３次元屈折率分布を求める。各第ｊブロックについて、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で、第１位置の複素振幅画像、及び、ステップＳ８３で算出した３次元屈折率分布に基づいて、第２位置の複素振幅画像を生成する。
【0163】
第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で生成された第（ｊ＋１）ブロックの第２位置の複素振幅画像は、次の第ｊブロックの第１位置の複素振幅画像として用いられて、第ｊブロックについてステップＳ８３及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の各処理が行われる。第１～第Ｊのブロックそれぞれについて３次元屈折率分布が得られたら、これらを結合することで観察対象物の全体の３次元屈折率分布が得られる。なお、第１～第Ｊのブロックそれぞれの３次元屈折率分布（例えば、図Ｃ０７の第１ブロックの屈折率分布、第２ブロックの屈折率分布及び第３ブロックの屈折率分布）は、屈折率断層データとなりえる。
【0164】
図Ｃ０４及び図Ｃ０５に示されるように、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２の後のステップＳ８１においてｊ＝０とされ、続くステップＳ８２においてｊの値が１増されてｊ＝１とされて、第１ブロックについてステップＳ８３及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の各処理が行われる。すなわち、撮像部に対し最も近い第１ブロックについては、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２で生成した複素振幅画像に基づいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚ０の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚ１の位置（遠端）を第２位置として、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７それぞれの処理が順に行われる。その後、ステップＳ８２に戻る。
【0165】
第ｊブロック（ここでは、ｊは２以上Ｊ未満）については、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で第（ｊ－１）ブロックについて生成した複素振幅画像に基づいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚｊ－１の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚｊの位置（遠端）を第２位置として、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７それぞれの処理が順に行われる。その後、ステップＳ８２に戻る。
【0166】
撮像部に対し最も遠い最終段ブロックである第Ｊブロックについては、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で第（Ｊ－１）ブロックについて生成した複素振幅画像に基づいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚＪ－１の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚＪの位置（遠端）を第２位置として、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）の処理が行われる。
【0167】
第Ｊブロックについては、ステップＳ８３の後のステップＳ８４において、最終段ブロックであると判断されて、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７に進むことなく終了すればよい。なお、第Ｊブロックについては、３次元位相画像生成ステップＳ７５の後において、最終段ブロックであると判断されて、屈折率分布算出ステップＳ７６に進むことなく終了してもよく、この場合には、観察対象物の全体の３次元位相画像が得られる。
【0168】
なお、光伝搬経路（ｚ方向）に沿った撮像部からの距離に基づいて観察対象物を含む領域を順に２個のブロックに区分してもよく、その場合には、上述した第１ブロックについての処理及び最終段の第Ｊブロックについての処理を行えばよい。また、観察対象物を含む領域を複数のブロックに区分しなくてもよく、その場合には、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７それぞれの処理を順に１回のみ行ってもよい。
【0169】
次に、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の詳細について説明する。観察対象物に光を照射して干渉強度画像を取得する際に、各第ｊブロックにおいて、第２位置（ｚ＝ｚｊ）の光波面は、第ｊブロックの内部を伝搬して第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）に到達し更に撮像部まで伝搬する。そこで、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、第ｊブロックの屈折率分布を考慮した数値計算により、第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）の光波面を第ｊブロックの内部を逆伝搬させることで、第２位置（ｚ＝ｚｊ）の光波面を求める。すなわち、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、複数の光照射方向それぞれについて、第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）の複素振幅画像及び第ｊブロックの屈折率分布に基づいて、第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚｊ）の複素振幅画像を生成する。この処理に際して、媒質の屈折率分布を考慮して光波面の伝搬を数値計算する手法が用いられる。このような不均一媒質伝搬の数値計算手法として、ＢＰＭ（Ｂｅａｍ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ）及びＳＳＮＰ（Ｓｐｌｉｔ－Ｓｔｅｐ Ｎｏｎ－Ｐａｒａｘｉａｌ）等が知られている。以下では、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７においてＢＰＭを用いた処理について説明する。
【0170】
図Ｃ０８は、ＢＰＭの処理内容を説明する図である。この図は、任意の第ｊブロックを示している。この図に示されるように、光伝搬経路（ｚ方向）に沿った撮像部からの距離に基づいて第ｊブロックをＭ個（この図では７個）のスライス（第１～第Ｍのスライス）に区分する。各スライスの厚みは波長程度である。
【0171】
各スライスの厚みは一定であってもよい。ここでは、各スライスの厚みを一定値のΔｚとする。第ｊブロックの第１～第Ｍのスライスのうちの第ｍスライスは、位置（ｚｊ－１＋（ｍ－１）Δｚ）から位置（ｚｊ－１＋ｍΔｚ）までである。第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）から第２位置（ｚ＝ｚｊ）へ向かって順に、第１～第Ｍのスライスにおいて順次に、屈折率分布に応じた位相変化を与えて光波面をΔｚだけ逆伝搬させる。
【0172】
なお、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の処理における各スライスの厚みΔｚは、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３の処理で第１位置から第２位置までの間の複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する際の位置間隔と、異なっていてもよいし、一致していてもよい。
【0173】
位置ｚにある厚みΔｚのスライスを逆伝搬する際に光波面に与えられる位相変化ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）は、下記（２２）式で表される。この（２２）式中のｋｖは真空中での光の波数である。δｎ（ｘ，ｙ，ｚ）は、位置ｚにおける観察対象物の屈折率分布ｎ（ｘ，ｙ，ｚ）と背景（媒質）の屈折率ｎｂとの差分であり、下記（２３）式で表される。また、ｃｏｓθは下記（２４）式で表される。
【0174】
【数22】
【0175】
【数23】
【0176】
【数24】
【0177】
第ｍスライスの位置（ｚ＝ｚｊ－１＋（ｍ－１）Δｚ）における光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚ）とすると、第ｍスライスの内部を光が逆伝搬した後の位置（ｚ＋Δｚ）における光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ＋Δｚ）は、下記（２５）式で表される。この（２５）式中のＰ（ｋｘ，ｋｙ；Δｚ）は、下記（２６）式で表される。（２５）式は、光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ）と位相変化ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）との積をフーリエ変換し、このフーリエ変換の結果とＰ（ｋｘ，ｋｙ；Δｚ）との積を逆フーリエ変換することで、厚みΔｚのスライスを伝搬した後の位置（ｚ＋Δｚ）における光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ＋Δｚ）を求めることを表している。ＰΔｚは、Δｚの光伝搬の演算を行う関数である。
【0178】
【数25】
【0179】
【数26】
【0180】
第ｊブロックの各スライスにおける光波面の伝搬は、下記（２７）式～（２９）式で表される。すなわち、第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）における光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ－１）とすると、第ｊブロックの第１スライスを伝搬した後の光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ－１＋Δｚ）は、下記（２７）式で表される。第ｊブロックの第（ｍ－１）スライスを伝搬した後の光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ－１＋（ｍ－１）Δｚ）とすると、第ｊブロックの第ｍスライスを伝搬した後の光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ－１＋ｍΔｚ）は、下記（２８）式で表される。第ｊブロックの第（Ｍ－１）スライスを伝搬した後の光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ－１＋（Ｍ－１）Δｚ）とすると、第ｊブロックの第Ｍスライスを伝搬した後の第２位置（ｚ＝ｚｊ）における光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ）は、下記（２９）式で表される。
【0181】
【数27】
【0182】
【数28】
【0183】
【数29】
このようにして、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、第ｊブロックの屈折率分布を考慮した数値計算により、第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）の光波面を第ｊブロックの内部をスライス毎に順次に逆伝搬させることで、第２位置（ｚ＝ｚｊ）の光波面を求めることができる。
【0184】
図Ｃ０９は、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７のフローチャートである。ステップＳ４１において、位置ｚを、第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）に初期化する。ステップＳ４２において、位置ｚにおける光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ）と位相変化ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）との相互作用を求める。ステップＳ４３において、その相互作用後の光の波面を距離Δｚだけ伝搬させて、位置ｚ＋Δｚにおける光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ＋Δｚ）を求める。ステップＳ４４において、Δｚを加算したｚを新たなｚとする。ステップＳ４４において、位置ｚが第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚｊ）に未だ到達していないと判断されれば、ステップＳ４２に戻って、ステップＳ４２～Ｓ４４を繰り返す。ステップＳ４４において、位置ｚが第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚｊ）に到達したと判断されれば、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の処理を終了する。終了時に取得された光の複素振幅が第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚｊ）における複素振幅となる。
【0185】
以上に説明した屈折率分布測定方法Ａ～Ｃの何れも、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響が低減された３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。屈折率分布測定方法Ａ～Ｃの何れも、観察対象物としての３次元培養体の屈折率分布を測定するのによい。
【0186】
なお、自己干渉を用いる観察装置及び屈折率分布測定方法でもよい。例えば、図Ｃ１０に示される観察装置１Ｊは、光源１１、レンズ１２、レンズ２１、ミラー２２、レンズ２３、コンデンサレンズ２４、対物レンズ２５、ミラー４４、レンズ４２、撮像部４３及び解析部７０などを備える。これまでに説明した観察装置の構成と比較すると、観察装置１Ｊでは、光源１１から出力された光は、光ファイバ１４により導光された後、２分岐されることなく光出射端１８から出射される点で相違する。また、観察装置１Ｊは、ビームスプリッタ４１に替えてミラー４４が設けられている点で相違する。観察装置１Ｊは、干渉光学系を備えていない。撮像部４３は、複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物Ｓに照射されて観察対象物Ｓを経た光の自己干渉による基準位置の干渉強度画像を撮像することができる。解析部７０は、このような自己干渉による干渉強度画像を用いて、これまでに説明したと同様の画像処理を行うことができる。
【0187】
また、第１位置から第２位置までの間の観察対象物Ｓの３次元屈折率分布は、３次元位相画像に基づく屈折率分布でなくてもよく、屈折率分布を取得できる屈折率分布取得装置を別途用いて取得してもよい。この場合、観察装置は、（１） 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光の基準位置の干渉強度画像を撮像した撮像部から、複数の光照射方向それぞれの基準位置の干渉強度画像を取得する干渉強度画像取得部と、（２） 複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、（３） 光伝搬経路に沿った撮像部からの距離に関し第１位置から第２位置までの間の、観察対象物の３次元屈折率分布を取得する屈折率分布取得部と、（４） 複数の光照射方向それぞれについて、第１位置の複素振幅画像及び３次元屈折率分布に基づいて第２位置の複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部（観察装置１Ａ～１Ｄの第３複素振幅画像生成部に相当）と、を備えればよい。
【0188】
また、この場合、屈折率分布測定方法は、（１） 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光の基準位置の干渉強度画像を撮像した撮像部から、複数の光照射方向それぞれの基準位置の干渉強度画像を取得する干渉強度画像取得ステップと、（２） 複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、（３） 光伝搬経路に沿った撮像部からの距離に関し第１位置から第２位置までの間の、観察対象物の３次元屈折率分布を取得する屈折率分布取得ステップと、（４） 複数の光照射方向それぞれについて、第１位置の複素振幅画像及び３次元屈折率分布に基づいて第２位置の複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、を備えればよい。
【0189】
本開示の一側面は、観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法である。
【0190】
本開示の一実施形態において、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定は、屈折率分布データに含まれるピクセル又はボクセルにおける屈折率の空間変化量に基づいて行われる。空間変化量とは、ピクセル又はボクセル毎に定められる、空間に対する屈折率の変化の度合いに関するパラメータであり、例えば微分法、差分法（一次元の微分法）又はブロブ検出法等により得ることができる。
【0191】
屈折率の空間変化量を微分法で算出する場合、例えば、ガウシアン関数の４階微分をカーネルとする畳み込みを屈折率分布画像に対して行い、その畳み込み後の画像に対し絶対値を取った後に、ピクセルまたはボクセルごとに閾値処理を行い、空間に対する屈折率の変化度合いが大きい部分を抽出する。
【0192】
屈折率の空間変化量を差分法で算出する場合、各方向隣接するピクセル又はボクセルの画素値の差分を取り、その差分に関して、各方向成分の２乗和を取った後に、ピクセルまたはボクセルごとに閾値処理を行い、空間に対する屈折率の変化度合いが大きい部分を抽出する。
【0193】
屈折率の空間変化量をブロブ検出法で算出する場合、ブロブ検出でよく用いられるガウシアン差分（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｇａｕｓｓｉａｎｓ）処理を行い、その処理後の画像の絶対値に対してピクセル又はボクセルごとに閾値処理を行い、空間に対する屈折率の変化度合いが大きい部分を抽出する。
【0194】
本開示の一実施形態において、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定は、屈折率分布データに含まれるピクセル又はボクセルにおける屈折率の空間変化量と閾値の大小関係に基づいて行われる。すなわち、屈折率の空間変化量が閾値より大きい領域が、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域であると決定される。本実施形態によるプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定方法を「閾値法」と呼ぶ。閾値法を用いたプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定の典型的なフローを、図３５に示す。閾値法は未処理の屈折率分布データについて行ってもよく、屈折率の空間変化量を強調する画像処理を行った処理済みデータについて行ってもよい。
【0195】
上記閾値は、観察対象物の種類及び状態並びに観察対象物に含まれる細胞の種類及び含有量などに応じて定めることができ、例えば既知の情報を用いてもよく、細胞の形態からプログラムされた細胞死を起こした細胞と判断することができる細胞の領域がプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域と決定されるように定めてもよく、クラスタリング等の教師無し機械学習によって算出してもよい。また、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定を行う観察対象物（サンプル）とは別の観察対象物（リファレンス）の屈折率分布データにおいて、プログラムされた細胞死を起こした細胞と判断することができる細胞の領域がプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域と決定されるように定めることもできる。この場合において、サンプルが細胞塊であるときは、リファレンスはサンプルを形成する細胞と同じ細胞種の細胞の培養体であることが好ましく、同じ細胞種の細胞からなる細胞塊であることがよい。また、リファレンスはプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を明確に決定できる観察対象物であることがよく、好適な例として、少なくともプログラムされた細胞死を起こした細胞が蛍光標識された観察対象物を挙げることができ、一例として、少なくともプログラムされた細胞死を起こした細胞及び生細胞が蛍光標識された観察対象物を挙げることができる。
【0196】
プログラムされた細胞死を起こした細胞を蛍光標識する方法は特に限定されず、プログラムされた細胞死がアポトーシスの場合、例えば、ＴＵＮＥＬアッセイキット、発蛍光性カスパーゼ３基質又は蛍光標識アネキシンＶ（蛍光標識アネキシンＡ５）等を用いることができ、プログラムされた細胞死がネクロプトーシスの場合、例えばＳＭＡＲＴ（Ｓｈｉｎ Ｍｕｒａｉ ｅｔ．ａｌ．ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ９，４４５７（２０１８））等を用いることができ、プログラムされた細胞死がフェロトーシスの場合、例えばＲｈｏＮｏｘ－１（Ｔ．Ｈｉｒａｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４，１２５０－１２５６（２０１３））等の遊離型鉄（ＩＩ）イオン検出プローブ等を用いることができ、プログラムされた細胞死がパイロトーシスの場合、例えば発蛍光性カスパーゼ１基質等を用いることができる。
【0197】
生細胞を蛍光標識する方法は特に限定されず、例えばカルセイン－ＡＭ等を用いることができる。
【0198】
本開示の一実施形態に係る閾値法を用いたプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法は、さらに生細胞領域であると決定された領域の細胞ごとの区分化を行うステップと、生細胞単位での屈折率の空間変化量を計算するステップと、計算結果に基づいて生細胞領域及びプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を補正するステップと、を含んでもよく、これらのステップは複数回反復されてもよい。これらのステップを含む場合の典型的な決定のフローを、図３６に示す。生細胞領域の細胞ごとの区分化は、例えば、Ｗａｔｅｒｓｈｅｄアルゴリズム又はＧｒａｐｈ ｃｕｔｓアルゴリズム等のルールベース画像解析方法、又は蛍光染色等で得られる生細胞画像を教師データとした機械学習によって行うことができる。生細胞単位での屈折率の空間変化量の計算は、例えば微分法、差分法（一次元の微分法）又はブロブ検出法等により行うことができる。生細胞領域及びプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の補正は、例えば、ランダムフォレスト等の決定木アルゴリズムや、クラスタリング等の教師無し機械学習法あるいはベイズ推定によって行うことができる。
【0199】
本開示の一実施形態において、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定は、参照観察対象物のプログラムされた細胞死領域データと、上記プログラムされた細胞死領域データに対応する参照観察対象物の屈折率分布データとを含む教師データを用いて学習した学習モデルに、観察対象物の屈折率分布データを入力することによって行われ、上記学習モデルが利用する特徴量は、屈折率分布データに含まれるピクセル又はボクセルにおける屈折率の空間変化量を含む。参照観察対象物とは、観察対象物と同様の方法により調製又は取得された、細胞を主成分として構成される物体である。本実施形態によるプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定方法を「機械学習法」と呼ぶ。
【0200】
機械学習法によるプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定方法は、少なくとも学習ステップと推論ステップを含む。
【0201】
学習ステップにおいては、参照観察対象物のプログラムされた細胞死領域データと、上記プログラムされた細胞死領域データに対応する参照観察対象物の屈折率分布データとを含む教師データを用いて、機械学習によって特徴量から生細胞領域及びプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を推論するようにモデルを学習させる。参照観察対象物のプログラムされた細胞死領域データとは、参照観察対象物を含む空間中の、プログラムされた細胞死を起こした細胞が占めるボクセル又はピクセルの空間分布を示すデータである。プログラムされた細胞死領域データは、参照観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を明らかにすることができる任意の参照観察対象物のデータから作成することができるが、一実施形態において、上記参照観察対象物のデータは、参照観察対象物の蛍光データ、すなわち参照観察対象物を含む空間中のボクセル又はピクセルの蛍光強度の空間分布を示すデータである。
【0202】
プログラムされた細胞死領域データが参照観察対象物の蛍光データから作成される場合の学習ステップにおけるモデルの典型的な学習フローを図３７に示す。学習ステップの第１段階においては、少なくともプログラムされた細胞死を起こした細胞が蛍光標識された参照観察対象物の屈折率分布データ及び蛍光データを取得する。参照観察対象物は更に、生細胞が蛍光染色されていてもよい。プログラムされた細胞死を起こした細胞及び生細胞の蛍光標識は、例えば閾値法で挙げた方法と同様の方法により行うことができる。
【0203】
学習ステップの第２段階においては、屈折率分布データから、特徴量を抽出する。上記特徴量は、屈折率の空間分布に関連する特徴量であって、ベクトルであってもスカラーであってもよいが、少なくとも屈折率分布データに含まれるピクセル又はボクセルにおける屈折率の空間変化量を含む。
【0204】
学習ステップの第３段階においては、蛍光データから、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を抽出し、プログラムされた細胞死領域データを作成する。プログラムされた細胞死領域データの作成においては、例えば、プログラムされた細胞死を起こした細胞を標識した色素の励起波長及び蛍光波長に対応する蛍光データに基づいて、蛍光標識された細胞の領域がプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域であると決定することができる。さらに生細胞領域を決定する場合には、例えば、生細胞を標識した色素の励起波長及び蛍光波長に対応する蛍光データに基づいて、蛍光標識された細胞の領域が生細胞領域であると決定することができる。また、例えば、全ての細胞を標識した色素の励起波長及び蛍光波長に対応する蛍光データに基づいて、蛍光標識された細胞の領域のうち、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域であると決定された領域以外の領域を生細胞領域であると決定することもできる。
【0205】
学習ステップの第４段階においては、参照観察対象物のプログラムされた細胞死領域データと、上記プログラムされた細胞死領域データに対応する参照観察対象物の屈折率分布データとを含む教師データを用いて、機械学習によって、第２段階において抽出した特徴量を入力として第３段階において決定したプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域及び生細胞領域が推論されるように、モデルを学習させる。蛍光データと屈折率分布データの同視野撮影等の検証を経たプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域及び生細胞領域のデータを教師データとすることで、判定精度の向上が期待できる。
【0206】
推論ステップの典型的な推論フローを図３８に示す。推論ステップの第１段階においては、観察対象物の屈折率分布データを取得する。続く第２段階においては、屈折率分布データから、学習ステップの第２段階において抽出したのと同じ特徴量を抽出する。続く第３段階においては、学習ステップで学習させたモデルを用いて、観察対象物のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域及び生細胞領域を推論する。
【0207】
本開示の他の一側面は、観察対象物の屈折率分布データを取得する工程と、観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する工程と、を備える、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定する方法である。屈折率分布データを取得する方法は、特に限定されず、また、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定は、閾値法によってもよく、機械学習法によってもよい。
【0208】
本開示の一側面は、細胞塊に薬物を添加するステップと、細胞塊の屈折率分布データを取得するステップと、細胞塊の屈折率分布データを用いて、細胞塊中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定するステップと、を含む、薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響を解析する方法である。薬物を添加する方法及び屈折率分布データを取得する方法は、特に限定されず、また、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定は、閾値法によってもよく、機械学習法によってもよい。薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響の解析は、例えば図３９に示したように、同一のタイムポイントにおける濃度依存的なプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の大きさを指標にしてもよく、図４０に示したように、細胞塊を一定濃度の薬物存在下で培養した場合の時間依存的なプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の拡大を指標にしてもよい。
【0209】
本開示の一実施形態は、正常細胞塊に薬物を添加するステップと、正常細胞塊の屈折率分布データを取得するステップと、正常細胞塊の屈折率分布データを用いて、正常細胞塊中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定するステップと、を含む、薬物の有する細胞毒性を解析する方法である。正常細胞塊とは、細胞塊に含まれる細胞が正常細胞である、細胞塊である。本実施形態においては、正常細胞塊に添加した際に正常細胞塊中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の拡大を誘起する薬物が、細胞毒性を有する可能性がある薬物と判断される。
【0210】
本実施形態において細胞毒性を有する可能性がある薬物であると判断されうる既知の薬物、すなわち正常細胞に添加した際に正常細胞のプログラムされた細胞死を誘起することが知られる薬物としては、例えば、スタウロスポリン及びアクチノマイシンＤ等の小分子、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ）等のペプチド並びにＦＡＳリガンド等のタンパク質を挙げることができる。
【0211】
本開示の一実施形態は、がん細胞塊に薬物を添加するステップと、がん細胞塊の屈折率分布データを取得するステップと、がん細胞塊の屈折率分布データを用いて、がん細胞塊中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定するステップと、を含む、薬物の有する抗がん活性を解析する方法である。がん細胞塊とは、がん細胞を含む細胞塊である。一実施形態において、がん細胞塊は、細胞塊に含まれる細胞ががん細胞である、細胞塊である。本実施形態においては、がん細胞塊に添加した際にがん細胞塊中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の拡大を誘起する薬物が、抗がん活性を有する可能性がある薬物と判断される。さらに、正常細胞塊に添加した際のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の拡大の程度と比較して、がん細胞塊に添加した際のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の拡大の程度が相対的に大きい薬物が、抗がん活性を有する可能性が高い薬物と判断される。
【0212】
本実施形態において抗がん活性を有する可能性がある薬物であると判断されうる既知の薬物、すなわちがん細胞に添加した際にがん細胞のプログラムされた細胞死を誘起することが知られる薬物としては、例えば、ドキソルビシン等のアントラサイクリン系抗がん剤、シスプラチン等の白金製剤系抗がん剤及びボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害薬を挙げることができる。
【0213】
以下、実施例等により、本開示を詳しく説明するが、本開示はこれらに限定されるものではない。
【実施例0214】
［実施例１：スタウロスポリンを添加したＡ５４９細胞塊の調製及び屈折率分布データの取得］
Ａ５４９細胞により形成した細胞塊に対して、アポトーシスを誘導する薬物であるスタウロスポリン（以下、ＳＴＳとも表記する。）を添加して、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を含むＡ５４９細胞塊を調製した。また、得られた細胞塊の屈折率分布データを取得した。
Ａ５４９細胞により形成した細胞塊に対して、アポトーシスを誘導する薬物であるスタウロスポリン（以下、ＳＴＳとも表記する。）を添加して、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を含むＡ５４９細胞塊を調製した。また、得られた細胞塊の屈折率分布データを取得した。
【0215】
ヒト肺がん由来細胞株であるＡ５４９細胞をＥＺＳＰＨＥＲＥ６ウェルプレート(ＡＧＣテクノグラス社製)に１ウェル当たり１．５０ｘ１０５細胞の密度で播種し、１０％ウシ胎児血清及びＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ社製）の終濃度１×を含むＭＥＭ培地中、５％ ＣＯ２、３７℃、１００％湿度の条件下で３日間培養して、細胞塊を形成した。そこに、スタウロスポリン（富士フイルム和光純薬社製）のＤＭＳＯ溶液を終濃度が０，１０，２０，５０，１００，２００，３００，５００，７００，１０００，２０００又は５０００ｎＭとなるように添加し、さらに１日培養した。なお、ＳＴＳの終濃度が０ｎＭの条件では、ＳＴＳの溶媒として使用したＤＭＳＯ(シグマアルドリッチ社製)の終濃度０．５％溶液を添加した。
【0216】
得られた細胞塊について、観察装置１Ａ及び屈折率分布測定方法Ｃに示したＯＤＴを用いて屈折率分布データを取得した。倍率６０倍の対物レンズを用いた。添加したスタウロスポリンの濃度と観察対象物とした細胞塊の直径との関係を図４１に、添加したスタウロスポリンの濃度と観察対象物とした細胞塊の体積との関係を図４２に、スタウロスポリン濃度０，２００及び１０００ｎＭにおいて得られた屈折率分布データから抽出した代表的な屈折率断層データを図４３に、それぞれ示す。
【0217】
図４１及び図４２によれば、観察対象物とした細胞塊の相当径及び体積はスタウロスポリン濃度に依存せず、スタウロスポリン濃度に依存した顕著な細胞塊の外形の変化は生じなかった。これに対し、屈折率分布データに着目すると、図４３によれば、スタウロスポリン１０００ｎＭ添加群において、アポトーシスの形態的な特徴である核の分断が見られる細胞が細胞塊の表面及び内部に見られ、かつそのような細胞においては屈折率の空間変化量が大きかった。
【0218】
［実施例２：スタウロスポリンを添加したＡ５４９細胞塊のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定］
プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を含むＡ５４９細胞塊の屈折率分布データを用いて、閾値法より、Ａ５４９細胞塊中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定することができるか検討した。
プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を含むＡ５４９細胞塊の屈折率分布データを用いて、閾値法より、Ａ５４９細胞塊中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定することができるか検討した。
【0219】
実施例１で取得した屈折率分布データについて、図４４に示したフローにより解析した。まず、細胞塊の屈折率分布データからのうち、屈折率が１．３４以上の領域に細胞塊が存在するとして、判定領域（細胞塊領域）を決定した。続いて、閾値法に用いる屈折率の空間変化量の閾値について、２ｘ１０－４に設定した。続いて、屈折率分布データについて、ガウシアンフィルタによるガウシアンノイズの除去処理、４階微分処理及び画像の畳み込み処理を行い、屈折率分布データに含まれるボクセル毎の屈折率の空間変化量を算出した。最後に、得られた屈折率の空間変化量と閾値である２ｘ１０－４とを比較して、屈折率の空間変化量が閾値より大きい領域をプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域（死細胞領域）であると決定し、小さい領域を非分断領域（生細胞領域）であると決定した。スタウロスポリン濃度０，２００及び１０００ｎＭにおける代表的な屈折率断層データと、同じ断層面における死細胞領域及び生細胞領域と判定された領域の画像を図４５に、添加したスタウロスポリンの濃度（指数表示）と閾値法により決定された非分断領域（生細胞領域）の割合との関係を図４６に、それぞれ示す。
【0220】
図４５によれば、閾値法を用いることで、アポトーシスの形態的な特徴である核の分断が見られる細胞の領域の多くがプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域であると決定され、核の分断が見られない細胞の領域の多くが非分断領域であると決定された。図４６によれば、スタウロスポリン濃度依存的に非分断領域であると決定された領域の割合は減少し、かつこれらの相関関係は生物学分野で一般的なヒル関数でカーブフィッティングすることができ、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出できることが確認された（ＩＣ５０＝１５８ｎＭ）。以上から、スタウロスポリンを添加したＡ５４９細胞塊について、屈折率の空間変化量を指標に、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定すること、及び薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響を解析することができた。
【0221】
［実施例３：スタウロスポリンを添加したＨｅｐＧ２細胞塊の調製、屈折率分布データの取得及びプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定］
ＨｅｐＧ２細胞により形成した細胞塊に対して、アポトーシスを誘導する薬物であるスタウロスポリンを添加して、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を含むＨｅｐＧ２細胞塊を調製した。また、得られた細胞塊の屈折率分布データを取得した。さらに、閾値法より、ＨｅｐＧ２細胞塊中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定することができるか検討した。
ＨｅｐＧ２細胞により形成した細胞塊に対して、アポトーシスを誘導する薬物であるスタウロスポリンを添加して、プログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を含むＨｅｐＧ２細胞塊を調製した。また、得られた細胞塊の屈折率分布データを取得した。さらに、閾値法より、ＨｅｐＧ２細胞塊中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定することができるか検討した。
【0222】
細胞種として、Ａ５４９細胞の代わりにヒト肝がん由来の細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を用いたこと、細胞を１ウェル当たり１．００ｘ１０５細胞の密度で播種したこと、培地として１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いたこと以外は、実施例１及び２と同様の工程により、細胞塊の調製、屈折率分布データの取得及びプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域の決定を行った。添加したスタウロスポリンの濃度と観察対象物とした細胞塊の直径との関係を図４７に、添加したスタウロスポリンの濃度と観察対象物とした細胞塊の体積との関係を図４８に、添加したスタウロスポリンの濃度（指数表示）と閾値法により決定された非分断領域（生細胞領域）の割合との関係を図４９に、それぞれ示す。
【0223】
Ａ５４９細胞塊同様、ＨｅｐＧ２細胞塊においても、外形の顕著な変化が生じていない細胞塊について、閾値法を用いて、屈折率の空間変化量を指標に、観察対象物中のプログラムされた細胞死を起こした細胞の領域を決定すること、及び薬物が細胞塊に含まれる細胞のプログラムされた細胞死に与える影響を解析することができた（ＩＣ５０＝２３３ｎＭ）。
【符号の説明】
【0224】
１Ａ～１Ｊ…観察装置、２…記録媒体、１１…光源、１２…レンズ、１３…光入射端、１４…光ファイバ、１５…ファイバカプラ、１６，１７…光ファイバ、１８，１９…光出射端、２１…レンズ、２２…ミラー、２３…レンズ、２４…コンデンサレンズ、２５…対物レンズ、３１…レンズ、３２…ミラー、３３…駆動部、３４…レンズ、４１…ビームスプリッタ、４２…レンズ、４３…撮像部、４４…ミラー，５０…解析部、５１…干渉強度画像取得部、５２…第１複素振幅画像生成部、５３…第２複素振幅画像生成部、５４…２次元位相画像生成部、５５…３次元位相画像生成部、５６…屈折率分布算出部、５７…表示部、５８…記憶部、６０…解析部、６１…干渉強度画像取得部、６２…第１複素振幅画像生成部、６３…第２複素振幅画像生成部、６４…位相共役演算部、６５…２次元位相画像生成部、６６…３次元位相画像生成部、６７…屈折率分布算出部、６８…表示部、６９…記憶部、７０…解析部、７１…干渉強度画像取得部、７２…第１複素振幅画像生成部、７３…第２複素振幅画像生成部、７４…２次元位相画像生成部、７５…３次元位相画像生成部、７６…屈折率分布算出部、７７…第３複素振幅画像生成部、７８…表示部、７９…記憶部。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
