特開 2024-22590 核酸増幅方法、核酸増幅装置及び核酸増幅用チップ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024022590

(43)【公開日】2024-02-16

(54)【発明の名称】核酸増幅方法、核酸増幅装置及び核酸増幅用チップ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6844 20180101AFI20240208BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20240208BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6844 Z

C12M1/00 A

【審査請求】有

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023183244

(22)【出願日】2023-10-25

(62)【分割の表示】P 2019222930の分割

【原出願日】2019-12-10

(71)【出願人】

【識別番号】512132147

【氏名又は名称】杏林製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】山本 隆雄

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029AA23

4B029AA27

4B029BB01

4B029FA15

4B029GA08

4B029GB10

4B063QA01

4B063QQ05

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS32

4B063QS39

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】新たな送液制御機構を用いた核酸増幅方法を提供すること
【解決手段】以下の工程を含む、核酸増幅用チップ及び前記核酸増幅用チップを載置可能な基板を備える核酸増幅装置を用いる核酸増幅方法：工程１：核酸増幅装置の基板上に核酸増幅用チップを載置する工程であって、当該核酸増幅装置が、第１及び第２ヒーター、送液用機構、第１及び第２四方向弁、第１及び第２二方向弁、制御装置、第１及び第２接続部、第１～第９流路を備え、前記核酸増幅用チップが第１及び第２曲線流路、中間流路、接続部、第１及び第２接続流路を備える工程、工程２：核酸増幅用チップにおける接続部と核酸増幅装置における第１及び第２接続部とを接続する工程、工程３：前記送液用機構により試料液に第１曲線流路と第２曲線流路とを中間流路を介して往復させてサーマルサイクリングを行う工程。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の工程を含む、核酸増幅用チップ（２）及び前記核酸増幅用チップ（２）を載置可能な基板（３）を備える核酸増幅装置（１）を用いる核酸増幅方法：
工程１：核酸増幅装置（１）の基板（３）上に核酸増幅用チップ（２）を載置する工程であって、
当該核酸増幅装置（１）が、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０）の移動を可能にする送液用機構（６）、
第１四方向弁（７）及び第２四方向弁（８）、
第１二方向弁（９）及び第２二方向弁（１０）、
第１四方向弁、第２四方向弁、第１二方向弁及び第２二方向弁の切り替えを制御する制御装置（１１）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第１接続部（１２）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第２接続部（１３）、
前記送液用機構と第１四方向弁及び第２四方向弁とを接続する第１流路（１４）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が前記第１接続部（１２）に接続されている第２流路（１５）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２接続部（１３）に接続されている第３流路（１６）、
一端が前記第１四方向弁に（７）接続され、他端が前記第１二方向弁（９）に接続されている第４流路（１７）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２二方向弁（１０）に接続されている第５流路（１８）、
一端が前記第１二方向弁（９）に接続され、他端が流路外に開放されている第６流路（１９）、
一端が前記第２二方向弁（１０）に接続され、他端が流路外に開放されている第７流路（２０）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が流路外に開放されている第８流路（２１）、及び
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が流路外に開放されている第９流路（２２）、
を備え、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置（１）であり、
前記核酸増幅用チップ（２）が、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯とに各々対応する第１曲線流路（２３）及び第２曲線流路（２４）、当該第１曲線流路（２３）及び第２曲線流路（２４）をつなぐ中間流路（２５）、前記核酸増幅装置に接続可能な２つの接続部（２６、２７）、第１曲線流路（２３）と接続部（２６）とをつなぐ第１接続流路（２８）、及び第２曲線流路（２４）と接続部（２７）とをつなぐ第２接続流路（２９）を備える、工程、
工程２：核酸増幅用チップ（２）における接続部（２６、２７）と核酸増幅装置における第１接続部（１２）及び第２接続部（１３）とを接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液に第１曲線流路（２３）と第２曲線流路（２４）とを中間流路（２５）を介して往復させてサーマルサイクリングを行う工程、及び
ただし、工程３において試料液（３０）を前記第１ヒーター（４）側から第２ヒーター（５）側に移動させる場合には第１流路（１４）と第２流路（１５）とを通じ、第４流路（１７）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１流路（１４）と第５流路（１８）とを通じ、第３流路（１６）と第９流路（２２）とを通
じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、かつ第２二方向弁（１０）を閉じた状態とし、第１二方向弁（９）を閉じた状態又は開いた状態とし、
工程３において試料液（３０）を前記第２ヒーター（５）側から第１ヒーター（４）側に移動させる場合には第１流路（１４）と第３流路（１６）とを通じ、第５流路（１８）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、第１流路（１４）と第４流路（１７）とを通じ、第２流路（１５）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１二方向弁（９）を閉じた状態とし、かつ第２二方向弁（１０）を閉じた状態又は開いた状態とし、
工程３において試料液（３０）の移動を止める場合には、第１流路（１４）と第４流路（１７）とを通じ、第２流路（１５）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１流路（１４）と第５流路（１８）を通じ、第３流路（１６）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、かつ第１二方向弁及び／又は第２二方向弁を開けた状態とする。

【請求項2】

請求項１に記載の方法であって、前記核酸増幅装置（１）が、前記中間流路（２５）を通過する試料液（３０）の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器をさらに備え、
前記方法が、工程４：前記中間流路（２５）の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液（３０）の蛍光強度の計測を行う工程をさらに含む、方法。

【請求項3】

前記工程３において、前記制御装置に試料液（３０）の移動に関する前記蛍光検出器からの電気信号が送られ、当該電気信号に基づき、中間流路の試料液（３０）の通過を制御装置が感知し、第１四方向弁、第２四方向弁、第１二方向弁及び第２二方向弁の切り替えを制御する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

核酸増幅用チップ（２）を載置可能な基板（３）、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０）の移動を可能にする送液用機構（６）、
第１四方向弁（７）及び第２四方向弁（８）、
第１二方向弁（９）及び第２二方向弁（１０）、
第１四方向弁、第２四方向弁、第１二方向弁及び第２二方向弁の切り替えを制御する制御装置（１１）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第１接続部（１２）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第２接続部（１３）、
前記送液用機構（６）と第１四方向弁及び第２四方向弁とを接続する第１流路（１４）、一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が前記第１接続部（１２）に接続されている第２流路（１５）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２接続部（１３）に接続されている第３流路（１６）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が前記第１二方向弁（９）に接続されている第４流路（１７）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２二方向弁（１０）に接続されている第５流路（１８）、
一端が前記第１二方向弁（９）に接続され、他端が流路外に開放されている第６流路（１９）、
一端が前記第２二方向弁（１０）に接続され、他端が流路外に開放されている第７流路（２０）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が流路外に開放されている第８流路（２１）、及び
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が流路外に開放されている第９流路（２２）、
を備え、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置（１）。

【請求項5】

以下の工程を含む、核酸増幅用チップ（２’）及び前記核酸増幅用チップ（２’）を載置可能な基板（３’）を備える核酸増幅装置（１’）を用いる核酸増幅方法：
工程１：核酸増幅装置（１’）の基板（３’）上に核酸増幅用チップ（２’）を載置する工程であって、
当該核酸増幅装置（１’）が、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４’）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５’）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０’）の移動を可能にする送液用機構（６’）、
第１三方向弁（７’）及び第２三方向弁（８’）、
第１三方向弁（７’）、第２三方向弁（８’）、送液用機構（６’）の駆動を制御する制御装置（１１’）、
前記核酸増幅用チップ（２’）に接続可能な第１接続部（１２’）、
前記核酸増幅用チップ（２’）に接続可能な第２接続部（１３’）、
前記送液用機構と第１三方向弁（７’）及び第２三方向弁（８’）とを接続する第１流路（１４’）、
一端が前記第１三方向弁（７’）に接続され、他端が前記第１接続部（１２’）に接続されている第２流路（１５’）、
一端が前記第２三方向弁（８’）に接続され、他端が前記第２接続部（１３’）に接続されている第３流路（１６’）、
一端が前記第１三方向弁（７’）に接続され、他端が流路外に開放されている第４流路（２１”）、及び
一端が前記第２三方向弁（８’）に接続され、他端が流路外に開放されている第５流路（２２”）
を備え、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置（１’）であり、
前記核酸増幅用チップ（２’）が、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯とに各々対応する第１曲線流路（２３’）及び第２曲線流路（２４’）、当該第１曲線流路（２３’）及び第２曲線流路（２４’）をつなぐ中間流路（２５’）、前記核酸増幅装置に接続可能な２つの接続部（２６’、２７’）、第１曲線流路（２３’）と接続部とをつなぐ第１接続流路（２８’）、及び第２曲線流路（２４’）と接続部とをつなぐ第２接続流路（２９’）を備える、工程、
工程２：核酸増幅用チップ（２’）における接続部（２６’、２７’）と核酸増幅装置（１’）における第１接続部（１２’）及び第２接続部（１３’）とを接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液を第一曲線流路（２３’）と第２曲線流路（２４’）とを中間流路（２５’）を介して往復させてサーマルサイクリングを行う工程、及びただし、工程３において試料液（３０’）を前記第１ヒーター（４’）側から第２ヒーター（５’）側に移動させる場合には第１流路（１４’）と第２流路（１５’）とを通じさせ、第４流路（２１”）は第１流路（１４’）及び第２流路（１５’）とは通じていない状態になるように前記第１三方向弁（７’）を制御し、第３流路（１６）と第５流路（２２”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第３流路（１６’）と第５流路（２２”）とは通じていない状態になるように前記第２三方向弁（８’）を制御し、試料液が前記中間流路（２５’）を通過する速度が１００ｍｍ／ｓ以下となるように送液用機構（６’）が制御され、
工程３において試料液（３０’）を前記第２ヒーター（５’）側から第１ヒーター（４’
）側に移動させる場合には第１流路（１４’）と第３流路（１６’）とを通じさせ、第５流路（２２”）は第１流路（１４’）及び第３流路（１６’）とは通じていない状態になるように前記第２三方向弁（８’）を制御し、第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とは通じていない状態になるように前記第１三方向弁（７’）を制御し、試料液（３０’）が前記中間流路（２５’）を通過する速度が１００ｍｍ／ｓ以下となるように送液用機構（６’）が制御され、
工程３において試料液（３０’）の移動を止める場合には、第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とは通じていない状態になるように前記第１三方向弁（７’）を制御し、第３流路（１６’）と第５流路（２２”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第３流路（１６’）と第５流路（２２”）とは通じていない状態になるように前記第２三方向弁（８’）を制御し、かつ前記第１三方向弁（７’）及び前記第２三方向弁（８’）の両弁を前記状態に制御後２秒以内に送液用機構（６’）を停止させる。

【請求項6】

請求項５に記載の方法であって、前記核酸増幅装置（１’）が、前記中間流路（２５’）を通過する前記試料液（３０’）の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器を備え、
前記方法が、前記中間流路（２５’）の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程を含む、方法。

【請求項7】

前記工程３において、前記制御装置（１１’）に試料液（３０’）の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られ、当該電気信号に基づき、中間流路（２５’）の試料液（３０’）の通過を制御装置が感知し、第１三方向弁（７’）、第２三方向弁（８’）、送液用機構（６’）の駆動を制御する、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記第１流路（１４’）の内部断面が、第１曲線流路（２３’）、第２曲線流路（２４’）及び中間流路（２５’）の内部断面より大きい流路である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸増幅方法、核酸増幅装置及び核酸増幅用チップに関する。

【背景技術】

【0002】

核酸の検出は、医学分野（医薬品の研究開発、臨床検査、法医学等）、農学分野（農作物、病原性微生物の種類の同定等）、様々な分野において中核となるものである。そして、ＤＮＡのある特定領域を選択的に増幅するＰＣＲ法は、核酸検出のための非常に有用な技術である。

【0003】

汎用のＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ用サーマルサイクラーにおける巨大な熱容量に起因してＰＣＲ反応に長時間を要するという課題があったところ流路チップを用いて複数の温度帯上へ繰り返し送液することでサーマルサイクルを高速化する手法が開発されている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第6226284号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、新たな送液制御機構を用いた核酸増幅方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、流路チップの試料送液の制御をポンプではなく、切換弁を用いて行うことを検討した。しかしながら、ポンプを駆動させたままで切換弁の開閉を行うと、ポンプに直接接続された流路では空気の逃げ場がなく流路内圧力が過剰となるためポンプ破損・劣化の原因となる。
そこで、本発明者は、送液用機構を１つ有する核酸増幅装置において、四方向弁とともに二方向弁を用いることにより、流路内圧力の上昇を回避できることを見出した。

【0007】

さらに本発明者らは、かかる新規の知見に基づき、送液用機構と２種類の弁をつなぐ流路の配置等を適宜修正することにより、本発明を完成するに至った。

【0008】

従って、本発明の１つは以下の項を提供する：
項１．以下の工程を含む、核酸増幅用チップ（２）及び前記核酸増幅用チップ（２）を載置可能な基板（３）を備える核酸増幅装置（１）を用いる核酸増幅方法：
工程１：核酸増幅装置（１）の基板（３）上に核酸増幅用チップ（２）を載置する工程であって、
当該核酸増幅装置（１）が、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０）の移動を可能にする送液用機構（６）、
第１四方向弁（７）及び第２四方向弁（８）、
第１二方向弁（９）及び第２二方向弁（１０）、
第１四方向弁、第２四方向弁、第１二方向弁及び第２二方向弁の切り替えを制御する制御装置（１１）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第１接続部（１２）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第２接続部（１３）、
前記送液用機構と第１四方向弁及び第２四方向弁とを接続する第１流路（１４）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が前記第１接続部（１２）に接続されている第２流路（１５）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２接続部（１３）に接続されている第３流路（１６）、
一端が前記第１四方向弁に（７）接続され、他端が前記第１二方向弁（９）に接続されている第４流路（１７）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２二方向弁（１０）に接続されている第５流路（１８）、
一端が前記第１二方向弁（９）に接続され、他端が流路外に開放されている第６流路（１９）、
一端が前記第２二方向弁（１０）に接続され、他端が流路外に開放されている第７流路（２０）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が流路外に開放されている第８流路（２１）、及び
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が流路外に開放されている第９流路（２２）、
を備え、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置（１）であり、
前記核酸増幅用チップ（２）が、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯とに各々対応する第１曲線流路（２３）及び第２曲線流路（２４）、当該第１曲線流路（２３）及び第２曲線流路（２４）をつなぐ中間流路（２５）、前記核酸増幅装置に接続可能な２つの接続部（２６、２７）、第１曲線流路（２３）と接続部（２６）とをつなぐ第１接続流路（２８）、及び第２曲線流路（２４）と接続部（２７）とをつなぐ第２接続流路（２９）を備える、工程、
工程２：核酸増幅用チップ（２）における接続部（２６、２７）と核酸増幅装置における第１接続部（１２）及び第２接続部（１３）とを接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液に第１曲線流路（２３）と第２曲線流路（２４）とを中間流路（２５）を介して往復させてサーマルサイクリングを行う工程、及び
ただし、工程３において試料液（３０）を前記第１ヒーター（４）側から第２ヒーター（５）側に移動させる場合には第１流路（１４）と第２流路（１５）とを通じ、第４流路（１７）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１流路（１４）と第５流路（１８）とを通じ、第３流路（１６）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、かつ第２二方向弁（１０）を閉じた状態とし、第１二方向弁（９）を閉じた状態又は開いた状態とし、
工程３において試料液（３０）を前記第２ヒーター（５）側から第１ヒーター（４）側に移動させる場合には第１流路（１４）と第３流路（１６）とを通じ、第５流路（１８）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、第１流路（１４）と第４流路（１７）とを通じ、第２流路（１５）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１二方向弁（９）を閉じた状態とし、かつ第２二方向弁（１０）を閉じた状態又は開いた状態とし、
工程３において試料液（３０）の移動を止める場合には、第１流路（１４）と第４流路（１７）とを通じ、第２流路（１５）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１流路（１４）と第５流路（１８）を通じ、第３流路（１６）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、かつ第１二方向弁及び／又は第２二方向弁を開けた状態とする。

【0009】

項２．項１に記載の方法であって、前記核酸増幅装置（１）が、前記中間流路（２５）
を通過する試料液（３０）の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器をさらに備え、
前記方法が、工程４：前記中間流路（２５）の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液（３０）の蛍光強度の計測を行う工程をさらに含む、方法。

【0010】

項３．前記工程３において、前記制御装置に試料液（３０）の移動に関する前記蛍光検出器からの電気信号が送られ、当該電気信号に基づき、中間流路の試料液（３０）の通過を制御装置が感知し、第１四方向弁、第２四方向弁、第１二方向弁及び第２二方向弁の切り替えを制御する、項２に記載の方法。

【0011】

項４．核酸増幅用チップ（２）を載置可能な基板（３）、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０）の移動を可能にする送液用機構（６）、
第１四方向弁（７）及び第２四方向弁（８）、
第１二方向弁（９）及び第２二方向弁（１０）、
第１四方向弁、第２四方向弁、第１二方向弁及び第２二方向弁の切り替えを制御する制御装置（１１）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第１接続部（１２）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第２接続部（１３）、
前記送液用機構（６）と第１四方向弁及び第２四方向弁とを接続する第１流路（１４）、一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が前記第１接続部（１２）に接続されている第２流路（１５）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２接続部（１３）に接続されている第３流路（１６）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が前記第１二方向弁（９）に接続されている第４流路（１７）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２二方向弁（１０）に接続されている第５流路（１８）、
一端が前記第１二方向弁（９）に接続され、他端が流路外に開放されている第６流路（１９）、
一端が前記第２二方向弁（１０）に接続され、他端が流路外に開放されている第７流路（２０）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が流路外に開放されている第８流路（２１）、及び
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が流路外に開放されている第９流路（２２）、
を備え、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置（１）。

【0012】

また、本発明者は、送液用機構を１つ有する核酸増幅装置において、三方向弁を用い、ポンプによる試料速度等を調整することによっても、流路内圧力の上昇を回避できることを見出した。

【0013】

さらに本発明者らは、かかる新規の知見に基づき、送液用機構と弁とをつなぐ流路の配置、ポンプによる試料速度、ポンプの停止条件を設定することにより、本発明の１つを完成するに至った。
従って、本発明の１つは以下の項を提供する：
項５．以下の工程を含む、核酸増幅用チップ（２’）及び前記核酸増幅用チップ（２’）を載置可能な基板（３’）を備える核酸増幅装置（１’）を用いる核酸増幅方法：
工程１：核酸増幅装置（１’）の基板（３’）上に核酸増幅用チップ（２’）を載置する工程であって、
当該核酸増幅装置（１’）が、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４’）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５’）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０’）の移動を可能にする送液用機構（６’）、
第１三方向弁（７’）及び第２三方向弁（８’）、
第１三方向弁（７’）、第２三方向弁（８’）、送液用機構（６’）の駆動を制御する制御装置（１１’）、
前記核酸増幅用チップ（２’）に接続可能な第１接続部（１２’）、
前記核酸増幅用チップ（２’）に接続可能な第２接続部（１３’）、
前記送液用機構と第１三方向弁（７’）及び第２三方向弁（８’）とを接続する第１流路（１４’）、
一端が前記第１三方向弁（７’）に接続され、他端が前記第１接続部（１２’）に接続されている第２流路（１５’）、
一端が前記第２三方向弁（８’）に接続され、他端が前記第２接続部（１３’）に接続されている第３流路（１６’）、
一端が前記第１三方向弁（７’）に接続され、他端が流路外に開放されている第４流路（２１”）、及び
一端が前記第２三方向弁（８’）に接続され、他端が流路外に開放されている第５流路（２２”）
を備え、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置（１’）であり、
前記核酸増幅用チップ（２’）が、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯とに各々対応する第１曲線流路（２３’）及び第２曲線流路（２４’）、当該第１曲線流路（２３’）及び第２曲線流路（２４’）をつなぐ中間流路（２５’）、前記核酸増幅装置に接続可能な２つの接続部（２６’、２７’）、第１曲線流路（２３’）と接続部とをつなぐ第１接続流路（２８’）、及び第２曲線流路（２４’）と接続部とをつなぐ第２接続流路（２９’）を備える、工程、
工程２：核酸増幅用チップ（２’）における接続部（２６’、２７’）と核酸増幅装置（１’）における第１接続部（１２’）及び第２接続部（１３’）とを接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液を第一曲線流路（２３’）と第２曲線流路（２４’）とを中間流路（２５’）を介して往復させてサーマルサイクリングを行う工程、及びただし、工程３において試料液（３０’）を前記第１ヒーター（４’）側から第２ヒーター（５’）側に移動させる場合には第１流路（１４’）と第２流路（１５’）とを通じさせ、第４流路（２１”）は第１流路（１４’）及び第２流路（１５’）とは通じていない状態になるように前記第１三方向弁（７’）を制御し、第３流路（１６）と第５流路（２２”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第３流路（１６’）と第５流路（２２”）とは通じていない状態になるように前記第２三方向弁（８’）を制御し、試料液が前記中間流路（２５’）を通過する速度が１００ｍｍ／ｓ以下となるように送液用機構（６’）が制御され、
工程３において試料液（３０’）を前記第２ヒーター（５’）側から第１ヒーター（４’）側に移動させる場合には第１流路（１４’）と第３流路（１６’）とを通じさせ、第５流路（２２”）は第１流路（１４’）及び第３流路（１６’）とは通じていない状態になるように前記第２三方向弁（８’）を制御し、第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とは通じていない状態になるように前記第１三方向弁（７’）を制御し、試料液（３０’）が前記中間流路（２５’）を通過する速度が１００ｍｍ／ｓ以下となるように送液用機構（６’）が制御され、
工程３において試料液（３０’）の移動を止める場合には、第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とは通じていない状態になるように前記第１三方向弁（７’）を制御し、第３流路（１６’）と第５流路（２２”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第３流路（１６’）と第５流路（２２”）とは通じていない状態になるように前記第２三方向弁（８’）を制御し、かつ前記第１三方向弁（７’）及び前記第２三方向弁（８’）の両弁を前記状態に制御後２秒以内に送液用機構（６’）を停止させる。

【0014】

項６．項５に記載の方法であって、前記核酸増幅装置（１’）が、前記中間流路（２５’）を通過する前記試料液（３０’）の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器を備え、
前記方法が、前記中間流路（２５’）の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程を含む、方法。

【0015】

項７．前記工程３において、前記制御装置（１１’）に試料液（３０’）の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られ、当該電気信号に基づき、中間流路（２５’）の試料液（３０’）の通過を制御装置が感知し、第１三方向弁（７’）、第２三方向弁（８’）、送液用機構（６’）の駆動を制御する、項６に記載の方法。

【0016】

項８．前記第１流路（１４’）の内部断面が、第１曲線流路（２３’）、第２曲線流路（２４’）及び中間流路（２５’）の内部断面より大きい流路である、項５～７のいずれか一項に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明における核酸増幅装置（１）及び核酸増幅用チップ（２）の一実施形態を示す。

【図2】四方向弁の概要を示す。

【図3】別の実施形態における四方向弁の概要を示す。

【図4】工程３における試料液、空気の流れの概略を示す。

【図5】工程３における試料液、空気の流れの概略を示す。

【図6】工程３における試料液、空気の流れの概略を示す。

【図7】二方向弁の概要を示す。（ａ）は、異なる面に２つのポートが存在する弁であり、（ｂ）は同一方向の面に２つのポートが存在する弁を表す。

【図8】本発明における核酸増幅装置（１’）及び核酸増幅用チップ（２’）の一実施形態を示す。

【図9】三方向弁の概要を示す。（ａ）は、１つの面に２つのポートが存在し、反対方向の面に１つのポートが存在する弁であり、（ｂ）は同一方向の面に３つのポートが存在する弁を表す。

【図10】工程３’における試料液、空気の流れの概略を示す。

【図11】工程３’における試料液、空気の流れの概略を示す。

【図12】工程３’における試料液、空気の流れの概略を示す。

【図13】流路チップの一実施形態を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下に図面を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの図面に具現化された特定の実施形態に特定されない。

【0019】

［Ｉ］四方向弁を用いた核酸増幅方法
図１に、本発明の核酸増幅で用いる核酸増幅装置（１）及び核酸増幅用チップ（２）の一実施形態を示す。図１に示すように、核酸増幅装置（１）は、
核酸増幅用チップを載置可能な基板（３）、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０）の移動を可能にする送液用機構（６）、
第１四方向弁（７）及び第２四方向弁（８）、
第１二方向弁（９）及び第２二方向弁（１０）、
第１四方向弁（７）、第２四方向弁（８）、第１二方向弁（９）及び第２二方向弁（１０）の切り替えを制御する制御装置（１１）、
前記核酸増幅用チップに接続可能な第１接続部（１２）、
前記核酸増幅用チップに接続可能な第２接続部（１３）、
前記送液用機構と第１四方向弁及び第２四方向弁とを接続する第１流路（１４）、
一端が前記第１四方向弁に接続され、他端が前記第１接続部に接続されている第２流路（１５）、
一端が前記第２四方向弁に接続され、他端が前記第２接続部に接続されている第３流路（１６）、
一端が前記第１四方向弁に接続され、他端が前記第１二方向弁に接続されている第４流路（１７）、
一端が前記第２四方向弁に接続され、他端が前記第２二方向弁に接続されている第５流路（１８）、
一端が前記第１二方向弁に接続され、他端が流路外に開放されている第６流路（１９）、一端が前記第２二方向弁に接続され、他端が流路外に開放されている第７流路（２０）、一端が前記第１四方向弁に接続され、他端が流路外に開放されている第８流路（２１）、及び
一端が前記第２四方向弁に接続され、他端が流路外に開放されている第９流路（２２）、を備える。

【0020】

本発明において、前記第１ヒーター（４）は、変性温度帯を形成できるものであれば特に限定されない。前記第２ヒーター（５）は、伸長・アニーリング温度帯を形成できるものであれば特に限定されない。第１ヒーター（４）及び第２ヒーター（５）の具体例としては、カートリッジヒーター、フィルムヒーター、ペルチェヒーター等が例示される。変性温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡ変性反応に必要な温度に維持されている。変性温度帯の温度は９０～１００℃程度が好ましく、９３～９８℃程度がより好ましい。伸長・アニーリング温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡのアニーリング反応及び伸長反応のために必要な温度に維持されている。伸長・アニーリング温度帯の温度は４０～７５℃程度が好ましく、５５～６５℃程度がより好ましい。

【0021】

送液用機構（６）としては流路及びチップ流路の空気の移動を介して試料液を移動させることができるものであれば特に限定されず、マイクロブロア、ファン、シリンジポンプ等が挙げられる。

【0022】

マイクロブロア（圧電マイクロブロアともいう）とは、空気を吸引及び吐出する公知の装置であり、密閉構造でない（逆止弁を有しない）ことを特徴とする。代表的なマイクロブロアにおいて、圧電素子への電圧印加によりダイヤフラムを屈曲変形させることで、空気の吸引及び吐出を実現する。マイクロブロアとしては、例えば、株式会社村田製作所が製造したものを使用することができる（ＭＺＢ１００１Ｔ０２，ＭＺＢ３００４Ｔ０４、ＭＺＢ３００５Ｔ０６、ＭＺＢ４００１Ｔ０５)。

【0023】

ファンとは、羽根車の回転運動によって送風を行う装置をいう。羽根車の構造上の特性上、流路を閉鎖系としない。

【0024】

本発明において、四方向弁とは、弁の切り替え前後において共に２組の２つの流路（合計４つの流路）をつないでいる弁を意味する。例えば、図２に示すように、四方向弁が流路Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤをつなぐ場合、当該四方向弁を制御することにより流路ＡとＢ，流路ＣとＤとをそれぞれつなぐ状態から、流路ＡとＤ、流路ＢとＣとをそれぞれつなぐ状態に切り替えることができる。また、本発明において、四方向弁は、弁の切り替え前後において共に２組の２つの流路をつないでいる弁であれば、特に限定されず、例えば、図３に示すようなメカニズムにより流路をつないでいる弁も「四方向弁」に包含される。

【0025】

好ましくは、４つまたは５つの接続口を持っている四方向電磁弁である。

【0026】

また、本発明において二方向弁とは、２つの流路をつなぐ弁であって、その制御により、弁を閉じたり開けたりすることができるものを示す。例えば、図７に示すような「二方向弁」を挙げることができる。

【0027】

好ましくは、二方向電磁弁でああり、さらに好ましくはＬＶＭ０９Ｒ３（ＳＭＣ株式会社製）のように通常時弁を閉じており、通電時に弁が開く二方向電磁弁である。

【0028】

制御装置（１１）としては、第１四方向弁（７）、第２四方向弁（８）、第１二方向弁（９）及び第２二方向弁（１０）の切り替えを制御するためのＣＰＵ等が挙げられる。また制御装置（１１）は、さらに送液用機構（６）を制御してもよい。

【0029】

本実施形態において、第１流路（１４）、第２流路（１５）、第３流路（１６）、第４流路（１７）、第５流路（１８）、第６流路（１９）、第７流路（２０）、第８流路（２１）、及び第９流路（２２）は、核酸増幅装置（１）における各部材をつなぐ管状の部材である。これらの流路を構成する材料としては特に限定されないが、例えば、シリコン、各種プラスチック等が挙げられる。これらの各流路の断面の形状は、特に限定されず、半円形状、円形状、直方形状、台形状、くさび形、多角形などとすることができる。各流路の断面が略円形の場合、直径としては特に限定されないが、例えば、１～６ｍｍ、好ましくは２～５ｍｍの範囲で設計することができる。

【0030】

核酸増幅用チップ（２）は、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯とに各々対応する第１曲線流路（２３）及び第２曲線流路（２４）、当該第１曲線流路及び第２曲線流路をつなぐ中間流路（２５）、前記核酸増幅装置（１）に接続可能な２つの接続部（２６、２７）、第１曲線流路と接続部とをつなぐ第１接続流路（２８）、及び第２曲線流路と接続部とをつなぐ第２接続流路（２９）を備える。本明細書において、核酸増幅用チップ（２）における第１曲線流路（２３）、第２曲線流路（２４）、中間流路（２５）、第１接続流路（２８）及び第２接続流路（２９）を総称して、単にチップ流路と示す。

【0031】

これらのチップ流路を構成する素材としては特に限定されないが、例えば、ガラス、石英、シリコン、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの熱硬化性又は光硬化性の各種樹脂が等が挙げられる。これらのチップ流路の断面の形状は、特に限定されず、半円形状、円形状、直方形状、台形状、くさび形、多角形などとすることができる。また、チップ流路の断面は、例えば、幅１００～１０００μｍ程度、深さ１００～１０００μｍ程度の直方形状又は台形状とすることができる。好ましくは、幅１００～１０００μｍ程度、深さ１００～１０００μｍ程度の直方形状又は台形状である。また、チップ流路の幅及び深さのそれぞれは、一定、または、部分的に幅若しくは深さが変化するものとすることができる。従って、本明細書において、そうでないことを明示しない限り、各チップ流路について、「幅」とは当該チップ流路の幅の平均値を示す。同様に、本明細書において、そうでないことを明示しない限り、各チップ流路について、「深さ」とは当該チップ流路の深
さの平均値を示す。

【0032】

変性温度帯に対応する第１曲線流路（２３）及び伸長・アニーリング温度帯に対応する第２曲線流路（２４）のそれぞれの長さは、２０ｍｍ以上であることが好ましい。

【0033】

次に、核酸増幅用チップにおける接続部（２６、２７）と核酸増幅装置（１）における第１接続部（１２）及び第２接続部（１３）とを接続する工程を行う。当該工程により、核酸増幅装置（１）からの空気の流れを核酸増幅用チップに送ることができるようにする。なお、核酸増幅用チップ（２）と核酸増幅装置（１）との接続は、核酸増幅用チップ（２）の核酸増幅装置（１）の基板（３）への載置と同時に行われてもよい。

【0034】

そして、前記送液用機構（６）により試料液（３０）を第１曲線流路（２３）及び第２曲線流路（２４）とを往復させてサーマルサイクリングを行う工程を行う。図４に示すように、当該工程３において、試料液（３０）を前記第１ヒーター（４）側から第２ヒーター（５）側に移動させる場合には、第１流路（１４）と第２流路（１５）とを通じ、第４流路（１７）と第８流路（２１）とを通じさせるように第１四方向弁（７）を制御する。この場合、第１二方向弁（９）は開けていても閉じていてもよい。一方、第１流路（１４）と第５流路（１８）とを通じ、第３流路（１６）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、かつ第２二方向弁（１０）を閉じる。送液用機構（６）から送り出された空気は、第１四方向弁（７）及び第２四方向弁（８）に向かう。第２四方向弁（８）側については、第２二方向弁（１０）が閉じているためその先に抜けることができない。一方第１四方向弁（７）側は、第２流路（１５）、核酸増幅用チップ（２）における第１曲線流路（２３）、中間流路（２５）及び第２曲線流路（２４）、第３流路（１６）、第２四方向弁（８）及び第９流路（２２）を介して末端が流路外に開放されるため、送液用機構（６）からの空気の圧力により試料液（３０）は第２ヒーター（５）側に移動する。

【0035】

図５に示すように、工程３において試料液（３０）の移動を止める場合には、第１流路（１４）と第４流路（１７）とを通じ、第２流路（１５）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１流路（１４）と第５流路（１８）とを通じ、第３流路（１６）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御する。この場合、第１二方向弁（９）と第２二方向弁（１０）の少なくとも１つを開放する。これにより、核酸増幅用チップ（２）中のチップ流路ならびに核酸増幅装置（１）における第２流路（１５）及び第３流路（１６）の残圧が第８流路（２１）及び第９流路（２２）から抜けるため、流路中の残圧による望まれない試料液（３０）の移動を抑えることができる。さらに、送液用機構（６）から送り出された空気が第１流路（１４）から、第４流路（１７）及び第６流路（１９）を介して流路外に放出されるか、あるいは第５流路（１８）及び第７流路（２０）を介しても流路外に放出されるため、第１流路（１４）内の圧力が過剰にならず、送液用機構（６）の損傷・劣化を回避できる。本発明のうち四方向弁を用いる実施形態は、送液用機構（６）の制御でなく弁の制御のみにより送液制御が可能となる点で好ましい。

【0036】

図６に示すように、当該工程３において、試料液（３０）を前記第２ヒーター（５）側から第１ヒーター（４）側に移動させる場合には第１流路（１４）と第３流路（１６）とを通じ、第５流路（１８）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御する。この場合、第２二方向弁（１０）は開けていても閉じていてもよい。一方、第１流路（１４）と第４流路（１７）とを通じ、第２流路（１５）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、かつ第１二方向弁（９）を閉じる。送液用機構（６）から送り出された空気は第１四方向弁（７）及び第２四方向弁（８）に向かう。
第１四方向弁（７）側については、第１二方向弁（９）が閉じているためその先に抜けることができない。一方第２四方向弁（８）側は、第３流路（１６）、核酸増幅用チップ（２）における第２曲線流路（２４）、中間流路（２５）及び第１曲線流路（２３）、第２流路（１５）、第１四方向弁（７）及び第８流路（２１）を介して末端が流路外に開放されるため、送液用機構（６）からの空気の圧力により試料液（３０）は第１ヒーター（４）側に移動する。

【0037】

以上、図面を参照して本発明の典型的な実施形態を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されない。例えば、核酸増幅用チップ（２）のチップ流路に対しフィルター領域（３１、３２）、サンプル注入口（３３）、逆転写反応領域等が存在していても良い。

【0038】

また、本発明においては、前記核酸増幅装置（１）が、前記中間流路を通過する試料液（３０）の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器（図示せず）をさらに備えてもよい。

【0039】

また、本発明の好ましい実施形態において、前記工程３において、前記制御装置（１１）に試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られ、当該電気信号に基づき、中間流路（２５）の試料液（３０）の通過を制御装置が感知し、第１四方向弁（７）、第２四方向弁（８）、第１二方向弁（９）及び第２二方向弁（１０）の切り替えを制御してもよい。また、中間流路（２５）の試料液（３０）の通過を感知するための蛍光検出器を試料液（３０）の核酸増幅を測定するための蛍光検出器とは別に設置してもよい。

【0040】

［ＩＩ］三方向弁を用いた核酸増幅方法
図８に、本発明の核酸増幅で用いる核酸増幅装置（１’）及び核酸増幅用チップ（２’）の一実施形態を示す。図８に示すように、核酸増幅装置（１’）は、
核酸増幅用チップを載置可能な基板（３’）、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４’）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５’）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０’）の移動を可能にする送液用機構（６’）、
第１三方向弁（７’）及び第２四方向弁（８’）、
第１三方向弁（７’）、第２三方向弁（８’）及び送液用機構（６’）の駆動を制御する制御装置（１１’）、
前記核酸増幅用チップ（２’）に接続可能な第１接続部（１２’）、
前記核酸増幅用チップ（２’）に接続可能な第２接続部（１３’）、
前記送液用機構（６‘）と第１三方向弁（７’）及び第２三方向弁（８’）とを接続する第１流路（１４’）、
一端が前記第１三方向弁（７’）に接続され、他端が前記第１接続部（１２’）に接続されている第２流路（１５’）、
一端が前記第２三方向弁（８’）に接続され、他端が前記第２接続部（１３’）に接続されている第３流路（１６’）、
一端が前記第１三方向弁（７’）に接続され、他端が流路外に開放されている第４流路（２１”）、及び
一端が前記第２三方向弁（８’）に接続され、他端が流路外に開放されている第５流路（２２”）、を備える。

【0041】

本発明において、前記第１ヒーター（４’）は、変性温度帯を形成できるものであれば特に限定されない。前記第２ヒーター（５’）は、伸長・アニーリング温度帯を形成できるものであれば特に限定されない。第１ヒーター（４’）及び第２ヒーター（５’）の具体例としては、カートリッジヒーター、フィルムヒーター、ペルチェヒーター等が例示される。変性温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡ変性反応に必要な温度に維持されている。変
性温度帯の温度は９０～１００℃程度が好ましく、９３～９８℃程度がより好ましい。伸長・アニーリング温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡのアニーリング反応及び伸長反応のために必要な温度に維持されている。伸長・アニーリング温度帯の温度は４０～７５℃程度が好ましく、５５～６５℃程度がより好ましい。

【0042】

送液用機構（６’）としては流路及びチップ流路の空気の移動を介して試料液を移動させることができるものであれば特に限定されず、マイクロブロア、ファン、シリンジポンプ等が挙げられる。

【0043】

マイクロブロア（圧電マイクロブロアともいう）とは、空気を吸引及び吐出する公知の装置であり、密閉構造でない（逆止弁を有しない）ことを特徴とする。代表的なマイクロブロアにおいて、圧電素子への電圧印加によりダイヤフラムを屈曲変形させることで、空気の吸引及び吐出を実現する。マイクロブロアとしては、例えば、株式会社村田製作所が製造したものを使用することができる（ＭＺＢ１００１Ｔ０２，ＭＺＢ３００４Ｔ０４、ＭＺＢ３００５Ｔ０６、ＭＺＢ４００１Ｔ０５)。

【0044】

ファンとは、羽根車の回転運動によって送風を行う装置をいう。羽根車の構造上の特性上、流路を閉鎖系としない。

【0045】

本発明において、三方向弁とは、例えば、図８に示すように、三方向弁が流路Ａ、Ｂ及びＣをつなぐ場合、当該三方向弁を制御することにより流路ＡとＢをつなぐ状態から、流路ＡとＣとをつなぐ状態に切り替えることができる。また、例えば、図９に示すように１つの流路を開けば他方の流路を閉じるようにつないでいる弁も「三方向弁」に包含される。

【0046】

好ましくは、三方向電磁弁であり、例えば、ＬＶＭ０９５Ｒ（ＳＭＣ株式会社製）を挙げることができる
制御装置（１１’）としては、第１三方向弁（７’）、第２三方向弁（８’）及び送液用機構（６’）の駆動を制御するためのＣＰＵ等が挙げられる。

【0047】

本実施形態において、第１流路（１４’）、第２流路（１５’）、第３流路（１６’）、第４流路（２１”）、及び第５流路（２２”）は、核酸増幅装置（１’）における各部材をつなぐ管状の部材である。これらの流路を構成する材料としては特に限定されないが、例えば、シリコン、各種プラスチック等が挙げられる。これらの各流路の断面の形状は、特に限定されず、半円形状、円形状、直方形状、くさび形、多角形などとすることができる。各流路の断面が略円形の場合、直径としては特に限定されないが、例えば、１～６ｍｍ、好ましくは２～５ｍｍの範囲で設計することができる。

【0048】

核酸増幅用チップ（２’）は、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯とに各々対応する第１曲線流路（２３’）及び第２曲線流路（２４’）、当該第１曲線流路（２３’）及び第２曲線流路（２４’）をつなぐ中間流路（２５’）、前記核酸増幅装置（１’）に接続可能な２つの接続部（２６’、２７’）、第１曲線流路（２３’）と接続部（２６’）とをつなぐ第１接続流路（２８）、及び第２曲線流路（２４’）と接続部（２７’）とをつなぐ第２接続流路（２９’）を備える。本明細書において、核酸増幅用チップ（２’）における第１曲線流路（２３’）、第２曲線流路（２４’）、中間流路（２５’）、第１接続流路（２８’）及び第２接続流路（２９’）を総称して、単にチップ流路と示す。

【0049】

これらのチップ流路を構成する素材としては特に限定されないが、例えば、ガラス、石英、シリコン、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの熱硬化性又は光硬化性の各種
樹脂が等が挙げられる。これらのチップ流路の断面の形状は、特に限定されず、半円形状、円形状、直方形状、台形形状、くさび形、多角形などとすることができる。また、チップ流路の断面は、例えば、幅１００～１０００μｍ程度、深さ１００～１０００μｍ程度の直方形状又は台形形状とすることができる。好ましくは、幅１００～１０００μｍ程度、深さ１００～１０００μｍ程度の直方形状又は台形状である。また、チップ流路の幅及び深さのそれぞれは、一定、または、部分的に幅若しくは深さが変化するものとすることができる。従って、本明細書において、そうでないことを明示しない限り、各チップ流路について、「幅」とは当該チップ流路の幅の平均値を示す。同様に、本明細書において、そうでないことを明示しない限り、各チップ流路について、「深さ」とは当該チップ流路の深さの平均値を示す。

【0050】

変性温度帯に対応する第１曲線流路（２３’）及び伸長・アニーリング温度帯に対応する第２曲線流路（２４’）のそれぞれの長さは、２０ｍｍ以上であることが好ましい。

【0051】

次に、核酸増幅用チップにおける接続部（２６’、２７’）と核酸増幅装置（１’）における第１接続部（１２’）及び第２接続部（１３’）とを接続する工程を行う。当該工程により、核酸増幅装置（１’）からの空気の流れを核酸増幅用チップ（２’）に送ることができるようにする。なお、核酸増幅用チップ（２’）と核酸増幅装置（１’）との接続は、核酸増幅用チップ（２’）の核酸増幅装置（１’）の基板（３’）への載置と同時に行われてもよい。

【0052】

そして、前記送液用機構（６’）により試料液（３０’）を第１曲線流路（２３’）及び第２曲線流路（２４’）とを往復させてサーマルサイクリングを行う工程を行う。
図１０に示すように、当該工程３’において、試料液（３０’）を前記第１ヒーター（４’）側から第２ヒーター（５’）側に移動させる場合には、第１流路（１４’）と第２流路（１５’）とを通じ、第４流路（２１”）は第１流路（１４’）及び第２流路（１５’）とは通じていない状態になるように第１三方向弁（７’）を制御する。一方、第３流路（１６’）と第５流路（２２”）とを通じ、第１流路（１４’）は第三流路（１６’）及び第５流路（２２”）とは通じていない状態になるように前記第２三方向弁（８’）を制御する。送液用機構（６’）から送り出された空気は、第１三方向弁（７’）及び第２三方向弁（８’）に向かう。第２三方向弁（８’）側については、空気はその先に抜けることができない。一方第１三方向弁（７’）側は、第２流路（１５’）、核酸増幅用チップ（２’）における第１曲線流路（２３’）、中間流路（２５’）及び第２曲線流路（２４’）、第３流路（１６’）、第２三方向弁（８’）及び第５流路（２２”）を介して末端が流路外に開放されるため、送液用機構（６’）からの空気の圧力により試料液（３０’）は第２ヒーター（５’）側に移動する。

【0053】

図１１に示すように、工程３’において試料液（３０’）の移動を止める場合には、第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とを通じ、第１流路（１４’）は第２流路（１５’）及び第４流路（２１”’）と通じていない状態になるように前記第１三方向弁（７’）を制御し、第３流路（１６’）と第５流路（２２”）とを通じ、第１流路（１４’）は第３流路（１６’）及び第５流路（２２”）とは通じていない状態になるように前記第２三方向弁（８’）を制御する。これにより、核酸増幅用チップ（２’）中のチップ流路ならびに核酸増幅装置（１’）における第２流路（１５’）及び第３流路（１６’）の残圧が第４流路（２１”）及び第５流路（２２”）から抜けるため、流路中の残圧による望まれない試料液（３０’）の移動を抑えることができる。さらに、送液用機構（６’）から送り出す空気を、前記中間流路での速度を１００ｍｍ／ｓ以下（好ましくは３０～７０ｍｍ／ｓ）となるように制限するとともに第１三方向弁（７’）及び第２三方向弁（８’）を前記状態に制御後２秒以内に停止させるよう制御することにより、第１流路（１４’）内の圧力が過剰にならず、送液用機構（６’）の損傷・劣化を回避できる。好ましくは第
１三方向弁（７’）及び第２三方向弁（８’）を制御後１秒以内、さらに好ましくは０．５秒以内である。本発明のうち四方向弁ではなく三方弁を用いる実施形態は、電気消費量も少なく、装置の小型化の点でも好ましい。

【0054】

図１２に示すように、当該工程３’において、試料液（３０’）を前記第２ヒーター（５’）側から第１ヒーター（４’）側に移動させる場合には第１流路（１４’）と第３流路（１６’）とを通じ、第５流路（２２”）は第１流路（１４’）及び第３流路（１６’）とは通じない状態となるように前記第２三方向弁（８’）を制御する。一方、第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とを通じ、第１流路（１４’）は第２流路（１５’）及び第４流路（２１”）と通じない状態になるように前記第１三方向弁（７’）を制御する。送液用機構（６’）から送り出された空気は第１三方向弁（７’）及び第２三方向弁（８’）に向かう。
第１三方向弁（７’）側については、空気はその先に抜けることができない。一方第２三方向弁（８’）側は、第３流路（１６’）、核酸増幅用チップ（２’）における第２曲線流路（２４’）、中間流路（２５’）及び第１曲線流路（２３’）、第２流路（１５’）、第１三方向弁（７）及び第４流路（２１”）を介して末端が流路外に開放されるため、送液用機構（６’）からの空気の圧力により試料液（３０’）は第１ヒーター（４’）側に移動する。

【0055】

また、本発明においては、前記核酸増幅装置（１’）が、前記中間流路を通過する試料液（３０’）の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器（図示せず）をさらに備えてもよい。

【0056】

また、本発明の好ましい実施形態において、前記工程３’において、前記制御装置（１１’）に試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られ、当該電気信号に基づき、中間流路（２５’）の試料液（３０’）の通過を制御装置が感知し、第１三方向弁（７’）、第２三方向弁（８’）及び送液用機構（６’）の駆動を制御してもよい。また、中間流路（２５’）の試料液（３０’）の通過を感知するための蛍光検出器を試料液（３０’）の核酸増幅を測定するための蛍光検出器とは別に設置してもよい。

【実施例0057】

図１に概要を示す核酸増幅装置（１）及び核酸増幅用チップ（２）を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。測定条件は以下の通り：
核酸増幅装置（１）の各流路の形状：円形
核酸増幅装置（１）の各流路の直径： ３ｍｍ
核酸増幅用チップ（２）のチップ流路の形状： 直方形状
核酸増幅用チップ（２）のチップ流路の幅： ０．５ｍｍ
核酸増幅用チップ（２）のチップ流路の深さ： ０．５ｍｍ
試料液：１５μＬ
リアルタイムＰＣＲにおけるサーマルサイクル条件： 98℃で30秒加熱後、さらに98℃で2秒と58℃で4秒を45サイクル繰り返す。
上記条件でリアルタイムＰＣＲを行うことにより、試料の移動を停止する際の残圧の影響を抑えつつ、第１流路（１４）の過剰な圧力によるポンプへのダメージを抑制すこともできる。

【実施例0058】

図８に概要を示す核酸増幅装置（１’）及び核酸増幅用チップ（２’）を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。測定条件は以下の通り：
核酸増幅装置（１）の各流路の形状：円形
核酸増幅装置（１）の各流路の直径： ３ｍｍ
核酸増幅用チップ（２）のチップ流路の形状： 直方形状
核酸増幅用チップ（２）のチップ流路の幅： ０．５ ｍｍ
核酸増幅用チップ（２）のチップ流路の深さ： ０．５ ｍｍ
試料液：１５μＬ
試料液の中間流路の通過速度を６０ｍｍ／ｓとなるように設定する。
試料液を流路内で停止させるために第１三方向電磁弁及び第２三方向電磁弁を制御後０．４秒以内にポンプを停止する。
リアルタイムＰＣＲにおけるサーマルサイクル条件： 98℃で30秒加熱後、さらに98℃で2秒と58℃で4秒を45サイクル繰り返す。
上記条件でリアルタイムＰＣＲを行うことにより、試料の移動を停止する際の残圧の影響を抑えつつ、第１流路（１４’）の過剰な圧力によるポンプへのダメージを抑制すこともできる。