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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024023091
(43)【公開日】2024-02-21
(54)【発明の名称】固相担体及び対象物の測定用キット
(51)【国際特許分類】
G01N 21/65 20060101AFI20240214BHJP
G01N 21/41 20060101ALI20240214BHJP
【ＦＩ】
G01N21/65
G01N21/41 102
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022126678
(22)【出願日】2022-08-08
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】308036402
【氏名又は名称】株式会社ＪＶＣケンウッド
(71)【出願人】
【識別番号】304020292
【氏名又は名称】国立大学法人徳島大学
(71)【出願人】
【識別番号】390014960
【氏名又は名称】シスメックス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100114937
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 裕幸
(74)【代理人】
【識別番号】100162868
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 英輔
(72)【発明者】
【氏名】小野 雅之
(72)【発明者】
【氏名】宮坂 禎也
(72)【発明者】
【氏名】矢野 隆章
(72)【発明者】
【氏名】岡田 昌也
【テーマコード（参考）】
2G043
2G059
【Ｆターム（参考）】
2G043AA01
2G043EA03
2G043EA14
2G059AA01
2G059BB09
2G059BB12
2G059EE02
(57)【要約】
【課題】ホットスポット以外の領域への対象物の捕捉量を低減可能な、固相担体、及び対象物の測定用キットの提供。
【解決手段】対象物の測定に用いられる固相担体であって、基板と、前記基板の一方の面に配置されたナノ構造体と、を含み、前記ナノ構造体は、表面プラズモン共鳴を励起可能な物質により形成され、光の照射により局在表面プラズモン共鳴が励起されるナノ構造を有するプラズモン励起層と、表面プラズモン共鳴を励起しない物質により形成される被覆層と、を含み、前記プラズモン励起層は、前記被覆層により被覆される被覆領域と、前記被覆層により被覆されない非被覆領域と、を有し、前記非被覆領域は、局在表面プラズモン共鳴が生じるホットスポットを含み、前記被覆層の表面は、前記プラズモン励起層の表面よりも、前記対象物の特異的結合物質に対する結合親和性が低い、固相担体。
【選択図】図２Ｂ
【解決手段】対象物の測定に用いられる固相担体であって、基板と、前記基板の一方の面に配置されたナノ構造体と、を含み、前記ナノ構造体は、表面プラズモン共鳴を励起可能な物質により形成され、光の照射により局在表面プラズモン共鳴が励起されるナノ構造を有するプラズモン励起層と、表面プラズモン共鳴を励起しない物質により形成される被覆層と、を含み、前記プラズモン励起層は、前記被覆層により被覆される被覆領域と、前記被覆層により被覆されない非被覆領域と、を有し、前記非被覆領域は、局在表面プラズモン共鳴が生じるホットスポットを含み、前記被覆層の表面は、前記プラズモン励起層の表面よりも、前記対象物の特異的結合物質に対する結合親和性が低い、固相担体。
【選択図】図２Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象物の測定に用いられる固相担体であって、
基板と、
前記基板の一方の面に配置されたナノ構造体と、を含み、
前記ナノ構造体は、
表面プラズモン共鳴を励起可能な物質により形成され、光の照射により局在表面プラズモン共鳴が励起されるナノ構造を有するプラズモン励起層と、
表面プラズモン共鳴を励起しない物質により形成される被覆層と、を含み、
前記プラズモン励起層は、前記被覆層により被覆された被覆領域と、前記被覆層により被覆されていない非被覆領域と、を有し、
前記非被覆領域は、局在表面プラズモン共鳴が生じるホットスポットを含み、
前記被覆層の表面は、前記プラズモン励起層の表面よりも、前記対象物の特異的結合物質に対する結合親和性が低い、
固相担体。
基板と、
前記基板の一方の面に配置されたナノ構造体と、を含み、
前記ナノ構造体は、
表面プラズモン共鳴を励起可能な物質により形成され、光の照射により局在表面プラズモン共鳴が励起されるナノ構造を有するプラズモン励起層と、
表面プラズモン共鳴を励起しない物質により形成される被覆層と、を含み、
前記プラズモン励起層は、前記被覆層により被覆された被覆領域と、前記被覆層により被覆されていない非被覆領域と、を有し、
前記非被覆領域は、局在表面プラズモン共鳴が生じるホットスポットを含み、
前記被覆層の表面は、前記プラズモン励起層の表面よりも、前記対象物の特異的結合物質に対する結合親和性が低い、
固相担体。
【請求項2】
前記対象物の第１の特異的結合物質が、前記非被覆領域に結合されている、
請求項１に記載の固相担体。
請求項１に記載の固相担体。
【請求項3】
前記基板が光を透過する基板である、請求項１に記載の固相担体。
【請求項4】
対象物の測定用キットであって、
請求項１～３のいずれか一項に記載の固相担体と、
標識物質が結合された、前記対象物の第２の特異的結合物質と、
を含む、対象物の測定用キット。
請求項１～３のいずれか一項に記載の固相担体と、
標識物質が結合された、前記対象物の第２の特異的結合物質と、
を含む、対象物の測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、固相担体及び対象物の測定用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
生体試料の分析又は分子間相互作用の解析等に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の現象を利用した測定技術が普及している。市販されている代表的な装置としては、Ｂｉａｃｏｒｅ等が挙げられる。これらの装置では、ガラス表面に５０ｎｍ程度の金薄膜を形成した測定用基板が用いられている。これらの装置における、タンパク質等の生体分子の検出下限濃度は、数百ｐＭ～数ｎＭである。
【0003】
プラズモン現象を応用した、より高感度な測定を可能とする手法として、ナノフォトニクスを用いた技術が研究されている。ナノフォトニクスでは、ナノスケールの構造を用いることで、特有の光学現象を生じさせ、その光学現象の効果によりセンサーの検出性能を向上させることが可能になる。例えば、局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）現象を利用した測定技術が利用され始めている。ＬＳＰＲは、光がナノ構造に閉じ込められることで特定のエネルギー（波長）がナノ構造近傍で増強する現象であり、ナノ構造の形状や材質によって閉じ込められるエネルギーが異なる。
【0004】
これらのナノ構造は、電子線描画やレーザー描画等の微細加工技術を利用して、基板表面に形成することができる。ナノ粒子を塗布等の方法を用いて、基板表面にナノ構造を作製する場合もある。
微細加工技術を利用してＬＳＰＲ用のナノホール構造を作製する方法は、例えば、特許文献１に記載されている。ナノ構造として、ピラー形状又は剣山形状のナノ構造を形成する場合もある。微細加工技術でモールドを作製し、ナノインプリント等の成型技術で基板表面にナノ構造を作製した後、真空成膜等の方法で金又は銀などのプラズモン特性を有する物質を成膜して、ＬＳＰＲ用ナノ構造を作製する場合もある。アルミ等の表面に陽極酸化法でナノ構造を作製する方法もある。
微細加工技術を利用してＬＳＰＲ用のナノホール構造を作製する方法は、例えば、特許文献１に記載されている。ナノ構造として、ピラー形状又は剣山形状のナノ構造を形成する場合もある。微細加工技術でモールドを作製し、ナノインプリント等の成型技術で基板表面にナノ構造を作製した後、真空成膜等の方法で金又は銀などのプラズモン特性を有する物質を成膜して、ＬＳＰＲ用ナノ構造を作製する場合もある。アルミ等の表面に陽極酸化法でナノ構造を作製する方法もある。
【0005】
ＬＳＰＲ現象を利用した測定技術では、ナノ構造の表面に、対象物を捕捉又は吸着させる。これにより、共鳴波長のスペクトルシフトが生じる。このスペクトルシフトを検出することで、対象物を定量することができる。ＬＳＰＲの共鳴波長のスペクトルは、例えば、ナノ構造を透過する透過光を検出することで、確認することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２００９－２２２４０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ＬＳＰＲはナノ構造の特有の部分でのみ生じる。この部分をホットスポットと呼ぶ。例えば、ナノホール形状の場合は、ホールのエッジ部がホットスポットとなる。剣山形状の場合は、剣山の頂点部がホットスポットとなる。
ＬＳＰＲを利用して対象物を測定する場合、ホットスポット以外の領域に対象物が捕捉されたとしても、スペクトルシフトは生じない。むしろ、ホットスポット以外の領域に対象物が捕捉されることで、ホットスポットに捕捉される対象物が減少する。その結果、スペクトルシフト量が小さくなる（Ｓ／Ｎが悪くなる）。対象物の濃度が低い場合、ホットスポット以外の領域に対象物が捕捉されることで、スペクトルシフト量が小さくなり、対象物の定量を正確に行えない場合がある。
ＬＳＰＲを利用して対象物を測定する場合、ホットスポット以外の領域に対象物が捕捉されたとしても、スペクトルシフトは生じない。むしろ、ホットスポット以外の領域に対象物が捕捉されることで、ホットスポットに捕捉される対象物が減少する。その結果、スペクトルシフト量が小さくなる（Ｓ／Ｎが悪くなる）。対象物の濃度が低い場合、ホットスポット以外の領域に対象物が捕捉されることで、スペクトルシフト量が小さくなり、対象物の定量を正確に行えない場合がある。
【0008】
そこで、本発明は、ホットスポット以外の領域への対象物の捕捉量を低減可能な、固相担体、及び対象物の測定用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］対象物の測定に用いられる固相担体であって、基板と、前記基板の一方の面に配置されたナノ構造体と、を含み、前記ナノ構造体は、表面プラズモン共鳴を励起可能な物質により形成され、光の照射により局在表面プラズモン共鳴が励起されるナノ構造を有するプラズモン励起層と、表面プラズモン共鳴を励起しない物質により形成される被覆層と、を含み、前記プラズモン励起層は、前記被覆層により被覆された被覆領域と、前記被覆層により被覆されていない非被覆領域と、を有し、前記非被覆領域は、局在表面プラズモン共鳴が生じるホットスポットを含み、前記被覆層の表面は、前記プラズモン励起層の表面よりも、前記対象物の特異的結合物質に対する結合親和性が低い、固相担体。
［２］前記対象物の第１の特異的結合物質が、前記非被覆領域に結合されている、［１］に記載の固相担体。
［３］前記基板が光を透過する基板である、［１］に記載の固相担体。
［４］対象物の測定用キットであって、［１］～［３］のいずれか一つに記載の固相担体と、標識物質が結合された、前記対象物の第２の特異的結合物質と、を含む、対象物の測定用キット。
［１］対象物の測定に用いられる固相担体であって、基板と、前記基板の一方の面に配置されたナノ構造体と、を含み、前記ナノ構造体は、表面プラズモン共鳴を励起可能な物質により形成され、光の照射により局在表面プラズモン共鳴が励起されるナノ構造を有するプラズモン励起層と、表面プラズモン共鳴を励起しない物質により形成される被覆層と、を含み、前記プラズモン励起層は、前記被覆層により被覆された被覆領域と、前記被覆層により被覆されていない非被覆領域と、を有し、前記非被覆領域は、局在表面プラズモン共鳴が生じるホットスポットを含み、前記被覆層の表面は、前記プラズモン励起層の表面よりも、前記対象物の特異的結合物質に対する結合親和性が低い、固相担体。
［２］前記対象物の第１の特異的結合物質が、前記非被覆領域に結合されている、［１］に記載の固相担体。
［３］前記基板が光を透過する基板である、［１］に記載の固相担体。
［４］対象物の測定用キットであって、［１］～［３］のいずれか一つに記載の固相担体と、標識物質が結合された、前記対象物の第２の特異的結合物質と、を含む、対象物の測定用キット。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、ホットスポット以外の領域への対象物の捕捉量を低減可能な、固相担体、及び対象物の測定用キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A】ナノホール構造の一例を示す。
【図3】固相担体の作製方法の一例を説明する模式図である。
【図4】第１の特異的結合物質を結合させた固相担体の一例を示す模式図である。
【図5】対象物の測定方法の一例を説明する模式図である。
【図6A】ＬＳＰＲ現象の検出方法の一例を示す模式図である。
【図6B】対象物の結合による透過光スペクトルのピークシフトの一例を示す。
【図7】固相担体１に対して、第１の特異的結合物質（抗体）の反応、ブロッキング工程、及び対象物捕捉工程を行ったときの、特定波長における透過率の変化をリアルタイムに測定した例を示す。
【図8】標識体を用いた、対象物の測定方法の一例を説明する模式図である。
【図9A】ＬＳＰＲ現象の検出方法の一例を示す模式図である。
【図9B】対象物及び標識体の結合による透過光スペクトルのピークシフトの一例を示す。
【図10】固相担体１に対して、第１の特異的結合物質（抗体）の反応、ブロッキング工程、及び対象物捕捉工程を行ったときの、特定波長における透過率の変化をリアルタイムに測定した例を示す。
【図11A】対象物捕捉工程後の実施例及び比較例の固相担体を示す模式図である。
【図11B】実施例又は比較例の固相担体に、０～１ｎｇ／ｍＬのＰＳＡを反応させたときの透過率変化量をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【0013】
「対象物」とは、測定対象となる物（測定対象物）を意味する。対象物は、特に限定されず、当該対象物に特異的に結合する特異的結合物質が存在する物質であればよい。特異的結合物質は、対象物が有する分子に、特異的に結合してもよい。対象物としては、例えば、エクソソーム、ペプチド、タンパク質、核酸、糖鎖、レクチン、脂質等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0014】
対象物は、例えば、生体試料等に含まれるものであってもよい。生体試料は特に限定されず、生体から採取された試料を用いることができる。生体試料としては、例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、汗、乳汁、鼻汁、精液、胸水、消化管分泌液、脳脊髄液、組織間液、及びリンパ液等の体液試料、細胞破砕物試料、及び細胞抽出物試料等が挙げられるが、これらに限定されない。生体試料は、特定の生体物質画分を抽出又は濃縮したものであってもよい。
【0015】
「特異的結合物質」とは、特定の分子に対して、特異的に結合する物質を意味する。「特異的に結合する」とは、特定の分子に対して高い結合親和性を有するが、他の分子に対しては、極めて低い結合親和性しか有さないことを意味する。特異的結合物質は、好ましくは、特定の分子に高い結合性を有するが、他の分子にはほとんど結合性を有しない。一実施形態において、特定の分子は、生体分子である。生体分子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0016】
生体分子と特異的結合物質の組合せとしては、例えば、ペプチド若しくはタンパク質と、抗体；核酸と、当該核酸が含む配列に相補的な配列を含む核酸；リガンドと、その受容体；酵素と、その基質、阻害剤若しくは補因子；糖鎖と、レクチン；ペプチド、タンパク質若しくは核酸等と、アプタマー；核酸の転写制御配列部分と、その転写制御因子；等が挙げられるがこれらに限定されない。
【0017】
「対象物の特異的結合物質」は、対象物に対して特異的に結合する物質を意味する。対象物がペプチド又はタンパク質である場合、対象物の特異的結合物質としては、例えば、抗体又はアプタマーが挙げられ、抗体が好ましい。
【0018】
「抗体」とは、抗原結合活性を有する免疫グロブリンを意味する。抗体は、抗原結合活性を有していれば、インタクトな抗体である必要はなく、抗原結合断片であってもよい。本明細書において、「抗体」という用語は、抗原結合断片を包含する。「抗原結合断片」とは、抗体の一部を含むポリペプチドであって、元の抗体の抗原結合活性を維持しているポリペプチドである。抗原結合断片は、元の抗体の６つの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を全て含むものが好ましい。すなわち、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を全て含むことが好ましい。抗原結合断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２等が挙げられる。
【0019】
抗体は、いずれの生物に由来するものであってもよい。抗体が由来する生物としては、例えば、哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、イヌ等）、鳥類（ニワトリ、ダチョウ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体は、免疫グロブリンのいずれのクラス及びサブクラスであってもよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
抗体は、免疫法、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法等の公知の方法により作製することができる。
抗体は、免疫グロブリンのいずれのクラス及びサブクラスであってもよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
抗体は、免疫法、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法等の公知の方法により作製することができる。
【0020】
［固相担体］
本発明の第１の態様は、固相担体である。前記固相担体は、基板と、前記基板の一方の面に配置されたナノ構造体と、を含む。前記ナノ構造体は、表面プラズモン共鳴を励起可能な物質により形成され、光の照射により局在表面プラズモン共鳴が励起されるナノ構造を有するプラズモン励起層と、表面プラズモン共鳴を励起しない物質により形成される被覆層と、を含む。前記プラズモン励起層は、前記被覆層により被覆された被覆領域と、前記被覆層により被覆されていない非被覆領域と、を有し、前記非被覆領域は、局在表面プラズモン共鳴が増強されるホットスポットを含む。前記被覆層の表面は、前記プラズモン励起層の表面よりも、前記対象物の特異的結合物質に対する結合親和性が低い。
本発明の第１の態様は、固相担体である。前記固相担体は、基板と、前記基板の一方の面に配置されたナノ構造体と、を含む。前記ナノ構造体は、表面プラズモン共鳴を励起可能な物質により形成され、光の照射により局在表面プラズモン共鳴が励起されるナノ構造を有するプラズモン励起層と、表面プラズモン共鳴を励起しない物質により形成される被覆層と、を含む。前記プラズモン励起層は、前記被覆層により被覆された被覆領域と、前記被覆層により被覆されていない非被覆領域と、を有し、前記非被覆領域は、局在表面プラズモン共鳴が増強されるホットスポットを含む。前記被覆層の表面は、前記プラズモン励起層の表面よりも、前記対象物の特異的結合物質に対する結合親和性が低い。
【0021】
ＬＳＰＲ現象が生じるナノ構造としては、ナノホール構造が挙げられる。図１Ａは、ナノホール構造の一例を示す。図１Ａのナノホール構造において、電磁波解析による理論計算手法にてＬＳＰＲ特性をシミュレーションした結果を図１Ｂに示す。ガラス（ＳｉＯ２）基板上に金ナノホールが周期的に配列した構造に、ガラス基板側から白色光を照射し、透過した光を金ナノホール側から検出した際の透過光スペクトルを有限要素法による光学シミュレーション（ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ）にて計算した。ナノホールのピッチ（Ｐ）は４００ｎｍ、ナノホールの直径（Ｄ）は１５０ｎｍ、金ナノホールの深さ（Ｔ）は１００ｎｍとした。図１Ａ中、ｎ０＝１．３３（ｗａｔｅｒ）は水の屈折率を示す。
【0022】
透過光スペクトルは、波長６３８ｎｍ及び７２５ｎｍにピークを有しており、波長６３８ｎｍがナノホールの上端部、波長７２５ｎｍがナノホールの下端部に局在している。すなわち、ナノホール形状で生じるＬＳＰＲはナノホールのエッジ部がホットスポットとなる。このホットスポットに対象物が結合することで、透過光（又は反射光）スペクトルのピークシフトが生じる。このスペクトルの変化を検出することで、対象物を定量することができる。透過光スペクトルのピーク波長は、ナノホールの形状（ピッチ、ホールサイズ、深さ等）及びナノホールを構成する材質の種類で異なってくる。これらを調整することにより、あらかじめ特定の波長にピークを有するようにナノホールを設計することができる。これにより、特定の単一波長の光を照射し、その透過率（または反射率）を測定することで、ナノホール構造に結合した対象物を定量することも可能である。また、従来普及しているＳＰＲ検出方式のクレッチマン配置型のプラズモン共鳴角変化を検出するような方法で、共鳴角度の変化を検出することもできる。
ホットスポットに対象物が結合することで生じるＬＳＰＲ波長のピークシフトは、ラマン散乱光により検出してもよく（例えば、表面増強ラマン散乱分光）、蛍光により検出してもよい。
ホットスポットに対象物が結合することで生じるＬＳＰＲ波長のピークシフトは、ラマン散乱光により検出してもよく（例えば、表面増強ラマン散乱分光）、蛍光により検出してもよい。
【0023】
対象物がペプチド又はタンパク質である場合、図１Ａのようなナノ構造に、対象物を特異的に捕捉する方法としては、抗体を用いた免疫学的手法が挙げられる。抗体はタンパク質であり、金の表面に吸着しやすい性質を有する。この性質を利用して、金の表面に抗体を吸着させることで、目的の対象物のみを特異的に捕捉することが可能となる。目的の対象物を捕捉後、さらに標識物質で修飾された抗体で目的の対象物を特異的に標識することで、特異性を向上させることもできる。標識物質で修飾された抗体を用いる方法は、サンドイッチ法と呼ばれる。標識物質としては、蛍光物質、酵素、粒子など挙げられる。
【0024】
図１Ａに示す、一般的な金薄膜にナノホールが形成されたナノ構造体を用いて対象物を定量した場合、ホットスポット以外の部分にも抗体が吸着する。そのため、ホットスポット以外の部分にも、対象物が捕捉されることとなる。ホットスポット以外の部分に対象物が捕捉されても、透過光のスペクトルシフトは生じない。ホットスポット以外の部分に対象物が捕捉されることで、ホットスポットに捕捉される対象物が減少する。その結果、透過光のスペクトルのシフト量が小さくなり、対象物の検出感度が低下する。すなわち、ホットスポット以外に捕捉された対象物は、バックグラウンドノイズとなり、検出シグナルのＳ／Ｎ比を悪化させる要因となる。したがって、低濃度の対象物を高感度に測定するためには、ホットスポット以外の部分に捕捉させる対象物の量を低減することが望ましい。
【0025】
本態様の固相担体は、光の照射により局在表面プラズモン共鳴が励起されるナノ構造において、ホットスポット以外の領域の一部又は全部が、表面プラズモン共鳴を励起しない物質からなる被覆層により被覆されている。被覆層の表面は、プラズモン励起層の表面よりも、対象物の特異的結合物質に対する結合親和性が低い。そのため、ホットスポット以外の領域に結合する特異的結合物質の量が低減される。その結果、ホットスポット以外の領域に捕捉される対象物の量を低減することができる。
【0026】
図２Ａ及び図２Ｂは、本態様の固相担体の一例を示す模式図である。図２Ａは固相担体の一例である固相担体１の斜視図である。図２Ｂは、図２Ａに示す固相担体１のＡ－Ａ切断線による断面図である。図２Ａ及び図２Ｂに示す固相担体１は、光を透過する基板１０と、基板１０の一方の面に配置されたナノ構造体２０と、を含む。ナノ構造体２０は、プラズモン励起層２１と、プラズモン励起層２１の一部を被覆する被覆層２５と、から構成されている。
【0027】
＜基板＞
基板１０は、特に限定されないが、光透過性を有する基板が好ましい。基板１０は、局在表面プラズモン共鳴を励起するために用いる励起光を透過するものが好ましい。一実施形態において、基板１０は、透明基板である。基板１０の材質としては、ガラス、光透過性樹脂等が挙げられる。光透過性樹脂としては、アクリル樹脂（ポリメタクリル酸メチル等）、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、ＡＳ樹脂等が挙げられるが、これらに限定されない。
基板１０は、特に限定されないが、光透過性を有する基板が好ましい。基板１０は、局在表面プラズモン共鳴を励起するために用いる励起光を透過するものが好ましい。一実施形態において、基板１０は、透明基板である。基板１０の材質としては、ガラス、光透過性樹脂等が挙げられる。光透過性樹脂としては、アクリル樹脂（ポリメタクリル酸メチル等）、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、ＡＳ樹脂等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0028】
基板１０の厚さは、ナノ構造体２０を支持可能な厚さであれば、特に限定されない。基板１０の厚さとしては、例えば、０．０１～１０ｍｍが挙げられる。基板１０の厚さは、０．０１～５ｍｍ、０．０１～２ｍｍ、０．１～１０ｍｍ、０．１～５ｍｍ、又は０．１～２ｍｍであってもよい。
【0029】
＜ナノ構造体＞
ナノ構造体２０は、プラズモン励起層２１及び被覆層２５を含む。
ナノ構造体２０は、プラズモン励起層２１及び被覆層２５を含む。
【0030】
（プラズモン励起層）
プラズモン励起層２１は、表面プラズモン共鳴を励起可能な物質により形成されている。プラズモン励起層２１は、光の照射により局在表面プラズモン共鳴が励起されるナノ構造を有している。
プラズモン励起層２１は、表面プラズモン共鳴を励起可能な物質により形成されている。プラズモン励起層２１は、光の照射により局在表面プラズモン共鳴が励起されるナノ構造を有している。
【0031】
「表面プラズモン共鳴を励起可能な物質」とは、例えば、自由電子を有する物質をいう。表面プラズモン共鳴を励起可能な物質は、例えば、入射光に対して［実部（ｎ）＜消衰係数（ｋ）］の関係を満たす複素屈折率を有する物質である。
複素屈折率は、吸収のある物質の屈折率である。複素屈折率（ｍ）は、下記式で表すことができる。下記式中、実部ｎは通常の屈折率を表し、虚部ｋは消衰係数と呼ばれる。
ｍ＝ｎ－ｉｋ
表面プラズモン共鳴を励起可能な物質としては、例えば、金属が挙げられる。金属としては、例えば、金、銀、白金、アルミニウム等が挙げられる。
複素屈折率は、吸収のある物質の屈折率である。複素屈折率（ｍ）は、下記式で表すことができる。下記式中、実部ｎは通常の屈折率を表し、虚部ｋは消衰係数と呼ばれる。
ｍ＝ｎ－ｉｋ
表面プラズモン共鳴を励起可能な物質としては、例えば、金属が挙げられる。金属としては、例えば、金、銀、白金、アルミニウム等が挙げられる。
【0032】
「ナノ構造」とは、構造単位がナノメートルオーダー（１～１０００ｎｍ）である立体構造をいう。ナノ構造は、ナノ構造を収容し得る仮想的な外接直方体の最長辺が、ナノメートルオーダーであり得る。
図２Ａ及び図２Ｂに示す固相担体１では、プラズモン励起層２１は、ナノ構造として、ナノホール構造を有する。プラズモン励起層２１は、複数個のナノホールが形成された層である。ナノホールの配置方法は、特に限定されない。ナノホールの配置方法としては、例えば、格子状配置が挙げられる。
ナノホールのピッチＰ、直径Ｄ、及び深さＴは、使用する照射光の波長に応じて、適宜設定することができる。ナノホールのピッチＰとしては、例えば、５０～１０００ｎｍが挙げられる。ナノホールの直径Ｄとしては、例えば、１０～５００ｎｍが挙げられる。ナノホールの深さＴとしては、例えば、１０～５００ｎｍが挙げられる。
ナノ構造は、光の照射により、ＬＳＰＲが生じる構造であればよく、ナノホール構造に限定されない。また、ナノホールの形状は、平面視で円形である必要はなく、例えば、平面視で矩形、楕円形等であってもよく、特に限定されない。
図２Ａ及び図２Ｂに示す固相担体１では、プラズモン励起層２１は、ナノ構造として、ナノホール構造を有する。プラズモン励起層２１は、複数個のナノホールが形成された層である。ナノホールの配置方法は、特に限定されない。ナノホールの配置方法としては、例えば、格子状配置が挙げられる。
ナノホールのピッチＰ、直径Ｄ、及び深さＴは、使用する照射光の波長に応じて、適宜設定することができる。ナノホールのピッチＰとしては、例えば、５０～１０００ｎｍが挙げられる。ナノホールの直径Ｄとしては、例えば、１０～５００ｎｍが挙げられる。ナノホールの深さＴとしては、例えば、１０～５００ｎｍが挙げられる。
ナノ構造は、光の照射により、ＬＳＰＲが生じる構造であればよく、ナノホール構造に限定されない。また、ナノホールの形状は、平面視で円形である必要はなく、例えば、平面視で矩形、楕円形等であってもよく、特に限定されない。
【0033】
プラズモン励起層２１の厚さは、特に限定されない。プラズモン励起層２１の厚さとしては、例えば、１０～５００ｎｍが挙げられる。プラズモン励起層２１の厚さは、ナノホールの深さＴを規定する。
【0034】
プラズモン励起層２１が有するナノホール構造は、ナノホールの上端エッジ部分及び下端エッジ部分に、ホットスポットＨを有する。
プラズモン励起層２１は、被覆層２５により被覆される被覆領域２１ａと、被覆層２５により被覆されない非被覆領域２１ｂと、を有している。非被覆領域２１ｂは、ホットスポットＨを含んでいる。被覆領域２１ａは、ホットスポットＨ以外の領域の少なくとも一部を含んでいる。
プラズモン励起層２１は、被覆層２５により被覆される被覆領域２１ａと、被覆層２５により被覆されない非被覆領域２１ｂと、を有している。非被覆領域２１ｂは、ホットスポットＨを含んでいる。被覆領域２１ａは、ホットスポットＨ以外の領域の少なくとも一部を含んでいる。
【0035】
プラズモン励起層２１は、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）、化学修飾等により、第１の特異的結合物質３０に対する結合親和性を向上させてもよい。化学修飾としては、例えば、末端に官能基を有する分子を用いた修飾が挙げられる。
【0036】
（被覆層）
被覆層２５は、プラズモン励起層２１のホットスポットＨ以外の領域の一部又は全部を被覆する。図２Ａ及び図２Ｂの例では、被覆層２５は、プラズモン励起層２１のナノホールが形成されていない領域を被覆している。プラズモン励起層２１のナノホールの上端エッジ及び下端エッジのホットスポットＨは、被覆層２５により被覆されていない。
被覆層２５は、プラズモン励起層２１のホットスポットＨ以外の領域の一部又は全部を被覆する。図２Ａ及び図２Ｂの例では、被覆層２５は、プラズモン励起層２１のナノホールが形成されていない領域を被覆している。プラズモン励起層２１のナノホールの上端エッジ及び下端エッジのホットスポットＨは、被覆層２５により被覆されていない。
【0037】
被覆層２５は、表面プラズモンを励起しない物質により形成されている。「表面プラズモンを励起しない物質」とは、自由電子を有しない物質である。表面プラズモンを励起しない物質としては、例えば、酸化物系の無機化合物、樹脂等を用いることができる。酸化物系の無機化合物としては、例えば、金属酸化物が挙げられる。金属酸化物としては、例えば、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化鉄（ＦｅＯ、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４）、酸化銅（ＣｕＯ、Ｃｕ２Ｏ）、酸化チタン（ＴｉＯ２）等が挙げられるが、これらに限定されない。樹脂としては、例えば、シリコーン樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂等が挙げられるが、これらに限定されない。表面プラズモン共鳴を励起しない物質は、誘電体であってもよく、被覆層２５は誘電体層であってもよい。
【0038】
被覆層の表面は、プラズモン励起層２１の表面よりも、対象物の特異的結合物質に対する結合親和性が低くなるように形成される。そのため、被覆層は、特異的結合物質に対する結合親和性又は吸着性が低い物質で形成されることが好ましい。
特異的結合物質が抗体等のタンパク質である場合、被覆層は、タンパク質に対する吸着性又は結合親和性の低い物質で形成されることが好ましい。例えば、被覆層表面が親水性となるような物質を用いることができる。例えば、ＳｉＯ２の表面は、ＯＨ基が多く露出しており、親水性の特性を有している。そのため、タンパク質が吸着しにくい。被覆層表面は、特異的結合物質に対する結合親和性又は吸着性が低くなるように修飾されてもよい。例えば、被覆層の表面は、親水化処理がされてもよい。例えば、ポリエチレングリコール等の親水性分子による化学修飾等を行ってもよい。
特異的結合物質が抗体等のタンパク質である場合、被覆層は、タンパク質に対する吸着性又は結合親和性の低い物質で形成されることが好ましい。例えば、被覆層表面が親水性となるような物質を用いることができる。例えば、ＳｉＯ２の表面は、ＯＨ基が多く露出しており、親水性の特性を有している。そのため、タンパク質が吸着しにくい。被覆層表面は、特異的結合物質に対する結合親和性又は吸着性が低くなるように修飾されてもよい。例えば、被覆層の表面は、親水化処理がされてもよい。例えば、ポリエチレングリコール等の親水性分子による化学修飾等を行ってもよい。
【0039】
被覆層２５の厚さは、特に限定されない。被覆層２５の厚さは、透過光スペクトルのピーク波長に影響する。そのため、被覆層２５の厚さは、使用する照射光の波長に応じて、適宜設定してもよい。被覆層２５の厚さとしては、例えば、１～５００ｎｍが挙げられる。
【0040】
＜固相担体の製造方法＞
図３は、固相担体の製造方法の一例を説明する模式図である。
ガラス基板等の適切な基板を研磨及び洗浄して、平滑な表面を有する基板１０を準備する（図３（Ａ））。
次いで、基板１０上に、表面プラズモン共鳴を励起可能な物質の層２２を形成する（図３（Ｂ））。層２２は、公知の方法により形成することができる。例えば、真空成膜法（スパッタリグ法、真空蒸着法等）等が挙げられる。ナノ構造としてナノホールを形成する場合、層２２の厚さは、最終的に形成するナノホールの深さと同じとしてもよく、それ以上としてもよい。層２２の厚さは、最終的に形成するナノホールの深さと同じとすることが好ましい。
図３は、固相担体の製造方法の一例を説明する模式図である。
ガラス基板等の適切な基板を研磨及び洗浄して、平滑な表面を有する基板１０を準備する（図３（Ａ））。
次いで、基板１０上に、表面プラズモン共鳴を励起可能な物質の層２２を形成する（図３（Ｂ））。層２２は、公知の方法により形成することができる。例えば、真空成膜法（スパッタリグ法、真空蒸着法等）等が挙げられる。ナノ構造としてナノホールを形成する場合、層２２の厚さは、最終的に形成するナノホールの深さと同じとしてもよく、それ以上としてもよい。層２２の厚さは、最終的に形成するナノホールの深さと同じとすることが好ましい。
【0041】
次いで、層２２上に、表面プラズモン共鳴を励起しない物質の層２６を形成する（図３（Ｃ））。層２６は、公知の方法により形成することができる。例えば、真空成膜法、スピンコーティング等が挙げられる。例えば、表面プラズモン共鳴を励起しない物質として酸化物系の無機化合物を用いる場合、真空成膜法を用いることができる。表面プラズモン共鳴を励起しない物質として樹脂を用いる場合、スピンコーティング法を用いることができる。後述の工程で、先に金属の酸化物をレジストとして用いる場合、レジスト膜は真空成膜法で成膜されるため、層２２、層２６、及びレジスト膜を連続して真空成膜法により作製できることが好ましい。また、レーザー描画法によりナノ構造を形成する場合、熱伝導率が低い材料で、層２６を形成することが好ましい。そのような物質としては、例えば、ＳｉＯ２が挙げられる。
層２６の厚さは、最終的に形成する被覆層２５と同じ厚さとしてもよく、それ以上としてもよい。
層２６の厚さは、最終的に形成する被覆層２５と同じ厚さとしてもよく、それ以上としてもよい。
【0042】
次いで、層２６上に、レジスト膜４０を形成する。レジスト膜４０の形成は、公知のレジスト組成物を用いて、公知の方法により行うことができる。例えば、真空成膜法、スピンコーティング等が挙げられる。
ナノ構造の形成に電子線描画法を用いる場合、例えば、ポジ型レジスト（代表的なレジスト材料としてＺＥＰ－５２０等）を用いることができる。ナノ構造の形成にレーザー描画法を用いる場合、一般的なｇ線レジスト及びｉ線レジストでは解像限界以下のため用いることができない。集光レーザーのガウス分布の熱エネルギーを利用する場合は、メタルレジスト（代表的なレジスト材料として遷移金属の酸化物等）を用いることができる。
レジスト膜４０の厚さは、特に限定されず、後述の工程で、マスクとして使用可能な厚さであればよい。レジスト膜４０の厚さとしては、例えば、５０～１０００ｎｍ程度が挙げられる。
層２６へのレジスト膜４０の密着性を向上させるため、層２６とレジスト膜４０との間に密着層を形成してもよい。密着層としては、クロム、ゲルマニウム又はチタンなどの無機薄膜、シランカップリング剤などによる有機薄膜等が挙げられる。層２２、層２６、及びレジスト膜４０を真空成膜法で作製する場合、連続的な成膜が可能となるため、密着層として無機薄膜を用いることが好ましい。現像工程でアルカリ現像液を用いる場合、アルカリ現像液に溶解しないクロムを用いてもよい。
密着層の厚さとしては、例えば、１～５ｎｍ程度が挙げられ、１～２ｎｍ程度が好ましいる。
ナノ構造の形成に電子線描画法を用いる場合、例えば、ポジ型レジスト（代表的なレジスト材料としてＺＥＰ－５２０等）を用いることができる。ナノ構造の形成にレーザー描画法を用いる場合、一般的なｇ線レジスト及びｉ線レジストでは解像限界以下のため用いることができない。集光レーザーのガウス分布の熱エネルギーを利用する場合は、メタルレジスト（代表的なレジスト材料として遷移金属の酸化物等）を用いることができる。
レジスト膜４０の厚さは、特に限定されず、後述の工程で、マスクとして使用可能な厚さであればよい。レジスト膜４０の厚さとしては、例えば、５０～１０００ｎｍ程度が挙げられる。
層２６へのレジスト膜４０の密着性を向上させるため、層２６とレジスト膜４０との間に密着層を形成してもよい。密着層としては、クロム、ゲルマニウム又はチタンなどの無機薄膜、シランカップリング剤などによる有機薄膜等が挙げられる。層２２、層２６、及びレジスト膜４０を真空成膜法で作製する場合、連続的な成膜が可能となるため、密着層として無機薄膜を用いることが好ましい。現像工程でアルカリ現像液を用いる場合、アルカリ現像液に溶解しないクロムを用いてもよい。
密着層の厚さとしては、例えば、１～５ｎｍ程度が挙げられ、１～２ｎｍ程度が好ましいる。
【0043】
次いで、電子線描画法又はレーザー描画法等により、ナノ構造パターン（例えば、ナノホールパターン）を露光する（図３（Ｅ））。露光により、レジスト膜４０に、露光部４１及び未露光部４２が形成される。レーザー描画法は、電子線描画法に比べて高速に描画することが可能なため、短時間で大面積にナノ構造を作製することができる。それゆえ、量産性が高く、安価な固相担体の提供が可能となる。
【0044】
次いで、現像液を用いて現像し、レジストパターン４３を形成する（図３（Ｆ））。
次いで、レジストパターン４３をマスクとして、層２２及び層２６をエッチングする（図３（Ｇ）、図３（Ｈ））。エッチングは、公知の方法で行うことができる。例えば、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）又はイオンミリングなどのドライエッチング法を用いることができる。ドライエッチングとしては、例えば、Ａｒガスによるエッチング等が挙げられる。ナノホールを形成する場合、所望の深さのナノホールとなるように層２２のエッチングを行う。ナノホールを形成する場合、ナノホール形成部分の層２２は、エッチングにより全て除去することが好ましい。
次いで、レジストパターン４３をマスクとして、層２２及び層２６をエッチングする（図３（Ｇ）、図３（Ｈ））。エッチングは、公知の方法で行うことができる。例えば、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）又はイオンミリングなどのドライエッチング法を用いることができる。ドライエッチングとしては、例えば、Ａｒガスによるエッチング等が挙げられる。ナノホールを形成する場合、所望の深さのナノホールとなるように層２２のエッチングを行う。ナノホールを形成する場合、ナノホール形成部分の層２２は、エッチングにより全て除去することが好ましい。
【0045】
次いで、レジストパターン４３を除去する（図３（Ｉ））。これにより、基板１０上に所望のナノ構造を有するナノ構造体２０が配置された固相担体１を得ることができる。レジストパターン４３の除去は、公知の方法で行うことができる。例えば、アルカリ又は有機溶剤などを用いた液浸法、又はドライエッチング法等を用いることができる。
【0046】
＜第１の特異的結合物質が結合された固相担体＞
固相担体は、プラズモン励起層の非被覆領域に、対象物の第１の特異的結合物質が結合されたものであってもよい（図４参照）。
図４に示す固相担体２では、非被覆領域２１ｂに、対象物の第１の特異的結合物質３０が結合されている。
固相担体は、プラズモン励起層の非被覆領域に、対象物の第１の特異的結合物質が結合されたものであってもよい（図４参照）。
図４に示す固相担体２では、非被覆領域２１ｂに、対象物の第１の特異的結合物質３０が結合されている。
【0047】
非被覆領域２１ｂに対する第１の特異的結合物質３０の結合方法は、公知の方法を用いて行うことができる。プラズモン励起層２１が金等の金属で形成されている場合、金属表面は一般的に有機物を吸着しやすいという性質を有する。一方、被覆層２５の表面は、非被覆領域２１ｂよりも第１の特異的結合物質３０に対する結合親和性が低くなっている。
そのため、例えば、第１の特異的結合物質３０を含む溶液を、ナノ構造体２０が配置された固相担体１の面に供給する。これにより、第１の特異的結合物質３０を非被覆領域２１ｂの表面に吸着させることができる。一方、被覆層２５の表面には、第１の特異的結合物質３０はほとんど吸着しない。その結果、第１の特異的結合物質３０が、非被覆領域２１ｂのみに結合した固相担体２を得ることができる。
そのため、例えば、第１の特異的結合物質３０を含む溶液を、ナノ構造体２０が配置された固相担体１の面に供給する。これにより、第１の特異的結合物質３０を非被覆領域２１ｂの表面に吸着させることができる。一方、被覆層２５の表面には、第１の特異的結合物質３０はほとんど吸着しない。その結果、第１の特異的結合物質３０が、非被覆領域２１ｂのみに結合した固相担体２を得ることができる。
【0048】
第１の特異的結合物質３０の結合反応において、第１の特異的結合物質３０を含む溶液に界面活性剤等を添加することで、被覆層２５への第１の特異的結合物質３０をさらに抑制してもよい。
【0049】
ナノ構造体２０が配置された固相担体１の面への第１の特異的結合物質３０を含む溶液の供給は、当該面に井戸型のウェルを貼り付け、そこに第１の特異的結合物質３０を含む溶液を注入することにより、行うことができる。井戸型のウェルは、例えば、ジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の樹脂で作製することができる。非被覆領域２１ｂへの第１の特異的結合物質３０の結合反応は、室温（２０～３０℃）で行ってもよく、所定温度に維持した恒温槽内で行ってもよい。結合反応の温度は、第１の特異的結合物質３０の種類に応じて、適宜選択することができる。
第１の特異的結合物質３０の結合反応後、固相担体２の洗浄処理を行ってもよい。洗浄処理は、洗浄液を固相担体２の表面に供給し、洗浄液を除去することを１～３回程度繰り返すことにより、行うことができる。洗浄液としては、ＰＢＳ等の緩衝液にＴｗｅｅｎ２０等の非イオン性界面活性剤を添加したもの等が挙げられる。洗浄処理を行うことにより、未反応の第１の特異的結合物質３０を除去することができる。
第１の特異的結合物質３０の結合反応後、固相担体２の洗浄処理を行ってもよい。洗浄処理は、洗浄液を固相担体２の表面に供給し、洗浄液を除去することを１～３回程度繰り返すことにより、行うことができる。洗浄液としては、ＰＢＳ等の緩衝液にＴｗｅｅｎ２０等の非イオン性界面活性剤を添加したもの等が挙げられる。洗浄処理を行うことにより、未反応の第１の特異的結合物質３０を除去することができる。
【0050】
＜対象物の測定方法（１）＞
図５及び図６Ａは、固相担体２を用いた対象物の測定方法を説明する模式図である。
測定方法は、固相担体２の、ナノ構造体２０が配置された面をブロッキングする工程（ブロッキング工程；図５（Ｂ））と、第１の特異的結合物質３０との結合を介して、非被覆領域２１ｂに、対象物を結合させる工程（対象物捕捉工程；図５（Ｃ））と、ＬＳＰＲを検出する工程（ＬＳＰＲ検出工程；図６Ａ）と、を含むことができる。
図５及び図６Ａは、固相担体２を用いた対象物の測定方法を説明する模式図である。
測定方法は、固相担体２の、ナノ構造体２０が配置された面をブロッキングする工程（ブロッキング工程；図５（Ｂ））と、第１の特異的結合物質３０との結合を介して、非被覆領域２１ｂに、対象物を結合させる工程（対象物捕捉工程；図５（Ｃ））と、ＬＳＰＲを検出する工程（ＬＳＰＲ検出工程；図６Ａ）と、を含むことができる。
【0051】
（ブロッキング工程）
ブロッキング処理を行うことにより、第１の特異的結合物質３０が結合していない固相担体２の表面をブロッキングすることができる。これにより、固相担体２に対する非特異的吸着を低減することができる。
ブロッキング処理を行うことにより、第１の特異的結合物質３０が結合していない固相担体２の表面をブロッキングすることができる。これにより、固相担体２に対する非特異的吸着を低減することができる。
【0052】
ブロッキングは、固相担体２のナノ構造体２０が配置された面に、ブロッキング剤５０を含む溶液を供給することにより、行うことができる。
ブロッキング剤は、公知のブロッキング剤を特に制限なく用いることができる。ブロッキング剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルク、フィッシュゼラチン等の生化学の分野で一般的に用いられる生体由来タンパク質系のブロッキング剤；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等の合成高分子化合物等が挙げられる。ブロッキング剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば、ＰＥＧとタンパク質系ブロッキング剤とを組み合わせて用いてもよい。
ブロッキング液用の緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液、又は前記のような緩衝液にＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を添加したもの等が挙げられるが、これらに限定されない。
ブロッキング剤は、公知のブロッキング剤を特に制限なく用いることができる。ブロッキング剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルク、フィッシュゼラチン等の生化学の分野で一般的に用いられる生体由来タンパク質系のブロッキング剤；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等の合成高分子化合物等が挙げられる。ブロッキング剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば、ＰＥＧとタンパク質系ブロッキング剤とを組み合わせて用いてもよい。
ブロッキング液用の緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液、又は前記のような緩衝液にＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を添加したもの等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0053】
ブロッキング反応の反応温度としては、例えば、２０～４０℃が挙げられる。ブロッキング反応の反応時間としては、例えば、１０～１２０分が挙げられる。
ブロッキング反応後は、固相担体２の洗浄処理を行ってもよい。洗浄処理を行うことにより、未反応のブロッキング剤を除去することができる。
ブロッキング反応後は、固相担体２の洗浄処理を行ってもよい。洗浄処理を行うことにより、未反応のブロッキング剤を除去することができる。
【0054】
（対象物捕捉工程）
固相担体２のナノ構造体２０が配置された面に、対象物６０を含む溶液を供給することにより、第１の特異的結合物質３０に、対象物６０が結合する。これにより、対象物６０を、固相担体２に捕捉させることができる。
固相担体２のナノ構造体２０が配置された面に、対象物６０を含む溶液を供給することにより、第１の特異的結合物質３０に、対象物６０が結合する。これにより、対象物６０を、固相担体２に捕捉させることができる。
【0055】
対象物を含む溶液は、生体試料であってもよい。生体試料は、希釈バッファーで適宜希釈してもよい。希釈バッファーとしては、例えば、緩衝液（ＰＢＳ等）等を用いることができる。また、希釈バッファーは、非特異的吸着を低減するために、ブロッキング剤及び又は界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０等）を含んでいてもよい。
【0056】
第１の特異的結合物質と対象物との結合反応の条件は、対象物及び第１の特異的結合物質の種類に応じて、適宜選択可能である。例えば、対象物がタンパク質又はペプチドであり、第１の特異的結合物質が抗体である場合、反応温度としては、２０℃以上、３０℃以上、又は３５℃以上等が挙げられる。反応温度の上限は、特に限定されないが、例えば、５０℃以下、４５℃以下、又は４０℃以下等が挙げられる。反応温度の範囲としては、例えば、２０～５０℃、３０～４５℃、又は３０～４０℃等が挙げられる。
反応時間は、特に限定されず、第１の特異的結合物質と対象物との結合反応が十分に進行する程度の時間とすることができる。反応時間は、対象物及び第１の特異的結合物質の種類に応じて適宜選択することができる。対象物がタンパク質又はペプチドであり、第１の特異的対象物が抗体である場合、反応時間としては、例えば、３～２００分が挙げられる。反応時間の下限値は、特に限定されないが、例えば、３分以上、５分以上、１０分以上、２０分以上、又は３０分以上等が挙げられる。反応時間の上限は、特に限定されないが、例えば、２００分以下、１８０分以下、１２０分以下、又は１００分以下等が挙げられる。
反応時間は、特に限定されず、第１の特異的結合物質と対象物との結合反応が十分に進行する程度の時間とすることができる。反応時間は、対象物及び第１の特異的結合物質の種類に応じて適宜選択することができる。対象物がタンパク質又はペプチドであり、第１の特異的対象物が抗体である場合、反応時間としては、例えば、３～２００分が挙げられる。反応時間の下限値は、特に限定されないが、例えば、３分以上、５分以上、１０分以上、２０分以上、又は３０分以上等が挙げられる。反応時間の上限は、特に限定されないが、例えば、２００分以下、１８０分以下、１２０分以下、又は１００分以下等が挙げられる。
【0057】
対象物の結合反応後は、固相担体２の洗浄処理を行ってもよい。洗浄処理を行うことにより、未反応の対象物及び夾雑物を除去することができる。
【0058】
ブロッキング工程及び対象物捕捉工程は、固相担体２のナノ構造体２０が配置された面に、反応液を留置可能な構造を形成することにより行ってもよい。例えば、反応液を留置可能な構造内に、反応液を一定時間留置することで、ブロッキング反応又は対象物結合反応を行うことができる。反応液を留置可能な構造としては、例えば、ウェル構造、流路構造等が挙げられる。ウェル構造は、例えば、所望の大きさの貫通孔を有する樹脂シート等を、固相担体２のナノ構造体２０が配置された面に積層することにより、形成することができる。流路構造は、例えば、前記面に流路が形成されるように樹脂シートを配置し、前記流路の上部を別の樹脂シートで封鎖することにより形成することができる。樹脂シートの材質は、特に限定されないが、例えば、ＰＤＭＳ、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー等が挙げられる。
【0059】
（ＬＳＰＲ検出工程）
対象物を結合させる前の固相担体２（図５（Ｂ））及び対象物を結合させた固相担体２（図５（Ｃ））について、図６（Ａ）に示すように、基板１０側の面から光を照射し、ナノ構造体２０が配置された面側に透過する透過光を分光器１００で検出する。透過光の測定は、スペクトル検出可能な機器で行ってもよい。分光器１００により、特定の波長にピークを有する透過光スペクトルが検出される。
図５（Ｃ）の固相担体２では、対象物６０が捕捉されていることにより、図５（Ｂ）の固相担体２の透過光スペクトルとは、ピーク波長がシフトした透過光スペクトルが検出される。このピークシフト量から、固相担体２に捕捉された対象物６０の量を検出することができる。
図６Ｂは、透過光のスペクトルシフトの例を示す。
対象物を結合させる前の固相担体２（図５（Ｂ））及び対象物を結合させた固相担体２（図５（Ｃ））について、図６（Ａ）に示すように、基板１０側の面から光を照射し、ナノ構造体２０が配置された面側に透過する透過光を分光器１００で検出する。透過光の測定は、スペクトル検出可能な機器で行ってもよい。分光器１００により、特定の波長にピークを有する透過光スペクトルが検出される。
図５（Ｃ）の固相担体２では、対象物６０が捕捉されていることにより、図５（Ｂ）の固相担体２の透過光スペクトルとは、ピーク波長がシフトした透過光スペクトルが検出される。このピークシフト量から、固相担体２に捕捉された対象物６０の量を検出することができる。
図６Ｂは、透過光のスペクトルシフトの例を示す。
【0060】
ＬＳＰＲによる透過光スペクトルのピークシフトは、特定の検出波長における透過率が変化することを意味する（図６Ｂ参照）。そのため、ＬＳＰＲの検出は、単一波長の光を用いて行ってもよい。使用する波長は、例えば、対象物を結合させる前の固相担体２における透過光スペクトルのピーク波長付近を用いることができる。対象物を結合させる前の固相担体２（図５（Ｂ））及び対象物を結合させた固相担体２（図５（Ｃ））について、特定波長における透過率の変化を検出することにより、対象物を定量することができる。高額な分光器を用いる必要がないため、検出装置の低コスト化が見込めるというメリットがある。
【0061】
図１Ａ及び図１Ｂで示したように、ピッチＰ４００ｎｍ、直径Ｄ１５０ｎｍ、深さＴ１００ｎｍの金ナノホールにおけるＬＳＰＲを電磁波シミュレーションで計算すると、６３８ｎｍ及び７２５ｎｍにピークを有する透過光スペクトルとなる。このナノホールのホットスポットに対象物が吸着すると、長波長側にピークシフトする。ピークシフト量は対象物の吸着量と比例関係にあり、デバイスとしての感度を示す値として、対象物の単位屈折率変化量当たりのピークシフト量としてｎｍ／ＲＩＵ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｕｎｉｔ）という単位で評価されている。金ナノホールなどのナノ構造を使ったＬＳＰＲの感度として、１００～１０００ｎｍ／ＲＩＵの報告例がある。このピークシフトは、ホットスポットに結合した対象物に起因して生じる。ホットスポット以外に吸着した対象物は、ＬＳＰＲモードでの変化として検出することはできず、通常のＳＰＲモードでの変化として検出される。そのため、ＬＳＰＲの検出においてはバックグラウンドノイズとして検出精度を低下させる要因となる。
【0062】
第１の特異的結合物質３０及び対象物の溶液をナノ構造表面に注入した状態で固相担体１に対して、光入射及び透過光検出を維持できる構成であれば、ホットスポットに結合した物質の量をリアルタイムに測定が可能することもできる。例えば、ナノ構造表面に、溶液を留置可能な流路構造を形成することで、光入射及び透過光検出を維持したまま、ナノ構造表面への溶液注入が可能である。
固相担体１に対して、第１の特異的結合物質３０の反応、ブロッキング工程、及び対象物捕捉工程を行ったときの、特定波長（図６Ｂ参照）における透過率の変化をリアルタイムに測定した例を図７に示す。
固相担体１に対して、第１の特異的結合物質３０の反応、ブロッキング工程、及び対象物捕捉工程を行ったときの、特定波長（図６Ｂ参照）における透過率の変化をリアルタイムに測定した例を図７に示す。
【0063】
＜対象物の測定方法（２）＞
対象物の測定方法は、対象物捕捉工程及びＬＳＰＲ検出工程の間に、対象物に標識体を結合させる工程（標識体結合工程；図８（Ｄ））を含んでもよい。図８は、標識体結合工程を含む、対象物の測定方法を説明する模式図である。
対象物の測定方法は、対象物捕捉工程及びＬＳＰＲ検出工程の間に、対象物に標識体を結合させる工程（標識体結合工程；図８（Ｄ））を含んでもよい。図８は、標識体結合工程を含む、対象物の測定方法を説明する模式図である。
【0064】
【0065】
（標識体結合工程）
標識体７０は、標識物質７２が結合した第２の特異的結合物質７１から構成される。
標識体７０は、標識物質７２が結合した第２の特異的結合物質７１から構成される。
【0066】
第２の特異的結合物質７１は、対象物に応じて適宜選択される。第２の特異的結合物質７１は、第１の特異的結合物質３０と同じであってもよく、異なっていてもよい。第１の特異的結合物質－対象物－第２特異的結合物質の複合体の形成の観点から、第２特異的結合物質は、第１特異的結合物質と異なることが好ましい。例えば、対象物がペプチド又はタンパク質である場合、第１の特異的結合物質及び第２特異的結合物質は、互いに異なるエピトープに結合する抗体であってもよい。例えば、対象物がＲＮＡ又はＤＮＡ等の核酸である場合、第１の特異的結合物質及び第２特異的結合物質は、互いに異なる領域にハイブリダイズする核酸プローブ（ポリヌクレオチドプローブ又はオリゴヌクレオチドプローブ）であってもよい。
【0067】
標識物質７２としては、例えば、ナノ粒子、酵素、蛍光物質等が挙げられる。ナノ粒子の材質は、特に限定されない。ナノ粒子としては、例えば、樹脂ビーズ（ポリスチレン、グリシジルメタクリレート等）、磁気ビーズ、金属ナノ粒子等が挙げられる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６－カルボキシ－４’,５’－ジクロロ２’,７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５'－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト（ＨＥＸ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
標識物質７２は、対象物６０のみが捕捉された時の透過光スペクトルのピークシフトよりも、対象物６０に標識体７０が結合したときの透過光スペクトルのピークシフトが大きくするような物質を用いることが好ましい。標識物質７２としては、例えば、ナノ粒子が好ましい。ナノ粒子の種類としては、プラズモン励起層２１が有するナノ構造と、ナノ粒子との相互作用により、透過光スペクトルのピークシフト量が増大するようなものを選択してもよい。
標識物質７２は、対象物６０のみが捕捉された時の透過光スペクトルのピークシフトよりも、対象物６０に標識体７０が結合したときの透過光スペクトルのピークシフトが大きくするような物質を用いることが好ましい。標識物質７２としては、例えば、ナノ粒子が好ましい。ナノ粒子の種類としては、プラズモン励起層２１が有するナノ構造と、ナノ粒子との相互作用により、透過光スペクトルのピークシフト量が増大するようなものを選択してもよい。
【0068】
第２の特異的結合物質７１に対する標識物質７２の結合は、公知の方法により行うことができる。例えば、物理的吸着を利用する方法、第２の特異的結合物質が有する官能基と反応する官能基により標識物質を修飾する方法（例えば、アミノ基修飾、水酸基修飾、カルボキシ基修飾、スクシンイミド基修飾等）、ビオチン－アビジン結合を利用する方法等が挙げられる。
【0069】
標識体７０の結合反応は、固相担体２のナノ構造体２０が配置された面に、標識体７０を含む溶液を供給することにより、行うことができる。
【0070】
標識体の結合反応の条件は、対象物及び第２の特異的結合物質の種類に応じて、適宜選択可能である。例えば、対象物がタンパク質又はペプチドであり、第２の特異的結合物質が抗体である場合、反応温度としては、２０℃以上、３０℃以上、又は３５℃以上等が挙げられる。反応温度の上限は、特に限定されないが、例えば、５０℃以下、４５℃以下、又は４０℃以下等が挙げられる。反応温度の範囲としては、例えば、２０～５０℃、３０～４５℃、又は３０～４０℃等が挙げられる。
反応時間は、特に限定されず、第２の特異的結合物質と対象物との結合反応が十分に進行する程度の時間とすることができる。反応時間は、対象物及び第２の特異的結合物質の種類に応じて適宜選択することができる。対象物がタンパク質又はペプチドであり、第２の特異的対象物が抗体である場合、反応時間としては、例えば、３～２００分が挙げられる。反応時間の下限値は、特に限定されないが、例えば、３分以上、５分以上、１０分以上、２０分以上、又は３０分以上等が挙げられる。反応時間の上限は、特に限定されないが、例えば、２００分以下、１８０分以下、１２０分以下、又は１００分以下等が挙げられる。
反応時間は、特に限定されず、第２の特異的結合物質と対象物との結合反応が十分に進行する程度の時間とすることができる。反応時間は、対象物及び第２の特異的結合物質の種類に応じて適宜選択することができる。対象物がタンパク質又はペプチドであり、第２の特異的対象物が抗体である場合、反応時間としては、例えば、３～２００分が挙げられる。反応時間の下限値は、特に限定されないが、例えば、３分以上、５分以上、１０分以上、２０分以上、又は３０分以上等が挙げられる。反応時間の上限は、特に限定されないが、例えば、２００分以下、１８０分以下、１２０分以下、又は１００分以下等が挙げられる。
【0071】
標識体７０の結合反応後は、固相担体２の洗浄処理を行ってもよい。洗浄処理を行うことにより、未反応の標識体７０を除去することができる。
【0072】
標識体７０を対象物６０に結合させることで、ＬＳＰＲによる透過光スペクトルのピークシフト量を増大させることができる。そのため、対象物の検出感度を向上させることができる。また、対象物に対する特異性を向上させることができる。
【0073】
標識体結合工程は、ブロッキング工程及び対象物捕捉工程と同様に、固相担体２のナノ構造体２０が配置された面に、反応液を留置可能な構造を形成することにより行ってもよい。
【0074】
【0075】
図９Ｂは、透過光のスペクトルシフトの例を示す。
固相担体１に対して、第１の特異的結合物質３０の反応、ブロッキング工程、対象物捕捉工程、及び標識体結合工程を行ったときの、特定波長（図９Ｂ参照）における透過率の変化をリアルタイムに測定した例を図１０に示す。
固相担体１に対して、第１の特異的結合物質３０の反応、ブロッキング工程、対象物捕捉工程、及び標識体結合工程を行ったときの、特定波長（図９Ｂ参照）における透過率の変化をリアルタイムに測定した例を図１０に示す。
【0076】
本実施形態の固相担体は、プラズモン励起層のホットスポット以外の領域の一部又は全部が被覆層により被覆されている。被覆層は、第１の特異的結合物質に対する結合親和性が、プラズモン励起層よりも低い。そのため、固相担体に第１の特異的結合物質を結合させる際に、ホットスポット以外の領域への第１の特異的結合物質の結合が低減される。これにより、Ｓ／Ｎ比が向上し、対象物の検出感度を向上させることができる。
【0077】
［対象物の測定用キット］
本発明の第２の態様は、対象物の測定用キットである。前記キットは、第１の態様の固相担体と、標識物質が結合された、前記対象物の第２の特異的結合物質と、を含む。
本発明の第２の態様は、対象物の測定用キットである。前記キットは、第１の態様の固相担体と、標識物質が結合された、前記対象物の第２の特異的結合物質と、を含む。
【0078】
固相担体は、前記第１の態様の固相担体と同様である。固相担体は、プラズモン励起層の非被覆領域に、第１の特異的結合物質が結合されているものであってもよく、第１の特異的結合物質が結合されていないものであってもよい。
【0079】
標識物質が結合された第２の特異的結合物質は、上記標識体として説明したものと同様である。標識物質は、ナノ粒子が好ましい。
【0080】
（任意構成）
本実施形態の測定用キットは、上記構成に加えて、任意の構成を含んでいてもよい。任意の構成としては、例えば、試料を処理するための試薬（例えば、希釈液等）、洗浄液、ブロッキング液、緩衝液等の各種試薬類、標準試薬、及び使用説明書等が挙げられる。
本実施形態の測定用キットは、上記構成に加えて、任意の構成を含んでいてもよい。任意の構成としては、例えば、試料を処理するための試薬（例えば、希釈液等）、洗浄液、ブロッキング液、緩衝液等の各種試薬類、標準試薬、及び使用説明書等が挙げられる。
【0081】
本実施形態の測定用キットは、標準試薬を含んでいてもよい。標準試薬は、検出対象物の検量線を作成するための試薬である。標準試薬は、例えば、対象物と同種の精製物を用いることができる。
【0082】
本実施形態の測定用キットは、前記態様の固相担体及び標識体を含むため、低濃度の対象物を感度よく測定することができる。
【実施例0083】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0084】
［実施例］
（固相担体の作製）
図３に示す方法に従って、固相担体を作製した。表面プラズモン共鳴を励起可能な物質としては、金を用いて、プラズモン励起層２１を形成した。表面プラズモン共鳴を励起しない物質としては、ＳｉＯ２を用いて、被覆層２５を形成した。
具体的には、研磨洗浄したＢＫ７ガラス表面に、スパッタ法により、２ｎｍのクロム層（接着層）、５０ｎｍの金薄膜層、５０ｎｍのＳｉＯ２被覆層、及び５０ｎｍの熱レジスト層（タングステンを酸素とアルゴンの混合ガスを使って反応性スパッタにて成膜）を形成した。各層は、表面酸化の影響をなくすため、同一のスパッタ装置で連続的に形成した。次いで、波長４０５ｎｍの半導体レーザーを対物レンズでレジスト表面に集光して、ピッチ４００ｎｍでホールパターン（直径１５０ｎｍ）の描画を行った。次いで、２．３８％テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド（ＴＭＡＨ）現像液で、２０分間現像した。これにより、４００ｎｍピッチのホールレジストパターンを作製した。
次いで、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）法にて、ＣＨＦ３ガスを用いて、被覆層であるＳｉＯ２層をエッチングした。次いで、Ａｒガスにより、金薄膜層をエッチングした。次いで、２．３８％テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド（ＴＭＡＨ）現像液に一晩液浸させて、熱レジスト層を除去した。これにより、ガラス表面に、ナノホール構造（ピッチ４００ｎｍ、直径１５０ｎｍ、深さ１００ｎｍ）のナノ構造体が配置された固相担体Ａを作製した。
（固相担体の作製）
図３に示す方法に従って、固相担体を作製した。表面プラズモン共鳴を励起可能な物質としては、金を用いて、プラズモン励起層２１を形成した。表面プラズモン共鳴を励起しない物質としては、ＳｉＯ２を用いて、被覆層２５を形成した。
具体的には、研磨洗浄したＢＫ７ガラス表面に、スパッタ法により、２ｎｍのクロム層（接着層）、５０ｎｍの金薄膜層、５０ｎｍのＳｉＯ２被覆層、及び５０ｎｍの熱レジスト層（タングステンを酸素とアルゴンの混合ガスを使って反応性スパッタにて成膜）を形成した。各層は、表面酸化の影響をなくすため、同一のスパッタ装置で連続的に形成した。次いで、波長４０５ｎｍの半導体レーザーを対物レンズでレジスト表面に集光して、ピッチ４００ｎｍでホールパターン（直径１５０ｎｍ）の描画を行った。次いで、２．３８％テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド（ＴＭＡＨ）現像液で、２０分間現像した。これにより、４００ｎｍピッチのホールレジストパターンを作製した。
次いで、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）法にて、ＣＨＦ３ガスを用いて、被覆層であるＳｉＯ２層をエッチングした。次いで、Ａｒガスにより、金薄膜層をエッチングした。次いで、２．３８％テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド（ＴＭＡＨ）現像液に一晩液浸させて、熱レジスト層を除去した。これにより、ガラス表面に、ナノホール構造（ピッチ４００ｎｍ、直径１５０ｎｍ、深さ１００ｎｍ）のナノ構造体が配置された固相担体Ａを作製した。
【0085】
（抗ＰＳＡ抗体の結合）
固相担体のナノ構造体が配置された面に、ＰＤＭＳで作製した直径６ｍｍ、高さ１０ｍｍの井戸型ウェルを複数貼付けた。各井戸型ウェルに、ＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製した抗ＰＳＡ抗体（ＨｙＴｅｓｔ社製、型番４Ｐ３３－１Ｈ１２）溶液を１００μＬ注入し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。
固相担体のナノ構造体が配置された面に、ＰＤＭＳで作製した直径６ｍｍ、高さ１０ｍｍの井戸型ウェルを複数貼付けた。各井戸型ウェルに、ＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製した抗ＰＳＡ抗体（ＨｙＴｅｓｔ社製、型番４Ｐ３３－１Ｈ１２）溶液を１００μＬ注入し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。
【0086】
（ブロッキング工程）
固相担体Ａへの非特異的吸着を抑制するために、固相担体Ａのナノ構造体が配置された面をＢＳＡ（牛血清アルブミン、サーモフィッシャー製、型番３７５２５）でブロッキングした。ブロッキング後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。
固相担体Ａへの非特異的吸着を抑制するために、固相担体Ａのナノ構造体が配置された面をＢＳＡ（牛血清アルブミン、サーモフィッシャー製、型番３７５２５）でブロッキングした。ブロッキング後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。
【0087】
（対象物捕捉工程）
対象物として、ＰＳＡを用いた。ＰＳＡ抗原（ＨｙＴｅｓｔ社製、型番８Ｐ７８）をＰＢＳＴで希釈し、０～１ｎｇ／ｍＬの希釈系列のＰＳＡ溶液を作製した。前記希釈系列のＰＳＡ溶液を１００μＬずつ各ウェルに注入し、３７℃で６０分間反応させた。結合反応後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。
実施例における対象物捕捉工程後の固相担体Ａの模式図を図１１Ａ（上図）に示す。
対象物として、ＰＳＡを用いた。ＰＳＡ抗原（ＨｙＴｅｓｔ社製、型番８Ｐ７８）をＰＢＳＴで希釈し、０～１ｎｇ／ｍＬの希釈系列のＰＳＡ溶液を作製した。前記希釈系列のＰＳＡ溶液を１００μＬずつ各ウェルに注入し、３７℃で６０分間反応させた。結合反応後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。
実施例における対象物捕捉工程後の固相担体Ａの模式図を図１１Ａ（上図）に示す。
【0088】
（ＬＳＰＲ検出工程）
ガラス基板側から白色光を照射し、各反応領域における波長７２５ｎｍの透過光の透過率を分光器で測定した。ＰＳＡ濃度０ｎｇ／ｍＬにおける透過率を基準として、各ＰＳＡ濃度における透過率の変化量をグラフにプロットした。
ガラス基板側から白色光を照射し、各反応領域における波長７２５ｎｍの透過光の透過率を分光器で測定した。ＰＳＡ濃度０ｎｇ／ｍＬにおける透過率を基準として、各ＰＳＡ濃度における透過率の変化量をグラフにプロットした。
【0089】
［比較例］
（固相担体の作製）
層２６を形成しなかったこと以外は、図３に示す方法に従って、固相担体を作製した。
具体的には、研磨洗浄したＢＫ７ガラス表面に、スパッタ法により、２ｎｍのクロム層（接着層）、５０ｎｍの金薄膜層、及び５０ｎｍの熱レジスト層（タングステンを酸素とアルゴンの混合ガスを使って反応性スパッタにて成膜）を形成した。実施例１と同様の方法で、４００ｎｍピッチのホールレジストパターンを作製した。
次いで、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）法にて、Ａｒガスにより、金薄膜層をエッチングした。次いで、２．３８％テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド（ＴＭＡＨ）現像液に一晩液浸させて、熱レジスト層を除去した。これにより、ガラス表面に、ナノホール構造（ピッチ４００ｎｍ、直径１５０ｎｍ、深さ５０ｎｍ）のナノ構造体が配置された固相担体Ｂを作製した。
（固相担体の作製）
層２６を形成しなかったこと以外は、図３に示す方法に従って、固相担体を作製した。
具体的には、研磨洗浄したＢＫ７ガラス表面に、スパッタ法により、２ｎｍのクロム層（接着層）、５０ｎｍの金薄膜層、及び５０ｎｍの熱レジスト層（タングステンを酸素とアルゴンの混合ガスを使って反応性スパッタにて成膜）を形成した。実施例１と同様の方法で、４００ｎｍピッチのホールレジストパターンを作製した。
次いで、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）法にて、Ａｒガスにより、金薄膜層をエッチングした。次いで、２．３８％テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド（ＴＭＡＨ）現像液に一晩液浸させて、熱レジスト層を除去した。これにより、ガラス表面に、ナノホール構造（ピッチ４００ｎｍ、直径１５０ｎｍ、深さ５０ｎｍ）のナノ構造体が配置された固相担体Ｂを作製した。
【0090】
（抗ＰＳＡ抗体の結合、対象物捕捉工程）
固相担体Ａに替えて固相担体Ｂを用いたこと以外は、実施例と同様に、抗ＰＳＡ抗体の結合、及び対象物捕捉工程をおこなった。
比較例における対象物捕捉工程後の固相担体Ｂの模式図を図１１Ａ（下図）に示す。
固相担体Ａに替えて固相担体Ｂを用いたこと以外は、実施例と同様に、抗ＰＳＡ抗体の結合、及び対象物捕捉工程をおこなった。
比較例における対象物捕捉工程後の固相担体Ｂの模式図を図１１Ａ（下図）に示す。
【0091】
（ＬＳＰＲ検出工程）
ガラス基板側から白色光を照射し、各反応領域における波長７２５ｎｍの透過光の透過率を分光器で測定した。ＰＳＡ濃度０ｎｇ／ｍＬにおける透過率を基準として、各ＰＳＡ濃度における透過率の変化量をグラフにプロットした。
ガラス基板側から白色光を照射し、各反応領域における波長７２５ｎｍの透過光の透過率を分光器で測定した。ＰＳＡ濃度０ｎｇ／ｍＬにおける透過率を基準として、各ＰＳＡ濃度における透過率の変化量をグラフにプロットした。
【0092】
透過率変化量をプロットしたグラフを図１１Ｂに示す。いずれのＰＳＡ濃度においても、比較例と比較して、実施例の方が、透過率変化量が大きかった。透過率変化量は、ホットスポット以外の部分に捕捉される対象物の量に影響される。比較例の場合は、ホットスポット以外の部分がＳｉＯ２層で被覆されていないため、ホットスポット以外の領域にも対象物が捕捉される。その結果、ホットスポットに捕捉される対象物の量が減少し、透過率変化量が小さくなったと考えられる。したがって、低濃度の対象物を測定する最の透過率変化は小さくなり、対象物の測定が困難となる。
一方、実施例では、ＰＳＡ濃度０．１ｎｇ／ｍＬにおいても、透過率変化を十分に検出できることが確認された。これらの結果は、実施例では、高感度に対象物を検出できることを示している。
以上の結果より、ホットスポット以外の領域を被覆層で被覆した固相担体を用いることにより、高感度に対象物を検出できることが確認された。
一方、実施例では、ＰＳＡ濃度０．１ｎｇ／ｍＬにおいても、透過率変化を十分に検出できることが確認された。これらの結果は、実施例では、高感度に対象物を検出できることを示している。
以上の結果より、ホットスポット以外の領域を被覆層で被覆した固相担体を用いることにより、高感度に対象物を検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0093】
本発明によれば、ホットスポット以外の領域への対象物の捕捉量を低減可能な、固相担体、及び対象物の測定用キットが提供される。
【符号の説明】
【0094】
１ 固相担体
２ 第１の特異的結合物質が結合された固相担体
１０ 基板
２０ ナノ構造体
２１ プラズモン励起層
２１ａ 被覆領域
２１ｂ 非被覆領域
２２ 表面プラズモン共鳴を励起可能な物質の層
２５ 被覆層
２６ 表面プラズモン共鳴を励起しない物質の層
３０ 第１の特異的結合物質
４０ レジスト膜
４１ 露光部
５０ ブロッキング剤
６０ 対象物
７０ 標識体
７１ 第２の特異的結合物質
７２ 標識物質
１００ 分光器
２ 第１の特異的結合物質が結合された固相担体
１０ 基板
２０ ナノ構造体
２１ プラズモン励起層
２１ａ 被覆領域
２１ｂ 非被覆領域
２２ 表面プラズモン共鳴を励起可能な物質の層
２５ 被覆層
２６ 表面プラズモン共鳴を励起しない物質の層
３０ 第１の特異的結合物質
４０ レジスト膜
４１ 露光部
５０ ブロッキング剤
６０ 対象物
７０ 標識体
７１ 第２の特異的結合物質
７２ 標識物質
１００ 分光器
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】