(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024023185
(43)【公開日】2024-02-21
(54)【発明の名称】エキソソームを単離するための胎盤の培養
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240214BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20240214BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20240214BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240214BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240214BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240214BHJP
A61K 35/50 20150101ALI20240214BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240214BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240214BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20240214BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20240214BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240214BHJP
【FI】
C12N5/071
C12N5/078
C12N5/09
A61P37/04
A61P43/00 107
A61P35/00
A61K35/50
A61K35/12
A61K31/7105
A61K38/19
A61K38/02
A61K9/08
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】OL
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023183102
(22)【出願日】2023-10-25
(62)【分割の表示】P 2020545051の分割
【原出願日】2018-11-16
(31)【優先権主張番号】62/587,335
(32)【優先日】2017-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】520169074
【氏名又は名称】セルラリティ インク.
(74)【代理人】
【識別番号】100097456
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 徹
(72)【発明者】
【氏名】キアン イエ
(57)【要約】 (修正有)
【課題】培養した胎盤、またはその一部から回収したエキソソームを、生成、単離、及び、特徴決定する方法を提供する。
【解決手段】a)胎盤又はその一部、好ましくは、培養胎盤又はその一部を、第1の培地と接触させること;及びb)胎盤又はその一部からエキソソームの集団を含む第1の画分を得ること;c)任意に、第2の培地と接触させ、第2の画分を得ること;d)任意に、第3の培地と接触させ、第3の画分を得ること;e)任意に、第1、第2、及び/又は、第3の画分に由来するエキソソームの集団を、好ましくは連続遠心分離及び/又は特異的な抗体又はその結合部分を使用するアフィニティークロマトグラフィーで単離することを含み、抗体又はその結合部分を、膜、樹脂、ビーズ、又は容器などの基質に固定している、胎盤又はその一部からエキソソームを単離する方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
胎盤、または、その一部からエキソソームを単離する方法であって、前記方法は:
a)胎盤、または、その一部、好ましくは、培養胎盤、または、その一部を、第1の培
地と接触させること;及び
b)前記胎盤、または、その一部からエキソソームの集団を含む第1の画分を得ること
;
c)任意に、前記胎盤、または、その一部を、第2の培地と接触させ、かつ、前記胎盤
、または、その一部に由来するエキソソームの集団を含む第2の画分を得ること;
d)任意に、前記胎盤、または、その一部を、第3の培地と接触させ、かつ、前記胎盤
、または、その一部に由来するエキソソームの集団を含む第3の画分を得ること;及び
e)任意に、前記第1、第2、及び/または、第3の画分に由来するエキソソームの集
団を、好ましくは、連続遠心分離、及び/または、所望のエキソソームの集団に存在する
マーカー、または、ペプチドに特異的な抗体、または、その結合部分を使用するアフィニ
ティークロマトグラフィーで単離すること、を含み、前記抗体、または、その結合部分を
、膜、樹脂、ビーズ、または、容器などの基質に固定している、前記方法。
【請求項2】
前記胎盤、または、その一部が、羊膜をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記胎盤、または、その一部が、ヒト胎盤、または、その一部である、請求項2に記載
の方法。
【請求項4】
前記第1、第2、及び/または、第3の培地を、胎盤、または、その一部と、45分間
、または、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15
、16、17、18、19、20、21、22、23、または、24時間、または、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18
、19、または、20日間など、少なくとも45分間かけて接触させ、任意の時間の長さは、前記した時点のいずれか2つで定義した範囲内にある、前出請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項5】
前記第1、第2、及び/または、第3の培地を、胎盤、または、その一部と、少なくと
も7、14、28、35、または、42日間、または、前記した時点のいずれか2つで定
義した範囲内にある任意の長さの時間をかけて接触させる、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項6】
前記胎盤、または、その一部が、細分化、粉砕、または、酵素処理してある、請求
項1~5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
前記胎盤、または、その一部は、実質的に平坦、または、シート状であり、及び、脱細
胞化し、かつ、実質的に乾燥させており、及び、前記方法が、外因性細胞を含む体液を、
前記脱細胞化胎盤、または、その一部と接触させて、前記脱細胞化胎盤、または、その一
部に対して、前記外因性細胞を播種することをさらに含み、及び、前記細胞と、前記脱細
胞化胎盤、または、その一部との接触は、脱細胞化胎盤、または、その一部を、第1の培
地と接触させる前に行う、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】
前記外因性細胞を、前記胎盤、または、その一部のドナー対象とは異なる対象から得る
、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
前記体液が、腹水、血液、または、血漿である、請求項7または8に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞が、臓器に由来する、請求項7または8に記載の方法。
【請求項11】
前記細胞が、肝臓、腎臓、肺、または、膵臓に由来する、請求項10に記載の方法。
【請求項12】
前記細胞が、免疫細胞である、請求項7または8に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞が、T細胞またはB細胞である、請求項12に記載の方法。
【請求項14】
前記第1の培地が、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項15】
前記第1、第2、または第3の画分が、腹水、血液、または、血漿に由来するエキソソ
ームを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項16】
前記第1、第2、または第3の画分が、臓器細胞に由来するエキソソームを含む、請求
項10に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞が、肝臓、腎臓、肺、または、膵臓に由来する、請求項11に記載の方法。
【請求項18】
前記第2の培地が、成長因子を含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項19】
前記第3の培地が、キレート剤を含む、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項20】
前記キレート剤が、ホスホネート、BAPTA四ナトリウム塩、BAPTA/AM、D
i-Notrophen(商標)試薬四ナトリウム塩、EGTA/AM、ピリドキサール
イソニコチノイルヒドラジン、N、N、N’、N’-テトラキス-(2ピリジルメチル)
エチレンジアミン、6-ブロモ-N’-(2-ヒドロキシベンジリデン)-2-メチルキ
ノリン-4-カルボヒドラジド、1,2-ビス(2-アミノフェノキシ)エタン-N、N
、N’、N’-四酢酸テトラキス(アセトキシメチルエステル)、(エチレンジニトリロ
)四酢酸、(EDTA)、エダタミル、エチレンジニトリロ四酢酸、エチレングリコール
-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N、N、N’、N’-四酢酸、または、エチレン
グリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N’、N’-四酢酸四ナトリ
ウム塩(EGTA)、または、これらのあらゆる組み合わせである、請求項19に記載の
方法。
【請求項21】
前記キレート剤が、EDTA、または、EGTA、または、これらの組み合わせである
、請求項19または20に記載の方法。
【請求項22】
前記キレート剤を、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8m
M、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM
、80mM、90mM、または、100mMの濃度、または、前記した濃度のいずれか2
つで定義した範囲内にある濃度で第3の培地に提供する、請求項19~21のいずれか1
項に記載の方法。
【請求項23】
前記第3の培地でのEDTAの濃度は、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6
mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、
60mM、70mM、80mM、90mM、または、100mMの濃度、または、前記し
た濃度のいずれか2つで定義した範囲内にある濃度で提供する、請求項19~22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項24】
前記第3の培地が、プロテアーゼを含む、請求項1~23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項25】
前記プロテアーゼが、トリプシン、コラゲナーゼ、キモトリプシン、または、カルボキ
シペプチダーゼ、または、これらのあらゆる組み合わせである、請求項24に記載の方法
。
【請求項26】
前記プロテアーゼが、トリプシンである、請求項25に記載の方法。
【請求項27】
前記プロテアーゼを、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8
mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70m
M、80mM、90mM、または、100mMの濃度、または、前記した濃度のいずれか
2つで定義した範囲内にある濃度で第3の培地に提供する、請求項24に記載の方法。
【請求項28】
前記方法が、前記胎盤、または、その一部を、さらなる複数の培地と接触させることを
さらに含み、前記接触により、エキソソームを含む複数の画分が得られる、請求項1~27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項29】
前記第1、第2、第3、または、さらなる培地が、グルコースを含む、請求項28に記載の方法。
【請求項30】
前記第1、第2、第3、または、さらなる培地が、GM-CSFを含む、請求項28ま
たは29記載の方法。
【請求項31】
前記第1、第2、第3、または、さらなる培地が、血清を含む、請求項28~30のい
ずれか1項に記載の方法。
【請求項32】
前記第1、第2、第3、または、さらなる培地が、DMEMを含む、請求項28~31
のいずれか1項に記載の方法。
【請求項33】
前記第1、第2、第3、または、さらなる培地が、AHRアンタゴニストを含む、請求
項28~32のいずれか1項に記載の方法。
【請求項34】
前記AHRアンタゴニストが、SR1である、請求項33に記載の方法。
【請求項35】
前記SR1が、1nM、10nM、100nM、200nM、300nM、400nM
、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、または、1mMの濃
度、または、前記した値のいずれか2つで定義した範囲内にあるその他のあらゆる濃度
である、請求項34に記載の方法。
【請求項36】
前記第1の培地が、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、
40℃の温度、または、前記した温度のいずれか2つで定義した範囲内にある温度を維持
しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、請求項1~35のいずれか1項に記載の方法。
【請求項37】
前記第2の培地が、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、
40℃の温度、または、前記した温度のいずれか2つで定義した範囲内にある温度を維持
しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、請求項1~36のいずれか1項に記載の方法。
【請求項38】
前記第3の培地が、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、
40℃の温度、または、前記した値のいずれか2つで定義した範囲内にある温度を維持
しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、請求項1~37のいずれか1項に記載の方法。
【請求項39】
前記複数のさらなる培地が、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、
35℃、40℃の温度、または、前記した値のいずれか2つで定義した範囲内にある温
度を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、請求項28~38のい
ずれか1項に記載の方法。
【請求項40】
前記第1、第2または第3のかん流液、または、さらなる複数の培地が、抗生物質を含
む、請求項1~39のいずれか1項に記載の方法。
【請求項41】
(a)前記第1、第2、及び/または、第3の画分、または、複数の画分を、組織フィ
ルターに通すこと;
(b)(a)で回収した濾過物に対して第1の遠心分離を行って、細胞ペレット、及び
、第1の上清を生成すること;
(c)前記第1の上清に関して第2の遠心分離を行って、第2の上清を生成すること;
及び
(d)前記第2の上清に関して第3の遠心分離を行って、エキソソームペレットを生成
すること;及び、任意に、
(e)前記エキソソームを溶液に再懸濁すること、
を含む方法で、前記エキソソームを、前記第1、第2、及び/または、第3の画分、ま
たは、複数の画分から単離する、請求項1~40のいずれか1項に記載の方法。
【請求項42】
前記エキソソームが、CD63、CD63-A、パーフォリン、Fas、TRAIL、
または、グランザイムB、または、これらのあらゆる組み合わせを含む、請求項1~41のいずれか1項に記載の方法。
【請求項43】
前記エキソソームが、CD63Aを含む、請求項42に記載の方法。
【請求項44】
前記エキソソームが、シグナル伝達分子を含む、請求項1~43のいずれか1項に記載の方法。
【請求項45】
前記エキソソームが、サイトカイン、mRNA、または、miRNAを含む、請求項1~44のいずれか1項に記載の方法。
【請求項46】
アフィニティークロマトグラフィーによってエキソソームを単離することをさらに含み
、アフィニティークロマトグラフィーが、ウイルス抗原、ウイルスタンパク質、細菌抗原
、細菌タンパク質、真菌抗原、または、真菌タンパク質を含むエキソソームの除去に関し
て選択的である、請求項1~45のいずれか1項に記載の方法。
【請求項47】
1つ以上のさらなるアフィニティークロマトグラフィーステップによってエキソソーム
を単離することをさらに含み、前記1つ以上のさらなるアフィニティークロマトグラフィ
ーステップが、炎症マーカー、及び/または、腫瘍マーカーを含むエキソソームの除去に
関して選択的である、請求項1~46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項48】
ヒト胎盤由来のエキソソームを含む組成物であって、前記エキソソームが、CD1c、
CD20、CD24、CD25、CD29、CD2、CD3、CD8、CD9、CD11
c、CD14、CD19、CD31、CD40、CD41b、CD42a、CD44、C
D45、CD49e、CD4、CD56、CD62P、CD63、CD69、CD81、
CD86、CD105、CD133-1、CD142、CD146、CD209、CD3
26、HLA-ABC、HLA-DRDPDQ、MCSP、ROR1、SSEA-4、ま
たは、これらの組み合わせに対して陽性である、前記組成物。
【請求項49】
前記エキソソームが、CD1c、CD20、CD24、CD25、CD29、CD2、
CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD31、CD40、CD
41b、CD42a、CD44、CD45、CD49e、CD4、CD56、CD62P
、CD63、CD69、CD81、CD86、CD105、CD133-1、CD142
、CD146、CD209、CD326、HLA-ABC、HLA-DRDPDQ、MC
SP、ROR1、及び、SSEA-4に対して陽性である、請求項48に記載の組成物。
【請求項50】
前記エキソソームが、CD1c、CD20、CD24、CD25、CD29、CD2、
CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD31、CD40、CD
41b、CD42a、CD44、CD45、CD49e、CD4、CD56、CD62P
、CD63、CD69、CD81、CD86、CD105、CD133-1、CD142
、CD146、CD209、CD326、HLA-ABC、HLA-DRDPDQ、MC
SP、ROR1、及び、SSEA-4からなる群から選択した、2、3、4、5、6、7
、8、9、10個、または、それ以上のマーカーに対して陽性である、請求項48に記載
の組成物。
【請求項51】
前記エキソソームが、CD3-、CD11b-、CD14-、CD19-、CD33-
、CD192-、HLA-A-、HLA-B-、HLA-C-、HLA-DR-、CD1
1c-、または、CD34-である、請求項48~50のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項52】
前記エキソソームが、CD3-、CD11b-、CD14-、CD19-、CD33-
、CD192-、HLA-A-、HLA-B-、HLA-C-、HLA-DR-、CD1
1c-、及び、CD34-である、請求項48~50のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項53】
前記エキソソームが、非コードRNA分子を含む、請求項48~52のいずれか1項に
記載の組成物。
【請求項54】
前記RNA分子が、ミクロRNAである、請求項53に記載の組成物。
【請求項55】
前記ミクロRNAを、表7のミクロRNA、及び、それらの組み合わせからなる群から
選択する、請求項54に記載の組成物。
【請求項56】
前記ミクロRNAを、hsa-mir-26b、hsa-miR-26b-5p、hs
a-mir-26a-2、hsa-mir-26a-1、hsa-miR-26a-5p
、hsa-mir-30d、hsa-miR-30d-5p、hsa-mir-100、
hsa-miR-100-5p、hsa-mir-21、hsa-miR-21-5p、
hsa-mir-22、hsa-miR-22-3p、hsa-mir-99b、hsa
-miR-99b-5p、hsa-mir-181a-2、hsa-mir-181a-
1、hsa-miR-181a-5p、及び、これらの組み合わせからなる群から選択す
る、請求項54に記載の組成物。
【請求項57】
前記エキソソームが、表3のサイトカイン、及び、それらの組み合わせからなる群から
選択するサイトカインを含む、請求項48~56のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項58】
前記エキソソームが、表4のサイトカイン受容体、及び、それらの組み合わせからなる
群から選択するサイトカイン受容体を含む、請求項48~57のいずれか1項に記載の組
成物。
【請求項59】
前記エキソソームが、表6のタンパク質、及び、それらの組み合わせからなる群から選
択するタンパク質を含む、請求項48~58のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項60】
前記エキソソームが、細胞質アコニット酸ヒドラターゼ、細胞表面糖タンパク質MUC
18、タンパク質アルギニンN-メチルトランスフェラーゼ1、グアニンヌクレオチド結
合タンパク質G(s)サブユニットアルファ、カリン-5、カルシウム結合タンパク質3
9、グルコシダーゼ2サブユニットベータ、塩化物細胞内チャネルタンパク質5、セマフ
ォリン-3B、60Sリボソームタンパク質L22、スプライセオソームRNAヘリカー
ゼDDX39B、転写活性化タンパク質Pur-アルファ、プログラム細胞死タンパク質
10、BRO1ドメイン含有タンパク質BROX、キヌレニン-オキソグルタル酸トラン
スアミナーゼ3、ラミニンサブユニットアルファ5、ATP結合カセットサブファミリー
Eメンバー1、シンタキシン結合タンパク質3、プロテアソームサブユニットベータタイ
プ7、及び、これらの組み合わせ、からなる群から選択したタンパク質を含む、請求項4
8~58のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項61】
前記エキソソームが、間葉系幹細胞、臍帯血、または、胎盤かん流液に由来するエキソ
ソームよりも少なくとも2倍高いレベルで、少なくとも1つのマーカー分子を含む、請求
項48~60のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項62】
前記エキソソームが、間葉系幹細胞、臍帯血、及び、胎盤かん流液に由来するエキソソ
ームよりも少なくとも2倍高いレベルで、少なくとも1つのマーカー分子を含む、請求項
48~60のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項63】
前記エキソソームを、全胎盤培養物の培地から単離する、請求項48~62のいずれか
1項に記載の組成物。
【請求項64】
前記エキソソームを、胎盤葉、または、胎盤の一部を含む全培養物の培地から単離する
、請求項48~62のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項65】
前記エキソソームを、請求項1~47のいずれか1項に記載の方法で生成する、請求項
48~64のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項66】
静脈内投与に適した形態である、請求項48~65のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項67】
局所注射に適した形態である、請求項48~65のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項68】
局所投与に適した形態である、請求項48~65のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項69】
超音波送達に適した形態である、請求項48~65のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項70】
免疫細胞の増殖を増加させる方法であって、前記細胞を、請求項48~65のいずれか
1項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項71】
前記免疫細胞が、T細胞である、請求項70に記載の方法。
【請求項72】
前記免疫細胞が、NK細胞である、請求項70に記載の方法。
【請求項73】
前記免疫細胞が、CD34+細胞である、請求項70に記載の方法。
【請求項74】
がん細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項48~65のいずれか1
項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項75】
前記対象での血管形成または血管新生の方法であって、前記対象に対して、請求項48
~65のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項76】
前記対象の免疫系を調節する方法であって、前記対象に対して、請求項48~65のい
ずれか1項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項77】
対象の罹患組織または損傷組織を修復する方法であって、前記対象に対して、請求項4
8~65のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項78】
対象のがんを処置する方法であって、前記対象に対して、請求項48~65のいずれか
1項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項79】
前記対象が、ヒトである、請求項75~78のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、2018年11月16日に出願した米国仮特許出願第62/587,335
号の利益を主張するものであり、その開示の全体を参照により本明細書に援用する。
【0002】
1.発明の分野
培養した胎盤、または、その一部から、エキソソームを生成、単離、及び、特徴決定す
る方法を提供する。本明細書で説明する代替手法は、バイオテクノロジーのツール、及び
、治療法として使用することができるエキソソームの生成、分離、特徴決定を容易にする
。
【背景技術】
【0003】
2.発明の背景
エキソソームは、生体細胞から分泌されるナノサイズの二脂質膜小胞であり、細胞間連
絡において重要な機能を果たす。ヒトが妊娠している期間、胎盤は、生理的ホメオスタシ
スの調節と、胎児の発達の支援において中心的な役割を果たす。胎盤が分泌する細胞外小
胞、及び、エキソソームは、胎盤と母体組織との間の連絡に寄与して、母体胎児耐性を維
持することが知られている。エキソソームは、脂質、サイトカイン、ミクロRNA、mR
NA、及び、DNA、ならびに、タンパク質などの活性な生物製剤を含んでおり、これら
を、当該エキソソームの表面に提示することができる。エキソソームは、免疫調節、血管
形成の促進などの数多くの治療方法、及び、薬剤の送達に有用であると考えられている。
大量のエキソソームの分離を可能にするさらなる手法が必要であることは、明らかである
。
【発明の概要】
【0004】
3.概要
本発明の態様は、培養した胎盤、または、その一部から、エキソソームを生成、単離、
及び、特徴決定する方法に関する。本明細書で説明する手法は、バイオテクノロジーのツ
ール、及び、治療法として使用することができるエキソソームの生成、分離、特徴決定を
容易にする。好ましい代替手法は、以下の通りである:
【0005】
1.胎盤、または、その一部からエキソソームを単離する方法であって、前記方法は:
a)胎盤、または、その一部、好ましくは、培養胎盤、または、その一部を、第1の培
地と接触させること;及び
b)前記胎盤、または、その一部からエキソソームの集団を含む第1の画分を得ること
;
c)任意に、前記胎盤、または、その一部を、第2の培地と接触させ、かつ、前記胎盤
、または、その一部に由来するエキソソームの集団を含む第2の画分を得ること;
d)任意に、前記胎盤、または、その一部を、第3の培地と接触させ、及び、前記胎盤
、または、その一部に由来するエキソソームの集団を含む第3の画分を得ること;及び
e)任意に、前記第1、第2、及び/または、第3の画分に由来するエキソソームの集
団を、好ましくは、連続遠心分離、及び/または、所望のエキソソームの集団に存在する
マーカー、または、ペプチドに特異的な抗体、または、その結合部分を使用するアフィニ
ティークロマトグラフィーで単離すること、を含み、前記抗体、または、その結合部分を
、膜、樹脂、ビーズ、または、容器などの基質に固定している、前記方法。
【0006】
2.前記胎盤、または、その一部が、羊膜をさらに含む、代替手法1に記載の方法。
【0007】
3.前記胎盤、または、その一部が、ヒト胎盤、または、その一部である、代替手法2
に記載の方法。
【0008】
4.前記第1、第2、及び/または、第3の培地を、胎盤、または、その一部と、45
分間、または、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、または、24時間、または、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、または、20日間など、少なくとも45分間かけて接触させ、時間の長さは
、前記した時点のいずれか2つで定義した範囲内にある、前出代替手法のいずれか1つに
記載の方法。
【0009】
5.前記第1、第2、及び/または、第3の培地を、胎盤、または、その一部と、少な
くとも7、14、28、35、または、42日間、または、前記した時点のいずれか2つ
で定義した範囲内にある長さの時間をかけて接触させる、前出代替手法のいずれか1つに
記載の方法。
【0010】
6.前記胎盤、または、その一部が、細分化、粉砕、または、酵素処理してある、前出
代替手法のいずれか1つに記載の方法。
【0011】
7.前記胎盤、または、その一部は、実質的に平坦、または、シート状であり、及び、
脱細胞化し、かつ、実質的に乾燥させており、及び、前記方法が、外因性細胞を含む体液
を、脱細胞化胎盤、または、その一部と接触させて、前記脱細胞化胎盤、または、その一
部に対して、前記外因性細胞を播種することをさらに含み、及び、前記細胞と、前記脱細
胞化胎盤、または、その一部との接触は、脱細胞化胎盤、または、その一部を、第1の培
地と接触させる前に行う、代替手法1~5のいずれか1つに記載の方法。
【0012】
8.前記外因性細胞を、前記胎盤、または、その一部のドナー対象とは異なる対象から
得る、代替手法7に記載の方法。
【0013】
9.前記体液が、腹水、血液、または、血漿である、代替手法7または8に記載の方法
。
【0014】
10.前記細胞が、臓器に由来する、代替手法7または8に記載の方法。
【0015】
11.前記細胞が、肝臓、腎臓、肺、または、膵臓に由来する、代替手法10に記載の
方法。
【0016】
12.前記細胞が、免疫細胞である、代替手法7または8に記載の方法。
【0017】
13.前記細胞が、T細胞またはB細胞である、代替手項12に記載の方法。
【0018】
14.前記第1の培地が、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む、前出代替手法のい
ずれか1つに記載の方法。
【0019】
15.前記第1、第2、または第3の画分が、腹水、血液、または、血漿に由来するエ
キソソームを含む、代替手法9に記載の方法。
【0020】
16.前記第1、第2、または第3の画分が、臓器細胞に由来するエキソソームを含む
、代替手法10に記載の方法。
【0021】
17.前記細胞が、肝臓、腎臓、肺、または、膵臓に由来する、代替手法11に記載の
方法。
【0022】
18.前記第2の培地が、成長因子を含む、前出代替手法のいずれか1つに記載の方法
。
【0023】
19.前記第3の培地が、キレート剤を含む、前出代替手法のいずれか1つに記載の方
法。
【0024】
20.前記キレート剤が、ホスホネート、BAPTA四ナトリウム塩、BAPTA/A
M、Di-Notrophen(商標)試薬四ナトリウム塩、EGTA/AM、ピリドキ
サールイソニコチノイルヒドラジン、N、N、N’、N’-テトラキス-(2ピリジルメ
チル)エチレンジアミン、6-ブロモ-N’-(2-ヒドロキシベンジリデン)-2-メ
チルキノリン-4-カルボヒドラジド、1,2-ビス(2-アミノフェノキシ)エタン-
N、N、N’、N’-四酢酸テトラキス(アセトキシメチルエステル)、(エチレンジニ
トリロ)四酢酸、(EDTA)、エダタミル、エチレンジニトリロ四酢酸、エチレングリ
コール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N、N、N’、N’-四酢酸、または、エ
チレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N’、N’-四酢酸四
ナトリウム塩(EGTA)、または、これらのあらゆる組み合わせである、代替手法19
に記載の方法。
【0025】
21.前記キレート剤が、EDTA、または、EGTA、または、これらの組み合わせ
である、代替手法19または20に記載の方法。
【0026】
22.前記キレート剤を、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM
、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、7
0mM、80mM、90mM、または、100mMの濃度、または、前記した濃度のいず
れか2つで定義した範囲内にある濃度で第3の培地に提供する、代替手法19~21のい
ずれか1つに記載の方法。
【0027】
23.前記第3の培地でのEDTAの濃度は、1mM、2mM、3mM、4mM、5m
M、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50
mM、60mM、70mM、80mM、90mM、または、100mMの濃度、または、
前記した濃度のいずれか2つで定義した範囲内にある濃度である、代替手法19~22の
いずれか1つに記載の方法。
【0028】
24.前記第3の培地が、プロテアーゼを含む、前出代替手法のいずれか1つに記載の
方法。
【0029】
25.前記プロテアーゼが、トリプシン、コラゲナーゼ、キモトリプシン、または、カ
ルボキシペプチダーゼ、または、これらのあらゆる組み合わせである、代替手法24に記
載の方法。
【0030】
26.前記プロテアーゼが、トリプシンである、代替手法25または25に記載の方法
。
【0031】
27.前記プロテアーゼを、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7m
M、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、
70mM、80mM、90mM、または、100mMの濃度、または、前記した濃度のい
ずれか2つで定義した範囲内にある濃度で第3の培地に提供する、代替手法24に記載の
方法。
【0032】
28.前記方法が、前記胎盤、または、その一部を、さらなる複数の培地と接触させる
ことをさらに含み、前記接触により、エキソソームを含む複数の画分が得られる、前出代
替手法のいずれか1つに記載の方法。
【0033】
29.前記第1、第2、第3、または、さらなる培地が、グルコースを含む、代替手法
28に記載の方法。
【0034】
30.前記第1、第2、第3、または、さらなる培地が、GM-CSFを含む、代替手
法28または29記載の方法。
【0035】
31.前記第1、第2、第3、または、さらなる培地が、血清を含む、代替手法28~
30のいずれか1つに記載の方法。
【0036】
32.前記第1、第2、第3、または、さらなる培地が、DMEMを含む、代替手法2
8~31のいずれか1項に記載の方法。
【0037】
33.前記第1、第2、第3、または、さらなる培地が、AHRアンタゴニストを含む
、代替手法28~32のいずれか1つに記載の方法。
【0038】
34.前記AHRアンタゴニストが、SR1である、代替手法33に記載の方法。
【0039】
35.前記SR1が、1nM、10nM、100nM、200nM、300nM、40
0nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、または、1m
Mの濃度、または、前記した濃度のいずれか2つで定義した範囲内にあるその他のあらゆ
る濃度である、代替手法34に記載の方法。
【0040】
36.前記第1の培地が、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、3
5℃、40℃の温度、または、前記した温度のいずれか2つで定義した範囲内にある温度
を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、前出代替手法のいずれか
1つに記載の方法。
【0041】
37.前記第2の培地が、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、3
5℃、40℃の温度、または、前記した温度のいずれか2つで定義した範囲内にある温度
を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、前出代替手法のいずれか
1つに記載の方法。
【0042】
38.前記第3の培地が、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、3
5℃、40℃の温度、または、前記した温度のいずれか2つで定義した範囲内にある温度
を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、前出代替手法のいずれか
1つに記載の方法。
【0043】
39.前記複数のさらなる培地が、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、3
0℃、35℃、40℃の温度、または、前記した温度のいずれか2つで定義した範囲内に
ある温度を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、代替手法28~
38のいずれか1つに記載の方法。
【0044】
40.前記第1、第2または第3のかん流液、または、さらなる複数の培地が、抗生物
質を含む、前出代替手法のいずれか1つに記載の方法。
【0045】
41.(a)前記第1、第2、及び/または、第3の画分、または、複数の画分を、組
織フィルターに通すこと;
(b)(a)で回収した濾過物に対して第1の遠心分離を行って、細胞ペレット、及び
、第1の上清を生成すること;
(c)前記第1の上清に関して第2の遠心分離を行って、第2の上清を生成すること;
及び
(d)前記第2の上清に関して第3の遠心分離を行って、エキソソームペレットを生成
すること;及び、任意に、
(e)前記エキソソームを溶液に再懸濁すること、
を含む方法で、前記エキソソームを、前記第1、第2、及び/または、第3の画分、ま
たは、複数の画分から単離する、前出代替手法のいずれか1つに記載の方法。
【0046】
42.前記エキソソームが、CD63、CD63-A、パーフォリン、Fas、TRA
IL、または、グランザイムB、または、これらのあらゆる組み合わせを含む、前出代替
手法のいずれか1つに記載の方法。
【0047】
43.前記エキソソームが、CD63Aを含む、代替手法42記載の方法。
【0048】
44.前記エキソソームが、シグナル伝達分子を含む、前出代替手法のいずれか1つに
記載の方法。
【0049】
45.前記エキソソームが、サイトカイン、mRNA、または、miRNAを含む、前
出代替手法のいずれか1つに記載の方法。
【0050】
46.アフィニティークロマトグラフィーによってエキソソームを単離することをさら
に含み、アフィニティークロマトグラフィーが、ウイルス抗原、ウイルスタンパク質、細
菌抗原、細菌タンパク質、真菌抗原、または、真菌タンパク質を含むエキソソームの除去
に関して選択的である、前出代替手法のいずれか1つに記載の方法。
【0051】
47.1つ以上のさらなるアフィニティークロマトグラフィーステップによってエキソ
ソームを単離することをさらに含み、前記1つ以上のさらなるアフィニティークロマトグ
ラフィーステップが、炎症マーカー、及び/または、腫瘍マーカーを含むエキソソームの
除去に関して選択的である、前出代替手法のいずれか1つに記載の方法。
【0052】
ヒト胎盤由来のエキソソームを含む組成物も提供しており、当該エキソソームは、CD
1c、CD20、CD24、CD25、CD29、CD2、CD3、CD8、CD9、C
D11c、CD14、CD19、CD31、CD40、CD41b、CD42a、CD4
4、CD45、CD49e、CD4、CD56、CD62P、CD63、CD69、CD
81、CD86、CD105、CD133-1、CD142、CD146、CD209、
CD326、HLA-ABC、HLA-DRDPDQ、MCSP、ROR1、SSEA-
4、または、それらの組み合わせに対して陽性である。
【0053】
本明細書に記載したエキソソームは、特定のマーカーを含む。そのようなマーカーとし
て、例えば、エキソソームの同定において、及び、それらをその他のエキソソーム、例え
ば、胎盤に由来しないエキソソームと区別する上で有用になり得る。特定の実施形態では
、そのようなエキソソームは、例えば、フローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化細胞
選別(FACS)によって決定することができる1つ以上のマーカーに対して陽性である
。加えて、本明細書で提供するエキソソームは、特定のマーカーの欠如に基づいて識別す
ることができる。そのようなマーカーの有無の決定は、当該技術分野で公知の方法、例え
ば、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて行うことができる。
【0054】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、CD1c、CD20、CD24、CD25
、CD29、CD2、CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD
31、CD40、CD41b、CD42a、CD44、CD45、CD49e、CD4、
CD56、CD62P、CD63、CD69、CD81、CD86、CD105、CD1
33-1、CD142、CD146、CD209、CD326、HLA-ABC、HLA
-DRDPDQ、MCSP、ROR1、及び、SSEA-4に対して陽性である。一部の
実施形態では、当該エキソソームは、CD1c、CD20、CD24、CD25、CD2
9、CD2、CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD31、C
D40、CD41b、CD42a、CD44、CD45、CD49e、CD4、CD56
、CD62P、CD63、CD69、CD81、CD86、CD105、CD133-1
、CD142、CD146、CD209、CD326、HLA-ABC、HLA-DRD
PDQ、MCSP、ROR1、及び、SSEA-4からなる群から選択する2、3、4、
5、6、7、8、9、10個、または、それ以上のマーカーに対して陽性である。
【0055】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、CD3-、CD11b-、CD14-、C
D19-、CD33-、CD192-、HLA-A-、HLA-B-、HLA-C-、H
LA-DR-、CD11c-、または、CD34-である。一部の実施形態では、当該エ
キソソームは、CD3-、CD11b-、CD14-、CD19-、CD33-、CD1
92-、HLA-A-、HLA-B-、HLA-C-、HLA-DR-、CD11c-、
及び、CD34-である。
【0056】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、非コードRNA分子を含む。一部の実施形
態では、当該RNA分子は、ミクロRNAである。一部の実施形態では、当該ミクロRN
Aを、表7のミクロRNA、及び、それらの組み合わせからなる群から選択する。一部の
実施形態では、当該ミクロRNAを、hsa-mir-26b、hsa-miR-26b
-5p、hsa-mir-26a-2、hsa-mir-26a-1、hsa-miR-
26a-5p、hsa-mir-30d、hsa-miR-30d-5p、hsa-mi
r-100、hsa-miR-100-5p、hsa-mir-21、hsa-miR-
21-5p、hsa-mir-22、hsa-miR-22-3p、hsa-mir-9
9b、hsa-miR-99b-5p、hsa-mir-181a-2、hsa-mir
-181a-1、hsa-miR-181a-5p、及び、それらの組み合わせからなる
群から選択する。
【0057】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、表3のサイトカイン、及び、それらの組み
合わせからなる群から選択するサイトカインを含む。
【0058】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、表4のサイトカイン受容体、及び、それら
の組み合わせからなる群から選択するサイトカイン受容体を含む。
【0059】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、表6のタンパク質、及び、それらの組み合
わせからなる群から選択するタンパク質を含む。一部の実施形態では、当該エキソソーム
は、細胞質アコニット酸ヒドラターゼ、細胞表面糖タンパク質MUC18、タンパク質ア
ルギニンN-メチルトランスフェラーゼ1、グアニンヌクレオチド結合タンパク質G(s
)サブユニットアルファ、カリン-5、カルシウム結合タンパク質39、グルコシダーゼ
2サブユニットベータ、塩化物細胞内チャネルタンパク質5、セマフォリン-3B、60
Sリボソームタンパク質L22、スプライセオソームRNAヘリカーゼDDX39B、転
写活性化タンパク質Pur-アルファ、プログラム細胞死タンパク質10、BRO1ドメ
イン含有タンパク質BROX、キヌレニン-オキソグルタル酸トランスアミナーゼ3、ラ
ミニンサブユニットアルファ5、ATP結合カセットサブファミリーEメンバー1、シン
タキシン結合タンパク質3、プロテアソームサブユニットベータタイプ7、及び、これら
の組み合わせからなる群から選択したタンパク質を含む。
【0060】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、間葉系幹細胞、臍帯血、または、胎盤かん
流液に由来するエキソソームよりも少なくとも2倍高いレベルで、少なくとも1つのマー
カー分子を含む。一部の実施形態では、当該エキソソームは、間葉系幹細胞、臍帯血、及
び、胎盤かん流液に由来するエキソソームよりも少なくとも2倍高いレベルで、少なくと
も1つのマーカー分子を含む。
【0061】
一部の実施形態では、当該エキソソームを、全胎盤培養物の培地から単離する。一部の
実施形態では、当該エキソソームを、胎盤葉、または、胎盤を含む培地全体から単離する
。
【0062】
一部の実施形態では、当該エキソソームを、本発明の方法で生成する。一部の実施形態
では、当該組成物は、静脈内投与に適した形態である。一部の実施形態では、当該組成物
は、局所注射に適した形態である。一部の実施形態では、当該組成物は、局所投与に適し
た形態である。一部の実施形態では、当該組成物は、超音波送達に適した形態である。
【0063】
免疫細胞の増殖を増加させる方法であって、当該細胞を、請求項48~65のいずれか
1項に記載の組成物と接触させることを含む方法も提供する。一部の実施形態では、当該
免疫細胞は、T細胞である。一部の実施形態では、当該免疫細胞は、NK細胞である。一
部の実施形態では、当該免疫細胞は、CD34+細胞である。
【0064】
当該細胞を、本発明の組成物と接触させることを含む、がん細胞の増殖を阻害する方法
も提供する。
【0065】
本発明の組成物を、対象に対して投与することを含む、当該対象における血管形成また
は血管新生の方法も提供する。
【0066】
本発明の組成物を、対象に対して投与することを含む、当該対象の免疫系を調節する方
法も提供する。
【0067】
本発明の組成物を、対象に対して投与することを含む、当該対象の罹患組織または損傷
組織を修復する方法も提供する。
【0068】
本発明の組成物を、対象に対して投与することを含む、当該対象のがんを処置する方法
も提供する。
【0069】
上記した方法の一部の実施形態では、当該対象は、ヒトである。
【0070】
本明細書では、エキソソームを含む組成物も提供する。そのような組成物は、一般的に
は、エキソソームが由来する胎盤細胞を含まない。さらに、そのような組成物は、一般的
に、エキソソームが由来する細胞培養物での細胞培養上清を含まない。
【0071】
特定の実施形態では、精製したエキソソームを、それを必要とする対象への投与に適し
た医薬組成物へと製剤する。特定の実施形態では、当該対象は、ヒトである。本明細書で
提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、それを必要とする対象に対して、局
所的、全身的皮下、非経口的、静脈内、筋肉内、局所的、経口的、皮内、経皮的、または
、鼻腔内投与するように製剤できる。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来
のエキソソーム含有医薬組成物は、局所投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細
書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、全身皮下投与用に製剤する。特
定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、非経
口投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム
含有医薬組成物は、筋肉内投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する
胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、局所投与用に製剤する。特定の実施形態では
、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、経口投与用に製剤する
。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、
皮内投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソー
ム含有医薬組成物は、経皮投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する
胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、鼻腔内投与用に製剤する。特定の実施形態で
は、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、静脈内投与用に製剤
する。
【0072】
別の態様では、本明細書に記載したエキソソーム、及び/または、エキソソームを含む
医薬組成物の使用を、本明細書で提供する。
【0073】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソーム、及び/または、エキソソーム
を含む医薬組成物を、それを必要とする対象の疾患、及び/または、病態を、処置、及び
/または、予防するために使用する。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソ
ーム、及び/または、エキソソームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象での血管
形成、及び/または、血管新生を促すために使用する。別の特定の実施形態では、本明細
書に記載したエキソソーム、及び/または、エキソソームを含む医薬組成物は、それを必
要とする対象での免疫活性を調節する(例えば、免疫応答を増大する、または、免疫応答
を抑制する)ために使用する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソー
ム、及び/または、エキソソームを含む医薬組成物は、それを必要とする対象での組織損
傷、例えば、急性または慢性損傷が引き起こす組織損傷を修復するために使用する。
【0074】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載した誘導エキソソーム、及び/または、エキ
ソソームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象の疾患、及び/または、病態を、処
置、及び/または、予防する方法に使用する。別の実施形態では、本明細書に記載したエ
キソソームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象の疾患、及び/または、病態を処
置する方法に使用する。別の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを含む医薬
組成物を、それを必要とする対象の疾患、及び/または、病態を予防する方法に使用する
。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを含む医薬組成物を、それを必
要とする対象での血管形成、及び/または、血管新生を促すための方法に使用する。別の
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを含む医薬組成物を、それを必要
とする対象において免疫活性を調節する(例えば、免疫応答を増大する、または、免疫応
答を抑制する)方法に使用する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソ
ームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象での組織損傷、例えば、急性または慢性
損傷が引き起こす組織損傷を修復する方法に使用する。
【0075】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソーム、及び/または、エキソソ
ームを含む医薬組成物を、細胞保護剤として使用する。別の態様では、本明細書に記載し
たエキソソーム、及び/または、エキソソームを含む医薬組成物を、医薬用途に適したキ
ットの形態で提供する。
【図面の簡単な説明】
【0076】
4.図面の簡単な説明
【
図1】エキソソーム単離のための細胞培養の概略図である。
【0077】
【
図2A】NanoSightでのサイズ分布について分析をしたpExo分離株を示す。この作業は、SBI Inc.(System Bioscience Inc.)が、受託サービスに従って、作業と報告にあたった(www.systembio.com/services/exosome-services/)。
【
図2B】NanoSightでのサイズ分布について分析をしたpExo分離株を示す。この作業は、SBI Inc.(System Bioscience Inc.)が、受託サービスに従って、作業と報告にあたった(www.systembio.com/services/exosome-services/)。
【
図2C】NanoSightでのサイズ分布について分析をしたpExo分離株を示す。この作業は、SBI Inc.(System Bioscience Inc.)が、受託サービスに従って、作業と報告にあたった(www.systembio.com/services/exosome-services/)。
【0078】
【
図3A】MACSPlexキットを使用して、pExo(N=12)に存在するタンパク質マーカーを示す。
【
図3B】MACSPlexキットを使用して、胎盤かん流液エキソソームに存在するタンパク質マーカーを示す。
【
図3C】MACSPlexキットを使用して、臍帯血由来エキソソームに存在するタンパク質マーカーを示す。
【0079】
【
図4】胎盤のエキソソーム集団で同定したタンパク質の機能経路を示す。
【0080】
【
図5】3つの胎盤エキソソーム試料で同定した共通するユニークなタンパク質を示す。
【0081】
【
図6】pExoが、トランスウェルシステムにおいてヒト皮膚線維芽細胞の移動を促すことを示す。
【0082】
【
図7】pExoが、ヒト臍帯血管内皮細胞の移動を促すことを示す。
【0083】
【
図8】pExoが、HUVECの増殖を刺激することを示す。
【0084】
【
図9】pExoが、ヒトCD34+細胞の増殖を刺激することを示す。
【0085】
【
図10】pExoが、ヒトCD34+細胞のコロニー形成を刺激することを示す。
【0086】
【
図11】pExoが、SKOV3がん細胞の増殖を阻害することを示す。
【0087】
【
図12】pExoが、A549がん細胞の増殖を阻害することを示す。
【0088】
【
図13】pExoが、MDA321がん細胞の増殖を阻害することを示す。
【0089】
【
図14】pExoが、培養中のCD3+T細胞の増殖に影響を及ぼさないことを示す。
【0090】
【
図15】pExoが、UBC T CD3+細胞において、活性化マーカーCD69の発現を大きくすることを示す。
【0091】
【
図16】pExoが、成人PBMC T CD3+細胞において、活性化マーカーCD69の発現を大きくすることを示す。
【0092】
【
図17】pExoが、PBMCにおいて、CD56+ NK細胞を増やすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0093】
5.詳細な説明
5.1.胎盤由来のエキソソーム
本明細書に記載した胎盤由来のエキソソームは、後述するように、それらの形態、及び
/または、分子マーカーで選択、及び、同定することができる。本明細書に記載した胎盤
由来のエキソソームは、当該技術分野で公知のエキソソーム、例えば、絨毛膜絨毛間葉系
幹細胞由来のエキソソーム、例えば、Salomon et al.,2013、PLO
S ONE、8:7、e68451に記載されたものなど、とは異なる。したがって、本
明細書で使用する用語「胎盤由来のエキソソーム」は、絨毛膜絨毛間葉系幹細胞から得た
、または、それに由来したエキソソームを含むことを意味しない。
【0094】
特定の実施形態では、本明細書に記載した胎盤由来エキソソームの集団は、細胞、例え
ば、有核細胞、例えば、胎盤細胞を含まない。
【0095】
5.1.1.胎盤由来のエキソソームマーカー
本明細書に記載した胎盤由来のエキソソームは、当該エキソソームを、同定、及び/ま
たは、単離するために使用することができるマーカーを含む。これらのマーカーは、例え
ば、タンパク質、核酸、糖分子、グリコシル化タンパク質、脂質分子とし得るものであり
、そして、モノマー、オリゴマー、及び/または、マルチマーの形態で存在し得る。特定
の実施形態では、これらのマーカーは、エキソソームが由来する細胞が生産する。特定の
実施形態では、当該マーカーは、エキソソームの由来となる細胞が提供するが、当該マー
カーは、前記細胞が、高レベルで発現することはない。特定の実施形態では、本明細書に
記載したエキソソームのマーカーは、対照マーカー分子と比較した場合に、起源の細胞と
比較して、エキソソームの方がより多い。別の特定の実施形態では、本明細書に記載した
エキソソームのマーカーは、別の細胞型から得たエキソソームと比較して、当該エキソソ
ームの方で豊富にあり(例えば、Salomon et al.,2013、PLOS
ONE、8:7、e6845lに記載の絨毛膜絨毛間葉系幹細胞、及び、前脂肪細胞間葉
系幹細胞)、これらのエキソソームは、同一の方法で単離する。
【0096】
エキソソームの三次元構造は、エキソソームの表面、及び/または、エキソソーム内に
含まれるマーカーの保持を可能にする。同様に、マーカー分子は、一部をエキソソーム内
に、一部をエキソソームの外表面に、及び/または、当該エキソソームのリン脂質二重層
の前後に存在し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームに関連する
マーカーは、タンパク質である。特定の実施形態では、これらのマーカーは、エキソソー
ムリン脂質二重層内に固定した膜貫通タンパク質、または、タンパク質分子の一部が、エ
キソソーム内にある一方で、同じ分子の一部が、当該エキソソームの外表面に露出するよ
うに、エキソソームリン脂質二重層の前後に固定した膜貫通タンパク質である。特定の実
施形態では、これらのマーカーは、当該エキソソーム内に完全に含まれる。別の特定の実
施形態では、本明細書に記載したエキソソームに関連するマーカーは、核酸である。特定
の実施形態では、当該核酸は、非コードRNA分子、例えば、ミクロRNA(miRNA
)である。
【0097】
5.1.1.1.表面マーカー
本明細書に記載したエキソソームは、それらの同定を可能にし、かつ、それらの起源の
細胞、ならびに、その他の細胞物質、及び、非細胞物質を含まない細胞エキソソームの実
質的に純粋な集団を単離/得るために使用できる表面マーカーを含む。エキソソーム表面
マーカー組成を決定する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、エキソソーム表面
マーカーは、蛍光活性化細胞選別(FACS)、または、ウエスタンブロッティングで検
出することができる。
【0098】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームは、例えば、FACSで決定す
ることができるなど、当該技術分野で公知のエキソソームよりも多量の表面マーカーを含
む。
【0099】
5.1.1.2.収率
本明細書に記載したエキソソームは、本明細書に記載した方法に従って単離し得るもの
であり、そして、それらの収率を定量し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載した
エキソソームを、約0.5~5.0mg/リットルの培養培地(例えば、血清を含む、ま
たは、含まない培養培地)の濃度で単離する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載
したエキソソームを、約2~3mg/リットルの培養培地(例えば、血清を含む培養培地
)の濃度で単離する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームは、約
0.5~1.5mg/リットルの培養培地(例えば、血清を含まない培養培地)の濃度で
単離する。
【0100】
5.1.2.貯蔵及び保存
本明細書に記載したエキソソームは、保存することができ、すなわち、長期保存を可能
にする条件下、または、エキソソームの分解を阻害する条件下に置くことができる。
【0101】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームは、適切な温度で、緩衝剤を含
む組成物において、上記した方法に従って回収をした後に保存することができる。特定の
実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを、例えば、約-20℃、または、約-
80℃で凍結保存する。
【0102】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームは、例えば、アンプルなどの小
さな容器(例えば、2mLのバイアル)で凍結保存することができる。特定の実施形態で
は、本明細書に記載したエキソソームを、約0.1mg/mL~約10mg/mLの濃度
で凍結保存する。
【0103】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを、約-80℃~約-180℃
の温度で凍結保存する。凍結保存したエキソソームは、使用のために解凍する前に、液体
窒素に移すことができる。一部の実施形態では、例えば、一旦、アンプルが約-90℃に
まで達すると、それらを、液体窒素貯蔵領域に移す。凍結保存は、速度制御した冷凍庫を
使用して解凍することもできる。凍結保存したエキソソームは、使用前に、約25℃から
約40℃の温度で解凍することができる。
【0104】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを、短期間(例えば、2週間未
満)、約4℃~約20℃の温度で保存する。
【0105】
5.2.組成物
本明細書では、本明細書で提供するエキソソームを含む組成物、例えば、医薬組成物を
さらに提供する。本明細書に記載した組成物は、エキソソームを用いた処置が有益である
対象(例えば、ヒト対象)における特定の疾患、及び、障害の処置において有用である。
【0106】
特定の実施形態では、本明細書で提供したエキソソームを含むことに加えて、本明細書
に記載した組成物(例えば、医薬組成物)は、医薬として許容可能な担体を含む。本明細
書で使用する用語「医薬として許容可能な」は、連邦政府または州政府の規制機関から承
認を受けたものであること、または、動物、特に、ヒトでの使用のために米国薬局方、あ
るいは、一般的に認められているその他の薬局方に収載されていることを意味する。医薬
として許容可能な担体に関連して本明細書で使用する用語「担体」とは、医薬組成物と共
に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または、ビヒクルのことを指す。とりわけ
、生理食塩水、及び、デキストロース水溶液とグリセロール溶液も、注射可能な溶液用の
液体担体として使用することができる。適切な賦形剤として、デンプン、グルコース、ラ
クトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米穀、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステア
リン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキ
ムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。適切な
医薬担体の例は、「Remington’s Pharmaceutical Scie
nces」JP Remington and AR Gennaro、1990、第1
8版に記載されている。
【0107】
特定の実施形態では、本明細書に記載した組成物は、1つ以上の緩衝剤、例えば、生理
食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、ダルベッコのPBS(DPBS)、及び/ま
たは、スクロースリン酸グルタミン酸緩衝剤をさらに含む。その他の実施形態では、本明
細書に記載した組成物は、緩衝剤を含まない。特定の実施形態では、本明細書に記載した
組成物は、血漿溶解物をさらに含む。
【0108】
特定の実施形態では、本明細書に記載した組成物は、1つ以上の塩、例えば、塩化ナト
リウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、及び、アルミニ
ウム塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン(硫酸カリウム
アルミニウム)、または、そのようなアルミニウム塩の混合物)をさらに含む。その他の
実施形態では、本明細書に記載した組成物は、塩を含まない。
【0109】
本明細書に記載した組成物を、投与説明書と共に、容器、パック、または、ディスペン
サーに入れておくことができる。
【0110】
本明細書に記載した組成物は、使用前に保存することができ、例えば、これらの組成物
は、冷凍保存(例えば、約-20℃または約-80℃で);冷蔵状態で保存(例えば、約
4℃);または、室温で保存することができる。
【0111】
5.2.1.製剤、及び、投与経路
疾患または病態の処置、及び/または、予防における治療的使用に有効である、本明細
書に記載したエキソソームまたは組成物の量は、疾患の性質によって変化し、また、標準
的な臨床技術によって決定することができる。対象に投与するエキソソーム、または、そ
の組成物の正確な投与量も、投与経路、及び、処置する疾患または病態の重症度によって
変化し、また、開業医の判断と、それぞれの対象の状況に応じて決定すべきである。例え
ば、有効な投与量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態(年齢、体重、及び、健
康状態など)、患者が人間であるか動物であるか、投与するその他の薬剤、及び、処置が
予防的であるか否かによって、変化し得る。安全性と有効性を最適化するために、最適な
治療用量に調整する。
【0112】
本明細書に記載したエキソソーム、または、その組成物の投与は、当該技術分野で公知
の様々な経路を介して行うことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキ
ソソーム、または、その組成物は、局部、全身、皮下、非経口、静脈内、筋肉内、局所、
経口、皮内、経皮、または、鼻腔内投与で投与する。特定の実施形態では、当該投与は、
静脈内注射による。特定の実施形態では、当該投与は、皮下注射を介する。特定の実施形
態では、当該投与は、局所的である。別の特定の実施形態では、当該エキソソーム、また
は、その組成物は、細胞外マトリックスを含む製剤で投与する。別の特定の実施形態では
、当該エキソソーム、または、その組成物は、1つ以上のさらなる送達デバイス、例えば
、ステントと組み合わせて投与する。別の特定の実施形態では、当該エキソソーム、また
は、その組成物は、(例えば、虚血性疾患の処置での)低酸素組織または流入領域リンパ
節など、当該エキソソーム、または、組成物で処置をする部位で、または、その周辺に対
して局部的に投与する。
【0113】
5.3.使用の方法
5.3.1.血管形成が有効な疾患の処置
本明細書に記載したエキソソーム、及び、その組成物は、血管形成を促すものであり、
したがって、血管形成が有効な疾患及び障害を処置するために使用することができる。し
たがって、本明細書に記載したエキソソーム、または、その組成物を使用して、それを必
要とする対象における血管形成を促す方法を、本明細書で提供する。本明細書で使用する
用語「処置する」は、対象における疾患、障害、または、病態、または、それらのあらゆ
るパラメータ、または、症状の治癒、緩和、改善、重症度の軽減、または、経時的抑制を
含む。特定の実施形態では、本明細書で提供する方法に従って処置する対象は、哺乳動物
、例えば、ヒトである。
【0114】
ある実施形態では、対象での血管形成または血管新生を誘導する方法を本明細書で提供
しており、当該方法は、本明細書で提供するエキソソーム、または、その組成物を、対象
に対して投与することを含む。したがって、本明細書で提供する方法を使用して、血管形
成/血管新生の拡大が有効な対象の疾患及び障害を処置することができる。血管形成が有
効で、それにより、本明細書に記載したエキソソーム、及び、組成物で処置することがで
きる疾患/病態の例として、心筋梗塞、鬱血性心不全、末梢動脈疾患、重症下肢虚血、末
梢血管疾患、左形成不全心臓症候群、糖尿病性足潰瘍、静脈潰瘍、または、動脈潰瘍があ
るが、これらに限定されない。
【0115】
ある実施形態では、例えば、末梢血管系にて血流が撹乱している対象を処置する方法を
、本明細書で提供しており、当該方法は、本明細書で提供するエキソソーム、または、そ
の組成物を、当該対象に対して投与することを含む。特定の実施形態では、本明細書で提
供する方法は、虚血を有する対象を、本明細書で提供するエキソソーム、または、その組
成物で処置することを含む。特定の実施形態では、当該虚血は、末梢動脈疾患(PAD)
、例えば、重大な四肢虚血(CLI)である。特定のその他の実施形態では、当該虚血は
、末梢血管疾患(PVD)、末梢動脈疾患、虚血性血管疾患、虚血性心疾患、または、虚
血性腎疾患である。
【0116】
5.3.2.患者集団
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームは、本明細書に記載した疾患ま
たは病態のいずれかを治療する必要がある対象に対して投与する。別の実施形態では、本
明細書に記載した組成物は、本明細書に記載した疾患または病態のいずれかを治療する必
要がある対象に対して投与する。特定の実施形態では、当該対象は、ヒトである。
【0117】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソーム、または、組成物は、血管形成
、及び/または、血管新生を増やす治療を必要とする対象(例えば、ヒト)に対して投与
する。
【0118】
5.4.キット
本明細書に記載した医薬組成物、すなわち、本明細書に記載したエキソソームを含む組
成物の1つ以上の成分で満たした1つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを、本明
細書で提供する。医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または、販売を規制する政府
機関が規定した形式の通知を、任意に、それら容器(複数可)に明記することができ、こ
のものは、ヒトへの投与のための製造、使用、または、販売の規制機関の承認を示す。
【0119】
本明細書に記載したキットは、上記した方法で使用することができる。本明細書に記載
した組成物は、個人に対して容易に投与できる形態で調製することができる。例えば、当
該組成物は、医療用途に適した容器に入れることができる。このような容器として、例え
ば、滅菌プラスチックバッグ、フラスコ、ジャー、または、これらの組成物を容易に分配
できるその他の容器とすることができる。例えば、当該容器は、レシピエントに対する液
体の静脈内投与に適した、血液バッグ、または、その他のプラスチック製の医学的に許容
されるバッグとすることができる。
【0120】
例示的な胎盤培養物
胎盤は、造血幹細胞(HSC)、及び、非造血幹細胞などの幹細胞を含む細胞の貯蔵庫
である。本明細書では、バイオリアクターで培養をする胎盤、または、その一部からエキ
ソソームを単離する方法を記載している。培養を行っている間に、細胞からエキソソーム
は分泌され、そして、培地にエキソソームは分泌され、これにより、エキソソームのさら
なる処理と分離が容易になる。エキソソームは、培養の異なる段階で、胎盤、または、そ
の一部から分離することもできる(例えば、異なる時点で、かつ、それぞれの回復ステッ
プで、異なるかん流液を使用し得る)。これらのエキソソームを、一旦、培地に取り込む
と、例えば、遠心分離、(例えば、小さなRabファミリーGTPase、アネキシン、
フロチリン、Alix、Tsg101、ESCRT複合体、CD9、CD37、CD53
、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90、上皮細胞接
着分子(EpCam)、パーフォリン、TRAIL、グランザイムB、Fasに特異的な
基質に結合した結合剤などの固定化結合剤;Fasリガンド、CD24、EpCAM、E
DIL3、フィブロネクチン、Survivin、PCA3、TMPRSS2:ERG、
Glypican-1、TGF-β1、MAGE 3/6、EGFR、EGFRvIII
、CD9、CD147、CA-125、EpCam、及び/または、CD24などの1つ
以上のがんマーカー;または、α-シヌクレイン、HIV、または、HCVタンパク質、
タウ、ベータ-アミロイド、TGF-ベータ、TNF-アルファ、フェチュイン-A、及
び/または、CD133など、これらに限定されない、ウイルス、真菌、または、細菌タ
ンパク質、または、ペプチドなどの1つ以上の炎症マーカーまたは病原マーカーを利用す
る)市販のエキソソーム単離キット、レクチンアフィニティー、及び/または、アフィニ
ティークロマトグラフィーを使用してさらに単離することができる。単離したエキソソー
ムは、治療、診断、及び、バイオテクノロジーツールとして使用することができる。
【0121】
本明細書に記載した「エキソソーム」は、精嚢液、血液、尿、血清、及び、母乳など、
数多くの、そして、おそらくはすべての真核生物の体液に存在する小胞である。それらは
、細胞外小胞とも称し得る。エキソソームは、細胞間連絡における重要な機能を果たす生
体細胞から分泌される二脂質膜小胞である。エキソソームは、幹細胞、上皮細胞などの細
胞が生成し、かつ、マトリックス結合ナノ小胞(MBV)として定義されるエキソソーム
のサブタイプが、細胞外マトリックス(ECM)生体足場(非体液)に存在すると報告さ
れている。報告のあったエキソソームの直径は、30~100nmであり、低密度リポタ
ンパク質(LDL)よりも大きいが、例えば、赤血球よりもはるかに小さい。多胞体が原
形質膜と融合するときに細胞からエキソソームを放出することができ、または、当該原形
質膜から直接にエキソソームを放出することができる。
【0122】
エキソソームは、特殊な機能を持ち合わせており、また、凝固、細胞間シグナル伝達、
廃棄物管理などのプロセスで重要な役割を果たすことが示されている。胎盤から分泌され
る細胞外小胞、及び、エキソソームは、胎盤と母体組織との間の連絡に寄与して、母体胎
児耐性を維持することが知られている。ヒト胎盤外植片から単離したエキソソームは、免
疫調節活性を有することが示されている。幹細胞由来のエキソソームは、アストロサイト
とミクログリアの活性化を抑制して神経炎症を軽減し、そして、おそらくは、TBIの後
の神経組織修復と機能回復の双方に寄与する神経原性ニッチを標的とすることで神経形成
を促すことも示されている。(Yang et al.2017、Frontiers
in Cellular Neuroscienceを確認されたい)。ヒト胚性間葉系
幹細胞に由来するエキソソームも、骨軟骨再生を促す(Zhang et al.201
6、Osteoarthritis and Cartilage)。機能性Fasリガ
ンドとTrail分子とを保有するヒト胎盤が分泌したエキソソームは、活性化した免疫
細胞にアポトーシスを伝達することが示されており、このことは、胎児のエキソソームを
介した胎児の免疫特権を示唆している。(Ann-Christin Stenqvis
t et al.,Journal of Immunology、2013、191:
doi:10.4049)。
【0123】
エキソソームは、脂質、サイトカイン、ミクロRNA、mRNA、及び、DNAなどの
活性生物製剤を含む。それらは、遺伝物質、及び/または、タンパク質転移を介した細胞
間連絡の伝達物質としても機能し得る。エキソソームは、細胞の機能的または生理学的状
態を反映し得る細胞タイプに特異的な情報も含み得る。その結果、エキソソームの臨床的
、及び、生物学的用途の開発に対する関心が高まっている。
【0124】
したがって、本明細書に記載した手法を使用して、任意に、(例えば、当該エキソソー
ムに関する1つ以上のタンパク質、または、マーカーの有無を同定することで)特徴決定
した当該エキソソームを含むヒト胎盤、または、その一部から単離したエキソソームを使
用して、免疫調節、抗線維化環境、及び/または、再生促進効果を刺激することができる
。したがって、本明細書に記載した手法を使用してヒト胎盤、または、その一部から単離
したエキソソームを、(例えば、当該エキソソームに関するマーカーの有無に従って)選
択し、精製し、凍結し、凍結乾燥し、梱包し、治療用品、及び/または、バイオテクノロ
ジーのツールとして流通し得る。
【0125】
一部の代替手法では、腫瘍マーカーまたはペプチド、病原マーカーまたはペプチド、例
えば、ウイルス、真菌、または、細菌のマーカー、または、ペプチド、及び/または、炎
症ペプチドなどの炎症マーカーを有するエキソソームを同定して、そのようなエキソソー
ムを、エキソソームの集団から効果的に除去(例えば、そのような腫瘍マーカーまたはペ
プチド、病原マーカーまたはペプチド、及び/または、炎症マーカーまたはペプチドに特
異的な抗体、または、その結合部分などの結合分子を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーで除去)し得る。したがって、一部の代替手法では、例えば、エキソソームの第1
の集団を、本明細書に記載した方法によって、ヒト胎盤、または、その一部から単離し、
そして、エキソソームの第1の集団を単離すると、このエキソソームの集団を、固定化抗
体、または、その結合部分を有する基質(例えば、当該固定化抗体、または、その結合部
分を有する膜、樹脂、ビーズ、または、容器)を使用して、さらに処理をしてエキソソー
ムの1つ以上の亜集団を除去し、当該固定化抗体、または、その結合部分は、エキソソー
ムの亜集団に存在するマーカーまたはペプチドに対して特異的であり、それらを、1つ以
上の腫瘍マーカーまたはペプチド、病原マーカーまたはペプチド、例えば、ウイルス、真
菌、または、細菌マーカー、または、ペプチド、及び/または、炎症マーカーなどまたは
炎症ペプチドなどのさらなる単離のために選択する。一部の代替手法では、本明細書に記
載した方法によって、ヒト胎盤、または、その一部から単離したエキソソームの第1の集
団を、固定化抗体、または、その結合部分を有する基質(例えば、当該固定化抗体、また
は、その結合部分を有する膜、樹脂、ビーズ、または、容器)と接触させ、当該固定化抗
体、または、その結合部分は、Fasリガンド、CD24、EpCAM、EDIL3、フ
ィブロネクチン、Survivin、PCA3、TMPRSS2:ERG、Glypic
an-1、TGF-β1、MAGE 3/6、EGFR、EGFRvIII、CD9、C
D147、CA-125、EpCam、及び/または、CD24などの1つ以上のがんマ
ーカーに対して特異的であり、これにより、当該固定化抗体、または、その結合部分に対
する親和性に基づいて、エキソソームの第1の集団から第2のエキソソームの集団を単離
する。一部の代替手法では、本明細書に記載した方法によって、ヒト胎盤、または、その
一部から単離したエキソソームの第1の集団を、固定化抗体、または、その結合部分を有
する基質(例えば、当該固定化抗体、または、その結合部分を有する膜、樹脂、ビーズ、
または、容器)と接触させ、当該固定化抗体、または、その結合部分は、α-シヌクレイ
ン、HIV、または、HCVタンパク質、タウ、ベータ-アミロイド、TGF-ベータ、
TNF-アルファ、フェチュイン-A、及び/または、CD133、または、これらの一
部など、これらに限定されない、ウイルス、真菌、または、細菌タンパク質、または、ペ
プチドなどの1つ以上の炎症マーカーまたは病原マーカーに対して特異的であり、これに
より、当該固定化抗体、または、その結合部分に対する親和性に基づいてエキソソームの
第1の集団から第2のエキソソームの集団を単離する。
【0126】
一部の代替手法では、本明細書に記載した手法で単離、及び/または、選択したエキソ
ソームの集団は、インビトロ及びインビボの双方で抗腫瘍活性を媒介することが示されて
いるパーフォリン、及び/または、グランザイムB(J Cancer 2016;7(
9):1081-1087)、または、標的がん細胞に対して細胞傷害活性を発揮するエ
キソソームで知見されたFas(Theranostics 2017;7(10):2
732-2745)など、治療に有用なマーカーまたはペプチドを有する。したがって、
一部の代替手法では、本明細書に記載した方法によって、ヒト胎盤、または、その一部か
ら単離したエキソソームの第1の集団を、固定化抗体、または、その結合部分を有する基
質(例えば、当該固定化抗体、または、その結合部分を有する膜、樹脂、ビーズ、または
、容器)と接触させ、当該固定化抗体、または、その結合部分は、パーフォリン、TRA
IL、及び/または、グランザイムB、及び/または、Fasに対して特異的であり、か
つ、エキソソームの第1の集団に由来するエキソソームの第2の集団は、パーフォリン、
TRAIL、及び/または、グランザイムB、及び/または、Fasに対する当該固定化
抗体、または、その結合部分の親和性に基づいて単離する。一部の代替手法では、CD6
3 RNA、及び/または、所望のミクロRNAを含むエキソソームの集団を単離する。
一部の代替手法では、エキソソームの集団を、アフィニティークロマトグラフィー、また
は、免疫学的技術を使用して、単離し、及び/または、特徴決定を行い、エキソソームの
当該集団は、小さなRabファミリーGTPase、アネキシン、フロチリン、Alix
、Tsg101、ESCRT複合体、CD9、CD37、CD53、CD63、CD63
A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90)、及び/または、上皮細胞接着分
子(EpCam)などのマーカー、または、ペプチドを含む。先に詳述したように、一部
の代替手法では、本明細書に記載した方法で、ヒト胎盤、または、その一部から単離した
エキソソームの第1の集団を、固定化抗体、または、その結合部分を有する基質(例えば
、当該固定化抗体、または、その結合部分を有する膜、樹脂、ビーズ、または、容器)と
接触させ、当該固定化抗体、または、その結合部分は、小さなRabファミリーGTPa
se、アネキシン、フロチリン、Alix、Tsg101、ESCRT複合体、CD9、
CD37、CD53、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hs
p90)、及び/または、上皮細胞接着分子(EpCam)に対して特異的であり、かつ
、エキソソームの第1の集団に由来するエキソソームの第2の集団は、小さなRabファ
ミリーGTPase、アネキシン、フロチリン、Alix、Tsg101、ESCRT複
合体、CD9、CD37、CD53、CD63、CD63A、CD81、CD82)、H
sp70、Hsp90)、及び/または、上皮細胞接着分子(EpCam)に対する当該
固定化抗体、または、その結合部分の親和性に基づいて単離する。その他の代替手法では
、本明細書に記載した方法によって、ヒト胎盤、または、その一部から単離したエキソソ
ームの集団を、小さなRabファミリーGTPase、アネキシン、フロチリン、Ali
x、Tsg101、ESCRT複合体、CD9、CD37、CD53、CD63、CD6
3A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90、及び/または、上皮細胞接着分
子(EpCam)の1つ以上に対して特異的な抗体、または、その結合部分と接触させ、
そして、当該抗体、または、その結合部分の結合を、当該抗体、または、その結合部分に
(例えば、ELISA、または、ブロッティング手順を利用して)結合し、それにより、
単離したエキソソーム集団での当該小さなRabファミリーGTPase、アネキシン、
フロチリン、Alix、Tsg101、ESCRT複合体、CD9、CD37、CD53
、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90、及び/また
は、上皮細胞接着分子(EpCam)の存在を確認する検出可能な試薬を有する二次結合
剤で検出する。
【0127】
本明細書に記載した「単離」とは、エキソソームを、その他の物質から分離するための
方法である。エキソソームの分離は、遠心分離機での強度の強い遠心力、市販キット(例
えば、SeraMir Exosome RNA Purification kit(
SBI system biosciences)、Intact Exosome P
urification and RNA Isolation(Combinatio
nKit)Norgen BioTek Corp.)の利用、及び、上記したマーカー
、または、ペプチドなど(例えば、小さなRabファミリーGTPase、アネキシン、
フロチリン、Alix、Tsg101、ESCRT複合体、CD9、CD37、CD53
、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90、上皮細胞接
着分子(EpCam)、パーフォリン、TRAIL、グランザイムB、Fas;Fasリ
ガンド、CD24、EpCAM、EDIL3、フィブロネクチン、Survivin、P
CA3、TMPRSS2:ERG、Glypican-1、TGF-β1、MAGE 3
/6、EGFR、EGFRvIII、CD9、CD147、CA-125、EpCam、
及び/または、CD24などの1つ以上のがんマーカー、または、α-シヌクレイン、H
IV、または、HCVタンパク質、タウ、ベータ-アミロイド、TGF-ベータ、TNF
-アルファ、フェチュイン-A、及び/または、CD133など、これらに限定されない
、ウイルス、真菌、または、細菌タンパク質、または、ペプチドなどの1つ以上の炎症マ
ーカーまたは病原マーカーに対して特異的な結合剤)、エキソソームに関するマーカーま
たはペプチドに対して特異的な結合剤(例えば、抗体、または、その結合部分)を用いた
レクチンアフィニティーまたはアフィニティークロマトグラフィーを使用して実行し得る
。
【0128】
本明細書に記載した「胎盤」は、妊娠中の真獣類哺乳動物の子宮内の臓器であり、臍帯
を通して胎児に栄養を与え、そして、維持をする。本明細書に記載したように、胎盤は、
エキソソームを得るためのバイオリアクターとして使用し得る。一部の代替手法では、脱
細胞化胎盤は、足場、及び、バイオリアクターとして使用し得るものであり、それは、外
因性細胞集団(例えば、脱細胞化胎盤に播種し、そして、培養をした細胞集団)を保有し
ており、細胞特異的な当該細胞からエキソソームの集団を得る。したがって、一部の代替
手法では、脱細胞化胎盤に、再生細胞集団(例えば、幹細胞、及び/または、内皮細胞、
及び/または、前駆細胞を含む細胞の集団)を播種し、そして、当該再生細胞集団を、バ
イオリアクターにて、当該脱細胞化胎盤で培養し、そして、細胞特異的エキソソームを、
遠心分離、市販のエキソソーム単離キット、レクチンアフィニティー、及び/または、上
記したマーカー、または、ペプチドなど(例えば、小さなRabファミリーGTPase
、アネキシン、フロチリン、Alix、Tsg101、ESCRT複合体、CD9、CD
37、CD53、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp9
0、上皮細胞接着分子(EpCam)、パーフォリン、TRAIL、グランザイムB、F
as;Fasリガンド、CD24、EpCAM、EDIL3、フィブロネクチン、Sur
vivin、PCA3、TMPRSS2:ERG、Glypican-1、TGF-β1
、MAGE 3/6、EGFR、EGFRvIII、CD9、CD147、CA-125
、EpCam、及び/または、CD24などの1つ以上のがんマーカー、または、α-シ
ヌクレイン、HIV、または、HCVタンパク質、タウ、ベータ-アミロイド、TGF-
ベータ、TNF-アルファ、フェチュイン-A、及び/または、CD133など、これら
に限定されない、ウイルス、真菌、または、細菌タンパク質、または、ペプチドなどの1
つ以上の炎症マーカーまたは病原マーカーに対して特異的な結合剤)を使用するアフィニ
ティークロマトグラフィーを使用して、当該培養細胞から単離する。
【0129】
本明細書に記載した「腹水」とは、腹部と腹部臓器(腹腔)を覆う膜との間の空間にあ
る過剰な体液のことである。腹水は、エキソソームの供給源となり得る。
【0130】
本明細書に記載した「血漿」とは、血液、及び、リンパ液の液体部分であり、血液の体
積の約半分を構成する。血漿には細胞がなく、血清とは異なり、凝固しない。血漿は、抗
体やその他のタンパク質を含む。血漿は、エキソソームの供給源となり得る。
【0131】
本明細書では、大量のエキソソームを生産するように細胞を培養するための幾つかの方
法を提供する。エキソソームを回収または単離するために使用する培地に、1つ以上の栄
養素、酵素、または、キレート剤を提供し得る。キレート剤は、培養細胞からのエキソソ
ームの放出を促すために使用し得る。幾つかの方法で使用するキレート剤として、ホスホ
ン酸塩、BAPTA四ナトリウム塩、BAPTA/AM、Di-Notrophen(商
標)試薬四ナトリウム塩、EGTA/AM、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラジン
、N、N、N’、N’-テトラキス-(2ピリジルメチル)エチレンジアミン、6-ブロ
モ-N’-(2-ヒドロキシベンジリデン)-2-メチルキノリン-4-カルボヒドラジ
ド、1,2-ビス(2-アミノフェノキシ)エタン-N、N、N’、N’-四酢酸テトラ
キス(アセトキシメチルエステル)、(エチレンジニトリロ)四酢酸、(EDTA)、エ
ダタミル、エチレンジニトリロ四酢酸、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエ
ーテル)-N、N、N’、N’-四酢酸、または、エチレングリコール-ビス(β-アミ
ノエチルエーテル)-N、N、N’、N’-四酢酸(EGTA)、または、これらのあら
ゆる組み合わせがあるが、これらに限定されない。当該キレート剤を、1mM、2mM、
3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30
mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、または、100
mMの濃度、または、前述した濃度のいずれか2つで定義した範囲内にある濃度で当該培
地に提供して、エキソソームを培養または単離するために使用し得る。本明細書で示した
ように、培地での1つ以上のキレート剤の存在は、バイオリアクターで培養した胎盤に由
来するエキソソームの回収を予想外に高めた。当該エキソソームを、培養、及び/または
、回収するために使用した培地は、プロテアーゼをも有し得るものであり、これは、エキ
ソソームの放出をさらに促し得る。一部の代替手法では、当該培地に提供するプロテアー
ゼは、トリプシン、コラゲナーゼ、キモトリプシン、または、カルボキシペプチダーゼで
ある。一部の代替手法では、当該プロテアーゼを、1mM、2mM、3mM、4mM、5
mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、5
0mM、60mM、70mM、80mM、90mM、または、100mMの濃度、または
、前述した濃度のいずれか2つで定義した範囲内にある濃度で当該培地に提供する。エキ
ソソームを、培養、及び/または、回収するために使用する培地に、1つ以上の糖をも加
え得る。一部の代替手法では、当該培地に添加する糖は、グルコースである。当該培地に
グルコースが存在すると、エキソソームの放出が促されると考えられる。一部の代替手法
では、当該グルコースを、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、
8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70
mM、80mM、90mM、または、100mMの濃度、または、前述した濃度のいずれ
か2つで定義した範囲内にある濃度で当該培地に提供する。また、当該培地は、成長因子
、サイトカイン、または、1つ以上の薬物、例えば、GM-CSF、血清、及び/または
、AHRアンタゴニストを含み得る。
【0132】
胎盤、または、その一部からエキソソームを回収する方法
胎盤からエキソソームを回収する例示的な方法を、
図1に示す。エキソソーム生成のた
めのバイオリアクターとして胎盤を使用するのであれば、臍帯血:PRP、胎盤かん流液
(PS)、胎盤組織培養物(PTS)、胎盤臓器培養物(PO)、または、胎盤、または
、その一部に存在し得る外因性細胞胎盤を、エキソソーム単離の供給源とし得る。ある手
法によって、胎盤、または、その一部を回収する(#200010323、2017年9
月25日に回収した)。胎盤を培地と接触させ、または、通常のPSC-100 回収方
法でかん流させて、PS-1(2017年9月26日)として回収した。胎盤、または、
その一部を、フード内で、少なくとも4時間インキュベートする。胎盤、または、その一
部を、培地(RPMI培地)と接触させ、または、500mLのRPMIベース培地(1
%抗生物質)でかん流させて、PS-2として回収した。次に、胎盤、または、その一部
を、フード内で、一晩インキュベートし、そして、カバーをかける。胎盤、または、その
一部を、750mLの生理食塩水と接触させ、または、かん流させて、そして、PS-3
として回収する。その後、これらの試料を、分析(Warren)のために実験室に発送
した。PS1、PS2、及び、PS3を、RBC溶解した後に、同日に、FACSで分析
した。
【0133】
分析に向けて、胎盤組織を、1×1×1cmの大きさに切り、100mLの溶液(すべ
て、1%P&Sを含む)が入ったT75フラスコ(それぞれに、胎盤の約1/8)に入れ
た。4つの溶液をアッセイした:A:DMEM培地;B:PBS;C:PBS+5mM
EDTA;D:PBS+0.025%トリプシン-EDTA。次に、これを、37℃のイ
ンキュベーターで、一晩(O/N)、インキュベートした。
【0134】
次に、上清を回収し、組織フィルターを通過させ、そして、400gで遠心して細胞(
ペレット)を回収した。次に、最初の遠心分離をした後の上清を、エキソソーム単離のた
めに遠心分離した(3000gスピンスープ>10,000スピンスープ:100,00
0gペレット)。
【0135】
回収した細胞を、FACS分析にも使用した。これらの細胞試料は、幾つかの緩衝剤に
入れてあった(A=PTS1;B=PTS2;C=PTS-3、D=PTS4)。エキソ
ソームを回収し、次いで、アッセイして、エキソソームマーカーの存在を同定し、この手
順で、エキソソームが取得でき、かつ、単離されたことを確認した。
【0136】
ELISAとタンパク質アッセイを使用した、胎盤バイオリアクターから単離したエキソ
ソームの集団の同定
胎盤バイオリアクターの上清の画分を、上記した方法で回収し、そして、これらの画分
を濾過した。その後、上清を、400g×10分の遠心分離にかけて、細胞を回収した。
最初の遠心分離の後に、2回目の遠心分離を、3000g×30分で行って、細胞破片を
ペレット化した。3回目の遠心分離を、10,000g×1時間で行って、微小胞をペレ
ット化した。次に、4回目の遠心分離を、100,000g×1.5時間で行って、エキ
ソソームをペレット化した。次に、ペレット化したエキソソームを含む遠沈管を逆さにし
て紙の上に置いて、残留液体を排出した。次に、当該エキソソームペレットを、適切な容
量(例えば、2.0mL)の滅菌PBSに溶解して、ペレットを溶解し、そして、当該エ
キソソームを含む溶液を、滅菌エッペンドルフチューブに等分し、次に、-20℃/-8
0℃の冷凍庫で凍結した。そして、エキソソームを、ELISA-63A、及び、タンパ
ク質定量キットを使用して、エキソソーム特異的マーカーCD63Aの存在についてアッ
セイした。
ここで示したように、PRP、胎盤かん流液、及び、胎盤組織は、CD63+であり、
かつ、超遠心によって効率的に単離できるエキソソームの集団を含む。当該エキソソーム
を単離するために、まず、培養上清を、組織フィルターで濾過し、そして、上記したよう
にして数度の遠心分離を行ってエキソソームを得て、それを、次に、凍結した。当該エキ
ソソームをELISA検出するために、抗CD63抗体を使用した。アッセイでは、試料
を、エキソソーム結合緩衝剤(60uL+60uL)で、1:1に希釈した。この手順に
よって、CD63+エキソソームを、効率的に単離した。
【0137】
エキソソームの特徴決定
エキソソームは、タンパク質、ペプチド、RNA、DNA、及び、サイトカインを含み
得る。miRNA配列決定、表面タンパク質分析(MACSPlex Exosome
Kit、Miltenyi)、プロテオミクス分析、機能研究(インビトロでの酵素アッ
セイ創傷治癒アッセイ(スクラッチアッセイ)、エキソソーム誘発細胞増殖(ヒトケラチ
ノサイト、または、線維芽細胞)(5つの公知の刺激物質との比較)、エキソソーム誘発
コラーゲン生産(ヒトケラチノサイト、または、線維芽細胞):TGFbと比較して、血
清及び非血清対照、プロコラーゲン1CペプチドのELISA、炎症性サイトカインのエ
キソソーム誘発阻害を含んでおり:応答細胞タイプは、ヒトケラチノサイト、または、ヒ
ト線維芽細胞、及び、凍結乾燥した加熱殺菌細菌、または、LPSとの比較を含む)など
の方法で実行し得る。
【0138】
一部の代替手法では、単離したエキソソームを、100-Kda Vivaspinフ
ィルター(Sartorius)で濃縮し、PBSで1回洗浄し、そして、約40μLを
回収した。エキソソームの当該濃縮集団を、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roch
e)を含む10uLの5×RIPA溶解緩衝剤と混合し、そして、ボルテックスした後に
、ウォーターソニケーター(Ultrasonic Cleaner、JSP)で、20
℃で、5分間、超音波処理した。超音波処理した後に、当該試験管を、断続的に混合しな
がら、20分間、氷上で、インキュベートした。次に、この混合物を、4℃で、10分間
、10,000gで遠心分離した。単離した澄明な溶解物を、新たな試験管に移した。タ
ンパク質量を、BCAキットで測定し、そして、ウエスタンブロッティングのために、レ
ーンあたり10ugのタンパク質を投入し、次に、目的のタンパク質の決定のために抗体
を使用した。
【0139】
別の代替手法では、細胞によるエキソソームの標識と取り込みを調べる(例えば、HE
K293T)。凍結溶出したエキソソームのアリコートを、1mLのPBSに再懸濁し、
そして、PKH26蛍光細胞リンカーキット(Sigma-Aldrich)を使用して
標識付けをした。2×PNK26-色素溶液(1mLの希釈液Cに4uLの色素)を調製
し、そして、1mLのエキソソーム溶液と混合して、最終色素濃度を2×10e-6Mに
した。直ちに、試料を5分間混合し、そして、1%BSAを添加して染色を停止して、P
KH26色素を捕捉した。標識したエキソソームを、100-Kda Vivaspin
フィルターに移し、次いで、4000gで回転させた後に、PBSで2回洗浄し、そして
、約50uLの試料を回収し、NTAを使用してエキソソーム濃度を分析した後に、-8
0℃で保存した。標識反応のネガティブ対照として、PBSを使用した。取り込みについ
て研究するために、HEK293T細胞を、通常の培地を使用して、8ウェルチャンバー
スライド(1×10e4/ウェル)に接種した。24時間後に、当該スライドを、PBS
で2回洗浄し、そして、DMEM-エキソ不含FBS(10%)で、24時間、インキュ
ベートした。これに続いて、2×10e9エキソソームに対応する、10%エキソ不含P
BS(200uL)で、それぞれに標識を付けたエキソソーム試料を含む新鮮なDMEM
培地を、それぞれのウェルに加え、そして、細胞培養インキュベーターで、1.5時間イ
ンキュベートした。インキュベートした後に、当該スライドを、PBS(500ul)で
2回洗浄し、そして、4%パラホルムアルデヒド溶液で、室温で、20分間、固定した。
これらのスライドを、PBS(500uL)で2回洗浄し、乾燥させ、そして、DAPI
を含むProLong Gold Antifade Reagentを使用して載置し
た。これらの細胞を、Axioskop顕微鏡(Zeiss)を使用して、視覚化した。
【0140】
培養した産後のヒト胎盤由来のエキソソームの高収率単離
ドナーの完全な同意の下、分娩後のヒト胎盤をかん流した。胎盤の残存血液を、大量の
滅菌生理食塩水で洗い流し、次いで、抗生物質を補充した無血清培養培地を含む5-Lバ
イオリアクターで培養し、そして、37℃インキュベーター(5%CO2)で培養し、次
いで、冷蔵条件で、最長で4日間かけて回転させた。培養培地の上清を、3000g、及
び、10,000gの連続遠心分離で処理して、組織、細胞、及び、微小胞をペレット化
した。エキソソームを、10,000g遠心分離で得た上清から、100,000g超遠
心分離によってペレット化し、そして、滅菌PBSで溶解した。エキソソームの収量を、
BCAタンパク質アッセイで定量した。
【0141】
胎盤臓器培養物から得た上清を、エキソソームを単離する方法に記載したようにして処
理をした。抗CD63A抗体を使用したELISAアッセイは、単離したエキソソームが
、エキソソームの特異的なタンパク質マーカーであるCD63Aタンパク質を含む、こと
を実証した。1リットルの培地で培養したある胎盤は、約40mgのエキソソーム、また
は、約1×1013のCD63A陽性エキソソーム粒子を、24時間で、生成したと推定
する。CD9、CD81、大きさ、及び、機能的活性の発現など、これらの胎盤臓器由来
のエキソソームのさらなる特徴決定を行う。
【0142】
別の一連の実験では、ドナーの完全な同意の下、分娩後のヒト胎盤をかん流して、ED
TAの濃度が異なる培地でエキソソームを単離する。抗生物質と、様々な濃度のEDTA
(例えば、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または、10
0mM、または、前述した濃度のいずれか2つで定義した範囲内にある濃度)のEDTA
を含む無血清培地を、一定速度の蠕動ポンプを介して、臍帯静脈を通じて胎盤にかん流さ
せ、そして、制御した条件下で、さらに24~48時間培養する。この培養の後に、ED
TAの使用量を含む750mLの生理学的培地を、制御速度でかん流させる。次いで、す
べてを上記した通りにして、エキソソームを、遠心分離と超遠心分離で連続的に単離し、
CD63A ELISAアッセイで確認し、そして、BCAタンパク質アッセイで定量す
る。エキソソームを回収するために使用した培地でのEDTAの濃度は、バイオリアクタ
ーで培養した胎盤から回収したエキソソームの量に影響を与える、ことを示す。
【0143】
さらなる代替手法
一部の代替手法では、胎盤、または、その一部からエキソソームを単離する方法を提供
する。この方法は、a)胎盤、または、その一部を、第1の培地と接触させること;b)
当該胎盤、または、その一部から、エキソソームを含む第1の画分を得ること;c)当該
胎盤、または、その一部を、第2の培地と接触させること;d)当該胎盤、または、その
一部から、エキソソームを含む第2の画分を得ること;e)当該胎盤、または、その一部
を、第3の培地と接触させること;f)当該胎盤、または、その一部から、エキソソーム
を含む第3の画分を得ること、及び、任意に、当該第1、第2、及び/または、第3の画
分からエキソソームを単離すること、を含む。一部の代替手法では、当該方法は、胎盤、
または、その一部を、さらなる培地と接触させること;及び、当該胎盤、または、その一
部から、エキソソームを含むさらなる画分を得る複数のステップをさらに含む。これらの
2つのステップは、複数回反復し得る。好ましくは、当該胎盤、または、その一部を、バ
イオリアクターで、培養及び/または維持する。一部の代替手法では、当該胎盤、または
、その一部は、羊膜を含む。一部の代替手法では、当該胎盤、または、その一部は、ヒト
の胎盤、または、その一部である。一部の代替手法では、当該第1、第2、及び/または
、第3の培地は、当該胎盤、または、その一部と、45分間、または、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、または、12時間、または、前出した時点のいずれか
2つで定義した範囲内にある長さの時間など、少なくとも45分間かけて接触させる。一
部の代替手法では、当該第1、第2、及び/または、第3の培地は、胎盤、または、その
一部と、少なくとも7、14、28、35、または、42日間、または、前出した時点の
いずれか2つで定義した範囲内にある長さの時間をかけて接触させる。一部の代替手法で
は、胎盤、または、その一部を、細分化、粉砕、または、コラゲナーゼ、及び/または、
プロテアーゼなどの酵素で処理する。
【0144】
一部の代替手法では、胎盤、または、その一部を、脱細胞化し、任意に、実質的に乾燥
した、実質的に平坦またはシート状の足場材料として提供する。当該脱細胞化胎盤、また
は、その一部を、足場として使用し、細胞培養または一次単離手順から得た均一な細胞集
団などの外因性細胞(例えば、幹細胞、内皮細胞、及び/または、前駆細胞などの再生細
胞)を有する。この方法は、脱細胞化胎盤、または、その一部に播種される細胞を含む継
代液または体液をさらに含む。細胞を一旦確立すると、上記した手順を使用して、それら
細胞から生成したエキソソームを回収し、そして、単離する。一部の代替手法では、脱細
胞化胎盤、または、その一部に播種される細胞を含む体液は、腹水、血液、または、血漿
である。一部の代替手法では、それらの細胞は、臓器に由来する。一部の代替手法では、
当該細胞は、肝臓、腎臓、肺、または、膵臓に由来する。一部の代替手法では、当該細胞
は、免疫細胞である。一部の代替手法では、当該細胞は、T細胞またはB細胞である。
【0145】
一部の代替手法では、当該第1の培地は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む。一
部の代替手法では、当該第2の培地は、成長因子を含む。一部の代替手法では、当該第3
の培地は、キレート剤を含む。一部の代替手法では、当該キレート剤は、EDTA、EG
TA、ホスホン酸塩、BAPTA四ナトリウム塩、BAPTA/AM、Di-Notro
phen(商標)試薬四ナトリウム塩、EGTA/AM、ピリドキサールイソニコチノイ
ルヒドラジン、N、N、N’、N’-テトラキス-(2ピリジルメチル)エチレンジアミ
ン、6-ブロモ-N’-(2-ヒドロキシベンジリデン)-2-メチルキノリン-4-カ
ルボヒドラジド、1,2-ビス(2-アミノフェノキシ)エタン-N、N、N’、N’-
四酢酸酸テトラキス(アセトキシメチルエステル)、(エチレンジニトリロ)四酢酸、E
DTA、エダサミル、エチレンジニトリロ四酢酸、エチレングリコール-ビス(2-アミ
ノエチルエーテル)-N、N、N’、N’-四酢酸、または、エチレングリコール-ビス
(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N’、N’-四酢酸四ナトリウム塩、または、
それらのあらゆる組み合わせである。一部の代替手法では、当該キレート剤は、EDTA
、または、EGTA、または、それらの組み合わせである。一部の代替手法では、当該キ
レート剤を、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9m
M、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80m
M、90mM、または、100mM、または、前出した濃度のいずれか2つで定義した範
囲内にある濃度で、当該第3の培地に提供する。一部の代替手法では、当該第3の培地で
のEDTAの濃度は、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8m
M、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM
、80mM、90mM、または、100mM、または、前出した濃度のいずれか2つで定
義した範囲内にある濃度である。
【0146】
一部の代替手法では、当該第3の培地は、プロテアーゼを含む。一部の代替手法では、
当該プロテアーゼは、トリプシン、コラゲナーゼ、キモトリプシン、または、カルボキシ
ペプチダーゼ、または、それらの混合物である。一部の代替手法では、当該プロテアーゼ
は、トリプシンである。一部の代替手法では、当該プロテアーゼを、1mM、2mM、3
mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30m
M、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、または、100m
M、または、前出した濃度のいずれか2つで定義した範囲内にある濃度で、当該第3の培
地に提供する。
【0147】
一部の代替手法では、当該方法は、胎盤、または、その一部を、さらなる複数の培地と
接触させることをさらに含み、接触させることで、エキソソームを含む複数の画分を得る
。一部の代替手法では、当該第1、第2、第3、または、さらなる培地は、グルコースを
含む。一部の代替手法では、当該第1、第2、第3、または、さらなる培地は、GM-C
SFを含む。一部の代替手法では、当該第1、第2、第3、または、さらなる培地は、血
清を含む。一部の代替手法では、当該第1、第2、第3、または、さらなる培地は、DM
EMを含む。一部の代替手法では、当該第1、第2、第3、または、さらなる培地は、A
HRアンタゴニストを含む。一部の代替手法では、当該AHRアンタゴニストは、SR1
である。一部の代替手法では、当該SR1は、1nM、10nM、100nM、200n
M、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、90
0nM、または、1mMの濃度、または、前出した濃度のいずれか2つで定義した範囲内
にあるその他の濃度である。
【0148】
一部の代替手法では、当該第1の培地は、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25
℃、30℃、35℃、または、40℃、または、前出した温度のいずれか2つで定義した
範囲内にある温度を維持しながら、胎盤、または、その一部と接触する。一部の代替手法
では、当該第2の培地は、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35
℃、または、40℃、または、前出した温度のいずれか2つで定義した範囲内にある温度
を維持しながら、胎盤、または、その一部と接触する。一部の代替手法では、当該第3の
培地は、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、または、40
℃、または、前出した温度のいずれか2つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、
胎盤、または、その一部と接触する。一部の代替手法では、当該さらなる複数の培地は、
0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、または、40℃、また
は、前出した温度のいずれか2つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、胎盤、ま
たは、その一部と接触する。
【0149】
一部の代替手法では、当該第1、第2、または、第3の培地、または、さらなる複数の
培地は、抗生物質を含む。
【0150】
一部の代替手法では:
(a)当該第1、第2、及び/または、第3の画分、または、複数の画分を組織フィルタ
ーに通すこと;
(b)(a)で回収した濾過物の第1の遠心分離を実行して、細胞ペレット、及び、第1
の上清を生成すること;
(c)当該第1の上清について第2の遠心分離を実行して、第2の上清を生成すること;
及び
(d)当該第2の上清について第3の遠心分離を実行して、エキソソームペレットを生成
すること;及び、任意に、
(e)当該エキソソームを溶液に再懸濁すること、を含む方法で、当該エキソソームを、
当該第1、第2、及び/または、第3の画分、または、複数の画分から単離する。
【0151】
一部の代替手法では、単離したエキソソームの集団は、CD63、CD63-A、パー
フォリン、Fas、TRAIL、または、グランザイムB B、または、これらの組み合
わせを有するエキソソームを含む。一部の代替手法では、単離したエキソソームの集団は
、シグナル伝達分子を含むエキソソームを含む。一部の代替手法では、単離したエキソソ
ームの集団は、サイトカイン、mRNA、または、miRNAを含むエキソソームを含む
。
【0152】
一部の代替手法では、当該方法は、アフィニティークロマトグラフィーによってエキソ
ソームを単離することをさらに含み、当該アフィニティークロマトグラフィーは、ウイル
ス抗原、ウイルスタンパク質、細菌抗原、または、細菌タンパク質真菌抗原、または、真
菌タンパク質を含むエキソソームの除去について選択的である。
【0153】
一部の代替手法では、当該方法は、代替的、または、さらなるアフィニティークロマト
グラフィーステップによってエキソソームを単離することをさらに含み、当該代替的、ま
たは、さらなるアフィニティークロマトグラフィーステップは、炎症タンパク質を含むエ
キソソームの除去について選択的である。一部の代替手法では、この方法は、抗炎症生体
分子を含むエキソソームの集団を濃縮することをさらに含む。
【0154】
一部の代替手法では、本明細書の実施形態のいずれか1つによって生成したエキソソー
ムを提供する。一部の代替手法では、当該エキソソームは、腹水、血液、または、血漿に
由来する。一部の代替手法では、当該エキソソームは、臓器由来の細胞に由来する。一部
の代替手法では、当該エキソソームは、免疫細胞に由来する。一部の代替手法では、当該
エキソソームは、T細胞またはB細胞に由来する。
【0155】
一般的に、本明細書、とりわけ、添付した特許請求の範囲(例えば、添付した特許請求
の範囲の本文)で使用した用語は、当業者であれば、一般的に、「オープン」用語を意図
しているものと理解する(例えば、用語「含む(including)」は、「があるが
、それに限定されない(including but not limited to)
」と解釈し、用語「有する」は、「少なくとも有する」と解釈し、用語「含む(incl
udes)」は、「があるが、それに限定されない(includes but not
limited to)」と解釈するなど)。導入した請求項の要素に関して特定の数
値を意図する場合に、そのような意図は、当該請求項に明示的に記載しているものであっ
て、また、そのような記載が無ければ、そのような意図が存在しないことを、当業者は理
解する。例えば、理解を助けるために、以下に添付した特許請求の範囲は、請求項の要素
に添える導入句「少なくとも1つ」及び「1つ以上」の使用を含み得る。しかしながら、
そのような句を使用しても、不定冠詞「a」または「an」を導入した請求項の記載が、
たとえ、同じ請求項が、導入句「1つ以上」または「少なくとも1つ」、及び、「a」ま
たは「an」などの不定冠詞(例えば、「a」及び/または「an」は、「少なくとも1
つ」または「1つ以上」を意味するものと解釈する)を含んでいたとしても、そのような
導入を行った請求項の要素を含む特定の請求項を、そのような要素を一つだけ含む実施形
態にまで限定するものでなく;請求項の要素を導入する際に添えた定冠詞の使用について
も同様である。加えて、導入した請求項の要素に関して特定の数値が明示的に記載されて
いても、そのような記載は、少なくとも記載した数値を意味するものと解釈する、ことを
当業者は認識する(例えば、単なる「2つの要素」という記載は、その他の修飾語句が無
くとも、少なくとも2つの要素、または、2つ以上の要素のこと意味する)。さらに、「
A、B、及び、Cなどの少なくとも1つ」に類似した慣例を使用する事例では、一般的に
、このような構文は、当業者が慣例を理解する意味で意図している(例えば、「A、B、
及び、Cの少なくとも1つを有するシステム」として、Aのみ、Bのみ、Cのみ、AとB
を一緒に、AとCを一緒に、BとCを一緒に、及び/または、A、B、及び、Cを一緒に
、などを有するシステムがあるが、これらに限定されない。)。「A、B、または、Cの
少なくとも1つなど」に類似した慣例を使用する事例では、一般的に、このような構文は
、当業者が慣例を理解する意味で意図している(例えば、「A、B、または、Cの少なく
とも1つを有するシステム」として、Aのみ、Bのみ、Cのみ、AとBを一緒に、AとC
を一緒に、BとCを一緒に、及び/または、A、B、及び、Cを一緒に、などを有するシ
ステムがあるが、これらに限定されない。)。さらに、詳細な説明、特許請求の範囲、ま
たは、図面のいずれでも、2つ以上の代替的な用語を示す実質的に離接的な単語、及び/
または、句は、当該用語の一方、当該用語のいずれか、または、当該用語の双方を含む可
能性を企図している、ことを当業者は理解する。例えば、句「AまたはB」は、「A」ま
たは「B」または「A及びB」の可能性を含む、ことを理解する。
【実施例0156】
6.実施例
6.1.実施例1:ヒト胎盤の培養
ヒト胎盤を受領し、そして、滅菌PBS、または、生理食塩水で洗浄して血液を除去す
る。次いで、この胎盤を、抗生物質と2mM EDTAとを補充した500mLまたは1
000mLのDMEM培養液を入れた大きな容器で、臓器全体を容器内で培養する。別の
方法では、当該胎盤を、様々な大きさに細分し、そして、培養容器に入れることができる
。この培養は、37oCで、5%CO2を含む細胞培養インキュベーターで行う。培養時
間は、4時間~8時間であり、そして、培養液の上清を、エキソソームの単離のために使
用する。新たな培地を、それぞれの回収時点で(例えば、8時間ごと、または、12時間
ごとに)加え、そして、当該胎盤臓器と組織とを、少なくとも5日間培養する。
【0157】
6.2.実施例2:胎盤エキソソームの単離と精製
培養の上清を、3,000gで、30分間、遠心して、細胞と、組織の破片とをペレッ
ト化する。次いで、当該上清を、10,000gで、1時間、遠心分離し、そして、ペレ
ット(小細胞破片と細胞小器官)を廃棄する。次いで、当該上清を、100,000gで
、2時間、遠心分離する。得られたペレットは、エキソソームである。このエキソソーム
ペレットは、以下の方法でさらに精製できる:異なる量の滅菌PBSで再懸濁し、そして
、100,000で、2時間遠心し、次いで、最終ペレットを、滅菌PBSで再懸濁する
。この再懸濁したエキソソームを、シリンジフィルター(0.2um)で濾過し、-80
℃で、300uL~1mLまでの異なる量で分注する。
【0158】
胎盤のエキソソームは、大きさで特徴決定する。サイズ分布を、ナノ粒子追跡アッセイ
で分析する。NanoSightを使用して、3つの代表的なpExoの試料の大きさを
測定した。それぞれの単離物の平均サイズは、それぞれ117、101、96であり、報
告されているエキソソームのサイズと一致する。結果を、
図2A~
図2Cに示す。
【0159】
6.3.実施例3:FACS分析によるpExosのマーカー
pExoのタンパク質マーカーを、MACSPlex Exosome Kit(Mi
ltenyi Biotec、Cat#130-108-8l3)を用いて、このキット
に備え付けのプロトコールに従って分析した。要するに、120μLのpExo単離物を
、15μLのエキソソーム捕捉ビーズと、室温で、一晩、インキュベートした。1mLの
洗浄液で1度洗浄した後に、当該エキソソームを、エキソソーム検出試薬CD9、CD6
3、CD81カクテルとインキュベートし、そして、さらに1時間インキュベートした。
2回洗浄した後に、これらの試料を、FACS(BD Canto 10)で分析した。
このキットは、mIgG1とREA対照とを除いて、合計で37個のタンパク質マーカー
を備えている(表1)。
表1:MACSPlex Exosome KitでpExoを検出するために使用した
タンパク質マーカーのリスト
【表1】
【0160】
pExo試料は、CD1c、CD9、CD20、CD24、CD25、CD29、CD
2、CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD31、CD10、
CD41b、CD42a、CD44、CD45、CD19c、CD4、CD15、CD1
9c、CD4、CD56、CD62P、CD83、CD69、CD81、CD86、CD
105、CD133-1、CD142、CD148、HLA-ABC、HLA-DRDP
DQ、MSCP、ROR1、SSEA-4のタンパク質マーカーに対して強い陽性を示す
ことが認められた。pExoは、CD209では、非常に低レベル(2.6%)である。
培地と細胞培養インキュベーターで培養せずに、生理食塩水で胎盤の血管系をかん流させ
て得たヒト胎盤かん流液も使用してエキソソームを単離し、そして、マーカータンパク質
発現のための同じ方法で分析した。かん流液由来のエキソソームも、pExoに認められ
る大部分のマーカーを高レベルで発現するが、pExosと比較して、CD11c(2.
0%)、MCSP(3.4%)、及び、SSEA-4(3.5%)では、非常に抑制され
ている。また、pExoは、胎盤かん流液エキソソームと比較して、CD142、及び、
CD81のレベルが非常に高い。また、臍帯血を使用して、エキソソームも単離し、そし
て、マーカータンパク質発現と同じ方法で分析した。臍帯血由来のエキソソームも、大部
分のタンパク質マーカーに対して陽性であるが、一般的には、これらのそれぞれのマーカ
ータンパク質発現のレベルは低い。具体的には、pExoと比較して、臍帯血血清エキソ
ソームは、CD56(1.4%)、CD3(0.3%)、及び、CD25(3.9%)と
低レベルである。臍帯血血清でのSSEA-4、及び、MSCPタンパク質の発現は、p
Exoより非常に小さいが、胎盤かん流液エキソソームよりは大きい。臍帯血血清エキソ
ソームも、pExoと比較して、MSCPタンパク質のレベルが高い。これらのデータは
、培養した胎盤組織が、培養していない胎盤及び臍帯血血清と比較して、独特のエキソソ
ーム集団を生成することを示す。臍帯血血清由来のエキソソーム、及び、胎盤かん流液エ
キソソームと比較した、pExo試料の結果を、
図3A~
図3C、及び、表2に示す。
表2
【表2】
【0161】
6.4.実施例4:pExo試料のサイトカイン、及び、成長因子
41個の異なるサイトカインを備えたMiltiPlex Luminexキットを使
用して、サイトカインの含有量について、pExo試料を分析した。以下の表は、15個
の異なるpExo調製物で検出したサイトカインのデータを示す。このデータは、pEx
oが、FGF2、G-CSF、フラクタルカイン、GDGF-AA/BB、GRO、IL
-1RA、IL-8、VEGF、及び、RANTESなどのサイトカインを、有意なレベ
ル(平均>50pg/mL)で含むことを示す。pExoは、EGF、Flt-3L、I
FNa3、MCP-3、PDGF-AA、IL-15、sCD40L、IL6、IP-1
0、MCP-1、MIP-アルファ、MIP-1ベータ、及び、TNF-アルファなどの
その他のサイトカインも、検出可能なレベル(5pg/mL~49pg/mL)のサイト
カインとして含む。
表3:pExo製剤で検出したサイトカイン
【表3】
【0162】
pExo(11個の試料)を、Multiplex Luminex分析で、可溶性サ
イトカイン受容体の存在も分析した。そのデータを、以下の表に示す。このデータは、p
Exoが、sEFGR、sgp-130、sIL-1R1、sTNFR1、sTNFRI
I、sVEGRR1、sVEGFR1、sVEGFR3を、高レベル(>100pg/m
L)で含み、かつ、sCD30、sIL-2Ra、sIL-6R、sRAGEも、一部の
試料で検出(>10ng/mL)することを示す。<と表示したデータは、検出がされて
おらず、そして、陰性とみなした。
表4
【表4】
【0163】
6.5.実施例5:胎盤エキソソームのプロテオーム分析
3つのpExo試料を、プロテオーム分析に供した。提出を受けた試料を、超音波プロ
ーブ(QSonica)を使用して:振幅40%、パルス10×1秒オン、1秒オフに設
定して溶解した。そのタンパク質濃度を、Qubitフルオロメトリーで測定した。10
ugのそれぞれの試料を、SDSページで処理し、そして、精製したタンパク質を、トリ
プシン消化した。表5は、それぞれの試料で同定した総タンパク質を示す。これらの試料
では、合計で1814のタンパク質を同定している。表6は、pExo試料において同定
頻度が大きかったタンパク質の識別子と遺伝子IDを示す。さらなるデータを、
図4及び
図5に示す。
表5
【表5】
表6
【表6】
【0164】
6.6.実施例6:胎盤エキソソームのRNA分析
3つのpExo試料を、配列決定して、それらのRNAプロファイルを分析した。要す
るに、pExo試料由来のRNAを抽出し、そして、cDNAに変換し、そして、配列決
定する。次いで、当該配列データを、データベースと比較して、それぞれの配列データの
タイプと実体を同定する。表7に、RNA配列決定結果の全体的なプロファイルを示す。
pExoのRNAは、tRNA、ミクロRNA、及び、その他の非コードRNAのカテゴ
リを含む。ミクロRNAは、pEXO試料の構成において2番目に豊富なRNAである。
これら3つのpExo試料では、合計で1500の異なるミクロRNAが同定されている
。一部は、3つすべての試料に一般的に存在しており、また、一部は、1つ、または、2
つの試料に特異的に認められている。最も高頻度のミクロRNAの遺伝子識別子、及び、
相対的頻度、及び、存在量を示す。ミクロRNAは、細胞間連絡の機能において重要な役
割を果たすことが知られている。
表7
【表7】
【0165】
6.7.実施例7:胎盤エキソソームは、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)の移動を促す
サイトカインプロファイルは、pExoが、走化性成長因子を含むことを示しており、
このことは、pExoが、細胞移動を促す機能を備えていることを示唆している。このこ
とを調べるために、トランスウェル移動アッセイを、次のように設定した:750uLの
DMEM基本培地(無血清)を、トランスウェル(24ウェル)プレートの下部チャンバ
ーに置き、pExoを、50uLで加えた。PBSを、対照として、同量を加えた。1×
10e5 HDFを、当該トランスウェルの上部チャンバー(8um細孔)に播種した。
6~24時間後に、当該トランスウェルの上部チャンバーの細胞を、綿棒を使って取り除
いた。次いで、当該トランスウェルを、1%エタノールを含むPBSを含んだ溶液で固定
し、1%エタノール-PBSに溶解した1%クリスタルバイオレットで染色する。移動し
た細胞を、顕微鏡で可視化する。このデータは、HDFが当該トランスウェルの底面に向
けて移動するのに対して、PBS対照トランスウェルでは、ウェルを通って移動する細胞
が大幅に少ない、という結果の例を示す。この研究は、pExoが、ヒト皮膚線維芽細胞
の移動を促すことができる、ことを実証している。
図6を参照されたい。
【0166】
6.8.実施例8:胎盤エキソソームは、ヒト臍帯血内皮細胞(HUVEC)の移動を促
す
トランスウェル移動アッセイも、次のように設定した:750uLのDMEM基本培地
(無血清)を、トランスウェル(24ウェル)プレートの下部チャンバーに置き、pEx
oを、50uLで加えた。PBSを、対照として、同量を加えた。2×10e5 HUV
EC発現GFPタンパク質を、当該トランスウェルの上部チャンバー(8um細孔)に播
種した。6~24時間後、移動したウェルを倒立蛍光顕微鏡(AMG)で、直接に可視化
する。この研究は、試験した3つすべてのpExo試料が、3連のすべてのウェルでHU
VECの移動を促すことができる、ことを実証している。陽性対照として使用するHUV
ECの完全培地では、細胞移動が顕著であり、また、さらなる対照として使用するPBS
は、完全培地、または、pExo試験済ウェルと比較して、細胞移動がわずかである。図
7を参照されたい。
【0167】
6.9.実施例9:胎盤エキソソームは、HUVECの増殖を刺激する
pExoのサイトカインプロファイルは、それが、HUVECの増殖に関与することが
公知である幾つかの増殖因子(PGDF-AA、BB、VEGF)を有することを示す。
HUVECの成長と増殖に関するpExoの影響を調べるために、HUVEC発現GFP
を、100uLのHUVEC増殖完全培地が入った96ウェルプレート(透明な底部と、
不透明な壁)に、1×10e4細胞を播種した。2時間播種した後に、細胞を、ウェルの
底に付着させた。次いで、これらのウェルに、25uLの異なるpExo試料(N=6/
試料)を加える。次いで、プレートリーダーを使用して、当該プレートを、播種をして0
日後と2日後に、蛍光強度で評価する(Synergy H4、励起395nm/発光5
09nm)。
図13に示すように、完全培地は、0日目から2日目で、GFPシグナル(
細胞数の指標)が強くなっていることが実証されている。完全培地を50%希釈するPB
S対照は、完全培地と比較して、わずかな増殖を示した。8つの異なるpExo試料は、
すべて、2日目にGFPの堅実な成長を示した。
図8を参照されたい。
【0168】
6.10.実施例10:胎盤エキソソームは、ヒトCD34+細胞の増殖とコロニー形成
を刺激する
造血幹細胞の増殖に関するpExoの効果を試験するために、ヒト臍帯血CD34+細
胞(自社で調製した)を解凍し、そして、1×10e4/細胞/ml(N=4)で、10
% FCS-IMDMを含む、SCF、Flt-3、KL(培地A)のカクテルを含有す
る増殖培地で培養した。培養ウェルに、25uLのPBS、または、25uLのpExo
試料(試験した2つのpExo試料)を加えた。1週間の培養後に、それぞれのウェルで
の総細胞数を計数し、そして、当該培養物でのCD34+細胞の割合を、抗CD34抗体
を使用したフローサイトメトリー(FACS)で評価した。CD34+総細胞数を、培養
物でのCD34+細胞の%に対するウェル内の細胞総数として計算する。これらの結果は
、pExoで処理した両方の培養物が、PBS対照培養物と比較して、有意に多くのCD
34+細胞を有することを示した。また、pExoは、コロニー形成単位培養(CFU)
でのCD34+細胞への影響についても試験した。CFU培養は、MethoCult
H4434培地(Stem Cell Technologies)で確立されたもので
あり、そして、pExoまたはPBSを、50uL/mLで添加した。2週間の培養後に
、それぞれの35mmディッシュでの合計CFU数を計数する(N=3)。このデータは
、pExoの存在下で、PBS対照培養と比較して、有意に多くのCFUが存在すること
を示した。
図9及び
図10を参照されたい。
【0169】
6.11.実施例11:がん細胞増殖の阻害
ミクロRNAデータ、及び、サイトカインデータは、pExoが、がん細胞増殖を阻害
する活性を有することを示唆している。pExo試料を使用して、96ウェルプレートで
のSKOV3(ヒト卵巣癌細胞株)の増殖に関する影響を調べた。このSKOV3細胞は
、ルシフェラーゼを発現するように遺伝子操作しているので、ルシフェラーゼ活性の測定
が、細胞増殖の指標となる。合計で8つの異なるpExo試料を使用した。2000個の
SKOV3細胞を、100uLの増殖培地(DMEM-10%FCS)の入った96ウェ
ルプレートに加えた。2時間後に、40uLのpExoを、ウェル(N=6)に加え、そ
して、60uLの増殖培地を補充した。40μLのPBSを、対照として使用した。完全
培地の条件は、ウェルに対して100μLの培地を加えることである。インキュベーター
で2日間培養した後に、ルシフェラーゼの活性を、Luciferase Assay
Kit(Promega)で、細胞を溶解して測定し、そして、ルシフェラーゼ活性を、
プレートリーダー(Synergy H4)を用いてルミネセンス発光で測定した。この
データは、それぞれの細胞濃度で、pExo処理した培養物が、PBS対照と比較して、
ルミネックス指標が有意に小さいことを示す。このデータは、pExoが、SKOV3細
胞の増殖を阻害したことを示す。
図11を参照されたい。
【0170】
A549がん細胞株(ヒト肺癌がん細胞株)を、96ウェルプレート(Xicelig
ence)に、1500個の細胞/ウェルで播種した。播種して24時間後に、pExo
を、増殖培地(100uL)に、3つの異なる用量(5uL、25、及び、50uL)で
加える。同量のPBSを、対照として加えた。細胞の成長は、ウェルへの細胞の付着を反
映するソフトウェアを介して、播種してから1日目~3日目までモニターすることができ
る。このデータは、pExoの存在が、正規化した細胞指標として示した細胞の成長を、
PBS対照と比較して、pExoの存在下で有意に抑制している、ことを示した。それぞ
れの成長曲線は、3つの独立したウェルの平均細胞指標である。
図12を参照されたい。
【0171】
pExo試料を使用して、様々な用量の細胞を入れた96ウェルプレートでのMDA2
31(ヒト乳癌細胞株)の成長に関する効果を調べた。このMDA231細胞は、ルシフ
ェラーゼを発現するように遺伝子操作しているので、ルシフェラーゼ活性の測定は、細胞
増殖の指標である。異なる細胞数のMDA231-ルシフェラーゼを、96ウェルプレー
ト(3連)に播種し、そして、25uLのpExo#789を加えた。インキュベーター
で2日間培養した後に、Luciferase Assay Kit(Promega)
で、細胞を溶解して測定し、そして、ルシフェラーゼ活性を、プレートリーダー(Syn
ergy H4)を用いて、ルミネセンス発光で測定した。このデータは、それぞれの細
胞濃度で、pExoで処理した培養液が、PBS対照と比較して、Luminex指標が
有意に小さい、ことを示している。このデータは、pExoが、MDA231細胞の増殖
を阻害した、ことを示している。
図13を参照されたい。
【0172】
6.12.実施例12:胎盤エキソソームは、免疫細胞の活性化及び分化を調節する
免疫細胞に関するpExoの効果を調べるために、ヒト臍帯血T細胞を、PKH蛍光色
素で標識し、次いで、刺激となるpExoまたはPHAとインキュベートした。RPMI
+10%FCSで5日間培養した後に、すべてのT細胞、ならびに、CD4、CD8、C
D69、CD27などの様々なタイプのT細胞のサブタイプを区別できる抗体を利用する
FACSで、細胞を分析する。このデータは、pExoの存在下で、CD3+細胞のMF
Iが、対照培養と同様であることを示しており、このことは、pExoだけでは、T細胞
に関する増殖活性に影響を与えないことを示す。PHA刺激で、MFIは有意に減少して
おり、PHAとpExoの両方の存在下で細胞が増殖したことを示しているが、当該MF
IはPHA単独と同様であるので、細胞増殖が、pExoの存在による影響を受けないこ
とを示す。CD69+細胞は、pExoで処理した細胞で有意に多く、CD69+細胞は
、CD3+細胞(T細胞)で有意に増加させており、このことは、T細胞の活性化を、p
Exoが高めたことを示す。この観察は、臍帯血T細胞と、PBMC細胞の両方で認めら
れた。加えて、pExoが、PBMCでのCD56+細胞(NK)細胞の割合を高めるこ
とが認められた。
図14、
図15、
図16、及び、
図17を参照されたい。
【0173】
6.13.実施例13:培養した胎盤、胎盤かん流液、及び、PRP(臍帯血血清)由来
のエキソソームの収量
胎盤かん流液、及び、PRP(臍帯血血清)を、培養したヒト胎盤組織と同じ方法で単
離した。以下の表は、胎盤かん流液、及び、PRPに由来するエキソソームの収量が、培
養した胎盤よりも有意に少ないことを示す。
表8
【表8】
【0174】
考察
本発明の方法は、独特かつ有利な特性を有する大量のエキソソームを生成することがで
きる。これらのエキソソームは、実証したエキソソームの機能によって生物活性であると
考えられる数多くのタンパク質、及び、RNAを含むことが明らかになっている。これら
のエキソソームは、数多くの細胞表面マーカーを発現しており、それらは、例えば、受容
体またはリガンドなどの結合パートナーとして機能し得るものであり、それにより、この
生物活性を、所望の細胞型に対する標的とすることができる。
【0175】
本明細書に提示したデータは、表9に記載したものなど、様々な適応症のためのエキソ
ソームの有用性を示す。
表9
【表9】
【0176】
均等物:
本開示は、本明細書に記載した特定の実施形態によって、範囲が限定されることはない
。実際のところ、本明細書で提供する内容の様々な変更は、これまでに説明したものに加
えて、前出の説明、及び、添付した図面から当業者に自明である。そのような変更が、添
付した特許請求の範囲に属するものである、ことを意図している。
【0177】
様々な刊行物、特許、及び、特許出願を、本明細書で引用しており、それらの開示の全
内容を参照により援用する。