特開 2024-23264 切断可能なＣ末端電荷対タグを有する二重特異性抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024023264

(43)【公開日】2024-02-21

(54)【発明の名称】切断可能なＣ末端電荷対タグを有する二重特異性抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20240214BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20240214BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 9/50 20060101ALN20240214BHJP

   C07K 14/00 20060101ALN20240214BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20240214BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240214BHJP

【ＦＩ】

C07K16/00 ZNA

C07K16/46

C12N5/10

C12N5/071

C12P21/08

C12N9/50

C07K14/00

C07K7/08

C12N15/13

【審査請求】有

【請求項の数】43

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023191593

(22)【出願日】2023-11-09

(62)【分割の表示】P 2020560761の分割

【原出願日】2019-05-08

(31)【優先権主張番号】62/668,626

(32)【優先日】2018-05-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジョン・ケイ・カウォーヤ

(72)【発明者】

【氏名】アレックス・タブリュ・ジョコビッツ

(72)【発明者】

【氏名】クリフトファー・モール

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン・スミス

(72)【発明者】

【氏名】ケビン・グラハム

(72)【発明者】

【氏名】レイ・リエ・ユン・ロウ

(72)【発明者】

【氏名】オリバー・ティール

(72)【発明者】

【氏名】ダンテ・ロマニーニ

(72)【発明者】

【氏名】ビクトリア・ワグナー

(72)【発明者】

【氏名】ニーラジ・ジェイ・アグラワル

(57)【要約】      （修正有）

【課題】多重特異性抗体を作製するための技術及びプロセスを提供する。
【解決手段】ＣＨ３含有分子であって、（ａ）ＣＨ３ドメイン及び連続した負に荷電したアミノ酸残基を含む負に荷電したドメインを含む第１のポリペプチド；並びに（ｂ）ＣＨ３ドメイン及び連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む正に荷電したドメインを含む第２のポリペプチドを含むＣＨ３含有分子を提供する。また、合成分子を多重特異性抗原結合分子にコンジュゲートするための方法が提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＨ３含有分子であって、
（ａ）ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含む負に荷電したドメインを含む第１のポリペプチド；並びに
（ｂ）ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む正に荷電したドメインを含む第２のポリペプチド
を含む、ＣＨ３含有分子。

【請求項2】

前記第１のポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び前記負に荷電したドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置され、前記第２のポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び前記正に荷電したドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置される、請求項１に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項3】

前記第１及び第２のポリペプチドの各々がさらに、ＣＨ２ドメインを含む、請求項１又は２に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項4】

前記第１及び第２のポリペプチドの各々がさらに、ヒンジドメインを含む、請求項１～３のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項5】

前記第１及び第２のポリペプチドの各々が、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置されたＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１～４のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項6】

前記分子がさらに、第３及び第４のポリペプチドを含み、前記第３のポリペプチドが、第１のＶＬドメインを含み、且つ前記第４のポリペプチドが、第２のＶＬドメインを含む、請求項１～５のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項7】

前記第３のポリペプチドがさらに、第１のＣＬドメインを含み、前記第１のＶＬ及びＣＬドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において前記第３のポリペプチド内で互いに対して配置され、前記第４のポリペプチドがさらに、第２のＣＬドメインを含み、且つ前記第２のＶＬ及びＣＬドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において前記第４のポリペプチド内で互いに対して配置される、請求項６に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項8】

前記負に荷電したドメインが、少なくとも５つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含み、且つ前記正に荷電したドメインが、少なくとも５つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項１～７のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項9】

前記負に荷電したドメインが、少なくとも６つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含み、且つ前記正に荷電したドメインが、少なくとも６つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項１～８のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項10】

前記負に荷電したドメインが、少なくとも７つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含み、且つ前記正に荷電したドメインが、少なくとも７つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項１～９のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項11】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、アスパラギン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される、請求項１～１０のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項12】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、アスパラギン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン残基である、請求項１～１１のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項13】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、グルタミン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項14】

前記第１のポリペプチドがさらに、前記ＣＨ３ドメインの前記Ｃ末端に共有結合されたリンカー配列を含み、且つ前記リンカーが、前記負に荷電したドメインの前記Ｎ末端に結合され；且つ
前記第２のポリペプチドがさらに、前記ＣＨ３ドメインの前記Ｃ末端に共有結合されたリンカー配列を含み、且つ前記リンカーが、前記正に荷電したドメインの前記Ｎ末端に結合される、請求項１～１３のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項15】

前記第１のポリペプチドの前記リンカーが、前記第２のポリペプチドの前記リンカーと同じである、請求項１４に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項16】

前記リンカーが、酵素によって切断され得る、請求項１５に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項17】

前記酵素が、ソルターゼＡ、ソルターゼＢ、ソルターゼＣ、ソルターゼＤ、ソルターゼＥ、及びソルターゼＦからなる群から選択される、請求項１６に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項18】

前記酵素が、ソルターゼＡである、請求項１７に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項19】

前記リンカーが、配列番号１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴ）；配列番号２（ＬＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号３（ＬＰＥＴＧ）；配列番号４（ＬＰＥＴＧＧ）；配列番号５（ＬＰＸＴＡ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）：配列番号６（ＮＰＸ［Ｔ／Ｓ］［Ｎ／Ｇ／Ｓ］、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号７（ＩＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；及び配列番号８（ＬＡＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）のアミノ酸配列を含む、請求項１４～１８のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項20】

前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチドのいずれか、又は両方がさらに、そのＣ末端に結合される精製タグを含む、請求項１～１９のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項21】

前記精製タグが、ｈｉｓ－タグ、ｓｔｒｅｐ－タグ、ｆｌａｇ－タグ、Ｔ７－タグ、Ｖ５－ペプチド－タグ、ＧＳＴ－タグ、ＣＢＰ－タグ、ＭＢＰ－タグ及びｃ－Ｍｙｃ－タグからなる群から選択される、請求項２０に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項22】

前記精製タグが、少なくとも５つの連続したヒスチジンアミノ酸残基を含むｈｉｓ－タグである、請求項２１に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項23】

前記第１のポリペプチドが、配列番号９（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤ）のアミノ酸配列を含み、且つ前記第２のポリペプチドが、配列番号１０（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含む、請求項１～２２のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項23】

前記第１のポリペプチドが、配列番号１１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含み、且つ前記第２のポリペプチドが、配列番号１２（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫ）のアミノ酸配列を含む、請求項１～２２のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項24】

第１の重鎖ポリペプチド、第１の軽鎖ポリペプチド、第２の重鎖ポリペプチド、及び第２の軽鎖ポリペプチドを含む多重特異性抗体であって、
前記第１の重鎖ポリペプチドが、ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含む負に荷電したドメインを含み、且つ前記第１の重鎖ポリペプチド及び前記第１の軽鎖ポリペプチドが、第１の抗原に結合し；且つ
前記第２の重鎖ポリペプチドが、ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む正に荷電したドメインを含み、且つ前記第２の重鎖ポリペプチド及び前記第２の軽鎖ポリペプチドが、第２の抗原に結合する、多重特異性抗体。

【請求項25】

前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び前記負に荷電したドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置され、且つ前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び前記正に荷電したドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置される、請求項２に記載の多重特異性抗体。

【請求項26】

前記負に荷電したドメインが、少なくとも５つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含み、且つ前記正に荷電したドメインが、少なくとも５つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項２４又は２５に記載の多重特異性抗体。

【請求項27】

前記負に荷電したドメインが、少なくとも６つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含み、且つ前記正に荷電したドメインが、少なくとも６つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項２６に記載の多重特異性抗体。

【請求項28】

前記負に荷電したドメインが、少なくとも７つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含み、且つ前記正に荷電したドメインが、少なくとも７つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項２７に記載の多重特異性抗体。

【請求項29】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、アスパラギン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される、請求項２４～２８のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項30】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、アスパラギン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン残基である、請求項２４～２９のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項31】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、グルタミン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される、請求項２４～２８のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項32】

前記第１の重鎖ポリペプチドがさらに、前記ＣＨ３ドメインの前記Ｃ末端に共有結合されたリンカー配列を含み、且つ前記リンカーが、前記負に荷電したドメインの前記Ｎ末端に結合され；且つ
前記第２の重鎖ポリペプチドがさらに、前記ＣＨ３ドメインの前記Ｃ末端に共有結合されたリンカー配列を含み、且つ前記リンカーが、前記正に荷電したドメインの前記Ｎ末端に結合される、請求項２４～３１のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項33】

前記第１の重鎖ポリペプチドの前記リンカーが、前記第２の重鎖ポリペプチドの前記リンカーと同じである、請求項３２に記載の多重特異性抗体。

【請求項34】

前記リンカーが、酵素によって切断され得る、請求項３３に記載の多重特異性抗体。

【請求項35】

前記酵素が、ソルターゼＡ、ソルターゼＢ、ソルターゼＣ、ソルターゼＤ、ソルターゼＥ、及びソルターゼＦからなる群から選択される、請求項３４に記載の多重特異性抗体。

【請求項36】

前記酵素が、ソルターゼＡである、請求項３５に記載の多重特異性抗体。

【請求項37】

前記リンカーが、配列番号１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴ）；配列番号２（ＬＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号３（ＬＰＥＴＧ）；配列番号４（ＬＰＥＴＧＧ）；配列番号５（ＬＰＸＴＡ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）：配列番号６（ＮＰＸ［Ｔ／Ｓ］［Ｎ／Ｇ／Ｓ］、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号７（ＩＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；及び配列番号８（ＬＡＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）のアミノ酸配列を含む、請求項３２～３６のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項38】

前記第１の重鎖ポリペプチド、前記第２の重鎖ポリペプチドのいずれか、又は両方がさらに、そのＣ末端に結合される精製タグを含む、請求項３２～３７のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項39】

前記精製タグが、ｈｉｓ－タグ、ｓｔｒｅｐ－タグ、ｆｌａｇ－タグ、Ｔ７－タグ、Ｖ５－ペプチド－タグ、ＧＳＴ－タグ、ＣＢＰ－タグ、ＭＢＰ－タグ及びｃ－Ｍｙｃ－タグからなる群から選択される、請求項３８に記載の多重特異性抗体。

【請求項40】

前記精製タグが、少なくとも５つの連続したヒスチジンアミノ酸残基を含むｈｉｓ－タグである、請求項３９に記載の多重特異性抗体。

【請求項41】

前記第１重鎖ポリペプチドが、配列番号９（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤ）のアミノ酸配列を含み、且つ前記第２の重鎖ポリペプチドが、配列番号１０（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含む、請求項３２～４０のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項41】

前記第１の重鎖ポリペプチドが、配列番号１１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含み、且つ前記第２の重鎖ポリペプチドが、配列番号１２（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫ）のアミノ酸配列を含む、請求項３２～４０のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項42】

前記多重特異性抗体が、哺乳動物細胞によって発現される、請求項３２～４１のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項43】

前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ又はＣＨＯ細胞である、請求項４２に記載の多重特異性抗体。

【請求項44】

多重特異性抗体を生成する方法であって、培養培地中で請求項３２～４１のいずれかに記載の前記多重特異性抗体をコードするベクターを含む細胞を培養する工程を含む方法。

【請求項45】

前記方法がさらに、前記細胞又は前記培養培地から前記多重特異性抗体を回収することを含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

抗体コンジュゲートを作製する方法であって、
ａ）請求項４０又は４１のいずれかに記載の多重特異性抗体をもたらす工程；及び
ｂ）前記抗体を、合成分子（前記分子は、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ配列を含む）の存在下にてソルターゼ酵素で処理する工程を含む方法。

【請求項47】

工程ｂ）が、約２～約１０００の合成分子：抗体モル比率を使用して実施される、請求項４６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多重特異性抗体を含む多重特異性タンパク質複合体である新規の操作されたタンパク質、それらを構築する方法及びそれらを生成する方法に関する。本発明はまた、多重特異性タンパク質複合体を得るのに有用な技術の新たな適用に関する。

【0002】

本出願は、コンピューター可読形式（ＣＲＦ）並びに３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．８２１（ｃ）及び１．８２１（ｅ）によって要求される紙の複写の両方として役立ち、且つ全体として参照により本明細書に組み込まれるＡＳＣＩＩ「ｔｘｔ」準拠の配列表を含む。２０１９年５月８日に作成された「ｔｘｔ」ファイルの名称は、Ａ－２２３８－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿０５０７１９＿ＳＴ２５であり、３０ｋｂのサイズである。

【背景技術】

【0003】

ヒト疾患のための治療剤としての多重特異性抗体の開発は、大きな臨床的可能性を有する。多重特異性抗体は、同時に２つの異なる抗原を認識し、異なる病原性メディエーターを中和し、異なる種類のエフェクター細胞を動員し、且つシグナル経路を調節できる。しかしながら、多重特異性抗体の生成は、非常に困難であった。多重特異性抗体の広範な適用は、有利な半減期、高い安定性、免疫原性の欠如、及び大規模製造及び精製のための実現可能性を示す多重特異性抗体を生成するためのプラットフォームを開発する困難さによって妨げられてきた。ＤＶＤ－Ｉｇ（二重可変ドメインＩｇ）などの有望な多重特異性抗体形式（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１２９０－１２９７（２００７））；クロスオーバーＩｇ［Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ｗ ｅｔ ａｌ（２０１１）ＰＮＡＳ １０８（２７）：１１１８７－１１１９２］；ツー・イン・ワンＩｇ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９，３２３，１６１０）；ＢｉＴＥ（登録商標）抗体［ＰＮＡＳ ９２（１５）：７０２１－７０２５；１９９５］は、多重特異性抗体の生成を可能にするが、それらは異なる種類の負担を有する。

【0004】

いくつかの革新的な技術は、多重特異性を設計するための骨格を提供するＦｃヘテロ二量体のほとんど排他的な集合を可能にした（例えば、ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１７，１９９６）、静電ステアリング（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１９６３７，２０１０）及び鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）（Ｄａｖｉｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．＆Ｓｅｌ．２３：１９５，２０１０））。二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ手法において、第２の抗体のＶＬ及びＶＨは、それぞれ第１の抗体の軽鎖及び重鎖のＮ末端に可撓性リンカーを介して融合されて、外側ＶＤ及び内側ＶＤと呼ばれる直列の２つの可変ドメイン（ＶＤ）を創出する（Ｗｕ ｅｔ ａｌ，同書）。内側ＶＤのリガンド結合部位に対する外側ＶＤの近接によってもたらされる立体障害のため、内側ＶＤの結合親和性を保持するためには、ほとんどが実験的に決定されなければならない、いくつかの利用可能なモノクローナル抗体からのＶＤの選択、ＶＤの配向、及びリンカーの設計を含む広範な最適化が必要である（ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９：１４５，２０１２）。

【0005】

別の方法は、ラット／マウスクアドローマにおける種に制限される重鎖及び軽鎖対形成を利用する（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２１９，１９９５）。しかしながら、生成された多重特異性抗体は、ラット／マウス抗体であり、これは治療薬として明らかに免疫原性の問題を有する。

【0006】

ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）ヘテロ二量体化重鎖に基づくＣｒｏｓｓｍａｂ手法はさらに、多重特異性ＩｇＧ抗体の生産のための一般的な手法として免疫グロブリンドメインクロスオーバーを使用する（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：１ １ １８７，２０１ １）。それにもかかわらず、Ｈ鎖ヘテロ二量体及び同族Ｆｖの正しい対形成は、排他的ではなく、望まれない副産物が、精製中に除去されなければならない。

【0007】

Ｃｒｏｓｓｍａｂ手法の拡張を使用して、ＣｒｏｓｓｍａｂのＣ末端にＦａｂ及びＣｒｏｓｓｍａｂ Ｆａｂ断片の追加のセットをタグ付けすることによって、四価の多重特異性抗体を生成できたが（Ｒｅｇｕｌａら、米国特許出願公開第２０１０／０３２２９３４号明細書）、Ｈ鎖ヘテロ二量体及び同族Ｆｖの排他的に正しい対形成を得ることの課題は残っている。

【0008】

多重特異性に対するさらなる手法は、２つの異なる抗原を標的化する単一の結合部位を使用することであり、「ツー・イン・ワン」抗体によって実証された。１つのそのような「ツー・イン・ワン」抗体は、抗体ハーセプチンの多様体であり、これは、Ｈｅｒ２及びＶＥＧＦの両方と相互作用する（Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１６１０，２００９）。この手法は、通常のＩｇＧと同一の形式を有する多重特異性抗体をもたらすため、臨床適用にとって魅力的である。しかしながら、そのような多様体のためのスクリーニングは、非常に労働集約的であり、目的の両方の抗原に結合できる単一の結合部位を得ることができる保証はない。

【0009】

商業的且つ治療的な目的に有用であり且つ適応性のある多重特異性抗体を結合するための技術を見出すことは、達成が難しかった。多くの方法が試みられてきたが、ほとんど全ての方法は、とりわけ可溶性が低い；哺乳類細胞では発現しない、ヘテロ二量体構造の収率が低い、製造が技術的に困難である、免疫原性がある、インビボでの半減期が短い、不安定であるなどの重大な欠点を抱えている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：６４４４－６４４８；米国特許第５，９３２，４４８号明細書；同第６，８３３，４４１号明細書；同第５，５９１，８２８号明細書；同第７，１２９，３３０号明細書；同第７，５０７，７９６号明細書；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４：３－１４；Ｂｏｏｙ（２００６）Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．５４：８５－１０１；Ｃａｏ ｅｔ ａｌ（２００３）５５：１７１－１９７；及びＭａｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ９（２）：１８４－１９３。したがって、多重特異性抗体を作製するための技術及びプロセスの改善が必要とされる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１０／０３２２９３４号明細書

【特許文献2】米国特許第５，９３２，４４８号明細書

【特許文献3】米国特許第６，８３３，４４１号明細書

【特許文献4】米国特許第５，５９１，８２８号明細書

【特許文献5】米国特許第７，１２９，３３０号明細書

【特許文献6】米国特許第７，５０７，７９６号明細書

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１２９０－１２９７（２００７）

【非特許文献2】Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ｗ ｅｔ ａｌ（２０１１）ＰＮＡＳ １０８（２７）：１１１８７－１１１９２

【非特許文献3】Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９，３２３，１６１０

【非特許文献4】ＰＮＡＳ ９２（１５）：７０２１－７０２５；１９９５

【非特許文献5】Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１７，１９９６

【非特許文献6】Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１９６３７，２０１０

【非特許文献7】Ｄａｖｉｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．＆ Ｓｅｌ．２３：１９５，２０１０

【非特許文献8】Ｗｕ ｅｔ ａｌ，ｉｂｉｄ

【非特許文献9】ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９：１４５，２０１２

【非特許文献10】Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２１９，１９９５

【非特許文献11】Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：１ １ １８７，２０１ １

【非特許文献12】Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１６１０，２００９

【非特許文献13】Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：６４４４－６４４８

【非特許文献14】Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４：３－１４

【非特許文献15】Ｂｏｏｙ（２００６）Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．５４：８５－１０１

【非特許文献16】Ｃａｏ ｅｔ ａｌ（２００３）５５：１７１－１９７

【非特許文献17】Ｍａｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ９（２）：１８４－１９３

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

一態様では、本発明は、（ａ）ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含む負に荷電したドメインを含む第１のポリペプチド；並びに（ｂ）ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む正に荷電したドメインを含む第２のポリペプチドを含むＣＨ３含有分子に関する。

【0013】

一実施形態では、第１のポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び負に荷電したドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置され、第２のポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び正に荷電したドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置される。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの各々はさらに、ＣＨ２ドメインを含む。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの各々はさらに、ヒンジドメインを含む。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの各々は、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置されたＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む。

【0014】

一実施形態では、分子はさらに、第３及び第４のポリペプチドを含み、第３のポリペプチドは、第１のＶＬドメインを含み、且つ第４のポリペプチドは、第２のＶＬドメインを含む。一実施形態では、第３のポリペプチドはさらに、第１のＣＬドメインを含み、第１のＶＬ及びＣＬドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向において第３のポリペプチド内で互いに対して配置され、且つ第４のポリペプチドはさらに、第２のＣＬドメインを含み、且つ第２のＶＬ及びＣＬドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向において第４のポリペプチド内で互いに対して配置される。

【0015】

一実施形態では、負に荷電したドメインは、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又は少なくとも７つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含み、正に荷電したドメインは、少なくとも５つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む。

【0016】

一実施形態では、負に荷電したアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基であり、正に荷電したアミノ酸残基は、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される。一実施形態では、負に荷電したアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基であり、正に荷電したアミノ酸残基は、リジン残基である。

【0017】

一実施形態では、負に荷電したアミノ酸残基は、グルタミン酸残基であり、正に荷電したアミノ酸残基は、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される。

【0018】

一実施形態では、第１のポリペプチドはさらに、ＣＨ３ドメインのＣ末端に共有結合したリンカー配列を含み、リンカーは、負に荷電したドメインのＮ末端に結合され；且つ第２のポリペプチドはさらに、ＣＨ３ドメインのＣ末端に共有結合されたリンカー配列を含み、リンカーは、正に荷電したドメインのＮ末端に結合される。

【0019】

一実施形態では、第１のポリペプチドのリンカーは、第２のポリペプチドのリンカーと同じである。

【0020】

一実施形態では、リンカーは、酵素によって切断され得る。一実施形態では、酵素は、ソルターゼＡ、ソルターゼＢ、ソルターゼＣ、ソルターゼＤ、ソルターゼＥ、及びソルターゼＦからなる群から選択される。

【0021】

一実施形態では、リンカーは、配列番号１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴ）；配列番号２（ＬＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号３（ＬＰＥＴＧ）；配列番号４（ＬＰＥＴＧＧ）；配列番号５（ＬＰＸＴＡ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）：配列番号６（ＮＰＸ［Ｔ／Ｓ］［Ｎ／Ｇ／Ｓ］、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号７（ＩＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；及び配列番号８（ＬＡＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）のアミノ酸配列を含む。

【0022】

一実施形態では、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドのいずれか、又は両方はさらに、そのＣ末端に結合される精製タグを含む。

【0023】

一実施形態では、精製タグは、ｈｉｓ－タグ、ｓｔｒｅｐ－タグ、ｆｌａｇ－タグ、Ｔ７－タグ、Ｖ５－ペプチド－タグ、ＧＳＴ－タグ、ＣＢＰ－タグ、ＭＢＰ－タグ及びｃ－Ｍｙｃ－タグからなる群から選択される。一実施形態では、精製タグは、少なくとも５つの連続したヒスチジンアミノ酸残基を含むｈｉｓ－タグである。

【0024】

一実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号９（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤ）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号１０（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含む。

【0025】

一実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号１２（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫ）のアミノ酸配列を含む。

【0026】

一態様では、本発明は、第１の重鎖ポリペプチド、第１の軽鎖ポリペプチド、第２の重鎖ポリペプチド、及び第２の軽鎖ポリペプチドを含む多重特異性抗体に関し、
第１の重鎖ポリペプチドは、ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含む負に荷電したドメインを含み、且つ第１の重鎖ポリペプチド及び第１の軽鎖ポリペプチドは、第１の抗原に結合し；且つ
第２の重鎖ポリペプチドは、ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む正に荷電したドメインを含み、且つ第２の重鎖ポリペプチド及び第２の軽鎖ポリペプチドは、第２の抗原に結合する。

【0027】

一実施形態では、多重特異性抗体は、哺乳動物細胞によって発現される。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ細胞又はＣＨＯ細胞である。

【0028】

一態様では、本発明は、多重特異性抗体を生成する方法であって、培養培地中で本発明の多重特異性抗体をコードするベクターを含む細胞を培養する工程を含む方法に関する。

【0029】

一実施形態では、方法はさらに、細胞又は培養培地から多重特異性抗体を回収することを含む。

【0030】

一態様では、本発明は、抗体コンジュゲートを作製するための方法であって、
ａ）請求項４０又は４１のいずれかの多重特異性抗体をもたらす工程；及び
ｂ）抗体を、合成分子（分子は、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ配列を含む）の存在下にてソルターゼ酵素で処理する工程を含む方法に関する。一実施形態では、工程ｂ）は、約２～約１０００の合成分子：抗体モル比率を使用して実施される。

【0031】

本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】Ｃ末端電荷対タグを介する二重特異性抗体の操作を示す。

【図2】Ｃ末端電荷対タグに基づく二重特異性抗体を示す。

【図3】二重特異性抗体に基づくＣ末端電荷対タグを示す。

【図4】ソルターゼによる二重特異性抗体からのＣ末端電荷対タグの切除を示す。

【図5】Ｃ末端電荷対タグを介して生成される二重特異性抗体のペプチド転移を示す。

【図6】Ｃ末端電荷対タグを介して生成される二重特異性抗体薬物コンジュゲートを示す。

【図7】一過性のＨＥＫ ２９３－６ｅ発現－ＴＦＮα／ＴＬＡ１を示す。

【図8】一過性のＨＥＫ ２９３－６ｅ発現－ＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１を示す。

【図9】Ｃ末端電荷－対二重特異性ＴＮＦα／ＴＬＡ１及びＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１の発現レベルを示す（１５０～２５０ｍｇ／Ｌ）。

【図10】抗体Ａ精製－ＴＮＦα／ＴＬＡ１を示す。

【図11】溶出プロファイル：ＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１のプロテインＡアフィニティー精製を示す。

【図12】ＬＣＭＳ：Ｐｒｏ Ａプール－ＴＮＦα／ＴＬＡ１を示す。

【図13】ＬＣＭＳ：Ｐｒｏ Ａプール－ＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１を示す。

【図14】ＳＤＳ－Ｐａｇｅ：ＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１のプロテインＡアフィニティー精製を示す。

【図15】分析的サイズ排除及びカチオン交換クロマトグラフィーによるＴＮＦα／ＴＬＡ１純度の分析を示す。

【図16】分析的サイズ排除及びカチオン交換クロマトグラフィーによるＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１純度の分析を示す。

【図17】ＵＰＬＣ：Ｐｒｏ Ａ精製後のＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１の分析的Ｓｅｃプロファイルを示す。

【図18】ＴＮＦα／ＴＬＡ１：分取カチオン交換クロマトグラフィーを示す。

【図19】分取カチオン交換クロマトグラフィーを示す。

【図20】Ｃ末端電荷対タグによって生成されるＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１二重特異性抗体のＣａｌｉｐｅｒ分析を示す。

【図21】二重特異性ＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１抗体結合分析を示す。

【図22】Ｃ末端電荷対タグの部位特異的切断を示す。

【図23】ペプチド転移を介する二重特異性抗体の部位特異的コンジュゲーションを示す。

【図24】ソルターゼに媒介されるタグの除去を示す。

【図25】大規模なペプチド転移を示す。

【図26】ＴＮＦα／ＴＬＡ１からの電荷対タグのＬＣＭＳ除去を示す。

【図27】ＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１からの電荷対タグのＬＣＭＳ除去を示す。

【図28】電荷対由来の二重特異性抗体のＣ末端コンジュゲーションを示す。

【図29】二重特異性抗体の部位特異的標識を示す。

【図30】ＴＮＦα／ＴＬＡ１のソルターゼＡに媒介されるビオチン化を示す。

【図31】ＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１のソルターゼＡに媒介されるビオチン化を示す。

【図32】ソルターゼＡを介するＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１及びＴＮＦα／ＴＬＡ１のペグ化を示す。

【図33】ソルターゼＡによるＧＧＧ－ＰＥＧ２０を用いたＴＮＦα／ＴＬＡ１のペグ化を示す。

【図34】ソルターゼＡによるＧＧＧ－ＰＥＧ２０を用いたＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１のペグ化を示す。

【図35】ＳＤＳ Ｐａｇｅ：ソルターゼＡ－Ｂｉａｂ＋ソルターゼＡ＋Ｇ３ｃ－ＰＥＧ２０ｋを使用する２０ｋｄ－ＰＥＧによるＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１及びＴＮＦα／ＴＬＡ１二重特異性のペグ化を示す。

【図36】ＰＥＧ２０ｋでペグ化された二重特異性抗体の分析的Ｃｅｘを示す。

【図37】ソルターゼＡ－ＴＮＦα／ＴＬＡ１によるＧＧＧ－Ａｌｅｘａフルオロフォアの部位特異的融合を示す。

【図38】ソルターゼＡ－ＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１による－ＧＧＧ－Ａｌｅｘａフルオロフォアの部位特異的コンジュゲーションを示す。

【図39】ソルターゼはまた非標準求核剤を利用できることを示す。

【図40】ＰＡＣ１／ＣＧＲＰＲ１－ＰＥＧ３－Ｎ３＋Ｄｉｂｏ－Ａｌｅｘａ４８８クリックケミストリー反応－２４時間のインキュベーションを示す。

【発明を実施するための形態】

【0033】

理論に束縛されることなく、出願人は、本明細書に記載されるＣ末端電荷対タグが、免疫グロブリンのＦｃ領域の存在下でさえ驚くほど高い程度の精度及び効率で２つ以上の分子の結合を共に駆動する初期トリガーを提供し、そのＦｃ領域はまた、細胞培養条件下で互いに自然に引きつけ合うと考えている。

【0034】

重鎖のホモ二量体化を減少させることによって、本明細書に記載される反対に荷電したＣ末端電荷対タグの使用は、ＣＨ３、ＣＨ２－ＣＨ３、又はヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３成分（例えば、多重特異性又は１アーム抗体など）を含むタンパク質複合体の均一な集団を生成する能力におけるブレークスルーをもたらす。多重特異性複合体は、例えば、それらが、標的（例えば、腫瘍細胞）及び標的（例えば、Ｔ細胞）に対して向けられる薬剤の共局在を誘導できるか又はそれらが、対象に対する併用療法の必要性及び２種以上の治療薬を与えることに伴うリスクを排除できるため、治療適用における使用に関して有利である。さらに、プロテアーゼを使用して、ヘテロ二量体からのＣ末端電荷対タグの除去を促進できる。

【0035】

実施例を含む、本明細書中で使用される組換えポリペプチド及び核酸方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）に記載されるものであり、これらはいずれも任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0036】

本明細書で使用される項目見出しは、単に構成的な目的のためのものであり、記載する主題を限定すると解釈すべきではない。

【0037】

本明細書では、別段の定義がない限り、本出願と関連して使用される科学用語及び専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。

【0038】

一般に、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びに本明細書に記載のタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及び技術は当該技術分野でよく知られ、且つ一般に使用されているものである。別段の記載がない限り、本出願の方法及び手法は、一般に、当該技術分野においてよく知られる通常の方法に従って実施され、こうした方法及び手法は、本明細書を通して引用及び議論される様々な一般の参考文献及び特定性の高い参考文献に記載されるものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。酵素反応及び精製手法は、製造者の説明に従って実施されるか、当該技術分野において一般に達成されるように実施されるか、又は本明細書に記載のように実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、並びに医薬品化学及び製薬化学と関連して使用される専門用語、並びにそれらの実験室的な手順及び手法は、当該技術分野においてよく知られ、且つ一般に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、及び送達、並びに患者の治療には、標準的な手法が使用され得る。

【0039】

本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール及び試薬等に限定されず、したがって、変わり得るものであると理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態の説明を目的としているにすぎず、開示の範囲の限定は意図されず、開示の範囲は、特許請求の範囲のみによって定義される。

【0040】

実施例又は別の形で記載される場合を除き、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を示す数は全て、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、割合と関連して使用されるとき、±１％を意味し得る。

【0041】

別段の記載がない限り、本明細書で使用される「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、慣例に従い、「１つ以上」を意味する。

【0042】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」及び「残基」という用語は、互換的に使用され、ペプチド又はポリペプチドとの関連で使用されるとき、天然起源のアミノ酸と合成のアミノ酸との両方、並びに天然起源のアミノ酸と化学的に類似したアミノ酸類似体、アミノ酸模倣体及び非天然起源のアミノ酸を指す。

【0043】

「天然起源のアミノ酸」は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、並びに遺伝コードによってコードされ、合成された後に修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート及びＯ－ホスホセリン）である。アミノ酸類似体は、天然起源のアミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチルメチオニンスルホニウムである。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は改変されたペプチド骨格を有し得るが、天然起源のアミノ酸と同一の基本化学構造を保持するであろう。

【0044】

「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般化学構造と異なる構造を有するが、天然起源のアミノ酸と類似の様式で機能する化学化合物である。例としては、アミドのメタクリロイル誘導体又はアクリロイル誘導体、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、δ－アミノ酸（ピペリジン－４－カルボン酸など）などが挙げられる。

【0045】

「非天然起源のアミノ酸」は、天然起源のアミノ酸と同一の基本化学構造を有するが、翻訳複合体によって伸長ポリペプチド鎖に組み込まれない化合物である。「非天然起源のアミノ酸」には、限定はされないが、天然にコードされるアミノ酸（限定はされないが、２０の一般的なアミノ酸を含む）が修飾（例えば、翻訳後修飾）されることによって生じるが、翻訳複合体によって伸長ポリペプチド鎖にそれ自体が天然に組み込まれることのないアミノ酸も含まれる。ポリペプチド配列に挿入することができる、又はポリペプチド配列における野生型残基の代わりに使用することができる非天然起源のアミノ酸の例のリストには、限定はされないが、β－アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び側鎖が誘導体化されたアミノ酸が含まれる。例としては、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα－メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα－メチルホモシトルリン（Ｎα－ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα－メチルオルニチン（Ｎα－ＭｅＯｒｎ又はＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリシン（ｈＬｙｓ又はｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ又はｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα－メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα－メチルロイシン（Ｎα－ＭｅＬ又はＮＭｅＬ）、Ｎ－メチルホモリシン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα－メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール－２－カルボン酸（Ｏｉｃ）、３－（１－ナフチル）アラニン（１－Ｎａｌ）、３－（２－ナフチル）アラニン（２－Ｎａｌ）、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２－インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ－ヨードフェニルアラニン（ｐＩ－Ｐｈｅ）、パラ－アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰ又は４－アミノ－Ｐｈｅ）、４－グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリシン（「Ｋ（Ｎε－グリシル）」又は「Ｋ（グリシル）」又は「Ｋ（ｇｌｙ）」と略される）、ニトロフェニルアラニン（ニトロｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（アミノｐｈｅ又はアミノ－Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ベンジルｐｈｅ）、γ－カルボキシグルタミン酸（γ－カルボキシｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ヒドロキシｐｒｏ）、ｐ－カルボキシル－フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α－アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα－メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ－α－メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα－メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（アセチルａｒｇ）、α，β－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α，γ－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４－メチル－フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β－ジフェニル－アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４－フェニル－フェニルアラニン（又はビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α－アミノ－イソ酪酸（Ａｉｂ）、ベータ－アラニン、ベータ－アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ－ヒドロキシリシン、イソデスモシン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、４－ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ－カルボキシグルタメート、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリシン、ε－Ｎ－アセチルリシン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリシン、ω－メチルアルギニン、４－アミノ－Ｏ－フタル酸（４ＡＰＡ）及び他の類似アミノ酸、並びに具体的に記載のもののいずれかの誘導体化形態が挙げられ、これらのものは、Ｌ－形態又はＤ－形態をとり；括弧内は略語である。

【0046】

「単離された核酸分子」という用語は、５’末端から３’末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基若しくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖若しくは二本鎖のポリマー又はその類似体であって、供給源細胞から全核酸が単離されるときにその核酸と共に天然に見出されるポリペプチド、ペプチド、脂質、糖質、ポリヌクレオチド、又は他の物質の少なくとも約５０パーセントが取り除かれているものを指す。好ましくは、単離された核酸分子は、その核酸の天然環境において見出され、ポリペプチド生成におけるその使用、又はその治療的、診断的、予防的、若しくは研究的な使用を妨害すると想定される任意の他の混入核酸分子又は他の分子を実質的に含まない。

【0047】

「単離されたポリペプチド」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、脂質、糖質、ポリヌクレオチド、又は供給源細胞から単離された場合にポリペプチドが天然に見出される他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離されたポリペプチドをいう。単離されたポリペプチドは、その天然環境において見出され、その治療的、診断的、予防的、又は研究的な使用を妨害すると想定される任意の他の汚染性ポリペプチド又は他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。

【0048】

「コードする」という用語は、１つ以上のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を指す。用語は、開始コドン又は終始コドンを必要としない。

【0049】

２つ以上の核酸又はポリペプチド配列と関連する「同一の」及び「同一性」パーセントという用語は、同一である２つ以上の配列又は部分配列を指す。「同一性パーセント」は、比較分子におけるアミノ酸又はヌクレオチドの間で残基が同一であるパーセントを意味し、比較される分子の中で最小のもののサイズに基づいて計算される。こうした計算では、アライメントにおけるギャップ（存在する場合）は、特定の数学モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により対処することができる。アラインした核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用し得る方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），（１９８８）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されるものが含まれる。

【0050】

同一性パーセントを計算する際には、比較する配列を、配列間の最大の一致を与えるような方法でアラインする。同一性パーセントを決定するために使用されるコンピュータプログラムは、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む。コンピュータアルゴリズムであるＧＡＰは、配列同一性パーセントが決定されることになる２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドのアラインメントをとるために使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドが最適に一致するように並べられる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開始ペナルティ（３×平均対角として計算される。ここで、「平均対角」は、使用される比較マトリックスの対角の平均であり；「対角」は、特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全アミノ酸一致に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）並びにＰＡＭ ２５０又はＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリックスがアルゴリズムと共に使用される。特定の実施形態では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５－３５２を参照；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９を参照されたい）もアルゴリズムによって使用される。

【0051】

ＧＡＰプログラムを使用し、ポリペプチド又はヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するための推奨パラメーターは、下記のものである：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２（上記）のＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティ：１２（ただし、エンドギャップに対するペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０

【0052】

２つのアミノ酸配列をアラインするための特定のアライメントスキームを用いると、２つの配列において短い領域のみが一致する可能性があり、アラインされたこの短い領域は、２つの全長配列の間に顕著な関連性が存在せずとも非常に高い配列同一性を有する可能性がある。したがって、所望するならば、標的ポリペプチドの少なくとも５０の連続するアミノ酸にまたがるアライメントが得られるように、選択したアライメント法（例えば、ＧＡＰプログラム）を調整することができる。

【0053】

本明細書で使用される「抗原結合タンパク質」は、特定の標的抗原に特異的に結合する任意のタンパク質を意味する。この用語は、少なくとも２本の全長重鎖及び２本の全長軽鎖を含むインタクトな抗体、並びにその誘導体、多様体、断片及び変異物を包含する。抗体断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及びＦｖ断片が含まれる。抗原結合タンパク質には、以下にさらに記載されるｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ及びｓｃＦｖなどのドメイン抗体も含まれる。

【0054】

一般に、抗原結合タンパク質は、その抗原結合タンパク質が非標的抗原分子に対して本質的にバックグラウンドの結合を示すとき、その標的抗原に「特異的に結合する」ことである。しかしながら、その標的抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、異なる種に由来する標的抗原ポリペプチドと交差反応し得る。典型的には、抗原結合タンパク質は、表面プラズマ共鳴手法（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ，ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）又は結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ，Ｓａｐｉｄｙｎｅ，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）によって測定される解離定数（ＫＤ）が≦１０－７Ｍであるとき、その標的抗原に特異的に結合する。抗原結合タンパク質は、記載の方法を使用して測定されるＫＤが≦５×１０－９Ｍであるとき、「高い親和性」でその標的抗原に特異的に結合し、記載の方法を使用して測定されるＫＤが≦５×１０－１０Ｍであるとき、「非常に高い親和性」でその標的抗原に特異的に結合する。

【0055】

「抗原結合領域」は、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質又はタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に与えるアミノ酸残基を含む抗原結合タンパク質のその部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、典型的には、免疫グロブリン、一本鎖免疫グロブリン、又はラクダ科の動物の抗体の「相補的結合領域」（「ＣＤＲ」）を１つ以上含む。特定の抗原結合領域は、１つ以上の「フレームワーク」領域も含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合の特異性及び親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、ＣＤＲの適切な立体構造の維持に役立つことで、抗原結合領域と抗原との間の結合を促進することができる。

【0056】

「組換えタンパク質」は組換え手法を用いて、すなわち、本明細書に記載されるような組換え核酸の発現によって作製されるタンパク質である。組換えタンパク質の生成方法及び生成手法は、当該技術分野においてよく知られている。

【0057】

「抗体」という用語は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン、又は標的抗原への特異的結合についてインタクトな抗体と競合することができるその断片を指し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び多重特異性抗体を含む。したがって、「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。インタクトな抗体は、一般に、少なくとも２本の全長重鎖及び２本の全長軽鎖を含む。抗体は、単一の供給源のみに由来するか、又は「キメラ」、すなわち、以下にさらに記載されるように、その抗体の異なる部分が、２つの異なる抗体に由来し得るものであり得る。抗原結合タンパク質、抗体、又は結合断片は、ハイブリドーマにおいて、組換えＤＮＡ手法により又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的な切断により生成され得る。

【0058】

抗体又はその断片に関して使用される「軽鎖」という用語は、全長軽鎖、及び結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメイン（ＶＬ）及び定常領域ドメイン（ＣＬ）を含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、カッパ鎖及びラムダ鎖が含まれる。

【0059】

抗体又はその断片に関して使用される「重鎖」という用語は、全長重鎖、及び結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメイン（ＶＨ）並びに３つの定常領域ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に位置し、ＣＨドメインは、カルボキシル末端に位置し、ＣＨ３が、ポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い位置に存在する。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ及びＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１サブタイプ及びＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ、並びにＩｇＥを含む、任意のアイソタイプのものであり得る。

【0060】

本明細書で使用される、抗体又は免疫グロブリンの鎖（重鎖又は軽鎖）の「免疫学的に機能性の断片」（又は単に「断片」）という用語は、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠いているが、抗原に特異的に結合する能力を有する抗体の一部（その部分がどのように得られるか、又は合成されるかは問われない）を含む抗原結合タンパク質である。そのような断片は、それが標的抗原に特異的に結合するという点で生物学的に活性であり、所与のエピトープへの特異的な結合について、インタクトな抗体を含む、他の抗原結合タンパク質と競合することができる。

【0061】

こうした生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ手法によって生成され得、又はインタクトな抗体を含む、抗原結合タンパク質の酵素的若しくは化学的な切断によって生成され得る。免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片には、限定はされないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片及びＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。

【0062】

別の実施形態では、Ｆｖ、ドメイン抗体及びｓｃＦｖであり、これらは、本発明の抗体に由来し得る。

【0063】

例えば、１つ以上のＣＤＲなど、本明細書に開示の抗原結合タンパク質の機能性部分は、第２のタンパク質又は小分子に共有結合させることで、体における特定の標的を対象とする治療剤を創出し、二機能性の治療特性を持たせるか、又は血清半減期を延長できることがさらに企図される。

【0064】

「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。

【0065】

「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によってまとめられる。

【0066】

「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインに加えてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も含む１つの重鎖の一部とを含み、その結果、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成することでＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。

【0067】

「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖と、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含む２つの重鎖とを含み、その結果、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間に形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によってまとめられた２つのＦａｂ’断片から構成される。

【0068】

「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖との両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている。

【0069】

「一本鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、重鎖及び軽鎖可変領域が抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成するために、可撓性リンカーによって連結されているＦｖ分子である。ｓｃＦｖについては、国際公開第８８／０１６４９号パンフレット、並びに米国特許第４，９４６，７７８号明細書及び同第５，２６０，２０３号明細書に詳細に論じられており、これらの開示は、参照により組み込まれる。

【0070】

「ドメイン抗体」又は「一本鎖免疫グロブリン」は、重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片である。ドメイン抗体の例には、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）が含まれる。いくつかの場合、２つ以上のＶＨ領域が、ペプチドリンカーを介して共有結合で連結されることで二価のドメイン抗体が創出される。二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一又は異なる抗原を標的とし得る。

【0071】

「二価の抗原結合タンパク質」又は「二価の抗体」は、２つの抗原結合領域を含む。いくつかの場合、２つの結合領域は、同一の抗原特異性を有する。二価の抗原結合タンパク質及び二価の抗体は、二重特異性であり得、これについては以下を参照されたい。

【0072】

「多重特異性抗原結合タンパク質」又は「多重特異性抗体」は、２つ以上の抗原又はエピトープを標的とするものである。

【0073】

「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異性（ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」又は「二重特異性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」の抗原結合タンパク質又は抗体は、それぞれハイブリッドの抗原結合タンパク質又は抗体であり、２つの異なる抗原結合部位を有する。二重特異性の抗原結合タンパク質及び抗体は、多重特異性抗原結合タンパク質又は多重特異性抗体の一種であり、限定はされないが、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結を含む、様々な方法によって生成され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３を参照されたい。二重特異性の抗原結合タンパク質又は抗体の２つの結合部位は、２つの異なるエピトープに結合し、こうした２つの異なるエピトープは、同一又は異なるタンパク質標的に存在し得る。

【0074】

抗原結合タンパク質（例えば、抗体）との関連において使用されるとき、「競合する」という用語は、抗原結合タンパク質間の競合が、共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合を抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその免疫学的に機能性の断片）が試験下で阻止又は阻害するアッセイによって決定されることを意味する。多くの種類の競合結合アッセイを使用することができ、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２－２５３を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４－３６１９を参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）；Ｉ－１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７－１５を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６－５５２を参照されたい）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７－８２）である。典型的には、このようなアッセイでは、固体表面に結合した精製抗原又はこうした抗原のいずれかを有する細胞、非標識試験抗原結合タンパク質及び標識参照抗原結合タンパク質が使用される。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例において提供される。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在すると、競合する抗原結合タンパク質は、共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合が少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％阻害する。いくつかの場合、結合は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％以上阻害される。

【0075】

「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体を含む）などの選択的結合剤による結合を受ける能力を有し、さらに、その抗原に結合する能力を有する抗体を生成するために動物において使用することが可能な分子又は分子の一部を指す。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば、抗体と相互作用する能力を有する１つ以上のエピトープを有し得る。

【0076】

「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）により結合される分子の一部である。この用語は、抗体などの抗原結合タンパク質に特異的に結合する能力を有する任意の決定基を含む。エピトープは、連続的又は非連続的（不連続的）（例えば、ポリペプチドにおいて、そのポリペプチド配列では互いに連続的ではないが、その分子の中で結び付きを有するアミノ酸残基は、抗原結合タンパク質による結合を受ける）であり得る。立体構造エピトープは、活性タンパク質の立体構造には存在するが、変性タンパク質には存在しないエピトープである。特定の実施形態では、エピトープは、抗原結合タンパク質を生成するために使用されるエピトープと類似した三次元構造を含むが、抗原結合タンパク質を生成するために使用される、そのエピトープにおいて見られるアミノ酸残基を含まないか、又はそのいくつかのみを含む、という点で模倣的であり得る。エピトープは、タンパク質に存在することが最も多いが、場合により、核酸などの他の種類の分子に存在し得る。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、リン酸基又はスルホニル基などの化学的に活性な表面分類の分子を含み得、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗原結合タンパク質は、タンパク質及び／又は巨大分子の複合混合物において標的抗原に存在するエピトープを優先的に認識する。

【0077】

本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」は、記載された分子種が、存在する優勢な種であること、すなわちモル基準で同じ混合物中の任意の他の個々の種よりも豊富であることを意味する。特定の実施形態では、実質的に純粋な分子は、対象種が、存在する全ての高分子種の少なくとも５０％（モル基準で）を含む組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在する全ての高分子種の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％を構成する。他の実施形態では、対象種は、実質的な均一性を有するまで精製され、通常の検出方法によって組成物中に混入種を検出することはできず、したがって組成物は、単一の検出可能な高分子種からなる。

【0078】

「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、一本鎖のヌクレオチドポリマーと二本鎖のヌクレオチドポリマーとの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかの型のヌクレオチドの改変形態であり得る。改変には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基改変、２’，３’－ジデオキシリボースなどのリボース改変、並びにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）及びホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）などのヌクレオチド間結合の改変が含まれる。

【0079】

「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０～６０の塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０～４０のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の構築において使用するための一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのための放射標識、蛍光標識、ハプテン、又は抗原性標識を含む、標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー、又はハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。

【0080】

「単離された核酸分子」は、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくは合成を起源とするか、又はそれらの何らかの組み合わせであるＤＮＡ又はＲＮＡであって、単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドの全て若しくは一部を伴わないか、又はそれが天然では連結されないポリヌクレオチドに連結されているＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。本開示の目的では、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は、インタクトな染色体を包含しないと理解されるべきである。特定の核酸配列「を含む」単離された核酸分子は、その特定の配列に加えて、最大で１０若しくはさらに最大で２０に及ぶ数の他のタンパク質若しくはその一部をコードする配列を含み得、又は記載の核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含み得、且つ／又はベクター配列を含み得る。

【0081】

別段の記載がない限り、本明細書で議論される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への付加の方向は、転写方向と呼ばれ；ＲＮＡ転写産物の５’末端の５’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ；ＲＮＡ転写産物の３’末端の３’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。

【0082】

「制御配列」という用語は、それが連結されるコード配列の発現及びプロセシングに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物用制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み得る。例えば、真核生物用制御配列は、転写因子のための認識部位を１つ又は複数含むプロモーター、転写エンハンサー配列、及び転写終結配列を含み得る。「制御配列」は、リーダー配列及び／又は融合パートナー配列を含み得る。

【0083】

「ベクター」という用語は、宿主細胞へのタンパク質コード情報の導入に使用される任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、又はウイルス）を意味する。

【0084】

「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、そこに作動可能に連結される１つ以上の異種性コード領域の発現を（宿主細胞と協同して）誘導及び／又は制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現コンストラクトは、限定はされないが、転写、翻訳に影響するか、又はそれを制御し、イントロンが存在するのであれば、そこに作動可能に連結されるコード領域のＲＮＡスプライシングに影響する配列を含み得る。

【0085】

本明細書で使用される「作動可能に連結される」は、この用語が適用される構成要素が、適切な条件下でその固有機能を実施することが可能になる関係にあることを意味する。例えば、ベクターにおいてタンパク質コード配列に「作動可能に連結される」制御配列は、制御配列の転写活性と適合する条件下でタンパク質コード配列の発現が達成されるようにそこに連結される。

【0086】

「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されており、それによって目的遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語には、目的遺伝子が存在する限り、子孫の形態又は遺伝的構成が元の親細胞と同一であるか否かに関わらず、親細胞の子孫が含まれる。

【0087】

「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、また、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の類似体又は模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然起源のアミノ酸ポリマーにも適用される。この用語はまた、例えば、糖タンパク質を形成するための糖質残基の付加、又はリン酸化によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し得る。ポリペプチド及びタンパク質は、天然起源及び非組換え細胞によって産生し得るか；又は遺伝子操作若しくは組み換えられた細胞によって産生され、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、或いは天然の配列からの１つ以上のアミノ酸の欠失、それへの付加及び／又はその置換を有する分子を含む。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、具体的には、抗原結合タンパク質、抗体、或いは抗原結合タンパク質からの１つ以上のアミノ酸の欠失、それへの付加及び／又はその置換を有する配列を包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、全長タンパク質と比較して、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失及び／又は内部の欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片は、全長タンパク質と比較して改変されたアミノ酸も含み得る。特定の実施形態では、断片は、約５～５００のアミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、又は少なくとも４５０のアミノ酸長であり得る。有用なポリペプチド断片には、結合ドメインを含む、抗体の免疫学的に機能性の断片が含まれる。

【0088】

「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）それと共に通常見られると想定される他のタンパク質を少なくともいくつかは含まないか、（２）例えば、同一種などの同一源に由来する他のタンパク質を実質的に含まないか、（３）異なる種に由来する細胞によって発現するか、（４）天然ではそれに付随するポリヌクレオチド、脂質、糖質、若しくは他の物質の少なくとも約５０パーセントが取り除かれているか、（５）天然ではそれに付随しないポリペプチドと（共有結合的若しくは非共有結合的な相互作用によって）作動可能に結び付いているか、又は（６）天然には生じないことを意味する。一般的には、「単離されたタンパク質」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、又は少なくとも約５０％を構成する。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、若しくは合成起源の他のＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせにより、そのような単離されたタンパク質はコードされ得る。単離されたタンパク質は、その天然環境において見出され、その治療、診断、予防、研究又は他の使用を妨害すると想定されるタンパク質若しくはポリペプチド又は他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。

【0089】

ポリペプチド（例えば、抗体などの抗原結合タンパク質）の「多様体」は、別のポリペプチド配列と比較して、アミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失及び／又は置換が生じたアミノ酸配列を含む。多様体には、融合タンパク質が含まれる。

【0090】

ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、別の化学部分へのコンジュゲーションによって、挿入、欠失、又は置換による多様体と異なる何らかの様式で化学的に改変されたポリペプチド（例えば、抗体などの抗原結合タンパク質）である。

【0091】

ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的物質に関連して本明細書を通して使用される「天然起源」という用語は、天然に見出される物質を指す。

【0092】

本明細書で使用される「対象」又は「患者」は、任意の哺乳類であり得る。典型的な実施形態では、対象又は患者は、ヒトである。

【0093】

「保存的アミノ酸置換」は、天然のアミノ酸残基（すなわち、ポリペプチド配列の所与の位置に見出される残基）の、非天然の残基（すなわち、ポリペプチド配列の同じ所与の位置に見出されない残基）による置換を含むことができ、その結果、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷に対する影響はほとんどないか又は全くない。保存的アミノ酸置換はまた、典型的には、生物学的な系における合成によってではなく、化学的なペプチド合成によって組み込まれる非天然起源のアミノ酸残基を包含する。こうしたものには、ペプチド模倣体及びアミノ酸部分が逆転又は反転した他の形態が含まれる。

【0094】

天然起源の残基は、下記の共通の側鎖特性に基づくクラスに分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0095】

アミノ酸のさらなるグループもまた、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ（２ｄ Ｅｄ．１９９３），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている原理を使用して明確に表現され得る。いくつかの場合、そのような特性の２つ以上に基づいて置換をさらに特徴付けることが有用であり得る（例えば、Ｔｈｒ残基などの「極性の小さい」残基での置換は、適切な状況では高度に保存的な置換となり得る）。

【0096】

保存的置換は、こうしたクラスの１つのメンバーと、同一クラスの別のメンバーとの交換を含み得る。非保存的置換は、こうしたクラスの１つのメンバーと、別のクラスのメンバーとの交換を含み得る。

【0097】

上記の分類のものと類似の生理化学的特性を有することが知られる合成アミノ酸残基、希少アミノ酸残基、又は改変アミノ酸残基を、配列における特定のアミノ酸残基を「保存的」に置換するものとして使用することができる。例えば、Ｄ－Ａｒｇ残基は、典型的なＬ－Ａｒｇ残基を置換するものとして働き得る。２つ以上の上記のクラスに関して特定の置換を説明することができる場合もあり得る（例えば、小さい疎水性の残基での置換は、上記のクラスの両方に見られる残基、又は両方の定義を満たすそのような残基と類似の生理化学的特性を有することが当該技術分野において知られる他の合成残基、希少残基、若しくは改変残基での１つのアミノ酸の置換を意味する）。

【0098】

核酸配列を発現するために、標準的なクローニング手法及び発現手法に従って、適切なコード配列を好適なベクターにクローニングすることができ、好適な宿主への導入の後、配列が発現することで、コードされるポリペプチドを生成することができ、こうした手法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載される）。本発明は、本発明による核酸配列を含むそのようなベクターにも関する。

【0099】

「ベクター」は、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を促進する送達媒体；（ｂ）そこからのポリペプチドの生成を促進する送達媒体；（ｃ）それを用いる標的細胞の遺伝子導入／形質転換を促進する送達媒体；（ｄ）核酸配列の複製を促進する送達媒体；（ｅ）核酸の安定性を促進する送達媒体；（ｆ）核酸及び／又は形質転換／遺伝子導入細胞の検出を促進する送達媒体；並びに／又は（ｇ）ポリペプチドをコードする核酸に対して有利な生物学的機能及び／若しくは生理化学的機能を別の形で付与する送達媒体を指す。ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター及び合成核酸ベクター（適切な一連の発現制御要素を含む核酸配列）を含む、任意の適切なベクターであり得る。このようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター、及びウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターが挙げられる。

【0100】

組換え発現ベクターは、原核細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））又は真核細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞、酵母細胞、若しくは哺乳類細胞）においてタンパク質が発現するように設計することができる。一実施形態では、宿主細胞は、哺乳類の非ヒト宿主細胞である。代表的な宿主細胞には、典型的にはクローニング及び発現に使用される宿主が含まれ、こうした宿主には、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株であるＴＯＰ１０Ｆ’、ＴＯＰ１０、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５ａ、ＨＢ１０１、Ｗ３１１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、哺乳類細胞株であるＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＨＥＫ２９３、２９３－ＥＢＮＡ ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３－５５０９（１９８９）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）が含まれる。或いは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼ及びインビトロの翻訳システムを使用し、インビトロで転写及び翻訳することができる。ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含むクローニング部位の上流にプロモーターを含むことが好ましい。スイッチのオンオフが切り替え可能なプロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターが挙げられる。

【0101】

ベクターは、任意の好適なプロモーター、エンハンサー及び他の発現促進要素を含むか、又はそれと結び付けられ得る。そのような要素の例としては、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＬ３－３プロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、若しくはＨＩＶ ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター）、有効なポリ（Ａ）終結配列、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミド産物のための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子及び／又は簡便なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げられる。ベクターはまた、ＣＭＶ ＩＥなどの構成的プロモーターとは対照的な誘導性プロモーターを含み得る。一態様では、肝臓組織又は膵臓組織などの代謝に関連する組織における配列の発現を促進する組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸が提供される。

【0102】

本開示の別の態様では、本明細書に開示の核酸及びベクターを含む宿主細胞が提供される。様々な実施形態において、ベクター又は核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、他の実施形態では、ベクター又は核酸は、染色体外に存在する。

【0103】

そのような核酸、ベクター、又はそれらのいずれか若しくは両方の組み合わせを含む酵母細胞、細菌細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））及び哺乳類細胞（例えば、不死化哺乳類細胞）などの組換え細胞が提供される。様々な実施形態において、ポリペプチドの発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、又は直鎖発現要素などの非組込み核酸を含む細胞が提供される。

【0104】

本明細書で提供されるポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、形質転換又は遺伝子導入によって宿主細胞に導入することができる。細胞を発現ベクターで形質転換する方法はよく知られている。

【0105】

核酸は、ウイルスベクターにより宿主細胞又は宿主動物に配置及び／又は送達することができる。この能力を有する任意の好適なウイルスベクターを使用することができる。ウイルスベクターは、任意の数のウイルスポリヌクレオチドを、単独で、或いは所望の宿主細胞における本発明の核酸の送達、複製及び／又は発現を促進する１つ以上のウイルスタンパク質と組み合わせて含み得る。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムの全て若しくは一部を含むポリヌクレオチド、ウイルスタンパク質／核酸コンジュゲート、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又はウイルス核酸及びポリペプチドをコードする核酸を含むインタクトなウイルス粒子であり得る。ウイルス粒子であるウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子又は改変ウイルス粒子を含み得る。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターアンプリコンなど、複製及び／又は発現のための別のベクター又は野生型ウイルスが存在する必要があるベクターであり得る（例えば、ウイルスベクターは、ヘルパー依存性ウイルスであり得る）。典型的には、そのようなウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子からなるか、或いは導入遺伝子容量が増えるか、又は核酸の遺伝子導入及び／又は発現に役立つようにそのタンパク質及び／又は核酸含量が改変されたウイルス粒子からなる（そのようなベクターの例としては、ヘルペスウイルス／ＡＡＶアンプリコンが挙げられる）。典型的には、ウイルスベクターは、通常はヒトに感染するウイルスと類似のもの及び／又はそれに由来するものである。この点に関して好適なウイルスベクター粒子としては、例えば、アデノウイルスベクター粒子（アデノウイルス科（ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）の任意のウイルス又はアデノウイルス科（ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスに由来する任意のウイルスを含む）、アデノ随伴ウイルスベクター粒子（ＡＡＶベクター粒子）又は他のパルボウイルス及びパルボウイルスベクター粒子、パピローマウイルスベクター粒子、フラビウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）が挙げられる。

【0106】

ポリペプチドを単離するために用いることができるタンパク質精製方法、並びに関連する材料及び試薬は、当該技術分野において知られている。ポリペプチドを単離するために有用であり得るさらなる精製方法は、Ｂｏｏｔｃｏｖ ＭＲ，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１１５１４－９，Ｆａｉｒｌｉｅ ＷＤ，２０００，Ｇｅｎｅ ２５４：６７－７６などの参考文献において見出され得る。

【0107】

提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）が１つ以上組み込まれ且つ／又は連結されるポリペプチドである。いくつかの抗原結合タンパク質では、ＣＤＲは、「フレームワーク」領域に組み込まれ、この領域によってＣＤＲの方向が整えられ、その結果、ＣＤＲの適切な抗原結合特性が達成される。本明細書に記載の特定の抗原結合タンパク質は、抗体であるか、又は抗体に由来する。他の抗原結合タンパク質では、ＣＤＲ配列は、異なる型のタンパク質骨格に組み込まれる。様々な構造が以下にさらに記載される。

【0108】

一般に、提供される抗原結合タンパク質は、典型的には、本明細書に記載のＣＤＲを１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ）含む。いくつかの場合、抗原結合タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造と、（ｂ）ポリペプチド構造に挿入及び／又は連結される１つ以上のＣＤＲとを含む。ポリペプチド構造は、様々な異なる形態をとり得る。例えば、ポリペプチド構造は、天然起源の抗体又はその断片若しくは多様体のフレームワークであり得るか、又はそれを含み得、或いは本質的に完全に合成のものであり得る。様々なポリペプチド構造の例が以下にさらに記載される。

【0109】

特定の実施形態では、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、抗体であるか、又は抗体に由来する。したがって、提供される特定の抗原結合タンパク質の例には、限定はされないが、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）などのドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣体」と称されることがある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体、及びそれぞれのその一部又は断片が含まれる。いくつかの場合、抗原結合タンパク質は、完全抗体の免疫学的断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）である。他の場合、抗原結合タンパク質は、本発明の抗体に由来するＣＤＲを使用するｓｃＦｖである。

【0110】

一実施形態では、抗原結合タンパク質は、下記の活性のうちの１つ以上を有する：
（ａ）標的抗原に結合し、その結果、例えば、表面プラズマ共鳴又は結合平衡除外法の手法を介して測定されるとおり、ＫＤが、≦２００ｎＭ、≦１５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦２ｎＭ、又は≦１ｎＭである。
（ｂ）ヒト血清における半減期が少なくとも３日である。

【0111】

提供される抗原結合タンパク質のいくつかの、標的抗原に対する結合速度（ｋａ）は、例えば、後述のように測定すると、少なくとも１０^４／Ｍｘ秒、少なくとも１０^５／Ｍｘ秒、又は少なくとも１０^６／Ｍｘ秒である。提供される特定の抗原結合タンパク質が有する解離速度（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）又は解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）は遅い。いくつかの抗原結合タンパク質は、例えば、１×１０^－２秒^－１、又は１×１０^－３秒^－１、又は１×１０^－４秒^－１、又は１×１０^－５秒^－１というｋｄ（解離速度）を有する。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、２５ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、１ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、又は５０ｎＭ未満のＫＤ（平衡結合親和性）を有する。

【0112】

別の態様では、インビトロ又はインビボ（例えば、ヒト対象に投与された場合）の半減期が少なくとも１日である抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、少なくとも３日の半減期を有する。様々な他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、５０日、又は６０日以上の半減期を有する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、非誘導体化抗体又は非改変抗体と比較してその半減期が長くなるように誘導体化又は改変される。別の実施形態では、血清半減期を増加させるために抗原結合タンパク質は点変異を含む。そのような変異体及び誘導体化形態に関する詳細は、以下にさらに提供される。

【0113】

提供される抗原結合タンパク質のいくつかは、典型的には、天然起源の抗体と関連する構造を有する。こうした抗体の構造単位は、典型的には、１つ以上の四量体を含み、四量体はそれぞれ、ポリペプチド鎖の２つの同一のカプレットから構成されるが、哺乳類のいくつかの種は、単一の重鎖のみを有する抗体も産生する。典型的な抗体では、それぞれの対又はカプレットは、１つの全長「軽」鎖（特定の実施形態では、約２５ｋＤａ）と、１つの全長「重」鎖（特定の実施形態では、約５０～７０ｋＤａ）とを含む。個々の免疫グロブリン鎖はそれぞれ、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」から構成され、「免疫グロブリンドメイン」はそれぞれ、およそ９０～１１０のアミノ酸からなり、特徴的なフォールディングパターンを示す。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識を担う可変ドメインを含む。カルボキシ末端部分は、鎖のもう一方の末端と比較して進化的に保存度が高く、「定常領域」又は「Ｃ領域」と称される。ヒト軽鎖は、一般に、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖に分類され、こうした軽鎖はそれぞれ、１つの可変ドメイン及び１つの定常ドメインを含む。重鎖は、典型的には、ミュー鎖、デルタ鎖、ガンマ鎖、アルファ鎖、又はイプシロン鎖に分類され、こうした鎖は、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥに抗体のアイソタイプを定義する。ＩｇＧは、限定はされないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む、いくつかのサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプには、ＩｇＭ及びＩｇＭ２が含まれる。ＩｇＡサブタイプには、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が含まれる。ヒトでは、ＩｇＡ及びＩｇＤアイソタイプは、４本の重鎖及び４本の軽鎖を含み；ＩｇＧ及びＩｇＥアイソタイプは、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含み；且つＩｇＭアイソタイプは、５本の重鎖及び５本の軽鎖を含む。重鎖のＣ領域は、典型的には、エフェクター機能を担い得るドメインを１つ以上含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存する。ＩｇＧの重鎖は、例えば、重鎖のそれぞれが、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含む。提供される抗体は、これらのアイソタイプ及びサブタイプのいずれかを有することができる。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、又はＩｇＧ４サブタイプのものである。

【0114】

全長の軽鎖及び重鎖では、可変領域及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．）１９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。

【0115】

本明細書で提供される抗体では、免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に、３つの超可変領域（「相補性決定領域」又はＣＤＲと呼ばれることの方が多い）によって連結された相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む同一の全体構造を示す。上述のそれぞれの重鎖／軽鎖対の２つの鎖に由来するＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列されることで、標的抗原の特定のエピトープと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、天然起源の軽鎖及び重鎖の可変領域は両方とも、典型的には、これらの要素が以下の順序に従う：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。これらのドメインの各々に位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるための番号付けシステムが考案されている。この番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ ａｎｄ １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）又はＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３に定義されている。

【0116】

したがって、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）におけるＥＵインデックス及びＡＨｏ番号付けスキーム（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ Ａ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ ８；３０９（３）：６５７－７０）の両方が、本発明において使用され得る。所与の抗体のアミノ酸位置並びに相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、いずれの系を使用しても同定され得る。例えば、３９、４４、１８３、３５６、３５７、３７０、３９２、３９９、及び４０９のＥＵ重鎖位置はそれぞれ、ＡＨｏ重鎖位置４６、５１、２３０、４８４、４８５、５０１、５２８、５３５、及び５５１と同一である。同様に、ＥＵ軽鎖位置３８、１００、及び１７６はそれぞれ、ＡＨＯ軽鎖位置４６、１４１、及び２３０と同一である。下の表１、２、及び３は、番号付け位置の間の同等性を実証する。

【0117】

一態様では、本発明は、（ａ）ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含む負に荷電したドメインを含む第１のポリペプチド；並びに（ｂ）ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む正に荷電したドメインを含む第２のポリペプチドを含むＣＨ３含有分子に関する。

【0118】

一実施形態では、第１のポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び負に荷電したドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置され、第２のポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び正に荷電したドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置される。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの各々はさらに、ＣＨ２ドメインを含む。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの各々はさらに、ヒンジドメインを含む。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの各々は、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置されたＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む。

【0119】

一実施形態では、分子はさらに、第３及び第４のポリペプチドを含み、第３のポリペプチドは、第１のＶＬドメインを含み、且つ第４のポリペプチドは、第２のＶＬドメインを含む。一実施形態では、第３のポリペプチドはさらに、第１のＣＬドメインを含み、第１のＶＬ及びＣＬドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向において第３のポリペプチド内で互いに対して配置され、且つ第４のポリペプチドはさらに、第２のＣＬドメインを含み、且つ第２のＶＬ及びＣＬドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向において第４のポリペプチド内で互いに対して配置される。

【0120】

重鎖及び軽鎖の変異は、重鎖及び軽鎖の適切な対形成を促進するために導入され得る。下記の表１、２及び３において、ＬＣ－Ｅは、ＨＣ－Ｋと対形成するが、ＬＣ－Ｋは、ＨＣ－Ｅと対形成することになる。ＬＣ－Ｅ及びＨＣ－Ｅ上で見出される共通の負の電荷は、互いに離れたこれらの２つの鎖を反発させることになる。同様に、ＬＣ－Ｋ及びＨＣ－Ｋ上で見出される共通の正電荷は、互いに離れたこれらの２つの鎖を反発させることになる。したがって、ＬＣ－Ｅ及びＨＣ－Ｋ間の対形成並びにＬＣ－Ｋ及びＨＣ－Ｅ間の対形成が有利であろう。

【0121】

【表1】

【0122】

【表2】

【0123】

【表3】

【0124】

特定の重鎖とその同族の軽鎖の会合を促進するために、重鎖及び軽鎖の両方は、相補的アミノ酸置換を含有し得る。本明細書で使用する場合、「相補的アミノ酸置換」は、一方の鎖における正に荷電したアミノ酸への置換と対になる他方の鎖における負に荷電したアミノ酸置換を指す。例えば、いくつかの実施形態において、重鎖は、荷電アミノ酸を導入するために少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、対応する軽鎖は、荷電アミノ酸を導入するために少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、重鎖に導入される荷電アミノ酸は、軽鎖に導入されるアミノ酸の反対の電荷を有する。ある種の実施形態では、１つ以上の正に荷電した残基（例えば、リジン、ヒスチジン又はアルギニン）を、第１の軽鎖（ＬＣ１）に導入することができ、且つ１つ以上の負に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を、ＬＣ１／ＨＣ１の結合界面で対になる重鎖（ＨＣ１）に導入することができるが、１つ以上の負に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を、第２の軽鎖（ＬＣ２）に導入することができ、且つ１つ以上の正に荷電した残基（例えば、リジン、ヒスチジン又はアルギニン）を、ＬＣ２／ＨＣ２の結合界面で対になる重鎖（ＨＣ２）に導入することができる。静電相互作用は、界面で反対の荷電残基（極性）が引き合うため、ＬＣ１をＨＣ１と対形成させ、且つＬＣ２をＨＣ２と対形成させるように誘導することになる。界面で同じ荷電残基（極性）を有する重／軽鎖の対（例えば、ＬＣ１／ＨＣ２及びＬＣ２／ＨＣ１）は、反発することになり、望まれないＨＣ／ＬＣの対形成の抑制をもたらす。

【0125】

これら及び他の実施形態では、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の正に荷電したアミノ酸は、１つ以上の負に荷電したアミノ酸で置き換えられる。或いは、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の負に荷電したアミノ酸は、１つ以上の正に荷電したアミノ酸で置き換えられる。いくつかの実施形態では、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｌ１２８、Ａ１４１、Ｌ１４５、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｈ１６８、Ｆ１７０、Ｐ１７１、Ｖ１７３、Ｑ１７５、Ｓ１７６、Ｓ１８３、Ｖ１８５及びＫ２１３から選択されるＥＵ位置でヘテロ二量体抗体中の第１及び／又は第２の重鎖のＣＨ１ドメインにおける１つ以上のアミノ酸は、荷電アミノ酸で置き換えられる。ある種の実施形態では、負又は正に荷電したアミノ酸による置換のための重鎖残基は、Ｓ１８３（ＥＵ番号付けシステム）である。いくつかの実施形態では、Ｓ１８３は、正に荷電したアミノ酸で置換される。代替的な実施形態では、Ｓ１８３は、負に荷電したアミノ酸で置換される。例えば、一実施形態において、Ｓ１８３は、第１の重鎖における負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｓ１８３Ｅ）で置換され、且つＳ１８３は、第２の重鎖における正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｓ１８３Ｋ）で置換される。

【0126】

軽鎖がカッパ軽鎖である実施形態において、Ｆ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２３、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｎ１３７、Ｎ１３８、Ｑ１６０、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７４及びＳ１７６から選択される位置（カッパ軽鎖におけるＥＵ番号付け）でヘテロ二量体抗体中の第１及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸は、荷電アミノ酸で置き換えられる。軽鎖がラムダ軽鎖である実施形態において、Ｔ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｅ１２３、Ｅ１２４、Ｋ１２９、Ｔ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１３７、Ｅ１６０、Ｔ１６２、Ｓ１６５、Ｑ１６７、Ａ１７４、Ｓ１７６及びＹ１７８から選択される位置（ラムダ鎖におけるＥＵ番号付け）でヘテロ二量体抗体中の第１及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸は、荷電アミノ酸で置き換えられる。いくつかの実施形態では、負又は正に荷電したアミノ酸による置換のための残基は、カッパ又はラムダ軽鎖のいずれかのＣＬドメインのＳ１７６（ＥＵ番号付けシステム）である。ある種の実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、正に荷電したアミノ酸で置き換えられる。代替的な実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、負に荷電したアミノ酸で置換される。一実施形態では、Ｓ１７６は、第１の軽鎖における正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｓ１７６Ｋ）で置換され、且つＳ１７６は、第２の軽鎖における負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｓ１７６Ｅ）で置換される。

【0127】

ＣＨ１及びＣＬドメインにおける相補的アミノ酸置換に加えて又はその代わりとして、ヘテロ二量体抗体における軽鎖及び重鎖の可変領域は、荷電アミノ酸を導入するために１つ以上の相補的アミノ酸置換を含有し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体抗体の重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の正に荷電したアミノ酸は、１つ以上の負に荷電したアミノ酸で置き換えられる。或いは、重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の負に荷電したアミノ酸は、１つ以上の正に荷電したアミノ酸で置き換えられる。

【0128】

ＶＨ領域内のＶ領域界面残基（すなわち、ＶＨ及びＶＬ領域の集合を媒介するアミノ酸残基）としては、ＥＵ位置１、３、３５、３７、３９、４３、４４、４５、４６、４７、５０、５９、８９、９１、及び９３が挙げられる。ＶＨ領域中のこれらの界面残基の１つ以上は、荷電した（正又は負に荷電した）アミノ酸で置換され得る。ある種の実施形態では、第１及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置３９のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンに置換される。代替的な実施形態では、第１及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置３９のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。いくつかの実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置３９のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に置換され（例えば、Ｇ３９Ｅ）、第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置３９のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に置換される（例えば、Ｇ３９Ｋ）。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置４４のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンに置換される。代替的な実施形態では、第１及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置４４のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。ある種の実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置４４のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に置換され（例えば、Ｇ４４Ｅ）、第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置４４のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に置換される（例えば、Ｇ４４Ｋ）。

【0129】

ＶＬ領域内のＶ領域界面残基（すなわち、ＶＨ及びＶＬ領域の集合を媒介するアミノ酸残基）としては、ＥＵ位置３２、３４、３５、３６、３８、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、８５、８７、８９、９０、９１、及び１００が挙げられる。ＶＬ領域中の１つ以上の界面残基は、荷電アミノ酸、好ましくは、同族重鎖のＶＨ領域に導入されるものと反対の電荷を有するアミノ酸で置換され得る。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域中のＥＵ位置１００のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンに置換される。代替的な実施形態では、第１及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域中のＥＵ位置１００のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。ある種の実施形態では、第１の軽鎖のＶＬ領域中のＥＵ位置１００のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に置換され（例えば、Ｇ１００Ｋ）、第２の軽鎖のＶＬ領域中のＥＵ位置１００のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に置換される（例えば、Ｇ１００Ｅ）。

【0130】

さらに、又は代わりに、正しい重－軽鎖対形成は、カルボキシル末端Ｆａｂ結合ドメイン中のＣＨ１及びＣＬドメインを交換することによって促進され得る。一例として、重鎖のカルボキシル末端に融合される第１のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含んでもよく、且つ第２のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＨドメイン及びＣＬドメインを含んでもよい。別の実施形態では、重鎖のカルボキシル末端に融合される第１のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＨドメイン及びのＣＬドメインを含んでもよく、且つ第２のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含んでもよい。

【0131】

本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質の重鎖定常領域又はＦｃ領域は、抗原結合タンパク質のグリコシル化及び／又はエフェクター機能に影響する１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。免疫グロブリンのＦｃ領域の機能の１つは、免疫グロブリンがその標的に結合するときに免疫系に伝達することである。これは、一般に「エフェクター機能」と呼ばれる。伝達は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）につながる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞の表面上のＦｃ受容体へのＦｃ領域の結合を介して媒介される。ＣＤＣは、Ｆｃと補体系のタンパク質、例えばＣ１ｑとの結合を介して媒介される。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、定常領域において、エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性、及び／又は抗原結合タンパク質のクリアランス若しくは半減期を増強する１つ以上のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を増強できる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ番号付け）には、Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｙ、Ｒ２９２Ｐ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｄ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、又は上記のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

【0132】

他の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、定常領域において、エフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を低減できる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ番号付け）には、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、又は上記のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

【0133】

グリコシル化は、抗体、特にＩｇＧ１抗体のエフェクター機能に寄与し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、結合タンパク質のグリコシル化のレベル又は型に影響する１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合である。Ｎ結合は、糖鎖のアスパラギン残基側鎖への結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。Ｏ結合グリコシル化は、糖のＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はトレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンも使用され得る。

【0134】

ある種の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ以上のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域に付加することによって増加される。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することによって都合よく達成され得る（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）。改変は、１つ以上のセリン若しくはトレオニン残基の開始配列への付加又はそれによる置換によってもなされ得る（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。容易にするために、抗原結合タンパク質アミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、予め選択された塩基で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって改変し得る。

【0135】

本発明はまた、エフェクター活性の変化をもたらす改変糖鎖構造を有する二重特異性抗原結合タンパク質分子、例えば、ＡＤＣＣ活性の向上を示すフコシル化が存在しないか又は減少した抗原結合タンパク質の産生を包含する。フコシル化を減少又は排除する様々な方法が当該技術分野で知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合によって媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＮ２９７残基でのＮ結合型グリコシル化の糖鎖構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、高い親和性でこの受容体に結合し、ＦｃγＲＩＩＩ媒介エフェクター機能を天然のフコシル化抗体よりも効率的に誘発する。例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え産生は、ＡＤＣＣ活性が１００倍増加した抗体を生じる（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４－２２，２００４を参照されたい）。同様の効果は、フコシル化経路におけるアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素又は他の酵素の活性を減少させることにより、例えばｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ処理、酵素をノックアウトするための細胞株の操作又は選択的グリコシル化阻害剤との培養によって達成され得る（Ｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１２）：１１１３－２３，１９８９を参照されたい）。いくつかの宿主細胞株、例えばＬｅｃ１３又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３－４０，２００２及びＳｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６－７３，２００３を参照されたい）。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換え産生することによる、二分された糖鎖レベルの増加もＡＤＣＣ活性を増加させることが判明している（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６－８０，１９９９を参照されたい）。

【0136】

他の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ以上のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域から除くことによって減少又は排除される。Ｎ結合グリコシル化部位を排除又は改変するアミノ酸置換により、抗原結合タンパク質のＮ結合グリコシル化を減少又は排除することができる。ある種の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、又はＮ２９７ＧなどのＮ２９７の位置（ＥＵ番号付け）での変異を含む。特定の一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。Ｎ２９７変異を含む分子の安定性を改善するために、分子のＦｃ領域がさらに操作され得る。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域における１つ以上のアミノ酸は、二量体状態のジスルフィド結合形成を促進するためにシステインで置換される。したがって、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、又はＩ３３２（ＥＵ番号付け）に対応する残基が、システインで置換され得る。一実施形態では、残基の特定の対が互いにジスルフィド結合を優先的に形成するようにシステインで置換され、それによってジスルフィド結合のスクランブルを制限又は防止する。ある種の実施形態では、対としては、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃの変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。このような実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７Ｇ変異も含み得る。

【0137】

例えば、サルベージ受容体結合エピトープの組込み又は追加（例えば、適切な領域の変異による、又はエピトープをペプチドタグに組み込み、続いて、例えば、ＤＮＡ若しくはペプチド合成によって、いずれかの末端又は中央で抗原結合タンパク質に融合されることによる；例えば、国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照）、或いは、ＰＥＧ又は他の水溶性ポリマー、例えば、多糖ポリマーなどの分子の追加による血清半減期を増加させるための本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の改変もまた望ましい場合がある。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の任意の１つ以上のアミノ酸残基が抗原結合タンパク質中の類似の位置に転移される領域を構成する。一実施形態では、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の３つ以上の残基が転移される。一実施形態では、エピトープがＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域）のＣＨ２ドメインからとられ、抗原結合タンパク質のＣＨ１、ＣＨ３、若しくはＶＨ領域、又は２つ以上のそのような領域に移される。或いは、エピトープがＦｃ領域のＣＨ２ドメインからとられ、抗原結合タンパク質のＣＬ領域若しくはＶＬ領域、又はその両方に移される。Ｆｃ多様体及びサルベージ受容体とのそれらの相互作用の説明については、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照されたい。

【0138】

一実施形態では、負に荷電したドメインは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又は少なくとも７つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含み、正に荷電したドメインは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又は少なくとも７つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む。

【0139】

一実施形態では、負に荷電したアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基であり、正に荷電したアミノ酸残基は、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される。一実施形態では、負に荷電したアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基であり、正に荷電したアミノ酸残基は、リジン残基である。

【0140】

一実施形態では、負に荷電したアミノ酸残基は、グルタミン酸残基であり、正に荷電したアミノ酸残基は、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される。

【0141】

一実施形態では、第１のポリペプチドはさらに、ＣＨ３ドメインのＣ末端に共有結合したリンカー配列を含み、リンカーは、負に荷電したドメインのＮ末端に結合され；且つ第２のポリペプチドはさらに、ＣＨ３ドメインのＣ末端に共有結合されたリンカー配列を含み、リンカーは、正に荷電したドメインのＮ末端に結合される。

【0142】

一実施形態では、第１のポリペプチドのリンカーは、第２のポリペプチドのリンカーと同じである。

【0143】

一実施形態では、リンカーは、酵素によって切断され得る。一実施形態では、酵素は、ソルターゼＡ、ソルターゼＢ、ソルターゼＣ、ソルターゼＤ、ソルターゼＥ、及びソルターゼＦからなる群から選択される。

【0144】

一実施形態では、リンカーは、配列番号１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴ）；配列番号２（ＬＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号３（ＬＰＥＴＧ）；配列番号４（ＬＰＥＴＧＧ）；配列番号５（ＬＰＸＴＡ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）：配列番号６（ＮＰＸ［Ｔ／Ｓ］［Ｎ／Ｇ／Ｓ］、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号７（ＩＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；及び配列番号８（ＬＡＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）のアミノ酸配列を含む。

【0145】

一実施形態では、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドのいずれか、又は両方はさらに、そのＣ末端に結合される精製タグを含む。

【0146】

一実施形態では、精製タグは、ｈｉｓ－タグ、ｓｔｒｅｐ－タグ、ｆｌａｇ－タグ、Ｔ７－タグ、Ｖ５－ペプチド－タグ、ＧＳＴ－タグ、ＣＢＰ－タグ、ＭＢＰ－タグ及びｃ－Ｍｙｃ－タグからなる群から選択される。一実施形態では、精製タグは、少なくとも５つの連続したヒスチジンアミノ酸残基を含むｈｉｓ－タグである。

【0147】

一実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号９（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤ）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号１０（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含む。

【0148】

一実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号１２（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫ）のアミノ酸配列を含む。

【0149】

一態様では、本発明は、第１の重鎖ポリペプチド、第１の軽鎖ポリペプチド、第２の重鎖ポリペプチド、及び第２の軽鎖ポリペプチドを含む多重特異性抗体に関し、
第１の重鎖ポリペプチドは、ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含む負に荷電したドメインを含み、且つ第１の重鎖ポリペプチド及び第１の軽鎖ポリペプチドは、第１の抗原に結合し；且つ
第２の重鎖ポリペプチドは、ＣＨ３ドメイン及び少なくとも４つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む正に荷電したドメインを含み、且つ第２の重鎖ポリペプチド及び第２の軽鎖ポリペプチドは、第２の抗原に結合する。

【0150】

一実施形態では、多重特異性抗体は、哺乳動物細胞によって発現される。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ細胞又はＣＨＯ細胞である。

【0151】

一態様では、本発明は、多重特異性抗体を生成する方法であって、培養培地中で本発明の多重特異性抗体をコードするベクターを含む細胞を培養する工程を含む方法に関する。

【0152】

一実施形態では、方法はさらに、細胞又は培養培地から多重特異性抗体を回収することを含む。

【0153】

一態様では、本発明は、抗体コンジュゲートを作製するための方法であって、
ａ）請求項４０又は４１のいずれかの多重特異性抗体をもたらす工程；及び
ｂ）抗体を、合成分子（分子は、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ配列を含む）の存在下にてソルターゼ酵素で処理する工程を含む方法に関する。一実施形態では、工程ｂ）は、約２～約１０００の合成分子：抗体モル比率を使用して実施される。

【実施例0154】

ソルターゼ切断可能なＣ末端電荷対タグを介するコンジュゲートされた二重特異性抗体の生成
コンストラクト設計：
重鎖：重鎖（ＨＣ：ＨＣ）対形成：
２つのモデル二重特異性抗体、ＴＮＦα／ＴＬ１Ａ及びＰＡＣ１／ＣＧＲＰ１のためのコンストラクトが設計された。ＴＮＦα及びＰＡＣ１重鎖の両方が延長されて、１７個の残基Ｃ末端延長：ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤ（配列番号１５）を生成するソルターゼ認識配列（ＬＰＥＴＧ（配列番号１３））、短いソルターゼに好都合のリンカー（ＧＥＥＳＴ（配列番号１４））、及び７個のアスパラギン酸残基を含有した。

【0155】

ＴＬ１Ａ及びＣＧＲＰ１重鎖の両方が延長されて、２３個の残基Ｃ末端延長を生成するソルターゼ認識配列（ＬＰＥＴＧ（配列番号１３））、短いソルターゼに好都合のリンカー（ＧＥＥＳＴ（配列番号１４））、７個のリジン残基、及び６個のヒスチジン残基を含有した。
ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６）

【0156】

これらの末端延長を、標準的な方法を使用する部位特異的変異誘発を介して既存の抗体コンストラクトに付加した（Ｃａｒｒｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．２０１１）。

【0157】

重鎖：軽鎖（ＨＣ：ＬＣ）対形成：
正しいＨＣ：ＬＣ対形成は、（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１５；Ｆｌｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．２０１６）に従って設計された。

【0158】

ＴＮＦα／ＴＬ１Ａ二重特異性に関する全長遺伝子配列：
ＴＮＦα重鎖：

【化1】

【0159】

ＴＮＦα軽鎖：

【化2】

【0160】

ＴＬ１Ａ重鎖：

【化3】

【0161】

ＴＬ１Ａ軽鎖：

【化4】

【0162】

ＰＡＣ１／ＣＧＲＰ１に関する全長遺伝子配列：
ＰＡＣ１重鎖：

【化5】

【0163】

ＰＡＣ１軽鎖：

【化6】

【0164】

ＣＧＲＰ１重鎖：

【化7】

【0165】

ＣＧＲＰ１軽鎖：

【化8】

【0166】

クローニング
全ての重鎖に関する遺伝子が、ゴールデンゲート法を使用してベクターｐＴＴ５．２にクローン化されたが（Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００８）、ＴＮＦα及びＴＬ１Ａ軽鎖に関する遺伝子は、ｐＴＴ５．１にクローン化され、ＰＡＣ１及びＣＧＲＰ１軽鎖は、使用するｐＴＴ５にクローン化された。

【0167】

一過性ＨＥＫ ２９３－６ｅ細胞発現
ＨＥＫ ２９３－６ｅ細胞を、３６℃、５％ＣＯ２でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ－１７＋０．１％（１０％の１０ｍＬ／Ｌ）、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８＋５００μＬ／Ｌ Ｇ４１８＋６ｍＭ（３０ｍＬ／Ｌ）Ｌ－グルタミン中で１．５ｅ６のＶＣＤまで増殖させ、１５０ｒｐｍにてフラスコ内で振盪させた後、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ－１７培地（最終培養体積の１０％）、０．５ｍｇ／ＬトランスフェクションＤＮＡ（鎖当たり１．２５ｇ／Ｌ）、２．０ｍｇ／Ｌ ＰＥＩ Ｍａｘ（ｐＨ７．０）からなるトランスフェクション複合体を添加した（Ｌｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．２０１３）。最初のトランスフェクションの３時間後、培養物に０．５％ｗ／ｖ最終濃度のイーストレート、及び２．５ｇ／Ｌのグルコースを供給した。

【0168】

一過的にトランスフェクトされた細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートさせ、１５０ｒｐｍにて７日間フラスコ内で振盪させた後、４０００ＲＰＭで１０分間の遠心分離によって収集した。次に、各収集物からの条件培地を回収し、０．２２μｍのボトルトップフィルターに通して真空濾過した。

【0169】

精製
抗体を、ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏＡ ＨＰレジン（ＧＥ）上のＰｒｏＡ捕捉によって条件培地から精製し、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ３．６において溶出した。１０～２０ｍｌのＰｒｏＡカラム溶出物を、１００～６００μｌの１Ｍ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ ｐＨ９の添加によってｐＨ５．０に調整し、溶出画分をプールし、２倍希釈して、カチオン交換カラムにロードするための調製物中の伝導率を下げた。希釈されたＰｒｏＡ溶出物を、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０中で予め平衡化されたＨｉＴｒａｐ ＳＰカラム（ＧＥ）にロードし、２０カラム体積にわたって０～１ＭのＮａＣｌの直線勾配によって溶出した。高度に荷電したＣ末端延長は、所望の二重特異性ヘテロ二量体抗体（生成された材料の７５～８５％）と単一特異性ホモ二量体抗体夾雑物との間のベースライン分離を可能にした。ＣＥＸ溶出物を、＞５０，０００の希釈倍率に達するまで、１５ｍＬの３０，０００ ＭＷＣＯ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中での段階的な濃縮及び希釈を通して１０ｍＭ酢酸ナトリウム＋９％スクロースｐＨ５に緩衝液交換した。

【0170】

ソルターゼ切断反応
ＳｒｔＡ媒介性加水分解を介して電荷対タグを除去するソルターゼ切断反応（Ｊａｃｏｂｉｔｚ ｅｔ ａｌ．２０１７；Ｔｏｎ－Ｔｈａｔ，Ｈ．，Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｓ．Ｋ．，Ａｌｋｓｎｅ，Ｌ．，ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ ２０００；Ｃｌａｎｃｙ ｅｔ ａｌ．２０１０）を、５０ｍＭ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、ｐＨ５（ここでは、低ｐＨが特異的に選択されて、ポリＫテールにおけるＬｙｓ側鎖（Ｄａｓｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．２０１１）に対する、ＳｒｔＡに触媒される望まれないイソペプチド結合の形成を減少させた）中の１０μＭ二重特異性抗体、２０μＭ ＳｒｔＡ２．０（１２３ Ｂｉｏ）を使用して、３７℃で２４時間実施した。本発明者が知る限り、ＳｒｔＡによるタンパク質からのＣ末端タグの除去は、どこにも報告されていない。さらに、本発明者らのものが、ｐＨ５．０でのタグの効率的なＳｒｔＡ切断を示す最初の報告である。通常、ＳｒｔＡに媒介される切断は、ｐＨ７．０～８．５で実施される。反応の進行は、分析的ＣＥＸによってモニターされ、反応生成物は、ＬＣＭＳによって検証された。２４時間後、反応は、典型的には、８５～９０％完了に達した。次に、完全に脱タグ化された二重特異性抗体を、上記のとおりのカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって残留タグ分子及びソルターゼから精製できた。

【0171】

分子実体による二重特異性抗体のコンジュゲーション
ソルターゼペプチド転移反応
ソルターゼに媒介されるペプチド転移（Ｊａｃｏｂｉｔｚ ｅｔ ａｌ．２０１７；Ｌｅｖａｒｙ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｒａｎｇａｎａｔｈ Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｓｗｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｐｏｐｐ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｐｒｏｆｔ ２０１０；Ｓｐｉｒｉｇ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｃｌａｎｃｙ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．２０１６）を利用して、電荷対タグを除去し、それらを、Ｇｌｙ３、Ｇｌｙ３－ビオチン、Ｇｌｙ３－ＰＥＧ２０、Ｇｌｙ３－ＰＥＧ２０ｋＤ、及びＧｌｙ３－Ａｌｅｘａ６５０を含むソルターゼ認識のためのＧｌｙ３配列を内部に持つ様々な合成分子と置き換えた。反応は、１０～１００倍モル過剰の合成基質：二重特異性抗体と共に０．１～１０％ｗ／ｗ ＳｒｔＡ２．０（１２３ Ｂｉｏ）で１０～１００μＭ二重特異性抗体を使用して、５０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ｐＨ６．５中において３７℃で２４時間実施された。反応の進行は、分析的ＣＥＸによってモニターされ、生成物はＬＣＭＳによって分析された。ソルターゼに媒介されるペプチド転移を介する蛍光Ｇｌｙ３－Ａｌｅｘａ６５０プローブの共有結合がさらに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して予想される分子量での蛍光バンドの出現によって検証された。２４時間後、反応は、典型的には、８５～９９％収率に達した。ペプチド転移生成物を、上記のとおりのカチオン交換クロマトグラフィーを通して未反応材料及びソルターゼから精製した。

【0172】

非標準求核剤によるソルターゼに媒介されるペプチド転移及びそれに続くクリックケミストリーによる蛍光タグの共有結合を介する「クリッカブル」二重特異性抗体の生成
追加のソルターゼに媒介されるペプチド転移反応を実施して、二重特異性のＣ末端に対してクリックケミストリーハンドルを含有する非標準求核剤（Ｒａｎｇａｎａｔｈ Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｔｏｎ－Ｔｈａｔ，Ｈ．，Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｓ．Ｋ．，Ａｌｋｓｎｅ，Ｌ．、及びＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ ２０００）を共有結合するソルターゼの能力を実証した。続いて、このクリッカブル二重特異性を使用して、アジド－ＤＩＢＯクリックケミストリーを介して合成フルオロフォアを共有結合できた。５０μＭのＰＡＣ１／ＣＧＲＰ１二重特異性抗体を、２５ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ ｐＨ６．５中で５ｍＭ ＮＨ２－ＰＥＧ３－Ｎ３及び５μＭ ＳｒｔＡ２．０（１２３ Ｂｉｏ）と３７℃で２４時間インキュベートした。反応の進行は、ＣＥＸによりモニターされ、２４時間後に８７％の最終収率を有した。予想される生成物種の生成は、ＬＣＭＳによって検証された。反応生成物を、上に詳述される方法を使用して、ＣＥＸによって未反応の出発材料から除去した。得られたアジド－官能化二重特異性を、１０倍モル過剰のＤＩＢＯ－Ａｌｅｘａ ４８８と共に１μＭにて室温で２４時間インキュベートした後、フルオロフォアと新たに形成された二重特異性の間の共有結合性の架橋を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上の正しい分子量での蛍光バンドの出現により確認し、さらにＬＣＭＳにより検証した。

【0173】

本明細書において引用又は参照される全ての特許、特許出願、特許出願公報、及び他の公開物は、各々の独立した特許、特許出願、特許出願公報又は公開物が、具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示される場合と同じ範囲で参照により本明細書に組み込まれる。

【0174】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2023-12-08

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

ＣＨ３含有分子であって、
（ａ）ＣＨ３ドメイン及び少なくとも７つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含む負に荷電したドメインを含む第１のポリペプチド；並びに
（ｂ）ＣＨ３ドメイン及び少なくとも７つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む正に荷電したドメインを含む第２のポリペプチド
を含む、ＣＨ３含有分子。

【請求項2】

前記第１のポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び前記負に荷電したドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置され、前記第２のポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び前記正に荷電したドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置される、請求項１に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項3】

前記第１及び第２のポリペプチドの各々がさらに、ＣＨ２ドメインを含む、請求項１又は２に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項4】

前記第１及び第２のポリペプチドの各々がさらに、ヒンジドメインを含む、請求項１～３のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項5】

前記第１及び第２のポリペプチドの各々が、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置されたＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１～４のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項6】

前記分子がさらに、第３及び第４のポリペプチドを含み、前記第３のポリペプチドが、第１のＶＬドメインを含み、且つ前記第４のポリペプチドが、第２のＶＬドメインを含む、請求項１～５のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項7】

前記第３のポリペプチドがさらに、第１のＣＬドメインを含み、前記第１のＶＬ及びＣＬドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において前記第３のポリペプチド内で互いに対して配置され、前記第４のポリペプチドがさらに、第２のＣＬドメインを含み、且つ前記第２のＶＬ及びＣＬドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において前記第４のポリペプチド内で互いに対して配置される、請求項６に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項8】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、アスパラギン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される、請求項１～７のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項9】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、アスパラギン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン残基である、請求項１～８のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項10】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、グルタミン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される、請求項１～９のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項11】

前記第１のポリペプチドがさらに、前記ＣＨ３ドメインの前記Ｃ末端に共有結合されたリンカー配列を含み、且つ前記リンカーが、前記負に荷電したドメインの前記Ｎ末端に結合され；且つ
前記第２のポリペプチドがさらに、前記ＣＨ３ドメインの前記Ｃ末端に共有結合されたリンカー配列を含み、且つ前記リンカーが、前記正に荷電したドメインの前記Ｎ末端に結合される、請求項１～１０のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項12】

前記第１のポリペプチドの前記リンカーが、前記第２のポリペプチドの前記リンカーと同じである、請求項１１に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項13】

前記リンカーが、酵素によって切断され得る、請求項１２に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項14】

前記酵素が、ソルターゼＡ、ソルターゼＢ、ソルターゼＣ、ソルターゼＤ、ソルターゼＥ、及びソルターゼＦからなる群から選択される、請求項１３に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項15】

前記酵素が、ソルターゼＡである、請求項１４に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項16】

前記リンカーが、配列番号１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴ）；配列番号２（ＬＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号３（ＬＰＥＴＧ）；配列番号４（ＬＰＥＴＧＧ）；配列番号５（ＬＰＸＴＡ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）：配列番号６（ＮＰＸ［Ｔ／Ｓ］［Ｎ／Ｇ／Ｓ］、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号７（ＩＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；及び配列番号８（ＬＡＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）のアミノ酸配列を含む、請求項１１～１５のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項17】

前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチドのいずれか、又は両方がさらに、そのＣ末端に結合される精製タグを含む、請求項１～１６のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項18】

前記精製タグが、ｈｉｓ－タグ、ｓｔｒｅｐ－タグ、ｆｌａｇ－タグ、Ｔ７－タグ、Ｖ５－ペプチド－タグ、ＧＳＴ－タグ、ＣＢＰ－タグ、ＭＢＰ－タグ及びｃ－Ｍｙｃ－タグからなる群から選択される、請求項１７に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項19】

前記精製タグが、少なくとも５つの連続したヒスチジンアミノ酸残基を含むｈｉｓ－タグである、請求項１８に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項20】

前記第１のポリペプチドが、配列番号９（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤ）のアミノ酸配列を含み、且つ前記第２のポリペプチドが、配列番号１０（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含む、請求項１～１９のいずれかに記載のＣＨ３含有分子。

【請求項21】

第１の重鎖ポリペプチド、第１の軽鎖ポリペプチド、第２の重鎖ポリペプチド、及び第２の軽鎖ポリペプチドを含む多重特異性抗体であって、
前記第１の重鎖ポリペプチドが、ＣＨ３ドメイン及び少なくとも７つの連続した負に荷電したアミノ酸残基を含む負に荷電したドメインを含み、且つ前記第１の重鎖ポリペプチド及び前記第１の軽鎖ポリペプチドが、第１の抗原に結合し；且つ
前記第２の重鎖ポリペプチドが、ＣＨ３ドメイン及び少なくとも７つの連続した正に荷電したアミノ酸残基を含む正に荷電したドメインを含み、且つ前記第２の重鎖ポリペプチド及び前記第２の軽鎖ポリペプチドが、第２の抗原に結合する、多重特異性抗体。

【請求項22】

前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び前記負に荷電したドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置され、且つ前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び前記正に荷電したドメインが、Ｎ末端からＣ末端方向において互いに対して配置される、請求項２１に記載の多重特異性抗体。

【請求項23】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、アスパラギン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される、請求項２１又は２２に記載の多重特異性抗体。

【請求項24】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、アスパラギン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン残基である、請求項２１～２３のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項25】

前記負に荷電したアミノ酸残基が、グルタミン酸残基であり、且つ前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン、アルギニン、及びヒスチジン残基からなる群から選択される、請求項２１又は２２に記載の多重特異性抗体。

【請求項26】

前記第１の重鎖ポリペプチドがさらに、前記ＣＨ３ドメインの前記Ｃ末端に共有結合されたリンカー配列を含み、且つ前記リンカーが、前記負に荷電したドメインの前記Ｎ末端に結合され；且つ
前記第２の重鎖ポリペプチドがさらに、前記ＣＨ３ドメインの前記Ｃ末端に共有結合されたリンカー配列を含み、且つ前記リンカーが、前記正に荷電したドメインの前記Ｎ末端に結合される、請求項２１～２５のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項27】

前記第１の重鎖ポリペプチドの前記リンカーが、前記第２の重鎖ポリペプチドの前記リンカーと同じである、請求項２６に記載の多重特異性抗体。

【請求項28】

前記リンカーが、酵素によって切断され得る、請求項２７に記載の多重特異性抗体。

【請求項29】

前記酵素が、ソルターゼＡ、ソルターゼＢ、ソルターゼＣ、ソルターゼＤ、ソルターゼＥ、及びソルターゼＦからなる群から選択される、請求項２８に記載の多重特異性抗体。

【請求項30】

前記酵素が、ソルターゼＡである、請求項２９に記載の多重特異性抗体。

【請求項31】

前記リンカーが、配列番号１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴ）；配列番号２（ＬＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号３（ＬＰＥＴＧ）；配列番号４（ＬＰＥＴＧＧ）；配列番号５（ＬＰＸＴＡ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）：配列番号６（ＮＰＸ［Ｔ／Ｓ］［Ｎ／Ｇ／Ｓ］、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；配列番号７（ＩＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）；及び配列番号８（ＬＡＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）のアミノ酸配列を含む、請求項２６～３０のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項32】

前記第１の重鎖ポリペプチド、前記第２の重鎖ポリペプチドのいずれか、又は両方がさらに、そのＣ末端に結合される精製タグを含む、請求項２６～３１のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項33】

前記精製タグが、ｈｉｓ－タグ、ｓｔｒｅｐ－タグ、ｆｌａｇ－タグ、Ｔ７－タグ、Ｖ５－ペプチド－タグ、ＧＳＴ－タグ、ＣＢＰ－タグ、ＭＢＰ－タグ及びｃ－Ｍｙｃ－タグからなる群から選択される、請求項３２に記載の多重特異性抗体。

【請求項34】

前記精製タグが、少なくとも５つの連続したヒスチジンアミノ酸残基を含むｈｉｓ－タグである、請求項３３に記載の多重特異性抗体。

【請求項35】

前記第１重鎖ポリペプチドが、配列番号９（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤ）のアミノ酸配列を含み、且つ前記第２の重鎖ポリペプチドが、配列番号１０（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含む、請求項２６～３４のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項36】

前記多重特異性抗体が、哺乳動物細胞によって発現される、請求項２６～３５のいずれかに記載の多重特異性抗体。

【請求項37】

前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ又はＣＨＯ細胞である、請求項３６に記載の多重特異性抗体。

【請求項38】

多重特異性抗体を生成する方法であって、培養培地中で請求項２６～３５のいずれかに記載の前記多重特異性抗体をコードするベクターを含む細胞を培養する工程を含む方法。

【請求項39】

前記方法がさらに、前記細胞又は前記培養培地から前記多重特異性抗体を回収することを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

抗体コンジュゲートを作製する方法であって、
ａ）請求項３４又は３５のいずれかに記載の多重特異性抗体をもたらす工程；及び
ｂ）前記抗体を、合成分子（前記分子は、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ配列を含む）の存在下にてソルターゼ酵素で処理する工程を含む方法。

【請求項41】

工程ｂ）が、約２～約１０００の合成分子：抗体モル比率を使用して実施される、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記第１のポリペプチドが、配列番号１１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含み、且つ第２のポリペプチドが、配列番号１２（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫ）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＨ３含有分子。

【請求項43】

前記第１の重鎖ポリペプチドが、配列番号１１（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＤＤＤＤＤＤＤＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列を含み、且つ前記第２の重鎖ポリペプチドが、配列番号１２（ＬＰＥＴＧＧＥＥＳＴＫＫＫＫＫＫＫ）のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の多重特異性抗体。

【外国語明細書】