特開 2024-23357 金属結合モチーフを有する複合ポリペプチド及びそれを備える分子構築物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024023357

(43)【公開日】2024-02-21

(54)【発明の名称】金属結合モチーフを有する複合ポリペプチド及びそれを備える分子構築物

(51)【国際特許分類】

   C07K 2/00 20060101AFI20240214BHJP

【ＦＩ】

C07K2/00 ZNA

【審査請求】有

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023197399

(22)【出願日】2023-11-21

(62)【分割の表示】P 2021556739の分割

【原出願日】2020-03-25

(31)【優先権主張番号】62/823,626

(32)【優先日】2019-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517405987

【氏名又は名称】イミュンワーク インク．

【氏名又は名称原語表記】Ｉｍｍｕｎｗｏｒｋ Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100167689

【弁理士】

【氏名又は名称】松本 征二

(72)【発明者】

【氏名】チャン， ツェ・ウェン

(72)【発明者】

【氏名】チュウ， シン・マオ

(72)【発明者】

【氏名】ティアン， ウェイ・ティング

(72)【発明者】

【氏名】ユー， ユー・フシアング

(57)【要約】      （修正有）

【課題】機能的要素を生体分子、特にペプチドベースの分子の特異的な部位に効果的に結合する方法を提供する。
【解決手段】中心コアは、２～１０個のリシン（Ｋ）残基を備え、Ｋ残基のうちの任意の２個は、相互に隣接し又はフィラーによって分離される。ＳＨ反応性基は、中心コアの最初又は最後のＫ残基にそれとアミド結合を形成することによって連結される。他の場合では、中心コアが末端スペーサーをさらに備え、ＳＨ反応性基は、末端スペーサーの末端アミノ酸残基にそれとアミド結合を形成することによって連結される。末端スペーサーは、最初のＫ残基のＮ末端に連結されたＮ末端スペーサー又は最後のＫ残基のＣ末端に連結されたＣ末端スペーサーであり得る。フィラー及び末端スペーサーの各々は、独立して、（１）１～１２個の非Ｋアミノ酸残基又は（２）エチレングリコールユニットの１～１２個の反復を有するＰＥＧ化アミノ酸を備える、リンカーユニット。
【選択図】図７Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

リンカーユニットであって、
中心コアであって、
２～１０個のリシン（Ｋ）残基と、
選択的に、１以上のフィラーであって、前記Ｋ残基のうちの任意の２個が相互に隣接し又は前記フィラーによって分離される、１以上のフィラーと、
選択的に、末端スペーサーであって、該末端スペーサーは、最初のＫ残基のＮ末端に連結されたＮ末端スペーサー又は最後のＫ残基のＣ末端に連結されたＣ末端スペーサーであり、前記フィラー及び前記末端スペーサーの各々は、独立して、（１）１～１２個の非Ｋアミノ酸残基又は（２）エチレングリコール（ＥＧ）ユニットの１～１２個の反復を有するＰＥＧ化アミノ酸を備える、末端スペーサーと、
前記中心コアの前記最初又は最後のＫ残基にそれとアミド結合を形成することによって連結されたＳＨ反応性基、又は前記末端スペーサーが存在する場合、該末端スペーサーの末端アミノ酸残基にそれとアミド結合を形成することによって連結されたＳＨ反応性基であって、前記中心コアは前記ＳＨ反応性基に連結されたアミノ酸残基に又はその付近に局在負電荷を担持する、ＳＨ反応性基と、
を備える中心コアと、
２～１０個の標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素であって、
各標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素が前記コアのＫ残基に連結され、又は
前記リンカーユニットが２～１０個の連結アームをさらに備える場合、各連結アームの一方の末端が前記Ｋ残基のε－アミノ基とアミド結合を形成することを介して前記コアのＫ残基に連結され、各連結アームの他方の末端が各標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素に連結され、前記連結アームは２～１２個の非Ｋアミノ酸残基を備えるペプチド又はＥＧユニットの２～２４個の反復を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である、
２～１０個の標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素と、
を備えるリンカーユニット。

【請求項2】

前記中心コアは、前記ＳＨ反応性基に連結されたアミノ酸残基に又はその付近に少なくとも１つのグルタミン酸（Ｅ）残基又はアスパラギン酸（Ｄ）残基を有して前記負電荷を付与する、請求項１に記載のリンカーユニット。

【請求項3】

前記局在負電荷は、前記ＳＨ反応性基に連結されたアミノ酸残基から開始して最初の５～１５個のアミノ酸残基に存在する、請求項１に記載のリンカーユニット。

【請求項4】

前記エフェクター要素は、負に帯電した化学部分である、請求項１に記載のリンカーユニット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、亜鉛カチオンと錯体を形成することができる短いオリゴペプチドである金属結合モチーフを有する複合ポリペプチドに関する。

【背景技術】

【0002】

バイオコンジュゲーションは、生体分子と、生体分子であってもよいし生体分子でなくてもよい他の分子との間に共有結合を形成するように使用される技術である。生体分子は、一般に、有機体に存在し生物学的プロセスに必須となる分子をいう。生体分子は、天然及び合成のポリペプチド又はタンパク質、炭水化物、脂質、核酸並びに代謝物を含む。

【0003】

抗体又は抗体フラグメントを、毒素（すなわち、抗体－毒素結合体、つまり「ＡＴＣ」）、細胞毒性薬物（すなわち、抗体－薬物結合体、つまり「ＡＤＣ」）及び放射性核種（すなわち、抗体－放射性核種結合体、つまり「ＡＲＣ」）で武装させる概念は、１９７０年代に生じた。そのようなバイオコンジュゲートの合成は、表面接触可能なリシン、システイン又はチロシン残基のカップリング並びに表面接触可能なリシン若しくはトリプトファン残基又はＮ及びＣ末端の修飾などの結合反応を伴うことが多い。それでもなお、上記のアミノ酸残基は親抗体中に豊富にあり、結合反応は通常、ランダムなプロセスである。結果として、結合反応は、化学選択性及び効率を欠き、不均一な生成物をもたらすことが多い。例えば、マイタンシノイド－モノクローナル抗体免疫結合体であるｈｕＮ９０１－ＤＭ１に関する以前の研究は、リシン結合ＡＤＣサンプルは、０から６までの範囲の異なる薬物対抗体比（ＤＡＲ）のＡＤＣを有し、４５０万を超える固有の分子を含む可能性があることを明らかにしている。

【0004】

前述を鑑み、機能的要素を生体分子、特にペプチドベースの分子の特異的な部位に効果的に結合することができる結合戦略に対するニーズが高まっている。本発明は、そのニーズに対する回答であると考えられる。

【発明の概要】

【0005】

以下に、基本的な理解を読者に与えるために開示の簡略化した概要を提示する。この概要は、開示の広範な概観ではなく、本発明の鍵となる／重要な要素を特定するものでも本発明の範囲を記述するものでもない。その専らの目的は、ここに開示される幾つかの概念を、後述のさらに詳細な説明の序章としての簡略な形態で提示することである。

【0006】

一態様では、本開示は、適切な条件下で亜鉛イオンと錯体を形成することができる金属結合モチーフに向けられる。

【0007】

本開示の一実施形態によると、金属結合モチーフはＮ末端からＣ末端の順に又はＣ末端からＮ末端の順にＣＸ_１Ｘ_２ＨＡのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：（配列番号）１）を備え、Ｘ_１はグリシン又はプロリンであり、Ｘ_２はグリシン又はアラニンであり、金属結合モチーフは親ポリペプチドのＮ又はＣ末端に位置する。金属結合モチーフの例示は、これに限定されないが、ＣＧＧＨＡ（配列番号２）、ＣＰＧＨＡ（配列番号３）、ＣＧＡＨＡ（配列番号４）、ＣＰＡＨＡ（配列番号５）、ＧＣＧＧＨＡ（配列番号６）、ＡＣＰＧＨＡ（配列番号７）及びＧＣＰＧＨＡ（配列番号８）を含む。

【0008】

他の態様では、本開示は、上記の態様／実施形態による金属結合モチーフを備える複合ポリペプチドに向けられる。したがって、複合ポリペプチドは、適切な条件下で金属結合モチーフを介して金属イオン（例えば、亜鉛イオン）と錯体を形成することができる。このように、金属イオンとの錯体におけるシステイン残基のスルフヒドリル基は、金属イオンと錯体化されていないシステイン残基のスルフヒドリル基よりも反応性が高い。理解され得るように、上記錯体は、部位特異的な態様で他の化学成分又は生体分子との化学結合を受けることによってバイオコンジュゲートを形成し得る。

【0009】

本開示の一実施形態によると、複合ポリペプチドは、親ポリペプチド及び当該親ポリペプチドのＮ又はＣ末端に位置する金属結合モチーフを備える。ある選択的実施例では、親ポリペプチドと金属結合モチーフとの間に１～１０個のグリシン残基の介在配列があり、一方、他の実施例では、本金属結合モチーフは親ポリペプチドの直前又は直後となる。

【0010】

さらに他の態様では、１以上の機能的要素が、複合ポリペプチドの金属結合モチーフにおけるシステイン残基のスルフヒドリル（ＳＨ）基と反応することによって、本開示の上記態様／実施形態による複合ポリペプチドと共有結合することによって分子構築物（又はバイオコンジュゲート）を形成することができる。

【0011】

本開示の選択的実施形態によると、ＳＨ反応性基は、マレイミド、ヨードアセチル、ブロモアセチル、ビニルスルホン、モノスルホン、メチルスルホニルベンゾチアゾール又は２－ピリジルジチオール基である。

【0012】

ある選択的実施形態では、複合ポリペプチドは二量体の形態であり、例えば、複合ポリペプチドは、Ｆｃ領域、Ｆ（ａｂ´）_２又は抗体の部分を備え得る。これらの場合では、各複合ポリペプチド鎖は、それに結合された１つの機能的要素を有する。

【0013】

本開示の種々の実施形態によると、機能的要素は、治療効果を引き出すことができる小分子成分である。例えば、小分子成分は、細胞毒性薬物、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、又は放射性核種で錯体化されたキレート剤であり得る。あるいは、機能的要素は、全体として親ポリペプチド又は分子構築物の薬物動態的プロファイルを変更することができる脂肪酸鎖である。

【0014】

あるいは、機能的要素は、リンカーユニット（「バンドル」ともいう）の形態である。本発明の特定の実施形態によると、リンカーユニットは、中心コア、及び複数の標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素を備える。

【0015】

具体的には、中心コアは、２～１０個のリシン（Ｋ）残基を備える。Ｋ残基のうちの任意の２個は、相互に隣接し、又はフィラーによって分離される。ある場合では、ＳＨ反応性基は、中心コアの最初又は最後のＫ残基にそれとアミド結合を形成することによって連結される。他の場合では、中心コアが末端スペーサーをさらに備え、ＳＨ反応性基は、末端スペーサーの末端アミノ酸残基にそれとアミド結合を形成することによって連結される。末端スペーサーは、最初のＫ残基のＮ末端に連結されたＮ末端スペーサー又は最後のＫ残基のＣ末端に連結されたＣ末端スペーサーであり得る。フィラー及び末端スペーサーの各々は、独立して、（１）１～１２個の非Ｋアミノ酸残基又は（２）エチレングリコール（ＥＧ）ユニットの１～１２個の反復を有するＰＥＧ化アミノ酸を備える。

【0016】

本開示のある実施形態によると、中心コアは、ＳＨ反応性基に連結されたアミノ酸残基に又はその付近に局在負電荷を担持する。例えば、局在負電荷は、ＳＨ反応性基に連結されたアミノ酸残基から開始するアミノ酸残基内で最初の５～１５個のアミノ酸残基内に存在する。具体的には、局在負電荷は、ＳＨ反応性基に連結されたアミノ酸残基から開始して最初の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸残基内に存在する。局在負電荷は、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）残基などのｐＨ＝７で負に帯電した１以上のアミノ酸残基を含むことによって付与可能である。あるいは、コアは、負に帯電した複数のエフェクター要素に結合され得る。

【0017】

ある実施例では、各標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素は、Ｋ残基のε－アミノ基とアミド結合を形成することを介してコアのＫ残基に連結される。他のある場合では、分子構築物は２～１０個の連結アームをさらに備え、各連結アームの一方の末端がＫ残基のε－アミノ基とアミド結合を形成することを介してコアのＫ残基に連結され、各連結アームの他方の末端が各標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素に連結される。例えば、連結アームは、２～１２個の非Ｋアミノ酸残基を備えるペプチド又はＥＧユニットの２～２４個の反復を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖であり得る。

【0018】

本発明のある実施形態によると、上述した複合ポリペプチドは、分子構築物を対象部位に方向付け又は分子構築物の相対レベルを対象部位において増加させることができる標的化要素として作用する。これらの場合、リンカーユニット（又はバンドル）は、上述した小分子成分などの複数のエフェクター要素を担持し得る。

【0019】

本発明のある実施形態によると、上述した複合ポリペプチドは、被検体において所望の治療効果を引き出すことができるエフェクター要素として作用する。これらの場合、リンカーユニット（又はバンドル）は、被検体において分子構築物又は複合ポリペプチドの薬物動態的プロファイルを変更又は最適化するように、Ｃ_８－２８脂肪酸誘導体又はＣ_８－２８二酸性脂肪酸誘導体のような複数の薬物動態的要素を担持し得る。本発明の種々の実施形態によると、Ｋ残基のε－アミノ基は、Ｃ_８－２８脂肪酸誘導体又はＣ_８－２８二酸性脂肪酸誘導体に連結される。脂肪酸分子は、血清アルブミンと結合することができ、したがって、修飾された親ポリペプチドの運動特性を生体内で向上することができる。

【0020】

また、上述したリンカーユニットも本発明の範囲内にあり、それは本複合ポリペプチドとともに分子構築物を形成することができる。

【0021】

さらに他の態様では、本発明は、本開示の上記態様／実施形態による複数の複合ポリペプチドを担持することができるリンカーユニットに向けられる。本開示の実施形態によると、その中心コアに共有結合で連結された複数の複合ポリペプチドを有するリンカーユニットをポリペプチドバンドルということもある。

【0022】

本発明の特定の実施形態によると、本リンカーユニットは、中心コア及び複数の連結アームを備える。

【0023】

具体的には、中心コアは、２～１０個のリシン（Ｋ）残基及び結合基を備える。Ｋ残基のうちの任意の２個は、相互に隣接し又はフィラーによって分離される。ある場合では、結合基は、中心コアの最初又は最後のＫ残基にそれとアミド結合を形成することによって連結される。結合基の例は、これに限定されないが、アジド、アルキン、テトラジン、シクロオクテン及びシクロオクチン基を含む。他の例では、中心コアは末端スペーサーをさらに備え、結合基は末端スペーサーの末端アミノ酸残基にそれとアミド結合を形成することによって連結される。末端スペーサーは、最初のＫ残基のＮ末端に連結されたＮ末端スペーサー又は最後のＫ残基のＣ末端に連結されたＣ末端スペーサーであり得る。フィラー及び末端スペーサーの各々は、独立して、（１）１～１２個の非Ｋアミノ酸残基又は（２）エチレングリコール（ＥＧ）ユニットの１～１２個の反復を有するＰＥＧ化アミノ酸を備える。

【0024】

ある実施形態によると、各連結アームの一方の末端はＫ残基のε－アミノ基とのアミド結合を形成することを介してコアのＫ残基に連結され、一方で各連結アームの他方の末端はＳＨ反応性基を有する。例えば、連結アームは、２～１２個の非Ｋアミノ酸残基を備えるペプチド又はＥＧユニットの２～２４個の反復を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖であり得る。

【0025】

本発明のある実施形態によると、リンカーユニットは、上記態様／実施形態による２～１０個の複合ポリペプチド、及び１つの機能的要素をさらに備える。各複合ポリペプチドは、ＳＨ反応性架橋化学作用を介して金属結合モチーフにおいてシステイン残基のチオール基に結合される。

【0026】

本発明のある選択的実施形態によると、各連結アームは、ＳＨ反応性基に連結されたアミノ酸残基に又はその付近に局在負電荷を担持する。具体的には、局在負電荷は、ＳＨ反応性基に連結されたアミノ酸残基から開始するアミノ酸残基内で最初の５～１５個のアミノ酸残基内に存在する。例えば、局在負電荷は、ＳＨ反応性基に連結されたアミノ酸残基から開始して最初の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸残基内に存在する。局在負電荷は、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）残基などのｐＨ＝７で負に帯電した１以上のアミノ酸残基を含むことによって付与可能である。

【0027】

本開示の付随する構成及び効果の多くは、添付図面との関連で検討される以下の詳細な説明を参照してより深く理解されることになる。

【0028】

本説明は、添付図面を考慮して読まれる以下の詳細な説明からより深く理解されるはずである。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、本発明の効果的一実施例によるＭａｌ－ペプチド１中心コアのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの結果である。

【図2】図２は、本発明の効果的一実施例によるＭａｌ－ペプチド２－ＤＯＴＡバンドルの構造を示す。

【図3A】図３Ａは、Ｍａｌ－ペプチド２－ＤＯＴＡバンドルの逆相分析用ＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す。

【図3B】図３Ｂは、本発明の効果的一実施例によるＭａｌ－ペプチド２－ＤＯＴＡバンドルのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの結果である。

【図4A】図４Ａは、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１の構造を示す。

【図4B】図４Ｂは、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図5】図５は、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－２の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図6】図６は、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－３の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図7A】図７Ａは、本発明の効果的一実施例による抗ＣＤ１９抗体－ＭＢＭ－１又は抗ＣＤ１９抗体－ＭＢＭ－２の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図7B】図７Ｂは、本発明の効果的一実施例による抗ＣＤ１９抗体－ＭＢＭ－１又は抗ＣＤ１９抗体－ＭＢＭ－２の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図8】図８は、本発明の効果的一実施例による４個の（ｓｃＦｖ α ＣＤ３３）－Ｆｃ－ＭＢＭ分子構築物の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図9】図９は、本発明の効果的一実施例によるＶ_Ｌ－Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｈ－Ｖ_Ｌ構成の双方における組換え（ｓｃＦｖ α ＣＤ２０）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図10A】図１０Ａは、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ ｓｃＦｖ α ＣＤ２０）－Ｆｃ－ＭＢＭ－２の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図10B】図１０Ｂは、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ ｓｃＦｖ α ＣＤ２０）－Ｆｃ－ＭＢＭ－３の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図11A】図１１Ａは、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ ｓｃＦｖ α ＣＡ１９－９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図11B】図１１Ｂは、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ ｓｃＦｖ α ＣＡ１９－９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－２の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図12A】図１２Ａは、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ ｓｃＦｖ α ＣＣ３８）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図12B】図１２Ｂは、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ ｓｃＦｖ α ＣＣ３８）－Ｆｃ－ＭＢＭ－２の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図13A】図１３Ａは、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルの構造を示す。

【図13B】図１３Ｂは、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図14】図１４は、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－２×２ＤＯＴＡバンドルの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図15】図１５は、組換え２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－３×２ＤＯＴＡバンドルの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図16】図１６は、本発明の効果的一実施例による無傷の抗ＣＤ１９抗体－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルの還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図17】図１７は、本発明の効果的一実施例による無傷の抗ＣＤ１９抗体－ＭＢＭ－２×２ＤＯＴＡバンドルｆの還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図18】図１８は、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ３３）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図19】図１９は、本発明の効果的一実施例による組換え２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ２０）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図20】図２０は、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルに対する陰イオン交換カラムのＦＰＬＣ溶出プロファイルを示す。

【図21】図２１は、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルに対する陰イオン交換カラムから採集された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図22】図２２は、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ２０）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルに対する陰イオン交換カラムから採集された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図23】図２３は、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの結果である。

【図24】図２４は、本発明の効果的一実施例による^８９Ｙ^３＋イオンでキレートされた安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの結果である。

【図25】図２５は、本発明の効果的一実施例による^１７５Ｌｕ^３＋イオンでキレートされた安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの結果である。

【図26】図２６は、本発明の効果的一実施例による^１１１Ｉｎで標識化された安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルの放射化学純度のＴＬＣ分析結果である。

【図27】図２７は、本発明の効果的一実施例による^１１１Ｉｎ標識化された安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルのウエスタンブロッティングによって分析された安定性試験の結果を示す。

【図28A】図２８Ａは、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルの染色分析の結果を示す。

【図28B】図２８Ｂは、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルの染色分析の結果を示す。

【図28C】図２８Ｃは、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルの染色分析の結果を示す。

【図28D】図２８Ｄは、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルの染色分析の結果を示す。

【図29】図２９は、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析された安定性試験の結果を示す。

【図30】図３０は、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルのＴＬＣによって分析された安定性試験の結果を示す。

【図31】図３１は、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルの半減期を示す。

【図32】図３２は、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルのＣＤ１９発現異種移植腫瘍に対する標的化効果を示す。

【図33】図３３は、本発明の効果的一実施例による安定化２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ１９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルのＣＤ１９発現異種移植腫瘍における生体内分布分析の結果を示す。

【図34】図３４は、本発明の効果的一実施例によるＡｉｂ－ＧＬＰ－１アゴニスト－Ｃｙｓの構造を示す概略図である。

【図35】図３５は、本発明の効果的一実施例によるＣｙｓ－オクトレオチドの構造を示す概略図である。

【図36】図３６は、本発明の効果的一実施例によるＣｙｓ－オクトレオチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦの結果を示す。

【図37】図３７は、本発明の効果的一実施例によるＣｙｓ－ＰＳＭＡリガンドの構造を示す概略図である。

【図38】図３８は、本発明の効果的一実施例によるＣｙｓ－ＰＳＭＡリガンドのＥＳＩ－ＭＳの結果を示す。

【図39】図３９は、本発明の効果的一実施例によるカルシトニン－ＭＢＭ－１の構造を示す概略図である。

【図40】図４０は、本発明の効果的一実施例によるＭａｌ－ペプチド３－レナリドミドバンドルの構造を示す概略図である。

【図41】図４１は、本発明の効果的一実施例によるＭａｌ－ペプチド３－レナリドミドバンドルのＥＳＩ－ＭＳの結果を示す。

【図42】図４２は、本発明の効果的一実施例によるＭａｌ－ペプチド４－レナリドミドバンドルの構造を示す概略図である。

【図43】図４３は、本発明の効果的一実施例によるＭａｌ－ペプチド５－脂肪酸バンドルの構造を示す概略図である。

【図44】図４４は、本発明の効果的一実施例によるＭａｌ－ペプチド５－脂肪酸バンドルのＥＳＩ－ＭＳの結果を示す。

【図45】図４５は、本発明の効果的一実施例による３－ＤＯＴＡアームリンカーユニットの構造を示す概略図である。

【図46】図４６は、本発明の効果的一実施例による３－ＤＯＴＡアームリンカーユニットのＥＳＩ－ＭＳの結果を示す。

【図47】図４７は、本発明の効果的一実施例によるＭＢＭ－１－ＩＬ－２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図48】図４８は、本発明の効果的一実施例による２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ３８）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２レナリドミドバンドルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図49】図４９は、本発明の効果的一実施例によるオクトレオチド×脂肪酸バンドルの構造を示す概略図である。

【図50A】図５０Ａは、本発明の効果的一実施例によるＡｉｂ－ＧＬＰ－１アゴニスト×脂肪酸バンドルの構造を示す概略図である。

【図50B】図５０Ｂは、本発明の効果的一実施例によるテリパラチド－ＭＢＭ－１×脂肪酸バンドルの構造を示す概略図である。

【図51A】図５１Ａは、本発明の効果的一実施例によるロイプロリド－ＭＢＭ－３×脂肪酸バンドルの構造を示す概略図である。

【図51B】図５１Ｂは、本発明の効果的一実施例によるロイプロリド－ＭＢＭ－３×脂肪酸バンドルのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの結果を示す。

【図52A】図５２Ａは、本発明の効果的一実施例による３－ＤＯＴＡアームリンカーユニット×３ＰＳＭＡリガンドの構造を示す概略図である。

【図52B】図５２Ｂは、本発明の効果的一実施例による３－ＤＯＴＡアームリンカーユニット×３ＰＳＭＡリガンドのＥＳＩ－ＭＳの結果を示す。

【図53】図５３は、本発明の効果的一実施例による精製された２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＡ１９－９）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２ＤＯＴＡバンドルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図54】図５４は、本発明の効果的一実施例による精製された２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ３８）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２レナリドミドバンドルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図55】図５５は、本発明の効果的一実施例による精製された２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ３８）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２レナリドミドバンドルのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの結果を示す。

【図56A】図５６Ａは、本発明の効果的一実施例による親抗ＣＤ３８ｈＩｇＧ１．Ｆｃ抗体の半減期を示す。

【図56B】図５６Ｂは、本発明の効果的一実施例による２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ３８）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２レナリドミドバンドルの半減期を示す。

【図57A】図５７Ａは、本発明の効果的一実施例による２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ３８）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２レナリドミドバンドルの標的化効果を示す。

【図57B】図５７Ｂは、本発明の効果的一実施例による２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ３８）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２レナリドミドバンドルの標的化効果を示す。

【図57C】図５７Ｃは、本発明の効果的一実施例による２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ３８）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２レナリドミドバンドルの標的化効果を示す。

【図58A】図５８Ａは、本発明の効果的一実施例による２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ３８）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２レナリドミドバンドルのＡＤＣＣ効果を示す。

【図58B】図５８Ｂは、本発明の効果的一実施例による２鎖（ｓｃＦｖ α ＣＤ３８）－Ｆｃ－ＭＢＭ－１×２レナリドミドバンドルのＡＤＣＣ効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る形態のみを示すものではない。その記載は、実施例の機能及び実施例を構成して動作させるためのステップの配列を説明する。ただし、同一又は同等の機能及び配列が、異なる実施例によっても実現され得る。

【0031】

便宜上、明細書、実施例及び付随する特許請求の範囲において採用される特定の用語をここにまとめる。ここで特に断りがない限り、本開示で採用される科学的及び技術的用語は、一般的に当業者に理解及び使用される意味を有するものとする。

【0032】

また、文脈によってそれ以外が必要とされない限り、単数形の用語はその複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとすることが理解される。また、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。またさらに、本明細書及び付随する特許請求の範囲を通じて使用される文言「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ又はＣの少なくとも１つ」及び「Ａ、Ｂ及び／又はＣの少なくとも１つ」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢ双方、Ｂ及びＣ双方、Ａ及びＣ双方、そしてＡ、Ｂ及びＣの全てを含むことが意図されている。

【0033】

発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、具体的な実施例で説明される数値は可能な限り厳密に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。また、ここで使用されるように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。有効な／効果的な実施例以外においても、明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及び割合の全ては、いずれの場合においても用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で説明される数値パラメータは、所望のように変化し得る概数である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効数字の数を考慮してかつ通常の四捨五入手段を適用して少なくとも解釈されるべきである。範囲は、ここでは、ある終点から他の終端まで又は２つの終点間として表現され得る。ここに開示される全ての範囲は、特に断りがない限り終点を包含する。

【0034】

ここで使用されるように、用語「標的化要素」は、対象の標的（例えば、細胞表面の受容体又は組織内のタンパク質）に直接又は間接に結合することにより、対象の標的への本分子構築物の輸送を促進する分子構築物の部分をいう。ある実施例では、標的化要素は、分子構築物を標的細胞の付近に方向付けることができる。他の場合では、標的化要素は、標的細胞表面に存在する分子に対して、又は細胞表面に存在する分子に特異的に結合する第２の分子に対して、特異的に結合する。ある場合では、標的化要素は、それが対象の標的に結合されると、本分子構築物とともに内在化され得るので、標的細胞の細胞質ゾル内に移動される。標的化要素は、細胞表面受容体に対する抗体又はリガンドであってもよいし、そのような抗体又はリガンドに結合することによって本分子構築物を標的部位（例えば、選択した細胞の表面）に間接的に標的化する分子であってもよい。疾患部位におけるエフェクター（治療剤）の局在化は、標的化機能のない治療剤との比較として、本分子構築物で強化又は好適化される。局在化は程度又は相対比率の問題であり、疾患部位へのエフェクターの絶対的又は全局在化を意味するものではない。

【0035】

本発明によると、用語「エフェクター要素」は、分子構築物がその標的部位に方向付けられると、生物学的活性（例えば、免疫活性を誘発又は抑制すること、細胞毒性効果を発揮させること、酵素を阻害することなど）又は他の機能的活性（例えば、免疫細胞又は他の治療分子を与えること）を引き起こす分子構築物の部分をいう。「効果」は、治療的又は診断的であり得る。エフェクター要素は、細胞及び／又は細胞外免疫調整因子に結合するものを包含する。エフェクター要素は、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、糖ペプチド、薬剤部分（小分子薬剤及び生物学的製剤の双方）、化合物、元素及び同位体並びにそれらフラグメントのような試剤を備える。

【0036】

本発明によると、「薬物動態的要素」は、分子構築物の以下の特性：溶解性、浄化値、半減期及び生物学的利用能の少なくとも１つを変更することができる要素を意味するものである。例えば、薬物動態的要素は、約２００００～５００００ダルトンの分子量を有する長いＰＥＧ鎖を備え得る。あるいは、薬物動態的要素は、Ｃ_８－２８脂肪酸鎖又はＣ_８－２８二酸性脂肪酸鎖を備え得る。

【0037】

本発明による用語「バイオコンジュゲート」は、本発明の複合ポリペプチド及び１以上の機能的要素を備える分子構築物をいう。

【0038】

第１、第２、第３等の用語は、ここでは種々の要素、構成要素、領域及び／又は部分を記載するのに使用され得るが、これらの要素（並びに構成要素、領域及び／又は部分）はこれらの用語によって限定されるものではない。また、そのような序数の使用は、文脈によって明記されない限り、順列又は順序を示唆するものではない。逆に、これらの用語は、１つの要素を他の要素から区別するのに使用されるにすぎない。したがって、以下に記載する第１の要素は、例示的実施形態の教示から逸脱することなく、第２の要素と表記されてもよい。

【0039】

ここで、用語「連結する（ｌｉｎｋ）」、「結合する（ｃｏｕｐｌｅ）」及び「結合する（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、２つの構成要素を２つの構成要素間の直接の連結を介して又は間接的な連結を介して接続する任意の手段をいうものとして互換可能に用いられる。

【0040】

ここで使用される用語「ポリペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸残基を有するポリマーをいう。通常、ポリペプチドは、長さ２～約２００個の残基を範囲とするアミノ酸残基を備え、それでもそれは２００個超のアミノ酸残基を有する高分子も包含する。アミノ酸配列がここに与えられる場合、Ｌ－、Ｄ－又はベータアミノ酸バージョンの配列も考慮される。ポリペプチドはまた、１以上のアミノ酸残基が対応の天然に生じるアミノ酸及び天然に生じるアミノ酸ポリマーの人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーを含む。さらに、当該用語は、ペプチド結合によって、又は例えば、ペプチド連結がα－エステル、β－エステル、チオアミド、ホスホルアミド、カルボメート、ヒドロキシレートなどによって置換される他の「修飾連結」によって接合されたアミノ酸に当てはまる。

【0041】

特定の実施形態では、ここに記載される配列のいずれかを備えるアミノ酸の保存的な置換が考慮される。種々の実施形態では、１、２、３、４又は５個の異なる残基が置換される。用語「保存的な置換」は、分子の活性（例えば、生物学的又は機能的な活性及び／又は特異性）を実質的に変更しないアミノ酸置換を反映するのに使用される。通常、保存的なアミノ酸置換は、１つのアミノ酸を類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水度）を有する他のアミノ酸に置換することを伴う。ある保存的な置換は、親残基から最小限に異なる非標準（例えば、希少性、合成など）のアミノ酸によって標準アミノ酸が置換される「類似置換」を含む。アミノ酸類似体は、親構造に対する大きな変化なく標準アミノ酸に合成的に由来するものであり、異性体であり、又は代謝物質前駆体である。本出願では、アミノ酸残基の（１）その側鎖にアミン基を含むリシン、（２）その側鎖にチオール基を含むシステイン、（３）それらの側鎖にヒドロキシル基を含むセリン及びスレオニン、並びに（４）それらの側鎖にカルボキシル基を含むアスパラギン酸及びグルタミン酸が、アミノ酸の特徴的な４基とみなされる。アミノ酸のこれらの４基の各々は、それらの側鎖において、種々の化学成分に結合するために応用され得る固有の官能基を含む。側鎖に同じ官能基を含む非天然アミノ酸が、同様の目的のために置換されてもよい。

【0042】

特定の実施形態では、ここに記載する配列のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％又は９８％の配列同一性を備えるポリペプチドも考慮される。

【0043】

ここで同定されるポリペプチド配列に関する「パーセンテージ（％）アミノ酸配列同一性」は、最大パーセントの配列同一性を得るように必要に応じて配列の整列及びギャップの導入を行った後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、特定のペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるポリペプチド残基のパーセンテージとして定義される。パーセンテージ配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いる当技術内の種々の態様で達成可能である。当業者であれば、対比されている配列の全長にわたって最大アライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のため、２つのポリペプチド酸配列間の配列比較は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によってオンラインで提供されるコンピュータプログラムＢｌａｓｔｐ（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ）によって実行された。所与のポリペプチド酸配列Ｂに対する所与のポリペプチド酸配列Ａのパーセンテージアミノ酸配列同一性（あるいは、所与のポリペプチド酸配列Ｂに対して所定％のアミノ酸配列同一性を有する所与のポリペプチド酸配列Ａということもできる）は、以下の定式で計算される。
Ｘ／Ｙ×１００％
ここで、Ｘは、そのプログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて配列アライメントプログラムＢＬＡＳＴによる完全な一致としてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、いずれか短い方のＡ又はＢにおけるアミノ酸残基の合計数である。

【0044】

ここで使用される用語「ＰＥＧ化されたアミノ酸」は、１つのアミノ基及び１つのカルボキシル基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖をいう。一般に、ＰＥＧ化されたアミノ酸は、ＮＨ_２－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－ＣＯ_２Ｈの式を有する。本開示では、ｎの値は、１～２０の範囲であり、好ましくは２～１２の範囲である。

【0045】

ここで使用される用語「結合部分」は、化学的に反応性であり、他の化学ユニットに共有結合することができる１以上の官能基（「結合基」ともいう）を有する分子をいう。官能基の非限定的な例は、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、チオール、アミン、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）、ＳＨ反応性基（例えば、マレイミド、ハロアセチル、スルホン又はピリジルジスルフィド）、ヨード、ヨードアセトアミドアジド、アルキン、テトラジン、シクロオクテン及びシクロオクチン基を含む。本開示の実施形態によると、本分子構築物の結合部分は、２つの官能基を有し、一方は、結合部分がコアのＮ又はＣ末端アミノ酸残基に結合されるように、コアの末端アミノ酸残基のアルファアミノ又はカルボキシル基と、その間のアミド結合を形成することを介して結合するためのカルボキシル又はアミン基であり、他方は、ＳＨ反応性架橋化学作用を介して第２の元素と結合するためのＳＨ反応性基である。

【0046】

ここで使用されるように、ポリペプチドに関する用語「末端」とは、ポリペプチドのＮ端又はＣ端におけるアミノ酸残基のことをいう。ポリマーに関しては、用語「末端」とは、ポリマー骨格の端部に位置するポリマー（例えば、本開示のポリエチレングリコール）の構成単位のことをいう。本明細書及び特許請求の範囲において、用語「遊離末端」は、末端アミノ酸残基又は構成単位が他のいずれの分子にも化学結合されていないことを意味するのに使用される。

【0047】

用語「抗原」又は「Ａｇ」は互換可能に使用され、免疫反応を引き起こす分子のことをいう。この免疫反応は、分泌型、体液性及び／又は細胞性抗原特異的反応を伴い得る。本開示では、用語「抗原」は、タンパク質、ポリペプチド（その突然変異体又は生物学的に活性なフラグメントを含む）、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸又はこれらの組合せのいずれかであり得る。

【0048】

本明細書及び特許請求の範囲において、用語「抗体」又は「抗体フラグメント」は、広義で使用され、完全にアセンブルされた抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ／Ｆａｂ´）、（ジスルフィド結合によって相互に連結された２つの抗原結合Ｆａｂ部分を有する）Ｆ（ａｂ´）_２フラグメント、可変フラグメント（Ｆｖ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、二特異性一本鎖可変フラグメント（ｂｉ－ｓｃＦｖ）、ナノボディ（シングルドメイン抗体ｓｄＡｂともいう）、ユニボディ及びディアボディなど、抗原と結合する抗体フラグメントを包含する。「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合領域又は可変領域を備える。抗体フラグメントは、ヒトγ４又はγ１免疫グロブリン由来の一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＮ又はＣ末端に融合された一対のｓｃＦｖを備え得る。通常、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされた１以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。周知の免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常域遺伝子、並びに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンとして分類され、それは同様に免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ定義する。標準的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体からなることが知られている。各四量体は、各対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有して、２つの同一のポリペプチド鎖対で構成される。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれそれらの軽鎖及び重鎖をいう。本開示の実施形態によると、抗体フラグメントは、天然抗体を修飾することによって又は組換えＤＮＡ法を用いたデノボ合成によって生成され得る。本開示の特定の実施形態によると、抗体及び／又は抗体フラグメントは、二特異性であってもよく、種々の構成のものであり得る。例えば、二特異性抗体は、２つの異なる抗原結合部分（可変領域）を備え得る。種々の実施形態において、二特異性抗体は、ハイブリドーマ技術又は組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。特定の実施形態では、二特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する。抗体フラグメントを採用する分子構成の多くにおいて、抗体フラグメントは、抗体フラグメントと同じ抗原成分に結合する抗体模倣物に代替され得る。抗体模倣物は、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、フィロマー、アンキリン、アビマー及びその他を含む。

【0049】

ここで使用される用語「特異的に結合する」は、約１×１０^－６Ｍ、１×１０^－７Ｍ、１×１０^－８Ｍ、１×１０^－９Ｍ、１×１０^－１０Ｍ、１×１０^－１１Ｍ、１×１０^－１２Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）で抗原と結合し、及び／又は非特異抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で抗原に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントの能力をいう。

【0050】

ここで使用される用語「処置／治療／処理」は予防的（例えば、予防の）治癒的又は緩和的な処置／治療／処理を含み、ここで使用される用語「処置／治療／処理している」も予防的（例えば、予防の）治癒的又は緩和的な処置／治療／処理を含む。特に、ここで使用される用語「処置／治療／処理している」は、上記特定の疾患、障害及び／又は状態の１以上の症状又は特徴の部分的又は完全な軽減、改善、解放、発症の遅延、進行の阻害、重症度の低減及び／又は発症率の低減を目的で、医学的状態、医学的状態に関連する症状、医学的状態に対して二次的な疾患若しくは障害、又は医学的状態に対する素質を有する被検体への本分子構築物又は当該分子構築物を備える薬学的組成物の適用又は投与をいう。処置／治療／処理は、疾患、障害及び／若しくは病状に関連する進展する病理のリスクを減少させる目的のために、疾患、障害及び／若しくは病状の兆候を示さない被検体、又は疾患、障害及び／若しくは病状の初期の兆候のみを示す被検体に施され得る。

【0051】

ここで使用される用語「有効量」は、所望の治療上の反応をもたらすのに充分な量の本分子構築物をいう。薬剤の有効量は、疾患又は状態を治癒することは要件とされないが、疾患又は病状の発症が遅延、阻害若しくは防止され又は疾患及び病状の症状が改善されるように疾患又は状態に対する処置を与える。有効量は、指定された期間を通して１、２又はそれ以上の回数に投与される適切な形態で１、２又はそれ以上の投与量に分割され得る。具体的な有効な又は充分な量は、処置されている特定の状態、患者の肉体的状態（例えば、患者の体重、年齢又は性別）、処置されている被検体の種類、処置の継続期間、（それがある場合には）併用療法の性質、並びに採用される具体的処方及び化合物又はその誘導体の構造といった要因で変化することになる。有効量は、例えば、活性成分の合計質量（例えば、グラム、ミリグラム又はマイクログラム）又は体重に対する活性成分の質量の比、例えば、キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）として表現され得る。

【0052】

用語「適用」及び「投与」は、ここでは、その処置を必要とする被検体への本発明の分子構築物又は薬学的成分の適用を意味するものとして互換可能に使用される。

【0053】

用語「被検体」及び「患者」は、ここでは互換可能に使用され、本発明の分子構築物、薬学的組成物及び／又は方法によって処置可能なヒト種を含む動物を意味することが意図される。用語「被検体」又は「患者」は、一方の性別が具体的に示されない限り、雄及び雌の両方の性別をいうものとする。したがって、用語「被検体」又は「患者」は、本開示の処置方法から利益を受け得る任意の哺乳動物を含む。「被検体」又は「患者」の例は、これに限定されないが、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及び家禽を含む。例示的実施形態では、患者はヒトである。用語「哺乳動物」は、ヒト、霊長類、ウサギ、ブタ、ヒツジ及び畜牛などの家畜及び農場動物、並びに動物園、スポーツ又はペットの動物、マウス及びラットなどの齧歯類を含む哺乳類の全てのメンバーをいう。用語「非ヒト哺乳動物」は、ヒト以外の哺乳類の全てのメンバーをいう。

【0054】

本発明の種々の実施形態によると、用語「金属結合モチーフ」は、Ｚｎ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｍｎ^２＋又はＣｕ^２＋などの金属イオンを結合することができる短いオリゴペプチドのことをいう。ある実施形態では、亜鉛イオンを結合することができる金属結合モチーフを「亜鉛結合モチーフ」ともいい、それでも当業者には分かるように、そのようなタグは、亜鉛イオンと同様の物理的及び／又は化学的特性の他の金属イオンとも結合し得る。

【0055】

本開示は、少なくとも、親ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合可能な幾つかの新規な金属結合モチーフの設計に基づく。本金属結合モチーフは、幾つかの態様においてバイオコンジュゲートの構築に対して有利である。第１に、本金属結合モチーフは、ヒト由来の配列であるので、ヒトゲノムの部分ではない従来の金属結合モチーフと比較して免疫原性が低い。第２に、本金属結合モチーフを有する複合ポリペプチドの発現収率は望ましいものであり、結果として発現した複合ポリペプチドは保存、結合及び精製プロセス中に非常に安定的である。第３に、本金属結合モチーフは、親ポリペプチドのシステイン残基がほとんど不活性である条件下で、金属結合モチーフのシステイン残基のＳＨ基と機能的要素のＳＨ反応性基との間の容易な部位特異的結合反応を可能とする。そこで、本発明は、多機能バイオコンジュゲートを構築するための多様な手段を与える。本発明の態様及び実施形態を以下に与える。

【0056】

（Ｉ）金属結合モチーフ
本開示の第１の態様は、適切な条件下でＺｎ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｍｎ^２＋又はＣｕ^２＋などの金属イオンと錯体を形成可能な金属結合モチーフに向けられる。

【0057】

本開示の一実施形態によると、金属結合モチーフは、Ｘ_１がグリシン又はプロリンであり、Ｘ_２がグリシン又はアラニンであるとして、Ｎ末端からＣ末端の順又はＣ末端からＮ末端の順でＣＸ_１Ｘ_２ＨＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を備える。金属結合モチーフの例示は、これに限定されないが、ＣＧＧＨＡ（配列番号２）、ＣＰＧＨＡ（配列番号３）、ＣＧＡＨＡ（配列番号４）、ＣＰＡＨＡ（配列番号５）、ＧＣＧＧＨＡ（配列番号６）、ＡＣＰＧＨＡ（配列番号７）及びＧＣＰＧＨＡ（配列番号８）を含む。

【0058】

（ＩＩ）金属結合モチーフを含む複合ポリペプチド
他の態様では、本開示は、上記の態様／実施形態による金属結合モチーフを備える複合ポリペプチドに向けられる。したがって、複合ポリペプチドは、適切な条件下で金属結合モチーフを介して金属イオンと錯体を形成することができる。

【0059】

本開示の一実施形態によると、複合ポリペプチドは、本発明の上記態様／実施形態による親ポリペプチド及び金属結合モチーフを備える。種々の実施形態では、金属結合モチーフは、親ポリペプチドのＮ又はＣ末端に、直接又は１以上の介在するアミノ酸残基とともに融合される。選択的な実施形態では、介在する配列は、２～１０個のグリシン残基を有し得る。

【0060】

本開示の種々の実施形態によると、金属結合モチーフが親ポリペプチドのＮ末端に位置する場合、金属結合モチーフは、Ｘ_１がグリシン又はプロリンであり、Ｘ_２がグリシン又はアラニンであるとして、Ｎ末端からＣ末端の順又はＣ末端からＮ末端の順で配列ＣＸ_１Ｘ_２ＨＡ（配列番号１）を有し得る。同様に、金属結合モチーフが親ポリペプチドのＣ末端に位置する場合、金属結合モチーフは、Ｘ_１がグリシン又はプロリンであり、Ｘ_２がグリシン又はアラニンであるとして、Ｎ末端からＣ末端への順又はＣ末端からＮ末端への順でＣＸ_１Ｘ_２ＨＡ（配列番号１）の配列を有し得る。

【0061】

本開示の種々の実施形態によると、親ポリペプチドは、ペプチドホルモン又はその同等物であり得る。ペプチドホルモンの同等物は、当業者に周知である機能的フラグメント、前駆体、類似体又は誘導体を含む。ここでの使用に適切なペプチドホルモンの非限定的な例は、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、アミリン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、カルシトニン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、グレリン、グルカゴン、成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インスリン、レプチン、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、オキシトシン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、プロラクチン、レニン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、バソプレシン及び血管作動性腸管ペプチドを含む。例えば、インスリンの同等物は、これに限定されないが、リスプロ、アスパルト、グルリジン、デテミル、デグルデク及びグラルギンを含む。カルシトニンの同等物は、これに限定されないが、プロカルシトニン及びアドレノメデュリンを含む。ソマトスタチンの同等物は、これに限定されないが、オクトレオチド及びランレオチドを含む。

【0062】

特定の実施形態では、親ポリペプチドは、細胞表面受容体に結合するペプチド模倣リガンドであり得る。ペプチド模倣体は、ペプチドを模倣するように設計された小さなタンパク質様の鎖である。例えば、ＰＳＭＡ－結合親和性を有する一連のグルタミン酸－尿素－リシンベースのペプチド模倣体が設計されている。

【0063】

選択的な実施形態では、親ポリペプチドは、モノクローナル抗体、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭなどの抗体であり得る。抗体全体の機能的フラグメント又は誘導体もまた本開示の範囲によって包含され、その例は、これに限定されないが、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、タンデム ジ－ｓｃＦｖ、タンデム トリ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ´）２フラグメント、Ｆｄ、ドメイン抗体及びミニボディを含む。

【0064】

代替的に、親ポリペプチドは、サイトカイン又はその同等物であり得る。サイトカインの同等物は、当業者に周知である機能的フラグメント、前駆体、類似体又は誘導体を含む。サイトカインの例示は、これに限定されないが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ－α）、ＩＦＮ－γ、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を含む。

【0065】

ある実施形態では、親ポリペプチドは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）、タンデム ジ－ｓｃＦｖ及びタンデム トリ－ｓｃＦｖなどの単鎖抗体フラグメントであり得る。他のある実施形態では、親ポリペプチドは、免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖に由来する抗体フラグメントであってもよく、本複合ポリペプチドは、全長抗体の一部、フラグメント結晶化可能領域（Ｆｃ領域）、フラグメント抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）_２、Ｆａｂ´、Ｆｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃ（Ｆｖ）_２、ダイアボディ、Ｆｄ、Ｆｄ´又はミニボディを備える。免疫グロブリンは、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、ＩｇＥ又はＩｇＧに由来し得る。抗体は、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体であり得る。

【0066】

特定の実施形態では、抗体（及びその機能的フラグメント）は、びまん性腫瘍に関連し、及び／又はびまん性腫瘍上に過剰発現する細胞表面抗原に特異的である。そのような細胞表面抗原の例示は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ７２ａ、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９を含む。これらの細胞表面抗原に対する抗体（又はそのフラグメント若しくは誘導体）は、それを備える分子構築物を疾患部位に方向付けることができる標的化要素として使用可能である。他の選択的な実施形態では、抗体（及びその機能的フラグメント又は誘導体）は他の細胞表面抗原に特異的であり、そのような抗体は人体内で治療効果を引き起こすことができ、そのような細胞表面抗原の例はＣＤ３、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）及びプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を含む。さらに代替的に、抗体（又はそのフラグメント）は、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、ＣＡ１２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ガングリオシドＧＤ２、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、メソテリン、ムチン関連Ｔｎ、シアリルＴｎ、グロボＨ、ステージ特異的胎児性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）などの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的であり得る。各ＴＡＡは１以上のタイプの固形腫瘍の細胞表面上に過剰発現することが多く、そのようなＴＡＡに対する抗体はここに提案される分子構築物の一部として標的化要素として使用可能である。他のある選択的な実施形態では、抗体（又はそのフラグメント）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、突然変異体ＥＧＦ、エピレグリン、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）からなる群から選択される成長因子に特異的である。ある実施形態では、抗体（又はそのフラグメント）は、上記のサイトカインに特異的である。

【0067】

（ＩＩＩ）機能的要素及び金属結合モチーフを含む複合ポリペプチドの分子構築物
さらに他の態様では、１以上の機能的要素を、複合ポリペプチドの金属結合モチーフ中のシステイン残基のスルフヒドリル（ＳＨ）基と反応させることにより、本開示の上記態様／実施形態による複合ポリペプチドと共有結合することができ、それによりこの発明による分子構築物（又はバイオコンジュゲート）を形成する。特に、複合ポリペプチドの金属結合活性は、部位特異的結合を可能とし、それにより均質な分子構築物をもたらす。

【0068】

本開示の選択的な実施形態によると、ＳＨ反応性基は、マレイミド、ヨードアセチル、ブロモアセチル、ビニルスルホン、モノスルホン、メチルスルホニルベンゾチアゾール又は２－ピリジルジチオール基である。

【0069】

理解され得るように、機能的要素は、被検体の体内で所望の治療効果を引き起こすことができるエフェクター分子であり得る。代替的に、機能的要素は、分子構築物を被検体の体内の標的部位に方向付けることができる標的化要素であり得る。さらに代替的に、機能的要素は、被検体の体内での分子構築物の薬物動態的プロファイルを変更可能な薬物動態的要素である。さらに代替的に、機能的要素は、リンカーユニット又はバンドルの形態である。本発明の特定の実施形態によると、リンカーユニットは、中心コア、及び複数の標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素を備え、上記リンカーユニットの構造を以下の章（ＩＶ）で説明する。

【0070】

本発明で使用可能なエフェクター分子の例は、これに限定されないが、（単独又は放射性核種と錯体化された）細胞毒性薬物、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト又はキレート剤を含む。

【0071】

理解され得るように、特定の細胞に対して細胞毒性効果を表す細胞毒性薬物は、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン及びメゲストロール）、ＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴスクルクリン及びロイプロリド）、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド及びビカルタミド）、光線力学的療法（例えば、ベルトポルフィン、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４及びデメトキシ－ヒポクレリンＡ）、ナイトロジェンマスタード類（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド、クロラムブシル、エストラムスチン及びメルファラン）、ニトロソウレア類（例えば、カルムスチン及びロムスチン）、アルキルスルホン酸塩（例えば、ブスルファン及びトレオスルファン）、トリアゼン類（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド）、白金含有化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）、ビンカアルカロイド類（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビン）、タキソイド類（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル及びタキソール）、エピポドフィリン類（例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、トポテカン、９－アミノカンプトテシン、カンプトイリノテカン、イリノテカン、クリスナトール、ミトマイシンＣ）、抗代謝物、ＤＨＦＲ阻害剤（例えば、メトトレキサート、ジクロロメトトレキサート、トリメトレキサート、エダトレキサート）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ阻害剤（例えば、ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリン及びＥＩＣＡＲ）、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤（例、ヒドロキシウレア及びデフェロキサミン）、ウラシル類似体（例えば、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、ラチトレキセド、テガフール－ウラシル、カペシタビン）、シトシン類似体（例えば、シタラビン（ａｒａＣ）、シトシンアラビノシド及びフルダラビン）、プリン類似体（例えば、メルカプトプリン及びチオグアニン）、ビタミンＤ３類似体（例えば、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３及びＫＨ１０６０）、イソプレニル化阻害剤（例えば、ロバスタチン）、ドーパミン作動性神経毒素（例えば、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン）、細胞周期阻害剤（例えば、スタウロスポリン）、アクチノマイシン（例えば、アクチノマイシンＤ、ダクチノマイシン）、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＢ２、ペプロマイシン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン）、ＭＤＲ阻害剤（例えば、ベラパミル）、Ｃａ２＋ ＡＴＰａｓｅ阻害剤（例えば、タプシガルギン）、イマチニブ、サリドマイド、レナリドミド、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、アキシチニブ、ボスチニブ、セディラニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、ネラチニブ、ニロチニブ、セマキサニブ、スニチニブ、トセラニブ、バンデタニブ、バタラニブ、リツキシマブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、エベロリムス、テムシロリムス）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス及びリダフォロリムス）、オブリメルセン、ゲムシタビン、カルミノマイシン、ロイコボリン、ペメトレキセド、シクロホスファミド、ダカルバジン、プロカルビジン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、カンパテテシン、プリカマイシン、アスパラギナーゼ、アミノプテリン、メトプテリン、ポルフィロマイシン、メルファラン、ロイロシジン、ロイロシン、クロラムブシル、トラベクテジン、プロカルバジン、ディスコデルモリド、カルミノマイシン、アミノプテリン又はヘキサメチルメラミンであり得る。本開示の具体的な一実施形態によると、細胞毒性薬物は、メルタンシン、オーリスタチン、メイタンシン、ドキソルビシン、カリケアマイシン又はカンプトテシンである。

【0072】

Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストの例示は、リポテイコ酸、グルカン、モトリモド、イミキモド、レシキモド、ガルジキモド、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＤＯＮ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、モノホスホリルリピドＡ及びザイモサンを含む。

【0073】

種々の実施形態では、キレート剤は、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´´－四酢酸（ＤＯＴＡ）、Ｎ，Ｎ´´－ビス［２－ヒドロキシ－５－（カルボキシエチル）ベンジル］エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ´´－二酢酸（ＨＢＥＤ－ＣＣ）、１，４，７－トリアザシクロ－ノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、２－（４，７－ビス（カルボキシメチル）－１，４，７－トリアゾナン－１－イル）ペンタン二酸（ＮＯＤＡＧＡ）、２－（４，７，１０－トリス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル）ペンタン二酸（ＤＯＴＡＧＡ）、１，４，７－トリアザシクロ－ノナンホスフィン酸（ＴＲＡＰ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１－［メチル（２－カルボキシエチル）ホスフィン酸］－４，７－ビス［メチル（２－ヒドロキシメチル）ホスフィン酸］（ＮＯＰＯ）、３，６，９，１５－テトラアザビシクロ［９．３．１．］ペンタデカ－１（１５），１１，１３－トリエン－３，６，９－三酢酸（＝ＰＣＴＡ）、Ｎ´｛５－［アセチル（ヒドロキシ）アミノ］ペンチル｝－Ｎ－［５－（｛４－［（５－アミノペンチル）（ヒドロキシ）アミノ］－４－オキソブタノイル｝アミノ）ペンチル］－Ｎ－ヒドロキシスクシンアミド（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、トランス－シクロヘキシル－ジエチレントリアミン五酢酸（ＣＨＸ－ＤＴＰＡ）、１－オキサ－４，７，１０－トリアザシクロドデカン－４，７，１０－三酢酸（オキソ－Ｄｏ３Ａ）、ｐ－イソチオシアナトベンジル－ＤＴＰＡ（ＳＣＮ－Ｂｚ－ＤＴＰＡ）、１－（ｐ－イソチオシアナトベンジル）－３－メチル－ＤＴＰＡ（１Ｂ３Ｍ）、２－（ｐ－イソチオシアナトベンジル）－４－メチル－ＤＴＰＡ（１Ｍ３Ｂ）及び１－（２）－メチル－４－イソシアナトベンジル－ＤＴＰＡ（ＭＸ－ＤＴＰＡ）からなる群から選択される。ある実施形態では、放射性核種は^１１１Ｉｎ、^１３１Ｉ又は^１７７Ｌｕであり、他の実施形態では、放射性核種は^９０Ｙ、^６８Ｇａ、^９９ｍＴｃ、^６４Ｃｕ、^１５３Ｇｄ、^１５５Ｇｄ、^１５７Ｇｄ、^２１３Ｂｉ、^２２５Ａｃ又はＦｅであり得る。

【0074】

他の実施形態では、この発明の分子構築物に対するエフェクター要素の選択はまた、（１）（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２／ＩＬ－２３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＢＡＦＦのような）炎症性サイトカインに特異的な抗体フラグメント、（２）ＲＡＮＫＬに特異的な抗体フラグメント、（３）Ｔ細胞及びＮＫ細胞上に発現されるＣＤ３及びＣＤ１６ａに対する抗体フラグメント、（４）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４及び他の免疫チェックポイントに特異的な抗体フラグメント、並びに（５）免疫増強サイトカイン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α）を含む、広範囲のペプチドベースの分子を包含する。

【0075】

本発明の実施形態での使用による標的化要素は、処置される疾患に応じて選択され得る。例えば、種々の疾患を処置するための標的化要素は、（１）Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、α－アグリカン及びオステオネクチンなどの、関節、皮膚又は骨の細胞外マトリクスの成分に特異的な抗体フラグメント、（２）ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ５２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ；ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ７８、ＣＤ１３８；ＣＤ３１９、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ３０；又はＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６５及びＣＤ１１ｃなどの分化マーカーのクラスターに特異的な抗体フラグメント、並びにリンパ性及び骨髄性系統の細胞及び形質細胞の他の表面抗原、又は（３）ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＨＥＲ３、Ｔｎ、グロボＨ、ガングリオシドＧＤ－２、ＣＡ１２５、ＣＡ１９－９及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの、固形腫瘍の細胞表面上に過剰発現される受容体又は抗原に特異的な抗体フラグメントを含む。

【0076】

標的化要素はまた、ホルモン、成長因子又はサイトカインの抗体であってもよく、ホルモン、成長因子又はサイトカインの受容体は、腫瘍細胞又は他の疾患細胞上に発現される。他の幾つかの選択的な実施形態では、本分子構築物の標的化要素は、成長因子である。

【0077】

本開示のある実施形態によると、本開示の親ポリペプチド及び機能的要素の少なくとも一方は、成長因子に特異的な抗体フラグメントである。ある実施形態では、成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、突然変異体ＥＧＦ、エピレグリン、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）からなる群から選択される。上記と同様の概念で、標的化要素が成長因子（例えば、ＥＧＦ）である場合、本分子構築物は、受容体を発現する細胞／組織／器官（例えば、ＥＧＦ受容体がその上に発現される腫瘍細胞）を特異的に標的化することができる。エフェクター要素が成長因子（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ）に特異的な抗体フラグメントである場合、それは、成長因子関連シグナル伝達経路（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ誘導性血管新生）を捕捉及び中和し得る。効果的一実施例によると、本分子構築物は、エフェクター要素がＶＥＧＦ－Ａに特異的な抗体フラグメントである固形腫瘍の処置に有用である。

【0078】

薬物動態的要素の例は、Ｃ_８－２８脂肪酸誘導体又はＣ_８－２８二酸性脂肪酸誘導体である。各薬物動態的要素は、Ｋ残基のε－アミノ酸基を介してＫ残基の１つと連結される。本開示の種々の実施形態によると、機能的要素は、オクタン酸、ペラルゴン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ヘンエイコサン酸、ベヘン酸、トリコサン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リシノール酸又はバクセン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）に由来する脂肪酸誘導体である。本開示の特定の実施形態によると、機能的要素は、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、ブラッシル酸、テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、タプシン酸、ヘプタデカン二酸又はオクタデカン二酸に由来する二酸性脂肪酸誘導体である。ある実施形態では、本機能的要素は、ミリスチン酸又はパルミチン酸に由来する。他の実施形態では、本機能的要素は、テトラデカン二酸又はタプシン酸に由来する。

【0079】

（ＩＶ）金属結合モチーフを含む複合ポリペプチドと結合するためのリンカーユニット
ある選択的な実施形態では、上記複合ポリペプチドと結合された機能的要素は、バンドル又はリンカーユニットの形態となる。本発明の特定の実施形態によると、リンカーユニットは、中心コア、及び複数の標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素を備える。理解され得るように、そのようなリンカーユニットもまた、本開示の保護範囲に含まれる。

【0080】

本発明の特定の実施形態によると、リンカーユニットは、上記態様／実施形態による中心コア、及び複数の標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素を備える。

【0081】

具体的には、中心コアは、３～１２０アミノ酸残基長を有するポリペプチドであり、２～１０個のリシン（Ｋ）残基を備え、例えば、本コアは、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のＫ残基を備え得る。Ｋ残基の任意の２個は相互に隣接し、又はフィラーによって分離される。ある場合では、ＳＨ反応性基は、中心コアの最初又は最後のＫ残基に、それとアミド結合を形成することによって連結される。他の場合では、中心コアは末端スペーサーをさらに備え、ＳＨ反応性基は末端スペーサーの末端アミノ酸残基に、それとアミド結合を形成することによって連結される。このようにして、親ポリペプチドのシステイン残基がほとんど不活性である条件下で、本リンカーユニットの末端ＳＨ反応性基を複合ポリペプチドの金属結合モチーフのシステイン残基のＳＨ基と結合させ、それにより均質な分子構築物をもたらす部位特異的な結合を達成することが実行可能である。

【0082】

末端スペーサーは、最初のＫ残基のＮ末端に連結されるＮ末端スペーサー又は最後のＫ残基のＣ末端に連結されるＣ末端スペーサーであり得る。フィラー及び末端スペーサーの各々は、（１）１～１２個の非Ｋアミノ酸残基又は（２）エチレングリコール（ＥＧ）ユニットの１～１２個の反復を有するＰＥＧ化アミノ酸を独立して備える。

【0083】

リンカーユニットが連結アームを有しない場合では、各標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素は、Ｋ残基のε－アミノ基とアミド結合を形成することを介してコアのＫ残基に連結される。一方、分子構築物のリンカーユニットが２～１０個の連結アームをさらに備える場合、各連結アームの一方の末端がＫ残基のε－アミノ基とアミド結合を形成することを介してコアのＫ残基に連結され、各連結アームの他方の末端が各標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素に連結される。例えば、連結アームは、２～１０個の非Ｋアミノ酸残基を備えるペプチド又はＥＧユニットの２～２４個の反復を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖であり得る。

【0084】

本開示の選択的な実施形態によると、標的化要素、エフェクター要素又は薬物動態的要素と結合される前に、連結アームの遊離末端（すなわち、中心コアのリシン残基に連結されていない端）は、アミン、カルボキシル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）、アジド、アルキン、シクロオクチン、テトラジン及びシクロオクテン基からなる群から選択される連結基を担持し得る。リシン残基の側鎖アミノ基を（連結アームが存在しない場合において）修飾する連結基（すなわち、アミン、カルボキシル、ＮＨＳ、アジド、アルキン、シクロオクチン、テトラジン又はシクロオクテン基）又は連結アームの遊離末端に存在する連結基に応じて、機能的要素が以下の化学反応のいずれかを介して連結アームの遊離末端と連結され得るように（標的化要素、治療エフェクター要素又は薬物動態的要素などの）機能的要素を対応する官能基で設計することが実行可能である。
（１）それらの間のアミド結合の形成：この場合、連結基がアミン、カルボキシル又はＮＨＳ基であり、機能的要素がアミン又はカルボキシル基を有する、
（２）銅（Ｉ）触媒によるアルキン－アジド環状付加反応（ＣｕＡＡＣ反応）：連結基及び官能基の一方がアジド又はピコリルアジド基を有するのに対して、他方がアルキン基を有する、
（３）逆電子要求Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ（ｉＥＤＤＡ）反応：連結基及び官能基の一方がテトラジン基を有するのに対して、他方がシクロオクテン基（例えば、ＴＣＯ又はノルボルネン基）を有する、又は
（４）歪み促進型アジド－アルキンクリックケミストリー（ＳＰＡＡＣ）反応：結合基及び官能基の一方がアジド基を有するのに対して、他方がシクロオクチン基を有する。

【0085】

本開示の種々の実施形態によると、テトラジン基は１，２，３，４－テトラジン、１，２，３，５－テトラジン、１，２，４，５－テトラジン又はその誘導体であり、シクロオクテン基はノルボルネン又はトランスシクロオクテン（ＴＣＯ）基であり、シクロオクチン基はジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、二フッ化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）、ビシクロノニン（ＢＣＮ）及びジベンゾアザシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ又はＤＢＣＯ）からなる群から選択される。本開示の一実施形態によると、テトラジン基は、６－メチルテトラジンである。

【0086】

本発明のある選択的な実施形態によると、中心コアは、ＳＨ反応性基と連結されるアミノ酸残基又はその近傍に局在負電荷を担持する。具体的には、局在負電荷は、ＳＨ反応性基と連結されるアミノ酸残基から始まるアミノ酸残基内の最初の５～１５個のアミノ酸残基内に存在する。例えば、局在負電荷は、ＳＨ反応性基と連結されるアミノ酸残基から始まる最初の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸残基内に存在する。局在負電荷は、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）残基などのｐＨ＝７で負に帯電した１以上のアミノ酸残基を含むことによって付与可能である。

【0087】

代替的には、コアは、中心コアがＳＨ反応性基又はその近傍に局在負電荷を担持するように、負に帯電した複数のエフェクター要素と結合され得る。例えば、エフェクター要素は、リンカーユニットの正味の負電荷を全体として増加させることができるキレート剤（例えば、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡＧＡなど）を備え得る。

【0088】

上記の章（ＩＩＩ）で説明した標的化要素、エフェクター要素及び薬物動態的要素は、章（ＩＶ）の実施形態において適用可能であり、簡潔にするため、ここではその詳細な説明を省略する。種々の実施形態では、複数のエフェクター要素を担持するリンカーユニットを「エフェクターバンドル」又は「薬物バンドル」といい、複数のキレート剤を担持するリンカーユニットを「キレート剤バンドル」といい、複数の標的化要素を担持するリンカーユニットを「標的化バンドル」といい、複数のｓｃＦｖを担持するリンカーユニットを「ｓｃＦｖバンドル」といい、複数の薬物動態的要素を担持するリンカーユニットを「薬物動態的（ＰＫ）バンドル」といい、複数の脂肪酸及び／又は二酸性脂肪酸鎖を担持するリンカーユニットを「脂肪酸（ＦＡ）バンドル」という。

【0089】

特定の実施形態では、脂肪酸（又は二酸性脂肪酸）誘導体は、化学的に修飾された脂肪酸分子（又は二酸性脂肪酸）である。例えば、脂肪酸分子のカルボキシル基（又は二酸性脂肪酸分子のカルボキシル基の１個）は、一方の官能基が（それにより、（二酸性）脂肪酸分子と共有結合を形成する）カルボキシル反応性であるのに対して他方がリシン残基の側鎖アミノ基と反応可能な官能基である、２個の官能基を有する化学部分と反応する。本開示の選択的な実施形態によると、（二酸性）脂肪酸分子を修飾する化学成分はグルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、アミノ－ＥＧ２－酸又はガンマ－アミノ酪酸などであるが、本開示はそれに限定されない。

【0090】

理解され得るように、親ポリペプチドにおいてスルフヒドリル基を含みシステイン残基又は他のアミノ酸残基が存在しない場合では、末端システイン残基を末端金属結合モチーフの代わりに導入して複合ポリペプチドを形成してもよく、本リンカーユニットは、そのような複合ポリペプチドとの結合を末端のシステイン残基を介して形成することができる。

【0091】

（Ｖ）金属結合モチーフを含む複数の複合ポリペプチドを担持するリンカーユニット
さらに他の態様では、本発明は、本開示の上記態様／実施形態による複数の複合ポリペプチドを担持することができるリンカーユニットに向けられる。ある実施形態では、そのようなリンカーユニットを「ペプチドバンドル」という。

【0092】

本発明の特定の実施形態によると、リンカーユニットは、上記態様／実施形態による中心コア、２～１０個の連結アーム、及び２～１０個の複合ポリペプチドを備える。そのようなリンカーユニットの連結アームはその遊離末端にＳＨ反応性基を有し、各複合ポリペプチドは本金属結合モチーフを有するので、親ポリペプチドのシステイン残基がほとんど非活性である条件下で、部位特異的な態様において、複合ポリペプチドを連結アームに結合させることができる。

【0093】

具体的には、中心コアは、３～１２０アミノ酸残基長を有するポリペプチドであり、コアは２～１０個のリシン（Ｋ）残基を備え、例えば、本コアは、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のＫ残基及び結合基を備え得る。Ｋ残基のいずれか２個は相互に隣接し、又はフィラーによって分離される。

【0094】

ある場合では、中心コアは、中心コアの最初又は最後のＫ残基に、それとアミド結合を形成することによって連結される結合基をさらに備える。結合基の例は、これに限定されないが、アジド、アルキン、テトラジン、シクロオクテン及びシクロオクチン基を含む。

【0095】

他の場合では、中心コアは末端スペーサーをさらに備え、結合基は末端スペーサーの末端アミノ酸残基に、それとアミド結合を形成することによって連結される。末端スペーサーは、最初のＫ残基のＮ末端に連結されるＮ末端スペーサー又は最後のＫ残基のＣ末端に連結されるＣ末端スペーサーであり得る。

【0096】

フィラー及び末端スペーサーの各々は、（１）１～１２個の非Ｋアミノ酸残基又は（２）エチレングリコール（ＥＧ）ユニットの１～１２個の反復を有するＰＥＧ化アミノ酸を独立して備える。一般に、上記の末端スペーサー又はフィラーは、（１）Ｋアミノ酸残基以外の１～１２（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２）個のオリゴペプチド又は（２）１～１２個のＥＧユニットを有する（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個のＥＧユニットを有する）ＰＥＧ化アミノ酸であり得る。具体的には、本コアが複数のＫ残基を備える場合では、末端スペーサー又はフィラーは２～１２個のＥＧユニットを有するＰＥＧ化アミノ酸を備えていてもよいし、１～１２個の非Ｋアミノ酸残基を備えてもよく、非Ｋアミノ酸残基の各々はグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）残基からなる群からそれぞれ選択され、好ましくは、非Ｋアミノ酸残基の各々はＧ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ及びＷからなる群からそれぞれ選択され、より好ましくは、非Ｋアミノ酸残基の各々はそれぞれＧ及び／又はＳ残基である。

【0097】

ある実施形態によると、各連結アームの一方の末端はＫ残基のε－アミノ基とアミド結合を形成することを介してコアのＫ残基に連結されるのに対して、各連結アームの他方の末端はスルフヒドリル（ＳＨ）反応性基を有する。例えば、連結アームは、２～１２個の非Ｋアミノ酸残基を備えるペプチド又はＥＧユニットの２～２４個の反復を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖であり得る。

【0098】

例示的なＳＨ反応性基は、マレイミド、ハロアセチル（例えば、ヨードアセチル又はブロモアセチル）、スルホン（例えば、ビニルスルホン、モノスルホン、メチルスルホニルベンゾチアゾール）及びピリジルジスルフィド（例えば、２－ピリジルジチオール）基を含む。

【0099】

本開示のある実施形態によると、連結アームは、Ｋアミノ酸残基以外の、２～１２（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２）個のアミノ酸残基（それらの各々が天然又は非天然アミノ酸残基であり得る）を備えるペプチドである。例えば、連結アームは、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ及びＷ残基からなる群から独立して選択される２～１２個のアミノ酸残基を備えるペプチドである。効果的一実施例によると、連結アームは、Ｇ、Ｓ、Ｅ及びＲ残基からなる群から独立して選択される５～１０個のアミノ酸残基を備えるペプチドである。代替的に、連結アームは、ＥＧユニットの２～２４（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４）個の反復、好ましくは、ＥＧユニットの５～１５個の反復、より好ましくは、ＥＧユニットの６～１２個の反復を有するＰＥＧ鎖であり得る。理解され得るように、連結アームのペプチド又はＰＥＧ鎖は、略同一長のポリマーで置換され得る。炭水化物又は他の親水性ビルディングブロックを備えるポリマーは、連結アームとしての使用に適切である。

【0100】

本発明のある実施形態によると、各連結アームは、ＳＨ反応性基と連結されるアミノ酸残基又はその近傍に局在負電荷を担持する。具体的には、局在負電荷は、ＳＨ反応性基と連結されるアミノ酸残基から開始するアミノ酸残基内の最初の５～１５個のアミノ酸残基内に存在する。例えば、局在負電荷は、ＳＨ反応性基と連結されるアミノ酸残基から開始する最初の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸残基内に存在する。局在負電荷は、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）残基などのｐＨ＝７で負に帯電した１以上のアミノ酸残基を含むことによって付与可能である。

【0101】

理解され得るように、本コアが少なくとも２つの末端スペーサー又はフィラーを備える場合、末端スペーサー又はフィラーの各々は同一又は異なってもよく、すなわち、各末端スペーサー又はフィラーは同一又は異なるアミノ酸配列及び／又はＥＧユニットを備え得る。本開示の一実施形態によると、本コアは、スペーサーの１つがＥＧユニットの８個の反復を有するＰＥＧ化アミノ酸であり、他の２つのスペーサーがそれぞれ１個のＳ残基及び１個のＧ残基である、３個のフィラーを備える。本開示の他の実施形態によると、本コアは、スペーサーの１つが４個のＧ及び２個のＳ残基からなり、一方で他の４個のスペーサーがそれぞれ１個のＧ及び１個のＳ残基からなる、１つの末端スペーサー及び４個のフィラーを備える。本開示のさらに他の実施形態によると、本コアは、２つの末端スペーサー及び３個のフィラーを備え、各々がＥＧユニットの４個の反復を有するＰＥＧ化アミノ酸である。

【0102】

本発明の選択的な実施形態によると、複数の複合ポリペプチドを備える上記のリンカーユニット（又はペプチドバンドル）は、中心コアの結合基と反応して分子構築物を形成することにより、追加のリンカーユニットと結合され得る。例えば、上記追加のリンカーユニットは、エフェクターバンドル、標的化バンドル又はＰＫバンドルであり得る。例えば、追加のリンカーユニットは、出願人の以前に提出した特許出願に記載されるものと同様の構造物を採用し得る。簡潔には、追加のリンカーユニットは、末端のＳＨ反応性基がペプチドバンドルの結合基に対応する結合基と置換されることを除き、上述の章（ＩＩＩ）に説明されるものと同様の構造物を有し得る。

【0103】

上記追加のリンカーユニットによって担持される標的化要素又はエフェクター要素がペプチドベースの要素である実施形態では、上記ペプチドベースの要素は上記の亜鉛結合モチーフを有してもよく、追加のリンカーユニットは本ペプチドバンドルの構造物を採用して、それにより異なる種類の機能的要素を担持する２つのペプチドバンドルから構成される分子構築物を形成し得る。

【0104】

ある選択的な実施形態では、結合基は、末端アミノ酸残基（すなわち、Ｎ末端スペーサーの最初の連結アミノ酸残基又はＮ末端アミノ酸残基）のα－アミノ基（－ＮＨ_２）又は末端アミノ酸残基（すなわち、Ｃ末端スペーサーの最後の連結アミノ酸残基又はＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）と共有結合を形成可能な官能基を有する結合部分の一部であり、それにより、結合部分がそこに連結される。特定の実施形態において、コアは、Ｎ及びＣ末端スペーサーの一方のみを有していてもよく、（末端スペーサーの末端連結アミノ酸残基又は末端アミノ酸残基であり得る）２個の末端アミノ酸残基にそれぞれ連結される第１及び第２の結合部分の双方を有する。コアがＮ及びＣ末端スペーサーの双方を備え、２つの結合部分が２つの末端スペーサーの末端アミノ酸残基にそれぞれ連結される実施形態もまた存在する。好ましい実施形態では、結合部分と末端アミノ酸残基の間に形成される共有結合は、アミド結合である。理解され得るように、得られたバンドルの均質性を確保するために、１つの結合部分はα－アミノ基又はカルボキシル基のいずれかと反応可能である１つの官能基のみを有することが重要である。

【0105】

選択的に、結合部分は、カルボキシル又はアミノ基及び結合基を接続するＥＧユニットの２～１０（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）個の反復を有するＰＥＧ鎖をさらに備え、例えば、ＰＥＧ鎖はＥＧユニットの４、６、７又は８個の反復を有し得る。

【0106】

本開示の種々の実施形態によると、２つの結合部分は、同一の反応性又は異なる反応性を有し得る。好ましくは、結合部分の第２の結合基がアジド、アルキン又はシクロオクチン基である場合には、第２の結合基と連結基の間の反応を回避するように連結アームの連結基はアジド、アルキン又はシクロオクチン基のいずれとなることもなく、むしろ、連結基はテトラジン、シクロオクテン、アミン、カルボキシル又はＮ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）基であり得る。代替的に、第２の結合基がテトラジン又はシクロオクテン基である場合、連結基はテトラジン又はシクロオクテン基のいずれとなることもなく、代わりに、連結基は、アジド、アルキン、シクロオクチン、アミン、カルボキシル又はＮ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）基であり得る。

【0107】

理解され得るように、コアに連結される選択的な連結アームの数は、主にコアに備わる連結アミノ酸残基（すなわち、Ｋ残基）の数によって決定される。本コアに備えられる少なくとも２個の連結アミノ酸残基が存在するので、本標的化バンドル又はエフェクターバンドルは複数の連結アームを備え得る。

【0108】

理解され得るように、エフェクター要素、標的化要素又は薬物動態的要素に関する説明は、それ以外を文脈が明示しない限り、そのような要素を伴う全ての態様／実施形態に適用可能である。

【0109】

理解され得るように、ペプチド中心コアの固相合成中に、コアが合成された後に機能的要素をコアに付着させる代わりに、特異的な機能的要素で修飾されたＫアミノ酸残基をペプチド鎖内に組み込むことも実行可能である。したがって、種々の実施形態によると、異なる機能的要素で修飾されたＫ残基は、均質な薬物動態的バンドルのバッチを与えるように、固相合成中に連続的に付加されてもよく、各薬物動態的バンドルは、そこに連結される２以上の異なる機能的要素を有し得る。

【0110】

以下の実施例は、本発明の特定の態様を明瞭にして本発明の実施の際に当業者を補助するように提供される。これらの実施例は、いかなる態様においても発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。更なる詳述なしに、当業者であれば、ここでの説明に基づいて、本発明をその最大の範囲で利用することができると考えられる。

【実施例0111】

Ｍａｌ－ペプチド１中心コアの合成
この実施例では、５個のリシン残基を有するペプチドが本発明者によって設計され、その製造をＫａｒｅＢａｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（米国、モンマンスジャンクション）に外注した。このペプチドは、リンカーユニット又は機能的バンドルを構築するために中心コアとして使用可能である。Ｍａｌ－ペプチド１（マレイミド－エチル－ＧＧＳＧＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫ；配列番号１１）を、標準的Ｆｍｏｃに基づく固相法を用いて合成した。Ｍａｌ－ペプチド１は、９５．６７％の純度を有していた。

【0112】

結果として合成されたペプチドの同定を、質量分光法ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを用いて実施した。質量分光分析を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＭＢ）、Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ、台湾、台北のＭａｓｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって実施した。測定を、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、独国、ブレーメン）において行った。

【0113】

図１は質量分光法ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの結果を示し、Ｍａｌ－ペプチド１は１７９０．９１６ダルトンの分子量を有することを示す。

【実施例0114】

Ｍａｌ－ペプチド２－ＤＯＴＡバンドルの合成
この実施例では、中心コアとして３個のリシン残基及び中心コアと結合した３個のＤＯＴＡ分子を有するマレイミド含有ペプチドを有するキレート剤バンドル（図２参照）（Ｍａｌ－ペプチド２－ＤＯＴＡバンドル）が本発明者によって設計され、その製造をＫａｒｅＢａｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（米国、モンマンスジャンクション）に外注した。

【0115】

中心コアとして用いたＭａｌ－ペプチド２（マレイミド－エチル－ＧＧＳＧＧＳＧＫＧＧＳＧＧＳＧＫＧＧＳＧＧＳＧＫ、配列番号１２）を、標準的Ｆｍｏｃに基づく固相合成を用いて合成し、その後にＤＯＴＡ分子を、液相合成を用いて中心コアに結合させた。

【0116】

結果として合成されたキレート剤バンドルの精製サンプルをＳｕｐｅｌｃｏＣ１８カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ；５μｍ）に対して逆相分析高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、移動相のアセトニトリル及び０．１％のトリフルオロ酢酸、線形勾配０％～１００％のアセトニトリルを用いて、３０分以上、流速１．０ｍｌ／分及びカラム温度３５℃で分析した。図３Ａは、実施例２のキレート剤バンドルの逆相ＨＰＬＣプロファイルを示し、キレート剤バンドルのピークが７．０６分の保持時間を有することを示す。

【0117】

Ｍａｌ－ペプチド２－ＤＯＴＡバンドルの同定を質量分光法ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって実施した。図３Ｂは、本キレートバンドルが３０９３．４５４ダルトンの分子量を有することを質量分光法ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの結果が示したことを示す。