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特開2024-23449発現強化座位の使用に基づいた抗体を作製するための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024023449
(43)【公開日】2024-02-21
(54)【発明の名称】発現強化座位の使用に基づいた抗体を作製するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20240214BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240214BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240214BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240214BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240214BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z ZNA
C12P21/02 C
C12P21/08
C12N5/10
C12N15/13
C12N5/071
【審査請求】有
【請求項の数】31
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023201924
(22)【出願日】2023-11-29
(62)【分割の表示】P 2021114374の分割
【原出願日】2017-04-20
(31)【優先権主張番号】62/325,400
(32)【優先日】2016-04-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】597160510
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】ロバート バブ
(72)【発明者】
【氏名】ダリャ ブラコフ
(72)【発明者】
【氏名】ガン チェン
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ ピー． ファンデル
(72)【発明者】
【氏名】ユ ジャオ
(57)【要約】
【課題】発現強化座位の使用に基づいた抗体を作製するための組成物および方法の提供。
【解決手段】本発明は、真核細胞における組み換えタンパク質の部位特異的な統合および発現に関する。特に本発明は、複数の発現強化部位を利用することによる、真核細胞、特にチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）の細胞株における、一特異性抗体および二特異性抗体を含む抗原結合タンパク質の発現改善のための組成物および方法を含む。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、真核細胞における組み換えタンパク質の部位特異的な統合および発現に関する。特に本発明は、複数の発現強化部位を利用することによる、真核細胞、特にチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）の細胞株における、一特異性抗体および二特異性抗体を含む抗原結合タンパク質の発現改善のための組成物および方法を含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第一の発現強化座位内に統合された第一の外因性核酸であって、前記第一の外因性核酸が、第一の重鎖断片（ＨＣＦ）をコードするヌクレオチド配列を備える、第一の外因性核酸；および
第二の発現強化座位内に統合された第二の外因性核酸であって、前記第二の外因性核酸は、第一の軽鎖断片（ＬＣＦ）をコードするヌクレオチド配列および第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、第一の選択マーカー遺伝子は、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列との間に存在し、前記選択マーカー遺伝子は、第一の組換え認識部位（ＲＲＳ）を備えるイントロンを備える、第二の外因性核酸
を備えた哺乳類細胞であって、
前記第一および第二の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードする、哺乳類細胞。
第二の発現強化座位内に統合された第二の外因性核酸であって、前記第二の外因性核酸は、第一の軽鎖断片（ＬＣＦ）をコードするヌクレオチド配列および第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、第一の選択マーカー遺伝子は、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列との間に存在し、前記選択マーカー遺伝子は、第一の組換え認識部位（ＲＲＳ）を備えるイントロンを備える、第二の外因性核酸
を備えた哺乳類細胞であって、
前記第一および第二の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードする、哺乳類細胞。
【請求項2】
前記第一の外因性核酸が、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、請求項１に記載の細胞。
【請求項3】
第二の選択マーカー遺伝子が、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列との間に存在し、前記第二の選択マーカー遺伝子は、前記第一の選択マーカー遺伝子とは異なり、第二のＲＲＳを備えるイントロンを備える、請求項２に記載の細胞。
【請求項4】
前記第一および第二のＨＣＦはそれぞれ重鎖可変領域を備える、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項5】
前記第一および第二のＨＣＦは、配列が異なる、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項6】
前記第一および第二のＨＣＦは、配列が同じである、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項7】
前記第一のＬＣＦが軽鎖可変領域を備える、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項8】
前記第一および第二のＬＣＦは、配列が同じである、請求項２～７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項9】
前記第一および第二のＬＣＦは、配列が異なる、請求項２～７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項10】
前記抗原結合タンパク質が全長抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項11】
前記抗体が二特異性抗体である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項12】
前記選択マーカー遺伝子が抗生物質に対する耐性を与える、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項13】
前記抗生物質がハイグロマイシン、ネオマイシンまたはカナマイシンである、請求項１２に記載の細胞。
【請求項14】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項15】
２つの前記発現強化座位のうちの一方は、配列番号１に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を備え、他方は、配列番号２または配列番号３に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を備える、請求項１４に記載の細胞。
【請求項16】
哺乳類細胞において二特異性抗原結合タンパク質を発現させるためのベクターのセットであって、前記セットは、
５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の核酸、第一のイントロンの５’部分を備える第一の選択マーカー遺伝子の５’部分および第二のＲＲＳを備えた第一ベクターであって、前記第二のＲＲＳは、前記第一の選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端でもある、前記第一のイントロンの５’部分の３’末端に配置される、第一ベクター；
５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二のＨＣをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、第四のＲＲＳを備えた第二ベクター；および
５’から３’の方向に、５’ＲＲＳ、前記第一のイントロンの残りの３’部分を備える前記第一の選択マーカー遺伝子の残りの３’部分、第３の核酸、および３’ＲＲＳを備える第三ベクターであって、前記５’ＲＲＳは、前記第一の選択マーカー遺伝子の３’部分の５’末端でもある、前記第一のイントロンの残りの３’部分の５’末端に配置され、前記５’ＲＲＳは前記第二のＲＲＳと同じであり、前記３’ＲＲＳは前記第一および第二のＲＲＳとは異なる、第三ベクター
を備え、
前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳは異なり；
前記第一および第三の核酸のうちの一方は第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、他方は第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え；
前記二特異性抗原結合タンパク質は、前記第一のＨＣＦ、前記第二のＨＣＦおよび前記第一のＬＣＦを備え、前記第一および第二のＨＣＦは異なる、セット。
５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の核酸、第一のイントロンの５’部分を備える第一の選択マーカー遺伝子の５’部分および第二のＲＲＳを備えた第一ベクターであって、前記第二のＲＲＳは、前記第一の選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端でもある、前記第一のイントロンの５’部分の３’末端に配置される、第一ベクター；
５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二のＨＣをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、第四のＲＲＳを備えた第二ベクター；および
５’から３’の方向に、５’ＲＲＳ、前記第一のイントロンの残りの３’部分を備える前記第一の選択マーカー遺伝子の残りの３’部分、第３の核酸、および３’ＲＲＳを備える第三ベクターであって、前記５’ＲＲＳは、前記第一の選択マーカー遺伝子の３’部分の５’末端でもある、前記第一のイントロンの残りの３’部分の５’末端に配置され、前記５’ＲＲＳは前記第二のＲＲＳと同じであり、前記３’ＲＲＳは前記第一および第二のＲＲＳとは異なる、第三ベクター
を備え、
前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳは異なり；
前記第一および第三の核酸のうちの一方は第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、他方は第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え；
前記二特異性抗原結合タンパク質は、前記第一のＨＣＦ、前記第二のＨＣＦおよび前記第一のＬＣＦを備え、前記第一および第二のＨＣＦは異なる、セット。
【請求項17】
第四ベクターをさらに備える、請求項１６に記載のセットであって、
前記第二ベクターは、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える第二の核酸、第二のイントロンの５’部分を備える第二の選択マーカー遺伝子の５’部分、および前記第四のＲＲＳを備え、前記第四のＲＲＳは、前記第二の選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端でもある、前記第２のイントロンの５’部分の３’末端に配置され；そして
前記第四ベクターは、５’から３’の方向に、５’ＲＲＳ、前記第二のイントロンの残りの３’部分を備える第二の選択マーカー遺伝子の残りの３’部分、第二のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列、および３’ＲＲＳを備え、前記５’ＲＲＳは、前記第二の選択マーカー遺伝子の３’部分の５’末端でもある、前記第二のイントロンの残りの３’部分の５’末端に配置され、前記５’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同じであり、前記第四ベクターの３’ＲＲＳは前記第三および第四のＲＲＳと異なる、セット。
前記第二ベクターは、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える第二の核酸、第二のイントロンの５’部分を備える第二の選択マーカー遺伝子の５’部分、および前記第四のＲＲＳを備え、前記第四のＲＲＳは、前記第二の選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端でもある、前記第２のイントロンの５’部分の３’末端に配置され；そして
前記第四ベクターは、５’から３’の方向に、５’ＲＲＳ、前記第二のイントロンの残りの３’部分を備える第二の選択マーカー遺伝子の残りの３’部分、第二のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列、および３’ＲＲＳを備え、前記５’ＲＲＳは、前記第二の選択マーカー遺伝子の３’部分の５’末端でもある、前記第二のイントロンの残りの３’部分の５’末端に配置され、前記５’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同じであり、前記第四ベクターの３’ＲＲＳは前記第三および第四のＲＲＳと異なる、セット。
【請求項18】
第四ベクターをさらに備える、請求項１６に記載のセットであって、
前記第二ベクターは、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、第二のイントロンの３’部分を備える第２の選択マーカー遺伝子の３’部分、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える前記第二の核酸、および前記第四のＲＲＳを備え、前記第三のＲＲＳは、前記第二の選択マーカー遺伝子の３’部分の５’末端でもある、前記第２のイントロンの３’部分の５’末端に配置され；そして
前記第四ベクターは、５’から３’の方向に、５’ＲＲＳ、前記第二のイントロンの残りの５’部分を備える前記第二の選択マーカー遺伝子の残りの５’部分、および３’ＲＲＳを備え、前記３’ＲＲＳは、前記第二の選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端でもある、前記第二のイントロンの５’部分の３’末端に配置され、前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同じである、セット。
前記第二ベクターは、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、第二のイントロンの３’部分を備える第２の選択マーカー遺伝子の３’部分、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える前記第二の核酸、および前記第四のＲＲＳを備え、前記第三のＲＲＳは、前記第二の選択マーカー遺伝子の３’部分の５’末端でもある、前記第２のイントロンの３’部分の５’末端に配置され；そして
前記第四ベクターは、５’から３’の方向に、５’ＲＲＳ、前記第二のイントロンの残りの５’部分を備える前記第二の選択マーカー遺伝子の残りの５’部分、および３’ＲＲＳを備え、前記３’ＲＲＳは、前記第二の選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端でもある、前記第二のイントロンの５’部分の３’末端に配置され、前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同じである、セット。
【請求項19】
前記第一および第二のＬＣＦは、配列が同じである、請求項１７または１８に記載のセット。
【請求項20】
前記二特異性抗原結合タンパク質が全長二特異性抗体である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のセット。
【請求項21】
前記選択マーカー遺伝子が抗生物質に対する耐性を与える、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のセット。
【請求項22】
前記抗生物質がハイグロマイシン、ネオマイシンまたはカナマイシンである、請求項２１に記載のセット。
【請求項23】
哺乳類細胞において一特異性抗原結合タンパク質を発現させるためのベクターのセットであって、前記セットは、
５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の核酸、イントロンの５’部分を備える選択マーカー遺伝子の５’部分および第二のＲＲＳを備えた第一ベクターであって、第二のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端でもある、第一のイントロンの５’部分の３’末端に配置される、第一ベクター；および
５’から３’の方向に、前記第二のＲＲＳ、前記イントロンの残りの３’部分を備える前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分、第二の核酸、および第三のＲＲＳを備えた第二ベクターであって、前記第二のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子の３’部分の５’末端でもある、前記イントロンの３’部分の５’末端に配置される、第二ベクター；
を備え、
前記第一、第二、および第三のＲＲＳは異なり；
前記第一および第二の核酸のうちの一方はＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、他方はＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え；
前記一特異性抗原結合タンパク質は、前記ＨＣＦおよび前記ＬＣＦを備える、セット。
５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の核酸、イントロンの５’部分を備える選択マーカー遺伝子の５’部分および第二のＲＲＳを備えた第一ベクターであって、第二のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端でもある、第一のイントロンの５’部分の３’末端に配置される、第一ベクター；および
５’から３’の方向に、前記第二のＲＲＳ、前記イントロンの残りの３’部分を備える前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分、第二の核酸、および第三のＲＲＳを備えた第二ベクターであって、前記第二のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子の３’部分の５’末端でもある、前記イントロンの３’部分の５’末端に配置される、第二ベクター；
を備え、
前記第一、第二、および第三のＲＲＳは異なり；
前記第一および第二の核酸のうちの一方はＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、他方はＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え；
前記一特異性抗原結合タンパク質は、前記ＨＣＦおよび前記ＬＣＦを備える、セット。
【請求項24】
前記選択マーカー遺伝子が抗生物質に対する耐性を与える、請求項２３に記載のベクターのセット。
【請求項25】
前記抗生物質がハイグロマイシン、ネオマイシンまたはカナマイシンである、請求項２４に記載のベクターのセット。
【請求項26】
一特異性抗原結合タンパク質を発現させるための哺乳類細胞であって、前記哺乳類細胞は、
第一の発現強化座位内に統合され、第二の発現強化座位内に統合された外因性核酸であって、前記外因性核酸が、第一のＲＲＳ、第一の核酸、第二のＲＲＳを備えるイントロンを備える選択マーカー遺伝子、第二の核酸、および第三のＲＲＳを備える、外因性核酸
を備え、
前記第一、第二、および第三のＲＲＳは異なり；
前記第一および第二の核酸のうちの一方はＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、他方はＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え；
前記一特異性抗原結合タンパク質は、前記ＨＣＦおよび前記ＬＣＦを備える、哺乳類細胞。
第一の発現強化座位内に統合され、第二の発現強化座位内に統合された外因性核酸であって、前記外因性核酸が、第一のＲＲＳ、第一の核酸、第二のＲＲＳを備えるイントロンを備える選択マーカー遺伝子、第二の核酸、および第三のＲＲＳを備える、外因性核酸
を備え、
前記第一、第二、および第三のＲＲＳは異なり；
前記第一および第二の核酸のうちの一方はＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、他方はＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え；
前記一特異性抗原結合タンパク質は、前記ＨＣＦおよび前記ＬＣＦを備える、哺乳類細胞。
【請求項27】
前記選択マーカー遺伝子が抗生物質に対する耐性を与える、請求項２６に記載の細胞。
【請求項28】
前記抗生物質がハイグロマイシン、ネオマイシンまたはカナマイシンである、請求項２７に記載の細胞。
【請求項29】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項30】
２つの前記発現強化座位のうちの一方は、配列番号１に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を備え、他方は、配列番号２または配列番号３に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を備える、請求項２９に記載の細胞。
【請求項31】
抗原結合タンパク質を産生する方法であって、
請求項１～１５または２６～３０のいずれか一項に記載の哺乳類細胞を培養すること；および
前記細胞から前記抗原結合タンパク質を産生することを含む、方法。
請求項１～１５または２６～３０のいずれか一項に記載の哺乳類細胞を培養すること；および
前記細胞から前記抗原結合タンパク質を産生することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／３２５，４００号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１６年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／３２５，４００号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、真核細胞における組み換えタンパク質の部位特異的統合および発現に関するものである。特に本開示は、発現強化部位を利用することによる、真核細胞、特にチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）の細胞株における、抗原結合タンパク質（一特異性抗体および二特異性抗体を含む）の発現改善のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0003】
細胞発現システムは、研究用途および治療用途を問わず、所与のタンパク質製造のための信頼できる、効率的な供給源を提供することを目的としている。例えば、哺乳類の発現系は組み換え型タンパク質を翻訳後に適切に修飾できる能力があり、それゆえに、治療用タンパク質製造の目的に対し、哺乳類細胞中で組み換え型タンパク質を発現させることは、好ましい方法である。
【0004】
様々な発現系が利用可能な状態であるにもかかわらず、組換え型タンパク質発現のための効率的な遺伝子移入および統合遺伝子の安定性といった課題が未だ存在する。標的導入遺伝子を長期的に発現させるにあたっての懸念事項の１つは、その細胞株の表現型が変化しないよう、細胞遺伝子の破壊を最小限とすることである。
【0005】
安定細胞株を操作して、たとえば多特異性抗体にあるような複合的な抗体鎖などの複合的な遺伝子の発現に適合させることは特に困難である。統合遺伝子の発現レベルに幅広いバリエーションが発生する可能性がある。追加遺伝子の統合は、局所的な遺伝子環境（すなわち位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ））が原因でさらに大きな発現バリエーションと不安定性を生じさせる可能性がある。多特異性抗原結合タンパク質作製のための発現システムは多くの場合、特有の多量体形式としてのペア形成が意図された２個以上の異なるイムノグロブリン鎖の発現が必要であり、そしてしばしば、所望されるヘテロ二量体や多量体の組み合わせよりも、ホモ二量体の産生が優勢となってしまう場合がある。したがって、当技術分野には、哺乳類発現システムの改善に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
１つの態様において、本開示は、２個の発現強化座位に部位特異的に統合された複数の外因性核酸を含有する細胞を提供するものであり、当該複数の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードしている。当該抗原結合タンパク質は二特異性抗原結合タンパク質、または従来的な一特異性抗原結合タンパク質であってもよい。
【0007】
一部の実施形態では、第一の発現強化座位内に統合された第一の外因性核酸と、第二の発現強化座位内に統合された第二の外因性核酸を含有する細胞が提供され、当該第一および第二の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードしている。
【0008】
一部の実施形態では、第一の外因性核酸は、第一の重鎖断片（ＨＣＦ：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ）をコードするヌクレオチド配列を含有し、第二の外因性核酸は、第一の軽鎖断片（ＬＣＦ：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ）をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【0009】
一部の実施形態では、第二の外因性核酸は、第二のＨＣＦ（またはＨＣＦ＊）をコードするヌクレオチド配列をさらに含有する。第一および第二のＨＣＦは同じであってもよく、または二特異性抗原結合タンパク質にあるように異なっていてもよい。各ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、定常領域由来のアミノ酸をコードしていてもよい。一部の実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、第二のＨＣＦ（ＨＣＦ＊）をコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードする。一部の実施形態では、第一および第二のＣＨ３ドメインは、たとえば異なるプロテインＡ結合特性を生じさせる位置など、少なくとも１か所のアミノ酸位置で異なっていてもよい。他の実施形態では、第一および第二のＣＨドメインをコードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で、互いに異なっている。
【0010】
一部の実施形態では、第一の外因性核酸（第一のＨＣＦコードヌクレオチド配列を含有する）は、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備えている。第二のＬＣＦは、第二の外因性核酸中の第一のＬＣＦと同じであってもよく、または異なっていてもよい。
【0011】
本明細書に提供される細胞の実施形態の多くの場合において、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチドの各々は、独立してプロモーターに動作可能に連結されており、それによりＨＣＦコード配列またはＬＣＦコード配列の各々の転写が、別個に制御される。
【0012】
一部の実施形態では、第一のＲＲＳと第二のＲＲＳはそれぞれ、第一の外因性核酸に対して５’と３’に位置し、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳはそれぞれ、第二の外因性核酸に対して５’と３’に位置しており、この場合において第一と第二のＲＲＳは異なっており、そして第三と第四のＲＲＳは異なっている。概して、外因性核酸に隣接するＲＲＳのペアの中のＲＲＳは異なっており、それによって意図されない外因性核酸の組み換えと除去が回避される。一部の実施形態では、第一、第二、第三、および第四のＲＲＳはすべて互いに異なっている。
【0013】
第一の座位中の第一の外因性核酸は、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含み、第二の座位中の第二の外因性核酸は、第一のＬＣＦをコードする配列と第二のＨＣＦをコードする配列の両方を含み、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に第一の追加ＲＲＳが存在していてもよい。追加ＲＲＳは、第一、第二、第三および第四の各ＲＲＳとは異なっていてもよい。一部の実施形態では、第一の追加ＲＲＳは、選択マーカー遺伝子が動作可能に連結されたプロモーターと当該選択マーカー遺伝子の間に含まれるか、または追加ＲＲＳは、第一のＬＣＦコード配列とＨＣＦコード配列の間に存在する、もしくは第一のＨＣＦコード配列と第二のＨＣＦコード配列の間に存在する選択マーカー遺伝子の中、または選択マーカー遺伝子のイントロン内に含まれる場合がある。
【0014】
第一の座位中の第一の外因性核酸は、第一のＨＣＦコードヌクレオチド配列と第二のＨＣＦコードヌクレオチド配列を含み、第二の座位の第二の外因性核酸は、第一のＬＣＦコード配列と第二のＨＣＦコード配列の両方を含み、第一のＲＲＳと第二のＲＲＳはそれぞれ、第一の外因性核酸に対して５’と３’に存在してもよく、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳはそれぞれ第二の外因性核酸に対して５’と３’に存在してもよく、この場合において第一と第二のＲＲＳは異なっており、第三と第四のＲＲＳは異なっている。一部の実施形態では、第一と第二のＨＣＦは同じであり、第一と第二のＬＣＦは同じであり、その場合において、当該ＲＲＳは、第一と第三のＲＲＳが同じであり、第二と第四のＲＲＳが同じであるように操作されてもよい。一部の実施形態では、第一と第二のＨＣＦは異なっており、第一と第二のＬＣＦは同じであり、その場合において、当該ＲＲＳは、第一、第二、第三および第四のすべてのＲＲＳが互いに異なるように操作されてもよい。２つのＨＣＦが同じであるか異なっているかに関わらず、追加ＲＲＳは、第一のＬＣＦコード配列と第二のＨＣＦコード配列の間に存在してもよく、および／または第二のＬＣＦコード配列と第一のＨＣＦコード配列の間に存在してもよい。追加（中間）ＲＲＳは、第一、第二、第三および第四の各ＲＲＳとは異なっている。追加ＲＲＳは、２つのＨＣＦ／ＬＣＦコード配列の間に位置する、選択マーカー遺伝子内に含まれてもよく、または選択マーカー遺伝子のイントロン内に含まれてもよい。
【0015】
別の態様では、ＲＲＳペアを含有する細胞が提供され、そのＲＲＳペアは２個の発現強化座位内に統合されており、その座位は、抗原結合タンパク質をコードする核酸のＲＭＣＥを介した統合に使用され得る。
【0016】
ある実施形態では、ＲＲＳペアを含有する細胞が提供され、そのＲＲＳペアは２個の発現強化座位内に統合されており、その座位はリコンビナーゼの存在下でＲＭＣＥを介した抗原結合タンパク質をコードする核酸の同時統合に使用され得る。
【0017】
一部の実施形態では、第一の発現強化座位内に統合された、５’から３’に向かって、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸および第二のＲＲＳを含有し、ならびに第二の発現強化座位内に統合された、５’から３’に向かって、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸および第四のＲＲＳを含有する細胞が提供され、この場合において第一と第二のＲＲＳは異なっており、第三と第四のＲＲＳは異なっている。
【0018】
一部の実施形態では、第一の外因性核酸は、第一の選択マーカーを含み、第二の外因性核酸は、第二の選択マーカーを含み、この場合において第一と第二の選択マーカー遺伝子は異なっている。
【0019】
一部の実施形態では、第一と第二の外因性核酸のうちの１つ、または両方は、追加ＲＲＳ、すなわち第一の座位中の第一と第二のＲＲＳの間の追加ＲＲＳ、および／または第三と第四のＲＲＳの間の追加ＲＲＳを含んでもよい。追加的な中間ＲＲＳは、５’および３’でＲＲＳとは異なっている。追加ＲＲＳが５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの間（たとえば第一のＲＲＳと第二のＲＲＳの間）に含まれる場合、１つの選択マーカー遺伝子は、５’ＲＲＳと追加（中間）ＲＲＳの間に含まれてもよく、別の異なる選択マーカー遺伝子は、追加ＲＲＳと３’ＲＲＳの間に含まれてもよい。
【0020】
別の実施形態では、細胞は、第三のＲＲＳ、すなわち第一の座位中の第一のＲＲＳと第二のＲＲＳの間の追加ＲＲＳを含む第一の外因性核酸を提供し、この場合において当該第一のＲＲＳと第二のＲＲＳは、発現カセットの５’末端と３’末端で２つの選択マーカーに隣接する。他の実施形態では、第二の外因性核酸は、同一の第三のＲＲＳ、すなわち第二の座位中の第一のＲＲＳと第二のＲＲＳの間の追加ＲＲＳを含んでもよく、この場合において当該第一のＲＲＳと第二のＲＲＳは、発現カセットの５’末端と３’末端で２つの選択マーカーに隣接する。４つの選択マーカー遺伝子は、第一、第三、および第二のＲＲＳの間に含まれ、互いに異なっている。
【0021】
別の実施形態では、細胞は、第三のＲＲＳ、すなわち第一の座位中の第一のＲＲＳと第二のＲＲＳの間の追加ＲＲＳを含む第一の外因性核酸を提供し、この場合において当該第一のＲＲＳと第二のＲＲＳは、発現カセットの５’末端と３’末端で２つの選択マーカーに隣接する。他の実施形態では、第二の外因性核酸は、第六のＲＲＳ、すなわち第二の座位中の第四のＲＲＳと第五のＲＲＳの間の追加ＲＲＳを含んでもよく、この場合において当該第四のＲＲＳと第五のＲＲＳは、発現カセットの５’末端と３’末端で２つの選択マーカーに隣接する。４つの選択マーカー遺伝子は、ＲＲＳの間に含まれ、互いに異なっている。
【0022】
多くの実施形態において、本明細書に提供される細胞は、ＣＨＯ細胞株の細胞である。
【0023】
様々な実施形態では、使用される２つの発現強化座位は、配列番号１に少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含有する座位、配列番号２に少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含有する座位、および配列番号３に少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含有する座位からなる群から選択される。
【0024】
さらなる態様では、細胞において二特異性抗原結合タンパク質を統合及び発現するためのベクターセットが提供される。
【0025】
一部の実施形態では、ベクターセットは、５’から３’に向かって、第一のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第一の核酸、および第二のＲＲＳを含有する第一ベクター；５’から３’に向かって、第三のＲＲＳ、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第二の核酸、および第四のＲＲＳを含有する第二ベクター；ならびに第一ベクター中の第一の核酸内、または第一と第二ベクターとは異なる第三ベクター中のいずれかにある第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合において第一、第二、第三、および第四のＲＲＳは異なっており、この場合において、二特異性抗原結合タンパク質は、第一のＨＣＦ、第二のＨＣＦ、および第一のＬＣＦを含有し、この場合において第一のＨＣＦと第二のＨＣＦは異なっている。
【0026】
一部の実施形態では、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一ベクター中の第一の核酸内にある。一部の実施形態では、第一の核酸は第一の選択マーカー遺伝子をさらに含む。
【0027】
一部の実施形態では、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第三ベクター中に提供され、および５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接されており、この場合において（ｉ）３’ＲＲＳは第一のＲＲＳと同じであり、５’ＲＲＳは第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっており、または（ｉｉ）５’ＲＲＳは第二のＲＲＳと同じであり、３’ＲＲＳは第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっている。一部の実施形態では、ベクターは、第一ベクターと第三ベクターに共有される共通ＲＲＳが、分割（ｓｐｌｉｔ）選択マーカー遺伝子形式（または分割‐イントロン形式）で提供されるように、たとえば第一および第三ベクターのうちの１つの選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、そして他方のベクターの選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置されるように設計されてもよい。
【0028】
一部の実施形態では、ベクターセットは、第二ベクター中の第二の核酸内、または第一、第二、および第三ベクターとは別の第四ベクター中のいずれかで提供される第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【0029】
一部の実施形態では、第一のＬＣＦと第二のＬＣＦは同一である。
【0030】
一部の実施形態では、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一ベクター中の第一の核酸内に含まれ、第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列は第四ベクター上に提供される。一部の実施形態では、第四ベクター上の第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）３’ＲＲＳは、第三のＲＲＳと同一であり、５’ＲＲＳは第三のＲＲＳおよび第四のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）５’ＲＲＳは第四のＲＲＳと同一であり、３’ＲＲＳは第三のＲＲＳおよび第四のＲＲＳとは異なっている。ある実施形態では、ベクターは、第二および第四ベクターにより共有される共通ＲＲＳが、（たとえばイントロンを介した）分割マーカー形式で、たとえば第二および第四ベクターのうちの１つのベクター上の選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、および他のベクター上の選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置されるように設計される。
【0031】
一部の実施形態では、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一ベクター中の第一の核酸内にあり、第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列は、第二ベクター上の第二の核酸内にある。
【0032】
一部の実施形態では、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第三ベクター上にあり、第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列は第四ベクター上にある。一部の実施形態では、第三ベクター上の第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳおよび３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）第三ベクター上の３’ＲＲＳは、第一のＲＲＳと同一であり、第三ベクター上の５’ＲＲＳは、第一および第二のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）第三ベクター上の５’ＲＲＳは、第二のＲＲＳと同一であり、第三ベクター上の３’ＲＲＳは、第一および第二のＲＲＳとは異なっており；およびこの場合において第四ベクター上の第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳおよび３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉｉｉ）第四ベクター上の３’ＲＲＳは、第三のＲＲＳと同一であり、第四ベクター上の５’ＲＲＳは、第三および第四のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｖ）第四ベクター上の５’ＲＲＳは、第四のＲＲＳと同一であり、第四ベクター上の３’ＲＲＳは、第三および第四のＲＲＳとは異なっている。
【0033】
本明細書に提供されるベクターセットの多くの実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードしてもよく、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードしてもよい。一部の実施形態では、第一および第二のＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸が異なっている。一部の実施形態では、第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で、異なっている。
【0034】
本明細書に提供されるベクターセットの多くの実施形態において、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチドの各々は、独立してプロモーターに連結されている。
【0035】
一部の実施形態では、ベクターセットは、ＲＲＳのうちの１つ以上を認識するリコンビナーゼを１つ以上コードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよく、それらはＬＣＦコードベクターもしくはＨＣＦコードベクターの内の１つに含まれてもよく、または別個のベクターで提供されてもよい。
【0036】
さらに他の実施形態では、細胞の第一発現強化座位への統合用の５’相同アームおよび３’相同アームに隣接される、第一の核酸を含有する第一ベクター；および細胞の第二発現強化座位への統合用の５’相同アームおよび３’相同アームに隣接される、第二の核酸を含有する第二ベクター、を含有するベクターセットが提供され；この場合において第一および第二の核酸はともに抗原結合タンパク質をコードする。
【0037】
さらなる態様において、本開示は、１つ以上のベクターと細胞（たとえばＣＨＯ細胞）の組み合わせを含み、および２つの発現強化座位内に外因性核酸が統合された細胞の作製に利用可能なシステムを提供するものであり、当該外因性核酸はともに一特異性タンパク質または二特異性タンパク質いずれかの抗原結合タンパク質をコードする。当該システムは、たとえばキットの形態で提供されてもよい。
【0038】
ある実施形態では、細胞とベクターセットを含むシステムが提供され、この場合において当該細胞は、そのゲノムの２つの別個の発現強化座位内に統合されたＲＲＳセットを含有し、当該ＲＲＳは互いに異なっており、およびベクターセット中の対象遺伝子との組み換え交換のための１つ以上の外因性核酸、たとえば選択マーカーなどの間に配置されており；ならびにこの場合において当該ベクターセット中のＲＲＳは、細胞中のＲＲＳと同じ配置を備えている。
【0039】
一部の実施形態では、細胞とベクターセットを含むシステムが提供され、この場合において当該細胞は、第一発現強化座位内に統合された、５’から３’に向かって、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸および第二のＲＲＳを含有し、ならびに第二発現強化座位内に統合された、５’から３’に向かって、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸および第四のＲＲＳを含有し；この場合において当該第一および第二のＲＲＳは異なっており、当該第三および第四のＲＲＳは異なっており；ならびにこの場合において当該第一および第二の発現強化座位は異なっており；この場合において当該ベクターセットは、（ｉ）５’から３’に向かって、第一ベクターの５’ＲＲＳ、第一核酸および第一ベクターの３’ＲＲＳを含有する第一ベクターであって、当該第一ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは異なっている；（ｉｉ）５’から３’に向かって、第二ベクターの５’ＲＲＳ、第二核酸および第二ベクターの３’ＲＲＳを含有する第二ベクターであって、当該第二ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは異なっている；および（ｉｉｉ）第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と、第一ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列であって、当該２つの重鎖コードヌクレオチド配列のうちの１つが第一核酸であり、他方のヌクレオチド配列が第二核酸である、を含有している；この場合において当該第一のＨＣＦと第一ＬＣＦは、抗原結合タンパク質の領域であり；およびベクターが細胞に導入されると、当該ベクター中の当該第一および第二核酸がそれぞれ、ＲＲＳに介在される組み換えを介して第一発現強化座位および第二発現強化座位に統合される。
【0040】
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、一特異性抗原結合タンパク質である。
【0041】
一部の実施形態では、第一および第三のＲＲＳは同一であり、第二および第四のＲＲＳは同一である。ある実施形態では、第一の追加ＲＲＳは、第一座位中の第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳの間に存在する。一部の実施形態では、第一ベクターの５’ＲＲＳは、第一のＲＲＳおよび第三のＲＲＳと同一である；第一ベクターの３’ＲＲＳ、第二ベクターの５’ＲＲＳ、および第一の追加ＲＲＳは、同一である；ならびに第二ベクターの３’ＲＲＳは、第二のＲＲＳおよび第四のＲＲＳと同一である。一部の実施形態では、ＬＣＦコードヌクレオチド配列は、第一ベクター中にあり、ＨＣＦコードヌクレオチド配列は、第二ベクター中にある。一部の実施形態では、第一ベクターの３’ＲＲＳは、選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、第二ベクターの５’ＲＲＳは、選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される。他の実施形態では、第一ベクターの５’ＲＲＳは、第一のＲＲＳと同一であり、第一ベクターの３’ＲＲＳは、第二のＲＲＳと同一である；およびこの場合において第二ベクターの５’ＲＲＳは、第三のＲＲＳと同一であり、第二ベクターの３’ＲＲＳは、第四のＲＲＳと同一である。
【0042】
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、二特異性抗原結合タンパク質である。
【0043】
一部の実施形態では、システムのベクターセットは、第一のＨＣＦとは異なる第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【0044】
一部の実施形態では、第一ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は両方とも、第一ベクター中の第一核酸内に含まれ、および第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二ベクター中にある。一部の実施形態では、第一ベクターの５’ＲＲＳは、第一のＲＲＳと同一であり、第一ベクターの３’ＲＲＳは、第二のＲＲＳと同一であり、第二ベクターの５’ＲＲＳは、第三のＲＲＳと同一であり、および第二ベクターの３’ＲＲＳは、第四のＲＲＳと同一である。
【0045】
一部の実施形態では、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、別個の第三ベクター上にあり、第三ベクターの５’ＲＲＳと第三ベクターの３’ＲＲＳに隣接されている。一部の実施形態では、第一ＬＣをコードするヌクレオチド配列は、第一ベクター中にあり、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二ベクター中にあり、第一ベクターの５’ＲＲＳは、第一のＲＲＳと同一であり、第一ベクターの３’ＲＲＳは、第二ベクターの５’ＲＲＳ、および第一追加ＲＲＳと同一であり、第二ベクターの３’ＲＲＳは、第二のＲＲＳと同一であり、第三ベクターの５’ＲＲＳは、第三のＲＲＳと同一であり、第三ベクターの３’ＲＲＳは、第四のＲＲＳと同一であり、この場合において第一追加ＲＲＳは、第一のＲＲＳと第二のＲＲＳの間の第一座位中に含まれる。一部の実施形態では、ベクターは、分割マーカー形式で共通ＲＲＳを提供するように設計され、たとえば第一ベクターの３’ＲＲＳが、第一ベクター中に含まれる選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、第二ベクターの５’ＲＲＳは、第二ベクター中に含まれる残りの選択マーカー遺伝子の５’末端に配置されるように設計される。
【0046】
一部の実施形態では、システムのベクターセットは、第二ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、当該第二ＬＣＦは、第一ＬＣＦと同一であっても、異なっていてもよい。
【0047】
一部の実施形態では、第二ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二ベクターの第二核酸中にあり、この場合において当該第一ベクターの５’ＲＲＳは、第一のＲＲＳと同一であり、第一ベクターの３’ＲＲＳは、第二のＲＲＳと同一であり、第二ベクターの５’ＲＲＳは、第三のＲＲＳと同一であり、および第二ベクターの３’ＲＲＳは、第四のＲＲＳと同一である。
【0048】
一部の実施形態では、第二ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、別個の第三ベクター中にあり、第三ベクターの５’ＲＲＳと第三ベクターの３’ＲＲＳに隣接されている。一部の実施形態では、第一ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳはそれぞれ、第一座位中の第一のＲＲＳと第二のＲＲＳと同一である；第三ベクターの５’ＲＲＳは、第三のＲＲＳと同一であり、第三ベクターの３’ＲＲＳは第二ベクターの５’ＲＲＳ、および第二座位中の第三のＲＲＳと第四のＲＲＳの間に存在する追加ＲＲＳと同一であり、第二ベクターの３’ＲＲＳは第四のＲＲＳと同一である。一部の実施形態では、共通ＲＲＳは、分割マーカー形式で設計され、たとえば第三ベクターの３’ＲＲＳは、第三ベクター中に含まれる選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、第二ベクターの５’ＲＲＳは、第二ベクター中に含まれる選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される。
【0049】
本明細書に提供されるシステムの多くの実施形態において、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、定常領域由来のアミノ酸をコードしていてもよい。一部の実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードしてもよく、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードしてもよい。一部の実施形態では、第一および第二のＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸が異なっている。一部の実施形態では、第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で、異なっている。
【0050】
本明細書に提供されるシステムの多くの実施形態において、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチドの各々は、独立してプロモーターに連結されている。
【0051】
一部の実施形態では、システムのベクターセットは、ＲＲＳのうちの１つ以上を認識するリコンビナーゼを１つ以上コードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよく、それらはＬＣＦコードベクターもしくはＨＣＦコードベクターの内の１つに含まれてもよく、または別個のベクターで提供されてもよい。
【0052】
様々な実施形態では、本明細書に提供されるシステム中の細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【0053】
様々な実施形態では、２つの発現強化座位は、配列番号１のヌクレオチド配列を備える座位、配列番号２のヌクレオチド配列を備える座位、および配列番号３のヌクレオチド配列を備える座位からなる群から選択される。
【0054】
別の態様において、本開示は、二特異性抗原結合タンパク質の作製方法も提供する。１つの実施形態では、当該方法は、本明細書に開示されるシステムを利用し、トランスフェクションによって当該システムのベクターを当該システムの細胞内に導入する。ＲＭＣＥを介して細胞の２つの発現強化座位内に外因性核酸が適切に統合されたトランスフェクト細胞がスクリーニングされ、特定されてもよい。ＨＣＦ含有ポリペプチドおよびＬＣＦ含有ポリペプチドは、統合核酸から発現されることができ、対象の抗原結合タンパク質は、特定されたトランスフェクト細胞から取得され、公知の方法を使用して精製されることができる。
【0055】
別の実施形態では、当該方法は、本明細書において上述される細胞を単純に利用するものであり、当該細胞は、２つの発現強化座位で統合された外因性核酸を含有し、それら外因性核酸は抗原結合タンパク質をコードし、当該細胞から当該抗原結合タンパク質を発現させる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
第一の発現強化座位内に統合された第一の外因性核酸と、第二の発現強化座位内に統合された第二の外因性核酸を備えた細胞であって、前記第一および第二の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードする、細胞。
（項目２）
前記第一の外因性核酸が、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第二の外因性核酸が、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記第二の外因性核酸が、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目２に記載の細胞。
（項目４）
前記第一および第二のＨＣＦが異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目５）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目３に記載の細胞。
（項目６）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている、項目５に記載の細胞。
（項目７）
前記第一および第二のＣＨドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている、項目５に記載の細胞。
（項目８）
前記第一の外因性核酸が、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目３に記載の細胞。
（項目９）
前記第一および第二のＬＣＦが同一である、項目８に記載の細胞。
（項目１０）
ＨＣＦまたはＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列の各々が、プロモーターに動作可能に連結されている、項目２、３、８のいずれかに記載の細胞。
（項目１１）
第一のＲＲＳと第二のＲＲＳはそれぞれ、前記第一の外因性核酸に対して５’と３’に位置し、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳはそれぞれ、前記第二の外因性核酸に対して５’と３’に位置しており、前記第一と第二のＲＲＳは異なっており、前記第三と第四のＲＲＳは異なっている、項目２に記載の細胞。
（項目１２）
前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳが、互いに異なっている、項目１１に記載の細胞。
（項目１３）
第一の追加ＲＲＳが、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、前記追加ＲＲＳが、前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳの各々と異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目１４）
前記第一の追加ＲＲＳが、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードする隣接ヌクレオチド配列の間に存在する選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有される、項目１３に記載の細胞。
（項目１５）
第一のＲＲＳと第二のＲＲＳはそれぞれ、前記第一の外因性核酸に対して５’と３’に位置し、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳはそれぞれ、前記第二の外因性核酸に対して５’と３’に位置しており、前記第一と第二のＲＲＳは異なっており、前記第三と第四のＲＲＳは異なっている、項目８に記載の細胞。
（項目１６）
前記第一と第二のＨＣＦは同一であり、前記第一と第二のＬＣＦは同一であり、前記第一と第三のＲＲＳが同一であり、前記第二と第四のＲＲＳが同一である、項目１５に記載の細胞。
（項目１７）
前記第一と第二のＨＣＦは異なっており、前記第一と第二のＬＣＦは同一であり、前記第一、第二、第三および第四のＲＲＳが互いに異なる、項目１５に記載の細胞。
（項目１８）
第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、前記第一の追加ＲＲＳは、前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳと異なっている、項目１６または１７に記載の細胞。
（項目１９）
前記第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第一の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有される、項目１８に記載の細胞。
（項目２０）
第二の追加ＲＲＳが、前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、この場合において前記第一および第二のＲＲＳが、同一または異なっており、各々、前記第一、第二、第三および第四のＲＲＳと異なっている、項目１８に記載の細胞。
（項目２１）
前記第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第一の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有され、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第二の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有され、前記第一および第二の選択マーカー遺伝子が異なっている、項目２０に記載の細胞。
（項目２２）
前記抗原結合タンパク質が、一特異性である、項目２に記載の細胞。
（項目２３）
前記抗原結合タンパク質が、二特異性である、項目４に記載の細胞。
（項目２４）
第一の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、および第二のＲＲＳ、
第二の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第四のＲＲＳ、を備える細胞であって、
前記第一および第二のＲＲＳが異なっており、前記第三および第四のＲＲＳが異なっている、細胞。
（項目２５）
前記第一の外因性核酸が、第一の選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子を備え、前記第一と第二の選択マーカー遺伝子が異なっている、項目２４に記載の細胞。
（項目２６）
前記第一の外因性核酸が、第一の追加ＲＲＳをさらに備え、前記第一の追加ＲＲＳが、第一および第二のＲＲＳとは異なっている、項目２５に記載の細胞。
（項目２７）
前記第二の外因性核酸が、第二の追加ＲＲＳをさらに備え、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっている、項目２６に記載の細胞。
（項目２８）
前記第一の外因性核酸が、第一の選択マーカー遺伝子、第一の追加ＲＲＳ、および第一の追加選択マーカー遺伝子を備え、前記第一の選択マーカー遺伝子および第一の追加選択マーカー遺伝子が異なっており、前記第一の追加ＲＲＳが、前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっている、項目２４に記載の細胞。
（項目２９）
前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子、第二の追加ＲＲＳ、および第二の追加選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の選択マーカー遺伝子および第二の追加選択マーカー遺伝子が互いに異なっており、ならびに前記第一の選択マーカー遺伝子および第一の追加選択マーカー遺伝子とも異なっており、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっている、項目２７に記載の細胞。
（項目３０）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、項目１～２９のいずれかに記載の細胞。
（項目３１）
２つの発現強化座位のうちの１つは、配列番号１に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、配列番号２に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、および配列番号３に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列からなる群から選択される、項目３０に記載の細胞。
（項目３２）
細胞において二特異性抗原結合タンパク質を発現するベクターセットであって、
５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および第二のＲＲＳを備えた第一ベクター、
５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二のＨＣをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および第四のＲＲＳを備えた第二ベクター、
および前記第一ベクター中の前記第一の核酸内、または前記第一および第二ベクターとは異なる第三ベクター中のいずれかにある、第一のＬＣをコードするヌクレオチド配列を備え、
この場合において前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳが異なっており、
ならびに前記二特異性抗原結合タンパク質が、前記第一のＨＣＦ、前記第二のＨＣＦ、および前記第一のＬＣＦを備え、ならびに前記第一および第二のＨＣＦが異なっている、ベクターセット。
（項目３３）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内にある、項目３２に記載のベクターセット。
（項目３４）
前記第一の核酸が、第一の選択マーカー遺伝子をさらに備える、項目３４に記載のベクターセット。
（項目３５）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第三ベクター中にあり、および５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記３’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳと同じであり、前記５’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記５’ＲＲＳは前記第二のＲＲＳと同じであり、前記３’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっている、項目３２に記載のベクターセット。
（項目３６）
前記第一および第三ベクターの間の共通ＲＲＳは、前記第一および第三ベクターの内の１つの選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、そして前記他方のベクターの選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される、項目３５に記載のベクターセット。
（項目３７）
第二ベクター中の前記第二の核酸内、または前記第一、第二、および第三ベクターとは別の第四ベクター中のいずれかである、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目３２に記載のベクターセット。
（項目３８）
前記第一および第二のＬＣＦが同一である、項目３７に記載のベクターセット。
（項目３９）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内であり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第四ベクター上にある、項目３８に記載のベクターセット。
（項目４０）
前記第四ベクター上の前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳおよび第四のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記５’ＲＲＳは前記第四のＲＲＳと同一であり、前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳおよび第四のＲＲＳとは異なっている、項目３９に記載のベクターセット。
（項目４１）
前記第二および第四ベクターの間の前記共通ＲＲＳは、前記第二および第四ベクターの内の１つの選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、そして前記他方のベクターの選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される、項目４０に記載のベクターセット。
（項目４２）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内であり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第二ベクター上の前記第二の核酸内である、項目３８に記載のベクターセット。
（項目４３）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第三ベクター上にあり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第四ベクター上にある、項目３８に記載のベクターセット。
（項目４４）
前記第三ベクター上の第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳおよび３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記第三ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記第三ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なっており、およびこの場合において前記第四ベクター上の前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳおよび３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記第四ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第四ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記第四ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一であり、前記第四ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第三および前記第四のＲＲＳとは異なっている、項目４３に記載のベクターセット。
（項目４５）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目３２に記載のベクターセット。
（項目４６）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸で異なっている、項目４５に記載のベクターセット。
（項目４７）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で異なっている、項目４５に記載のベクターセット。
（項目４８）
可変領域をコードするヌクレオチド配列の各々が、独立してプロモーターに連結されている、項目３２に記載のベクターセット。
（項目４９）
前記第一および第二のＲＲＳ、ならびに／または前記第三および第四のＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目３２に記載のベクターセット。
（項目５０）
細胞の第一の発現強化座位内への統合のための５’相同アームと３’相同アームに隣接される、第一の核酸を備える第一ベクター、および
前記細胞の第二の発現強化座位内への統合のための５’相同アームと３’相同アームに隣接される、第二の核酸を備える第二ベクター、を備えるベクターセットであって、
前記第一および第二の核酸がともに抗原結合タンパク質をコードする、ベクターセット。
（項目５１）
細胞およびベクターセットを備えるシステムであって、
前記細胞が、
第一の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、および第二のＲＲＳ、
第二の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第四のＲＲＳ、を備え、
この場合において前記第一および第二のＲＲＳが異なっており、前記第三および第四のＲＲＳが異なっており、ならびにこの場合において前記第一および第二の発現強化座位が異なっており、
前記ベクターセットが、
５’から３’の方向に、第一ベクターの５’ＲＲＳ、第一の核酸、および第一ベクターの３’ＲＲＳを備えた第一ベクターであって、前記第一ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは異なっている、第一ベクター、
５’から３’の方向に、第二ベクターの５’ＲＲＳ、第二の核酸、および第二ベクターの３’ＲＲＳを備えた第二ベクターであって、前記第二ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは異なっている、第二ベクター、
第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列の内の１つは、前記第一の核酸中にあり、他方のヌクレオチド配列は前記第二の核酸中にあり、この場合において前記第一のＨＣＦと前記第一のＬＣＦは、抗原結合タンパク質の領域である、ヌクレオチド配列、を備え、
この場合において前記ベクターが前記細胞内に導入されると、前記ベクター中の前記第一および第二の核酸がそれぞれ、前記ＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記第一の発現強化座位内と前記第二の発現強化座位内に統合する、システム。
（項目５２）
前記抗原結合タンパク質が、一特異性抗原結合タンパク質である、項目５１に記載のシステム。
（項目５３）
前記第一および第三のＲＲＳは同一であり、前記第二および第四のＲＲＳは同一である、項目５２に記載のシステム。
（項目５４）
第一の追加ＲＲＳは、前記第一座位中の前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳの間に存在する、項目５３に記載のシステム。
（項目５５）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳおよび第三のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳ、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および前記第一の追加ＲＲＳは同一であり、ならびに前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二および第四のＲＲＳと同一である、項目５４に記載のシステム。
（項目５６）
前記ＶＬをコードするヌクレオチド配列は、前記第一ベクター中にあり、前記ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にある、項目５５に記載のシステム。
（項目５７）
前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される、項目５５に記載のシステム。
（項目５８）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、およびこの場合において前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目５２に記載のシステム。
（項目５９）
前記抗原結合タンパク質が、二特異性抗原結合タンパク質である、項目５２に記載のシステム。
（項目６０）
前記第一のＨＣＦとは異なる第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目５９に記載のシステム。
（項目６１）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は両方とも、前記第一ベクター中の前記第一核酸内に含まれ、および前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にある、項目６０に記載のシステム。
（項目６２）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、およびこの場合において前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目６１に記載のシステム。
（項目６３）
前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、別個の第三ベクター上にあり、第三ベクターの５’ＲＲＳと第三ベクターの３’ＲＲＳに隣接されている、項目６０に記載のシステム。
（項目６４）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第一ベクター中にあり、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にあり、前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および第一の追加ＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一であり、この場合において前記第一の追加ＲＲＳは、前記第一と第二のＲＲＳの間の前記第一の座位中に含まれる、項目６３に記載のシステム。
（項目６５）
前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第一ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第二ベクターに含まれる前記残りの選択マーカー遺伝子の５’末端に配置される、項目６４に記載のシステム。
（項目６６）
第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目６１に記載のシステム。
（項目６７）
前記第一および第二のＬＣＦが同一である、項目６６に記載のシステム。
（項目６８）
前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクターの前記第二の核酸中にあり、この場合において前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、および前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目６７に記載のシステム。
（項目６９）
前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、別個の第三ベクター中にあり、第三ベクターの５’ＲＲＳと第三ベクターの３’ＲＲＳに隣接されている、項目６７に記載のシステム。
（項目７０）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳはそれぞれ、前記第一の座位中の前記第一のＲＲＳと第二のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および前記第二の座位中の前記第三のＲＲＳと第四のＲＲＳの間に存在する追加ＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目６９に記載のシステム。
（項目７１）
前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第三ベクター中に含まれる選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第二ベクター中に含まれる選択マーカー遺伝子の前記残りの３’部分の５’末端に配置される、項目７０に記載のシステム。
（項目７２）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目６０に記載のシステム。
（項目７３）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸で異なっている、項目７２に記載のシステム。
（項目７４）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で異なっている、項目７２に記載のシステム。
（項目７５）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が各々プロモーターに動作可能に連結されている、項目５１に記載のシステム。
（項目７６）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、項目５１に記載のシステム。
（項目７７）
前記２つの発現強化座位が、配列番号１のヌクレオチド配列を備える座位と、配列番号２のヌクレオチド配列を備える座位を含む、項目７６に記載のシステム。
（項目７８）
（ｉ）項目５１～７７のいずれか１項に記載のシステムを提供すること、
（ｉｉ）前記細胞内に、前記ベクターを、トランスフェクションにより導入すること、および、
（ｉｉｉ）前記ベクター中の前記核酸が、前記ＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記第一および第二の発現強化座位内に統合されている、トランスフェクト細胞を選択すること、を含む方法。
（項目７９）
（ｉｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞から前記抗原結合タンパク質を発現および取得すること、をさらに含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
抗原結合タンパク質を作製する方法であって、項目１～２３のいずれか１項に記載の細胞を提供すること、ならびに前記細胞から前記抗原結合タンパク質を発現および取得すること、を含む、方法。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
第一の発現強化座位内に統合された第一の外因性核酸と、第二の発現強化座位内に統合された第二の外因性核酸を備えた細胞であって、前記第一および第二の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードする、細胞。
（項目２）
前記第一の外因性核酸が、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第二の外因性核酸が、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記第二の外因性核酸が、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目２に記載の細胞。
（項目４）
前記第一および第二のＨＣＦが異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目５）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目３に記載の細胞。
（項目６）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている、項目５に記載の細胞。
（項目７）
前記第一および第二のＣＨドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている、項目５に記載の細胞。
（項目８）
前記第一の外因性核酸が、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目３に記載の細胞。
（項目９）
前記第一および第二のＬＣＦが同一である、項目８に記載の細胞。
（項目１０）
ＨＣＦまたはＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列の各々が、プロモーターに動作可能に連結されている、項目２、３、８のいずれかに記載の細胞。
（項目１１）
第一のＲＲＳと第二のＲＲＳはそれぞれ、前記第一の外因性核酸に対して５’と３’に位置し、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳはそれぞれ、前記第二の外因性核酸に対して５’と３’に位置しており、前記第一と第二のＲＲＳは異なっており、前記第三と第四のＲＲＳは異なっている、項目２に記載の細胞。
（項目１２）
前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳが、互いに異なっている、項目１１に記載の細胞。
（項目１３）
第一の追加ＲＲＳが、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、前記追加ＲＲＳが、前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳの各々と異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目１４）
前記第一の追加ＲＲＳが、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードする隣接ヌクレオチド配列の間に存在する選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有される、項目１３に記載の細胞。
（項目１５）
第一のＲＲＳと第二のＲＲＳはそれぞれ、前記第一の外因性核酸に対して５’と３’に位置し、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳはそれぞれ、前記第二の外因性核酸に対して５’と３’に位置しており、前記第一と第二のＲＲＳは異なっており、前記第三と第四のＲＲＳは異なっている、項目８に記載の細胞。
（項目１６）
前記第一と第二のＨＣＦは同一であり、前記第一と第二のＬＣＦは同一であり、前記第一と第三のＲＲＳが同一であり、前記第二と第四のＲＲＳが同一である、項目１５に記載の細胞。
（項目１７）
前記第一と第二のＨＣＦは異なっており、前記第一と第二のＬＣＦは同一であり、前記第一、第二、第三および第四のＲＲＳが互いに異なる、項目１５に記載の細胞。
（項目１８）
第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、前記第一の追加ＲＲＳは、前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳと異なっている、項目１６または１７に記載の細胞。
（項目１９）
前記第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第一の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有される、項目１８に記載の細胞。
（項目２０）
第二の追加ＲＲＳが、前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、この場合において前記第一および第二のＲＲＳが、同一または異なっており、各々、前記第一、第二、第三および第四のＲＲＳと異なっている、項目１８に記載の細胞。
（項目２１）
前記第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第一の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有され、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第二の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有され、前記第一および第二の選択マーカー遺伝子が異なっている、項目２０に記載の細胞。
（項目２２）
前記抗原結合タンパク質が、一特異性である、項目２に記載の細胞。
（項目２３）
前記抗原結合タンパク質が、二特異性である、項目４に記載の細胞。
（項目２４）
第一の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、および第二のＲＲＳ、
第二の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第四のＲＲＳ、を備える細胞であって、
前記第一および第二のＲＲＳが異なっており、前記第三および第四のＲＲＳが異なっている、細胞。
（項目２５）
前記第一の外因性核酸が、第一の選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子を備え、前記第一と第二の選択マーカー遺伝子が異なっている、項目２４に記載の細胞。
（項目２６）
前記第一の外因性核酸が、第一の追加ＲＲＳをさらに備え、前記第一の追加ＲＲＳが、第一および第二のＲＲＳとは異なっている、項目２５に記載の細胞。
（項目２７）
前記第二の外因性核酸が、第二の追加ＲＲＳをさらに備え、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっている、項目２６に記載の細胞。
（項目２８）
前記第一の外因性核酸が、第一の選択マーカー遺伝子、第一の追加ＲＲＳ、および第一の追加選択マーカー遺伝子を備え、前記第一の選択マーカー遺伝子および第一の追加選択マーカー遺伝子が異なっており、前記第一の追加ＲＲＳが、前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっている、項目２４に記載の細胞。
（項目２９）
前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子、第二の追加ＲＲＳ、および第二の追加選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の選択マーカー遺伝子および第二の追加選択マーカー遺伝子が互いに異なっており、ならびに前記第一の選択マーカー遺伝子および第一の追加選択マーカー遺伝子とも異なっており、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっている、項目２７に記載の細胞。
（項目３０）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、項目１～２９のいずれかに記載の細胞。
（項目３１）
２つの発現強化座位のうちの１つは、配列番号１に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、配列番号２に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、および配列番号３に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列からなる群から選択される、項目３０に記載の細胞。
（項目３２）
細胞において二特異性抗原結合タンパク質を発現するベクターセットであって、
５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および第二のＲＲＳを備えた第一ベクター、
５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二のＨＣをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および第四のＲＲＳを備えた第二ベクター、
および前記第一ベクター中の前記第一の核酸内、または前記第一および第二ベクターとは異なる第三ベクター中のいずれかにある、第一のＬＣをコードするヌクレオチド配列を備え、
この場合において前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳが異なっており、
ならびに前記二特異性抗原結合タンパク質が、前記第一のＨＣＦ、前記第二のＨＣＦ、および前記第一のＬＣＦを備え、ならびに前記第一および第二のＨＣＦが異なっている、ベクターセット。
（項目３３）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内にある、項目３２に記載のベクターセット。
（項目３４）
前記第一の核酸が、第一の選択マーカー遺伝子をさらに備える、項目３４に記載のベクターセット。
（項目３５）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第三ベクター中にあり、および５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記３’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳと同じであり、前記５’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記５’ＲＲＳは前記第二のＲＲＳと同じであり、前記３’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっている、項目３２に記載のベクターセット。
（項目３６）
前記第一および第三ベクターの間の共通ＲＲＳは、前記第一および第三ベクターの内の１つの選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、そして前記他方のベクターの選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される、項目３５に記載のベクターセット。
（項目３７）
第二ベクター中の前記第二の核酸内、または前記第一、第二、および第三ベクターとは別の第四ベクター中のいずれかである、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目３２に記載のベクターセット。
（項目３８）
前記第一および第二のＬＣＦが同一である、項目３７に記載のベクターセット。
（項目３９）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内であり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第四ベクター上にある、項目３８に記載のベクターセット。
（項目４０）
前記第四ベクター上の前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳおよび第四のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記５’ＲＲＳは前記第四のＲＲＳと同一であり、前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳおよび第四のＲＲＳとは異なっている、項目３９に記載のベクターセット。
（項目４１）
前記第二および第四ベクターの間の前記共通ＲＲＳは、前記第二および第四ベクターの内の１つの選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、そして前記他方のベクターの選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される、項目４０に記載のベクターセット。
（項目４２）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内であり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第二ベクター上の前記第二の核酸内である、項目３８に記載のベクターセット。
（項目４３）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第三ベクター上にあり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第四ベクター上にある、項目３８に記載のベクターセット。
（項目４４）
前記第三ベクター上の第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳおよび３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記第三ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記第三ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なっており、およびこの場合において前記第四ベクター上の前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳおよび３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記第四ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第四ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記第四ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一であり、前記第四ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第三および前記第四のＲＲＳとは異なっている、項目４３に記載のベクターセット。
（項目４５）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目３２に記載のベクターセット。
（項目４６）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸で異なっている、項目４５に記載のベクターセット。
（項目４７）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で異なっている、項目４５に記載のベクターセット。
（項目４８）
可変領域をコードするヌクレオチド配列の各々が、独立してプロモーターに連結されている、項目３２に記載のベクターセット。
（項目４９）
前記第一および第二のＲＲＳ、ならびに／または前記第三および第四のＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目３２に記載のベクターセット。
（項目５０）
細胞の第一の発現強化座位内への統合のための５’相同アームと３’相同アームに隣接される、第一の核酸を備える第一ベクター、および
前記細胞の第二の発現強化座位内への統合のための５’相同アームと３’相同アームに隣接される、第二の核酸を備える第二ベクター、を備えるベクターセットであって、
前記第一および第二の核酸がともに抗原結合タンパク質をコードする、ベクターセット。
（項目５１）
細胞およびベクターセットを備えるシステムであって、
前記細胞が、
第一の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、および第二のＲＲＳ、
第二の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第四のＲＲＳ、を備え、
この場合において前記第一および第二のＲＲＳが異なっており、前記第三および第四のＲＲＳが異なっており、ならびにこの場合において前記第一および第二の発現強化座位が異なっており、
前記ベクターセットが、
５’から３’の方向に、第一ベクターの５’ＲＲＳ、第一の核酸、および第一ベクターの３’ＲＲＳを備えた第一ベクターであって、前記第一ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは異なっている、第一ベクター、
５’から３’の方向に、第二ベクターの５’ＲＲＳ、第二の核酸、および第二ベクターの３’ＲＲＳを備えた第二ベクターであって、前記第二ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは異なっている、第二ベクター、
第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列の内の１つは、前記第一の核酸中にあり、他方のヌクレオチド配列は前記第二の核酸中にあり、この場合において前記第一のＨＣＦと前記第一のＬＣＦは、抗原結合タンパク質の領域である、ヌクレオチド配列、を備え、
この場合において前記ベクターが前記細胞内に導入されると、前記ベクター中の前記第一および第二の核酸がそれぞれ、前記ＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記第一の発現強化座位内と前記第二の発現強化座位内に統合する、システム。
（項目５２）
前記抗原結合タンパク質が、一特異性抗原結合タンパク質である、項目５１に記載のシステム。
（項目５３）
前記第一および第三のＲＲＳは同一であり、前記第二および第四のＲＲＳは同一である、項目５２に記載のシステム。
（項目５４）
第一の追加ＲＲＳは、前記第一座位中の前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳの間に存在する、項目５３に記載のシステム。
（項目５５）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳおよび第三のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳ、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および前記第一の追加ＲＲＳは同一であり、ならびに前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二および第四のＲＲＳと同一である、項目５４に記載のシステム。
（項目５６）
前記ＶＬをコードするヌクレオチド配列は、前記第一ベクター中にあり、前記ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にある、項目５５に記載のシステム。
（項目５７）
前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される、項目５５に記載のシステム。
（項目５８）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、およびこの場合において前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目５２に記載のシステム。
（項目５９）
前記抗原結合タンパク質が、二特異性抗原結合タンパク質である、項目５２に記載のシステム。
（項目６０）
前記第一のＨＣＦとは異なる第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目５９に記載のシステム。
（項目６１）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は両方とも、前記第一ベクター中の前記第一核酸内に含まれ、および前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にある、項目６０に記載のシステム。
（項目６２）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、およびこの場合において前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目６１に記載のシステム。
（項目６３）
前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、別個の第三ベクター上にあり、第三ベクターの５’ＲＲＳと第三ベクターの３’ＲＲＳに隣接されている、項目６０に記載のシステム。
（項目６４）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第一ベクター中にあり、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にあり、前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および第一の追加ＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一であり、この場合において前記第一の追加ＲＲＳは、前記第一と第二のＲＲＳの間の前記第一の座位中に含まれる、項目６３に記載のシステム。
（項目６５）
前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第一ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第二ベクターに含まれる前記残りの選択マーカー遺伝子の５’末端に配置される、項目６４に記載のシステム。
（項目６６）
第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目６１に記載のシステム。
（項目６７）
前記第一および第二のＬＣＦが同一である、項目６６に記載のシステム。
（項目６８）
前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクターの前記第二の核酸中にあり、この場合において前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、および前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目６７に記載のシステム。
（項目６９）
前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、別個の第三ベクター中にあり、第三ベクターの５’ＲＲＳと第三ベクターの３’ＲＲＳに隣接されている、項目６７に記載のシステム。
（項目７０）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳはそれぞれ、前記第一の座位中の前記第一のＲＲＳと第二のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および前記第二の座位中の前記第三のＲＲＳと第四のＲＲＳの間に存在する追加ＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目６９に記載のシステム。
（項目７１）
前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第三ベクター中に含まれる選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第二ベクター中に含まれる選択マーカー遺伝子の前記残りの３’部分の５’末端に配置される、項目７０に記載のシステム。
（項目７２）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目６０に記載のシステム。
（項目７３）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸で異なっている、項目７２に記載のシステム。
（項目７４）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で異なっている、項目７２に記載のシステム。
（項目７５）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が各々プロモーターに動作可能に連結されている、項目５１に記載のシステム。
（項目７６）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、項目５１に記載のシステム。
（項目７７）
前記２つの発現強化座位が、配列番号１のヌクレオチド配列を備える座位と、配列番号２のヌクレオチド配列を備える座位を含む、項目７６に記載のシステム。
（項目７８）
（ｉ）項目５１～７７のいずれか１項に記載のシステムを提供すること、
（ｉｉ）前記細胞内に、前記ベクターを、トランスフェクションにより導入すること、および、
（ｉｉｉ）前記ベクター中の前記核酸が、前記ＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記第一および第二の発現強化座位内に統合されている、トランスフェクト細胞を選択すること、を含む方法。
（項目７９）
（ｉｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞から前記抗原結合タンパク質を発現および取得すること、をさらに含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
抗原結合タンパク質を作製する方法であって、項目１～２３のいずれか１項に記載の細胞を提供すること、ならびに前記細胞から前記抗原結合タンパク質を発現および取得すること、を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【0056】
【図1】図１ 従来的な一特異性抗体に対し、複数の発現強化座位内への統合と１つの発現強化座位内への統合を比較した、抗体クローニング戦略の例である。２個のベクターを宿主細胞にトランスフェクトした。第一ベクターはたとえば軽鎖など抗体鎖１（ＡｂＣ１）をコードする核酸、第二ベクターはたとえば重鎖など抗体鎖２（ＡｂＣ２）をコードする核酸、および宿主細胞の標的座位内に統合されたマーカーとは異なる選択マーカーを担持している。５’から３’へ：ベクター構築物のＲＲＳ１、中間ＲＲＳ３、およびＲＲＳ２の部位は、宿主細胞の座位内の選択マーカーに隣接するＲＲＳ部位と合致する。宿主細胞にトランスフェクトされる追加のベクターは、リコンビナーゼをコードする。第二ベクターの選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、その２つのベクターは、連結し、マーカーを発現できるよう操作されているため、抗生物質中で増殖する陽性リコンビナントクローンが選択される。あるいは蛍光マーカーによって、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）解析を用いた陽性クローンの選択が可能となる。たとえばＥＥＳＹＲ（登録商標）座位（座位１）などの単一座位での部位特異的統合用に、同じベクターを利用してもよい。
【0057】
【0058】
【図3】図３ ３つの抗体鎖にコードされる二特異性抗体に対する、２つの別個の発現強化部位内への統合と、１つの発現強化座位内への統合を比較した、抗体クローニング戦略の例。３つのベクターをこの二特異性戦略に利用した。第一ベクターは、ＥＥＳＹＲ（登録商標）（配列番号１；座位１）への統合のための、ＲＲＳ１とＲＲＳ３に隣接した、たとえば共通軽鎖などの抗体鎖１（ＡｂＣ１）をコードする核酸を担持する。第二ベクターは、配列番号２の座位への統合のための、ＲＲＳ４とＲＲＳ６に隣接した、上流選択マーカーを有する、たとえば重鎖などの抗体鎖２（ＡｂＣ２）を担持する。そしてさらに第三ベクターは、第二ベクター中の選択マーカーとは異なる選択マーカーに連結され、およびベクターカセット中で、ＲＲＳ４により５’が、ＲＲＳ５により３’が隣接した（５’および３’ＲＲＳは、配列番号２を備えた座位で宿主細胞中のＲＲＳ部位に合致した）、たとえば第二（異なる）重鎖など抗体鎖３（ＡｂＣ３）に連結された第二のコピーＡｂＣ１をコードする核酸を担持する。たとえばＥＥＳＹＲ（登録商標）座位（配列番号１を備えている；座位１）などの単一座位での部位特異的統合用に、示されている２つのベクターシステムを利用してもよい。各産生細胞株の力価が解析された。図５を参照のこと。
【0059】
【図4】図４ ３つまたは４つの抗体鎖にコードされる二特異性抗体に対し、２つの別個の発現強化部位内への統合と、１つの発現強化座位内への統合を比較した、抗体クローニング戦略の例。４つのベクターをこの二特異性戦略に利用する。第一ベクターは、ＥＥＳＹＲ（登録商標）（配列番号１；座位１）への統合のための、ＲＲＳ１とＲＲＳ３に隣接した、たとえば第一軽鎖などの抗体鎖１（ＡｂＣ１）をコードする核酸を担持する。第二ベクターは、ＲＲＳ３により５’が、ＲＲＳ２により３’が隣接した、上流選択マーカーを有する、たとえば重鎖などの抗体鎖２（ＡｂＣ２）を担持し、これもまたＥＥＳＹＲ（登録商標）座位（配列番号１を備える；座位１）へ統合される。そして第三ベクターは、第二ベクター中の選択マーカーとは異なる選択マーカーをコードし、ベクターカセット中で、ＲＲＳ６により５’が、ＲＲＳ５により３’が隣接した（５’および３’ＲＲＳは、配列番号２を備えた座位；座位２で、宿主細胞中のＲＲＳ部位に合致した）、たとえば第二（異なる）重鎖など抗体鎖３（ＡｂＣ３）に連結された核酸を担持する。そしてさらに第四ベクターは、たとえば抗体鎖１（ＡｂＣ１）（ただし、第一の軽鎖と同じであっても、異なっていてもよい）などの第二の軽鎖をコードする核酸を担持する。たとえばＥＥＳＹＲ（登録商標）座位（配列番号１を備えている；座位１）と、配列番号２または配列番号３を備えた座位などの２つの座位での部位特異的統合用に、示されている４つのベクターシステムを利用してもよい。１つの座位（ＥＥＳＹＲ（登録商標）座位；座位１）で、この４ベクターシステムを、２ベクターシステム統合と比較する。
【0060】
【図5】図５ ２つの発現強化座位内への統合と、１つの発現強化座位内への統合を比較するために、２ベクタークローニング戦略を使用したところ、二特異性抗体Ｃと二特異性抗体Ｄがクローニングされた。細胞を単離し、１２日間の流加培養に供し、その後、採取して、固定抗Ｆｃと第二抗Ｆｃ＊（改変Ｆｃ検出抗体。ＵＳ２０１４－０１３４７１９Ａ１を参照のこと。２０１４年５月１５日公開）を使用してＯｃｔｅｔ力価アッセイを行った。また細胞は同質遺伝子的であり、安定であることも観察された。総合的な二特異性力価（ヘテロ二量体形成）は、１統合部位での二特異性抗体（ヘテロ二量体）の発現と比較して、２部位統合法を利用した場合には１．７５～２倍に増加したことが観察された。
【0061】
【図6】図６Ａおよび図６Ｂ 二特異性抗体Ｅ（Ａｂ Ｅ）、二特異性抗体Ｆ（Ａｂ Ｆ）、二特異性抗体Ｇ（Ａｂ Ｇ）、および二特異性抗体Ｈ（Ａｂ Ｈ）が、ＲＳＸまたはＲＳＸ２ＢＰにおいてクローニングされた。各二特異性抗体発現細胞は、１発現強化座位（ＲＳＸ）または２発現強化座位（ＲＳＸ２ＢＰ）のいずれかにおいて、（共通）軽鎖ヌクレオチド、重鎖ヌクレオチド（野生型Ｆｃ）および改変重鎖ヌクレオチド（Ｆｃ＊）を備えている。細胞を単離し、バイオリアクター中で１３日間の流加培養に供し、その後採取して、ＨＰＬＣ溶出法を行い、全体的な抗体価と二特異性抗体価を決定した（図６Ａ）。総抗体価当たりの、二特異性抗体種の力価の比率（ホモ二量体種から精製分離）は、総Ａｂの割合として決定された（図６Ｂ）。
【0062】
【発明を実施するための形態】
【0063】
用語の定義
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互結合した２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖から構成されるイムノグロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域を備える場合がある。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインとヒンジを備える。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本発明においてＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域に割り込まれている。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲによって構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３として省略されてもよく、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３として省略されてもよい）。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互結合した２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖から構成されるイムノグロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域を備える場合がある。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインとヒンジを備える。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本発明においてＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域に割り込まれている。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲによって構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３として省略されてもよく、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３として省略されてもよい）。
【0064】
「抗原結合タンパク質」という文言は、少なくとも１つのＣＤＲを有するタンパク質を含み、抗原を選択的に認識することができる。すなわち、少なくともマイクロモル単位のＫＤで抗原に結合することができる。治療用抗原結合タンパク質（たとえば治療用抗体）はしばしば、ナノモルまたはピコモル単位のＫＤを必要とする。典型的には、抗原結合タンパク質は２個以上のＣＤＲ、たとえば２個、３個、４個、５個、または６個のＣＤＲを含む。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、たとえば抗体の重鎖と軽鎖の可変領域を含有するポリペプチドなどの抗体の抗原結合断片（たとえば、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ’）２断片）、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域と、重鎖および／または軽鎖の定常領域由来の追加アミノ酸（たとえば１個以上の定常ドメイン、すなわち、ＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのうちの１つ以上）を含有するタンパク質が挙げられる。
【0065】
「二特異性抗原結合タンパク質」という文言は、２個の異なる分子（たとえば抗原）上、または同じ分子上（たとえば同じ抗原上）のいずれかの２個以上のエピトープに対して、選択的に結合することができる、または異なる特異性を有する抗原結合タンパク質を含む。かかるタンパク質の抗原結合部分、または抗原結合断片部分（Ｆａｂ）は、特定の抗原に対する特異性をもたらし、典型的にはイムノグロブリンの重鎖可変領域と軽鎖可変領域から構成される。一部の環境下では、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、同系ペアではない場合があり、言い換えれば異なる結合特異性を有する場合がある。
【0066】
二特異性抗原結合タンパク質の例は、「二特異性抗体」であり、これには２個以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体が含まれる。二特異性抗体は、多くの場合、２個の異なる重鎖を備え、各重鎖は２個の異なる分子（例えば抗原）上、または同じ分子上（例えば同じ抗原上）のいずれかの異なるエピトープに特異的に結合する。二特異性抗原結合タンパク質が、２つの異なるエピトープ（第一のエピトープと第二のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第一のエピトープに対する第一重鎖の可変領域のアフィニティは概して、第二のエピトープに対する第一重鎖の可変領域のアフィニティよりも少なくとも１～２桁、または３桁もしくは４桁低く、その逆もまた然りである。二特異性抗原結合タンパク質、たとえば二特異性抗体は、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変領域を含んでもよい。典型的な二特異性抗体は、２つの重鎖を有しており、その重鎖は各々、３つの重鎖ＣＤＲを有し、それに続けて（Ｎ末端からＣ末端方向に）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有している。また典型的な二特異性抗体は、イムノグロブリン軽鎖を有しており、そのイムノグロブリン軽鎖は、抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合可能であるか、または各重鎖と会合可能でありかつ重鎖抗原結合領域に結合するエピトープの１つ以上を結合させることができるか、または各重鎖と会合可能でありかつ重鎖の一方もしくは両方をエピトープの一方もしくは両方に結合させることができる。１つの実施形態では、Ｆｃドメインは少なくともＣＨ２とＣＨ３を含む。Ｆｃドメインは、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含んでもよい。
【0067】
ある具現化された二特異性形式は、第一重鎖（ＨＣ）、改変ＣＨ３（ＨＣ＊）を有する第二重鎖、および共通軽鎖（ＬＣ）（２コピーの同一軽鎖）を含む。別の実施形態では、第一重鎖（ＨＣ）、共通ＬＣ、およびＨＣ－ＳｃＦｖ融合ポリペプチドを含む（この場合、第二ＨＣは、ＳｃＦｖのＮ末端に融合されている）。別の実施形態では、第一重鎖（ＨＣ）、同系ＬＣ、ＨＣ－ＳｃＦｖ融合ポリペプチドを含む（この場合、第二ＨＣは、ＳｃＦｖのＮ末端に融合されている）。別の実施形態では、第一重鎖（ＨＣ）、ＬＣおよびＦｃドメインを含む。別の実施形態では、第一ＨＣ、ＬＣ、ＳｃＦｖ－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む（この場合、Ｆｃは、ＳｃＦｖのＣ末端に融合されている）。別の実施形態では、第一ＨＣ、共通ＬＣ、およびＦｃ－ＳｃＦｖ融合ポリペプチドを含む（この場合、Ｆｃは、ＳｃＦｖのＮ末端に融合されている）。別の実施形態では、第一ＨＣ、ＬＣ、およびＳｃＦｖ－ＨＣを含む（この場合、第二ＨＣは、ＳｃＦｖのＣ末端に融合されている）。
【0068】
ある実施形態では、１つの重鎖（ＨＣ）は、天然型または「野生型」の配列であってもよく、第二重鎖は、Ｆｃドメインが改変されていてもよい。他の実施形態では、１つの重鎖（ＨＣ）は、天然型または「野生型」の配列であってもよく、第二重鎖は、コドン改変されていてもよい。
【0069】
「細胞」という用語は、組み換え型核酸配列の発現に適しており、外因性核酸の安定した統合および強化された発現を可能とする座位を有する任意の細胞を含む。細胞としては、たとえば非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合、例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマなどの哺乳類細胞が挙げられる。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は、以下の細胞から選択される哺乳類細胞である：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および前述細胞から派生する細胞株。一部の実施形態では、細胞は、一つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞）を備えている。
【0070】
「細胞密度」とは、サンプル体積当たりの細胞数を指し、たとえば１ｍＬ当たりの細胞総数（生細胞および死細胞）である。細胞数は、手作業で、またはたとえばフローサイトメーターを用いて自動で計数されてもよい。自動細胞カウンターは、トリパンブルー取り込み標準法などを使用して、生細胞または死細胞または生／死細胞の両方を計数するよう適合されている。「生細胞密度」または「生細胞濃度」という文言は、サンプル体積当たりの生細胞数を指す（「生細胞数」とも呼称される）。多くの公知の手を用いた技術または自動化された技術を使用して細胞密度を決定してもよい。培養物のオンラインバイオマス測定が計測されてもよく、キャパシタンスまたは光学的密度が体積当たりの細胞数と相関している。たとえば製造培養などの細胞培養中の最終細胞密度は、開始細胞株に応じて、たとえば約１．０～１０ｘ１０６細胞／ｍＬの範囲で変化する。一部の実施形態では、最終細胞密度は、製造細胞培養から対象タンパク質を採取する前に１．０～１０ｘ１０６細胞／ｍＬに達する。他の実施形態では、最終細胞密度は、５．０ｘ１０６細胞／ｍＬ超、６ｘ１０６細胞／ｍＬ超、７ｘ１０６細胞／ｍＬ超、８ｘ１０６細胞／ｍＬ超、９ｘ１０６細胞／ｍＬ超、または１０ｘ１０６細胞／ｍＬ超に達する。
【0071】
「コドン改変された」という用語は、タンパク質コードヌクレオチド配列が、１つ以上のヌクレオチド、すなわち１つ以上のコドンで、そのコドンにコードされるアミノ酸を変化させることなく改変され、当該ヌクレオチド配列のコドン改変型を生じさせることを意味する。ヌクレオチド配列のコドン改変は、核酸系アッセイ（たとえばとくにハイブリダイゼーション系アッセイ、ＰＣＲなど）において、そのコドン改変型からヌクレオチド配列を識別する簡便な基盤を提供することができる。一部の例では、当分野に公知のコドン最適化技術を使用することにより、コードされたタンパク質の宿主細胞中の発現が改善または最適化されるようにヌクレオチド配列のコドンが改変される（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２：３４６－３５３；Ｃｈｕｎｇ，Ｂ．Ｋ．－Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６７：３２６－３３３；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，８３（１）：３７－４６）。かかる技術を使用した配列設計ソフトウェアツールも当分野に公知であり、限定されないが、とくにＣｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ（Ｆｕｇｌｓａｎｇ Ａ．２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，３１：２４７－２４９）、Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ Ａ，ｅｔ ａｌ．，２００６，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ，７：２８５）、およびＯＰＴＩＭＩＺＥＲ（Ｐｕｉｇｂｏ Ｐ，ｅｔ ａｌ．２００７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：Ｗ１２６－Ｗ１３１）が挙げられる。
【0072】
「相補性決定領域」という文言または「ＣＤＲ」という用語には、生物体のイムノグロブリン遺伝子の核酸配列にコードされるアミノ酸配列が含まれ、該アミノ酸配列は通常（すなわち、野生型動物では）、イムノグロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域中の２つのフレームワーク領域の間に存在する。ＣＤＲは、例えば生殖細胞系の配列または再構成配列もしくは非再構成配列によってコードされ、例えば、ナイーヴＢ細胞もしくは成熟Ｂ細胞またはＴ細胞によってコードされ得る。一部の環境下（例えば、ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系配列）によりコードすることができ、その２つ以上の配列は（例えば、非再構成核酸配列においては）連続していないが、配列のスプライシングまたは連結（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ－Ｄ－Ｊ再構成）の結果として、Ｂ細胞核酸配列では連続している。
【0073】
「発現強化座位」という用語は、細胞ゲノム中の座位を指し、当該座位は、配列を含有し、当該配列中に、または当該配列の近くに適切な遺伝子または構築物が外生的に加えられた（すなわち統合された）場合に、または当該配列に「動作可能に連結された」場合に、ゲノム中の他の領域または配列と比較して高い発現レベルを示す。
【0074】
発現強化を記載するために使用される場合、「強化された」という用語は、ゲノム中に外因性配列が無作為に統合されたことにより、または別の座位に統合されたことにより通常観察される発現よりも、たとえば同じ発現構築物の単一コピーのさまざまな無作為統合物と比較して、少なくとも約１．５倍～少なくとも約３倍の発現強化を含む。本発明配列を使用して観察された倍数発現強化は、同じ遺伝子の発現レベルとの比較であり、本発明配列が非存在下で、実質的に同じ条件下で測定され、たとえば同種ゲノム内に別の座位で統合された場合と比較している。強化組み換え効率は、座位の組み換え能力（例えば、リコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）の利用）の強化を含む。強化とは、無作為組み換えを越える組み換え効率を指し、たとえばリコンビナーゼ認識部位または同種物を利用しない場合は通常、０．１％である。好ましい強化組み換え効率は、無作為の約１０倍であり、または約１％である。特定されない限り、特許請求される発明は特定の組み換え効率に限定されない。発現強化座位は多くの場合、宿主細胞による対象タンパク質の高い生産性を支持する。ゆえに強化発現には、単純に培養中の細胞のコピー数が多いことによって高い力価を得ることよりも、細胞当たりの対象タンパク質の産生が高いことを含む（タンパク質１グラム当たりの力価が高い）。特異的生産性Ｑｐ（ｐｇ／細胞／日、すなわちｐｃｄ）は、持続可能な生産性の測定とみなされる。５ｐｃｄよりも高い、１０ｐｃｄよりも高い、または１５ｐｃｄよりも高い、または２０ｐｃｄよりも高い、または２５ｐｃｄよりも高い、またはさらに３０ｐｃｄよりも高いＱｐを示す組み換え宿主細胞が望ましい。発現強化座位または「ホットスポット」に対象遺伝子が挿入された宿主細胞は、高い特異的生産性を示す。
【0075】
「外生的に加えられた遺伝子」、「外生的に加えられた核酸」、または単純に「外因性核酸」という文言が、対象座位に関連して使用された場合、当該文言は、当該座位が自然界に存在する場合には対象座位内に存在しない任意のＤＮＡ配列または遺伝子を指す。たとえば、ＣＨＯ座位（たとえば、配列番号１または配列番号２の配列を備えた座位）内の「外因性核酸」は、自然界の特定のＣＨＯ座位内には存在しないハムスターの遺伝子（すなわち、ハムスターゲノムの別の座位に由来するハムスター遺伝子）、任意の他の種に由来する遺伝子（たとえば、ヒトの遺伝子）、キメラ遺伝子（たとえば、ヒト／マウス）、または自然界でＣＨＯ座位内に存在することが判明していない任意の他の遺伝子であってもよい。
【0076】
「重鎖」または「イムノグロブリン重鎖」という文言には、任意の生物体由来のイムノグロブリン重鎖定常領域配列が含まれ、特別の規定がない限り、重鎖可変ドメインが含まれる。特別の規定がない限り、重鎖可変ドメインには、３つの重鎖ＣＤＲと４つのＦＲ領域とが含まれる。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端方向に）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを備える。「重鎖の断片」という用語は、重鎖の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のアミノ酸のペプチドを含み、１つ以上のＣＤＲ、１つ以上のＦＲ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２もしくはＣＨ３、可変領域、定常領域、定常領域の断片（たとえば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上と組み合わされた１つ以上のＣＤＲを含んでもよい。ＨＣＦの例としては、ＶＨｓ、およびＦｃ領域のすべて、または一部が挙げられる。「ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列」という文言は、ＨＣＦからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ＨＣＦを含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、たとえば、特定のＨＣＦに加えて追加アミノ酸を含有し得るポリペプチドを含む。たとえば、ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列はとくに、ＶＨからなるポリペプチド、ＣＨ３に連結されたＶＨからなるポリペプチド、全長重鎖からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0077】
核酸配列に関する文脈において「相同配列」とは、参照核酸配列に対し、実質的に相同な配列を指す。一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応ヌクレオチドの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が同一の場合、実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は完全（すなわち、全長）配列である。
【0078】
「軽鎖」という文言には、任意の生物体由来のイムノグロブリン軽鎖定常領域配列が含まれ、別段の規定がない限り、ヒトカッパ軽鎖およびヒトラムダ軽鎖が含まれる。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインには、特別の規定がない限り、３つの軽鎖ＣＤＲと４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が含まれるのが典型的である。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＶＬドメインと、軽鎖定常ドメインとが含まれる。本発明で使用可能な軽鎖には、例えば、二特異性抗体に選択的に結合される第一エピトープまたは第二エピトープのいずれにも選択的に結合しない軽鎖が含まれる。また、適切な軽鎖として、抗体の抗原結合領域に結合される１つまたは両方のエピトープに結合することができる、または結合に寄与することができる軽鎖が挙げられる。「軽鎖の断片」または「軽鎖断片」（または「ＬＣＦ」）という文言は、軽鎖の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のアミノ酸のペプチドを含み、１つ以上のＣＤＲ、１つ以上のＦＲ、可変領域、定常領域、定常領域の断片またはそれらの組み合わせと組み合わされた１つ以上のＣＤＲを含んでもよい。ＬＣＦの例としては、ＶＬｓおよび軽鎖定常領域（ＣＬｓ）の全部または一部が挙げられる。「ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列」という文言は、ＬＣＦからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ＬＣＦを含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、たとえば、特定のＬＣＦに加えて追加アミノ酸を含有し得るポリペプチドを含む。たとえば、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列はとくに、ＶＬからなるポリペプチド、または全長軽鎖からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0079】
「動作可能に連結された」という文言は、連結された分子が意図されるように機能する様式での、核酸またはタンパク質の連結を指す。相互に機能的に関係しているとき、ＤＮＡ領域は動作可能に連結される。例えば、プロモーターが配列の転写に参画する能力を有す場合、プロモーターはコード配列に動作可能に連結し；リボソーム結合部位は、翻訳を許容するように位置する場合、コード配列に動作可能に連結する。一般的に、動作可能に連結しているとは、連続性を含むことができるが、連続性を必要としない。分泌リーダーなどの配列の場合には、連続性およびリーディングフレーム内での適正な配置は典型的な特徴である。対象座位の発現強化配列は、対象遺伝子（ＧＯＩ）と機能的に関連付けられている場合、例えば、その存在が結果としてＧＯＩの発現の強化をもたらす場合、ＧＯＩに動作可能に連結されている。
【0080】
「同一性割合」とは、対象座位、たとえば配列番号１または配列番号２またはそれらの断片を記載する場合、連続相同領域に沿って同一性の列挙を示す相同性配列を含むことを意味するが、比較配列中の相同性が無いギャップ、欠失、または挿入は、同一性割合の算出に考慮されない。
【0081】
本明細書に使用される場合、たとえば配列番号１またはその断片と種ホモログの間の「同一性割合」の決定は、その種ホモログが、アライメントにおいて比較を行うための相同配列を有していない配列の比較は含まない（すなわち、配列番号１またはその断片が、その点で挿入を有しているか、または場合によっては種ホモログがギャップまたは欠失を有している配列の比較は含まない）。ゆえに「同一性割合」は、ギャップ、欠失および挿入のペナルティを含まない。
【0082】
「認識部位」または「認識配列」は、ヌクレアーゼに認識される特定のＤＮＡ配列、またはＤＮＡ骨格に結合し、部位特異的切断を指示する他の酵素により認識される特定のＤＮＡ配列である。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子内でＤＮＡを切断する。認識部位は当分野において、認識標的部位とも呼称される。
【0083】
「リコンビナーゼ認識部位」（「ＲＲＳ」）は、たとえばＣｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）またはフリッパーゼ（ｆｌｐ）などのリコンビナーゼにより認識される特定のＤＮＡ配列である。部位特異的リコンビナーゼは、その標的認識配列のうちの１つ以上が生物ゲノム内に戦略的に配置された場合、欠失、転位、および転座を含むＤＮＡ再構成を実行することができる。１つの例では、Ｃｒｅは、そのＤＮＡ標的認識部位であり、８ｂｐのスペーサーにより分離される２個の１３ｂｐの逆位リピートから構成されるｌｏｘＰで、組み換え事象を特異的に介在する。２つ以上のリコンビナーゼ認識部位を使用して、たとえば組み換え介在性のＤＮＡ交換を促進することができる。リコンビナーゼ認識部位、たとえばｌｏｘ部位などの多様体または変異体を使用してもよい（Ａｒａｋｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０：１９，ｅ１０３）。
【0084】
「リコンビナーゼ介在性カセット交換」または「ＲＭＣＥ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ）」は、ゲノム標的カセットを、ドナーカセットと正確に置換させるプロセスに関する。このプロセスを実行するために通常提供される分子構成は、１）特定のリコンビナーゼに対し特異的な認識標的部位により、５’と３’の両方に隣接されたゲノム標的カセット、２）認識標的部位を合致させることにより隣接されたドナーカセット、および３）部位特異的リコンビナーゼ、を含む。リコンビナーゼタンパク質は当分野に公知であり（Ｔｕｒａｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｂｏｄｅ Ｊ．，２０１１，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２５，ｐｐ．４０８８－４１０７）、ヌクレオチドを付加または欠失させることなく、特定の認識標的部位（ＤＮＡ配列）内で、ＤＮＡを正確に切断することが可能である。普遍的なリコンビナーゼ／部位の組み合わせとしては、限定されないが、Ｃｒｅ／ｌｏｘおよびＦｌｐ／ｆｒｔが挙げられる。ＲＭＣＥ用の、Ｒ４－ａｔｔＰ 部位を含有するベクターと、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼをコードするベクターは、市販のキットでも提供される。（たとえば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０００４９４６号も参照のこと）
【0085】
「部位特異的統合」または「標的挿入」とは、ゲノム中の特定の位置への遺伝子もしくは核酸配列の挿入または統合を指示する、すなわち、連続ポリヌクレオチド鎖中の２つのヌクレオチド間の特定の部位へＤＮＡを移動させるために使用される遺伝子標的化方法を指す。部位特異的な統合または標的挿入は、複数の発現単位またはカセット、たとえば各々自身の制御因子（たとえばプロモーター、エンハンサー、および／または転写終結配列など）を有する複数の遺伝子を含む特定の核酸に対し行われてもよい。「挿入」と「統合」は相互交換可能に使用される。遺伝子または核酸配列（たとえば発現カセットを備えた核酸配列）の挿入は、使用された遺伝子編集技術に応じて１つ以上の核酸の置換または欠失が生じ得る（またはそのように操作され得る）と理解されている。
【0086】
「安定した統合」とは、宿主細胞ゲノム中に統合された外因性核酸が、細胞培養において、たとえば少なくとも７日、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、またはそれ以上の長期間、統合状態を維持することを意味する。大規模な製造および精製を目的とした、二特異性抗原結合タンパク質の製造は難題であると理解されている。安定性およびクローン性は、任意の生物分子、とくに治療用に使用される生物分子の再現性にとって必須である。本開示方法により作製される、二特異性抗体を発現する安定クローンは、治療用生物分子生成のための一貫性と再現性のある手段を提供する。
【0087】
概要
本開示は、宿主細胞、とくにチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）細胞株において、当該宿主細胞中で複数の（たとえば２つの）発現強化座位を使用することによる、複数のポリペプチド発現の改善のための組成物および方法を提供する。より具体的には、本開示は、抗原結合タンパク質をコードする複数の外因性核酸を、たとえばＣＨＯ細胞などの宿主細胞中の複数の発現強化座位内に、部位特異的な様式で統合するよう設計された組成物および方法を提供する。特に本開示は、複数の発現強化座位内に統合された複数の外因性核酸を含有する細胞を提供するものであり、当該複数の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードしている。本開示はさらに、複数の外因性核酸の、複数の発現強化座位内への部位特異的な統合を目的として設計された核酸ベクターを提供する。本開示は、複数の発現強化座位の各々で複数のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）を含有する宿主細胞、および合致ＲＲＳと複数の外因性核酸を含有するベクターセットを含む、当該ベクター由来の複数の外因性核酸を、当該複数の発現強化座位内に部位特異的に統合することを目的としたシステムをさらに提供する。さらに本開示は、本明細書に開示される細胞、ベクター、およびシステムを使用し抗原結合タンパク質を作製する方法を提供する。
本開示は、宿主細胞、とくにチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）細胞株において、当該宿主細胞中で複数の（たとえば２つの）発現強化座位を使用することによる、複数のポリペプチド発現の改善のための組成物および方法を提供する。より具体的には、本開示は、抗原結合タンパク質をコードする複数の外因性核酸を、たとえばＣＨＯ細胞などの宿主細胞中の複数の発現強化座位内に、部位特異的な様式で統合するよう設計された組成物および方法を提供する。特に本開示は、複数の発現強化座位内に統合された複数の外因性核酸を含有する細胞を提供するものであり、当該複数の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードしている。本開示はさらに、複数の外因性核酸の、複数の発現強化座位内への部位特異的な統合を目的として設計された核酸ベクターを提供する。本開示は、複数の発現強化座位の各々で複数のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）を含有する宿主細胞、および合致ＲＲＳと複数の外因性核酸を含有するベクターセットを含む、当該ベクター由来の複数の外因性核酸を、当該複数の発現強化座位内に部位特異的に統合することを目的としたシステムをさらに提供する。さらに本開示は、本明細書に開示される細胞、ベクター、およびシステムを使用し抗原結合タンパク質を作製する方法を提供する。
【0088】
複数の発現強化座位内に部位特異的に統合された複数の外因性核酸を有する細胞
１つの態様において、本開示は、２個の発現強化座位に部位特異的に統合された複数の外因性核酸を含有する細胞を提供するものであり、当該複数の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードしている。当該抗原結合タンパク質は二特異性抗原結合タンパク質、または従来的な（すなわち一特異性）抗原結合タンパク質であってもよい。
１つの態様において、本開示は、２個の発現強化座位に部位特異的に統合された複数の外因性核酸を含有する細胞を提供するものであり、当該複数の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードしている。当該抗原結合タンパク質は二特異性抗原結合タンパク質、または従来的な（すなわち一特異性）抗原結合タンパク質であってもよい。
【0089】
本明細書に提供される細胞は、高い力価および／または高い特異的生産性（ｐｇ／細胞／日）で所望される抗原結合タンパク質を産生することができる。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも１ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ．２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌまたはそれ以上の力価で、抗原結合タンパク質を産生する。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質を産生する細胞は、１日当たり、１細胞当たりで産生される総抗原結合タンパク質（ｐｇ）に基づき決定される特異的生産性が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ピコグラム／細胞／日またはそれ以上である。
【0090】
抗原結合タンパク質をコードし、２つの発現強化座位に統合された外因性核酸を備えた宿主細胞は、製造培養において、高い細胞密度、たとえば１～１０ｘ１０６細胞／ｍＬを示す。他の実施形態では、抗原結合タンパク質をコードする宿主細胞は、最終細胞密度が、（製造培養において）少なくとも５ｘ１０６細胞／ｍＬ、６ｘ１０６細胞／ｍＬ、７ｘ１０６細胞／ｍＬ、８ｘ１０６細胞／ｍＬ、９ｘ１０６細胞／ｍＬ、または１０ｘ１０６細胞／ｍＬに到達する。
【0091】
一部の実施形態では、総抗原結合タンパク質力価に対する二特異性抗原結合タンパク質力価の比率が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％またはそれ以上で、二特異性抗原結合タンパク質を産生することができる細胞が提供される。一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質を産生することができる細胞が提供され、この場合において当該二特異性抗原結合タンパク質の比率は、細胞により産生される総抗原結合タンパク質力価の少なくとも５０％である。
【0092】
他の実施形態では、抗原結合タンパク質を産生することができる細胞が提供され、この場合において２つの座位における発現により産生される総抗原結合タンパク質力価は、１つの座位における発現により産生される総抗原結合タンパク質力価と比較し、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％またはそれ以上高い。ある実施形態では、抗原結合タンパク質を産生することができる細胞が提供され、この場合において２つの座位における発現により産生される総抗原結合タンパク質力価は、１つの座位における発現により産生される総抗原結合タンパク質力価と比較し、少なくとも０．５倍、０．７５倍、１倍、１．５倍、１．７５倍、２倍またはそれ以上高い。
【0093】
一部の実施形態では、細胞は、第一の発現強化座位内の特定部位で統合された第一の外因性核酸と、第二の発現強化座位内の特定部位で統合された第二の外因性核酸を含有し、当該第一および第二の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードしている。第一および第二の外因性核酸はともに、抗原結合タンパク質のＨＣＦまたはＬＣＦ（たとえば可変領域）をコードする複数のヌクレオチド配列を含有する。たとえば一特異性抗体に関しては、一特異性抗原結合タンパク質に対するＨＣＦ（たとえばＶＨ）をコードする１つのヌクレオチド配列と、ＬＣＦ（たとえばＶＬ）をコードする１つのヌクレオチド配列であってもよく、またはそれぞれの複数コピー（たとえば２コピー）であってもよい。二特異性抗体に関しては、各々ＨＣＦをコードする２つのヌクレオチド配列（典型的には、その２つのＨＣＦは互いに異なっている）、１コピーもしくは２コピーのＬＣＦコードヌクレオチド配列、または２つの異なるＬＣＦをコードする２つのヌクレオチド配列であってもよい。抗原結合タンパク質が一特異性か二特異性かに応じて、ＨＣＦまたはＬＣＦ（たとえば可変領域）をコードするヌクレオチド配列は、２つの発現強化座位で異なる多様性または組み合わせで統合されてもよい。たとえば一特異性抗原結合タンパク質に関しては、１つの例で、ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、２つの座位に、各座位で１つずつ別々に統合されてもよい。一方で、別の例では、ＨＣＦとＬＣＦをコードする核酸が１つの座位に統合され、同じＨＣＦと同じＬＣＦをコードする別個の核酸は、別の座位に統合される。二特異性抗原結合タンパク質に関しては、１つの例で、第一のＨＣＦとＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一の座位に統合され、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は第二の座位に統合されてもよい。この場合において、当該２つのＨＣＦは異なっており、ＬＣＦは、二特異性抗原結合タンパク質の共通ＬＣＦである。そして別の例では、第一のＨＣＦとＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一の座位に統合され、第二のＨＣＦと同一ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二の座位に統合される。
【0094】
一部の実施形態において、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、定常領域由来のアミノ酸をコードしてもよい。たとえばＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ１、ＣＨ２、もしくはＣＨ３の組み合わせのうちの１つ以上をコードしてもよく、または定常領域全体をコードしてもよい。一部の実施形態では、ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、ＣＨ３ドメインをコードする。特定の実施形態では、ＨＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、重鎖をコードする。一部の実施形態では、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、軽鎖をコードする。
【0095】
２つのＨＣＦが関与する実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一の定常領域由来のアミノ酸をコードしてもよく、および第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二の定常領域由来のアミノ酸をコードしてもよく、この場合において当該２つの定常領域由来のアミノ酸は、少なくとも１つの位置（たとえば異なるプロテインＡ結合特性を生じさせる位置、または様々な二特異性抗原結合タンパク質に関し本明細書で以下に記載される他の位置）で、同じであっても、異なっていてもよい。アミノ酸における差異にかかわらず、２つの定常領域由来のアミノ酸をコードする２つのヌクレオチド配列は、１つのヌクレオチド配列の１つ以上のコドンを改変することにより識別されることができ、それにより、核酸系アッセイにおいて当該２つのヌクレオチド配列を識別するための簡便な基盤が提供される。
【0096】
一部の実施形態では、各ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、プロモーターを含有する転写制御配列に動作可能に連結される。「独立して」とは、各コード配列が、たとえばプロモーターなどの別個の転写制御配列に動作可能に連結され、それにより、当該コード配列の転写が別個の制御および管理下になることを意味する。一部の実施形態では、２つのＨＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーターは同じである。一部の実施形態では、２つのＨＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーター、ならびにＶＬ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーターはすべて同じであり、たとえばＣＭＶプロモーターなどである。一部の実施形態では、各ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターに動作可能に連結される。誘導性プロモーターおよび抑制性プロモーターによって、生産期（流加培養）でのみ産生が発生し、増殖期（シードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）培養）の間は産生しないことが可能となる。または異なる座位の抗体構成要素（ＨＣＦおよびＬＣＦ）の発現を特異的に正確に管理することが可能となる。各遺伝子産物の産生（発現）の良好な管理は、異なるプロモーターによって達成され得る。
【0097】
そのような１つの例では、細胞は最初にテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）を発現するよう改変され、各ＨＣＦコードヌクレオチド配列とＬＣＦコードヌクレオチド配列は、その活性がＴｅｔＲにより制御されるプロモーターの転写管理下に置かれる。２つのタンデムＴｅｔＲオペレーター（ｔｅｔＯ）は、ＣＭＶプロモーターのすぐ下流に配置される。一部の実施形態では、各ＨＣＦおよび／またはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、少なくとも１つのＴｅｔＲオペレーター（ＴｅｔＯ）またはＡｒｃオペレーター（ＡｒｃＯ）の上流のプロモーターに動作可能に連結される。他の実施形態では、各ＨＣＦおよび／またはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、ＣＭＶ／ＴｅｔＯまたはＣＭＶ／ＡｒｃＯハイブリッドプロモーターに動作可能に連結される。追加の適切なプロモーターを、本明細書において以下に記載する。
【0098】
一部の実施形態では、２つの座位で統合された複数の外因性核酸は、ＲＲＳに隣接される。たとえば、第一のＲＲＳと第二のＲＲＳはそれぞれ、第一の座位で統合された第一の外因性核酸に対し、５’と３’に配置され、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳはそれぞれ、第二の座位で統合された第二の外因性核酸に対し、５’と３’に配置され、この場合において第一のＲＲＳと第二のＲＲＳは異なっており、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳは異なっている。一部の実施形態では、第一、第二、第三、および第四のＲＲＳはすべて互いに異なっている。他の実施形態では、第一のＲＲＳと第三のＲＲＳは同一であり、第二のＲＲＳと第四のＲＲＲＳは同一であり、この場合において第一の外因性核酸はＨＣＦとＬＣＦをコードし、第二の外因性核酸は同じＨＣＦとＬＣＦをコードする。
【0099】
座位で統合された外因性核酸が、２つのＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を含む一部の実施形態では、追加のＲＲＳは、この２つのヌクレオチド配列の間に含有されてもよい。かかる追加のＲＲＳは、当該外因性核酸に隣接する２つのＲＲＳとは異なっていなければならない。一部の実施形態では、追加のＲＲＳは、統合外因性核酸内に含有される選択マーカー遺伝子のイントロン内に挿入され、２つのＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に配置される。転写および転写後プロセシングの後、イントロンは切除され、選択マーカーをコードするｍＲＮＡが生じる。第一の座位で統合された外因性核酸と第二の座位で統合された外因性核酸の両方が、２つのＨＣＦまたはＬＣＦをコードする配列（たとえば、ＬＣＦ－ＨＣＦ１およびＬＣＦ－ＨＣＦ２）を含む実施形態では、追加ＲＲＳは、各座位で、２つのＨＣＦまたはＬＣＦをコードする配列の間で、第一および第二の外因性核酸のうちの１つのみ、または両方に含有されてもよい。第一座位の追加ＲＲＳは、第二座位の追加ＲＲＳと同一であっても、異なってもよい。各追加ＲＲＳは、その座位で統合された外因性核酸に隣接する２つのＲＲＳとは異なっていなければならない。各追加ＲＲＳは任意で、選択マーカー遺伝子のイントロン内に挿入されてもよく、および２つの座位においてイントロンを有する当該選択マーカー遺伝子は異なっていてもよい。
【0100】
複数のＨＣＦまたはＬＣＦをコードする配列が、座位に統合された外因性核酸内に含有される場合、当該座位内の複数のコード配列の相対的な位置は、変化し得る。たとえば、統合された外因性核酸が、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列とＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する実施形態では、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列に対し、上流または下流に位置付けられてもよい。特定の実施形態では、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列に対して上流に位置付けられる。両方の座位が、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列とＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する特定の実施形態では、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、両方の座位において、ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列に対し、上流または下流に位置付けられる。
【0101】
さらなる実施形態において、第一の発現強化座位内に統合されたＲＲＳの第一ペアと、第二の発現強化座位内に統合されたＲＲＳの第二ペアを含有する細胞が提供され、この場合において各ペア内の２つのＲＲＳは、異なっている。かかる細胞は、共に抗原結合タンパク質をコードする、統合される複数の外因性核酸の受容に有用である。
【0102】
一部の実施形態では、第一の外因性核酸は、第一の座位の２つのＲＲＳの間に存在し、第二の外因性核酸は、第二の座位の２つのＲＲＳの間に存在する。第一および第二の外因性核酸は各々、１つ以上の選択マーカー遺伝子をコードしてもよい。選択マーカー遺伝子は、互いに異なってもよい。
【0103】
一部の実施形態では、追加ＲＲＳは、座位のペア内の２つのＲＲＳ（すなわち、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳ）の間に存在し、この場合において当該追加ＲＲＳは、当該座位の５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの両方と異なっている。一部の実施形態では、追加ＲＲＳは、２つの座位のうちの１つで、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの間に存在する。他の実施形態では、追加ＲＲＳは、２つの座位のうちの各々で、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの間に存在する。追加ＲＲＳが、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの間に存在する場合、選択マーカー遺伝子は、５’ＲＲＳと追加ＲＲＳの間に含まれてもよく、別の選択マーカー遺伝子は、追加ＲＲＳと３’ＲＲＳの間に含まれてもよく、その２つの選択マーカーは異なっている。
【0104】
記載される実施形態に多くにおいて、細胞はＣＨＯ細胞であり、この場合において、２つの発現強化座位のうちの１つは、配列番号１に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、配列番号２に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、および配列番号３に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列からなる群から選択される。
【0105】
二特異性抗原結合タンパク質
本開示に記載される細胞、ベクターおよびシステムにおけるクローニングと産生に適した、たとえば二特異性抗体などの二特異性抗原結合タンパク質は、二特異性抗原結合タンパク質の任意の特性の形式に限定されない。
本開示に記載される細胞、ベクターおよびシステムにおけるクローニングと産生に適した、たとえば二特異性抗体などの二特異性抗原結合タンパク質は、二特異性抗原結合タンパク質の任意の特性の形式に限定されない。
【0106】
様々な実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、２つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、抗原結合部分（たとえばＨＣ）とＣＨ３ドメインを含有し、この場合において当該２つのポリペプチドの抗原結合部分は、異なる抗原特異性を有し、およびこの場合において当該２つのＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメインのうちの１つが少なくとも１つのアミノ酸位置で改変され、当該２つのポリペプチド間で異なるプロテインＡ結合特性を生じさせているという点で、互いに関しヘテロ二量体性である。たとえば、米国特許第８，５８６，７１３号に記載される二特異性抗体を参照のこと。この方法において、異なるプロテインＡ単離スキームを使用して、ホモ二量体からヘテロ二量体性二特異性抗原結合タンパク質を容易に単離することができる。
【0107】
一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、異なる抗原特異性を有し、およびＣＨ３ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸位置が異なり、それにより２つの重鎖の間で異なるプロテインＡ結合特性が生じる、２つの重鎖を含む。
【0108】
一部の実施形態では、２つのポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインを含有し、この場合において当該２つのポリペプチドの内の１つは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインを含有し、当該２つのポリペプチドのうちの他の１つは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの改変ＣＨ３ドメインを含有し、この場合において当該改変は、プロテインＡに対する改変ＣＨ３領域の結合を減少させ、または消滅させる。特定の実施形態では、当該２つのポリペプチドのうちの１つは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを含有し、当該２つのポリペプチドのうちの他の１つは、ヒトＩｇＧ１の改変ＣＨ３ドメインを含有し、この場合において当該改変は、ＩＭＧＴエクソンナンバリングシステムにおける（ｉ）９５Ｒならびに（ｉｉ）９５Ｒおよび９６Ｆからなる群から選択される。他の特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＩＭＧＴエクソンナンバリングシステムにおける、１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、および８２Ｉからなる群から選択される１～５個の追加改変を備えている。
【0109】
他の様々な実施形態では、当該２つのポリペプチドは、マウスＩｇＧのＣＨ３ドメインを含有し、この場合において当該２つのポリペプチドのうちの１つは、未改変マウスＩｇＧのＣＨ３ドメインを含有し、当該２つのポリペプチドのうちの他の１つは、マウスＩｇＧの改変ＣＨ３ドメインを含有し、この場合において、当該改変は、プロテインＡに対する改変ＣＨ３領域の結合を減少させ、または消滅させる。様々な実施形態では、マウスＩｇＧ ＣＨ３ドメインは、以下からなる群から選択される特定の位置（ＥＵナンバリング）で、特定のアミノ酸を備えるよう改変される：２５２Ｔ、２５４Ｔ、および２５６Ｔ；２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、および２５８Ｋ；２４７Ｐ、２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、および２５８Ｋ；４３５Ｒおよび４３６Ｆ；２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、４３５Ｒ、および４３６Ｆ；２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、２５８Ｋ、４３５Ｒ、および４３６Ｆ；２４ｔＰ、２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、２５８Ｋ、４３５Ｒ、および４３６Ｆ；ならびに４３５Ｒ。特定の実施形態では、以下からなる群から選択される改変の特定群が作製される：Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ；Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ；Ｉ２４７Ｐ、Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ；Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ、Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；Ｉ２４７Ｐ、Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ、Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；およびＨ４３５Ｒ。
【0110】
様々な実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、マウスとラットのモノクローナル抗体または抗原結合タンパク質のハイブリッドであり、たとえばマウスＩｇＧ２ａとラットＩｇＧ２ｂのハイブリッドである。これら実施形態に従い、二特異性抗体は、２つの抗体のヘテロ二量体から構成され、当該抗体は各々の１つの重鎖／軽鎖のペアを備え、それらは自身のＦｃ部分を介して結合している。記載されるヘテロ二量体は、２つの元の抗体ホモ二量体と二特異性ヘテロ二量体の混合物から容易に精製されることができる。その理由は、プロテインＡに対する二特異性抗体の結合特性は、元の抗体の結合特性とは異なっているためである。ラットのＩｇＧ２ｂは、プロテインＡには結合せず、一方でマウスＩｇＧ２ａは結合する。結論として、マウス－ラットのヘテロ二量体は、プロテインＡに結合するが、マウスＩｇＧ２ａホモ二量体よりも高いｐＨで溶出する。これが二特異性ヘテロ二量体の選択的精製を可能にする。
【0111】
他の様々な実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、当分野において「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」と呼称される形式のものである（たとえば米国特許第７，１８３，０７６号を参照のこと）。これらの実施形態では、２つの抗体のＦｃ部分を操作して、１つに「こぶ（ｋｎｏｂ）」を突き出させ、他方に相補的な「穴（ｈｏｌｅ）」が作られる。同じ細胞において産生される場合、操作された「こぶ」と操作された「穴」の結合により、重鎖は、ホモ二量体よりもヘテロ二量体を優先的に形成すると言われている。
【0112】
他の実施形態では、第一の重鎖と第二の重鎖は、ＣＨ３ドメインにおいて１つ以上のアミノ酸改変を備え、それにより、２つの重鎖の相互作用が可能となる。ＣＨ３－ＣＨ３の接触面のアミノ酸残基が荷電アミノ酸と置換され、それによりホモ二量体の形成が静電的に不利となる。（たとえば、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ２００９０８９００４および欧州公開ＥＰ１８７０４５９を参照のこと）
【0113】
他の実施形態では、第一の重鎖は、アイソタイプＩｇＡのＣＨ３ドメインを備え、第二の重鎖はＩｇＧのＣＨ３ドメインを備え（逆もまた然り）、ヘテロ二量体の優先的な形成を促進する。（たとえば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２００７１１０２０５を参照のこと）
【0114】
他の実施形態では、たとえばＦａｂ－ａｒｍ交換（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２００８１１９３５３；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２０１１１３１７４６）、コイル化コイルドメイン相互作用（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２０１１０３４６０５）、またはロイシンジッパーペプチド（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２，１４８（５）：１５４７－１５５３）などの、ヘテロ二量体の形成を促す操作方法により、様々な形式がイムノグロブリン鎖と組み込まれ得る。
【0115】
二特異性抗原結合タンパク質を作製するために使用され得るイムノグロブリン重鎖断片（たとえば可変領域）は、当分野に公知の任意の方法を使用して作製することができる。たとえば、第一の重鎖は、核酸によりコードされる可変領域を備え、当該核酸は第一動物の成熟Ｂ細胞のゲノムに由来し、当該第一動物は第一抗原で免疫化されており、そして第一の重鎖は第一の抗原を特異的認識する。第二重鎖は核酸によりコードされる可変領域を備え、当該核酸は第二動物の成熟Ｂ細胞のゲノムに由来し、当該第二動物は第二抗原で免疫化されており、そして第二の重鎖は第二の抗原を特異的に認識する。免疫グロブリン重鎖可変領域配列はたとえばファージディスプレイ法など当分野に公知の任意の他の方法により取得することもできる。他の例では、重鎖可変領域をコードする核酸は、当分野に報告されている、または別の手段により入手可能な抗体のものを含む。一部の実施形態では、２つの重鎖コード配列のうちの１つはコドン改変され、それにより核酸系アッセイにおいて当該２つのコード配列を識別するための簡便な基盤が提供される。
【0116】
２つの異なるエピトープ（または２つの異なる抗原）を認識する２つの重鎖を備えた二特異性抗体は、それらが同じ軽鎖（すなわち、軽鎖が同一の可変ドメインと定常ドメインを有している））とペア形成できる場合に、より簡易に単離される。たとえば米国特許第８，５８６，７１３号に記載され、およびその中に開示される技術のように、重鎖可変ドメインと、その標的抗原との選択性および／またはアフィニティに干渉することなく、または実質的に干渉することなく、異なる特異性の２つの重鎖とペア形成できる軽鎖を作製するための様々な方法が当分野において公知である。
【0117】
二特異性抗原結合タンパク質は様々な二面的な抗原特異性と、関連した有用なアプリケーションを有し得る。
【0118】
一部の例では、腫瘍抗原とＴ細胞抗原に対する結合特異性を備え、細胞上の抗原、たとえばＣＤ２０を標的とし、およびＴ細胞上の抗原、たとえばＣＤ３などのＴ細胞受容体も標的とする二特異性抗原結合タンパク質が作製され得る。この場合では、二特異性抗原結合タンパク質は、患者中の対象細胞（たとえばＣＤ２０結合を介してリンパ腫患者のＢ細胞）ならびに患者のＴ細胞の両方を標的とする。様々な実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３の結合でＴ細胞を活性化するように設計され、それにより特定の選択腫瘍細胞と、Ｔ細胞活性化が結び付けられる。
【0119】
１つの部分がたとえばＣＤ３に結合するなど、Ｔ細胞受容体に結合し、他方の部分が標的抗原に結合する場合に二特異性抗原結合タンパク質の文脈において、標的抗原は腫瘍関連抗原である。特定の腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、たとえば、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（サバイビン）、ＢＩＲＣ７、β－カテニン、ｂｒｃ－ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＣＭＡ、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、炭酸脱水酵素ＩＸ、カスパーゼ－８、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ－１２、ＣＴＬＡ４、サイクリン－Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ－１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（たとえば、ＧＡＧＥ－１、－２）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン－３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ－ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ－ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ－Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥタンパク質（たとえば、ＭＡＧＥ－１、－２、－３、－４、－６、および－１２）、ＭＡＲＴ－１、メソテリン、ＭＬ－ＩＡＰ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６（ＣＡ－１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ－ＢＲ１、ＮＹ－ＢＲ６２、ＮＹ－ＢＲ８５、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ－１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、Ｓｔｅａｐ－１、Ｓｔｅａｐ－２、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原（Ｔｎ）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、およびウロプラキン－３が挙げられる。一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３に結合する１つの部分を備えている。抗ＣＤ３抗体部分の例は、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１、ならびに国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５３８５６に記載されており、２０１７年３月３０日に公開され、それらすべて本明細書に参照により援用される）。他の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３に結合する１つの部分、およびＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＣＬＥＣ－１２、Ｈｅｒ２、ＨＬＡタンパク質、ＭＡＧＥタンパク質、Ｍｕｃ１６、ＰＳＭＡ、またはＳｔｅａｐ－２に結合する１つの部分を備えている。さらに他の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２０二特異性抗体（米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１に記載され、参照により本明細書に援用される）、抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃｉｎ１６二特異性抗体（たとえば抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃ１６二特異性抗体）、および抗ＣＤ３ｘ抗前立腺特異的膜抗原二特異性抗体（たとえば抗ＣＤ３ｘ抗ＰＳＭＡ二特異性抗体）からなる群から選択される。
【0120】
１つの部分がたとえばＣＤ３に結合するなど、Ｔ細胞受容体に結合し、他方の部分が標的抗原に結合する場合に二特異性抗原結合タンパク質の文脈において、標的抗原は感染性疾患関連抗原であってもよい。感染性疾患関連抗原の非限定的な例としては、たとえば、ウイルス粒子の表面上に発現される抗原、または優先的にウイルスに感染した細胞上に発現される抗原が挙げられ、この場合において当該ウイルスは、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（たとえば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＣＭＶ、ＨＡＶ－６、ＶＺＶまたはエプスタインバールウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、およびアルボウイルス脳炎ウイルスからなる群から選択される。あるいは標的抗原は、細菌表面上に発現される抗原であってもよく、または優先的に細菌に感染した細胞上に発現される抗原であってもよく、この場合において当該細菌は、クラミジア属、リケッチア属、マイコバクテリウム属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、肺炎球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、シュードモナス属、レジオネラ属、ジフテリア菌、サルモネラ属、バチルス属、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭そ菌、ペスト菌、レプトスピラ属、およびライム病の細菌からなる群から選択される。ある実施形態では、標的抗原は、真菌の表面上に発現される抗原であり、または優先的に真菌に感染した細胞上に発現される抗原であり、この場合において当該真菌は、カンジダ属（アルビカンズ（ａｌｂｉｃａｎｓ）、クルーセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラータ（ｇｌａｂｒａｔａ）、トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス属（フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）など）、ケカビ目（ムコール属（ｍｕｃｏｒ）、アブシジア属（ａｂｓｉｄｉａ）、リゾプス属（ｒｈｉｚｏｐｕｓ））、スポロスリックス・シエンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、南アメリカ分芽菌（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、およびヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）からなる群から選択される。ある実施形態では、標的抗原は寄生虫の表面上に発現される抗原であり、または優先的に寄生虫に感染した細胞上に発現される抗原であり、この場合において当該寄生虫は、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ種（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、カリニ肺炎菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ
ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（，Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、タエニア・クラシセプス（Ｔａｅｎｉａ ｃｒａｓｓｉｃｅｐｓ）、およびマレー糸条虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）からなる群から選択される。特定の寄生虫関連抗原の非限定的な例としては、たとえばＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＣＤ４、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｌ、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｍ、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｓ、Ｃ型肝炎ウイルス Ｅ１、Ｃ型肝炎ウイルス Ｅ２，、肝細胞特異的タンパク質、単純ヘルペスウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＢ、およびＨＴＬＶエンベロープタンパク質が挙げられる。
ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（，Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、タエニア・クラシセプス（Ｔａｅｎｉａ ｃｒａｓｓｉｃｅｐｓ）、およびマレー糸条虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）からなる群から選択される。特定の寄生虫関連抗原の非限定的な例としては、たとえばＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＣＤ４、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｌ、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｍ、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｓ、Ｃ型肝炎ウイルス Ｅ１、Ｃ型肝炎ウイルス Ｅ２，、肝細胞特異的タンパク質、単純ヘルペスウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＢ、およびＨＴＬＶエンベロープタンパク質が挙げられる。
【0121】
各々が、同一細胞表面上の結合パートナーに指向する（すなわち、各々が異なる標的に指向する）２つの結合部分を備えた二特異性結合タンパク質が作製されてもよい。この設計は特に、同一細胞表面上に両方の標的を発現する特定の細胞または細胞型を標的化する場合に適している。標的は、他の細胞上にも個々に現れ得るが、これら結合タンパク質の結合部分は、各結合部分が比較的低いアフィニティ（たとえば低マイクロモルまたは高ナノモル、たとえば百ナノモルｋＤ超、たとえば５００、６００、７００、８００ナノモル）でその標的に結合するよう選択される。この場合では、長期の標的結合は、２つの標的が同じ細胞上で近接している状況下でのみ好ましい。
【0122】
同一標的に、同一標的の異なるエピトープで結合する２つの結合部分を備えた二特異性結合タンパク質が作製されてもよい。この設計は、結合タンパク質を用いて標的をブロッキングする成功率を最大化したい場合に特に適している。たとえば膜貫通チャンネルまたは細胞表面受容体の複数の細胞外ループを、同一の二特異性結合分子により標的化してもよい。
【0123】
免疫抑制をもたらす免疫シグナル伝達の負の制御因子をクラスター化し、活性化する２つの結合分子を備えた二特異性結合タンパク質を作製してもよい。ｉｎ ｃｉｓでの抑制は、標的が同一細胞上にある場合に実施することができる。ｉｎ ｔｒａｎｓでの抑制は、標的が異なる細胞上にある場合に実施することができる。ｉｎ ｃｉｓでの抑制は、たとえば抗ＩｇＧＲＩＩｂ結合部分と抗ＦｅｌＤ１結合部分を有する二特異性結合タンパク質を用いて実施することができ、それによって、ＩｇＧＲＩＩｂはＦｅｌＤ１の存在下でのみクラスター化され、ＦｅｌＤ１への免疫応答が下方制御される。ｉｎ ｔｒａｎｓでの抑制は、たとえば抗ＢＴＬＡ結合部分と、対象の組織特異的抗原に特異的に結合する結合部分を有する二特異性結合タンパク質を用いて行うことができ、それによって阻害性ＢＴＬＡ分子のクラスター化が選択標的組織中でのみ発生し、自己免疫疾患への対処法となる可能性がある。
【0124】
多成分性受容体を活性化する二特異性結合タンパク質を作製してもよい。この設計では、受容体の２成分に指向する２つの結合部分が、当該受容体に結合、架橋し、受容体からのシグナル伝達を活性化する。これは、ＩＦＮＡＲ１に結合する結合部分と、ＩＦＮＡＲ２に結合する結合部分を有する二特異性結合タンパク質を使用することで行うことができ、この場合、結合が受容体を架橋する。かかる二特異性結合タンパク質は、インターフェロン治療の代替法を提供し得る。
【0125】
半透過性バリア、たとえば血液脳関門を交差し、結合部分を輸送する二特異性結合タンパク質を作製してもよい。この設計では、１つの結合部分が、特定の選択バリアを通過することができる標的に結合し、他方の結合部分が、治療活性を有する分子を標的とし、この場合において治療活性を有する標的分子は通常、当該バリアを越えることができない。この種の二特異性結合タンパク質は、別の手段では治療剤が到達しない組織への治療剤の送達に有用である。一部の例としては、消化管または肺へ治療剤を輸送するｐＩＧＲ受容体の標的化、または脳血液関門を交差し、治療剤を輸送するトランスフェリン受容体の標的化が挙げられる。
【0126】
結合部分を特定の細胞または細胞型へと輸送する二特異性結合タンパク質が作製されてもよい。この設計では、１つの結合部分は、容易に細胞内に内在化される細胞表面タンパク質（たとえば受容体）を標的とする。他方の結合部分は、細胞内タンパク質を標的化し、当該細胞内タンパク質の結合が治療効果を生じさせる。
【0127】
貪食免疫細胞の表面受容体と、感染性病原体（たとえば酵母又は細菌）の表面分子に結合する二特異性結合タンパク質は、貪食免疫細胞の周辺に感染性病原体を送達させ、病原体の貪食を促進する。かかる設計の例は、ＣＤ６４分子またはＣＤ８９分子と、さらに病原体も標的とする二特異性抗体である。
【0128】
１つの結合部分として抗体可変領域を有し、第二の結合部分として非Ｉｇ部分を有する二特異性結合タンパク質。抗体可変領域は標的化を行い、一方で非Ｉｇ部分はＦｃに連結されたエフェクターまたは毒素である。この場合では、リガンド（たとえばエフェクターまたは毒素）は、抗体可変領域に結合された標的に送達される。
【0129】
各々Ｉｇ領域（たとえばＣＨ２領域とＣＨ３領域を含有するＩｇ配列）に結合される２つの部分を有する二特異性結合タンパク質は、Ｆｃ環境下で互いの周辺に任意の２つのタンパク質部分を運ばせることができる。この設計の例としては、たとえば、ホモ二量体またはヘテロ二量体のトラップ分子などのトラップが挙げられる。
【0130】
発現強化座位
本発明の使用に適した発現強化座位としては、たとえば、米国特許第８，３８９，２３９号に記載される配列番号１に対し、実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位（本明細書において、「ＥＥＳＹＲ（登録商標）座位」または「座位１」とも呼称される）、米国特許出願１４／９１９，３００に記載される配列番号２または配列番号３に対し、実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位（本明細書において、「ＹＡＲＳ座位」または「座位２」とも呼称される）、およびその他の発現強化座位ならびに当分野に報告される配列（たとえば、ＵＳ２０１５０１６７０２０Ａ１および米国特許第６，８００，４５７号）が挙げられる。
本発明の使用に適した発現強化座位としては、たとえば、米国特許第８，３８９，２３９号に記載される配列番号１に対し、実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位（本明細書において、「ＥＥＳＹＲ（登録商標）座位」または「座位１」とも呼称される）、米国特許出願１４／９１９，３００に記載される配列番号２または配列番号３に対し、実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位（本明細書において、「ＹＡＲＳ座位」または「座位２」とも呼称される）、およびその他の発現強化座位ならびに当分野に報告される配列（たとえば、ＵＳ２０１５０１６７０２０Ａ１および米国特許第６，８００，４５７号）が挙げられる。
【0131】
一部の実施形態では、本発明で使用される２つの発現強化座位は、配列番号１に対し実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位、配列番号２に対し実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位、および配列番号３に対し実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位からなる群から選択される。これらの座位は配列を含有し、当該配列は、配列に対し動作可能に連結されて、（すなわち配列内に、または配列の近傍内に）統合された遺伝子の発現強化をもたらすだけではなく、ゲノム中の他の配列と比較し、高い組み換え効率と統合安定性の改善を示す。
【0132】
配列番号１、配列番号２、および配列番号３は、ＣＨＯ細胞から同定された。他の哺乳類種（たとえばヒトまたはマウス）は、同定された発現強化領域に対し、限定的な相同性を有していることが判明している。しかしながら、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）の他の組織型から誘導された細胞株、または他の同系種において、配列が発見される可能性があり、当分野に公知の技術により単離することができる。たとえば、異種間ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ系技術により、他の相同配列が特定される可能性がある。さらに、当分野に公知の部位特異的突然変異誘導技術または無作為突然変異誘導技術により、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に記載されるヌクレオチド配列に、変化を発生させることができる。次いで得られた配列変異体を、発現強化活性に関し検証してもよい。発現強化活性を有する配列番号１、配列番号２、または配列番号３に対する核酸同一性において少なくとも約９０％同一であるＤＮＡは、日常的な実験で単離され、そして発現強化活性を示すことが予期される。
【0133】
１つ以上の外因性核酸の挿入物の統合部位、部位、またはヌクレオチド位置は、発現強化配列（たとえば配列番号１、配列番号２、配列番号３）のいずれかの内、または隣接している任意の位置であってもよい。対象座位の内、または隣接する特定の染色体位置が、統合される外因性遺伝子の安定した統合および効率的な転写を支持するかどうかは、当分野に公知の標準的な方法、たとえば米国特許第８，３８９，２３９号および米国特許出願１４，９１９，３００に記載される方法に従い決定することができる。
【0134】
本明細書において検討される統合部位は、発現強化配列内に位置し、または染色体ＤＮＡ上の発現強化配列の位置に対し、たとえば約１ｋｂ未満、５００塩基対（ｂｐ）、２５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、２５ｂｐ、１０ｂｐまたは約５ｂｐ未満で上流（５’）または下流（３’）など、配列の近傍内に位置している。さらに一部の他の実施形態では、使用される統合部位は、染色体ＤＮＡ上の発現強化配列の位置に対し、約１０００塩基対、２５００塩基対、５０００塩基対またはそれ以上、上流（５’）または下流（３’）に位置している。
【0135】
当分野において、たとえばスキャホールド／マトリクス付着領域などの大きなゲノム領域が、染色体ＤＮＡの効率的な複製と転写に使用されると理解されている。スキャホールド／マトリクス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ：ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）は、スキャホールド－付着領域（ＳＡＲ：ｓｃａｆｆｏｌｄ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）またはマトリクス関連領域もしくはマトリクス付着領域（ＭＡＲ：ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄまたはｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）とも呼称されることが知られており、真核細胞のゲノムＤＮＡ領域であり、ここに核マトリクスが付着する。いずれか１つの学説に拘束されないが、Ｓ／ＭＡＲｓは多くの場合、非コード領域にマッピングされ、その近辺から所与の転写領域（たとえばクロマチンドメイン）を隔て、また、転写を実行可能とする因子の構造および／または結合のためのプラットフォーム、たとえばデオキシリボヌクレアーゼまたはポリメラーゼに対する認識部位などを提供する。一部のＳ／ＭＡＲｓは、約１４～２０ｋｂの長さで特徴解析されている（Ｋｌａｒ，ｅｔ ａｌ．２００５，Ｇｅｎｅ ３６４：７９－８９）。したがって、発現強化座位（たとえば、配列番号１もしくは配列番号２もしくは配列番号３の内または近傍）での遺伝子の統合は、発現強化をもたらすことが予測される。一部の実施形態では、発現強化座位内の特定の部位に統合された、二特異性抗原結合タンパク質をコードする外因性核酸配列を備えた宿主細胞は、高い特異的生産性を示す。他の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質をコードする宿主細胞は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、または３０ピコグラム／細胞／日（ｐｃｄ）の特異的生産性を有する。
【0136】
一部の実施形態では、外因性核酸は、配列番号１のヌクレオチド配列を備えた座位内の部位に統合される。特定の実施形態では、統合部位は、配列番号１のヌクレオチド配列の内、または近傍内である。特定の実施形態では、統合部位は、１０～１３，５１５；２０～１２，０２０；１，０２０～１１，０２０；２，０２０～１０，０２０；３，０２０～９，０２０；４，０２０～８，０２０；５，０２０～７，０２０；６，０２０～６，９２０；６，１２０～６，８２０；６，２２０～６，７２０；６，３２０～６，６２０；６，４２０～６，５２０；６，４６０～６，５００；６，４７０～６，４９０；および６，４７５～６，４８５と番号づけられた位置に及ぶヌクレオチドから選択される、配列番号１内の位置である。他の実施形態では、統合部位は、配列番号１のヌクレオチド５，０００～７，４００、５，０００～６，５００、６，４００～７，４００、および配列番号１のヌクレオチド６，４００～６，５００からなる群から選択される配列中である。特定の実施形態では、統合部位は、配列番号１の「作動する」３つ組ヌクレオチド６４７１～６４７３の前、後、またはその中である。
【0137】
一部の実施形態では、外因性核酸は、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列を備えた座位内の部位に統合される。特定の実施形態では、統合部位は、配列番号２のヌクレオチド配列の内、または近傍内である。特有の実施形態では、統合部位は、配列番号３のヌクレオチド配列の内、または近傍内である。一部の実施形態では、統合部位は、配列番号３のヌクレオチド１９９０～１９９１、１９９１～１９９２、１９９２～１９９３、１９９３～１９９４、１９９５～１９９６、１９９６～１９９７、１９９７～１９９８、１９９９～２０００、２００１～２００２、２００２～２００３、２００３～２００４、２００４～２００５、２００５～２００６、２００６～２００７、２００７～２００８、２００８～２００９、２００９～２０１０、２０１０～２０１１、２０１１～２０１２、２０１２～２０１３、２０１３～２０１４、２０１４～２０１５、２０１５～２０１６、２０１６～２０１７、２０１７～２０１８、２０１８～２０１９、２０１９～２０２０、２０２０～２０２１または２０２１～２０２２の内である。特定の実施形態では、統合は、配列番号３のヌクレオチド２００１～２０２２で、またはその内である。一部の実施形態では、外因性核酸は、配列番号３のヌクレオチド２００１～２００２またはヌクレオチド２０２１～２０２２で、またはその内に挿入され、挿入の結果として、配列番号３のヌクレオチド２００２～２０２１は削除される。
【0138】
発現強化座位内への部位特異的統合
部位特異的な様式で発現強化座位内への、すなわち、本明細書に開示される発現強化座位内の１つの特定の部位内への、１つ以上の外因性核酸の統合は、いくつかの方法で実施することができ、たとえば、当分野に報告される相同組み換え、およびリコンビナーゼ介在性カセット交換などが挙げられる（例えば米国特許第８，３８９，２３９号およびその中に開示される技術を参照のこと）。
部位特異的な様式で発現強化座位内への、すなわち、本明細書に開示される発現強化座位内の１つの特定の部位内への、１つ以上の外因性核酸の統合は、いくつかの方法で実施することができ、たとえば、当分野に報告される相同組み換え、およびリコンビナーゼ介在性カセット交換などが挙げられる（例えば米国特許第８，３８９，２３９号およびその中に開示される技術を参照のこと）。
【0139】
一部の実施形態では、対象の１つ以上の外因性核酸または遺伝子を含有する核酸の統合に便利な発現強化座位内に、少なくとも２つ、すなわち２個以上の異なるリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ）を含有する細胞が提供される。かかる細胞は、たとえば米国特許第８，３８９，２３９号およびその中に開示される技術など、本明細書において以下に解説され、および当分野において解説されるように相同組み換えを含む様々な手段を用いて２つ以上のＲＲＳを含有する外因性核酸配列を、所望される座位内に導入することにより取得することができる。
【0140】
特定の実施形態では、複数の外因性核酸の統合に便利な発現強化座位内に、３つ以上の異なるリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ）を含有する細胞が提供される。特定の実施形態では、２つの別個の外因性核酸の統合を介在することができる発現強化座位内に３つの異なるリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ）を含有する細胞が提供され、たとえば、この場合においてゲノム中の５’ＲＲＳおよび中間ＲＲＳは、統合される第一の外因性核酸に隣接する５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに合致し、そしてゲノム中の中間ＲＲＳと３’ＲＲＳは、統合される第二の外因性核酸に隣接する５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに合致する。
【0141】
適切なＲＲＳは、ＬｏｘＰ、Ｌｏｘ５１１、Ｌｏｘ５１７１、Ｌｏｘ２２７２、Ｌｏｘ２３７２、Ｌｏｘｍ２、Ｌｏｘ－ＦＡＳ、Ｌｏｘ７１、Ｌｏｘ６６、およびそれらの変異体を含有する群から選択されてもよく、この場合において部位特異的リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼまたはその誘導体であり、これを使用して、リコンビナーゼ介在性カセット交換（ＲＭＣＥ）が実施される。他の例において、適切なＲＲＳは、ＦＲＴ、Ｆ３、Ｆ５、ＦＲＴ変異体－１０、ＦＲＴ変異体＋１０、およびそれらの変異体を含有する群から選択されてもよく、この場合において、部位特異的リコンビナーゼのＦｌｐリコンビナーゼまたはその誘導体が使用され、ＲＭＣＥが実施される。さらに別の例では、ＲＲＳは、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、およびそれらの変異体を含有する群から選択されてもよく、部位特異的リコンビナーゼがｐｈｉＣ３１インテグラーゼまたはその誘導体である場合、これを使用してＲＭＣＥが実施される。
【0142】
他の実施形態では、天然細胞は、相同組み換え技術により改変され、それにより１つ以上の外因性核酸を含有する核酸配列が発現強化座位内の特定部位に統合される。
【0143】
相同組み換えに関しては、相同なポリヌクレオチド分子（すなわち、相同アーム）が並び、その配列区間を交換する。導入遺伝子が相同ゲノム配列に隣接されている場合、この交換の間に導入遺伝子が導入され得る。１つの例において、リコンビナーゼ認識部位は、相同組み換えを介し、統合部位で宿主細胞ゲノム内に導入されてもよい。他の例では、対象の１つ以上の外因性核酸、たとえばＨＣＦまたはＬＣＦ（たとえば可変領域）を各々コードする１つ以上の核酸を含有する核酸配列は、この場合において当該核酸配列は標的座位の配列に対し相同な配列（相同アーム）により隣接されており、宿主ゲノム内に挿入される。
【0144】
染色体のＤＮＡ内の統合部位に切断を導入することによって真核細胞内での相同的組み換えを容易にすることができる。これは、ある一定の核を特定の統合部位へと標的化することによって遂行されてもよい。標的の遺伝子座においてＤＮＡ配列を識別するＤＮＡ結合したタンパク質は当該技術分野で既知である。遺伝子標的化ベクターは、相同的組み換えを容易にするためにも採用される。
【0145】
相同組み換えを実施するための遺伝子標的化ベクター構築およびヌクレアーゼ選択は、本発明が関連する当該技術分野の当業者の技能の範疇内である。一部の例では、モジュラー構造を有し、かつ個別のジンクフィンガードメインを含有するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、標的配列内の特定の３－ヌクレオチド配列を識別する（例えば、標的とされる組み込みの部位）。一部の実施形態は、多重標的配列を標的化する個別のジンクフィンガードメインの組み合せを用いてＺＦＮを利用することができる。転写活性化物質様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、部位特異的なゲノム編集にも採用されてもよい。ＴＡＬエフェクタータンパク質ＤＮＡ結合ドメインは、典型的にはＦｏｋＩなどの制限ヌクレアーゼの非特定的な開裂ドメインと組み合せて利用される。一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクタータンパク質ＤＮＡ結合したドメインおよび制限ヌクレアーゼ開裂ドメインを含む融合タンパク質は、本発明の遺伝子座内の標的配列においてＤＮＡを識別および分割するために採用される（Ｂｏｃｈ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２）。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）は、細菌性適応性免疫機構から開発されたプログラム可能なゲノムエンジニアリングツールである。このシステム、すなわちクラスター化された規則的な配置の短い回文の繰返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲに関連付けられた（Ｃａｓ）免疫応答では、２つのＲＮＡで複合化されたときタンパク質Ｃａｓ９は、配列特異的なエンドヌクレアーゼを形成し、そのうちの１つは標的選択を誘導する。ＲＧＥＮは構成要素（Ｃａｓ９およびｔｒａｃｒＲＮＡ）および標的に特異的なＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）から成る。ＤＮＡ標的開裂の効率と開裂部位の場所との両方とも、標的認識のための追加要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の位置に基づいて変化する（Ｃｈｅｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４年３月１４日にオンラインで出版、マニュスクリプトとしてはＭ１１３．５３９７２６）。座位（たとえば配列番号１、配列番号２、または配列番号３）の特異的な標的化に対して特有な配列は、これら配列の多くを、ＣＨＯゲノムに並行に並べることにより特定することができ、１６～１７塩基対の合致で、潜在的なオフターゲット部位を明らかにすることができる。
【0146】
一部の実施形態では、対象核酸（たとえば、１つ以上の選択マーカー遺伝子に任意で隣接する１つ以上のＲＲＳを含有する核酸、または各々ＨＣＦまたはＬＣＦ（たとえば可変領域）をコードする１つ以上の外因性核酸を含有する核酸であって、５’および３’の相同アームに隣接されている）を担持する標的化ベクターが、１つ以上の追加ベクターまたはｍＲＮＡとともに細胞内に導入される。１つの実施形態では、１つ以上の追化ベクターまたはｍＲＮＡは、限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、およびＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをはじめとする部位特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する。ある実施形態では、当該１つ以上のベクターまたはｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＣａｓ酵素をコードするヌクレオチド配列を備えた第一ベクターと、ドナー（外因性）ヌクレオチド配列を備えた第二ベクターを含む。かかるドナー配列は、対象遺伝子をコードするヌクレオチド配列、または認識配列をコードするヌクレオチド配列、または標的挿入が意図されたこれら外因性要素の内のいずれか１つを備えた遺伝子カセットをコードするヌクレオチド配列を含有する。ｍＲＮＡが使用される場合、ｍＲＮＡは、当業者に公知の普遍的なトランスフェクション法を用いて細胞内にトランスフェクトされることができ、およびたとえばトランスポーゼーズまたはエンドヌクレアーゼなどの酵素をコードしてもよい。細胞内に導入されるｍＲＮＡは一過性であってもよく、ゲノム内に統合されないが、ｍＲＮＡは、統合が発生するために必要な、または有益な外因性核酸を担持してもよい。一部の例では、ｍＲＮＡは、付随ポリヌクレオチドの長期継続する副作用の任意のリスクを除外するために選択され、この場合、核酸の所望される統合を実施するためには短期発現のみが必要とされる。
【0147】
部位特異的統合のためのベクター
本明細書において、部位特異的統合を介して２つの発現強化座位内に外因性核酸を導入するための核酸ベクターが提供される。適切なベクターとしては、ＲＭＣＥを介した統合のためのＲＲＳに隣接された外因性核酸配列を含有するように設計されたベクターと、相同組み換えを書いた統合のための相同アームに隣接された対象外因性核酸配列を含有するよう設計されたベクターが挙げられる。
本明細書において、部位特異的統合を介して２つの発現強化座位内に外因性核酸を導入するための核酸ベクターが提供される。適切なベクターとしては、ＲＭＣＥを介した統合のためのＲＲＳに隣接された外因性核酸配列を含有するように設計されたベクターと、相同組み換えを書いた統合のための相同アームに隣接された対象外因性核酸配列を含有するよう設計されたベクターが挙げられる。
【0148】
様々な実施形態では、ＲＭＣＥを介した部位特異的統合を実施するためのベクターが提供される。一部の実施形態では、ベクターは、２つの標的座位内への複数核酸の同時統合を実施するように設計される。連続統合とは対照的に、同時統合は、抗原結合タンパク質、または大規模生産（製造）に適した他の対象多量体タンパク質を産生する望ましいクローンの効率的で迅速な単離を可能とする。
【0149】
一部の実施形態では、細胞における二特異性抗原結合タンパク質の発現用のベクターセットが提供される。
【0150】
一部の実施形態では、ベクターセットは、２つの「ＨＣＦベクター」を含有してもよく、各ベクターは、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接される核酸を含有し、その核酸は、ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有し、およびこの場合において当該ＨＣＦは異なっている。２つのＨＣＦベクター上のＲＲＳは互いに異なっており、ＨＣＦコードヌクレオチド配列を、２つの発現強化座位に統合するよう設計される。ベクターセットはまた、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有し、ＬＣＦはＨＣＦベクターの内の１つ、または両方のＨＣＦベクターに含まれてもよく（それにより、２コピーの同一ＬＣＦが提供される）、またはあるいは、別個の「ＬＣＦベクター」中に提供され、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接されてもよい。
【0151】
一部の実施形態では、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、ＨＣＦベクターの内の１つに含まれ、当該ＨＣＦベクター上の５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの間に位置付けられる。ＬＣＦをコードする配列は、ＨＣＦをコードする配列の上流または下流に配置されてもよい。
【0152】
一部の実施形態では、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、両方のＨＣＦベクターに含まれ、各ＨＣＦベクター上の５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの間に位置付けられる。同様に、ＬＣＦをコードする配列は、各ベクター中のＨＣＦをコードする配列の上流または下流に配置されてもよい。
【0153】
一部の実施形態では、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、別個のベクター中に提供され、「ＬＣＦ」ベクターは、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接され、当該２つのＲＲＳは、互いに異なっている。ベクターセット中のＲＲＳは、標的座位とのＲＭＣＥの間に共通ＲＲＳを介してＨＣＦをコードする配列の内の１つと、ＬＣＦをコードする配列が「結合」され得るように設計されてもよく、標的座位もまた共通ＲＲＳを含有している。たとえば、ＬＣＦベクターの３’ＲＲＳは、ＨＣＦベクターの内の１つの５’ＲＲＳと同一であってもよく、それによりＲＭＣＥを介した標的座位での統合後、ＬＣＦ－ＨＣＦの配列が発生する。別の例では、ＨＣＦベクターの３’ＲＲＳは、ＬＣＦベクターの５’ＲＲＳと同一であってもよく、それによりＲＭＣＥを介した標的座位での統合後、ＨＣＦ－ＬＣＦの配列が発生する。一部の実施形態では、共通ＲＲＳは、分割選択マーカー形式で設計される。すなわち、１つのベクター中に含有される選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に含有され、そしてまた、別のベクター中に含有される同じ選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端にも含有され、それによって、「結合」と、標的座位への統合が起こることで、適切に統合された核酸は、選択マーカーの全遺伝子を含有し、トランスフェクタントの簡便な特定が可能となる。一部の実施形態では、共通ＲＲＳは、分割遺伝子形式で設計される。すなわち、共通ＲＲＳは、かかる分割遺伝子内の遺伝子またはイントロンの５’部分の３’末端で、１つのベクター上の当該遺伝子の５’部分の一部として含有され、そしてかかる分割遺伝子内の遺伝子またはイントロンの残りの部分の５’末端で、当該分割遺伝子の残りの３’部分の一部として含有される。さらに他の実施形態では、第一ベクター中の第三のＲＲＳまたは中間ＲＲＳは、動作可能に連結される（が、他のベクター上では分離されている）プロモーターと選択マーカー遺伝子の間になるように設計される。第一ベクター中の第三の「ＲＲＳまたは中間ＲＲＳは、プロモーターの３’であるように設計される。そして第二ベクター中の第三のＲＲＳまたは中間ＲＲＳは、選択マーカー遺伝子の５’であるように設計される。
【0154】
一部の実施形態では、ベクターセットは、ＬＣＦをコードする追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。すなわち、ベクターセットは２つのＨＣＦベクターと、２つのＬＣＦコードヌクレオチド配列を含んでもよい。２つのＬＣＦコード配列は、同じＬＣＦをコードしても、または異なるＬＣＦをコードしてもよい。一部の実施形態では、２つのＬＣＦコード配列は各々、ＨＣＦベクター内に含有されてもよく、それにより、各々がＨＣＦコード配列とＬＣＦコード配列を含有する２つのベクターが得られる。２つのベクターは、当該２つのベクター配列を２つの座位内へ標的化することに適したＲＲＳを有するよう設計されてもよい。他の実施形態では、２つのＬＣＦコード配列の内の１つは、ＨＣＦベクター内に含まれ、当該ＨＣＦベクター上の５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの間に位置付けられ、他方のＬＣＦコード配列は別個のベクター上に提供される。すなわち、ＬＣＦとＨＣの両方を（ＬＣＦ－ＨＣＦまたはＨＣＦ－ＬＣＦの配列で、または短く「ＬＣＦ／ＨＣＦベクター」で）有する１つのベクター、１つのＨＣＦベクター、そして１つのＬＣＦベクターである。これらのその他の実施形態の一部では、ベクターのＲＲＳは、ＨＣＦベクター上のＨＣＦコード配列と、ＬＣＦベクター上のＬＣＦコード配列が、ＲＭＣＥを介して標的座位で結合することが可能となるよう設計されてもよい。たとえばＬＣＦベクターの３’ＲＲＳは、ＨＣＦベクターの５’ＲＲＳと同一であってもよく、当該共通ＲＲＳは、分割選択マーカー形式で設計されてもよく、または分割イントロン形式で設計されてもよく、それによりトランスフェクタントの選択と特定が促進される。さらに他の実施形態では、２つのＬＣＦが異なっている場合、当該２つのＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は各々、別個のベクター上で提供されてもよい。すなわち、ベクターセットは２つのＨＣＦベクターと、２つのＬＣＦベクターを含有する。ＲＲＳは、１つのＬＣＦコード配列と１つのＨＣＦコード配列を１つの標的座位で、および他方のＬＣＦコード配列と他方のＨＣＦコード配列を第二の標的座位で、適切に「結合する」ことが可能となるよう設計される。図１、３および４は、異なる形式のベクターと、ＲＲＳ／座位の組み合わせの図示であるが、限定であるとは意味されない。各所与のベクターシステムは、陽性統合体（所望されるクローン）の迅速および簡便な選択を目的とした、リコンビナーゼの存在下で各ヌクレオチド配列を同時に統合するための手段を提供する。
【0155】
ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、定常領域由来のアミノ酸またはドメインをコードしてもよく、または定常領域全体をコードしてもよい。特定の実施形態では、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、１つ以上の定常ドメイン、たとえばＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３またはそれらの組み合わせをコードしてもよい。ある実施形態では、ＨＣＦドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＣＨ３ドメインをコードしてもよい。たとえば、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードしてもよく、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードしてもよい。第一および第二のＣＨ３ドメインは同一であってもよく、または少なくとも１つのアミノ酸が異なっていてもよい。ＣＨ３ドメインにおける差異、または定常領域における差異は、本明細書に記載される二特異性抗原結合タンパク質に対する形式のいずれも取ることができ、たとえば異なるプロテインＡ結合特性を生じさせる差異、または「ｋｎｏｂ－ａｎｄ－ｈｏｌｅ」形式を生じさせる差異がある。いずれのアミノ酸配列の差異にも関係なく、２つのＨＣＦコードヌクレオチド配列は、当該２つのヌクレオチド配列の内の１つがコドン改変されているという点で異なっていてもよい。
【0156】
一部の実施形態では、各ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、たとえばプロモーターをはじめとする転写制御配列に動作可能に連結される。一部の実施形態では、２つのＨＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーターは同じである。一部の実施形態では、２つのＨＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーター、ならびにＬＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーターはすべて同じである（たとえばＣＭＶプロモーター、または本明細書に記載される任意のその他の適切なプロモーターなど）。一部の実施形態では、各ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターに動作可能に連結される。誘導性プロモーターおよび抑制性プロモーターによって、例えば、生産期（流加培養）でのみ産生が発生し、増殖期（シードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）培養）の間は発生しないことが可能となる。誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターによって、１つ以上の対象遺伝子の特異的な発現も可能となる。一部の実施形態では、各ＨＣＦおよび／またはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、少なくとも１つのＴｅｔＲオペレーター（ＴｅｔＯ）またはＡｒｃオペレーター（ＡｒｃＯ）の上流のプロモーターに動作可能に連結される。さらに他の実施形態では、各ＨＣＦおよび／またはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、ＣＭＶ／ＴｅｔＯまたはＣＭＶ／ＡｒｃＯハイブリッドプロモーターに動作可能に連結される。ハイブリッドプロモーター（制御性融合タンパク質とも呼称される）の例は、２００３年１２月１１日に公開された国際特許出願公開ＷＯ０３１０１１８９Ａ１（参照により本明細書に援用される）に見出される。
【0157】
一部の実施形態では、ベクターセットは、１つ以上のＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、それらはＨＣＦコードベクターもしくはＬＣＦコードベクターの内の１つに含まれてもよく、または別個のベクター中で提供されてもよい。
【0158】
様々なその他の実施形態では、相同組み換えを介した部位特異的統合を実施するためのベクターが提供される。
【0159】
一部の実施形態では、２つのベクターを含むベクターセットが提供され、各ベクターは、細胞中の２つの発現強化座位への部位特異的な統合を行うための５’相同アームと３’相同アームに隣接される外因性核酸を含有し、この場合において当該２つのベクターの当該外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードする。ゆえに１つのベクター上の相同アームは、２つの座位の内の１つへの統合用に設計され、他方のベクター上の相同アームは、他方の座位への統合用に設計される。これらの実施形態では、抗原結合タンパク質は、一特異性または二特異性であってもよい。
【0160】
発現強化座位内の配列に相同な配列を選択し、標的化ベクター中に相同アームとして当該選択された配列を含ませることは、当業者の技術範囲内にある。一部の実施形態では、ベクターまたは構築物は、第一の相同アームと第二の相同アームを備え、この場合において、組み合わされた第一および第二の相同アームは、座位内で、内因性配列を置き換える標的配列を備える。他の実施形態では、第一および第二の相同アームは、座位内の内因性配列内に統合される、または挿入される標的配列を備えている。一部の実施形態では、相同アームは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に存在するヌクレオチド配列に対し相同なヌクレオチド配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターは、配列番号３のヌクレオチド１００１～２００１に相当するヌクレオチド配列を有する５’相同アームと、配列番号３のヌクレオチド２０２２～３０２２に相同するヌクレオチドを有する３’相同アームを含有する。相同アーム、たとえば第一の相同アーム（５’相同アームとも呼ばれる）と、第二の相同アーム（３’相同アームとも呼ばれる）は、座位内の標的配列に対し相同である。５’から３’の方向に相同アームは、少なくとも１ｋｂ、または少なくとも２ｋｂ、または少なくとも３ｋｂ、または少なくとも４ｋｂ、または少なくとも５ｋｂ、または少なくとも１０ｋｂを備える、座位内の領域または標的配列を伸長してもよい。他の実施形態では、第一および第二の相同アームに選択された標的配列のヌクレオチドの総数は、少なくとも１ｋｂ、または少なくとも２ｋｂ、または少なくとも３ｋｂ、または少なくとも４ｋｂ、または少なくとも５ｋｂ、または少なくとも１０ｋｂを含有する。一部の例では、５’相同アームと３’相同アームの間の距離（標的配列に対し相同）は、少なくとも５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、または少なくとも１ｋｂ、または少なくとも約２ｋｂ、または少なくとも約３ｋｂ、または少なくとも約４ｋｂ、または少なくとも５ｋｂ、または少なくとも約１０ｋｂを含有する。配列番号３のヌクレオチド１００１～２００１と２０２２～３０２２が５’相同アームと３’相同アームに選択された場合の例では、その２つの相同アームの間の距離は、２０ヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド２００２～２０２１に相当する）であってもよい。かかる相同アームは、配列番号３を含有する座位内、たとえば配列番号３のヌクレオチド１９９０～２０２１または２００２～２０２１内への外因性核酸配列の統合と、配列番号３のヌクレオチド２００２～２０２１の同時削除を介在することができる。
【0161】
発現強化座位内へ部位特異的統合を行うための外因性核酸を導入するための本明細書に開示されるベクターは、追加の遺伝子と、対象の外因性核酸とコードされるポリペプチドの発現を指示するための配列、および対象の外因性核酸の統合が成功した細胞の選択と特定のための配列を含んでもよい。かかる追加配列としては、たとえば転写及び翻訳の制御配列、選択マーカー遺伝子、およびそれに類するものが挙げられ、本明細書において以下にも記載されている。
【0162】
制御配列
部位特異的な様式で発現強化座位内に外因性核酸を導入するための本明細書に開示されるベクター、および部位特異的統合の結果として得られた細胞は、対象の外因性核酸、およびコードされるポリペプチドの発現を指示するための制御配列を含んでもよい。制御配列としては、転写プロモーター、エンハンサー、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の停止を管理する配列が挙げられる。転写管理配列および翻訳管理配列は、ウイルス性の供給源によって提供されてもよい。たとえば、普遍的に使用されているプロモーターとエンハンサーは、たとえばポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウスまたはヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＣＭＶ前初期（ＣＭＶ－ＩＥ）またはＣＭＶ主要ＩＥ（ＣＭＶ－ＭＩＥ）プロモーター、ならびにＲＳＶ、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ、ユビキチン（Ｕｂｉ）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）、およびＨＩＶ ＬＴＲプロモーターに由来する。ウイルス性ゲノムプロモーター、制御配列、および／またはシグナル配列は、発現を駆動するために利用されてもよく、提供されたかかる制御配列は、選ばれた宿主細胞と両立する。対象タンパク質が発現される細胞型に応じて、非ウイルス性細胞プロモーター（例えば、β－グロビンおよびＥＦ－１αプロモーター）を使用することもできる。外因性ＤＮＡ配列の発現に有用なその他の遺伝子要素を提供するために、ＳＶ４０ウイルス性ゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起源の前期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、ならびにポリアデニル化部位を使用してもよい。前期プロモーターおよび後期プロモーターは特に有用である。その理由は、両プロモーターとも、断片としてＳＶ４０ウイルスから用意に取得され、これらも複製のＳＶ４０ウイルス起源を含むためである（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３，１９７８）。より小さいＳＶ４０断片またはより大きいＳＶ４０断片も使用されてもよい。典型的には、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位から複製のＳＶ４０起源に位置付けられたＢｇｌＩ部位に向かって延在するほぼ２５０ｂｐの配列が含まれる。誘導性（たとえば化合物、補因子、制御性タンパク質により誘導される）および／または抑制性（たとえば化合物、補因子、制御性タンパク質により抑制される）のプロモーターを使用することができ、それらは、生産期（流加培養）でのみ抗原結合タンパク質の産生を発生させ、増殖期（シードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）培養）の間は発生させないこと、または異なる座位の抗体構成要素の発現を特異的に正確に管理することが可能であるため、特に有用である。誘導性プロモーターの例としては、アルコール脱水素酵素Ｉ遺伝子プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター系、グルココルチコイド受容体プロモーター、エストロゲン受容体プロモーター、エクジソン受容体プロモーター、メタロチオネイン系プロモーター、およびＴ７ポリメラーゼ系プロモーターが挙げられる。抑制性プロモーターの例としては、少なくとも１つのＴｅｔＲオペレーター（ＴｅｔＯ）またはＡｒｃオペレーター（ＡｒｃＯ）に動作可能に連結されたＣＭＶプロモーターまたはその他のプロモーターを含有するハイブリッドプロモーター（制御性融合タンパク質とも呼称される）が挙げられ、それらは２００３年１２月１１日に公開された国際特許出願公開ＷＯ０３１０１１８９Ａ１に記載されている（参照により本明細書に援用される）。バイシストロニックベクターを介した複数の転写物の発現に適した配列は従前に報告されており（Ｋｉｍ Ｓ．Ｋ．ａｎｄ Ｗｏｌｄ Ｂ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ ４２：１２９，１９８５）、これを本発明に使用することができる。タンパク質のマルチシストロニック発現に好適な戦略例としては、２Ａペプチド（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５： ６２７－６３８（２００５））の使用、および内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）の使用が挙げられ、それらは両方とも当分野に公知である。その他のタイプの発現ベクターも有用であり、例えば、米国特許第４，６３４，６６５号（Ａｘｅｌら）および米国特許第４，６５６，１３４号（Ｒｉｎｇｏｌｄら）に記述されるものがある。
選択マーカー
部位特異的な様式で発現強化座位内に外因性核酸を導入するための本明細書に開示されるベクター、および部位特異的統合の結果として得られた細胞は、対象の外因性核酸、およびコードされるポリペプチドの発現を指示するための制御配列を含んでもよい。制御配列としては、転写プロモーター、エンハンサー、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の停止を管理する配列が挙げられる。転写管理配列および翻訳管理配列は、ウイルス性の供給源によって提供されてもよい。たとえば、普遍的に使用されているプロモーターとエンハンサーは、たとえばポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウスまたはヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＣＭＶ前初期（ＣＭＶ－ＩＥ）またはＣＭＶ主要ＩＥ（ＣＭＶ－ＭＩＥ）プロモーター、ならびにＲＳＶ、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ、ユビキチン（Ｕｂｉ）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）、およびＨＩＶ ＬＴＲプロモーターに由来する。ウイルス性ゲノムプロモーター、制御配列、および／またはシグナル配列は、発現を駆動するために利用されてもよく、提供されたかかる制御配列は、選ばれた宿主細胞と両立する。対象タンパク質が発現される細胞型に応じて、非ウイルス性細胞プロモーター（例えば、β－グロビンおよびＥＦ－１αプロモーター）を使用することもできる。外因性ＤＮＡ配列の発現に有用なその他の遺伝子要素を提供するために、ＳＶ４０ウイルス性ゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起源の前期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、ならびにポリアデニル化部位を使用してもよい。前期プロモーターおよび後期プロモーターは特に有用である。その理由は、両プロモーターとも、断片としてＳＶ４０ウイルスから用意に取得され、これらも複製のＳＶ４０ウイルス起源を含むためである（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３，１９７８）。より小さいＳＶ４０断片またはより大きいＳＶ４０断片も使用されてもよい。典型的には、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位から複製のＳＶ４０起源に位置付けられたＢｇｌＩ部位に向かって延在するほぼ２５０ｂｐの配列が含まれる。誘導性（たとえば化合物、補因子、制御性タンパク質により誘導される）および／または抑制性（たとえば化合物、補因子、制御性タンパク質により抑制される）のプロモーターを使用することができ、それらは、生産期（流加培養）でのみ抗原結合タンパク質の産生を発生させ、増殖期（シードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）培養）の間は発生させないこと、または異なる座位の抗体構成要素の発現を特異的に正確に管理することが可能であるため、特に有用である。誘導性プロモーターの例としては、アルコール脱水素酵素Ｉ遺伝子プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター系、グルココルチコイド受容体プロモーター、エストロゲン受容体プロモーター、エクジソン受容体プロモーター、メタロチオネイン系プロモーター、およびＴ７ポリメラーゼ系プロモーターが挙げられる。抑制性プロモーターの例としては、少なくとも１つのＴｅｔＲオペレーター（ＴｅｔＯ）またはＡｒｃオペレーター（ＡｒｃＯ）に動作可能に連結されたＣＭＶプロモーターまたはその他のプロモーターを含有するハイブリッドプロモーター（制御性融合タンパク質とも呼称される）が挙げられ、それらは２００３年１２月１１日に公開された国際特許出願公開ＷＯ０３１０１１８９Ａ１に記載されている（参照により本明細書に援用される）。バイシストロニックベクターを介した複数の転写物の発現に適した配列は従前に報告されており（Ｋｉｍ Ｓ．Ｋ．ａｎｄ Ｗｏｌｄ Ｂ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ ４２：１２９，１９８５）、これを本発明に使用することができる。タンパク質のマルチシストロニック発現に好適な戦略例としては、２Ａペプチド（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５： ６２７－６３８（２００５））の使用、および内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）の使用が挙げられ、それらは両方とも当分野に公知である。その他のタイプの発現ベクターも有用であり、例えば、米国特許第４，６３４，６６５号（Ａｘｅｌら）および米国特許第４，６５６，１３４号（Ｒｉｎｇｏｌｄら）に記述されるものがある。
選択マーカー
【0163】
部位特異的な様式で発現強化座位内に外因性核酸を導入するための本明細書に開示されるベクター、および部位特異的統合の結果として得られた細胞は、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【0164】
一部の実施形態では、選択マーカー遺伝子はたとえばＫａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（１９８８）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：５３７に記載されるものなど、薬剤耐性を寄与するものであり、ＤＨＦＲ－ＭＴＸ抵抗性、Ｐ－糖たんぱく質および多剤耐性（ＭＤＲ）－様々な脂溶性細胞毒性剤（たとえば、アドリアマイシン、コルヒチン、ビンクリスチン）、およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）－Ｘｙｌ－Ａ、またはアデノシンおよび２’－デオキシコホルマイシンへの耐性が挙げられる。他の主要な選択マーカーとしては、たとえばネオマイシン抵抗性、カナマイシン抵抗性、またはハイグロマイシン抵抗性などの微生物由来抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられる。いくつかの適切な選択システムが、哺乳類宿主用に存在している（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、頁１６．９－１６．１５）。２つの主要選択マーカーを用いた共トランスフェクションのプロトコールも報告されている（Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５：１１３６，１９８５）。
【0165】
他の実施形態では、選択マーカー遺伝子は、場合により挿入および／もしくは置換が成功した、または成功していない遺伝子カセットの認識用の検出シグナルを提供する、または検出シグナルを生成することができるポリペプチドをコードする。適切な例としては、とくに蛍光マーカーまたはタンパク質、検出シグナルを生成する化学反応を触媒する酵素が挙げられる。蛍光マーカーの例は当分野に公知であり、限定されないが、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａサンゴ（ＤｓＲｅｄ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、藍色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、高感度藍色蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、および近赤外蛍光タンパク質（たとえば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙまたはＥ２－クリムゾン）が挙げられる。たとえば、Ｎａｇａｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．２００２ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：８７－９０；Ｈｅｉｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．１９９５年２月２３日 Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６３－６６４；およびＳｔｒａｃｋ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．２００９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：８２７９－８１を参照のこと。
【0166】
抗原結合タンパク質を作製するためのシステム
さらなる態様において、本開示は、１つ以上のベクターと細胞（たとえばＣＨＯ細胞）の組み合わせを含み、および２つの発現強化座位内に外因性核酸が統合された細胞の作製に利用可能なシステムを提供するものであり、当該外因性核酸はともに一特異性タンパク質または二特異性タンパク質いずれかの抗原結合タンパク質をコードする。当該システムは、たとえばキットの形態で提供されてもよい。
さらなる態様において、本開示は、１つ以上のベクターと細胞（たとえばＣＨＯ細胞）の組み合わせを含み、および２つの発現強化座位内に外因性核酸が統合された細胞の作製に利用可能なシステムを提供するものであり、当該外因性核酸はともに一特異性タンパク質または二特異性タンパク質いずれかの抗原結合タンパク質をコードする。当該システムは、たとえばキットの形態で提供されてもよい。
【0167】
一部の実施形態では、システムは、効率的なベクター構築、および２つの発現強化座位内の特定の部位へのＲＭＣＥを介した複数外因性核酸の同時統合を可能とするよう設計される。同時統合により、所望されるクローンの迅速な単離が可能となり、２つの発現強化座位の使用は、タンパク質産生に適した安定細胞株（たとえば市販が可能な細胞株）の生成にも重要である。
【0168】
本明細書に提供されるシステムは、細胞およびベクターセットを含む。細胞は、２つの発現強化座位の各々に統合された１ペアのＲＲＳ（５’ＲＲＳと３’ＲＲＳ）を含有する。一部の実施形態では、外因性核酸は、各座位で５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの間に存在し、そしてたとえば１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有してもよい。ベクターセットは、少なくとも２つのベクターを含み、各ベクターは、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列に隣接する１ペアのＲＲＳ（５’ＲＲＳと３’ＲＲＳ）を含有し、２つのベクターの内の１つのヌクレオチド配列は、ＨＣＦをコードし（ＨＣＦベクター）、２つのベクターの内の他方のヌクレオチド配列は、ＬＣＦをコードし（ＬＣＦベクター）、この場合においてＨＣＦとＬＣＦは、抗原結合タンパク質の領域である。ＲＲＳの各ペア内の５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは異なっており、システムのＲＲＳは、ベクターが細胞内に導入されることで、ベクター中のＨＣＦコードヌクレオチド配列またはＬＣＦコードヌクレオチド配列が、ＲＲＳにより介在されるＲＭＣＥによって２つの発現強化座位内に統合され、抗原結合タンパク質が発現されるように設計される。抗原結合タンパク質に応じて、ベクター数、ＨＣＦまたはＬＣＦコード配列の配置、およびＲＲＳ間の関係性を別々に設計することができる。
【0169】
一部の実施形態では、システムは、２つの発現強化座位内への統合、および一特異性抗原結合タンパク質の発現を目的に設計される。一部の実施形態では、２つのベクター（すなわちＨＣＦベクターとＬＣＦベクター）の内の１つの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳはそれぞれ、当該２つの座位の内の１つの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳと同一であり、他方のベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは、他方の座位の５’ＲＲＳと３’ＲＲＳと同一であり、本質的に、ＨＣＦ核酸およびＬＣＦ核酸を別個に２つの座位にそれぞれ１つずつ標的化する。他の実施形態では、ＨＣＦコード配列およびＬＣＦコード配列は、別個のベクター上にありながら、２つの座位の各々に一緒に統合されるように設計される。これらの実施形態によると、第一の座位の５’ＲＲＳと３’ＲＲＳはそれぞれ、第二の座位の５’ＲＲＳと３’ＲＲＳと同一である。各座位は、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの間に追加のＲＲＳ（中間ＲＲＳ）をさらに含有する。さらに、最初の２つのベクター中の５’ＲＲＳは、第一および第二の座位中の５’ＲＲＳと同一であり、その第一ベクター中の３’ＲＲＳは、第二ベクター中の５’ＲＲＳならびに第一および第二の座位中の中間ＲＲＳと同一であり、第二ベクター中の３’ＲＲＳは、両座位中の３’ＲＲＳと同一である。ベクターは、分割プロモーターと選択マーカーの形式を有するよう設計されてもよい（１つのベクター上のプロモーターと、当該プロモーターが別のベクター上で動作可能に連結される選択マーカー）。ベクターは、適切な統合がなされたトランスフェクタントの選択を促進するための分割選択マーカー形式または分割イントロン形式を有するよう設計されてもよい。さらにシステムは、統合後にＬＣＦコード配列とＨＣＦコード配列の相対的位置が異なるよう設計されてもよい。一部の実施形態では、システムは、ＨＣＦコード配列の上流に統合されたＬＣＦコード配列を有するよう設計される。他の実施形態では、システムは、ＨＣＦコード配列の上流に統合されたＬＣＦコード配列を有するよう設計される。
【0170】
一部の実施形態では、システムは、２つの発現強化座位内への統合、および二特異性抗原結合タンパク質の発現を目的に設計される。
【0171】
一部の実施形態では、ＨＣＦベクター（第一のＨＣＦをコードする）と、ＬＣＦベクター（第一ＬＣＦをコードする）に加えて、システムは、第一のＨＣＦとは異なる第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、たとえば、ＬＣＦベクター中、または別個のベクター、すなわち第二のＨＣＦベクター中に含有されてもよい。一部の実施形態では、第二のＨＣＦをコードする配列は、ＬＣＦベクター上の５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの間で、ＬＣＦベクター中に含有され、その場合、当該システムは、ＨＣＦベクターと、ＬＣＦ／ＨＣＦベクターを含有する。システム、特にＲＲＳは、ＨＣＦコード配列を２つの座位の内の１つに統合し、ＨＣＦとＬＣＦの両方をコードする配列を他の座位に統合するように設計されてもよい。他の実施形態では、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、別個のベクター上にあり、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接され、この場合、システムは、２つのＨＣＦベクターと１つのＬＣＦベクターを含有する。これらのその他の実施形態では、システムのＲＲＳは、ＬＣＦコード配列が、ＲＭＣＥを介して共通ＲＲＳによりＨＣＦコード配列の内の１つに「結合され得る」ように設計されてもよく、当該座位の５’ＲＲＳと３’ＲＲＳの間の共通ＲＲＳは２つの座位の内の１つにも存在し、他方のＨＣＦコード配列は、当該２つの座位の内の他方に統合される。たとえば、ＬＣＦベクターの３’ＲＲＳは、１つのＨＣＦベクターの５’ＲＲＳと同一であってもよく、また、２つの座位の内の１つの中間ＲＲＳとも同一であってもよい。この設計により、中間ＲＲＳを有する座位への統合後、ＬＣＦ－ＨＣＦの配列が発生する。別の例では、ＨＣＦベクターの３’ＲＲＳは、ＬＣＦベクターの５’ＲＲＳと同一であってもよく、および２つの座位の内の１つの中間ＲＲＳと同一であってもよく、それにより中間ＲＲＳを有する座位での統合後、ＨＣＦ－ＬＣＦの配列が発生する。一部の実施形態では、共通ＲＲＳは、本明細書において上述されるように分割選択マーカー形式、または分割イントロン形式で設計される。
【0172】
一部の実施形態では、ＨＣＦベクター（第一のＨＣＦをコードする）とＬＣＦベクター（第一ＬＣＦをコードする）、および第一のＨＣＦとは異なる第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列に加えて、システムは、第二ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。すなわち、システムは、４つの別個のコード配列を含み、２つはＨＣＦを、２つはＬＣＦをコードする。２つのＬＣＦは同一であっても、異なっていてもよい。４つのコード配列は、異なる設計で、ベクター中に配置されてもよい。一部の実施形態では、４つの配列は、以下の２つのベクター中に配置される：ＬＣＦ／ＨＣＦおよびＬＣＦ／ＨＣＦ。ＬＣＦは、いずれかベクター中のＨＣＦの上流または下流のいずれかにある。システム（ＲＲＳ）は、１つのベクター配列が、１つの座位に統合され、他方のベクター配列が、他方の座位に統合されるように設計されてもよい。一部の実施形態では、４つの配列は、以下の３つのベクター中に配置される：ＬＣＦ、ＨＣＦ、およびＬＣＦ／ＨＣＦ（ＬＣＦは、ＨＣＦの上流または下流のいずれかにある）。システムのＲＲＳは、ＬＣＦベクター、ＨＣＦベクター、およびこの他方の座位に共有される共通ＲＲＳを利用することにより、ＬＣＦ／ＨＣＦベクター中の配列が１つの座位に統合され、ＬＣＦベクター中のＬＣＦコード配列とＨＣＦベクター中のＨＣＦコード配列が他方の座位に統合されるように設計されてもよい。、同様に、共通ＲＲＳは、分割マーカー形式または分割イントロン形式で設計されてもよい。一部の実施形態では、４つの配列は、以下の４つのベクター中に配置される：ＬＣＦ、ＨＣＦ、ＬＣＦ、およびＨＣＦ。システムのＲＲＳは、ＬＣＦベクターの内の１つのＬＣＦコード配列と、ＨＣＦベクターの内の１つのＨＣＦコード配列が、共通ＲＲＳを使用することにより１つの座位に一緒に統合され、そして他方のＬＣＦベクターのＬＣＦコード配列と、他方のＨＣＦベクターのＨＣＦコード配列が、共通ＲＲＳを使用することにより１つの座位に一緒に統合されるように、設計されてもよい。
【0173】
本明細書に提示されるシステムの様々な実施形態では、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、定常領域由来のアミノ酸、たとえばアミノ酸またはドメインをコードしてもよく、または定常領域全体をコードしてもよい。特定の実施形態では、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、１つ以上の定常ドメイン、たとえばＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはそれらの組み合わせをコードしてもよい。ある実施形態では、ＨＣＦドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＣＨ３ドメインをコードしてもよい。たとえば、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードしてもよく、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードしてもよい。第一および第二のＣＨ３ドメインは同一であってもよく、または少なくとも１つのアミノ酸が異なっていてもよい。ＣＨ３ドメインにおける差異、または定常領域における差異は、本明細書に記載される二特異性抗原結合タンパク質に対する形式のいずれも取ることができ、たとえば異なるプロテインＡ結合特性を生じさせる差異、または「ｋｎｏｂ－ａｎｄ－ｈｏｌｅ」形式を生じさせる差異がある。いずれのアミノ酸配列の差異にも関係なく、２つのＨＣＦコードヌクレオチド配列は、当該２つのヌクレオチド配列の内の１つがコドン改変されているという点で異なっていてもよい。
【0174】
本明細書に提供されるシステムの様々な実施形態では、各ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、たとえばプロモーターをはじめとする転写制御配列に動作可能に連結される。一部の実施形態では、２つのＨＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーターは同じである。一部の実施形態では、２つのＨＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーター、ならびにＬＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーターはすべて同じである（たとえばＣＭＶプロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または本明細書に記載される任意のその他の適切なプロモーターなど）。
【0175】
一部の実施形態では、本発明のシステムは、１つ以上のＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、それらは可変領域をコードするベクターの内の１つに含まれてもよく、または別個のベクター中で提供されてもよい。
【0176】
本明細書に開示されるシステムは、ベクターの効率的な構築と、所望されるクローンの迅速な単離を可能とするように設計され、２つの発現強化座位の使用も、安定細胞株の生成に重要である。一部の実施形態では、システムは、意図された部位特異的統合を有する形質転換体を特定するためのネガティブ選択を使用するよう設計される（たとえば、ＲＭＣＥ後に除去される宿主ゲノム中の１つ以上の蛍光マーカー遺伝子から生じる蛍光の欠落など）。１ラウンドのネガティブ選択はたった２週間で済む場合があるが、意図される組み換えを伴うクローンの単離効率は限定的である（約１％）。統合される核酸によりもたらされる新たな選択マーカー（たとえば新たな蛍光マーカー、または薬剤もしくは抗生物質に対する抵抗性をたとえば分割形式で）に基づき、ネガティブ選択とポジティブ選択を組み合わせた場合、意図される組み換えを伴うクローンの単離効率を大幅に改善することができる（～約４０％、最大で約８０％）。システムは、追加の構成要素、試薬、または情報、たとえばトランスフェクションによる、システムの細胞内へのシステムのベクター導入に関するプロトコールなどを含んでもよい。非限定的なトランスフェクション方法としては、化学系のトランスフェクション法が挙げられ、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）： ４５６－６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４（４）： １５９０－４ ａｎｄ，Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）、デンドリマー、またはたとえばＤＥＡＥデキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーの使用が挙げられる。非化学的な方法としては、エレクトロポレーション法、ソノ－ポレーション法、および光学的トランスフェクション法が挙げられる。粒子系のトランスフェクション法としては、遺伝子銃、磁性補助トランスフェクション法（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ｊ．（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８）の使用が挙げられる。ウイルス法もトランスフェクションに使用することができる。ｍＲＮＡ送達は、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（商標）およびＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）（Ｂｉｒｅ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１３，１３：７５）を使用する方法が挙げられる。普遍的に使用されている細胞内に異種ＤＮＡを導入する１つの方法は、リン酸カルシウム沈殿法であり、たとえば、Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５６７，１９８０）に記載されている。細菌プロトプラストと、哺乳類細胞のポリエチレン誘導性融合（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１６３）は、もう１つの有用な異種ＤＮＡ導入方法である。エレクトロポレーション法は、宿主細胞の細胞質内に直接ＤＮＡを導入するために使用することもでき、たとえば、Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７１６１，１９８８）またはＳｈｉｇｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２，１９８８）に記載されている。哺乳類細胞内への異種ＤＮＡの導入に有用な他の試薬は、たとえばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）試薬およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、米国メリーランド州、ゲイザースバーグ）などが報告されている。これらの市販の試薬は両方とも脂質－核酸複合体（またはリポソーム）を形成するために使用され、培養細胞に適用される場合、細胞内への核酸取り込みを促進する。
【0177】
抗原結合タンパク質の作製方法
本開示は、二特異性抗原結合タンパク質の作製方法もさらに提供する。本明細書に開示される方法を使用することで、所望される抗原結合タンパク質が、高い力価および／または高い特異的生産性（ｐｇ／細胞／日）で産生され得る。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、少なくとも１ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ．２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌまたはそれ以上の力価で産生される。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、１日当たり、１細胞当たりで産生される総抗原結合タンパク質（ｐｇ）に基づき決定される特異的生産性が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ピコグラム／細胞／日（ｐｃｄ）またはそれ以上で、産生される。一部の実施形態では、総抗原結合タンパク質力価に対する二特異性抗原結合タンパク質力価の比率が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％またはそれ以上で、二特異性抗原結合タンパク質が産生される。
本開示は、二特異性抗原結合タンパク質の作製方法もさらに提供する。本明細書に開示される方法を使用することで、所望される抗原結合タンパク質が、高い力価および／または高い特異的生産性（ｐｇ／細胞／日）で産生され得る。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、少なくとも１ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ．２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌまたはそれ以上の力価で産生される。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、１日当たり、１細胞当たりで産生される総抗原結合タンパク質（ｐｇ）に基づき決定される特異的生産性が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ピコグラム／細胞／日（ｐｃｄ）またはそれ以上で、産生される。一部の実施形態では、総抗原結合タンパク質力価に対する二特異性抗原結合タンパク質力価の比率が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％またはそれ以上で、二特異性抗原結合タンパク質が産生される。
【0178】
１つの実施形態では、当該方法は、本明細書に開示されるシステムを利用し、そしてトランスフェクションによって当該システムの細胞内に、当該システムのベクターを導入する。ＲＭＣＥを介して細胞の２つの発現強化座位内に外因性核酸が適切に統合されたトランスフェクト細胞がスクリーニングされ、特定されてもよい。一部の実施形態では、トランスフェクトされた細胞の特定は、トランスフェクションの前に宿主細胞中に存在した１つ以上の選択マーカーに対するネガティブ選択により実施される。他の実施形態では、トランスフェクトされた細胞の特定は、トランスフェクションの前に宿主細胞中に存在した１つ以上の選択マーカーに対するネガティブ選択と、統合されるよう設計されたベクター中の核酸によりもたらされる１つ以上の選択マーカーに基づいたポジティブ選択を組み合わせて実施される。ＨＣＦ含有ポリペプチドおよびＬＣＦ含有ポリペプチドは、統合核酸から発現されることができ、対象の抗原結合タンパク質は、特定されたトランスフェクト細胞から取得され、公知の方法を使用して精製されることができる。
【0179】
別の実施形態では、当該方法は、本明細書において上述される細胞を単純に利用するものであり、当該細胞は、２つの発現強化座位で統合された外因性核酸を含有し、それら外因性核酸は抗原結合タンパク質をコードし、当該細胞から当該抗原結合タンパク質を発現させる。各クローン化された発現カセットは、各特定の統合部位内で連続的である。
【0180】
本明細書は、限定するものとして解釈すべきではない以下の実施例により、さらに例示される。全ての引用参考文献（本出願全体で引用される文献参照、発行特許、及び公表された特許出願を含む）は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例0181】
実施例１：２つの特定の発現強化座位における、一特異性抗体（Ａｂｓ）の（部位特異的統合を介した）発現
Ａｂ鎖（ＡｂＣ１、ＡｂＣ２）はベクター内にクローニングされ、図１に図示されるように、ベクター中でＲＳＳ部位は、Ａｂ発現カセットと、選択マーカー用の発現カセットに隣接していた。２つのＡｂ鎖は別個のベクターにクローニングされてもよく、または１つのベクター内で組み合わされてもよく、その中で２つの発現カセットは、以下の可能性のある順序のいずれか１つで、タンデムに配置される：ＡｂＣ１、ＡｂＣ２、および選択マーカー。たとえばＡｂＣ１は、従来的なＬＣと同等であり、ＡｂＣ２は、従来的な重鎖と同等である。
Ａｂ鎖（ＡｂＣ１、ＡｂＣ２）はベクター内にクローニングされ、図１に図示されるように、ベクター中でＲＳＳ部位は、Ａｂ発現カセットと、選択マーカー用の発現カセットに隣接していた。２つのＡｂ鎖は別個のベクターにクローニングされてもよく、または１つのベクター内で組み合わされてもよく、その中で２つの発現カセットは、以下の可能性のある順序のいずれか１つで、タンデムに配置される：ＡｂＣ１、ＡｂＣ２、および選択マーカー。たとえばＡｂＣ１は、従来的なＬＣと同等であり、ＡｂＣ２は、従来的な重鎖と同等である。
【0182】
簡潔に述べると、ＶＨドメインとＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＰＣＲにより、単一抗原陽性Ｂ細胞から直接単離されてもよい。重鎖と軽鎖のＰＣＲ産物をそれぞれ、ＩｇＧ重鎖定常領域とカッパ軽鎖定常領域を含有するＳａｐ Ｉ－直線化抗体ベクター内にクローニングした。重鎖プラスミド（ＡｂＣ２）は、重鎖発現カセットに隣接するＲＲＳ３とＲＲＳ２の部位を有している。さらに、重鎖プラスミド中のＲＲＳ３のすぐ下流に、分割選択マーカー遺伝子がある（たとえば、ＵＳ７５８２２９８）。軽鎖プラスミドは、軽鎖発現カセットに隣接するＲＲＳ１とＲＲＳ３の部位を有している。さらに軽鎖プラスミドは、ＲＲＳ３で、ＡＴＧのすぐ前に強力なプロモーターを有している。そのため、宿主細胞の座位内にＲＲＳ３－近接プロモーターが統合されると、軽鎖プラスミド由来の開始ＡＴＧが、適切なリーディングフレームで、重鎖プラスミド中の選択マーカー遺伝子に隣接して置かれ、選択遺伝子の転写と翻訳が可能となる。次いで重鎖可変領域配列を有する精製組み換えプラスミドと、同じＢ細胞由来の軽鎖可変領域配列を有する精製組み換えプラスミドを混合して、リコンビナーゼを発現するプラスミドとともに改変ＣＨＯ宿主細胞株内にトランスフェクトする。当該改変ＣＨＯ宿主細胞株は適切なＲＳＳと選択マーカーを、配列番号１（ＥＥＳＹＲ（登録商標）、座位１）と配列番号２の座位で有している。改変ＣＨＯ宿主細胞株は、２つの転写活性座位で、４つの異なる選択マーカーを含有する。結果として、選択マーカーが異なる蛍光マーカーである場合、所望される細胞組換え体を表すポジティブ－ネガティブの組み合わせに対し、フローサイトメトリー法により産生ＣＨＯ細胞を単離することができる。重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を発現する組み換え型プラスミドがともに、リコンビナーゼを発現するプラスミドとともにトランスフェクトされる場合、当該リコンビナーゼに介在される部位特異的組み換えは、ＲＲＳを含有する各染色体の座位での抗体プラスミドの統合と、置換を生じさせる。したがって、一特異性抗体を発現する組み換え型細胞が単離され、１２日間の流加培養に供され、その後、採取され、固定プロテインＡを使用したＯｃｔｅｔ力価アッセイが行われる。細胞は同質遺伝子的であり、安定であることが確認された。小さな振とうフラスコ中の全体的な力価は、２座位統合法を使用した場合、一特異性抗体の発現の増加が観察され、抗体Ｂは大幅な増加を生じさせ、ほぼ二倍の力価であった（図２）。
【0183】
実施例２：２つの特定の発現強化座位における、二特異性抗体（ＢｓＡｂｓ）の（部位特異的統合を介した）発現
二特異性抗体の発現に関し、３つの抗体鎖と、２つの選択マーカーを、実施例１のプラスミドに類似したプラスミド内にクローニングした。それによりＡｂＣ１、ＡｂＣ２、および選択マーカー１が、第一の座位または統合座位（ＥＥＳＹＲ（登録商標）、配列番号１、座位１）と適合するＲＲＳ部位に隣接され、ＡｂＣ１、ＡｂＣ３、選択マーカー２は第二の座位または統合部位と適合するＲＲＳ部位に隣接される。我々の観察では、従来的なＬＣとしてのＡｂＣ１は、適切な発現に対し、２遺伝子コピーは必要としない。各部位に対し、１つまたは２つのプラスミドを作製した。３つの発現カセットのいずれかがタンデムに配置され、または２つのプラスミド内に配置される。２つの発現カセットが１つのベクター内にクローニングされ、残りの発現カセットは第二ベクター内にクローニングされる。図３を参照のこと。
二特異性抗体の発現に関し、３つの抗体鎖と、２つの選択マーカーを、実施例１のプラスミドに類似したプラスミド内にクローニングした。それによりＡｂＣ１、ＡｂＣ２、および選択マーカー１が、第一の座位または統合座位（ＥＥＳＹＲ（登録商標）、配列番号１、座位１）と適合するＲＲＳ部位に隣接され、ＡｂＣ１、ＡｂＣ３、選択マーカー２は第二の座位または統合部位と適合するＲＲＳ部位に隣接される。我々の観察では、従来的なＬＣとしてのＡｂＣ１は、適切な発現に対し、２遺伝子コピーは必要としない。各部位に対し、１つまたは２つのプラスミドを作製した。３つの発現カセットのいずれかがタンデムに配置され、または２つのプラスミド内に配置される。２つの発現カセットが１つのベクター内にクローニングされ、残りの発現カセットは第二ベクター内にクローニングされる。図３を参照のこと。
【0184】
重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を発現する組み換え型プラスミドがともに、リコンビナーゼを発現するプラスミドとともにトランスフェクトされる場合、当該リコンビナーゼに介在される部位特異的組み換えは、ＲＲＳを含有する各染色体の座位で、抗体プラスミドの統合と置換を生じさせる。したがって、二特異性抗体を発現する組み換え細胞が単離され、１２日間の流加培養に供され、その後、採取されて、固定抗Ｆｃと第二抗Ｆｃ＊（改変Ｆｃ検出抗体。ＵＳ２０１４－０１３４７１９Ａ１を参照のこと。２０１４年５月１５日公開）を使用してＯｃｔｅｔ力価アッセイを行った。細胞は同質遺伝子的であり、安定であることも観察された。小さな振とうフラスコ中の全体的な力価は、２座位統合法を使用した場合から、１．７５倍～２倍超と有意に上昇したことが観察された（図５）。
【0185】
実施例３：部位特異的統合後の二特異性抗体および一特異性抗体の大規模製造
宿主細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）は、上述のように実施例１に類似して作製された（二特異性抗体に関しては図３、一特異性抗体に関しては図１も参照のこと）。ＥＥＳＹＲ（登録商標）（座位１）と配列番号２（座位２）における遺伝子カセットのＲＭＣＥが可能な宿主細胞を、たった１つの統合部位（座位１／ＥＥＳＹＲ（登録商標））への遺伝子カセットのＲＭＣＥが可能な宿主細胞と比較した。抗体の軽鎖と重鎖（ＡｂＣ１、ＡｂＣ２、ＡｂＣ３）を担持するベクターと、必要なＲＲＳと選択マーカー核酸（図３を参照）を、産生細胞株（ＲＳＸ２ＢＰ）へと組み換え、Ａｂ Ｅ、Ａｂ Ｆ、Ａｂ Ｇ、およびＡｂ Ｈを発現する宿主細胞を作製した。ゆえに、各二特異性抗体宿主細胞は、１つの共通軽鎖と、異なる抗原に結合する２つの重鎖を発現し、当該重鎖の内の１つは、そのＣＨ３ドメイン中で操作され、プロテインＡに別個に結合する（参照により本明細書に援用される米国特許第８，５８６，７１３号に記載される）。
宿主細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）は、上述のように実施例１に類似して作製された（二特異性抗体に関しては図３、一特異性抗体に関しては図１も参照のこと）。ＥＥＳＹＲ（登録商標）（座位１）と配列番号２（座位２）における遺伝子カセットのＲＭＣＥが可能な宿主細胞を、たった１つの統合部位（座位１／ＥＥＳＹＲ（登録商標））への遺伝子カセットのＲＭＣＥが可能な宿主細胞と比較した。抗体の軽鎖と重鎖（ＡｂＣ１、ＡｂＣ２、ＡｂＣ３）を担持するベクターと、必要なＲＲＳと選択マーカー核酸（図３を参照）を、産生細胞株（ＲＳＸ２ＢＰ）へと組み換え、Ａｂ Ｅ、Ａｂ Ｆ、Ａｂ Ｇ、およびＡｂ Ｈを発現する宿主細胞を作製した。ゆえに、各二特異性抗体宿主細胞は、１つの共通軽鎖と、異なる抗原に結合する２つの重鎖を発現し、当該重鎖の内の１つは、そのＣＨ３ドメイン中で操作され、プロテインＡに別個に結合する（参照により本明細書に援用される米国特許第８，５８６，７１３号に記載される）。
【0186】
一特異性抗体に関しては、抗体の軽鎖と重鎖（ＡｂＣ１、ＡｂＣ２）はベクター内にクローニングされ、図１に図示されるように、その中でＲＳＳ部位は、Ａｂ発現カセットに隣接している（および発現カセットは選択マーカー遺伝子も提供する）。組み換えが実施され、Ａｂ ＪとＡｂ Ｋを発現する宿主細胞（ＲＳＸ２）が作製された。
【0187】
２Ｌ、１５Ｌ、または５０Ｌのバイオリアクターに、ＣＨＯ－Ｋ１由来の抗体産生細胞株ＲＳＸ２の種培養物が接種された。接種細胞を１３日間、３６．５℃で増殖させ、必要に応じてグルコースと他の補助栄養素を与えた。細胞は、化学的に規定された（加水分解物が無く、無血清）基礎培地中で増殖された。総抗体が採取され、精製が行われた。
【0188】
総ＩｇＧ抗体（力価）は、プロテインＡ／プロテインＧクロマトグラフィーの後に決定された。二特異性抗体に関しては、総ＩｇＧ抗体、ならびに二特異性（ヘテロ二量体Ｆｃ／Ｆｃ＊）、野生型重鎖とのホモ二量体（Ｆｃ／Ｆｃ）および改変重鎖とのホモ二量体（Ｆｃ＊／Ｆｃ＊）を含む３種の抗体の各々が測定され、所望される二特異性抗体種の比率が決定された。総力価は、プロテインＡ／プロテインＧカラムを使用したＨＰＬＣ法により、米国特許第８，５８６，７１３号に記載される溶出法を用いて決定された。簡潔に述べると、３つのバイオリアクター種は、サンプルローディングの間にカラムに結合し、二特異性種（Ｆｃ／Ｆｃ＊）は、イオン調節剤の存在下のｐＨ段階勾配を用いることで、プロテインＡから最初に溶出される。最初の溶出工程の間に二特異性種が集められ、その後、２つのホモ二量体種が溶出される。
【0189】
表１は、２つの統合座位を介して抗体を発現する宿主細胞を使用することで、試験的な大規模製造培養における全体的な（総）ＩｇＧ力価と、二特異性抗体力価（図６Ａ）が大幅に改善されたことを示す。
【0190】
【表1】
【0191】
二特異性力価は上述のように決定された。表２にみられるように、細胞により産生された総ＩｇＧ力価の比率としての二特異性抗体の力価は、２つの統合部位構造を有する宿主細胞の製造培養において有意に高い。図６Ｂを参照のこと。実際に５０％以上の二特異性の比率が一貫して得られたことは予想外であった。
【0192】
【表2】
【0193】
全体的なＩｇＧ力価における改善を決定するために、２統合部位法を使用して一特異性抗体が発現された。表３は、大規模バイオリアクターにおける全体的な力価が、０．６倍から１．３倍に有意に上昇したことが観察されたことを図示する。図７も参照のこと。製造で使用される生産バイオリアクター、特に５００Ｌから最大で１０，０００Ｌの培養量のもので、これら改善細胞株の使用により力価の上昇が観察され、バッチ当たりの生産量の有意な上昇と同等であった。
【0194】
【表3】
【0195】
前述の本発明は、解説および例示を目的としていくらか詳細に記載されているが、当分野の当業者には、添付の請求項の主旨または範囲から逸脱することなく、本発明技術に対してある変更および修飾が為され得ることを用意に理解されるであろう。
配列
配列
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表4-5】
【表4-6】
【表4-7】
【表4-8】
【表4-9】
【表4-10】
【表4-11】
【表4-12】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【外国語明細書】