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特開2024-23501ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性予測方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024023501

(43)【公開日】2024-02-21

(54)【発明の名称】ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性予測方法

(51)【国際特許分類】

G01N 33/68 20060101AFI20240214BHJP

G01N 33/53 20060101ALI20240214BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N33/53 Y

G01N33/53 D

G01N33/53 N

【審査請求】有

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023203884

(22)【出願日】2023-12-01

(62)【分割の表示】P 2021560871の分割

【原出願日】2020-12-04

(31)【優先権主張番号】10-2019-0162071

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0157961

(32)【優先日】2020-11-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

３．ＭＡＴＬＡＢ

(71)【出願人】

【識別番号】519375468

【氏名又は名称】プロテイナカンパニーリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100195257

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕一志

(72)【発明者】

【氏名】ユン、テ―ヨン

(72)【発明者】

【氏名】イ、ホンウォン

(72)【発明者】

【氏名】チェ、ビョンサン

(72)【発明者】

【氏名】チャ、ミンクォン

(72)【発明者】

【氏名】ホン、セム

(72)【発明者】

【氏名】イ、ヨンソ

(72)【発明者】

【氏名】チョン、チャング

(72)【発明者】

【氏名】コ、ヨンギル

(72)【発明者】

【氏名】ユン、ソン－ス

(57)【要約】（修正有）

【課題】ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性予測方法、およびＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物治療に適した対象の選別方法の提供。
【解決手段】試料内のアポトーシス抑制（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質とアポトーシス誘導（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質の間の相互作用を測定する段階（ａ１）および／または試料内のアポトーシス抑制タンパク質および／またはアポトーシス誘導タンパク質の水準（レベル）を測定する段階（ａ２）を含み得る。
【選択図】図３８ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

個体のＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法であって、
（ａ）次のうちから選択された少なくとも２つの段階の組み合せによる結果を取得する段階：
（ｉ）試料内の第１タンパク質、および前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階であって、前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質は外部から供給されたタンパク質である、段階；
（ｉｉ）試料内の第１タンパク質、および前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階であって、前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質は試料内に存在するタンパク質である、段階；および
（ｉｉｉ）第１タンパク質、前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質、またはこれらすべての試料内のレベルを測定する段階、
および、
（ｂ）段階（ａ）で得られた結果を基準値と比較する段階
を含み、
ここで、前記第１タンパク質はＢＣＬ２ファミリータンパク質のうちアポトーシス抑制（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質より選ばれた１種以上であり、前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質はＢＣＬ２ファミリータンパク質のうちアポトーシス誘導（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質からなる群より選ばれた１種以上であるか、または、前記第１タンパク質はＢＣＬ２ファミリータンパク質のうちアポトーシス誘導タンパク質より選ばれた１種以上であり、前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質はＢＣＬ２ファミリータンパク質のうちアポトーシス抑制タンパク質からなる群より選ばれた１種以上であり、
前記基準値は、ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物治療が治療効果を発揮する患者から分離された効果群試料、またはＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物治療が治療効果を発揮しない患者から分離された非効果群試料に段階を適用することにより得られた値であり、
前記試料は前記個体から分離された細胞または細胞溶解物を含む、方法。

【請求項2】

前記第１タンパク質はＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＢＣＬｗ、ＢＦＬ１およびＭＣＬ１からなる群より選ばれた１種以上であり、前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質はＢＡＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ｔＢＩＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＢＯＫからなる群より選ばれた１種以上であるか、または
前記第１タンパク質はＢＡＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ｔＢＩＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＢＯＫからなる群より選ばれた１種以上であり、前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質はＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＢＣＬｗ、ＢＦＬ１およびＭＣＬ１からなる群より選ばれた１種以上である、
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記段階（ｉ）は、基板に固定した前記第１タンパク質に、外部から供給されて標識物質で標識された前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質（第１タンパク質相互作用タンパク質）を接触させ、前記試料内の第１タンパク質および外部から供給された第１タンパク質相互作用タンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階を含み；
前記段階（ｉｉ）は、表面に前記第１タンパク質と結合する結合物質を含む基板に、試料を接触させ、試料内の第１タンパク質および試料内の第１タンパク質相互作用タンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階を含み；
前記段階（ｉｉｉ）は、試料内の第１タンパク質、試料内の第１タンパク質相互作用タンパク質、またはこれらすべてのレベルを測定する段階を含む、
請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記段階（ｉ）の測定する段階は、
（１）第１タンパク質の結合物質が含まれた基板に試料を供給して第１タンパク質を基板に固定させる段階；
（２－１）前記基板に、標識物質が付着した第１タンパク質相互作用タンパク質を外部から供給して、基板上の第１タンパク質と反応させる段階；および
（３）基板表面上の近接場領域内で前記標識物質が発生させる信号をＴＩＲＦ顕微鏡（ｔｏｔａｌｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて測定する段階
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記段階（ｉ）は、次の中から選ばれた一つ以上を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ－１）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＡＤタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－２）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－３）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－４）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－５）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＡＤタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－６）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－７）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－８）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－９）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＮＯＸＡタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－１０）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－１１）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；および
（ｉ－１２）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階。

【請求項6】

前記段階（ｉｉ）の複合体のレベルを測定する段階は、
（１）第１タンパク質の結合物質が含まれた基板に試料を供給して第１タンパク質を基板に固定させる段階；
（２－２）標識物質が付着した第１タンパク質相互作用タンパク質の結合物質を前記基板に供給し、試料内の第１タンパク質と試料内の第１タンパク質相互作用タンパク質の間に形成された複合体中の、第１タンパク質相互作用タンパク質と反応させる段階；および
（３）基板表面上の近接場領域内で前記標識物質から発生する信号をＴＩＲＦ顕微鏡（ｔｏｔａｌｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて測定する段階を含むか、または
（１’）第１タンパク質相互作用タンパク質の結合物質が含まれた基板に試料を供給して第１タンパク質相互作用タンパク質を基板に固定させる段階；
（２’－２）標識物質が付着した第１タンパク質結合物質を前記基板に供給し、試料内の第１タンパク質と試料内の第１タンパク質相互作用タンパク質の間に形成された複合体中の、第１タンパク質と反応させる段階；および
（３’）基板表面上の近接場領域内で前記標識物質から発生する信号をＴＩＲＦ顕微鏡（ｔｏｔａｌｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて測定する段階を含む、
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記段階（ｉｉ）は次の中から選ばれた一つ以上を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法：
（ｉｉ－１）試料内のＢＣＬ２タンパク質および試料内のＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－２）試料内のＢＣＬ２タンパク質および試料内のＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－３）試料内のＢＣＬ２タンパク質および試料内のＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－４）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＡＤタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－５）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－６）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－７）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－８）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＮＯＸＡタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－９）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－１０）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；および
（ｉｉ－１１）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階。

【請求項8】

前記段階（ｉｉｉ）のタンパク質のレベルを測定する段階は、
第１タンパク質の捕獲物質、第１タンパク質相互作用タンパク質の捕獲物質、またはこれらすべてが含まれた基板に試料を供給し、前記第１タンパク質、第１タンパク質相互作用タンパク質、またはこれらすべてを基板に固定化させる段階；
標識物質が付着した第１タンパク質の検出物質、標識物質が付着した第１タンパク質相互作用タンパク質の検出物質、またはこれらすべてを前記基板に供給して反応させる段階；および
基板表面上の近接場領域内で前記標識物質が発現する信号をＴＩＲＦ顕微鏡（ｔｏｔａｌｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて測定する段階
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記段階（ｉｉｉ）は次の中から選ばれた一つ以上を含む、請求項２～８のいずれか一項に記載の方法：
（ｉｉｉ－１）試料内のＢＣＬ２タンパク質のレベルを測定する段階；
（ｉｉｉ－２）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質のレベルを測定する段階；
（ｉｉｉ－３）試料内のＭＣＬ１タンパク質のレベルを測定する段階；
（ｉｉｉ－４）試料内のＢＡＸタンパク質のレベルを測定する段階；および
（ｉｉｉ－５）試料内のＢＡＫタンパク質のレベルを測定する段階。

【請求項10】

次の段階（ｉ－１）～（ｉ－１２）より選ばれた一つ以上および段階（ｉｉ－１）～（ｉｉ－１１）より選ばれた一つ以上を含むか、段階（ｉ－１）～（ｉ－１２）より選ばれた一つ以上および段階（ｉｉｉ－１）～（ｉｉｉ－５）より選ばれた一つ以上を含むか、段階（ｉｉ－１）～（ｉｉ－１１）より選ばれた一つ以上および段階（ｉｉｉ－１）～（ｉｉｉ－５）より選ばれた一つ以上を含むか、段階（ｉ－１）～（ｉ－１２）より選ばれた一つ以上、段階（ｉｉ－１）～（ｉｉ－１１）より選ばれた一つ以上、および段階（ｉｉｉ－１）～（ｉｉｉ－５）より選ばれた一つ以上を含む、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ－１）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＡＤタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－２）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－３）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－４）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－５）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＡＤタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－６）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－７）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－８）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－９）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＮＯＸＡタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－１０）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－１１）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉ－１２）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体のレベルを測定する段階；
（ｉｉ－１）試料内のＢＣＬ２タンパク質および試料内のＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－２）試料内のＢＣＬ２タンパク質および試料内のＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－３）試料内のＢＣＬ２タンパク質および試料内のＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－４）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＡＤタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－５）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－６）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－７）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－８）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＮＯＸＡタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－９）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＢＩＭタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－１０）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＢＡＸタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉ－１１）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＢＡＫタンパク質の間に形成された複合体レベルを測定する段階；
（ｉｉｉ－１）試料内のＢＣＬ２タンパク質のレベルを測定する段階；
（ｉｉｉ－２）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質のレベルを測定する段階；
（ｉｉｉ－３）試料内のＭＣＬ１タンパク質のレベルを測定する段階；
（ｉｉｉ－４）試料内のＢＡＸタンパク質のレベルを測定する段階；
（ｉｉｉ－５）試料内のＢＡＫタンパク質のレベルを測定する段階。

【請求項11】

前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物はベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）、ＡＢＴ７３７、および抗ＢＣＬ２抗体からなる群より選ばれたＢＣＬ２阻害剤である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物は抗ＭＣＬ－１抗体、ＡＭＧ－１７６、ＡＺＤ５９９１、およびマリトクラックス（Ｍａｒｉｔｏｃｌａｘ）からなる群より選ばれたＭＣＬ１阻害剤である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物は抗ＢＣＬｘＬ抗体およびＡＢＴ２６３からなる群より選ばれたＢＣＬｘＬ阻害剤である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記個体は癌患者であり、前記細胞は前記個体から分離された癌細胞である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記癌は血液癌である、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性予測方法、およびＢＣＬ２ファ
ミリータンパク質標的薬物治療に適した対象選別方法が提供される。

【背景技術】

【0002】

ＢＣＬ２（Ｂ－ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ２）ファミリータンパク質はアポトーシ
スを誘発（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）または抑制（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）
することでアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を調節するタンパク質である。

【0003】

ＢＣＬ２ファミリータンパク質は黒色腫、乳癌、前立腺癌、慢性リンパ球性白血病およ
び肺癌を含む多様な癌の原因として知られており、癌治療に対する抵抗性を誘発する原因
としても知られており、精神分裂症および自己免疫の原因である可能性も提示されている
。このような理由からＢＣＬ２ファミリータンパク質は抗癌剤の良い標的となっており、
ＢＣＬ２ファミリータンパク質を標的とする多様な抑制剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）が開発
されている。

【0004】

このようなＢＣＬ２ファミリータンパク質の標的薬物が癌治療に効果的に適用されるた
めにＢＣＬ２ファミリータンパク質によるアポトーシス調節信号を定量的に把握できる手
段の開発が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

信号伝達の媒介になるタンパク質の相互作用を定量的に測定して、ＢＣＬ２ファミリー
タンパク質標的薬物の処方によって癌（例えば、血液癌）治療が可能な患者を確認できる
個別オーダーメード治療技術が提供される。

【0006】

一例で、個体のＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性もしくは個体で
のＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物の効能を予測する方法または前記予測のために
情報を提供する方法が提供される。

【0007】

他の例は、ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対して反応性を有する対象または
ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物が効能を示す個体またはＢＣＬ２ファミリータン
パク質標的薬物を適用するのに適した個体を選別（確認）する方法または前記選別（確認
）のために情報を提供する方法が提供される。

【0008】

前記方法は、前記薬物に対して反応性を有する個体、前記薬物が効能を示す個体、また
は前記薬物もしくは前記薬物を用いる治療を適用するのに適した個体に前記薬物を投与す
る段階をさらに含み得る。

【0009】

他の例は、ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物を含み、ＢＣＬ２ファミリータンパ
ク質標的薬物に対して反応性を有する個体、ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物が効
能を示す個体、またはＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物もしくはそれを用いた治療
を適用するのに適した個体の癌治療用組成物を提供する。

【0010】

他の例は、前記方法により確認されたＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対して
反応性を有する個体、ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物が効能を示す個体、または
ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物もしくはそれを用いた治療を適用するのに適した
個体に前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物の薬学的有効量を投与する段階を含む
、癌の治療方法が提供される。

【0011】

前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物はＢＣＬ２ファミリータンパク質を標的と
するもの（例、ＢＣＬ２タンパク質阻害剤またはＭＣＬ１タンパク質阻害剤）であり得る
。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本明細書で提供される、個体のＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性
もしくは個体でのＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物の効能を予測する方法または前
記予測のために情報を提供する方法；および／またはＢＣＬ２ファミリータンパク質標的
薬物に対して反応性を有する個体もしくはＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物が効能
を示す個体もしくはＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物を適用するのに適した個体を
選択（確認）する方法または前記選択（確認）のために情報を提供する方法は、試料内の
アポトーシス抑制（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質とアポトーシス誘導（ｐ
ｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質の間の相互作用を測定する段階（ａ１）（例えば
；下記の段階（ｉ）および／または（ｉｉ））および／または試料内のアポトーシス抑制
タンパク質および／またはアポトーシス誘導タンパク質の水準（レベル）を測定する段階
（ａ２）（例えば、下記の段階（ｉｉｉ））を含み得る。

【0013】

一例で、本明細書で提供される方法は、次より選ばれた一つ以上（例、１個、２個、ま
たは３個）を含み得る：
（ｉ）試料内の第１タンパク質および前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質の
間の相互作用を測定する段階として、前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質は外
部から供給されたタンパク質である段階（第１タンパク質－タンパク質相互作用の測定段
階）；
（ｉｉ）試料内の第１タンパク質および前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質
の間の相互作用を測定する段階として、前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質は
試料内に存在するタンパク質である段階（第２タンパク質－タンパク質相互作用の測定段
階）；および
（ｉｉｉ）第１タンパク質、前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質、またはこ
れらすべての試料内の水準を測定する段階。

【0014】

一例で、本明細書で提供される方法は、前記段階（ｉ）、段階（ｉｉ）、または段階（
ｉｉｉ）を含み得る。他の例で、本明細書で提供される方法は、前記段階（ｉ）および段
階（ｉｉ）の組み合わせ、段階（ｉ）および段階（ｉｉｉ）の組み合わせ、段階（ｉｉ）
および段階（ｉｉｉ）の組み合わせ、または段階（ｉ）、段階（ｉｉ）、および段階（ｉ
ｉｉ）の組み合わせを含み得る。

【0015】

前記第１タンパク質および第１タンパク質と相互作用するタンパク質（以下、「第１タ
ンパク質と相互作用するタンパク質」を「第１タンパク質相互作用タンパク質」とも記載
する）はアポトーシス抑制（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）サブタイプタンパク質と細
胞生存誘導サブタイプタンパク質より選ばれ得る。

【0016】

一例として、前記段階（ｉ）～（ｉｉｉ）の第１タンパク質は、ＢＣＬ２ファミリータ
ンパク質のうちの「細胞生存誘導（ｐｒｏ－ｓｕｒｖｉｖａｌ）またはアポトーシス抑制
（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）サブタイプタンパク質」（以下、「アポトーシス抑制
タンパク質」と記載する）より選ばれた１種以上であり得る。例えば、前記段階（ｉ）～
（ｉｉｉ）の第１タンパク質は、互いに同一であるか異なってもよく、それぞれ独立して
、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＢＣＬｗ、ＢＦＬ１およびＭＣＬ１からなる群より選ばれた１
種以上（例、１種、２種または３種）であり得る。前記段階（ｉ）～（ｉｉｉ）の第１タ
ンパク質と相互作用するタンパク質は、ＢＣＬ２ファミリータンパク質のうちアポトーシ
ス誘導（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）サブタイプタンパク質（以下、「細胞アポトーシ
ス誘導（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）サブタイプタンパク質」を「アポトーシス誘導タ
ンパク質」と記載する）より選ばれた１種以上であり得る。一例で、段階（ｉ）～（ｉｉ
ｉ）の前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質は、互いに同一であるか異なっても
よく、それぞれ独立して、アポトーシス誘導タンパク質のうちＢＨ３サブタイプ（ＢＨ３
－ｏｎｌｙ）タンパク質（第２タンパク質）およびエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）サ
ブタイプタンパク質（第３タンパク質）からなる群より選ばれた１種以上であり得る。例
えば、前記第２タンパク質はＢＡＤ、ＢＩＭ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＢＩＤ、ｔＢＩＤ、Ｂ
ＩＫ、ＨＲＫおよびＮＯＸＡからなる群より選ばれた１種以上（例、１種、２種または３
種）であり、前記第３タンパク質はＢＡＸ、ＢＯＫおよびＢＡＫからなる群より選ばれた
１種以上（例、１種または２種）であり得る。一例で、前記第１タンパク質と相互作用す
るタンパク質はＢＡＤ、ＢＩＭ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＢＩＤ、ｔＢＩＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ
、ＮＯＸＡ、ＢＡＸ、ＢＯＫおよびＢＡＫからなる群より選ばれた１種以上（例、１種、
２種、３種、４種または５種）であり得る。前記方法が段階（ｉ）～（ｉｉｉ）のうち２
以上を含む場合、各段階での第１タンパク質と相互作用するタンパク質は互に同一または
異なってもよい。

【0017】

他の例で、前記段階（ｉ）～（ｉｉｉ）の第１タンパク質はＢＣＬ２ファミリータンパ
ク質のうちのアポトーシス誘導（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質より選ばれた
１種以上であり得る。一例で、前記段階（ｉ）～（ｉｉｉ）の第１タンパク質は、互いに
同一であるか異なってもよく、それぞれ独立して、ＢＣＬ２ファミリータンパク質のうち
のアポトーシス誘導タンパク質のうちＢＨ３サブタイプ（ＢＨ３－ｏｎｌｙ）タンパク質
およびエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）サブタイプタンパク質からなる群より選ばれた
１種以上であり得る。例えば、前記ＢＨ３サブタイプ（ＢＨ３－ｏｎｌｙ）タンパク質は
ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ｔＢＩＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫおよびＮＯＸＡからなる
群より選ばれた１種以上（例、１種、２種または３種）であり、前記エフェクター（ｅｆ
ｆｅｃｔｏｒ）サブタイプタンパク質はＢＡＸ、ＢＯＫおよびＢＡＫからなる群より選ば
れた１種以上（例、１種または２種）であり得る。前記段階（ｉ）～（ｉｉｉ）の第１タ
ンパク質と相互作用するタンパク質はＢＣＬ２ファミリータンパク質のうちアポトーシス
抑制（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質より選ばれた１種以上であり得る。例
えば、前記段階（ｉ）～（ｉｉｉ）の第１タンパク質と相互作用するタンパク質は、互い
に同一であるか異なってもよく、それぞれ独立して、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＢＣＬｗ、
ＢＦＬ－１およびＭＣＬ１からなる群より選ばれた１種以上（例、１種、２種または３種
）であり得る。

【0018】

前記方法が段階（ｉ）～（ｉｉｉ）のうち２以上を含む場合、各段階での第１タンパク
質および第１タンパク質と相互作用するタンパク質は互に同一または異なってもよい。

【0019】

本明細書で、用語の「試料（生物学的試料）」は個体（例えば、人間）から分離した細
胞または細胞溶解物を含むものであり得る。前記個体は疾病（例えば、癌）の治療を必要
とする個体として、ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物の投与もしくはＢＣＬ２ファ
ミリータンパク質標的薬物を用いた治療法の適用対象個体またはＢＣＬ２ファミリータン
パク質標的薬物の投与もしくはＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物を用いた治療法の
効能（薬物反応性）の確認を必要とする個体であり得る。一具体例で、前記個体は癌患者
（例えば、人間）であり、前記細胞は前記個体から分離した癌細胞であり得る。例えば、
前記個体は人間血液癌患者であり、前記試料は血液癌患者から分離した白血球（例、顆粒
白血球、リンパ球、および／または単核球（例、末梢血液単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
ｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）など）など）、骨髄細胞
（例、造血幹細胞など）、前記細胞を含む血液、骨髄、バフィーコート（ｂｕｆｆｙｃ
ｏａｔ）、およびこれらの溶解物などからなる群より選ばれた１種以上であり得る。本明
細書で提供される方法での選択または確認対象個体から得られた試料は、比較のための対
照試料（例えば、後述する比較のための基準値選定のための効果群試料または非効果群試
料）と区別するために「試験試料」と表す。

【0020】

本明細書で、用語の「外部から供給された（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）タンパク質（例えば
、第１タンパク質と相互作用するタンパク質）」は、試料内に存在する内在の（ｅｎｄｏ
ｇｅｎｏｕｓ）タンパク質でない外部から添加したタンパク質を意味する。一例で、前記
外部から供給されたタンパク質は通常の標識物質（例えば、蛍光物質など）で標識された
ものであり得るが、これに制限されるものではない。

【0021】

一例で、前記段階（ｉ）は試料内のＢＣＬ２ファミリータンパク質（第１タンパク質）
と外部から供給された（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ＢＣＬ２ファミリータンパク質（第１タン
パク質と相互作用するタンパク質）の間の相互作用を測定する段階（第１タンパク質－タ
ンパク質相互作用の測定段階）として、基板に固定された第１タンパク質（試料内のタン
パク質）に、外部から供給されて標識物質で標識された前記第１タンパク質と相互作用す
るタンパク質を接触させ、前記第１タンパク質（試料内のタンパク質）およびこれと相互
作用するタンパク質（外部投入タンパク質）の間のタンパク質－タンパク質相互作用を測
定（例えば、第１タンパク質および第１タンパク質と相互作用するタンパク質の間に形成
された複合体水準の測定）する段階を含み得る。

【0022】

一例で、前記段階（ｉｉ）は試料内（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）でのＢＣＬ２ファミリー
タンパク質の間の相互作用を測定する段階（第２タンパク質－タンパク質相互作用の測定
段階）として、前記第１タンパク質と結合する結合物質（例えば、第１タンパク質に対す
る抗体など）を含む基板に、第１タンパク質を含む試料を接触させ、前記第１タンパク質
（試料内のタンパク質）および第１タンパク質と相互作用するタンパク質（試料内のタン
パク質）の間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定（例えば、第１タンパク質および
第１タンパク質と相互作用するタンパク質の間に形成された複合体水準を測定）する段階
を含み得る。

【0023】

一例で、前記段階（ｉ）および／または（ｉｉ）において、第１タンパク質およびこれ
と相互作用するタンパク質の間に形成された複合体水準は、前記第１タンパク質と相互作
用するタンパク質（段階（ｉ））または前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質に
結合する結合物質（段階（ｉｉ））に標識された標識物質から発生した信号強度で測定で
きるが、これに制限されるものではない。

【0024】

一例で、前記段階（ｉｉｉ）は、第１タンパク質、第１タンパク質と相互作用するタン
パク質、またはこれらすべての試料内の水準（Ｔｏｔａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅ
ｖｅｌ）を測定する段階を含み得る。前記試料内の水準は試料内タンパク質の発現水準（
例えば、タンパク質濃度）、活性化されたタンパク質の発現水準（例えば、活性化された
タンパク質濃度）、リン酸化されたタンパク質の発現水準（例えば、リン酸化されたタン
パク質の濃度）、またはこれらのうち２以上の組み合わせであり得る。

【0025】

一具体例で、前記段階（ｉ）（第１タンパク質－タンパク質相互作用の測定段階）は、
次の中から選ばれた一つ以上（例、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
または１２個）を含み得る：
（ｉ－１）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＡＤタンパク質の
間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；
（ｉ－２）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＩＭタンパク質の
間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；
（ｉ－３）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＡＸタンパク質の
間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；
（ｉ－４）試料内のＢＣＬ２タンパク質および外部から供給されたＢＡＫタンパク質の
間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；
（ｉ－５）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＡＤタンパク質
の間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；
（ｉ－６）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＩＭタンパク質
の間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；
（ｉ－７）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＡＸタンパク質
の間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；
（ｉ－８）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および外部から供給されたＢＡＫタンパク質
の間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；
（ｉ－９）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＮＯＸＡタンパク質
の間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；
（ｉ－１０）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＢＩＭタンパク質
の間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；
（ｉ－１１）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＢＡＸタンパク質
の間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；および
（ｉ－１２）試料内のＭＣＬ１タンパク質および外部から供給されたＢＡＫタンパク質
の間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階。

【0026】

一具体例で、前記段階（ｉ）（第１タンパク質－タンパク質相互作用の測定段階）のそ
れぞれのタンパク質－タンパク質相互作用の測定段階は、
（１）第１タンパク質の結合物質が含まれた基板に前記試料を供給して第１タンパク質
を基板に固定させる段階；
（２－１）前記基板に、標識物質が付着した第１タンパク質相互作用タンパク質を外部
から供給して基板上の第１タンパク質と反応させる段階；および
（３）基板表面上の近接場領域内で前記標識物質が発生させる信号をＴＩＲＦ顕微鏡（
ｔｏｔａｌｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍ
ｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて測定する段階
により行われた前記段階を含み得る。

【0027】

第１タンパク質－タンパク質相互作用の測定段階において、前記外部から供給されたタ
ンパク質（第１タンパク質相互作用タンパク質）は標識物質で標識された（標識物質が付
着した）ものであり得る。第１タンパク質－タンパク質相互作用の測定段階において、前
記タンパク質－タンパク質相互作用の測定は、第１タンパク質（試料内のタンパク質）お
よびこれと相互作用するタンパク質（外部タンパク質）の間に形成された複合体水準を測
定して行われることができ、一例で、前記複合体水準は第１タンパク質相互作用タンパク
質に付着した標識物質で発生する信号によって測定される。

【0028】

一具体例で、前記段階（ｉｉ）（第２タンパク質－タンパク質相互作用の測定段階）は
、次の中から選ばれた一つ以上（例、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、また
は１１個）を含み得る：
（ｉｉ－１）試料内のＢＣＬ２タンパク質および試料内のＢＩＭタンパク質の間のタン
パク質－タンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階；
（ｉｉ－２）試料内のＢＣＬ２タンパク質および試料内のＢＡＸタンパク質の間のタン
パク質－タンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階；
（ｉｉ－３）試料内のＢＣＬ２タンパク質および試料内のＢＡＫタンパク質の間のタン
パク質－タンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階；
（ｉｉ－４）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＡＤタンパク質の間のタ
ンパク質－タンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階；
（ｉｉ－５）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＩＭタンパク質の間のタ
ンパク質－タンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階；
（ｉｉ－６）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＡＸタンパク質の間のタ
ンパク質－タンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階；
（ｉｉ－７）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質および試料内のＢＡＫタンパク質の間のタ
ンパク質－タンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階；
（ｉｉ－８）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＮＯＸＡタンパク質の間のタ
ンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階；
（ｉｉ－９）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＢＩＭタンパク質の間のタン
パク質－タンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階；
（ｉｉ－１０）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＢＡＸタンパク質の間のタ
ンパク質－タンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階；および
（ｉｉ－１１）試料内のＭＣＬ１タンパク質および試料内のＢＡＫタンパク質の間のタ
ンパク質－タンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階。

【0029】

一具体例で、前記段階（ｉｉ）（第２タンパク質－タンパク質相互作用の測定段階）の
それぞれのタンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階は、
（１）第１タンパク質の結合物質が含まれた基板に試料を供給（投入）して第１タンパ
ク質を基板に固定させる段階；
（２－２）標識物質が付着した第１タンパク質相互作用タンパク質の結合物質を前記基
板に供給し、第１タンパク質（試料内のタンパク質）と第１タンパク質相互作用タンパク
質（試料内のタンパク質）の間に形成された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）のうち第１タンパ
ク質相互作用タンパク質と反応させる段階；および
（３）基板表面上の近接場領域内で前記標識物質から発生する信号をＴＩＲＦ顕微鏡（
ｔｏｔａｌｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍ
ｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて測定する段階
により行われた前記段階を含み得る。

【0030】

他の例で、前記段階（ｉｉ）（第２タンパク質－タンパク質相互作用の測定段階）のそ
れぞれのタンパク質相互作用（例、形成された複合体水準）を測定する段階は、
（１）第１タンパク質相互作用タンパク質の結合物質が含まれた基板に試料を供給（投
入）して第１タンパク質相互作用タンパク質を基板に固定させる段階；
（２－２）標識物質が付着した第１タンパク質の結合物質を前記基板に供給し、第１タ
ンパク質（試料内のタンパク質）と第１タンパク質相互作用タンパク質（試料内のタンパ
ク質）の間に形成された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）のうち第１タンパク質と反応させる段
階；および
（３）基板表面上の近接場領域内で前記標識物質から発生する信号をＴＩＲＦ顕微鏡（
ｔｏｔａｌｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍ
ｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて測定する段階
により行われた前記段階を含み得る。

【0031】

第２タンパク質－タンパク質相互作用の測定段階において、前記複合体は試料内の第１
タンパク質と試料内の第１タンパク質相互作用タンパク質の間で内在的に形成されたもの
である。第２タンパク質－タンパク質相互作用の測定段階において、前記タンパク質－タ
ンパク質相互作用の測定は第１タンパク質（試料内のタンパク質）およびこれと相互作用
するタンパク質（試料内のタンパク質）の間に形成された複合体水準を測定して行われ得
、一例で、前記複合体水準は前記第１タンパク質相互作用タンパク質の結合物質または前
記第１タンパク質の結合物質に付着した標識物質で発生する信号によって測定され得る。

【0032】

一具体例で、前記段階（ｉｉｉ）は、次の中から選ばれた一つ以上を含み得る：
（ｉｉｉ－１）試料内のＢＣＬ２タンパク質の水準を測定する段階；
（ｉｉｉ－２）試料内のＢＣＬｘｌタンパク質の水準を測定する段階；
（ｉｉｉ－３）試料内のＭＣＬ１タンパク質の水準を測定する段階；
（ｉｉｉ－４）試料内のＢＡＸタンパク質の水準を測定する段階；および
（ｉｉｉ－５）試料内のＢＡＫタンパク質の水準を測定する段階。

【0033】

前記段階（ｉｉｉ）のそれぞれの水準の測定段階は、
－第１タンパク質の結合物質（第１タンパク質の基板固定のための捕獲物質）、第１タ
ンパク質相互作用タンパク質の結合物質（第１タンパク質相互作用タンパク質の固定のた
めの捕獲物質）、またはこれらすべてが含まれた基板に試料を供給し、前記第１タンパク
質、第１タンパク質相互作用タンパク質、またはこれらすべてを基板に固定化させる段階
；
－標識物質が付着した第１タンパク質の結合物質（基板に第１タンパク質が固定化され
た場合、第１タンパク質検出のための検出物質）、標識物質が付着した第１タンパク質相
互作用タンパク質の結合物質（基板に第１タンパク質相互作用タンパク質が固定化された
場合、第１タンパク質相互作用タンパク質検出のための検出物質）、またはこれらすべて
（基板に第１タンパク質および第１タンパク質相互作用タンパク質が固定化された場合）
を前記基板に供給して反応させる段階；および

【0034】

－基板表面上の近接場領域内で前記マーカーが発現する信号をＴＩＲＦ顕微鏡（ｔｏｔ
ａｌｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒ
ｏｓｃｏｐｅ）を用いて測定する段階
により行われたり前記段階を含み得る。

【0035】

前記捕獲物質と検出物質は同じ標的タンパク質に結合する互いに異なるタンパク質とし
て、前記標的タンパク質上の結合する部位が互いに完全に重複しないすべての結合物質（
例えば、抗体）のうちそれぞれ独立して選択される。

【0036】

前記段階（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）で使用された第１タンパク質の結合物質ま
たは第１タンパク質相互作用タンパク質の結合物質は、第１タンパク質または第１タンパ
ク質相互作用タンパク質に結合する物質（例えば、抗体、抗原結合断片、抗体類似体、ア
プタマー、小分子化合物など）であり得、標識物質で標識されたものであり得る。このと
き、前記第１タンパク質相互作用タンパク質の結合物質は第１タンパク質相互作用タンパ
ク質が第１タンパク質と相互作用（結合）する部位と相違する部位で第１タンパク質相互
作用タンパク質に結合する物質であり得る。

【0037】

一例で、段階（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）で第１タンパク質を基板に固定（ｐｕ
ｌｌｄｏｗｎ）するための第１タンパク質の結合物質、段階（ｉｉ）で第１タンパク質
と第１タンパク質相互作用タンパク質の間に形成された複合体の検出（ｄｅｔｅｃｔｉｎ
ｇ）のための第１タンパク質相互作用タンパク質の結合物質、および／または段階（ｉｉ
ｉ）で第１タンパク質または第１タンパク質相互作用タンパク質の検出（ｄｅｔｅｃｔｉ
ｎｇ）のための第１タンパク質の結合物質または第１タンパク質相互作用タンパク質の結
合物質は各結合対象タンパク質に対して通常使用可能なすべての抗体より格別な制限なし
に選ばれた１種以上のものであり得る。前記段階（ｉ）～（ｉｉｉ）のうち２以上が行わ
れて同じ第１タンパク質および／または第１タンパク質相互作用タンパク質が２以上の段
階で共通して使用される場合、同じタンパク質の固定（ｐｕｌｌｄｏｗｎ）および／ま
たは検出（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）のために各段階で使用される結合物質は互いに同一また
は相違してもよい。本明細書に記載された第１タンパク質および第１タンパク質と相互作
用するタンパク質の結合物質は次のように例示することができる：

【0038】

アポトーシス抑制（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質
ＢＣＬ２：ａｂ３２１２４、ａｂ１８２８５８、ａｂ２３８０４１、ａｂ６９２（以上
、Ａｂｃａｍ）、３４９８Ｓ、１５０７１Ｓ、＃４２２３（以上、ＣＳＴ）、ＢＳＭ－５
２３０４Ｒ、ＢＳＭ－１０８４６Ｍ、ＢＳＭ－３３４１１Ｍ、ＢＳＭ－５２０２２Ｍ（以
上、Ｂｉｏｓｓ）、ＮＢ１００－５６０９８（Ｎｏｖｕｓ）、１２７８９－１－ＡＰ（Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、ＬＳ－Ｃ１５９１７０－４００（ＬＳＢｉｏ）、１３－８８０
０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、６１０５３８（ＢＤ）、ｓ
ｃ－５０９、ｓｃ－２３９６０、ｓｃ－７３８２（以上、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＴＡ
８０６５９１、ＣＦ８０６５８９、ＵＭ８００１１７、ＣＦ８０６６３９（以上、Ｏｒｉ
Ｇｅｎｅ）など；
ＢＣＬ－ＸＬ：２７６４Ｓ、２７６２Ｓ、２８７０、３４９８Ｓ（以上、ＣＳＴ）、ａ
ｂ７７５７１、ａｂ５９３４８、ａｂ３２３７０、ａｂ１７８８４４（以上、Ａｂｃａｍ
）、ＭＡ５－１１９５０、ＭＡ５－２８６３７（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＭＡ５
－１５１４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢＳＭ－５１２
２９Ｍ（Ｂｉｏｓｓ）、ｓｃ－５６０２１、ｓｃ－１３６２０７、ｓｃ－２７１１２１、
ｓｃ－７０４１７、ｓｃ－２３９５８（以上、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＡＬＸ－８０４
－６６０－Ｃ１００（Ｅｎｚｏ）、６６０２０－１－ＩＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、
ＮＢＰ２－２５２４０、ＮＢＰ２－３２８１０、ＮＢＰ２－４４４１６、ＮＢＰ１－４７
６６５（以上、Ｎｏｖｕｓ）、ＴＡ５０６１８８（ＯｒｉＧｅｎｅ）、Ｈ０００００５９
８－Ｍ０１Ａ（Ａｂｎｏｖａ）など；
ＭＣＬ１：ａｂ３２０８７（Ａｂｃａｍ）、５４５３Ｓ、３９２２４Ｓ、＃９４２９６
（以上、ＣＳＴ）、ＭＡ５－３２０６０、１４－６７０１－８２、１４－９０４７－８２
、ＭＡ５－１５２３６、１４－６７０１－８２、１４－９０４７－８２（以上、Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）、ＳＰ２１７０Ｐ、ＴＡ５００９８６、ＴＡ５００９９０（以上、Ｏｒｉ
Ｇｅｎｅ）、１６２２５－１－ＡＰ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、ＬＳ－Ｃ４７５－０．
１（ＬＳＢｉｏ）、ＭＡＢ８８２５（Ａｂｎｏｖａ）、ｓｃ－１２７５６、ｓｃ－７４４
３７、ｓｃ－７４４３６、ｓｃ－３７７４８７、ｓｃ－６９８３９、ｓｃ－６９８４０、
ｓｃ－５３９５１（以上、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）など；
ＢＣＬｗ：ＭＡ５－１５０７６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、＃２７２４（ＣＳＴ）、ｓ
ｃ－２９３２３６、ｓｃ－１３０７０１（以上、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＮＢＰ２－６
１７０６（Ｎｏｖｕｓ）など；
ＢＦＬ１：ＮＢＰ２－６７５６３、ＮＢＰ２－４６５６８ＣＳＴ（以上、Ｎｏｖｕｓ）
、＃１４０９３（ＣＳＴ）、ＭＡ５－１１７５７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｓｃ－１６
６９４３（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）など；

【0039】

アポトーシス誘導（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質
ＢＡＸ：ａｂ３２５０３、ａｂ１８２７３３、ａｂ８１０８３（以上、Ａｂｃａｍ）、
＃５０２３、２７７４Ｓ、２７７２Ｓ（以上、ＣＳＴ）、ＭＡ５－１４００３、ＭＡ５－
１６３２２、３５－９７００（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢＳＭ－５２３１６Ｒ、
ＢＳＭ－３３２７９Ｍ（以上、Ｂｉｏｓｓ）、５０５９９－２－Ｉｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔ
ｅｃｈ）、ＳＡＢ４５０２５４６（Ｍｅｒｃｋ）、ＮＢ１００－５６０９６（Ｎｏｖｕｓ
）、６１０９８２、６１０９８３（以上、ＢＤ）、ｓｃ－７４８０、ｓｃ－２３９５９、
ｓｃ－７０４０８（以上、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＣＦ８１０３３５、ＴＡ８１０３３
４（以上、ＯｒｉＧｅｎｅ）、＃６３３６０２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＬＳ－Ｃ３５７
７１９－２０（ＬＳＢｉｏ）など；
ＢＡＫ：ａｂ２３８５１５、ａｂ３２３７１、ａｂ６９４０４、ａｂ１３７６４６（以
上、Ａｂｃａｍ）、６９４７Ｓ、１２１０５Ｓ（以上、ＣＳＴ）、Ｂ５８９７（Ｍｅｒｃ
ｋ）、０６－５３６、ＡＭ０３－１００ＵＧＣＮ、ＳＡＢ１３０５６５６（以上Ｓｉｇｍ
ａ）、Ｈ０００００５７８－Ｍ０１Ａ、ＭＡＢ８７５３（Ａｂｎｏｖａ）、ｓｃ－５１７
３９０、ｓｃ－５１８１１０（以上、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＭＡ５－３６２２５（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧＴＸ１０８０８（ＧｅｎｅＴｅｘ）など；
ＢＡＤ：９２９６Ｓ（ＣＳＴ）、ｓｃ－８０４４（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＭＡ５－
１１１１７、ＭＡ５－１５２３０（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など；
ＮＯＸＡ：ａｂ６８５２３（Ａｂｃａｍ）、ｓｃ－５１５８４０、ｓｃ－５６１６９、
ｓｃ－３９８８７３（以上、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、など；
ＢＩＭ：ＭＡ５－１５７６３、ＭＡ５－１５７６４（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
ｓｃ－３７４３５８（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＣＦ８１２４４１（ＯｒｉＧｅｎｅ）な
ど。

【0040】

前記列挙した抗体は例示のためのものであり、本発明はこれら抗体を使用することに制
限されるものではない。特定のタンパク質に対する結合活性が知られている抗体であれば
すべて使用可能であり、等しい効果を期待することができる。

【0041】

本明細書で、試料内のタンパク質－タンパク質相互作用の測定（段階（ｉｉ））で第１
タンパク質相互作用タンパク質または第１タンパク質の検出（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）のた
めに使用される第１タンパク質相互作用タンパク質または第１タンパク質の結合物質は、
標識物質で標識されたものであり得、前記結合物質が抗体である場合に、抗体に標識物質
が付着したり、前記抗体に結合する二次抗体に標識物質が付着することができる。

【0042】

本明細書で提供される方法は、前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質の間の相互作用を測
定する段階（ａ１）および／または試料内のＢＣＬ２ファミリータンパク質の水準を測定
する段階（ａ２）に加えて、
（ｂ）前記段階（ａ１）で測定されたＢＣＬ２ファミリータンパク質の間の相互作用お
よび／または段階（ａ２）で測定された試料内のＢＣＬ２ファミリータンパク質水準を基
準値と比較する段階（ｂ１）、および／または前記試料または前記試料が分離された個体
が前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対して反応性を有する患者であることお
よび／または前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物が前記試料または前記試料が分
離された個体で効果を発揮できるものであることを確認（または決定、判断）する段階、
および／または、前記個体を、ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物を適用するのに適
した対象として選択（または確認、決定、判断）する段階（ｂ２）をさらに含み得る。

【0043】

本明細書で提供される方法は、前記段階（ｂ）（具体的には、ｂ２）以後に、前記段階
（ｂ）（具体的には、ｂ２）でＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対して反応性を
有するか前記薬物が効能を示すと確認された個体、または前記薬物を適用するのに適した
ものとして選ばれた個体に、前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物を投与する段階
をさらに含み得る。

【0044】

前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性または前記薬物の効能は、
前記薬物の標的タンパク質（例えば、ＢＣＬ２タンパク質）を標的（例えば、阻害）する
ことで得られる病理学的効果を意味し、例えば、抗癌効果（癌（または癌細胞）の軽減、
減少、緩和、除去、治療、および／または進行および／または転移の抑制または遅延など
）、より具体的には、血液癌に対する抗癌効果であり得る。

【0045】

前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物の投与または前記薬物を用いる治療に適し
た個体は、前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物が疾病の治療効果を示し得る患者
を意味し、例えば、前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物の投与または前記ＢＣＬ
２ファミリータンパク質標的薬物を用いる治療によって抗癌効果（癌または癌細胞の軽減
、減少、緩和、除去、治療など）が発揮できる患者であり得る。

【0046】

前記段階（ｂ）（具体的には、ｂ１）で、基準値は、本明細書で提供される方法を用い
て既存の癌患者（例えば、血液癌患者）から得た情報に基づいて設定することができる。
一例として、前記基準値は、１）ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物治療が効果を発
揮した（ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対して反応性がある）患者もしくは患
者群、または前記患者もしくは患者群から分離した試料（効果群試料）に対して本明細書
で提供される方法（前記段階（ａ１）および／または（ａ２））を行って得られた測定値
、または２）ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物治療が効果を発揮できない（ＢＣＬ
２ファミリータンパク質標的薬物に対して反応性がない）患者もしくは患者群、または前
記患者もしくは患者群から分離した試料（非効果群試料）に対して本明細書で提供される
方法（前記段階（ａ１）および／または（ａ２））を行って得られた測定値であり得る。

【0047】

一例で、前記基準値が効果群試料から得られたものであるとき、試験試料内のＢＣＬ２
ファミリータンパク質の間の相互作用を測定する段階（ａ１）および／または試料内のＢ
ＣＬ２ファミリータンパク質の水準を測定する段階（ａ２）で得られた測定値が前記基準
値以上の場合（基準値と類似の範囲（例えば、同一または１０％以内、５％以内、４％以
内、３％以内、２％以内、または１％以内の誤差範囲）または前記基準値を超える場合）
、前記試料または前記試料が得られた個体を、前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬
物に対して反応性を有する患者（またはＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物治療（投
与）を適用するのに適した患者）として選択するか、前記試料または個体に前記ＢＣＬ２
ファミリータンパク質標的薬物が効果を発揮するものと確認（または決定、判断）するこ
とができる（段階ｂ２）。

【0048】

他の例で、前記基準値が非効果群試料から得られたものであるとき、試験試料内のＢＣ
Ｌ２ファミリータンパク質の間の相互作用を測定する段階（ａ１）および／または試料内
のＢＣＬ２ファミリータンパク質の水準を測定する段階（ａ２）で得られた測定値が、前
記基準値と類似の範囲（例えば、同一または１０％以内、５％以内、４％以内、３％以内
、２％以内、または１％以内の誤差範囲）または前記基準値未満の場合、前記試料または
前記試料が得られた個体を、前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に対して反応性
がない患者（またはＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物治療（投与）が効果を示さな
い患者）として選択するか、前記試料または個体に前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標
的薬物が効果を発揮しないものと確認（または決定、判断）することができる（段階ｂ２
）。

【0049】

また他の一例として、前記基準値は、効果群に対して試料内のＢＣＬ２ファミリータン
パク質の間の相互作用を測定する段階（ａ１）および／または試料内のＢＣＬ２ファミリ
ータンパク質の水準を測定する段階（ａ２）で得られた測定値の最小値、または中間値ま
たは平均値と設定することができる。患者情報が追加されることにより基準値は調整され
得、様々な分析値から導き出された数式またはアルゴリズムにより基準値が調整されるこ
ともできる。本明細書で提供される方法の段階（ｂ）で、段階（ａ１）および／または段
階（ａ２）の測定値が当該基準値より高い（類似の範囲および／または超過）場合、試験
試料または前記試料が得られた個体を、ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物治療に効
果（反応性）がある患者またはＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物治療（投与）に適
した患者として選定することができる。

【0050】

また他の例として、前記基準値は、非効果群に対して試料内のＢＣＬ２ファミリータン
パク質の間の相互作用を測定する段階（ａ１）および／または試料内のＢＣＬ２ファミリ
ータンパク質の水準を測定する段階（ａ２）で得られた測定値の最大値、または中間値ま
たは平均値と設定することができる。患者情報が追加されることにより基準値は調整され
得、様々な分析値から導き出された数式またはアルゴリズムにより基準値が調整されるこ
ともできる。本明細書で提供される方法の段階（ｂ）で、段階（ａ１）および／または段
階（ａ２）の測定値が当該基準値より低い（類似の範囲および／または未満）場合、試験
試料または前記試料が得られた個体を、ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物治療に効
果がない患者として選定することができる。

【0051】

他の例で、試料内の前記基準値は、比較タンパク質および前記比較タンパク質と相互作
用するタンパク質の間の相互作用および／または試料内の比較タンパク質および／または
前記比較タンパク質と相互作用するタンパク質の水準（発現量または濃度）であり得る。
前記比較タンパク質および比較タンパク質と相互作用するタンパク質はアポトーシス抑制
（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）とアポトーシス誘導タンパク質より選ばれる。前記比
較タンパク質および比較タンパク質と相互作用するタンパク質は先立って説明した第１タ
ンパク質および第１タンパク質と相互作用するタンパク質とそれぞれ同一であるか相違す
るものであり得る。一例で、前記比較タンパク質は第１タンパク質と相違するものであり
得、前記比較タンパク質と相互作用するタンパク質は第１タンパク質相互作用タンパク質
と同一であるか相違するものであり得る。

【0052】

この場合、本明細書で提供される方法は、前記段階（ｂ）以前に、次の段階（ａ１’）
および／または（ａ２’）をさらに含み得る：
（ａ１’）試料内の比較タンパク質および前記比較タンパク質と相互作用するタンパク
質の間の相互作用を測定する段階および／または（ａ２’）試料内の比較タンパク質およ
び／または比較タンパク質相互作用タンパク質の水準を測定する段階。

【0053】

他の例は、ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物を次の個体に投与する段階を含む、
癌（例、血液癌）治療方法、およびＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物を含む、次の
個体に適用（投与）するための癌（例、血液癌）治療用薬学組成物または次の個体の癌（
例、血液癌）を治療するための癌治療用薬学組成物を提供する：
個体から得られた（分離した）試料内のＢＣＬ２ファミリータンパク質の間の相互作用
（例えば、段階（ａ１）の（ｉ）および／または（ｉｉ）によって測定される）および／
または試料内のＢＣＬ２ファミリータンパク質水準（例えば、段階（ａ２）で測定される
）が、前記基準値（例えば、効果群から得られた基準値）と類似の範囲または前記基準値
を超える個体（例えば、本明細書で提供されるＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物に
対する反応性予測および／または前記薬物の効能予測方法によって前記ＢＣＬ２ファミリ
ータンパク質標的薬物に対して反応性を有するか前記薬物が効能を発揮するものと確認さ
れた個体、および／または前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物の投与またはそれ
を用いた治療に適した対象の選択方法によって前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬
物の投与またはＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物を用いる治療に適した対象に選ば
れた個体）。

【0054】

前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質は、ＢＣＬ－２相同性（ＢＣＬ－２ｈｏｍｏｌｏ
ｇｙ；ＢＨ；ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３）ドメインを共有するタンパク質を総称し、アポト
ーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；例えばミトコンドリアでのアポトーシス）を調節する。

【0055】

本明細書で使用されるものとして、第１タンパク質は、ＢＣＬ２ファミリータンパク質
のうちアポトーシスを防ぐアポトーシス抑制（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク
質として、アポトーシスタンパク質および／またはアポトーシス誘導タンパク質と相互作
用（結合）してアポトーシスタンパク質および／またはアポトーシス誘導タンパク質の機
能を阻害する機能を有するものであり得る。前記第１タンパク質は、個体から分離した生
物学的試料に含まれているか前記試料から分離した形態であり得る。一例で、前記第１タ
ンパク質は人間などの哺乳動物由来のタンパク質であり得、例えば、ＢＣＬ２（例、ＮＣ
ＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿０００６３３．２など）、ＢＣＬｘＬ（例、ＮＣＢＩｒ
ｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿１３８５７８．１など）、ＭＣＬ１（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅ
ｑ．ＮＭ＿０２１９６０．３など）、ＢＣＬｗ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿
００１１９９８３９．２など）、ＢＦＬ１（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿００
１１１４７３５．２など）などからなる群より選ばれた１種以上であり得る。

【0056】

前記第１タンパク質と相互作用するタンパク質は、ＢＨ３サブタイプ（ＢＨ３－ｏｎｌ
ｙ）タンパク質（第２タンパク質）；およびアポトーシスエフェクター（ｐｒｏ－ａｐｏ
ｐｔｏｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｒ）タンパク質（第３タンパク質）；からなる群より選ば
れた１種以上であり得る。

【0057】

本明細書で使用されるものとして、前記第２タンパク質（ＢＨ３サブタイプタンパク質
）は、ＢＨ３ドメインのみで構成されてＢＨ３－ｏｎｌｙタンパク質ともいう。例えば、
前記第２タンパク質はＢＩＭ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．Ｂ０３３６９４）、ＢＩ
Ｄ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿００１１９６．２）またはｔＢＩＤ（例、Ｎ
ＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿００１１９６．２のＮ－ｔｅｒｍｉｎａｌｔｒｕｎｃ
ａｔｅｄｆｏｒｍなど）、ＢＡＤ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿００４３２
２．２など）、ＮＯＸＡ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿００１３８２６１６．
１など）、ＰＵＭＡ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＡＡＯ１６８６２．１など）、Ｂ
ＭＦ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿００１００３９４０．２など）、ＢＩＫ（
例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．１．ＮＭ＿００１１９７．５）、ＨＲＫ（例、ＮＣＢＩ
ｒｅｆｓｅｑ．１．ＮＭ＿００３８０６．４など）などからなる群より選ばれた１種
以上であり得る。

【0058】

本明細書で使用されるものとして、第３タンパク質は、いくつかのＢＨドメインを含む
アポトーシス誘導（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質として、例えばＢＡＸ（例
、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿１３８７６１．３など）、ＢＡＫ（例、ＮＣＢＩ
ｒｅｆｓｅｑ．ＮＰ＿００１１７９．１など）、ＢＯＫ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅ
ｑ．ＮＭ＿０３２５１５．５など）などからなる群より選ばれた１種以上であり得る。

【0059】

他の例で、前記第１タンパク質は先立って説明したようなＢＨ３サブタイプ（ＢＨ３－
ｏｎｌｙ）タンパク質（第２タンパク質）；およびアポトーシスエフェクター（ｐｒｏ－
ａｐｏｐｔｏｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｒ）タンパク質（第３タンパク質）からなる群より
選ばれた１種以上であり、第１タンパク質と相互作用するタンパク質は先立って説明した
ようなアポトーシス抑制（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質より選ばれたもの
であり得る。

【0060】

本明細書で、外部から供給される第１タンパク質相互作用タンパク質は、野生型、また
は第１タンパク質との相互作用が可能であることを前提に、野生型と５０％以上、６０％
以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９
４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列
相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙｏｒｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有する変異型タンパク質であり
得る。また、前記第１タンパク質相互作用タンパク質は人間由来のものであるが、人間由
来の第１タンパク質と相互作用可能な異種由来のものであり得る。

【0061】

前記個体は人間などの哺乳動物であり得、例えば、癌患者（血液癌、固形癌）、より具
体的には血液癌患者であり得る。また、基準値設定のために、前記個体は、ＢＣＬ２ファ
ミリータンパク質標的薬物の投与または前記薬物の効能確認が必要な個体であり得る。

【0062】

本明細書で、血液癌は白血病（例、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨
髄性白血病、慢性リンパ球性白血病など）、リンパ腫（例、悪性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ
腫、小リンパ球性リンパ腫（ｓｍａｌｌｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｌｙｍｐｈｏｍａ；
ＳＬＬ）など）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などからなる群より選ばれる。

【0063】

前記試料は前記患者から分離した（由来した）生物学的試料として、細胞、細胞溶解物
、組織、またはこれらの培養物、または確立された細胞株を含むものであり得、例えば、
前記細胞または組織は癌細胞または癌組織であり得、具体的には前記癌は血液癌または固
形癌（例えば、乳癌または肺癌（例：肺腺癌など）など）であり得る。一具体例で、前記
個体は人間血液癌患者であり、前記試料は血液癌または固形癌（例えば、乳癌または肺癌
（例：肺腺癌など）患者から分離した白血球（例、顆粒白血球、リンパ球、および／また
は単核球など）、骨髄細胞（例、造血幹細胞など）、前記細胞を含む血液、骨髄、バフィ
ーコート（ｂｕｆｆｙｃｏａｔ）、癌細胞、癌組織、またはこれらの溶解物などからな
る群より選ばれた１種以上であり得る。

【0064】

一例で、前記試料は血液癌または固形癌（例えば、乳癌または肺癌（例：肺腺癌など）
患者から分離した白血球（例、顆粒白血球、リンパ球、および／または単核球など）、骨
髄細胞（例、造血幹細胞など）、前記細胞を含む血液、骨髄、バフィーコート（ｂｕｆｆ
ｙｃｏａｔ）、癌細胞、癌組織などからなる群より選ばれた一つ以上の溶解物であり得
る。前記溶解物はＨｅｐｅｓ、ＮａＣｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、コレステロール系洗浄剤（
ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ；以下、界面活性剤とも記載する）、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌなどからなる群より選ばれた１種以上を含む溶剤を使
用して得られたものであり得、このとき、コレステロール系洗浄剤（例えば、ｇｌｙｃｏ
ｌ－ｄｉｏｓｇｅｎｉｎ（ＧＤＮ）、ジギトニン（ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）など）、ＰＥＧ
系洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎｘ－１００など）などが利用され得る。本明細書で使
用可能な洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）はＧＤＮ、ジギトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）、
Ｔｒｉｔｏｎｘ－１００（ＴＸ－１００）、またはこれらのうち２以上の組み合わせな
どを含み得る。例えば、ＧＤＮは、全体溶剤基準として、０．００１～１０％、０．００
５～５％、０．００８～１．２％、０．０１～１０％、０．０５～５％、０．０８～１．
２％、０．１～１０％、０．５～５％、０．８～１．２％、または約１％（ｗｅｉｇｈｔ
ｆｏｒｗｅｉｇｈｔ）の量で使用される。前記溶解物は、前記洗浄剤を用いて適切な
濃度で希釈して使用される。前記のようなコレステロール系洗浄剤および／またはＰＥＧ
系洗浄剤を使用する場合、他の系の洗浄剤を使用した場合と比較して、細胞外（ｉｎｖ
ｉｔｒｏ）での細胞の機能、活性、および／またはタンパク質３次構造を細胞内と同様に
安定的に維持できるため、実際の細胞内の環境でのタンパク質の構造および／または機能
を比較的正確に模写することができ、細胞内でのタンパク質固有の特性を細胞外で正確に
観測できるという利点を有することができる。

【0065】

前記段階（ｉ）で外部から供給される、（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）標識物質が付着した、
第１タンパク質と相互作用するタンパク質は、細胞溶解液形態で使用される。前記細胞溶
解液は、標識物質が付着した、第１タンパク質と相互作用するタンパク質を組換え的に発
現する細胞を、適切な溶剤、例えばＴＸ－１００またはコレステロール系洗浄剤を含む溶
剤を使用して溶解させて得られたものであり得る。例えば、ＴＸ－１００は、全体溶剤基
準として、０．００１％～１％または０．２～５％（ｗｅｉｇｈｔｆｏｒｗｅｉｇｈ
ｔ）を含み得、好ましくは０．５～２％、さらに好ましくは０．８～１．２％、さらに好
ましくは１％を含み得る。前記製造された細胞溶解液は希釈後基板に供給されるが、この
とき細胞溶解液はＴＸ－１００を０．０２～０．０４％を含むように設定することが好ま
しい。前記ＴＸ－１００濃度の臨界値を超えると、ＰＥＧでコートされている基板で起き
る非特異的な結合信号を減らすことができるが、第１タンパク質との特異的な相互作用に
より観測される、第１タンパク質と相互作用するタンパク質の測定値（信号値）が低く形
成されてタンパク質分析に容易でない。前記臨界値未満であれば、溶媒中のＴＸ－１００
の臨界ミセル濃度（ＣｒｉｔｉｃａｌＭｉｃｅｌｌＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｃ
ＭＣ）未満の状態で存在するので第１タンパク質相互作用タンパク質の溶解状態が不安定
になり、ＰＥＧでコートされている基板で起きる第１タンパク質相互作用タンパク質の非
特異的な結合信号が増加して有効でない信号が測定されてタンパク質の分析において容易
でない。これはコレステロール系洗浄剤を使用することにおいても当該洗浄剤の臨界ミセ
ル濃度以上を使用することは同様に好ましい。

【0066】

前記第１タンパク質相互作用タンパク質を含む細胞溶解液内の、第１タンパク質相互作
用タンパク質の濃度は、１０^－２～１０^３ｎＭまたは１０^－１～１０^２ｎＭであり得るが
、これに制限されるものではなく、適宜調節することができる。

【0067】

本明細書で、前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物は、上記したＢＣＬ２ファミ
リータンパク質（例えば、アポトーシス抑制（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク
質）を認識および／または阻害するタンパク質（例えば、抗体、またはその類似体など）
、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡなど）、および小分子化合物からなる群より選ばれた１
種以上であり得、アポトーシス調節薬物（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ
Ｄｒｕｇ）であり得、一具体例で抗癌効果、例えば血液癌に対して抗癌効果を有するこ
ともできる。例えば、ＢＣＬ２標的薬物（例、ＢＣＬ２阻害剤）の例として抗ＢＣＬ２抗
体、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＢＴ７３７などが挙げられ、ＢＣＬｘＬ標的薬物（例、Ｂ
ＣＬｘＬ阻害剤）の例として抗ＢＣＬｘＬ抗体、ＡＢＴ２６３などが挙げられ、ＭＣＬ－
１標的薬物（例、ＭＣＬ－１阻害剤）の例として抗ＭＣＬ－１抗体、ＡＭＧ－１７６、Ａ
ＺＤ５９９１、Ｍａｒｉｔｏｃｌａｘなどが挙げられる。

【0068】

前記ベネトクラクス（Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（登録商標）またはＶｅｎｃｌｙｘｔｏ（
登録商標））は急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ；Ａ
ＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅ
ｍｉａ；ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ｓｍａｌｌｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｌｙ
ｍｐｈｏｍａ；ＳＬＬ）などの治療に使用される。

【0069】

以下、より詳細に説明する。

【0070】

一例で、ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物の代表的な例としてベネトクラクス（
Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）を挙げて説明する：
先立って説明した通り、本明細書において、遺伝子的特徴としては観測できないＢＣＬ
２ファミリータンパク質のアポトーシス抑制能力を、単分子タンパク質相互作用の測定方
法により定量的に把握し、これを血液癌患者の診断方法として活用することを提案する。
これのために核心的な技術は次のとおりである：（１）タンパク質相互作用の観測が、細
胞内に存在するＢＣＬ２ファミリータンパク質の多様な状態を反映、（２）多角的タンパ
ク質相互作用の観測およびタンパク質水準の観測の定量的な比較により、ＢＣＬ２ファミ
リータンパク質標的薬物（一例としてベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）、ＡＭＧ
１７６、またはＡＺＤ５９９１など）に敏感な細胞株および患者を選別可能。

【0071】

（１）細胞内の状態を保持してＢＣＬ２ファミリータンパク質を基板に捕獲
本明細書では、細胞内に存在するＢＣＬ２ファミリータンパク質の状態が保持された状
態で基板に捕獲されるかどうかを確認した。

【0072】

一実施例で、代表的な血液癌細胞株であるＨＬ６０（急性骨髄性白血病）またはＯＣＩ
－ＬＹ３（Ｂ細胞リンパ腫）細胞株を、細胞死誘導のためにベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔ
ｏｃｌａｘ）で細胞培養中で処理する。その後、細胞死タンパク質であるＢＡＸタンパク
質の活性化された形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を示すＮ－末端があらわれた（露出
した）ＢＡＸを測定する実験を行う。このとき、ベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ
）で処理することによりＮ－末端があらわれたＢＡＸの量が増加することを見ることがで
きる。反面、細胞溶解液にＴＸ－１００の処理により人為的にＢＡＸタンパク質のＮ－末
端が露出するようにした後同じ検査を行う場合、ＢＡＸの類似量が維持されることを確認
することができる。これは、ＢＡＸの発現量は変わらないが、ベネトクラクス処理時にＮ
－末端があらわれた活性化された形態のＢＡＸタンパク質比率が増加することを意味する
（図１７参照）。

【0073】

このような結果により、本明細書に提案する方法は、ＢＣＬ２ファミリータンパク質が
細胞内でなしている形態／ＰＴＭ（Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎｓ）などをそのまま反映できることを立証する。

【0074】

（２）細胞内のＢＣＬ２ファミリータンパク質の状態変化が反映されるタンパク質間の相
互作用（ＰＰＩ，Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＰｒｏｔｅｉｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の確認
本明細書で、細胞内に存在するＢＣＬ２ファミリータンパク質の状態変化がタンパク質
相互作用（ＰＰＩ）の測定に反映されることを確認した。

【0075】

一実施例で、ＯＣＩ－ＬＹ３細胞株やＨＬ６０細胞株を、それぞれＢＣＬ２阻害剤であ
るベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）、ＭＣＬ１阻害剤であるＡＺＤ５９９１で処
理した後、ＢＣＬ２ファミリータンパク質のタンパク質の間の相互作用（ＰＰＩ）変化を
比較した。当該阻害剤は、ＢＣＬ２、ＭＣＬ１タンパク質と異なるタンパク質の間の相互
作用を選択的に阻害するため、当該薬物処理による細胞内のＢＣＬ２ファミリータンパク
質の状態変化（例えば複合体の形成程度）を期待することができる。実際、ＯＣＩ－ＬＹ
３細胞株を培養中にベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）（ＢＣＬ２阻害剤）とＡＺ
Ｄ５９９１（ＭＣＬ－１阻害剤）でそれぞれ２４時間処理した後、取得した細胞溶解液と
何ら処理をしていない状態の細胞溶解液（無処理群）をそれぞれ準備した後、当該細胞溶
解液で抽出されたＢＣＬ２、ＭＣＬ１タンパク質とＢＡＤ、ＮＯＸＡ（マーカーＧＦＰが
付着した）タンパク質の間の相互作用を測定したとき、ベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃ
ｌａｘ）で処理された細胞溶解液で測定されたＢＣＬ２－ＢＡＤの間の相互作用（ＰＰＩ
）が、無処理群で測定されたＢＣＬ２－ＢＡＤの間の相互作用（ＰＰＩ）より高いことが
確認された。また、ＡＺＤ５９９１で処理された細胞溶解液から出たＭＣＬ１タンパク質
とＮＯＸＡ（マーカー付着）タンパク質の相互作用が、無処理群で測定されたＭＣＬ１タ
ンパク質とＮＯＸＡ（マーカー付着）タンパク質の相互作用より高いことが確認された。
反面、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ処理はＭＣＬ１－ＮＯＸＡ相互作用（ＰＰＩ）に何ら影響を
及ぼさず、ＡＺＤ５９９１処理はＢＣＬ２－ＢＡＤ相互作用（ＰＰＩ）に何ら影響を及ぼ
さなかった。また、本実験で使用された条件下では各薬物での処理がＢＣＬ２、ＭＣＬ１
発現量に顕著な変化を起こさないことが証明された。

【0076】

すなわち、特定薬物に反応する特定タンパク質の状態変化を確認および／または前記特
定タンパク質以外の他のタンパク質は状態変化が起きないことを確認することによって、
本明細書で提供される方法が薬物処理による正確な状態変化を測定できることを確認した
。

【0077】

従来の多くの研究では、ＢＣＬ２タンパク質の発現量を測定して、細胞内でＢＣＬ２が
アポトーシス作用を抑制する程度を計ったが、本明細書ではタンパク質の分子的形質が反
映されたＰＰＩ観測によりアポトーシス作用を抑制する程度を定量的に測定できることが
特徴である。

【0078】

（３）多角的タンパク質相互作用の観測およびタンパク質水準の観測によるＢＣＬ２ファ
ミリータンパク質標的薬物の敏感度予測
本明細書では、細胞や患者検体のアポトーシス誘導タンパク質とアポトーシス抑制タン
パク質が細胞死に及ぼす影響を、試料内タンパク質と外来タンパク質の間の相互作用の測
定（第１タンパク質－タンパク質相互作用の測定）、試料内タンパク質間の相互作用の測
定（第２タンパク質－タンパク質相互作用の測定）、および／またはタンパク質発現量の
測定などをそれぞれ定量的に行い、細胞死信号を複合的に分析し、これを用いてＢＣＬ２
ファミリータンパク質標的薬物（一例としてベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ））
に対する敏感度を確認した。

【0079】

前記試料内タンパク質と外来タンパク質の間の相互作用の測定は、試料内のＢＣＬ２、
ＢＣＬｘＬ、ＭＣＬ１などアポトーシス抑制タンパク質と、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、
ＢＡＸ、ＢＡＫなど外部（試料外）から供給されたアポトーシス誘導タンパク質の間の相
互作用（第１タンパク質－タンパク質相互作用、以下第１ＰＰＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒ
ｏｔｅｉｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）と定義する）を測定し、ＢＣＬ２標的阻害剤（一
例としてベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ））またはＭＣＬ１標的阻害剤（一例と
してＡＭＧ１７６）反応性との相関関係を定量的に分析した。このとき、試料外から供
給されたアポトーシス誘導タンパク質はマーカーが付着している。

【0080】

前記試料内のタンパク質の間の相互作用（例えば、タンパク質複合体の形成）の測定は
、試料内のＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＭＣＬ１などアポトーシス抑制タンパク質と同じ試料
内のＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡなどアポトーシス誘導タンパク質の間の
相互作用（第２タンパク質－タンパク質相互作用、以下第２ＰＰＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐ
ｒｏｔｅｉｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）と定義する）を測定し、ＢＣＬ２標的阻害剤（
一例としてベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ））またはＭＣＬ１標的阻害剤（一例
としてＡＭＧ１７６）感受性との相関関係を確認した。

【0081】

前記試料内タンパク質と外来タンパク質の間の相互作用（第１ＰＰＩ）水準および／ま
たは試料内タンパク質間の相互作用（第２ＰＰＩ）水準を比較分析することによって、Ｂ
ＣＬ２標的阻害剤（一例としてベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ））またはＭＣＬ
１標的阻害剤（一例としてＡＭＧ１７６）感受性との相関関係を分析した。前記比較分
析により試料内のＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＭＣＬ１などアポトーシス抑制タンパク質の状
態を確認することができる。一例として、アポトーシス抑制タンパク質の、アポトーシス
誘導タンパク質と相互作用する活性サイトの露出程度を確認することができる。これによ
りタンパク質間の結合程度、結合強度、残余結合サイト、薬物敏感度などを間接的に予測
することができる。

【0082】

本明細書では、試料内のＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＭＣＬ１などアポトーシス抑制タンパ
ク質またはＢＡＸ、ＢＡＫなどアポトーシス誘導タンパク質の水準を測定し、ＢＣＬ２標
的阻害剤（一例としてベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ））またはＭＣＬ１標的阻
害剤（一例としてＡＭＧ１７６）感受性との相関関係を確認した。前記タンパク質の水
準は、タンパク質発現水準であり得、活性化されたタンパク質の発現水準であり得、リン
酸化されたタンパク質の発現水準であり得る。

【0083】

本明細書で提供されるタンパク質－タンパク質相互作用の測定は、ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏ
ｌｅｃｕｌｅｐｕｌｌ－ｄｏｗｎおよび／またはｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔ
ａｔｉｏｎ（ｃｏ－ＩＰ）を基盤とする。

【0084】

本明細書で使用された用語の「タンパク質－タンパク質相互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐ
ｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：ＰＰＩ）」は、第１タンパク質と第１タンパク
質相互作用タンパク質の間の物理的および／または化学結合または複合体形成を意味し、
例えば、結合頻度、接着強さ（強度）、および結合時間などの因子のうち一つ以上で測定
することができる。また、前記第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク質の間
の相互作用（結合）はこれらの間の直接的な相互作用（結合）だけでなく、中間に他のタ
ンパク質（信号伝達経路のうち第１タンパク質および第１タンパク質相互作用タンパク質
の間に位置するタンパク質）を媒介とした相互作用（結合）も含み得る。本明細書でのタ
ンパク質－タンパク質相互作用は、単分子（ｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅ）反応（１
分子の第１タンパク質と１分子の第１タンパク質相互作用タンパク質の間の反応）であり
得る。

【0085】

先立って説明した通り、第１タンパク質は、ＢＣＬ２ファミリータンパク質（Ａｎｔｉ
－ａｐｏｐｔｏｔｉｃタンパク質）として、ＢＣＬ－２（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ
．ＮＭ＿０００６３３．２など）、ＢＣＬｘＬ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿
１３８５７８．１など）、またはＭＣＬ－１（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿０
２１９６０．３など）であり得る。前記第１タンパク質相互作用タンパク質は、前記第１
タンパク質と相互作用するタンパク質として、ＢＩＭ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．
Ｂ０３３６９４）、ＢＩＤ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿００１１９６．２）
またはｔＢＩＤ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿００１１９６．２のＮ－ｔｅｒ
ｍｉｎａｌｔｒｕｎｃａｔｅｄｆｏｒｍなど）、ＢＡＤ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓ
ｅｑ．ＮＭ＿００４３２２．２など）、ＢＡＸ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿
１３８７６１．３など）、ＮＯＸＡ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＭ＿００１３８
２６１６．１）、ＢＡＫ（例、ＮＣＢＩｒｅｆｓｅｑ．ＮＰ＿００１１７９．１など
）などからなる群より選ばれた１種以上であり得る。

【0086】

本明細書で提供される方法で行われる第１タンパク質および第１タンパク質相互作用タ
ンパク質の間のタンパク質－タンパク質相互作用を測定する段階（ａ１；（ｉ）および／
または（ｉｉ））は、分離された細胞または組織に対して生体外または細胞外（ｉｎｖ
ｉｔｒｏ）で行われるものであり得る。

【0087】

本発明による測定を段階別に詳細に説明する。

【0088】

段階（１）：第１タンパク質が固定化された基板の準備段階（段階（ｉ）および（ｉｉ）
共通）
前記段階（１）は、第１タンパク質または第１タンパク質を含む試験試料を、表面に前
記第１タンパク質に特異的に結合する物質を含む基板に加えて、第１タンパク質が固定さ
れた基板を準備する段階である。

【0089】

前記試料は個体（患者）から分離した細胞、組織、細胞または組織の溶解物、破砕物、
または抽出物、体液（例えば、血液（全血、血漿、または血清）、唾液など）であり得る
。前記患者は癌患者例えば血液癌患者であり得、前記試料は前記癌細胞（血液癌細胞）を
含むものであり得、その具体的な例は先立って説明したとおりである。

【0090】

前記基板は、表面に第１タンパク質を固定させるすべての材質および／またはすべての
構造を有するものであり得る（結晶質または非結晶質をいずれも使用可能）。一例で、前
記基板は、標識信号の検出容易性を考慮し、光の屈折率が生体物質の多くの部分を占める
水の屈折率（約１．３）以上の材質であり得る。一例で、前記基板は厚さが約０．１～約
１ｍｍ、約０．１～約０．５ｍｍ、０．１～約０．２５ｍｍ、または約０．１３～約０．
２１ｍｍ程度であり得、屈折率が約１．３～約２、約１．３～約１．８、約１．３～約１
．６、または約１．５～約１．５４程度であり得る。前記基板は前記屈折率範囲を満足さ
せるすべての材質であり得、例えばガラス（屈折率：約１．５２）、石英などからなる群
より選ばれた材質から得られたものであり得るが、これに制限されるものではない。前記
基板は生物試料観察に通常使用されるすべての形態を有するものであり得、例えば、ウェ
ル型、スライド型、チャネル型、アレイ型、微少流体チップ、微細管（キャピラリ）など
であり得るが、これに制限されるものではない。蛍光顕微鏡観察時、前記試料が適用され
た基板の上にカバーガラスを取り付けて観察することができ、カバーガラスの材質は先立
って基板の説明で記載したとおりであり、厚さは基板の説明で記載した範囲またはこれよ
り薄くてもよい（例えば、屈折率１．５２、厚さ０．１７ｍｍであり得るがこれに制限さ
れるものではない）。

【0091】

前記第１タンパク質に特異的に結合する物質は、第１タンパク質、すなわち、ＢＣＬ２
、ＢＣＬｘＬ、ＭＣＬ１またはこれらすべてと特異的に結合できるすべての物質から選ば
れたものであり得、例えば、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＭＣＬ１、またはこれらすべてに特
異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２
、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２など）、アプタマー（タンパ
ク質または核酸分子）、小分子化合物などからなる群より選ばれた１種以上であり得る。
このとき、前記第１タンパク質（ＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＭＣＬ１、またはこれらすべて
）に特異的に結合する物質は、第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク質との
相互作用を妨げない部位、すなわち、第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク
質が相互作用（結合）する部位でない部位で第１タンパク質と結合するものであり得る。

【0092】

一例で、前記基板は、前記第１タンパク質に特異的に結合する生物学的物質（例えば、
抗体など）を表面に含む（固定する）ために適宜表面改質されたり、表面に直接、前記第
１タンパク質に特異的に結合する物質が固定されたものであり得る。前記基板が表面改質
された場合、前記基板は一面に、前記第１タンパク質に特異的に結合する生物学的物質（
例えば、抗体など）を固定化させる官能基を有するあらゆる化合物で処理（例えば、塗布
）され得、例えば、アルデヒド基、カルボキシル基およびアミン基からなる群より選ばれ
た官能基を含む化合物で処理することができる。一具体例で、前記アルデヒド基、カルボ
キシル基およびアミン基からなる群より選ばれた官能基を含む化合物は、ビオチン（ｂｉ
ｏｔｉｎ）、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ
）、ビオチンが結合されたウシ血清アルブミン、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔ
ｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）、ビオチンが結合されたＰＥＧ（ポリエチレング
リコール－ビオチン；ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎ）、ポリソルベート（ｅ．ｇ．，Ｔｗｅｅｎ
２０）などからなる群より選ばれた１種以上であり得るが、これに制限されるものではな
い。前記表面処理された基板はニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、ストレ
プトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）などからなる群
より選ばれた１種以上が追加で処理（例えば、塗布）され得る。

【0093】

段階（２）：第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク質を反応させる段階
前記段階（２）では、下記段階（２－１）および／または（２－２）を実施することが
できる。

【0094】

段階（２－１）：試料内のタンパク質および試料外のタンパク質の間のタンパク質－タン
パク質相互作用（段階（ｉ）の第１タンパク質－タンパク質相互作用）
前記段階（２－１）は、前記第１タンパク質（試料内のタンパク質）が固定された基板
（例えば、前記段階（１）で準備される）に、標識物質で標識された（標識物質が付着し
た）第１タンパク質相互作用タンパク質（試料外のタンパク質）を添加して前記第１タン
パク質と反応させる段階である。前記標識物質から生成された信号を測定することによっ
て、試料内のタンパク質と試料外のタンパク質の間の複合体形成水準を確認することがで
き、これにより試料内のタンパク質と試料外のタンパク質の間のタンパク質－タンパク質
相互作用水準を測定することができる。

【0095】

前記標識された第１タンパク質相互作用タンパク質は、第１タンパク質相互作用タンパ
ク質が検出可能な信号を発生させる標識物質で標識されたり（標識物質が、例えば、化学
的（例えば、共有的または非共有的）、組換え的、または物理的に、結合されたり）、標
識物質が結合されるｔａｇが付着した形態を意味する。前記検出可能な信号は通常の酵素
反応、蛍光、発光、および／または放射線検出により測定できるすべての信号（例えば、
光、放射線など）より選択することができる。前記標識物質は前記標識信号を発生させる
すべての小分子化合物、タンパク質、ペプチド、核酸分子などからなる群より選ばれた１
種以上であり得、例えば、蛍光染料（小分子化合物；Ｃｙａｎｉｎｅ、Ａｌｅｘ、Ｄｙｌ
ｉｇｈｔ、Ｆｌｕｏｐｒｏｂｅｓなど）、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質
（ＧＦＰ，ｅｎｈａｎｃｅｄＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青緑色蛍光タ
ンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＰＦ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＰＦ）、
ｍｃｈｅｒｒｙなど）などからなる群より選ばれた１種以上であり得る。前記ｔａｇはＨ
ｉｓ－ｔａｇ／Ｎｉ－ＮＴＡなどのように通常使用されるすべての種類より選ばれた１種
以上であり得る。前記標識物質の使用濃度は、ノイズを発生させず正確で容易な検出を可
能にするために、約１ｕＭ以下の範囲で適宜決定することができ、例えば、１ｎＭ～１０
００ｎＭ、１ｎＭ～５００ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１０ｎＭ～１０００ｎＭ、１０ｎ
Ｍ～５００ｎＭ、または１０ｎＭ～１００ｎＭ程度であり得るが、これに制限されるもの
ではない。前記のような標識物質から発生する信号は、これを検出または測定するために
通常使用されるすべての信号検出手段（例えば、通常の蛍光顕微鏡、蛍光カメラ、蛍光強
度測定（定量）装置など）によって測定することができる。

【0096】

段階（２－２）：試料内のタンパク質間のタンパク質－タンパク質相互作用（段階（ｉｉ
）の第２タンパク質－タンパク質相互作用）
前記段階（２－２）は、前記第１タンパク質が固定された基板（例えば、前記段階（１
）で準備される）に、第１タンパク質相互作用タンパク質の結合物質（前記結合物質は標
識物質が付着する）を供給し、第１タンパク質（試料内）と第１タンパク質相互作用タン
パク質（試料内）の間に形成された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）のうち第１タンパク質相互
作用タンパク質と反応させる段階である。前記標識物質から生成された信号を測定するこ
とによって試料内のタンパク質複合体形成水準を確認することができ、これにより試料内
のタンパク質－タンパク質相互作用の水準を測定することができる。

【0097】

前記第１タンパク質相互作用タンパク質結合物質は、検出可能な信号を発生させる標識
物質で標識されたり（標識物質が、例えば、化学的（例えば、共有的または非共有的）、
組換え的、または物理的に、結合されたり）、標識物質が結合できるｔａｇが付着した形
態を意味する。前記検出可能な信号は通常の酵素反応、蛍光、発光、および／または放射
線検出により測定できるすべての信号（例えば、光、放射線など）より選択することがで
きる。前記標識物質は前記標識信号を発生させるすべての小分子化合物、タンパク質、ペ
プチド、核酸分子などからなる群より選ばれた１種以上であり得、例えば、蛍光染料（小
分子化合物、有機蛍光染料（ｏｒｇａｎｉｃｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅ）；Ｃｙ
ａｎｉｎｅ、Ａｌｅｘ、Ｄｙｌｉｇｈｔ、Ｆｌｕｏｐｒｏｂｅｓなど）、蛍光タンパク質
（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，ｅｎｈａｎｃｅｄＧＦＰ）、黄色蛍光タンパ
ク質（ＹＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＰＦ）、赤
色蛍光タンパク質（ＲＰＦ）、ｍｃｈｅｒｒｙなど）などからなる群より選ばれた１種以
上であり得る。前記ｔａｇはＨｉｓ－ｔａｇ／Ｎｉ－ＮＴＡなどのように通常使用される
すべての種類より選ばれた１種以上であり得る。前記標識物質の使用濃度は、ノイズを発
生させず正確で容易な検出を可能にするために、約１ｕＭ以下の範囲で適宜決定すること
ができ、例えば、１ｎＭ～１０００ｎＭ、１ｎＭ～５００ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１
０ｎＭ～１０００ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、または１０ｎＭ～１００ｎＭ程度であり
得るが、これに制限されるものではない。前記のような標識物質から発生する信号は、こ
れを検出または測定するために通常使用されるすべての信号検出手段（例えば、通常の蛍
光顕微鏡、蛍光カメラ、蛍光強度測定（定量）装置など）によって測定することができる
。

【0098】

タンパク質の相互作用をより正確に測定するために、反応させる段階（段階（２））と
後続するタンパク質－タンパク質相互作用の測定段階（段階（３））の間に、前記反応が
起きた基板を通常の方法で洗浄する段階をさらに含み得る。

【0099】

段階（３）：タンパク質－タンパク質相互作用の測定段階
前記段階（３）は、前記段階（２）（すなわち、（２－１）および／または（２－２）
）で得られた反応物から信号を測定する段階である。前記信号測定は、段階（２）で使用
された標識信号（例えば、酵素反応、蛍光、発光、または放射線検出などの通常の方法に
より測定可能な信号）を検出（または測定または確認）できるあらゆる手段を用いて行わ
れ得る。

【0100】

一例で、段階（３）でのタンパク質－タンパク質相互作用の測定はリアルタイム分析に
よるものであり得る。

【0101】

一例で、前記標識信号が蛍光信号である場合、前記信号検出は、前記蛍光信号を発生さ
せる標識物質が吸収する光源を供給して、発生する蛍光信号を、例えば、蛍光顕微鏡、蛍
光（測定）カメラ、および／または蛍光強度測定（定量）装置などを用いて、映像化およ
び／または定量することができる。

【0102】

前記信号が蛍光信号である場合、段階（３）（タンパク質－タンパク質相互作用の測定
段階）は、
（ｉ）前記段階（２）の反応物に光源を供給する段階；および
（ｉｉ）前記供給された光源によって発生した蛍光信号を検出する段階
を含み得る。

【0103】

前記段階（ｉ）の光源を供給する段階は、前記段階（２）で得られた第１タンパク質と
第１タンパク質相互作用タンパク質の反応物に光源を供給する段階として、このような目
的を達成できれば、光源の供給時期は特に制限されない。例えば、前記光源は段階（１）
以前、同時、または以後から段階（２）以後まで持続的に供給されたり、段階（２）直前
、同時、または直後に所定の時間の間供給され得るが、これに制限されるものではない。

【0104】

前記光源は蛍光信号に該当する波長を有するあらゆる光源であり得、例えば、レーザ、
ハロゲンランプなどであり得る。

【0105】

一具体例で、段階（３）のタンパク質－タンパク質相互作用の測定段階は、全反射蛍光
顕微鏡（ＴｏｔａｌＩｎｔｅｒｎａｌＲｅｆｌｅｃｔｉｏｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｃｅ（ＴＩＲＦ）ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）または共焦点顕微鏡などを用いて光源を供給し
、通常の方法で蛍光信号を観察して行われることができる。他の例で、前記全反射蛍光顕
微鏡に、信号映像化のための蛍光（測定）カメラ、例えば、ＥＭＣＣＤ（Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｎ－ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇｃｈａｒｇｅ－ｃｏｕｐｌｅｄｄｅｖｉｃｅ）またはＣ
ＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｍｅｔａｌｏｘｉｄｅｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃ
ｔｏｒ）を取り付けて用いることによって、光源供給および蛍光信号の映像化および／ま
たは定量を遂行することができる。

【0106】

次は、段階（３）のタンパク質－タンパク質相互作用の測定段階を、全反射顕微鏡およ
び蛍光（測定）カメラを用いて行う場合を例に挙げてより詳細に説明する：

【0107】

イ）前記段階（１）または段階（２）の基板を全反射顕微鏡に取り付ける。全反射顕微
鏡で光源の供給位置は通常、観測しようとする基板側であり、レンズの位置は光源供給位
置と関係ない。

【0108】

ロ）光源はレーザであり得、光源の強度は約０．５ｍＷ～約５ｍＷ、約０．５ｍＷ～約
４．５ｍＷ、約０．５ｍＷ～約４ｍＷ、約０．５ｍＷ～約３．５ｍＷ、約０．５ｍＷ～約
３ｍＷ、約０．５ｍＷ～約２．５ｍＷ、約０．５ｍＷ～約２ｍＷ、約１ｍＷ～約５ｍＷ、
約１ｍＷ～約４．５ｍＷ、約１ｍＷ～約４ｍＷ、約１ｍＷ～約３．５ｍＷ、約１ｍＷ～約
３ｍＷ、約１ｍＷ～約２．５ｍＷ、約１ｍＷ～約２ｍＷ、約１．５ｍＷ～約５ｍＷ、約１
．５ｍＷ～約４．５ｍＷ、約１．５ｍＷ～約４ｍＷ、約１．５ｍＷ～約３．５ｍＷ、約１
．５ｍＷ～約３ｍＷ、約１．５ｍＷ～約２．５ｍＷ、または約１．５ｍＷ～約２ｍＷ、例
えば、約２ｍＷであり得、光源の波長は先立って説明した通り、蛍光信号または使用され
た標識物質、および／または装備の構成（例えば減衰フィルタを用いる場合は強度が強い
光源を使用できる）によって適宜選択することができる。

【0109】

ハ）前記光源供給によって発生した蛍光信号を蛍光（測定）カメラで撮影して映像化お
よび／または定量することができる。

【0110】

前記蛍光信号の撮影（または映像化）は、標識物質の蛍光信号発生維持時間（発光時間
、ｌｉｆｅｔｉｍｅ）を考慮し、光源供給と同時または前記信号発生維持時間以内に遂行
することができる。

【0111】

蛍光（測定）カメラ（例えば、ＥＭＣＣＤカメラ）で蛍光信号を撮影（または映像化）
することにおいて、１フレーム当たり露出時間、レーザパワー、カメラｇａｉｎ値、総撮
影フレームなどを適宜調節することができる。例えば、１フレーム当たり露出時間が短い
ほど１フレームに累積する信号が減り、これを相殺するためにレーザパワーを高めたり、
蛍光カメラの感度を高めることができる。一例で、１フレーム当たり露出時間を約０．０
０１秒～約５秒、約０．００１秒～約３秒、約０．００１秒～約２秒、約０．００１秒～
約１秒、約０．００１秒～約０．５秒、約０．００１秒～約０．３秒、約０．００１秒～
約０．１秒、約０．０１秒～約５秒、約０．０１秒～約３秒、約０．０１秒～約２秒、約
０．０１秒～約１秒、約０．０１秒～約０．５秒、約０．０１秒～約０．３秒、約０．０
１秒～約０．１秒、約０．０５秒～約５秒、約０．０５秒～約３秒、約０．０５秒～約２
秒、約０．０５秒～約１秒、約０．０５秒～約０．５秒、約０．０５秒～約０．３秒、約
０．０５秒～約０．１秒、約０．０７秒～約５秒、約０．０７秒～約３秒、約０．０７秒
～約２秒、約０．０７秒～約１秒、約０．０７秒～約０．５秒、約０．０７秒～約０．３
秒、約０．０７秒～約０．１秒、約０．１秒～約５秒、約０．１秒～約３秒、約０．１秒
～約２秒、約０．１秒～約１秒、約０．１秒～約０．５秒、または約０．１秒～約０．３
秒、例えば約０．１秒にすることができるが、これに制限されるものではない。

【0112】

例えば、ＥＭＣＣＤカメラを用いる場合、標識物質（例えば、ｅＧＦＰ）から生成され
た光子（ｐｈｏｔｏｎ）はＥＭＣＣＤの素子により電子に変わって計測される（光電効果
、ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｉｃｅｆｆｅｃｔ）。このとき、光子１個当たり生成される
電子の個数をｇａｉｎ値により変更することができる。設定されたｇａｉｎ値が高いほど
光子１個当たり生成される電子の個数が増え、ＥＭＣＣＤカメラの感度が高まると同時に
ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｎｏｉｓｅも共に増加するのでｓｉｇｎａｌ－ｔｏ－ｎｏｉｓｅ
比率が重要である。一具体例で、優れたｓｉｇｎａｌ－ｔｏ－ｎｏｉｓｅ比率を得るため
に、ｇａｉｎ値を約１０～約１００、約１０～約８０、約１０～約６０、約１０～約５０
、約２０～約１００、約２０～約８０、約２０～約６０、約２０～約５０、約３０～約１
００、約３０～約８０、約３０～約６０、または約３０～約５０、例えば、約４０程度に
定めることができるが、これに限定されずカメラの感度、寿命、装備構築現況、ノイズ、
試験条件などを考慮して適宜選択されることができる。

【0113】

総撮影フレーム個数と露出時間を乗ずると総撮影時間が得られる（露出時間＊総撮影フ
レーム個数＝撮影時間）。蛍光物質の発光時間（ｌｉｆｅｔｉｍｅ）以後には蛍光信号が
消えるので、前記撮影時間が発光時間内に行われるように総撮影フレーム個数および／ま
たは露出時間を調節することができる。

【0114】

タンパク質－タンパク質相互作用の測定結果の正確度を高めるために、前記映像化を、
一つ以上、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、７個以上、または１０個
以上（上限値は基板の大きさおよび映像化可能な面積によって決定される）の基板または
それを含む一つ以上のチャネル（各チャネルは２個以上の基板を含む）で行い、信号が現
れた領域（ｓｐｏｔ）、具体的にはイメージのうち明るい領域（ＰＰＩｃｏｍｐｌｅｘ
ともいう）の個数（ＰＰＩｃｏｕｎｔ）を求め、前記得られた蛍光信号を定量化するこ
とができ、これはタンパク質－タンパク質相互作用を定量化したものと見ることができる
。

【0115】

他の例で、段階（３）で測定された蛍光強度を、通常の装置を用いて数値化することに
よってタンパク質－タンパク質相互作用を定量することもできる。このとき、結果の正確
性のために、前記結果を、試料量または試料内のタンパク質量を基準として標準化（ｎｏ
ｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）することができる。

【0116】

第１タンパク質および／または第１タンパク質相互作用タンパク質を２種以上使用する
場合、段階（１）～（３）はそれぞれの第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパ
ク質の組み合わせに対してそれぞれ行われることができる（すなわち、段階（１）～（３
）は第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク質の組み合わせの数だけ繰り返し
行われることができる）。

【0117】

本明細書で提供される方法は、次の段階（４）をさらに含み得る：

【0118】

段階（４）：比較する段階（段階（ｂ）、具体的には（ｂ１））
段階（４）は、前記段階（３）で得られた結果（タンパク質－タンパク質相互作用の水
準）を、第１比較タンパク質と第１比較タンパク質相互作用タンパク質の間のタンパク質
－タンパク質相互作用水準と比較したり基準値と比較する段階である。前記第１比較タン
パク質と第１比較タンパク質相互作用タンパク質、および基準値は先立って説明したとお
りである。

【0119】

本明細書に使用される用語の「ＢＣＬ２ファミリータンパク質を標的とする」とは、Ｂ
ＣＬ２ファミリータンパク質を認識（特異的結合）するかおよび／または活性を阻害する
ことを意味する。ＢＣＬ２ファミリータンパク質の活性の阻害は、ＢＣＬ２ファミリータ
ンパク質と結合したり、および／またはＢＣＬ２ファミリータンパク質を分解および／ま
たは構造的変形を行い固有の機能、例えばアポトーシス抑制機能を減少させたり除去する
ことであり得る。

【0120】

本明細書に使用された用語の「薬物」は、薬理的効果を示すすべての物質、例えば、小
分子化合物、タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、またはその類似体など）、ペプチド
、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲ
ＮＡなど）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）、アプタマー、など
）、植物抽出物、動物抽出物、細胞抽出物などからなる群より１種以上選択されるもので
あり得る。

【0121】

本明細書で、第１タンパク質と相互作用するタンパク質、標識物質として蛍光タンパク
質、結合物質として抗体などの、すべての外部から供給されるタンパク質は、組換え的合
成または化学的合成により生産されたものであり得るが、これに制限されるものではない
。一例で、前記組換え的生産は、前記タンパク質をコードする遺伝子またはそれを含むベ
クターを、ＨＥＫ２９３細胞のような哺乳類細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌ）に形
質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）により発現したり、ＳＦ９のような昆虫細胞（ｉｎ
ｓｅｃｔｃｅｌｌ）に形質導入により発現したり、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌に形質導
入により発現させる段階を含み得る。このとき、前記発現したタンパク質は追加的な精製
（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程を経るが、それは必須ではなく、精製されたタンパク
質またはタンパク質を発現した細胞溶解液をそのまま使用してタンパク質－タンパク質測
定を遂行することができる。

【0122】

本明細書に使用される用語の「ＢＣＬ２ファミリータンパク質を標的とする治療または
ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物を使用する治療」は、互いに等価的意味で互換可
能であり、第１タンパク質の活性を阻害するすべての医学的および／または薬学的行為を
意味し、例えば、先立って説明したようなＢＣＬ２ファミリータンパク質の活性を阻害す
る薬物を、ＢＣＬ２ファミリータンパク質の活性を阻害することを必要とする対象に処方
および／または投与するものであり得る。より具体的には、「ＢＣＬ２ファミリータンパ
ク質を標的とする治療」は、ＢＣＬ２ファミリータンパク質と結合したり、および／また
はＢＣＬ２ファミリータンパク質を分解および／または構造的変形を行い固有の機能、例
えば、アポトーシス抑制機能を減少させたり除去する薬物を、これを必要とする対象に処
方および／または投与するものであり得る。

【0123】

前記投与は経口または非経口の経路で行われる。非経口投与である場合は静脈内注入、
皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、病変部位局所投与、鼻内投与、肺内投与、ま
たは直腸内投与などの経路で行われることができる。

【0124】

前記個体、患者または対象はすべての哺乳類、例えば人間、猿などの霊長類、マウス、
ラットなどの齧歯類などであり得、例えば第１タンパク質と関連した疾病を有する患者で
あり得る。前記第１タンパク質と関連する疾病は、第１タンパク質の過発現または第１タ
ンパク質が関与する細胞または組織内の信号伝達経路の活性化と関連する疾病であり得、
例えば、癌、より具体的には血液癌であり得る。具体的例で、前記個体、患者または対象
は癌患者、具体的には血液癌患者であり得る。

【0125】

本明細書に使用された用語の「薬物に対する反応性」は薬物の投与を受けた個体で前記
薬物が効果を発揮する程度を意味する。

【0126】

本明細書に使用された用語の「効能または効果」は、薬物または治療が処置対象におい
て達成しようとする医学的および／または薬学的効果を意味し、処置対象が有する疾病の
予防および／または治療、および／または症状の緩和および／または改善などを意味する
。例えば、前記薬物が抗癌剤であり、治療が抗癌治療であり、前記処置対象が癌患者であ
る場合、前記効果は抗癌効果（癌の予防および／または治療効果）であり得、前記抗癌効
果は癌細胞の成長を抑制する効果だけでなく、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、侵襲（ｉｎ
ｖａｓｉｏｎ）、および／または転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などを抑制、および／ま
たは癌の悪化を抑制、および／または抵抗性を減少または除去する効果などを含むことで
あり得る。

【0127】

他の例で、先立って説明したＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物の効果予測および
／またはＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物治療に使用するための、分析装置を提供
する。

【0128】

前記分析装置は、
第１タンパク質に特異的に結合する第１タンパク質の捕獲用物質または第１タンパク質
を含む反応部を含むか、
これに加えて、第１タンパク質相互作用タンパク質検出用製剤および／または信号検出
手段をさらに含むものであり得る。前記第１タンパク質相互作用タンパク質検出用製剤お
よび第１タンパク質相互作用タンパク質に（特異的に）結合する結合物質を含むものとし
て、前記結合物質は、第１タンパク質相互作用タンパク質が第１タンパク質と相互作用（
結合）する部位と相違する部位に結合する物質（例えば、抗体、抗原結合断片、抗体類似
体、アプタマー、小分子化合物など）であり得、標識物質で標識されたものであり得る。

【0129】

前記第１タンパク質は先立って説明したとおりであり、精製されたタンパク質またはそ
れを含む細胞もしくは前記細胞の溶解物形態で使用され得、前記反応部は前記第１タンパ
ク質、それを含む細胞、または前記細胞の溶解物、またはこれらが固定化された基板を含
むものであり得る。

【0130】

前記分析装置は第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク質の間の相互作用（
結合）の有無および／または程度を測定するためのものであり得る。

【0131】

前記反応部は、表面に第１タンパク質捕獲用物質が固定化されたり、前記第１タンパク
質が捕獲用物質によるかまたはよらずに（直接的に）固定化された基板を含み得る。前記
第１タンパク質捕獲用物質は、第１タンパク質に特異的に結合する物質、例えば、抗体ま
たはその抗原結合断片であり得る。前記反応部はウェル（例えば、マルチウェル）タイプ
、スライド型、チャネル型、アレイ型、微少流体チップ、微細管（キャピラリ）などであ
り得るが、これに制限されるものではない。

【0132】

前記分析装置は、第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク質の間のタンパク
質－タンパク質相互作用を測定する装置であり得、これのために、前記第１タンパク質と
相互作用するタンパク質をさらに含み得る。一例で、前記第１タンパク質相互作用タンパ
ク質は、検出可能な信号を発生させる標識物質で標識されたり（標識物質が、例えば、化
学的（例えば、共有的または非共有的）、組換え的、または物理的に、結合されたり）、
標識物質が結合できるｔａｇが付着した形態であり得る。

【0133】

また、前記タンパク質－タンパク質相互作用測定用装置は、信号検出手段で測定された
信号値を第１タンパク質の水準に正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）させるために、
第１タンパク質に結合する探知用物質および前記探知用物質に結合する標識用物質をさら
に含み得る。前記第１タンパク質に結合する探知用物質は、先立って説明したマルチウェ
ルに含まれた、第１タンパク質の捕獲用物質と相違する部位で第１タンパク質と結合する
生物分子（例えば、抗体）であり得、前記標識用物質は検出可能な信号を発生させる標識
物質で標識され（標識物質が、例えば、化学的（例えば、共有的または非共有的に結合）
）前記第１タンパク質に結合する探知用物質に結合可能な生物分子（例えば、抗体）であ
り得る。

【0134】

前記信号検出手段は、使用された標識物質で発生させる信号に応じて通常使用されるあ
らゆる信号検出手段であり得る。例えば、前記信号検出手段は、信号刺激部および信号検
出部を含み得、これに加えて、測定された信号を分析（例えば、定量または映像化）する
信号分析部をさらに含み得る。一例で、信号刺激、信号検出、および信号分析はそれぞれ
他の部位で行われたり、これらのうち少なくとも二つ以上が一つの部位で同時にまたは連
続して行われ得る。一例で、前記標識が蛍光物質である場合、前記信号検出手段は、蛍光
信号を発生および検出できるすべての手段より選ばれ得、例えば、蛍光信号刺激部（例え
ば、光源）、および蛍光信号検出部、および／または蛍光信号分析部を含み得る。一具体
例で、前記信号検出手段は、全反射蛍光顕微鏡（ＴｏｔａｌＩｎｔｅｒｎａｌＲｅｆ
ｌｅｃｔｉｏｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＴＩＲＦ）ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）または
共焦点顕微鏡（光源および蛍光信号検出用）を含むか、これに加えて、蛍光カメラ、例え
ばＥＭＣＣＤ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇｃｈａｒｇｅ－ｃｏｕｐｌ
ｅｄｄｅｖｉｃｅ）またはＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｍｅｔａｌｏｘ
ｉｄｅｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）をさらに含み、光源供給および蛍光信号の映像化
および／または定量を遂行することができる。前記光源の波長、強度、蛍光カメラ測定条
件（例えば、１フレーム当たり露出時間、レーザパワー、カメラｇａｉｎ値、総撮影フレ
ームなど）は先立って説明したとおりである。

【0135】

本明細書に提供されたタンパク質－タンパク質相互作用測定用装置は、少量の試料での
第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク質の間の相互作用および／または第１
タンパク質と第１タンパク質の発現水準を、正確かつ効率的に観察、分析、検出、および
／または測定できる利点を有する。したがって、前記マルチウェルまたはこれを用いる分
析方法は生検（例えば、ｎｅｅｄｌｅｂｉｏｐｓｙ）、血中癌細胞試料のように非常に
少量の試料に対しても有用であり、効果的に適用することができる。

【発明の効果】

【0136】

ベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）などのＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬
物は様々な血液癌患者の治療に使用することができる。例えば、ベネトクラクス（Ｖｅｎ
ｅｔｏｃｌａｘ）は、慢性白血病以外にも、薬物によるはやい好転が必要な急性白血病お
よび骨髄癌の治療に適用できるが、患者の負担を最小限に減らすためにはやく薬物の効能
を予想できる診断技法が必要である。ＢＣＬ２単一タンパク質の発現量および突然変異遺
伝子の有無を確認する従来の方法では、ベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）などの
ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物の効能を成功的に予測できないことに対し、本明
細書で提供されるタンパク質－タンパク質相互作用および／またはタンパク質発現測定に
基づく診断方法は、個別患者の多様な種類の血液癌にベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌ
ａｘ）などのＢＣＬ２ファミリータンパク質標的薬物がよく作用するかどうかをはやくか
つ特定的に予測することができ、より迅速かつ効果的に個別オーダーメード血液癌治療を
遂行できるようにする。

【図面の簡単な説明】

【0137】

【図1】基板に付着した個別抗体と標的タンパク質の間の結合を測定した図面であり、図１ａはＢＣＬ２、ＢＣＬｘＬ、ＭＣＬ１に関するものであり、図１ｂはＢＣＬ－Ｗ、Ｂｆｌ－１に関するものである。

【図2】図２ａは、試料内のＢＣＬ２、ＭＣＬ１、ＢＣＬｘＬと外部から投入（Input）したＢＩＭ、ＮＯＸＡ、ＢＡＤの相互作用を測定（ＰＰＩｃｏｕｎｔ）したものである。図２ｂは、試料内のＢＣＬ２、ＢＣＬ－ＸＬと外部から投入したｔＢＩＤの相互作用を測定（ＰＰＩｃｏｕｎｔ）したものである。図２ｃは、試料内のＢＣＬ２、ＭＣＬ１、ＢＣＬ－ＸＬと外部から投入したＢＡＸ、ＢＡＫの相互作用を測定（ＰＰＩｃｏｕｎｔ）したものである。図２ｄは、試料内のＢＣＬ２、ＢＣＬ－ＸＬ、ＭＣＬ１と外部から投入したＢＩＭタンパク質のＢＨ３ドメインのみを検査タンパク質として使用して相互作用を測定したものである。

【図3】第１タンパク質相互作用タンパク質の濃度による相互作用測定値の変化を、試料内のＢＣＬ２と外部から投入したＢＡＤの相互作用を測定して示す図である。

【図4】外部から投入される溶液に含まれる界面活性剤の種類および濃度による相互作用測定値の変化を、試料内のＢＣＬ２と外部から投入したＢＡＤの相互作用を測定して示す図である。

【図5】外部から投入される溶液に含まれる界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ－１００の濃度による相互作用測定値の変化を、試料内のＢＣＬ２と外部から投入したＢＡＤの相互作用を測定して示す図である。

【図6】外部から投入される検査タンパク質ＢＩＭに対して、種（ｓｐｅｃｉｅｓ）間の保存性に優れるアミノ酸（ｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓ）に変異が発生する場合にＢＣＬ－ＸＬまたはＢＣＬ２との相互作用測定値に違いが生じることを確認した図である。

【図7】試料（ＨＬ６０、ＯＣＩ－ＬＹ３）内のＢＣＬ２、ＭＣＬ１、ＢＣＬ－ＸＬとＢＩＭの複合体(complex)水準を測定した図である。

【図8】試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）内のＢＣＬ２とＢＡＸの複合体(complex)水準を測定した図である。

【図9】試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）内のＢＣＬ２、ＢＣＬ－ＸＬ、ＭＣＬ１とＢＡＫの複合体(complex)水準を測定した図である。

【図10】試料（ＨＬ６０、ＯＣＩ－ＬＹ３、ＳＵＤＨＬ８）内のＢＣＬ－ＸＬとＢＡＤの複合体(complex)水準、ＭＣＬ１とＮＯＸＡの複合体水準を測定した図である。

【図11】タンパク質複合体(complex)水準を測定することにおいて、第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク質が互いに互換できることを確認した図である。

【図12】図１２ａは、二種のＢＡＫ抗体がいずれもＢＡＫに結合できることを示した結果である。図１２ｂは、それぞれ［ＭＣＬ１，ＢＡＫ］、［ＢＣＬ－ＸＬ，ＢＡＫ］、［ＢＣＬ２，ＢＡＫ］を共発現(co-transfected)させた細胞（ＨＥＫ２９３）に対して、明示された沈降抗体（ｐｕｌｌｄｏｗｎＡｂ）を用いて信号を測定した結果である。これにより、ＢＡＫに結合されるＤ４Ｅ４クローン(clone)のＢＡＫ抗体は、ＢＣＬ２ファミリータンパク質が共発現された場合は結合されないことを検証した図である。図１２ｃは、図１２ａで使用された抗体の一つであるＡＴ３８Ｅ２を用いて、先立って使用した共発現(co-transfected)されたＢＡＫが検出されることを検証した図である。

【図13】試料内のＭＣＬ１、ＢＣＬ－ＸＬ、ＢＣＬ２の発現量を測定した図である。

【図14】試料内のＢＡＸ、ＢＡＫの発現量を測定した図である。

【図15】ａは、ＧＤＮ(Glycoldiosgenin)で処理した試料に治療剤（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）を投入した後、ＢＡＸの発現量を検出抗体で測定したものであり、ｂは、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で処理した試料に治療剤（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）を投入した後、ＢＡＸの発現量を検出抗体で測定したのである。ｃは、ＧＤＮで処理した試料に治療剤（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）を投入した後、ＢＡＸの発現量を検出抗体で測定したものであり、ｂは、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で処理した試料に治療剤（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）を投入した後、ＢＡＸの発現量を検出抗体で測定したのである。

【図16】検体内のＢＡＸ発現量を測定した図である。図１６のａ、ｃは特定の折り畳み形態のＢＡＸの発現量をｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ処理時間に応じて測定した図であり、図１６のｂ、ｄは同一検体をＴｒｉｔｏｎＸ－１００で処理した後に測定した結果である。

【図17】ａは試料（ＨＬ６０）のＢＣＬ２と外部から投入したＢＡＤの相互作用を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６で処理した後に測定した図であり、ｂは試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）のＢＣＬ２と外部から投入したＢＡＤの相互作用を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６で処理した後に測定した図である。

【図18】ａは試料（ＨＬ６０）のＭＣＬ１と外部から投入したＮＯＸＡの相互作用を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６で処理した後に測定した図であり、ｂは試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）のＭＣＬ１と外部から投入したＮＯＸＡの相互作用を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６で処理した後に測定した図である。

【図19】ａは試料（ＨＬ６０）のＢＣＬ－ＸＬと外部から投入したＢＡＤの相互作用を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６で処理した後に測定した図面であり、ｂは試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）のＢＣＬ－ＸＬと外部から投入したＢＡＤの相互作用を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６で処理した後に測定した図である。

【図20】ａは試料（ＨＬ６０）内のＢＣＬ２、ＭＣＬ１、ＢＣＬ－ＸＬ発現量を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６処理後測定した図であり、ｂは試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）内のＢＣＬ２、ＭＣＬ１、ＢＣＬ－ＸＬ発現量を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６処理後測定した図である。

【図21】ａは、試料（ＨＬ６０）内のＢＣＬ２、ＭＣＬ１、ＢＣＬ－ＸＬとＢＩＭの複合体(complex)水準を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６処理後測定した図であり、ｂは、試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）内のＢＣＬ２、ＭＣＬ１、ＢＣＬ－ＸＬとＢＩＭの複合体水準を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６処理後測定した図である。

【図22】ａは、試料（ＨＬ６０）内のＭＣＬ１とＮＯＸＡの複合体(complex)水準を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６処理後に測定した図であり、ｂは、試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）内のＭＣＬ１とＮＯＸＡの複合体水準を、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６処理後に測定した図である。

【図23】ａは試料（ＨＬ６０）内のＢＣＬ－ＸＬとＢＡＤの複合体(complex)水準をｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６処理後に測定した図であり、ｂは試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）内のＢＣＬ－ＸＬとＢＡＤの複合体水準をｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＭＧ１７６処理後に測定した図である。

【図24】ａは、試料（ＨＬ６０）内のＢＣＬ２とＢＡＸの複合体(complex)水準を、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ処理時間(hour)に応じて測定したものであり、ｂは、試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）内のＢＣＬ２とＢＡＸの複合体水準を、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ処理時間に応じて測定した図である。

【図25】ａは、試料（ＨＬ６０）内のＢＡＸ発現量を、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ処理時間(hour)に応じて測定したものであり、ｂは、試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）内のＢＡＸ発現量を、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ処理時間に応じて測定した図である。

【図26】ａは、試料（ＨＬ６０）内のＢＡＫ発現量を、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ処理時間(hour)に応じて測定したものであり、ｂは、試料（ＯＣＩ－ＬＹ３）内のＢＡＫ発現量を、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ処理時間に応じて測定した図である。

【図27】試料（ＨＬ６０）内のＢＣＬ２と外部から投入したＢＩＭの相互作用を、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＺＤ５９９１がそれぞれ共存する状態で処理濃度に応じて測定した図である。

【図28】試料（ＨＬ６０）内のＭＣＬ１と外部から投入したＢＩＭの相互作用を、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＡＺＤ５９９１がそれぞれ共存する状態で処理濃度に応じて測定した図である。

【図29】ＡＭＬ患者（ｎ＝３２）検体に対してすべてのパラメータ（相互作用（第１ＰＰＩ）、複合体(Complex)（第２ＰＰＩ）、発現量(Expression Level)）を測定した後、Ｚ－ｃｏｒｅヒットマップで示す図である。

【図30】乳癌(breast cancer)患者（ｎ＝３０２）検体のＢＣＬ２発現量(level)を定量的に測定した図である。

【図31】肺腺癌患者(Patients)（ｎ＝１５）検体のＢＣＬ２発現量を定量的に測定した図である。

【図32】試料（Sample:ＯＣＩ－ＬＹ３）をｖｅｎｅｔｏｃｌａｘで処理(treatment)した後、処理時間(hour)に応じて、試料内のＢＣＬ２と外部から投入したＢＩＭの相互作用水準変化、および試料内のＢＣＬ２とＢＩＭの複合体(complex)水準変化を測定した図である。

【図33】試料（Sample:ＯＣＩ－ＬＹ３）をＡＺＤ５９９１で処理(treatment)した時間(hour)に応じて、試料内のＭＣＬ１と外部から投入したＮＯＸＡの相互作用水準変化、および試料内のＭＣＬ１とＮＯＸＡの複合体(complex)水準変化を測定した図である。

【図34】患者１の試料内のＢＣＬ２、ＭＣＬ１、ＢＣＬ－ＸＬと外部から投入したＢＩＭの間の相互作用水準を、ｉ）診断当時(At diagnosis)抽出された骨髄(bone marrow)、ｉｉ）ＦＬＴ３標的抗癌剤（ｑｕｉｚａｒｔｉｎｉｂ）処方後に再抽出された骨髄、ｉｉｉ）ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘとＬＤＡＣ処方後に取得した全血検体(peripheral blood)から測定した図である。

【図35】患者２の試料内のＢＣＬ２、ＭＣＬ１、ＢＣＬ－ＸＬと外部から投入したＢＩＭの間の相互作用水準を、ｉ）診断当時(At relapse)抽出された骨髄(bone marrow)、ｉｉ）ＦＬＴ３標的抗癌剤（ｑｕｉｚａｒｔｉｎｉｂ）処方後に再抽出された骨髄、ｉｉｉ）ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘとＬＤＡＣ処方後に取得した全血検体(peripheral blood)から測定した図である。

【図36】ａ～ｃは、ＡＭＬ患者検体（ｎ＝３２）から、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ反応性（縦軸）とＰＰＩ（第１ＰＰＩ）、複合体（第２ＰＰＩ）、発現量など２１種類測定値の間の相関関係を分析した結果である。

【図37】ＡＭＬ患者検体からｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ反応性とＢＣＬ２－ＢＩＭＰＰＩ（第１ＰＰＩ）およびＢＣＬ２－ＢＩＭ複合体（第２ＰＰＩ）測定値の間の相関関係を分析した結果である。

【図38】指標（parameter）を組み合わせてｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ反応性を予測する結果に関するものであり、図３８ａは指標を１から１０個まで増やすときの相関係数値を示した結果であり、図３８ｂは、二つ指標を組み合わせたときの相関分析結果を、単独指標時の結果と比較して示すグラフであり、図３８ｃは、五つの主な指標が組み合わされた時の相関分析結果である。

【図39】図３９ａ～３９ｃは、ＡＭＬ患者検体（ｎ＝２６）からＡＺＤ５９９１反応性とＰＰＩ（第１ＰＰＩ）、複合体（第２ＰＰＩ）、発現量など２１種類の測定値の間の相関関係を分析した結果である。

【図40】四つの主な指標を結合してＡＺＤ５９９１反応性を予測した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0138】

本発明を下記実施例を挙げてより詳しく説明するが、本発明の権利範囲は下記実施例に
限定される意図ではない。

【実施例0139】

実施例１．試料内タンパク質および試料外タンパク質の間のタンパク質－タンパク質相互
作用（ＰＰＩ）の測定

【0140】

１．１．分析溶解液（試料）の準備
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および急性骨髄性白血病など多様な血液癌患者から得
られた骨髄サンプルから、Ｆｉｃｏｌｌｅｇｒａｄｉｅｎｔのｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＧＥ
ｈｅａｌｔｈｃａｒｅＦｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅｐｌｕｓ１７－１４４０－０３
）を用いてＢｕｆｆｙｃｏａｔのみを選別的に収集した。

【0141】

分離したＢｕｆｆｙｃｏａｔのペレットをｄＰＢＳでＷａｓｈｉｎｇした後、ｄＰＢ
Ｓ５００ｇで５ｍｉｎ間分離した。当該過程を二回繰り返し、細胞に残っている赤血球
と血小板を最大限に除去できるようにした。このように分離したＢｕｆｆｙｃｏａｔか
ら由来した血液癌細胞を１０^７個ずつ小分し、以後の実験に使用できるように窒素にＳｎ
ａｐ－ｆｒｅｅｚｅした後、－８０℃で保管した。

【0142】

血液癌細胞株（細胞株銀行およびＡＴＣＣ；ＨＬ－６０（ＣＶＣＬ＿０００２）、ＯＣ
Ｉ－ＬＹ３（ＣＶＣＬ＿８８００））、Ｒａｍｏｓ（ＣＶＣＬ＿０５９７）、Ｕ９３７、
ＴＨＰ１、ＳＵＤＨＬ８）および患者のＢｕｆｆｙｃｏａｔから由来した癌細胞のペレ
ットは、ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（Ｈｅｐｅｓ５０ｍＭＮａｃｌ１５０ｍＭＧ
ｌｙｃｅｒｏｌ１０％（ｗ／ｖ）ＧＤＮ（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）１％（ｗ／ｖ）ｗｉｔ
ｈ２％（ｗ／ｖ）ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ２
，３（Ｐ５７２６，Ｐ００４４））を用いてサスペンションし、１０分に一回ずつ総３回
にわたってｖｏｒｔｅｘｉｎｇした。３０分後、ペレットを溶かしたｌｙｓｉｓｂｕｆ
ｆｅｒを１５０００ｇで１０分間遠心分離して上層液を分離し、これを以後の実験で基板
に適用するための分析溶解液として使用した。

【0143】

１．２．標識物質で標識された第１タンパク質相互作用タンパク質の準備
標識物質で標識された第１タンパク質相互作用タンパク質（マーカー（ｐｒｏｂｅ）タ
ンパク質）は一時的トランスフェクションにより生産した。より具体的には、ｐＥＧＦＰ
－Ｃ１（Ａｄｄｇｅｎｅ：ＰＴ３０２８－５）に制限酵素処理後、各タンパク質遺伝子Ｂ
ＩＭ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ：ＨＧ１３８１９－Ｇ）、ＮＯＸＡ（Ｓｉｎｏ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ：ＨＧ１６５４８－Ｕ）、ＢＡＤ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ：ＨＧ１００２０－Ｍ）を挿入して、ＧＦＰ発現タンパク質ベクターを製造した。製造
された発現ベクターを、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞
（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ－３２１６）に一時的トランスフェクションして、過発現されたＧＦ
Ｐ－標識（ＧＦＰ－ｌａｂｅｌｅｄ）タンパク質を取得した。

【0144】

ＧＦＰ－標識タンパク質が発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１％ＴＸ１００ｌｙｓ
ｉｓｂｕｆｆｅｒで溶解させ、細胞溶解液サンプルを準備した。前記準備された細胞溶
解液を、１％ＴＸ１００ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを使用して１６５ｎＭに希釈した
後、小分してＳｎａｐ－ｆｒｅｅｚｅし、実験前に解凍して使用した。最終的に、標識さ
れた第１タンパク質相互作用タンパク質を含む細胞溶解液は０．０３％のＴＸ－１００を
含むように準備した。

【0145】

本発明の方法でＢＩＤ、またはＢＩＭ、ＢＡＸ、ＢＡＫのうちＢＨ３ドメイン（ｄｏｍ
ａｉｎ）のみを選別的に使用して、標識された第１タンパク質相互作用タンパク質を準備
した。次の表１は下記の実施例で使用された第１タンパク質相互作用タンパク質（人間由
来）およびこれらのＵｎｉｐｒｏｔＩＤと使用されたアミノ酸部位を例示する。

【0146】

【表1】

【0147】

前記第１タンパク質相互作用タンパク質のマーカー（ｐｒｏｂｅ）としては緑色蛍光タ
ンパク質（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ、以下ＧＦＰ；ｐＥＧ
ＦＰ－Ｃ１ｖｅｃｔｏｒ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）使用して標識）を使用し、前記第１タン
パク質相互作用タンパク質のＣ－末端にｅＧＦＰが連結された形態を準備した。

【0148】

１．３．基板の準備
４５ｍｍ＊６０ｍｍＧｌａｓｓｃｏｖｅｒｓｌｉｐを、ｂｉｏｔｉｎＰＥＧ：
ｍＰＥＧの比率を３：１００（ｗ：ｗ）にしてコートした。

【0149】

前記基板のＰＥＧコートされた面でＢＣＬ２ファミリータンパク質（第１タンパク質）
を沈降させるために、ＮＴＶ（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ２６６６）と
Ｂｉｏｔｉｎが標識されたＧｏａｔａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔｓｅｃｏｎｄａｒｙ（１
１１－０６５－０４６Ｊａｃｋｓｏｎｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）抗体を使用し
た。

【0150】

ＮＴＶおよび二次抗体を、ＰＥＧコートされた基板上に結合させた後、各ＢＣＬ２ファ
ミリータンパク質（第１タンパク質）を沈降（ｐｕｌｌｄｏｗｎ）させるための抗体（
一次抗体）として、次の表２に例示した抗体を使用した。

【0151】

患者細胞および細胞株（韓国細胞株バンクおよびＡＴＣＣ；ＨＬ－６０、Ｕ９３７、Ｔ
ＨＰ１、ＯＣＩ－ＬＹ３、ＳＵＤＨＬ８）の溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を、それぞれ観測し
ようとするタンパク質を沈降させ得る抗体（表２参照）がコートされたｗｅｌｌに１０ｕ
ｌずつ入れて、室温で１時間反応後、Ｗａｓｈｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（Ｈｅｐｅｓ５０
ｍＭＮａｃｌ１５０ｍＭＧｌｙｃｅｒｏｌ１％ＧＤＮ０．０３％）で残余ｌ
ｙｓａｔｅを洗浄した。

【0152】

【表2】

【0153】

前記表２に例示した抗体の性能を、ＧＦＰと融合した第１タンパク質を用いて基板に固
定される程度として測定した。具体的には、ＧＦＰと融合したＢＣＬ２タンパク質１ｎＭ
を、前記提示された抗体が備えられた基板に注入した後に反応させた後、洗浄過程を経て
残っているＧＦＰの量を測定した。ＢＣＬ－ＸＬ、ＭＣＬ１、ＢＣＬｗ、およびＢＦＬ１
に対しても同じ試験を行った。前記得られた結果を図１ａおよび１ｂに示した。図１ａお
よび１ｂに示すように、前記表２に提示された個別抗体は標的になるタンパク質を基板に
成功的に固定させ得ることを確認した。

【0154】

１．４．試料内タンパク質と試料外タンパク質の間の相互作用測定
前記実施例１．２で準備された、標識物質が付着した第１タンパク質相互作用タンパク
質を含む細胞溶解物を、実施例１．３で準備された基板に供給した。より具体的には、前
記実施例１．２の細胞溶解物をウェルに１０ｕｌずつ入れて室温で１５分間反応させた後
、Ｗａｓｈｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（Ｈｅｐｅｓ５０ｍＭＮａｃｌ１５０ｍＭＧｌ
ｙｃｅｒｏｌ１％ＧＤＮ０．０３％）で残余物を洗浄した。その後、次のようにタ
ンパク質相互作用（ＰＰＩ）を測定した：

【0155】

全反射蛍光顕微鏡に基板を固定させてイメージングし、タンパク質の間の相互作用（結
合）についてのデータを得た。結果の正確性を高めるために、同一条件で合計１０個の異
なる位置でイメージを取得し、それを平均して代表値として使用した。

【0156】

蛍光イメージは１６ｂｉｔｕｎｓｉｇｎｅｄｉｎｔｅｇｅｒ形式で保存した。蛍光
信号に合わせて信号観測のためのレーザの波長を調節し（ＧＦＰの場合４８８ｎｍ）、発
光時間を１１秒程度維持させるためにレーザパワーを２ｍＷに調節して使用した。

【0157】

全体フレーム（１０フレーム）のうち、序盤フレームを捨てて、３個のフレーム（７－
９回目フレーム）のイメージを平均して一つのイメージを生成し、このような過程をウェ
ルの中で位置を移りながら繰り返し行って、合計１０個のイメージを取得して下記の過程
を行った。ＥＭＣＣＤ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇｃｈａｒｇｅ－ｃ
ｏｕｐｌｅｄｄｅｖｉｃｅ；ＡｎｄｏｒｉＸｏｎＵｌｔｒａ８９７ＥＸ２（Ｄ
Ｕ－８９７Ｕ－ＣＳ０－ＥＸＦ））カメラを用いて１フレーム当たり露出時間を０．１秒
にし、ＥＭＣＣＤｇａｉｎ値は４０にして蛍光イメージを得た。

【0158】

蛍光タンパク質から出る信号は、特定位置に集まっている形態（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ
ｐｏｉｎｔｓｐｒｅａｄｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＰＳＦ））で発生するが、このＰＳＦ個
数（物理的な値）が、測定しようとするＢＣＬ２ファミリータンパク質とこれと相互作用
（結合）するタンパク質の間のＰＰＩ数字（生物学的な値）である。前記ＰＳＦ値は、下
記のような過程を経て生物学的な値であるＰＰＩ値に転換させた：

【0159】

（ａ）Ｌｏｃａｌｍａｘｉｍｕｍの位置を求めた（例えば、ｉ番目ｒｏｗ、ｊ番目ｃ
ｏｌｕｍｎｐｉｘｅｌ）。先立って記述した通り、単分子蛍光信号は５１２×５１２ピ
クセルのうち特定位置（現在の観測装備下で概ね５×５ピクセルサイズ、１ｐｉｘｅｌ＝
０．１６７マイクロメーター）に集まって形成されるので、ｌｏｃａｌｍａｘｉｍｕｍ
を見つけると個別ＰＳＦを選別することができる。これはＭａｔｌａｂで提供されるｔｏ
ｏｌｋｉｔを用いて求めることができる。

【0160】

（ｂ）前記（ａ）で求めたｌｏｃａｌｍａｘｉｍｕｍが実際のＰＳＦから発生したも
のであるかどうかに対する判別過程を経る。まずｌｏｃａｌｍａｘｉｍｕｍの最小値（
ｍｉｎｉｍｕｍｉｎｔｅｎｓｉｔｙｖａｌｕｅ）を定義し、前記得られたｌｏｃａｌ
ｍａｘｉｍｕｍのうちこの最小値より大きい場合のみ分析に使用した。本実施例で使用
された最小値は７５であり、この値はレーザパワー／露出時間／装備構築状況によって変
わる。最終的に得られたｌｏｃａｌｍａｘｉｍｕｍ座標を中心に５×５ピクセルの情報
を呼び出した後、この５×５ピクセルで明るさに対する中心を求めた（ｃｅｎｔｒｏｉｄ
ｏｆｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）。このとき、求めた明るさの中心が既存のｌｏｃａｌｍ
ａｘｉｍｕｍ座標に対して０．５ｐｉｘｅｌ以上外れると（ＰＳＦ形に対する２Ｄ対称が
消えると）、正常でない蛍光信号であると判断して分析から除外した。

【0161】

（ｃ）すべての条件を通過したＰＳＦのみを最終的に選別して、座標と全体個数を求め
た。このとき得られたＰＳＦ全体個数がＰＰＩの個数（ＰＰＩｃｏｕｎｔ）となる。

【0162】

同じ条件下で撮影されたすべてのファイルに対して前記過程を行ってＰＳＦ個数を求め
た後、これを集合して平均と標準偏差を求めた。この値が最終的に特定条件でＰＰＩの個
数を示す値になる。本実施で、ＰＰＩの個数により、試料内第１タンパク質と試料外第１
タンパク質相互作用タンパク質の間に形成された複合体を測定することができる。

【0163】

前記得られたＰＰＩの個数（ＰＰＩｃｏｕｎｔ）測定結果を図２ａ（第１タンパク質
および第１タンパク質相互作用タンパク質の種類に応じた結果）、２ｂ（細胞株の種類に
応じた結果）、２ｃ（第１タンパク質および細胞株の種類に応じた結果）、および２ｄ（
第１タンパク質および細胞株の種類に応じた結果）に示した。

【0164】

また、本実施例の試料内タンパク質および試料外タンパク質の間の相互作用の測定結果
に影響を及ぼす要素を確認するために、（ｉ）分析溶解液(extracts)（試料）濃度、およ
び標識物質が付着した第１タンパク質相互作用タンパク質の濃度（concentration）によ
るＰＰＩ強度（strength）（測定された蛍光信号強度）（図３）、（ｉｉ）分析溶解液(e
xtracts)（試料）濃度、および標識物質が付着した第１タンパク質相互作用タンパク質を
含む細胞溶解液に含まれる界面活性剤(Detergent)の種類(class)に応じたＰＰＩｃｏｕ
ｎｔ（図４）および濃度(concentration)に応じたＰＰＩｃｏｕｎｔ（図５）を測定し
た。大体において分析溶解液（試料）濃度および第１タンパク質相互作用タンパク質の濃
度が増加することによりＰＰＩｃｏｕｎｔも増加する傾向を示した。

【0165】

また、第１タンパク質相互作用タンパク質の変異に応じたＰＰＩｃｏｕｎｔを測定し
て図６に示した。

【0166】

実施例２．試料内タンパク質間の相互作用の測定（複合体（Ｃｏｍｐｌｅｘ）の測定）
本実施例では、同じ試料内第１タンパク質と第１相互作用タンパク質の間の相互作用測
定を行った。具体的には、前記相互作用は、分析溶解液内で第１タンパク質と第１タンパ
ク質相互作用タンパク質が結合された状態で存在する第１タンパク質－第１タンパク質相
互作用タンパク質複合体を検出して測定した。本実施例で測定された第１タンパク質－第
１タンパク質相互作用タンパク質の間複合体を下記の表３に例示した：

【0167】

【表3】

【0168】

前記表３に示した図面の結果は、第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク質
のうち、第１タンパク質が基板に固定され、標識された第１タンパク質相互作用タンパク
質結合物質を用いてこれらの間に形成された複合体を測定した結果である。逆に第１タン
パク質相互作用タンパク質が基板に固定され、標識された第１タンパク質結合物質を用い
てこれらの間に形成された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｃｏｕｎｔ、ＰＰＩｃｏｕｎｔ）
を測定することもできる（この場合、第１タンパク質相互作用タンパク質に対する抗体を
プルダウン（ｐｕｌｌｄｏｗｎ）抗体として、第１タンパク質に対する抗体を検出（ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ）抗体として使用する）（図１１）。図７～図１１で確認されるように
、第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク質のうちどれを基板に固定させるか
に関係なく等しい検出効果を得ることができる。

【0169】

前記のような結果は、次のように試料内の第１タンパク質－第１タンパク質相互作用タ
ンパク質の間の相互作用を測定して得られたものである：

【0170】

まず、前記実施例１．１と同一に準備された分析溶解液を、実施例１．３を参照して準
備された基板に供給した。

【0171】

試料内のタンパク質複合体検出のための結合物質として、第１タンパク質相互作用タン
パク質に対する抗体を検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ）として使用し
、前記検出抗体を標識するために、蛍光が標識されたＣｙ３ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＤ
ｏｎｋｅｙＡｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧ（ｊａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒ
ａｃｈ：７１５－１６５－１５１）抗体（二次抗体）を希釈して準備した。

【0172】

前記準備された検出抗体を、前記準備された基板に供給した。検出抗体はウェルに１０
ｕｌずつ入れて室温で１５分間反応させた後、Ｗａｓｈｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（Ｈｅｐｅ
ｓ５０ｍＭＮａｃｌ１５０ｍＭＧｌｙｃｅｒｏｌ１％ＧＤＮ０．０３％）
で残余抗体を洗浄した。その後、蛍光が標識されたＣｙ３ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＤｏ
ｎｋｅｙＡｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧ（ｊａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａ
ｃｈ：７１５－１６５－１５１）抗体を２０００倍希釈してウェル当たり１０ｕｌずつ１
０分間反応させた後、Ｗａｓｈｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（Ｈｅｐｅｓ５０ｍＭＮａｃｌ
１５０ｍＭＧｌｙｃｅｒｏｌ１％ＧＤＮ０．０３％）で残余抗体を洗浄した。
その次にタンパク質相互作用（ｃｏｍｐｌｅｘ）を測定した。測定方法は前記実施例１－
４と同一に実施した。

【0173】

本実施例に使用された結合物質（抗体）情報を下記表４に例示した：

【表4】

【0174】

前記叙述したように、第１タンパク質と第１タンパク質相互作用タンパク質は互いに相
互交換が可能である。また、使用された抗体がモノクローナルの場合、同等なクローンで
あれば他の製造会社の製品も使用可能である。

【0175】

前記抗体リストは本実施例を説明するために例示的に記載しただけであり、本発明の範
囲を制限するものとして解釈されない。

【0176】

本発明で複合体を形成する第１タンパク質または第１タンパク質相互作用タンパク質に
対する抗体、またはタンパク質特異的結合物質の使用について格別な制限は存在しない。
ただし、二つのタンパク質の複合体形成にとって主要であると知られている部位を抗体あ
るいは結合物質の認識部位として使用する場合には複合体検出ができなくなる。一実施形
態で、ＢＡＫと複合体を形成するＢＣＬ２、ＢＣＬ－ＸＬ、ＭＣＬ１を検出するためには
、ＢＡＫのＢＨ３部位を除いた他の部位（例えば、脂質膜を通過しない（膜貫通ドメイン
でない）、ｈｅｌｉｘ１番からｈｅｌｉｘ４番までの部位など）を認識する抗体を使
用した方が良い（図１２）。

【0177】

実施例３．試料内タンパク質発現水準の測定
本実施例では、分析溶解液内に存在する特定タンパク質の量を定量的に測定した。前記
特定タンパク質はＢＣＬ２、ＢＣＬ－ＸＬ、ＭＣＬ１、ＢＡＸ、およびＢＡＫである。

【0178】

これのために、前記実施例１－１と同様の方法で分析溶解液を準備し、実施例１－３と
同様に準備された基板に供給した。その後、前記基板に、実施例２のように準備された標
識された検出抗体（蛍光が標識されたＣｙ３ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＤｏｎｋｅｙＡ
ｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧ（ｊａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ：７１５
－１６５－１５１）抗体で標識される）を添加した。その後、実施例１－４と同様の方法
を行って、蛍光信号測定により分析溶解液内の分析対象タンパク質とその検出抗体の間の
結合を測定した。

【0179】

本実施例で、分析対象タンパク質を基板に固定するための捕獲（ｐｕｌｌｄｏｗｎ）
抗体と検出するための検出（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）抗体は互いに抗原が同一であるが、抗
原の互いに異なる部位に結合するものを選ぶべきである。

【0180】

本実施例に使用された抗体情報を次の表５に例示した：

【表5】

【0181】

前記第１結合物質は基板に固定される抗体であり、第２結合物質は、分析溶解液が注入
された後標的タンパク質検出のために供給される抗体である。このとき、前記第１結合物
質と第２結合物質は互いに変えて使用することが可能である。例えば、第２結合物質を基
板に固定して、分析溶解液、第１結合物質の順に基板に供給しても同様に標的タンパク質
の定量分析が可能である。前記提示された抗体は本発明の範囲を限定しない。ただし、第
１結合物質と第２結合物質の抗原認識部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）は互いに完全に重複するべ
きではない。

【0182】

実施例４．特定折り畳み形態（Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）のタンパ
ク質の測定
本実施例は、タンパク質折り畳み形態によって特異的に認知できる抗体または結合物質
を用いて、検体内に存在する特定折り畳み形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のタンパク
質を検出する方法に適用することができる。一実施形態でタンパク質折り畳み形態の特異
的検出はＢＡＸ、ＢＡＫを含む。

【0183】

従来の発見によれば、ＢＡＸタンパク質は細胞内で多様な折り畳み形態を維持すること
ができる。そのうちＮ－末端に属する約２０個程度のアミノ酸の露出（ｅｘｐｏｓｕｒｅ
）は、ＢＡＸタンパク質が細胞死を起こし得る形態への折り畳み時に発生すると知られて
いる（Yi-Te Hsu et al., J. Bio. Chem. 272, (1997), Michael A. Dengler et al., Ce
ll Rep. 27 (2019)）。またはＢＡＫタンパク質は、ミトコンドリア脂質膜への移動の際
に多様な折り畳み形態変化を起こして細胞死を誘導する（Mark Xiang Li et al., PNAS 1
14 (2017)）。このように特定折り畳み形態でのみ露出する部位を認識できる抗体または
結合物質を用いると前記実施形態を実現することができる。

【0184】

一例として、ＢＡＸタンパク質のＮ－末端を認知するように知られている抗体と、どの
折り畳み形態でも露出する部位を認知する抗体を用いる場合、検体内の細胞死を誘導する
ように活性化された状態のＢＡＸタンパク質を検出することができる。また他の例として
、ＢＡＫタンパク質のＢＨ３部位を選択的に認識する抗体といかなる状態でも露出するＢ
ＡＫ部位を認識する抗体対を用いる場合は、ＢＨ３が露出した折り畳み形態のＢＡＫタン
パク質を検体から検出することができる。下記表６はこのような発明を実現するために使
用された抗体対を提示する。下記抗体は本発明の範囲を限定するものではない。また、モ
ノクローナル抗体の場合は製造会社と関係ない。

【0185】

【表6】

【0186】

前記表で、抗体１は基板の表面に、抗体２は検出のために注入される抗体を意味する。
二つの抗体の役割が変わっても結果は等しい。例えば、抗体２を基板表面に固定し、抗体
１を検出抗体として注入しても等しい効果を期待することができる。

【0187】

前記方法の実現のためには、実施例１で実現したもののように分析溶解液を準備する。

【0188】

本実施例でタンパク質量の定量分析のための測定方法は、実施例２または実施例３で提
示した方法と同様の方法であり得る。例えば、使用される抗体またはタンパク質特異的結
合物質がいずれも同じ抗原または標的タンパク質に結合されるように形成されている。た
だし、二つの抗体あるいはタンパク質特異的結合物質の標的タンパク質結合部位は互いに
異なるべきである。また、抗体を使用する場合、二つの抗体の宿主（ｈｏｓｔ）は当該抗
体に直接的にマーカーが備えられていない限り異なることが推奨される。

【0189】

本実施例は実施例２または３で提案した方法を参照して遂行する。例えば、抗体１、検
体、抗体２の順に注入して特定の折り畳み形態の標的タンパク質を検出することができる
。

【0190】

本実施例の実現のために、人為的に細胞死を誘導して検体を準備することができる。例
えば細胞をＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅで１時間処理して細胞死を誘導したりｖｅｎｅｔ
ｏｃｌａｘで２４時間処理して細胞死を誘導した状態の検体を準備する。この検体を、Ｇ
ＤＮが含まれた溶解液で溶解して分析溶解液(extracts)を作った後、Ｎ－末端が露出した
ＢＡＸを検出すると信号が増加することを確認することができる（図１４）。同じ検体に
ついて、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００が含まれた溶解液で分析溶解液を準備する場合、非イ
オン系の界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ－１００によって強制的にＮ－末端を誘導す
ることができる。この分析溶解液からＮ－末端が露出したＢＡＸを検出する（図１５）。
細胞死が誘導された検体で、ＧＤＮを用いて分析溶解液を準備した後、検出抗体を用いて
Ｎ－末端が露出したＢＡＸを測定する場合は、増加することを見ることができる。反面、
ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を用いて人為的にＮ－末端が露出するようにする場合、細胞死
誘導の有無に関係なく一定の値で示されることを見ることができる。

【0191】

また他の例として、ＡＭＬ細胞であるＨＬ６０やＤＬＢＣＬ細胞であるＯＣＩ－ＬＹ３
をベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）で処理して細胞死を誘導して、ＢＡＸＮ－
末端が露出する比率を測定することができる。１００ｎＭ濃度のベネトクラクス（Ｖｅｎ
ｅｔｏｃｌａｘ）で２、４、８、２４時間処理した後取得された検体について、ＧＤＮが
含まれた溶解液で分析溶解液を準備する。その後ＢＡＸを検出すると、ベネトクラクス（
Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）処理時間によりＢＡＸ検出信号が変わることを確認することがで
きる（図１６）。反面、同じ分析溶解液に最終的に１％濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００
になるように追加で混ぜてＮ－末端露出を誘導した後同じ分析を行う場合、時間によって
ＢＡＸ量の変化が殆どないことを見ることができる。

【0192】

これにより、本発明で提示する折り畳み形態の特異的タンパク質検出方法は、細胞の状
態、例えば細胞死程度の分析に役に立つ指標を提供することができる。

【0193】

実施例５．ＢＣＬ２ファミリータンパク質標的阻害剤処理による細胞内のＢＣＬ２ファミ
リー信号伝達経路変化の測定
本実施例は、ＢＣＬ２ファミリータンパク質の標的阻害剤処理による細胞内の信号伝達
変化を測定できる方法を提供する。より具体的にはＢＣＬ２標的阻害剤であるベネトクラ
クス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）、またはＭＣＬ１標的阻害剤であるＡＺＤ５９９１で処理
しながら、細胞内に存在する多様なＢＣＬ２ファミリータンパク質（例えば、ＢＣＬ２、
ＢＣＬ－ＸＬ、ＭＣＬ１）の試料間のタンパク質相互作用の強度、試料内のタンパク質相
互作用の強度（複合体測定）、タンパク質発現量の変化を包括的に分析できる方法を提供
する。

【0194】

本実施例の実現のために、試料間のタンパク質相互作用の測定は実施例１、試料内のタ
ンパク質複合体の測定は実施例２、発現量変化の測定は実施例３、４と同一であり得る。

【0195】

一例として、細胞を処理する標的阻害剤ベネトクラクス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）また
はＡＺＤ５９９１の濃度は１００ｎＭであり、時間は２４時間であり得る。対照群として
同じ条件でＤＭＳＯで処理したものを準備する。

【0196】

本実施例で分析した内容は下記の表７および表８に整理した：

【0197】

【表7】

【0198】

（前記表７において、
ＢＩＭ＊は、ＢＩＭのうちＢＨ３ドメインのみを切り出したタンパク質にＧＦＰマーカ
ーが備えられた形態であり、
第１タンパク質は、分析溶解液に含まれたタンパク質であり、基板表面に結合されるタ
ンパク質である）

【0199】

【表8】

【0200】

前記表で、複合体を形成する第１タンパク質および第１タンパク質相互作用（結合）タ
ンパク質はいずれも分析溶解液に含まれたタンパク質である。二つのタンパク質のうちど
のタンパク質が基板表面に固定されても結果は等しい。例えば、基板の表面に固定される
抗体は第１タンパク質の抗体であり得、第１タンパク質相互作用（結合）タンパク質の抗
体でもあり得る。

【0201】

一例として、本実施例で提案する方法により、ＢＣＬ２標的阻害剤で処理される前／後
のＢＣＬ２ファミリータンパク質のＰＰＩ強度変化および複合体の形成程度変化を定量的
に測定することができる。これを実現するために、ＨＬ６０またはＯＣＩ－ＬＹ３細胞株
をＤＭＳＯ、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ１００ｎＭ（ＢＣＬ２標的阻害剤）、ＡＭＧ１７６
１００ｎＭ（ＭＣＬ１標的阻害剤）で２４時間処理した後、それぞれの検体から分析溶
解液を生成して、前記提示された指標を測定する。Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘで処理した場合
、ＨＬ６０やＯＣＩ－ＬＹ３のすべてにおいてＢＣＬ２－ＢＡＤＰＰＩ強度が増加するこ
とを確認することができる（図１７）。反面、ＭＣＬ１標的阻害剤であるＡＭＧ１７６で
処理した場合、ＢＣＬ２－ＢＡＤＰＰＩの変化は殆どなかった。これはｖｅｎｅｔｏｃｌ
ａｘ－ＢＣＬ２のみに限定されるものではない。ＭＣＬ１－ＮＯＸＡＰＰＩの場合、ＡＭ
Ｇ１７６で処理したとき選択的に増加することを確認することができる（図１８）。ＢＣ
Ｌ－ＸＬの場合、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ／ＡＭＧ１７６いずれにも反応せず、ＢＣＬ－Ｘ
Ｌ発現量に応じてＰＰＩ強度が変わることにより、ＢＣＬ２、ＭＣＬ１標的阻害剤による
当該タンパク質のＰＰＩ強度が選別的に発生することを確認することができる（図１９、
２０）。

【0202】

また他の例として、ＢＣＬ２標的阻害剤処理による複合体形成変化の測定が挙げられる
。前記ＰＰＩ測定と同一条件下で収集された検体を分析して、ＢＣＬ２ファミリーとＢＩ
Ｍ複合体の形成程度変化（図２１）、ＭＣＬ１－ＮＯＸＡ複合体変化（図２２）、ＢＣＬ
ＸＬ－ＢＡＤ複合体変化（図２３）の測定に用いられる。さらに、ＢＣＬ２－ＢＡＸ複合
体変化（図２４）、ＢＡＸおよびＢＡＫ発現量変化（図２５、図２６）の測定にも適用す
ることができる。

【0203】

本実施例は、使用される標的阻害剤とＢＣＬ２ファミリータンパク質および関連する信
号伝達タンパク質の間の直接的な関係の測定にも使用することができる。これを実現する
ために、第１タンパク質はＢＣＬ２またはＭＣＬ１タンパク質を用いて、第１タンパク質
相互作用タンパク質としてはＢＩＭ－ＧＦＰタンパク質を用いる。基板の表面に第１タン
パク質が固定された状態で、第１タンパク質相互作用タンパク質と共に多様な濃度の標的
阻害剤、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘまたはＡＺＤ５９９１（ＭＣＬ１標的阻害剤）を注入して
ＰＰＩ強度変化の測定にも使用することができる。ＢＣＬ２－ＢＩＭＰＰＩ強度は、ＢＣ
Ｌ２標的阻害剤であるｖｅｎｅｔｏｃｌａｘがある場合にのみ減少し、ＡＺＤ５９９１は
ほとんど影響を及ぼさない（図２７）。反面、ＭＣＬ１が第１タンパク質である場合は、
ＡＺＤ５９９１によってのみＭＣＬ１－ＢＩＭＰＰＩ強度が減少することを見ることがで
きる（図２８）。

【0204】

これをまとめると、本発明で提案する方法により、検体がＢＣＬ２ファミリー標的阻害
剤で処理されたとき現れるＢＣＬ２ファミリータンパク質の特性（ＰＰＩ強度、複合体形
成、発現量など）を定量的に分析することができる。また、ＰＰＩ強度変化は薬物によっ
て直接的に調節される現象であることを確認することができる。結論的に、本発明により
提案される方法は、ＢＣＬ２標的阻害剤処理によるＢＣＬ２ファミリータンパク質の変化
を測定できる方法であり、検体の分子診断技法として用いられることができる。

【0205】

実施例６．実際の患者検体の分析方法
本実施例で例示する方法は、患者（例えば急性骨髄性白血病（ＡｃｕｔｅＭｙｅｌｏ
ｉｄＬｅｕｋｅｍｉａ，ＡＭＬ）または乳癌）から由来した検体でＢＣＬ２ファミリー
タンパク質の特性を測定することである。

【0206】

患者検体間の同等な比較のために、準備された患者検体分析溶解液の全体タンパク質濃
度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ技法、ｌｏｗｒｙ技法、赤外線吸光度などより選ばれた一つ以上
の方法で決定することができる。基板に注入される検体の濃度を一定に維持し、検体間の
定量的な比較を可能にする。ＡＭＬ患者検体としては、患者の血液または骨髄から抽出さ
れた検体を使用することができる。固形癌組織の場合、手術、針生検（ｎｅｅｄｌｅｂ
ｉｏｐｓｙ）などから取得された検体を使用することができる。

【0207】

患者検体は実施例１、２、３に提示されたすべての分析が可能であり、これに限定され
るものではない。これは血液癌、固形癌に拘らずすべて適用することが可能である。

【0208】

一例として、ＡＭＬ血液癌患者３２名から取得された検体を分析してＢＣＬ２ファミリ
ーのＰＰＩ（実施例１参照）、複合体（実施例２参照）、発現量（実施例３参照）を総合
的に分析する方法を提供することができる（図２９）。

【0209】

また他の例として、乳癌患者３０２名から取得された検体を分析して、検体内存在する
ＢＣＬ２タンパク質の発現量を定量的に測定するために使用することができる（図３０）
。

【0210】

また他の例として、肺腺癌（ｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者検体１５
個から、検体内に存在するＢＣＬ２タンパク質の発現量の測定に適用することができる（
図３１）。

【0211】

実施例７．実施例１の相互作用測定と実施例２の複合体測定の比較
本実施例で提案する二つの方法、第１タンパク質相互作用タンパク質を用いるＰＰＩ強
度測定（実施例１）と第１タンパク質結合タンパク質との複合体形成測定（実施例２）は
互いに異なる情報を提供することができる。

【0212】

より具体的には、ＯＣＩ－ＬＹ３細胞培養中にＶｅｎｅｔｏｃｌａｘ１００ｎＭまた
はＡＺＤ５９９１１００ｎＭで処理する方法により、薬物処理前／後のＢＣＬ２ファミ
リータンパク質のＰＰＩ強度および複合体の形成程度の変化を本発明の方法により測定す
ることができる。一例として、ＢＣＬ２－ＢＩＭＰＰＩの場合、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘで
処理された検体で高まる傾向を示すが、ＢＣＬ２－ＢＩＭ複合体は減少すると確認される
（図３２）。また他の例として、ＭＣＬ１－ＮＯＸＡＰＰＩの場合はＡＺＤ５９９１で処
理された検体で高まったが、ＭＣＬ１－ＮＯＸＡ複合体は減少した（図３３）。このよう
な例により、実施例１により具現されるＰＰＩ強度測定と実施例２により具現される複合
体形成測定は根本的に異なる測定値であることがわかる。

【0213】

実施例８．薬物投与を決定するためにＢＣＬ２系タンパク質の相互作用変化観測により患
者状態の追跡をする方法
本実施例で提案する方法により、患者の分子的状態を時系列で追跡する方法を提供する
ことができる。より具体的には、血液癌患者の骨髄または血液検体を時間に応じて採集し
て、相互作用分析によりＢＣＬ２ファミリータンパク質の依存程度および該当標的抗癌剤
処方の有無を決定するのに役に立つ情報を提供することができる。これを実現するために
、患者１において、ｉ）診断当時の骨髄を抽出してＢＣＬ２、ＭＣＬ１、ＢＣＬ－ＸＬと
ＢＩＭ－ＧＦＰの間の相互作用（ＰＰＩ）分析、ｉｉ）ＦＬＴ３標的抗癌剤であるｑｕｉ
ｚａｒｔｉｎｉｂ処方後骨髄を再抽出して同じ分析、ｉｉｉ）前記ｉｉ）段階で取得され
た相互作用（ＰＰＩ）情報に基づいて、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘとＬｏｗ－ｄｏｓｅｃｙ
ｔａｒａｂｉｎｅ（ＬＤＡＣ）を処方した後取得した全血検体で同じ分析を行った（図３
４）。診断当時患者のＢＣＬ２－ＢＩＭＰＰＩは低いためｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ処方根拠
が不足したが、ＦＬＴ３標的阻害剤であるｑｕｉｚａｒｔｉｎｉｂ処方以後、ＢＣＬ２－
ＢＩＭＰＰＩが急激に高まる信号伝達経路再設定（ｓｉｇｎａｌｒｅｗｉｒｉｎｇ）が
発生し、これに基づいてｖｅｎｅｔｏｃｌａｘとＬＤＡＣを併用処方してＢＣＬ２－ＢＩ
ＭＰＰＩが再び低くなることを確認した。また、臨床的所見としてはｑｕｉｚａｒｔｉｎ
ｉｂ処方以後に急激な白血球(WBC)数値上昇が発生したが、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ＋ＬＤ
ＡＣの併用処方以後に再び安定した白血球数値を示して、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘの薬効を
臨床的レベルでも確認することができた。以後、臍帯血抽出幹細胞移植（Ｃｏｒｄｂｌ
ｏｏｄｓｔｅｍｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）により、当該患者は完
全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）を達成することができた。

【0214】

また他の例として、患者２番に対しても患者１と同様の方法で時系列診断を行った（図
３５）。当該患者もＦＬＴ３標的阻害剤処方ではＢＣＬ２ファミリータンパク質の信号伝
達経路を調節できなかったが、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘとＬＤＡＣの併用処方以後にはＢＣ
Ｌ２－ＢＩＭＰＰＩが急激に減少したことを確認することができた。これは、白血球(WBC
)数値検査においても同様にｑｕｉｚａｒｔｉｎｉｂ処方以後に約３倍程白血球数値が増
加したことから、ｑｕｉｚａｒｔｉｎｉｂ処方は臨床的効果がなかったと判断される。

【0215】

実施例９．ＢＣＬ２標的阻害剤反応性予測方法の開発
本実施例で提案される方法により、急性骨髄性白血病（Ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄ
ｌｅｕｋｅｍｉａ）患者の、ＢＣＬ２標的阻害剤ベネトクラクス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ
）に対する感受性を予測することができる。

【0216】

具体的には、実施例６によりＡＭＬ患者から抽出した検体（骨髄または血液）において
、ＢＣＬ２ファミリータンパク質のうち６種に対してＰＰＩ測定（実施例１）、６種に対
して発現量測定（実施例３）および９種に対して複合体測定（実施例２）を行った（下記
表９参照）。

【0217】

【表9】

【0218】

Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ反応性測定のために、患者から分離した検体をそれぞれ０、３０
、１００、３００、１０００ｎＭのｖｅｎｅｔｏｃｌａｘで２４時間処理した後、生きて
いる細胞の量をフローサイトメーターを用いて測定する。残余生存細胞量に対する容量反
応曲線を描いた後、グラフ下部面積（ＡＵＣ，Ａｒｅａｕｎｄｅｒｔｈｅｃｕｒｖ
ｅ）の逆数値を用いて個別患者のｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ反応性を定量する。

【0219】

個別測定値についてのｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ反応性との線形相関関係の分析により、最
も予測力が高い指標を取得することができる（図３６ａ－ｃ）。定量的比較のための線形
相関係数（Ｒ、ｐｅａｒｓｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を
取得する。合計２１個の指標のうちＲ値が０．６５以上で測定されるに値は、ＢＣＬ２－
ＢＡＤＰＰＩ、ＢＣＬ２－ＢＩＭＰＰＩ、ＢＣＬ２発現量およびＢＣＬ２－ＢＡＸ複合体
形成が含まれる（図３６ａ－ｃの四角で表した四つの指標）。前記選ばれた指標は、ｖｅ
ｎｅｔｏｃｌａｘ反応性測定モデル樹立にあたり発明の範囲（例えば予測モデルに含まれ
る指標の種類）を制限するものではない。

【0220】

ＰＰＩと形成された複合体が互いに異なる指標であることを確認するために、ＢＣＬ２
－ＢＩＭＰＰＩとＢＣＬ２－ＢＩＭ複合体の形成程度をそれぞれｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ反
応性と比較することができる（図３７）。ＢＣＬ２－ＢＩＭＰＰＩの場合、ｖｅｎｅｔｏ
ｃｌａｘ反応性とＲ＝０．７４で高い相関関係を示すが、ＢＣＬ２－ＢＩＭ複合体形成は
Ｒ＝０．４１で低い相関係数を示す。これによりＰＰＩ測定と複合体形成の測定は互いに
異なる指標であることを推論することができ、ＰＰＩ測定により高い正確度でｖｅｎｅｔ
ｏｃｌａｘ反応性の予測が可能であることを示す。

【0221】

測定値の結合（組合せ）によって、よりｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ反応性予測の正確度を向
上させることができる。測定値を組み合わせる方法は、多変数線形回帰（ｍｕｌｔｉｐｌ
ｅｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、ロジスティック回帰（ｌｏｇｉｓｔｉｃ
ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、サポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔｖｅｃｔｏｒｍ
ａｃｈｉｎｅ）など多様な方法があり、本発明の実施例では多変数回帰方式を用いたが、
本発明の範囲はこれに制限されるものではない。単一変数（指標）を用いる場合Ｒ＝０．
７５程度が最も高い値であったが、結合される変数の個数(Number of parameters combin
ed)が多くなるほどこれは増加する（図３８ａ）。

【0222】

２１個の変数（指標）を結合する場合、最大２，０９７，１５１個の変数結合が生成さ
れる。最適なモデル探索には生物学的妥当性、数学的妥当性など多様な変数が考慮される
。

【0223】

一例として、単独指標より２以上の指標を組み合わせる場合、より上昇された分析結果
が得られることを示すために、ＢＣＬ２－ＢＡＸまたはＢＣＬ２－ＢＩＭ複合体の形成程
度とｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ反応性との相関関係を図３８ｂの上段に示し、ＢＣＬ２－ＢＡ
ＸまたはＢＣＬ２－ＢＩＭ複合体の形成程度とＢＣＬ２－ＢＡＤＰＰＩを結合した結果と
ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ反応性との相関関係を図３８ｂの下段にそれぞれ示した。図３８ｂ
に示すように、ＢＣＬ２－ＢＡＸまたはＢＣＬ２－ＢＩＭ複合体の形成程度を測定した場
合、Ｒ値がそれぞれ０．６７および０．４１であったことに比べて、ＢＣＬ２－ＢＡＤＰ
ＰＩを結合した場合のＲ値はそれぞれ０．７６および０．７５で、二つの指標を組み合わ
せた場合より改善された薬物反応性予測結果が得られることを確認した。

【0224】

他の例として、合計５個の変数が結合されたモデルを用いる場合、線形相関係数が０．
８５に増加することを確認することができる（図３８ｃ）。このとき含まれる変数は下記
表１０のとおりであり、これは多様な変数の組み合わせのうち最も有意な結果を示す。

【0225】

【表10】

【0226】

実施例１０．ＭＣＬ１標的阻害剤反応性予測方法の実現
実施例９で行ったものと同様に、ＭＣＬ１標的阻害剤に対する反応性予測方法が提供さ
れ得る。一例としてＭＣＬ１標的阻害剤はＡＺＤ５９９１を用いたが、類似の薬物作用機
構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎ）を有する標的阻害剤であれば同等に使用
され得る。使用された薬物の種類は本発明の範囲を制限しない。

【0227】

実施例９のように単一指標に対する線形相関分析を行うことができ、これによりＭＣＬ
１－ＢＩＭＰＰＩ、ＢＣＬＸＬ－ＢＩＭＰＰＩ、ＢＡＸ発現量、ＢＡＫ発現量などがＡＺ
Ｄ５９９１反応性と相関関係があることを確認することができる（図３９ａ－ｃ）。

【0228】

反応性予測の正確度を上昇させるために、実施例９のように多様な変数結合を用いるこ
とができる。一例として下記表１１に示した変数を結合してＡＺＤ５９９１反応性との相
関分析を行うとＲ＝０．７８という値を取得し得（図４０）、これは多様な変数の組み合
わせのうち最も有意な結果を示す。

【0229】

【表11】