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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024025110
(43)【公開日】2024-02-26
(54)【発明の名称】光線力学的療法のための光感受性物質
(51)【国際特許分類】
A61K 31/555 20060101AFI20240216BHJP
C09K 11/06 20060101ALI20240216BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240216BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240216BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20240216BHJP
A61K 31/409 20060101ALI20240216BHJP
【ＦＩ】
A61K31/555
C09K11/06
A61P43/00 105
A61P35/00
A61K47/60
A61K31/409
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022128296
(22)【出願日】2022-08-10
(71)【出願人】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(71)【出願人】
【識別番号】397022911
【氏名又は名称】学校法人甲南学園
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】大谷 亨
(72)【発明者】
【氏名】三好 大輔
(72)【発明者】
【氏名】川内 敬子
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB16
4C076CC27
4C076FF68
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB04
4C086DA31
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA66
4C086NA13
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
【課題】本発明は、アニオン性フタロシアニン（ＡＰＣ）の金属錯体の生体内循環性が改善されている光線力学的療法のための光感受性物質、及び当該光感受性物質を含む光線力学的療法用製剤を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明に係る光線力学的療法のための光感受性物質は、アニオン性フタロシアニン金属錯体、及びポリアルキレングリコール鎖を有するテトラピロール環状化合物を含み、前記アニオン性フタロシアニン金属錯体と前記テトラピロール環状化合物が複合体を形成していることを特徴とする。
【選択図】なし
【解決手段】本発明に係る光線力学的療法のための光感受性物質は、アニオン性フタロシアニン金属錯体、及びポリアルキレングリコール鎖を有するテトラピロール環状化合物を含み、前記アニオン性フタロシアニン金属錯体と前記テトラピロール環状化合物が複合体を形成していることを特徴とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アニオン性フタロシアニン金属錯体、及びポリアルキレングリコール鎖を有するテトラピロール環状化合物を含み、
前記アニオン性フタロシアニン金属錯体と前記テトラピロール環状化合物が複合体を形成していることを特徴とする光線力学的療法のための光感受性物質。
前記アニオン性フタロシアニン金属錯体と前記テトラピロール環状化合物が複合体を形成していることを特徴とする光線力学的療法のための光感受性物質。
【請求項2】
前記ポリアルキレングリコール鎖の重合度が５以上、３００以下である請求項１に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
【請求項3】
前記アニオン性フタロシアニン金属錯体がアニオン性フタロシアニン亜鉛錯体である請求項１に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
【請求項4】
前記アニオン性フタロシアニン金属錯体が有するアニオン性基がスルホン酸基である請求項１に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
【請求項5】
前記テトラピロール環状化合物がポルフィリン骨格を有する請求項１に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
【請求項6】
前記テトラピロール環状化合物に対して２±１倍モルの前記アニオン性フタロシアニン金属錯体を含む請求項１に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
【請求項7】
請求項１～６のいずれかに記載の光線力学的療法のための光感受性物質、及び溶媒を含むことを特徴とする光線力学的療法用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アニオン性フタロシアニン（ＡＰＣ）の金属錯体の生体内循環性が改善されている光線力学的療法のための光感受性物質、及び当該光感受性物質を含む光線力学的療法用製剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
がんに対する標準治療として、手術療法、化学療法、放射線療法が知られている。例えば、手術でがん組織を除去した後、転移したがんに対して化学療法と放射線療法を行ったり、予め化学療法によりがんをある程度小さくしてから、手術でがんを取り除いたり、手術ができない患者には化学療法と放射線療法を合わせてがんの進行を抑える場合がある。
【0003】
しかし、手術療法は侵襲性のために患者に負担を与え、化学療法と放射線療法には副作用により正常細胞にも障害を与えるという問題がある。
【0004】
近年、光線力学的療法（ＰＤＴ：Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ）が注目されている。ＰＤＴとは、腫瘍親和性のある光感受性物質を投与した後、腫瘍組織にレーザー光を照射することにより励起した光感受性物質のエネルギーによって一重項酸素が発生し、更に種々の活性酸素種が発生し、この活性酸素種により腫瘍組織を変性壊死させる選択的治療法である。レーザー光としては正常細胞に影響を与えないものを用い、また活性酸素種の寿命は極めて短いため、光感受性物質の近辺の腫瘍組織にのみ影響を与えるという選択性を有する。
【0005】
光線力学的療法のための光感受性物質としては、様々なものが検討されている。例えば非特許文献１には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化されたポルフィリンのナノ粒子を投与した腫瘍モデルマウスにレーザー光を照射することにより、腫瘍重量が減少したことが記載されている。
【0006】
また、ＲＡＳシグナル伝達経路は細胞のがん化に重要な役割を担い、ＲＡＳタンパク質の一種としてＮＲＡＳが知られているところ、非特許文献２には、亜鉛（ＩＩ）フタロシアニンテトラスルホン酸（ＺｎＡＰＣ）がＮＲＡＳ ｍＲＮＡの四重鎖構造に特異的に結合し、更に光照射することによりＮＲＡＳ ｍＲＮＡが損傷し、ＮＲＡＳの発現が抑制されることが記載されている。
【0007】
但し、ＺｎＡＰＣには低体内循環性という問題がある。具体的には、ＺｎＡＰＣを注射投与すると、血中で凝集して注射部位に留まり、ＮＲＡＳ ｍＲＮＡへの特異的結合性にもかかわらず、腫瘍組織に到達しない。
【0008】
光線力学的療法のための光感受性物質の体内循環性の改善のためのキャリアが種々検討されている。例えば非特許文献３には、ポリ（Ｎ－ビニルカプロラクタム）－ｇ－ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）、及びポリ（Ｎ－ビニル カプロラクタム－ｃｏ－Ｎ－ビニル イミダゾール）－ｇ－ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）というグラフト共重合体からなるミセルが、非特許文献４には、ポリ（エチレングリコール） ブロック ポリスチレンが、光線力学的療法のための光感受性物質のキャリアとして開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｄｒ．Ｌｉａｎｇ Ｃｈｅｎｇら，Ａｄｖ Ｆｕｎｃｔ Ｍａｔｅｒ．，２０１７，２７（３４）
【非特許文献2】Ｋｅｉｋｏ Ｋａｗａｕｃｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１８，９，２２７１
【非特許文献3】Ｈｓｈｉｅｈ－Ｃｈｉｈ Ｔｓａｉら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３３（２０１２），１８２７－１８３７
【非特許文献4】Ｐｅｎｇ Ｚｈａｎｇら，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｂ： Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅ，１９４（２０２０），１１１２０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
上述したように、光線力学的療法のための光感受性物質としてＺｎＡＰＣが開発されている。ＺｎＡＰＣは光照射により活性酸素種を発生して腫瘍細胞を障害するのみならず、ＮＲＡＳ ｍＲＮＡへ特異的に結合して光照射を受けることにより当該ｍＲＮＡを損傷させ、腫瘍細胞の異常増殖に寄与するＮＲＡＳの発現を抑制すると考えられている。
しかしＺｎＡＰＣの生体内循環性は低く、投与されても腫瘍組織に送達できない可能性がある。
光線力学的療法のための光感受性物質を内包するキャリアとして、ポリ乳酸共重合体が開発されているが、光感受性物質の担持率が数％と１０％に至らないことや、担持した光感受性物質が漏出し易いといった問題がある。
そこで本発明は、アニオン性フタロシアニン（ＡＰＣ）の金属錯体の生体内循環性が改善されている光線力学的療法のための光感受性物質、及び当該光感受性物質を含む光線力学的療法用製剤を提供することを目的とする。
しかしＺｎＡＰＣの生体内循環性は低く、投与されても腫瘍組織に送達できない可能性がある。
光線力学的療法のための光感受性物質を内包するキャリアとして、ポリ乳酸共重合体が開発されているが、光感受性物質の担持率が数％と１０％に至らないことや、担持した光感受性物質が漏出し易いといった問題がある。
そこで本発明は、アニオン性フタロシアニン（ＡＰＣ）の金属錯体の生体内循環性が改善されている光線力学的療法のための光感受性物質、及び当該光感受性物質を含む光線力学的療法用製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、アニオン性フタロシアニン金属錯体に加えて特定のテトラピロール環状化合物を併用することにより、アニオン性フタロシアニン金属錯体の生体内循環性が顕著に改善されることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
以下、本発明を示す。
【0012】
［１］ アニオン性フタロシアニン金属錯体、及びポリアルキレングリコール鎖を有するテトラピロール環状化合物を含み、
前記アニオン性フタロシアニン金属錯体と前記テトラピロール環状化合物が複合体を形成していることを特徴とする光線力学的療法のための光感受性物質。
［２］ 前記ポリアルキレングリコール鎖の重合度が５以上、３００以下である前記［１］に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
［３］ 前記アニオン性フタロシアニン金属錯体がアニオン性フタロシアニン亜鉛錯体である前記［１］に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
［４］ 前記アニオン性フタロシアニン金属錯体が有するアニオン性基がスルホン酸基である前記［１］に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
［５］ 前記テトラピロール環状化合物がポルフィリン骨格を有する前記［１］に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
［６］ 前記テトラピロール環状化合物に対して２±１倍モルの前記アニオン性フタロシアニン金属錯体を含む前記［１］に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
［７］ 前記［１］～［６］のいずれかに記載の光線力学的療法のための光感受性物質、及び溶媒を含むことを特徴とする光線力学的療法用製剤。
前記アニオン性フタロシアニン金属錯体と前記テトラピロール環状化合物が複合体を形成していることを特徴とする光線力学的療法のための光感受性物質。
［２］ 前記ポリアルキレングリコール鎖の重合度が５以上、３００以下である前記［１］に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
［３］ 前記アニオン性フタロシアニン金属錯体がアニオン性フタロシアニン亜鉛錯体である前記［１］に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
［４］ 前記アニオン性フタロシアニン金属錯体が有するアニオン性基がスルホン酸基である前記［１］に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
［５］ 前記テトラピロール環状化合物がポルフィリン骨格を有する前記［１］に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
［６］ 前記テトラピロール環状化合物に対して２±１倍モルの前記アニオン性フタロシアニン金属錯体を含む前記［１］に記載の光線力学的療法のための光感受性物質。
［７］ 前記［１］～［６］のいずれかに記載の光線力学的療法のための光感受性物質、及び溶媒を含むことを特徴とする光線力学的療法用製剤。
【発明の効果】
【0013】
本発明に係る光感受性物質に含まれるアニオン性フタロシアニン金属錯体は、光線力学的療法のための光感受性物質として実績がある。また、アニオン性フタロシアニン金属錯体は、細胞のがん化に重要な役割を担うＲＡＳシグナル伝達経路に関与するＲＡＳタンパク質の一種であるＮＲＡＳのｍＲＮＡの四重鎖構造へ特異的に結合することから、光照射によりＮＲＡＳの発現を抑制できると共に、がん細胞の細胞死を誘導できる。更に、アニオン性フタロシアニン金属錯体は、生体内循環性が劣ることが知られているが、本発明に係る光感受性物質では、かかる生体内循環性が改善されている。従って本発明は、患者により少ない負担でがんを治療でいる技術に関するものとして、産業上非常に優れている。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図5】図５（１）は、ＺｎＡＰＣ複合体のみ、又はＺｎＡＰＣ複合体とＮＲＡＳ ＤＮＡを含む溶液のＵＶ－Ｖｉｓ測定結果であり、図５（２）ＮＲＡＳ ＤＮＡ濃度に対する６８０ｎｍでのＺｎＡＰＣの吸光度変化であり、図５（３）は、ＺｎＡＰＣ複合体のみ、又はＺｎＡＰＣ複合体とＮＲＡＳ ＤＮＡを含む溶液の蛍光スペクトルである。
【図6】図６は、ヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ）、ＮＲＡＳ ＤＮＡ、及びＺｎＡＰＣ、ＺｎＡＰＣ複合体またはＴＣＰＰ－ＰＥＧの混合溶液の励起波長４９０ｎｍに対する５１０ｎｍの蛍光強度の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明に係る光線力学的療法のための光感受性物質は、アニオン性フタロシアニン金属錯体、及びポリアルキレングリコール鎖を有するテトラピロール環状化合物を含む。
【0016】
アニオン性フタロシアニン金属錯体は、下記式（Ｉ）で表される。
［式中、Ｘ1～Ｘ4は、独立して、アニオン性基を示し、Ｍｎは第３～１３族金属を示す。］
【化1】
【0017】
アニオン性基としては、スルホン酸基（－ＳＯ3Ｈ）、カルボキシ基（－ＣＯ2Ｈ）、リン酸基（－ＰＯ3Ｈ）、フェノール性水酸基（－ＯＨ）が挙げられ、スルホン酸基および／またはカルボキシ基が好ましく、スルホン酸基がより好ましい。Ｘ1～Ｘ4は、互いに同一であっても異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。また、アニオン性基は塩であってもよく、塩を形成するカチオンとしては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のアルカリ金属イオンが挙げられる。
【0018】
第３～１３族金属は、周期表で第３族元素から第１２族元素の間に存在する遷移金属と第１３族金属であり、例えば、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ａｌが好ましく、Ｚｎがより好ましい。なお、Ａｌなどそのイオンが三価になる金属は、Ａｌ－Ｃｌなど二価ハロゲン化金属の状態でフタロシアニンに配位している可能性がある。
【0019】
アニオン性フタロシアニン金属錯体に含まれるアニオン性フタロシアニン化合物としては、市販されているものがある。また、置換基を有するフタロシアニン化合物には市販されているものがあり、当業者であれば、その置換基をアニオン性基に官能基変換し、更に金属を配位させることができる。
【0020】
テトラピロール環状化合物は、４個のピロリル基を有し、高度に共役したテトラピロール環状構造を有する化合物であれば特に制限されないが、例えば、以下のポルフィリン骨格（ＩＩ）、フタロシアニン骨格（ＩＩＩ）、ポルフィセン骨格（ＩＶ）、コルフィセン骨格（Ｖ）、ヘミポルフィセン骨格（ＶＩ）、コロール骨格（ＶＩＩ）、アザコロール骨格（ＶＩＩＩ）、クロリン骨格（ＩＸ）、又はナフタロシアニン骨格（Ｘ）を有するものが挙げられ、ポルフィリン骨格（ＩＩ）が好ましい。
【0021】
【化2】
【0022】
テトラピロール環状化合物が有するポリアルキレングリコール鎖としては、下記式（ＸＩ1）または（ＸＩ2）の構造のものを挙げることができる。
［式中、Ｒ1～Ｒ3は、独立して、Ｈ（水素原子）またはＣ1-6アルキル基を示し、ｎはポリアルキレングリコール鎖の重合度を示す。］
【化3】
【0023】
本発明において「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル等である。好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2アルキル基であり、最も好ましくはメチルである。Ｒ1およびＲ2としてはＨが好ましく、Ｒ3としてはＣ1-6アルキル基が好ましい。
【0024】
ポリアルキレングリコール鎖の重合度、即ち前記式（ＩＸ1）および（ＩＸ2）中のｎとしては、５以上、３００以下が好ましい。当該重合度が５以上であれば、テトラピロール環状化合物の親水性が十分に高められ、延いてはアニオン性フタロシアニン金属錯体－テトラピロール環状化合物複合体の親水性が十分に高められることによって、アニオン性フタロシアニン金属錯体の生体内循環性がより確実に改善される。一方、当該重合度が３００以下であれば、ポリアルキレングリコール鎖を有するテトラピロール環状化合物の合成も容易である。前記重合度としては、８以上がより好ましく、２０以上、３０以上または４０以上がより更に好ましく、また、２００以下または１００以下がより好ましく、８０以下または６０以下がより更に好ましい。
【0025】
また、ポリアルキレングリコール鎖の分子量としては、例えば、４００以上、２００００以下とすることができる。当該分子量としては、１０００以上が好ましく、１５００以上がより好ましく、また、１５０００以下が好ましく、１００００以下がより好ましい。
【0026】
テトラピロール環状化合物において、ポリアルキレングリコール鎖は、テトラピロール環状構造に直接結合していてもよいが、リンカー基を介して結合していてもよい。リンカー基は、テトラピロール環状化合物の合成を容易にしたり、ポリアルキレングリコール鎖の自由度を高めたりする作用を有する。当該リンカー基としては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｃ1-6アルカンジイル基、Ｃ6-12二価芳香族基、アミノ基（－ＮＨ－）、イミノ基（＞Ｃ＝Ｎ－または－Ｎ＝Ｃ＜）、エーテル基（－Ｏ－）、チオエーテル基（－Ｓ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、チオニル基（－Ｃ（＝Ｓ）－）、エステル基（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－または－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－）、アミド基（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－または－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－）、スルホキシド基（－Ｓ（＝Ｏ）－）、スルホニル基（－Ｓ（＝Ｏ）2－）、スルホニルアミド基（－ＮＨ－Ｓ（＝Ｏ）2－および－Ｓ（＝Ｏ）2－ＮＨ－）、並びにこれら２以上が結合した基を挙げることができる。２以上のこれら基が結合して上記リンカー基が構成されている場合、当該結合数としては、１０以下または５以下が好ましく、３以下がより好ましい。
【0027】
Ｃ6-12二価芳香族基は、炭素数が６以上、１２以下の二価芳香族炭化水素基をいう。例えば、フェニレン、ナフチレン、インデニレン、ビフェニレン等であり、好ましくはフェニレンである。
【0028】
テトラピロール環状化合物におけるポリアルキレングリコール鎖の置換位置は特に制限されず、ピロール環上であってもよいし、ピロール環以外であってもよい。例えばポルフィリン骨格を有するテトラピロール環状化合物の場合、ピロール環の２，３，７，８，１２，１３，１７，１８位であってもよいし、５，１０，１５，２０位であってもよい。ポリアルキレングリコール鎖の数としては、２以上が好ましく、３以上が好ましく、また、１０以下または８以下が好ましく、６以下がより好ましく、４がより更に好ましい。
【0029】
置換基を有するテトラピロール環状化合物には市販されているものがあり、当業者であれば、当該置換基にポリアルキレングリコール鎖またはリンカー基を結合させたり、ポリアルキレングリコール鎖またはリンカー基を導入するための置換基に官能基変換したりすることができる。
【0030】
アニオン性フタロシアニン金属錯体およびテトラピロール環状化合物は、それぞれ１種のみ用いてもよいし、２種以上を併用してもよいが、それぞれ１種のみ用いることが好ましい。
【0031】
本発明に係る光感受性物質は、アニオン性フタロシアニン金属錯体と前記テトラピロール環状化合物との複合体を有効成分とする。例えば、本発明者らの実験的知見によれば、亜鉛（ＩＩ）フタロシアニンテトラスルホン酸（ＺｎＡＰＣ）とＰＥＧ修飾ポルフィリン誘導体（ＴＣＰＰ－ＰＥＧ）は、約１０5Ｍ-1の結合定数で相互作用しているため、アニオン性フタロシアニン金属錯体と前記テトラピロール環状化合物は、溶液または分散液中では複合体を形成していると考えられるが、ＮＲＡＳ ｍＲＮＡなどアニオン性フタロシアニン金属錯体と強く相互作用する物質が存在すると、解離すると考えられる。
【0032】
アニオン性フタロシアニン金属錯体とテトラピロール環状化合物との相互作用は、アニオン性フタロシアニン金属錯体とテトラピロール環状化合物が高度に共役した構造を有するため、π－πスタッキング相互作用であると考えられる。
【0033】
複合体におけるアニオン性フタロシアニン金属錯体とテトラピロール環状化合物との割合は特に制限されないが、例えば、テトラピロール環状化合物に対するアニオン性フタロシアニン金属錯体の割合を０．５倍モル以上、１０倍モル以下とすることができる。当該割合としては、１倍モル以上が好ましく、１．５倍モル以上がより好ましく、また、８倍モル以下が好ましく、５倍モル以下がより好ましく、２±１倍モルがより更に好ましい。
【0034】
本発明に係る光感受性物質は、生体に投与した後、がん組織にレーザー光を照射することにより、がん組織を縮小または消滅させることができる。本発明に係る光感受性物質に含まれるアニオン性フタロシアニン金属錯体は、がん細胞の異常増殖を促進するＮＲＡＳのｍＲＮＡの四重鎖構造へ特異的に結合することから、複合体はがん細胞に送達された後に解離して、アニオン性フタロシアニン金属錯体ＮＲＡＳのｍＲＮＡに結合すると考えられる。次いで、レーザー光の照射により一重項酸素および活性酸素種が生成して、ＮＲＡＳのｍＲＮＡが切断されたり、がん細胞死が誘導される。
【0035】
本発明に係る光線力学的療法用製剤は、例えば、本発明に係る光感受性物質および溶媒を含み、主に注射剤として投与される。溶媒としては水系溶媒が挙げられ、等張または略等張であることが好ましい。具体的には、溶媒としては生理食塩水、緩衝生理食塩水および等張または略等張ブドウ糖水溶液が挙げられる。また、本発明に係る光線力学的療法用製剤は、例えば、経皮吸収製剤であってもよい。
【0036】
本発明に係る光線力学的療法用製剤における複合体の濃度は適宜調整すればよいが、例えば、０．１ｍｇ／ｍＬ以上、１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。また、光線力学的療法の前に、０．１ｍｇ／ｋｇ体重以上、１０ｍｇ／ｋｇ体重以下程度投与すればよい。なお、本発明に係る光線力学的療法用製剤は、用事調製、即ち使用前に複合体を溶媒に溶解または分散して調製してもよい。本発明に係る光線力学的療法用製剤は、静脈投与または皮下投与すればよい。
【0037】
本発明に係る光線力学的療法用製剤の投与後、適時、例えば０．５時間～７２時間後に患者に光を照射し、光線力学的療法を行う。照射する光は、アニオン性フタロシアニン金属錯体を励起できるものであれば特に制限されないが、例えば、６９０ｎｍの波長光含むレーザー光、より好ましくはピーク波長が６９０±５０ｎｍであるレーザー光が挙げられる。レーザーとしては、Ｎｄ－ＹＡＧ（イットリウム・アルミニウム・ガーネット）レーザー、ＣＯ2レーザー、アルゴン・ダイ・レーザー、エキシマ・レーザー等を用いることができる。また、患者の被験体の全身に光を照射してもよいし、患部付近に光を走者してもよいし、光ファイバーを含むカテーテルを血管等を通じて体内に挿入し、光ファイバーを通じて、腫瘍患部に局所的に光を照射してもよい。
【実施例0038】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【0039】
実施例１： ＰＥＧ修飾ポルフィリン誘導体（ＴＣＰＰ－ＰＥＧ）の合成
テトラキス（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ，３５．１ｍｇ，０．０３３ｍｍｏｌ）とα－メチル－ω－アミノプロピルポリオキシエチレン（３１３．２ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ，Ｍｗ＝２０００）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解した。別途、メタノール（５ｍＬ）に溶解した４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルフォリニウム（ＤＭＴ－ＭＭ，６８．２ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を滴下し、２４時間反応させた。反応溶液を減圧濃縮した。得られた反応物をクロロホルムに溶解し、有機相を５ｗｔ％食塩水（５０ｍＬ，２回）と純水（５０ｍＬ，１回）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去した。更に、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝９／１）で精製し、アニスアルデヒドにより呈色するＲｆ＝０．３の画分を回収した。溶媒を減圧留去した後、６０℃にて真空乾燥した。1Ｈ ＮＭＲ（溶媒：クロロホルム）とＦＴ－ＩＲより、得られた茶褐色固体が目的化合物であることを確認した（収量：２３５．７ｍｇ，収率：８１．３％）。
【化4】
【0040】
試験例１： ＺｎＡＰＣとの複合体形成能評価
（１）ＺｎＡＰＣ溶液の蛍光－励起スペクトルの変化
ＺｎＡＰＣを純水に溶解して２μＭ溶液（３ｍＬ）を調製し、得られたＺｎＡＰＣ溶液に対し、ＴＣＰＰ－ＰＥＧの最終濃度が０～４μＭとなるように１ｍＭ ＴＣＰＰ－ＰＥＧ溶液を添加し、ＬＳ ５５ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を使い、蛍光－励起スペクトルを測定した。ＺｎＡＰＣの励起スペクトルは、蛍光波長を６８０ｎｍとして４５０～６５０ｎｍの範囲で、蛍光スペクトルは励起波長を６１０ｎｍとして６２５～７５０ｎｍの範囲で測定した。結果を図１（１）に示す。
図１（１）に示される結果の通り、ＴＣＰＰ－ＰＥＧの濃度増加につれて、ＺｎＡＰＣの蛍光スペクトルと励起スペクトルともに減少し、ＴＣＰＰ－ＰＥＧを０．５等量添加すると、ＺｎＡＰＣの６８０ｎｍの蛍光はほとんど見られなくなった。大環状π電子系化合物はＨ会合体を形成すると蛍光を示さなくなることが知られているため、これらの消光から、溶液中でＴＣＰＰ－ＰＥＧがＺｎＡＰＣとπ－πスタッキング相互作用してＨ会合体を形成したことが考えられる。
（１）ＺｎＡＰＣ溶液の蛍光－励起スペクトルの変化
ＺｎＡＰＣを純水に溶解して２μＭ溶液（３ｍＬ）を調製し、得られたＺｎＡＰＣ溶液に対し、ＴＣＰＰ－ＰＥＧの最終濃度が０～４μＭとなるように１ｍＭ ＴＣＰＰ－ＰＥＧ溶液を添加し、ＬＳ ５５ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を使い、蛍光－励起スペクトルを測定した。ＺｎＡＰＣの励起スペクトルは、蛍光波長を６８０ｎｍとして４５０～６５０ｎｍの範囲で、蛍光スペクトルは励起波長を６１０ｎｍとして６２５～７５０ｎｍの範囲で測定した。結果を図１（１）に示す。
図１（１）に示される結果の通り、ＴＣＰＰ－ＰＥＧの濃度増加につれて、ＺｎＡＰＣの蛍光スペクトルと励起スペクトルともに減少し、ＴＣＰＰ－ＰＥＧを０．５等量添加すると、ＺｎＡＰＣの６８０ｎｍの蛍光はほとんど見られなくなった。大環状π電子系化合物はＨ会合体を形成すると蛍光を示さなくなることが知られているため、これらの消光から、溶液中でＴＣＰＰ－ＰＥＧがＺｎＡＰＣとπ－πスタッキング相互作用してＨ会合体を形成したことが考えられる。
【0041】
（２）ＴＣＰＰ－ＰＥＧ溶液の蛍光－励起スペクトルの変化
また、同様に、ＴＣＰＰ－ＰＥＧを純水に溶解して４μＭ溶液（３ｍＬ）を調製し、得られたＴＣＰＰ－ＰＥＧ溶液に対し、ＺｎＡＰＣの最終濃度が０～１２μＭとなるように１ｍＭ ＺｎＡＰＣを添加し、蛍光－励起スペクトルを測定した。ＴＣＰＰ－ＰＥＧの励起スペクトルは、蛍光波長を６５０ｎｍとして４５０～６００ｎｍの範囲で、蛍光スペクトルは励起波長を５１５ｎｍとして５５０～７５０ｎｍの範囲で測定した。結果を図１（２）に示す。
図１（２）に示される結果の通り、ＴＣＰＰ－ＰＥＧに対してＺｎＡＰＣを添加した場合にも、同様の蛍光の消光が見られ、ＴＣＰＰ－ＰＥＧに３等量のＺｎＡＰＣを添加すると蛍光がほとんど見られなくなった。かかる結果からも、溶液中でＴＣＰＰ－ＰＥＧがＺｎＡＰＣとπ－πスタッキング相互作用してＨ会合体を形成したことが考えられた。
また、同様に、ＴＣＰＰ－ＰＥＧを純水に溶解して４μＭ溶液（３ｍＬ）を調製し、得られたＴＣＰＰ－ＰＥＧ溶液に対し、ＺｎＡＰＣの最終濃度が０～１２μＭとなるように１ｍＭ ＺｎＡＰＣを添加し、蛍光－励起スペクトルを測定した。ＴＣＰＰ－ＰＥＧの励起スペクトルは、蛍光波長を６５０ｎｍとして４５０～６００ｎｍの範囲で、蛍光スペクトルは励起波長を５１５ｎｍとして５５０～７５０ｎｍの範囲で測定した。結果を図１（２）に示す。
図１（２）に示される結果の通り、ＴＣＰＰ－ＰＥＧに対してＺｎＡＰＣを添加した場合にも、同様の蛍光の消光が見られ、ＴＣＰＰ－ＰＥＧに３等量のＺｎＡＰＣを添加すると蛍光がほとんど見られなくなった。かかる結果からも、溶液中でＴＣＰＰ－ＰＥＧがＺｎＡＰＣとπ－πスタッキング相互作用してＨ会合体を形成したことが考えられた。
【0042】
（３）等温滴定型カロリメトリー測定
ＴＣＰＰ－ＰＥＧをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解して１．０ｍＭ溶液を調製し、ＮｉＡＰＣをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解して０．１ｍＭ溶液を調製し、それぞれフィルター（孔径：０．４５μｍ）で濾過した。シリンジにＴＣＰＰ－ＰＥＧ溶液を、セルにＮｉＡＰＣ溶液を入れ、等温滴定型カロリメーター（「Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＩＴＣ２００」Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用い、下記条件で等温滴定型カロリメトリー測定を行った。
Ｔｏｔａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ： １８ｔｉｍｅｓ
Ｓｔｉｒｒｉｎｇ Ｓｐｅｅｄ： ６５０ｒｐｍ
Ｃｅｌｌ ｔｅｍｐ．：２５℃
Ｖｏｌｕｍｅ： ２μＬ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｏｗｅｒ： ５μｃａｌ／ｓｅｃ
Ｄｕｒａｔｉｏｎ： ４ｓｅｃ
Ｉｎｉｔｉａｌ Ｄｅｌａｙ： ６０ｓｅｃ
Ｓｐａｃｉｎｇ： ９０ｓｅｃ
Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｅｒｉｏｄ： ５ｓｅｃ
得られた等温滴定曲線から、結合定数Ｋ［Ｍ-1］と結合数Ｎ［Ｓｉｔｅｓ］を算出した。結果を図２に示す。
ＴＣＰＰ－ＰＥＧをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解して１．０ｍＭ溶液を調製し、ＮｉＡＰＣをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解して０．１ｍＭ溶液を調製し、それぞれフィルター（孔径：０．４５μｍ）で濾過した。シリンジにＴＣＰＰ－ＰＥＧ溶液を、セルにＮｉＡＰＣ溶液を入れ、等温滴定型カロリメーター（「Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＩＴＣ２００」Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用い、下記条件で等温滴定型カロリメトリー測定を行った。
Ｔｏｔａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ： １８ｔｉｍｅｓ
Ｓｔｉｒｒｉｎｇ Ｓｐｅｅｄ： ６５０ｒｐｍ
Ｃｅｌｌ ｔｅｍｐ．：２５℃
Ｖｏｌｕｍｅ： ２μＬ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｏｗｅｒ： ５μｃａｌ／ｓｅｃ
Ｄｕｒａｔｉｏｎ： ４ｓｅｃ
Ｉｎｉｔｉａｌ Ｄｅｌａｙ： ６０ｓｅｃ
Ｓｐａｃｉｎｇ： ９０ｓｅｃ
Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｅｒｉｏｄ： ５ｓｅｃ
得られた等温滴定曲線から、結合定数Ｋ［Ｍ-1］と結合数Ｎ［Ｓｉｔｅｓ］を算出した。結果を図２に示す。
【0043】
図２に示される結果の通り、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中でもＮｉＡＰＣとＴＣＰＰ－ＰＥＧの結合定数は約１０5Ｍ-1の値となり、結合定数に塩が及ぼす影響は見られなかった。また、結合数Ｎが約０．４となったことから、ＮｉＡＰＣ２分子に対し、ＴＣＰＰ－ＰＥＧ１分子が相互作用していることが明らかになった。
以上の結果より、ＴＣＰＰ－ＰＥＧは、生体内条件を想定したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中で、結合定数１０5Ｍ-1の以上の複合体を形成した。血液中では１０4超の結合定数で解離し難いといわれていることから、ＴＣＰＰ－ＰＥＧは生体内で安定してＺｎＡＰＣと複合体を形成し、ＺｎＡＰＣを送達可能であることが示唆された。
以上の結果より、ＴＣＰＰ－ＰＥＧは、生体内条件を想定したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中で、結合定数１０5Ｍ-1の以上の複合体を形成した。血液中では１０4超の結合定数で解離し難いといわれていることから、ＴＣＰＰ－ＰＥＧは生体内で安定してＺｎＡＰＣと複合体を形成し、ＺｎＡＰＣを送達可能であることが示唆された。
【0044】
試験例２： ＴＥＭによる粒径測定
純水中、ＺｎＡＰＣとＴＣＰＰ－ＰＥＧを２：１のモル比で混合し、１μＭ ＺｎＡＰＣ複合体を調製した。調製したサンプル溶液（５μＬ）をＴＥＭグリッドに滴下し、室温にて一晩真空乾燥することでＴＥＭグリッドを乾燥させ、透過型電子顕微鏡（「ＪＥＯＬ ＪＥＭ－１２３０（１００ｋＶ）」日本電子社製）を使って観察した。得られた画像を用い、画像処理ソフトウェア（「ＩｍａｇｅＪ」）で解析した。具体的には、画像内の全ての粒子は真円であると仮定し、１７３個の粒子の面積を求め、直径を算出した。拡大画像を図３に、測定結果を表１に示す。
純水中、ＺｎＡＰＣとＴＣＰＰ－ＰＥＧを２：１のモル比で混合し、１μＭ ＺｎＡＰＣ複合体を調製した。調製したサンプル溶液（５μＬ）をＴＥＭグリッドに滴下し、室温にて一晩真空乾燥することでＴＥＭグリッドを乾燥させ、透過型電子顕微鏡（「ＪＥＯＬ ＪＥＭ－１２３０（１００ｋＶ）」日本電子社製）を使って観察した。得られた画像を用い、画像処理ソフトウェア（「ＩｍａｇｅＪ」）で解析した。具体的には、画像内の全ての粒子は真円であると仮定し、１７３個の粒子の面積を求め、直径を算出した。拡大画像を図３に、測定結果を表１に示す。
【0045】
【表1】
【0046】
図３の通り、直径が６０～１００ｎｍ程度の球形の粒子が観察され、ＺｎＡＰＣとＴＣＰＰ－ＰＥＧが複合体を形成していることが推察された。粒子の凝集は見られないものの、直径が１５０ｎｍ程度の粒子も観察されたことから、比較的多分散な系となっていると考えられた。
粒径５０ｎｍ以上の粒子は、腎臓での糸球体濾過を避けながら生体内を安定に循環できるとされており、また、ＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）に基づいて腫瘍蓄積性を期待できる粒径は５０～２００ｎｍであると考えられているため、本発明に係るＺｎＡＰＣ複合体は、生体内循環性と腫瘍蓄積性に優れたサイズを有する可能性が示唆された。
粒径５０ｎｍ以上の粒子は、腎臓での糸球体濾過を避けながら生体内を安定に循環できるとされており、また、ＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）に基づいて腫瘍蓄積性を期待できる粒径は５０～２００ｎｍであると考えられているため、本発明に係るＺｎＡＰＣ複合体は、生体内循環性と腫瘍蓄積性に優れたサイズを有する可能性が示唆された。
【0047】
試験例３： 細胞取込試験
ガラスボトムディッシュ３５ｍｍ／１４ｍｍに、ヒト子宮頸部がん由来のＨｅＬａ細胞を１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈとなるように播種し、５．０％ＣＯ2下、３７℃で２４時間培養した。培地を交換した後、ＺｎＡＰＣまたはＺｎＡＰＣ複合体の濃度が１０μＭとなるように１００μＭ溶液を細胞に添加した。１時間後と４時間後にそれぞれ培地を除き、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した後、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（１ｍＬ）を添加し、共焦点レーザー顕微鏡を用い、励起波長５９０ｎｍで観察した。結果を図４に示す。なお、ＺｎＡＰＣは６１０ｎｍに最大励起波長を有するので、図４中の青色蛍光部分はＺｎＡＰＣの存在によると考えられる。
ガラスボトムディッシュ３５ｍｍ／１４ｍｍに、ヒト子宮頸部がん由来のＨｅＬａ細胞を１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈとなるように播種し、５．０％ＣＯ2下、３７℃で２４時間培養した。培地を交換した後、ＺｎＡＰＣまたはＺｎＡＰＣ複合体の濃度が１０μＭとなるように１００μＭ溶液を細胞に添加した。１時間後と４時間後にそれぞれ培地を除き、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した後、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（１ｍＬ）を添加し、共焦点レーザー顕微鏡を用い、励起波長５９０ｎｍで観察した。結果を図４に示す。なお、ＺｎＡＰＣは６１０ｎｍに最大励起波長を有するので、図４中の青色蛍光部分はＺｎＡＰＣの存在によると考えられる。
【0048】
図４の通り、ＺｎＡＰＣとＺｎＡＰＣ複合体ともに、１時間後と４時間後の両方で細胞全体に蛍光が観察された。１時間後および４時間後で大きな蛍光強度の違いは観察されなかったことから、ＺｎＡＰＣとＺｎＡＰＣ複合体は、培養１時間で十分に細胞内に取り込まれていると考えられた。
【0049】
試験例４： ＺｎＡＰＣおよびＺｎＡＰＣ複合体のＮＲＡＳ ＤＮＡ結合能評価
（１）ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル測定
ＺｎＡＰＣは、細胞の分化増殖に関与し、がん細胞で異常発現しているＮＲＡＳのＲＮＡが形成する四重鎖構造（Ｇ４）に結合し、光照射により活性酸素種（ＲＯＳ）を産生し、このＧ４構造を含むＮＲＡＳ ＲＮＡを切断して細胞死を導くことができる。本実験では、ＮＲＡＳ ＲＮＡと同様にＮＲＡＳ ＤＮＡもＧ４構造を有するため、ＮＲＡＳ ＲＮＡのモデルとして、同様の塩基配列を有し且つより安定で安価なＮＲＡＳ ＤＮＡを用いて結合能を評価した。
ＮＲＡＳ ＤＮＡ（北海道システム・サイエンス社製）を、９０℃で５分間加熱した後、－０．５℃／ｍｉｎの速度で２５℃までゆっくり冷却することによりアニーリング処理した。緩衝液としてＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸，［ＭＥＳ］－ＬｉＯＨ，ｐＨ７．０，１００ｍＭ ＫＣｌ）中、０μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭの濃度でＮＲＡＳ ＤＮＡと、２μＭの濃度でＺｎＡＰＣまたはＺｎＡＰＣ複合体を含む溶液を調製し、４５０～７５０ｎｍのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを２５℃で測定した。また、同様にＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中で、最終濃度が５０μＭ ＮＲＡＳ ＤＮＡおよび１μＭ ＴＣＰＰ－ＰＥＧとなるように混合溶液（１２０μＬ）を調製し、４００～７５０ｎｍで同様にＵＶ－Ｖｉｓ測定を行った。ＵＶ－Ｖｉｓ測定の結果を図５（１）に、ＮＲＡＳ ＤＮＡ濃度に対する６８０ｎｍでのＺｎＡＰＣの吸光度変化を図５（２）に示す。
得られたスペクトルの６８０ｎｍの吸光度変化をＮＲＡＳ ＤＮＡ［μＭ］に対してプロットし、解離定数Ｋd［μＭ］を算出した。結果を表２に示す。
（１）ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル測定
ＺｎＡＰＣは、細胞の分化増殖に関与し、がん細胞で異常発現しているＮＲＡＳのＲＮＡが形成する四重鎖構造（Ｇ４）に結合し、光照射により活性酸素種（ＲＯＳ）を産生し、このＧ４構造を含むＮＲＡＳ ＲＮＡを切断して細胞死を導くことができる。本実験では、ＮＲＡＳ ＲＮＡと同様にＮＲＡＳ ＤＮＡもＧ４構造を有するため、ＮＲＡＳ ＲＮＡのモデルとして、同様の塩基配列を有し且つより安定で安価なＮＲＡＳ ＤＮＡを用いて結合能を評価した。
ＮＲＡＳ ＤＮＡ（北海道システム・サイエンス社製）を、９０℃で５分間加熱した後、－０．５℃／ｍｉｎの速度で２５℃までゆっくり冷却することによりアニーリング処理した。緩衝液としてＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸，［ＭＥＳ］－ＬｉＯＨ，ｐＨ７．０，１００ｍＭ ＫＣｌ）中、０μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭの濃度でＮＲＡＳ ＤＮＡと、２μＭの濃度でＺｎＡＰＣまたはＺｎＡＰＣ複合体を含む溶液を調製し、４５０～７５０ｎｍのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを２５℃で測定した。また、同様にＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中で、最終濃度が５０μＭ ＮＲＡＳ ＤＮＡおよび１μＭ ＴＣＰＰ－ＰＥＧとなるように混合溶液（１２０μＬ）を調製し、４００～７５０ｎｍで同様にＵＶ－Ｖｉｓ測定を行った。ＵＶ－Ｖｉｓ測定の結果を図５（１）に、ＮＲＡＳ ＤＮＡ濃度に対する６８０ｎｍでのＺｎＡＰＣの吸光度変化を図５（２）に示す。
得られたスペクトルの６８０ｎｍの吸光度変化をＮＲＡＳ ＤＮＡ［μＭ］に対してプロットし、解離定数Ｋd［μＭ］を算出した。結果を表２に示す。
【0050】
【表2】
【0051】
ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、ＺｎＡＰＣ複合体とＮＲＡＳ ＤＮＡを含む溶液のＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを図５（１）に示す。ＮＲＡＳ ＤＮＡを含まないＺｎＡＰＣ溶液は６３０ｎｍに吸収ピークを示すが、ＮＲＡＳ ＤＮＡの濃度上昇に伴って６３０ｎｍのブロードな吸収が減少し、６８０ｎｍの吸収が増加し、ＮＲＡＳ ＤＮＡを１００μＭ添加すると６３０ｎｍの吸収ピークは見られなくなった。ＺｎＡＰＣのモノマーは６８０ｎｍに鋭い吸収ピークを示すことが知られていることから、ＺｎＡＰＣ複合体は、ＮＲＡＳ ＤＮＡの存在により解離して、ＺｎＡＰＣモノマーがＮＲＡＳ ＤＮＡに結合したと考えられた。
ＮＲＡＳ ＤＮＡ濃度に対する６８０ｎｍでのＺｎＡＰＣの吸光度変化を図５（２）に示す。かかるプロットより、ＮＲＡＳ ＤＮＡとＺｎＡＰＣ複合体の解離定数Ｋdは１２．６μＭと推定された。また、ＮＲＡＳ ＤＮＡとＺｎＡＰＣの解離定数Ｋdは１１．４μＭと推定された。ＮＲＡＳ ＤＮＡおよびＺｎＡＰＣ複合体の解離定数と、ＮＲＡＳ ＤＮＡおよびＺｎＡＰＣの解離定数の差が約１μＭであることから、ＴＣＰＰ－ＰＥＧとの複合化によるＺｎＡＰＣのＮＲＡＳ ＤＮＡへの結合の阻害は僅かであることが示された。
細胞内にはＤＮＡよりＲＮＡが豊富に存在することを考慮すると、細胞にＺｎＡＰＣ複合体を添加した場合、細胞内のＮＲＡＳ ＲＮＡにＺｎＡＰＣが結合する可能性が示唆された。
ＮＲＡＳ ＤＮＡ濃度に対する６８０ｎｍでのＺｎＡＰＣの吸光度変化を図５（２）に示す。かかるプロットより、ＮＲＡＳ ＤＮＡとＺｎＡＰＣ複合体の解離定数Ｋdは１２．６μＭと推定された。また、ＮＲＡＳ ＤＮＡとＺｎＡＰＣの解離定数Ｋdは１１．４μＭと推定された。ＮＲＡＳ ＤＮＡおよびＺｎＡＰＣ複合体の解離定数と、ＮＲＡＳ ＤＮＡおよびＺｎＡＰＣの解離定数の差が約１μＭであることから、ＴＣＰＰ－ＰＥＧとの複合化によるＺｎＡＰＣのＮＲＡＳ ＤＮＡへの結合の阻害は僅かであることが示された。
細胞内にはＤＮＡよりＲＮＡが豊富に存在することを考慮すると、細胞にＺｎＡＰＣ複合体を添加した場合、細胞内のＮＲＡＳ ＲＮＡにＺｎＡＰＣが結合する可能性が示唆された。
【0052】
（２）蛍光スペクトル測定
ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、２μＭ ＺｎＡＰＣ複合体と、０、５０μＭ ＮＲＡＳ ＤＮＡの混合溶液（１２０μＬ）を調製し、励起波長６１０ｎｍにて、６２０～７５０ｎｍの蛍光スペクトルを２５℃で測定した。結果を図５（３）に示す。
図５（３）に示される結果の通り、ＮＲＡＳ ＤＮＡ添加前は励起波長６１０ｎｍにて蛍光は観察されなかった。ＺｎＡＰＣがＴＣＰＰ－ＰＥＧとπ－πスタッキング相互作用により複合体を形成しているため、蛍光が消光したと考えられる。
一方、５０μＭ ＮＲＡＳ ＤＮＡを添加すると、６９０ｎｍに蛍光が観察された。ＺｎＡＰＣが単量体化すると６９０ｎｍ蛍光を示すため、蛍光の発現から、ＺｎＡＰＣ複合体が解離してＮＲＡＳ ＤＮＡとＺｎＡＰＣが結合したと考えられる。
ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、２μＭ ＺｎＡＰＣ複合体と、０、５０μＭ ＮＲＡＳ ＤＮＡの混合溶液（１２０μＬ）を調製し、励起波長６１０ｎｍにて、６２０～７５０ｎｍの蛍光スペクトルを２５℃で測定した。結果を図５（３）に示す。
図５（３）に示される結果の通り、ＮＲＡＳ ＤＮＡ添加前は励起波長６１０ｎｍにて蛍光は観察されなかった。ＺｎＡＰＣがＴＣＰＰ－ＰＥＧとπ－πスタッキング相互作用により複合体を形成しているため、蛍光が消光したと考えられる。
一方、５０μＭ ＮＲＡＳ ＤＮＡを添加すると、６９０ｎｍに蛍光が観察された。ＺｎＡＰＣが単量体化すると６９０ｎｍ蛍光を示すため、蛍光の発現から、ＺｎＡＰＣ複合体が解離してＮＲＡＳ ＤＮＡとＺｎＡＰＣが結合したと考えられる。
【0053】
試験例５： 活性酸素種（ＲＯＳ）産生能評価
ヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ）は、ＲＯＳの一種であるヒドロキシラジカル（・ＯＨ）およびパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ-）と反応してフルオレセインを生成し、励起波長４９０ｎｍにて蛍光（Ｅｍ：５１０ｎｍ）を示す。そこで、ＮＲＡＳ ＤＮＡ、ＨＰＦ、及びＺｎＡＰＣ、ＺｎＡＰＣ複合体またはＴＣＰＰ－ＰＥＧを含む混合溶液にＬＥＤ照射し、蛍光測定した。
ヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ）は、ＲＯＳの一種であるヒドロキシラジカル（・ＯＨ）およびパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ-）と反応してフルオレセインを生成し、励起波長４９０ｎｍにて蛍光（Ｅｍ：５１０ｎｍ）を示す。そこで、ＮＲＡＳ ＤＮＡ、ＨＰＦ、及びＺｎＡＰＣ、ＺｎＡＰＣ複合体またはＴＣＰＰ－ＰＥＧを含む混合溶液にＬＥＤ照射し、蛍光測定した。
【0054】
【化5】
【0055】
５０ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ中、１μＭ ＨＰＦ、５０μＭ ＮＲＡＳ ＤＮＡ、及び２μＭ ＺｎＡＰＣ、ＺｎＡＰＣ複合体またはＴＣＰＰ－ＰＥＧの混合溶液（１００μＬ）を調製した。当該溶液に赤色ＬＥＤ光（ピーク波長： ６３０ｎｍ）を照射し、光照射開始から０、０．５、１、３、１０、３０、６０、９０、１２０分後に、励起波長４９０ｎｍにて５００～６００ｎｍの蛍光スペクトルを測定した。５１０ｎｍの蛍光強度の経時的変化を図６に示す。
【0056】
図６に示される結果の通り、Ｂｌａｎｋ溶液に２時間ＬＥＤの照射を行っても蛍光の増加は見られず、Ｂｌａｎｋ溶液に対する光の照射でＲＯＳの発生やＨＰＦの分解が発生しないことを確認した。ＴＣＰＰ－ＰＥＧ存在下において、５１０ｎｍの蛍光強度の増加がわずかに認められたが、その強度は低かった。
２μＭ ＺｎＡＰＣにＬＥＤ光を照射すると、５１０ｎｍの蛍光強度の増加が見られた。このことからＺｎＡＰＣが光増感能を有し、ＮＲＡＳ ＤＮＡが含まれる水溶液中でＲＯＳを産生できることが示された。
同様にＺｎＡＰＣ複合体に対しＬＥＤ光を照射した場合にも、５１０ｎｍの蛍光強度の増加が見られた。
ＺｎＡＰＣとＺｎＡＰＣ複合体を比較すると、光照射開始から３０分以降についてＺｎＡＰＣ複合体溶液はＺｎＡＰＣ溶液と比較して蛍光強度が低かった。この理由として、複合体においてＺｎＡＰＣがＴＣＰＰ－ＰＥＧと相互作用しているため、ＬＥＤにより励起されにくくなり、光増感能が低下した可能性と、ＺｎＡＰＣの励起により発生したヒドロキシラジカルが、ＨＰＦだけでなくＴＣＰＰ－ＰＥＧの分解も引き起こし、ＨＰＦの分解速度が低下した可能性が考えられる。
２μＭ ＺｎＡＰＣにＬＥＤ光を照射すると、５１０ｎｍの蛍光強度の増加が見られた。このことからＺｎＡＰＣが光増感能を有し、ＮＲＡＳ ＤＮＡが含まれる水溶液中でＲＯＳを産生できることが示された。
同様にＺｎＡＰＣ複合体に対しＬＥＤ光を照射した場合にも、５１０ｎｍの蛍光強度の増加が見られた。
ＺｎＡＰＣとＺｎＡＰＣ複合体を比較すると、光照射開始から３０分以降についてＺｎＡＰＣ複合体溶液はＺｎＡＰＣ溶液と比較して蛍光強度が低かった。この理由として、複合体においてＺｎＡＰＣがＴＣＰＰ－ＰＥＧと相互作用しているため、ＬＥＤにより励起されにくくなり、光増感能が低下した可能性と、ＺｎＡＰＣの励起により発生したヒドロキシラジカルが、ＨＰＦだけでなくＴＣＰＰ－ＰＥＧの分解も引き起こし、ＨＰＦの分解速度が低下した可能性が考えられる。
【0057】
試験例６： アポトーシス誘導性試験
ヒト乳がん由来ＭＣＦ－７細胞を、５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように、９６ｗｅｌｌプレート２枚に播種し、２４時間培養した。ＺｎＡＰＣ、ＴＣＰＰ－ＰＥＧ、又はＺｎＡＰＣ複合体をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ，ｐＨ７．４）に溶解して１０ｍＭ溶液をそれぞれ調製し、各最終濃度が１０μＭとなるように１０μＬずつ加え、更に１時間培養した。培地をアスピレータにより除去し、Ｄ－ＰＢＳで１回洗浄することで、取り込まれていない試料を除いた。フェノールレッド不含ＤＭＥＭ（ＦＢＳ不含，１％ＰＳ溶液）に培地を交換した。１枚の９６ｗｅｌｌプレートに対して、３７℃にてＬＥＤ光（最大発光波長：６３０ｎｍ）を２時間照射した。光照射しないプレートは、３７℃にて２時間静置した。生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社製）を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ加えて２時間培養し、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。測定は試料毎に６例行い、生細胞数の平均を算出した。各細胞の実体顕微鏡写真を図７に、生細胞数を図８に示す。図８中、「＊＊」は、光照射した場合において、Ｂｌａｎｋ（光照射無し）に対してｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
ヒト乳がん由来ＭＣＦ－７細胞を、５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように、９６ｗｅｌｌプレート２枚に播種し、２４時間培養した。ＺｎＡＰＣ、ＴＣＰＰ－ＰＥＧ、又はＺｎＡＰＣ複合体をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ，ｐＨ７．４）に溶解して１０ｍＭ溶液をそれぞれ調製し、各最終濃度が１０μＭとなるように１０μＬずつ加え、更に１時間培養した。培地をアスピレータにより除去し、Ｄ－ＰＢＳで１回洗浄することで、取り込まれていない試料を除いた。フェノールレッド不含ＤＭＥＭ（ＦＢＳ不含，１％ＰＳ溶液）に培地を交換した。１枚の９６ｗｅｌｌプレートに対して、３７℃にてＬＥＤ光（最大発光波長：６３０ｎｍ）を２時間照射した。光照射しないプレートは、３７℃にて２時間静置した。生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社製）を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ加えて２時間培養し、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。測定は試料毎に６例行い、生細胞数の平均を算出した。各細胞の実体顕微鏡写真を図７に、生細胞数を図８に示す。図８中、「＊＊」は、光照射した場合において、Ｂｌａｎｋ（光照射無し）に対してｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
【0058】
図７の通り、光照射しない場合とＢｌａｎｋでは、細胞の収縮や光損傷は見られなかった。
一方、ＺｎＡＰＣ、ＴＣＰＰ－ＰＥＧ、及びＺｎＡＰＣ複合体を添加し且つ光照射した場合には、アポトーシスが誘導された細胞のように細胞が収縮して丸くなった。
試料を添加した場合にのみ細胞の収縮が認められたため、ＺｎＡＰＣおよびＴＣＰＰ－ＰＥＧの両方が光増感作用を示し、これらに光照射することでＲＯＳが発生して細胞にダメージが与えられたと考えられる。
一方、ＺｎＡＰＣ、ＴＣＰＰ－ＰＥＧ、及びＺｎＡＰＣ複合体を添加し且つ光照射した場合には、アポトーシスが誘導された細胞のように細胞が収縮して丸くなった。
試料を添加した場合にのみ細胞の収縮が認められたため、ＺｎＡＰＣおよびＴＣＰＰ－ＰＥＧの両方が光増感作用を示し、これらに光照射することでＲＯＳが発生して細胞にダメージが与えられたと考えられる。
【0059】
図８の通り、それぞれの試料の添加のみ、また光照射のみの細胞に対して有意な毒性は見られなかった。
一方、試料の添加と光照射した細胞については、全てのサンプルについて有意に細胞毒性が見られた。ＺｎＡＰＣおよびＺｎＡＰＣ複合体を取り込んだ細胞に対し光照射すると、ＺｎＡＰＣが有する光増感能により、細胞内にてＲＯＳが産生すると考えられる。この産生したＲＯＳにより細胞死が誘導された可能性が示唆された。
また、キャリアであるＴＣＰＰ－ＰＥＧのみを添加した細胞についても、光照射により細胞毒性が見られた。ＴＣＰＰ－ＰＥＧ構造内のポルフィリンも光増感能を有する化合物であることが知られているため、赤色ＬＥＤ光によりポルフィリンも励起され、ＲＯＳを産生したことが考えられる。試料添加から１時間細胞培養し、取り込まれていない試料を洗浄してから光照射しているため、細胞外でＲＯＳ産生が生じることはないと考えられる。
一方、試料の添加と光照射した細胞については、全てのサンプルについて有意に細胞毒性が見られた。ＺｎＡＰＣおよびＺｎＡＰＣ複合体を取り込んだ細胞に対し光照射すると、ＺｎＡＰＣが有する光増感能により、細胞内にてＲＯＳが産生すると考えられる。この産生したＲＯＳにより細胞死が誘導された可能性が示唆された。
また、キャリアであるＴＣＰＰ－ＰＥＧのみを添加した細胞についても、光照射により細胞毒性が見られた。ＴＣＰＰ－ＰＥＧ構造内のポルフィリンも光増感能を有する化合物であることが知られているため、赤色ＬＥＤ光によりポルフィリンも励起され、ＲＯＳを産生したことが考えられる。試料添加から１時間細胞培養し、取り込まれていない試料を洗浄してから光照射しているため、細胞外でＲＯＳ産生が生じることはないと考えられる。
【0060】
以上の結果より、ＺｎＡＰＣ、ＺｎＡＰＣ複合体、ＴＣＰＰ－ＰＥＧは細胞内に１時間の培養で取り込まれ、キャリアの有無に関わらず、光照射により細胞死の誘導が可能であることが示された。また、光照射によりＲＯＳが産生され、細胞に損傷を与えることで細胞死を誘導することが示唆された。
【0061】
試験例７： ＮＲＡＳおよびＮＲＡＳ ＲＮＡ発現評価
（１）ウェスタンブロッティングによるＮＲＡＳ発現評価
ヒト乳がん由来ＭＣＦ－７細胞を１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの割合で６ｃｍ ｄｉｓｈに播種し、２４時間培養した後、培地を除去し、ＣＯ2 ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍを３ｍＬずつｄｉｓｈに加えることにより培地を交換した。１μＭの濃度となるようＤＭＳＯに溶解したアクチノマイシンＤを加えた。更に、１０μＭの濃度となるようにＺｎＡＰＣを、又は５μＭの濃度となるようＴＣＰＰ－ＰＥＧもしくはＺｎＡＰＣ複合体を細胞に添加し、３７℃で１時間培養した。その後、３７℃恒温室にて、一部の細胞に赤色ＬＥＤ光を２時間照射した。光照射後、細胞の様子を実体顕微鏡で観察し、更に３７℃にて５時間培養した。
培地を遠沈管に取り、１分間遠心分離した後に沈殿を回収した。また、細胞をＰＢＳ（１ｍＬ）で繰り返し洗浄した後、ＰＢＳを除去し、ｄｉｓｈにＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（１００μＬ）を加え、セルスクレーパーを用いて細胞を回収し、遠沈管の沈殿と合わせて細胞懸濁液とした。氷浴中で冷却しながら回収した細胞懸濁液を超音波処理し、１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、上澄を全て回収した。９６ ｗｅｌｌプレートに回収した細胞溶解液（２μＬ）、Ｈ2Ｏ（１０μＬ）、及びＢＣＡ ａｓｓａｙ溶液（２００μＬ）を添加し、紫外可視分光光度計を用いて５６２ｎｍの吸光度を測定した。得られた結果から、予め作成したＢＣＡ検量線に基づいて、タンパク質を定量した。
タンパク質含有量が２０μｇまたは５０μｇとなるように、細胞溶解液、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、試料ｂｕｆｆｅｒを混合した。タンパク質含量２０μｇの混合液と、タンパク質含量５０μｇの混合液に試料ｂｕｆｆｅｒを加え、総量をそれぞれ１５μＬと２０μＬに調整した。次いで、各混合液を９６℃で５分間加熱することにより、酵素を変性させた。
予め作成した１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルと１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに、プロテインスタンダード溶液と、それぞれタンパク質５０μｇ混合液とタンパク質２０μｇ混合液をロードし、３００Ｖ、９０ｍＭで４５分間電気泳動した。ゲルを取り出し、Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒで湿らせた濾紙上にメンブレンとゲルを重ねて置き、１２Ｖ、０．５３Ａで２５分間、タンパク質をメンブレンへ転写した。メンブレンをＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、５％Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ（３０ｍＬ）中で１時間ブロッキングした。スタンダードタンパク質を参照し、１５％ゲルのメンブレンから３７ｋＤａ付近、１０％ゲルのメンブレンから２０ｋＤａの部分を切り出した。ＮＲａｓ １次抗体溶液（１／１００，１ｍＬ）、β－ａｃｔｉｎ １次抗体溶液（１／１０００，２ｍＬ）中にメンブレンを浸し、２時間静置した。同様にＴＢＳＴ溶液で洗浄し、２次抗体溶液（１／１００００，５％ＢＳＡ，３ｍＬ）中で静置した後、ＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。次いで、ＥＣＬ染色を行い、Ｘ線フィルムを用いてタンパク質を観察した。結果を図９に示す。
（１）ウェスタンブロッティングによるＮＲＡＳ発現評価
ヒト乳がん由来ＭＣＦ－７細胞を１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの割合で６ｃｍ ｄｉｓｈに播種し、２４時間培養した後、培地を除去し、ＣＯ2 ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍを３ｍＬずつｄｉｓｈに加えることにより培地を交換した。１μＭの濃度となるようＤＭＳＯに溶解したアクチノマイシンＤを加えた。更に、１０μＭの濃度となるようにＺｎＡＰＣを、又は５μＭの濃度となるようＴＣＰＰ－ＰＥＧもしくはＺｎＡＰＣ複合体を細胞に添加し、３７℃で１時間培養した。その後、３７℃恒温室にて、一部の細胞に赤色ＬＥＤ光を２時間照射した。光照射後、細胞の様子を実体顕微鏡で観察し、更に３７℃にて５時間培養した。
培地を遠沈管に取り、１分間遠心分離した後に沈殿を回収した。また、細胞をＰＢＳ（１ｍＬ）で繰り返し洗浄した後、ＰＢＳを除去し、ｄｉｓｈにＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（１００μＬ）を加え、セルスクレーパーを用いて細胞を回収し、遠沈管の沈殿と合わせて細胞懸濁液とした。氷浴中で冷却しながら回収した細胞懸濁液を超音波処理し、１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、上澄を全て回収した。９６ ｗｅｌｌプレートに回収した細胞溶解液（２μＬ）、Ｈ2Ｏ（１０μＬ）、及びＢＣＡ ａｓｓａｙ溶液（２００μＬ）を添加し、紫外可視分光光度計を用いて５６２ｎｍの吸光度を測定した。得られた結果から、予め作成したＢＣＡ検量線に基づいて、タンパク質を定量した。
タンパク質含有量が２０μｇまたは５０μｇとなるように、細胞溶解液、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、試料ｂｕｆｆｅｒを混合した。タンパク質含量２０μｇの混合液と、タンパク質含量５０μｇの混合液に試料ｂｕｆｆｅｒを加え、総量をそれぞれ１５μＬと２０μＬに調整した。次いで、各混合液を９６℃で５分間加熱することにより、酵素を変性させた。
予め作成した１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルと１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに、プロテインスタンダード溶液と、それぞれタンパク質５０μｇ混合液とタンパク質２０μｇ混合液をロードし、３００Ｖ、９０ｍＭで４５分間電気泳動した。ゲルを取り出し、Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒで湿らせた濾紙上にメンブレンとゲルを重ねて置き、１２Ｖ、０．５３Ａで２５分間、タンパク質をメンブレンへ転写した。メンブレンをＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、５％Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ（３０ｍＬ）中で１時間ブロッキングした。スタンダードタンパク質を参照し、１５％ゲルのメンブレンから３７ｋＤａ付近、１０％ゲルのメンブレンから２０ｋＤａの部分を切り出した。ＮＲａｓ １次抗体溶液（１／１００，１ｍＬ）、β－ａｃｔｉｎ １次抗体溶液（１／１０００，２ｍＬ）中にメンブレンを浸し、２時間静置した。同様にＴＢＳＴ溶液で洗浄し、２次抗体溶液（１／１００００，５％ＢＳＡ，３ｍＬ）中で静置した後、ＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。次いで、ＥＣＬ染色を行い、Ｘ線フィルムを用いてタンパク質を観察した。結果を図９に示す。
【0062】
図９に示される結果の通り、試料の有無および光照射の有無に関わらず、β－アクチンの発現量に変化は見られなかった。光照射なしの場合は、光照射なしのＢｌａｎｋとＮＲＡＳのバンドが同様の濃さであるため、ＮＲＡＳの発現量に変化は無いと判断された。試験例４などの結果より、細胞にＺｎＡＰＣおよびＺｎＡＰＣ複合体を添加すると、細胞内でＺｎＡＰＣがＮＲＡＳ ＲＮＡと結合すると考えられるが、ＮＲＡＳの発現に影響が見られないことから、ＺｎＡＰＣとＮＲＡＳ ＲＮＡの結合はＮＲＡＳの発現に影響を与えないことが示された。
ＺｎＡＰＣおよびＺｎＡＰＣ複合体を添加して光照射を行った細胞のＮＲＡＳ発現量を見ると、光照射なしのＢｌａｎｋと比較してＮＲＡＳを示すバンドが薄くなった。光照射によりＺｎＡＰＣが光増感能を示し、ＮＲＡＳ ＲＮＡに光損傷を与えたことでＮＲＡＳ発現を抑制した可能性が考えられる。ＴＣＰＰ－ＰＥＧ存在下であっても、ＺｎＡＰＣは光照射によってＮＲＡＳの発現が抑制できることが明らかとなった。一方でＴＣＰＰ－ＰＥＧのみを添加し、光照射を行った細胞については、ＮＲＡＳ発現の抑制はほとんど見られなかった。光照射時の細胞毒性の結果から、ＴＣＰＰ－ＰＥＧも細胞に対し光損傷をもたらすと推察されるが、ＴＣＰＰ－ＰＥＧはＮＲＡＳ ＲＮＡと結合しないため、ＮＲＡＳ ＲＮＡに損傷を与えることはできず、発現に変化が見られなかったと考えられる。
この結果より、ＮＲＡＳ発現を効果的に抑制するには、ＺｎＡＰＣがＮＲＡＳ ＲＮＡに結合し、ＮＲＡＳ ＲＮＡに対し特異的に損傷を与える必要があると言える。
ＺｎＡＰＣおよびＺｎＡＰＣ複合体を添加して光照射を行った細胞のＮＲＡＳ発現量を見ると、光照射なしのＢｌａｎｋと比較してＮＲＡＳを示すバンドが薄くなった。光照射によりＺｎＡＰＣが光増感能を示し、ＮＲＡＳ ＲＮＡに光損傷を与えたことでＮＲＡＳ発現を抑制した可能性が考えられる。ＴＣＰＰ－ＰＥＧ存在下であっても、ＺｎＡＰＣは光照射によってＮＲＡＳの発現が抑制できることが明らかとなった。一方でＴＣＰＰ－ＰＥＧのみを添加し、光照射を行った細胞については、ＮＲＡＳ発現の抑制はほとんど見られなかった。光照射時の細胞毒性の結果から、ＴＣＰＰ－ＰＥＧも細胞に対し光損傷をもたらすと推察されるが、ＴＣＰＰ－ＰＥＧはＮＲＡＳ ＲＮＡと結合しないため、ＮＲＡＳ ＲＮＡに損傷を与えることはできず、発現に変化が見られなかったと考えられる。
この結果より、ＮＲＡＳ発現を効果的に抑制するには、ＺｎＡＰＣがＮＲＡＳ ＲＮＡに結合し、ＮＲＡＳ ＲＮＡに対し特異的に損傷を与える必要があると言える。
【0063】
（２）ｑＲＴ－ＰＣＲによるＮＲＡＳ発現評価
ＭＣＦ－７細胞の播種割合を１．４×１０6ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈに変更した以外は（１）と同様にして、ＬＥＤ光照射までを行った。
ＲＮＡの抽出にはＲＮＡ抽出キット（「ＩＳＯＳＰＩＮ Ｃｅｌｌ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ＲＮＡ ｋｉｔ」ニッポンジーン社製）を用いた。培地を遠沈管に取り、１分間遠心分離したのち沈殿を回収した。細胞をＤ－ＰＢＳ（１ｍＬ）で洗浄し、同様に遠心分離の後に沈殿を回収した。ｄｉｓｈ内の細胞にＣ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（６００μＬ）を加え、細胞を溶解した。遠沈管内の沈殿と合わせて細胞溶解液とし、ボルテックスミキサーを使って３０秒間撹拌した。その後、１３，０００×ｇで１分間遠心分離し、上清をマイクロチューブに全て回収した。上清に等量となるＰＴ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（６００μＬ）を加え、数回転倒混和した。
メンブレンにＲＮＡを吸着させるため、混合溶液（６００μＬ）をＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに添加し、１３，０００×ｇで１分間遠心分離した。濾液を除き、残りの混合溶液にも同様の操作を行った。更に、Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎにＰＴ Ｗａｓｈ １ Ｂｕｆｆｅｒ（５００μＬ）を添加し、１３，０００×ｇで１分間遠心分離し、濾液を除いた。また、ＤＮａｓｅ Ｉ Ｂｕｆｆｅｒ（１００μＬ）をｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに添加し、１５分間静置した。ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎにＰＴ Ｗａｓｈ １ Ｂｕｆｆｅｒ（３００μＬ）を添加し、１３，０００×ｇで１分間遠心分離し、濾液を除いた。更にＰＴ Ｗａｓｈ ２ Ｂｕｆｆｅｒ（６００μＬ）をｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに添加し、１３，０００×ｇで２分間遠心分離して洗浄した。Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに新しいエッペンチューブをセットし、ｄｄＷａｔｅｒ（５０μＬ）をメンブレン中央に滴下した後、３分間室温で静置した後、１３，０００×ｇで１分間遠心分離し、ＲＮＡ溶液を回収した。
超微量分光光度計（「Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ」Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、ＲＮＡ溶液の吸光度（２３０ｎｍ）を計測することで、溶液中のＲＮＡ量を定量した。
定量したＲＮＡ量から、ＲＮＡ量が２μｇとなるように、ＲＮＡ溶液と逆転写溶液を混合し、ｄｄＷａｔｅｒを加えて総量を１０μＬに調整した。ＰＣＲサーマルサイクラー（「ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ」Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、得られた溶液を３７℃で３０分逆転写反応に付した。その後、８５℃で５秒間加熱することにより逆転写反応を終結させ、４℃まで冷却した。
得られたｃＤＮＡ溶液（１μＬ）とｑＲＴ－ＰＣＲプライマー溶液（９μＬ）をｑＲＴ－ＰＣＲプレートに加え、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ｑＲＴ－ＰＣＲは、９５℃にて１分間加熱したのち、９５℃で１５秒間および５５℃で１分間の加熱を４０サイクル繰り返すことで行った。なお、ＮＲＡＳ ＲＮＡのｈｏｕｓｅ ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅとしてＢ２Ｍを用いた。ＮＲＡＳ ＲＮＡの相対的発現量を図１０に示す。図１０中、「＊」は、光照射した場合において、Ｂｌａｎｋ（光照射無し）に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
ＭＣＦ－７細胞の播種割合を１．４×１０6ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈに変更した以外は（１）と同様にして、ＬＥＤ光照射までを行った。
ＲＮＡの抽出にはＲＮＡ抽出キット（「ＩＳＯＳＰＩＮ Ｃｅｌｌ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ＲＮＡ ｋｉｔ」ニッポンジーン社製）を用いた。培地を遠沈管に取り、１分間遠心分離したのち沈殿を回収した。細胞をＤ－ＰＢＳ（１ｍＬ）で洗浄し、同様に遠心分離の後に沈殿を回収した。ｄｉｓｈ内の細胞にＣ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（６００μＬ）を加え、細胞を溶解した。遠沈管内の沈殿と合わせて細胞溶解液とし、ボルテックスミキサーを使って３０秒間撹拌した。その後、１３，０００×ｇで１分間遠心分離し、上清をマイクロチューブに全て回収した。上清に等量となるＰＴ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（６００μＬ）を加え、数回転倒混和した。
メンブレンにＲＮＡを吸着させるため、混合溶液（６００μＬ）をＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに添加し、１３，０００×ｇで１分間遠心分離した。濾液を除き、残りの混合溶液にも同様の操作を行った。更に、Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎにＰＴ Ｗａｓｈ １ Ｂｕｆｆｅｒ（５００μＬ）を添加し、１３，０００×ｇで１分間遠心分離し、濾液を除いた。また、ＤＮａｓｅ Ｉ Ｂｕｆｆｅｒ（１００μＬ）をｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに添加し、１５分間静置した。ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎにＰＴ Ｗａｓｈ １ Ｂｕｆｆｅｒ（３００μＬ）を添加し、１３，０００×ｇで１分間遠心分離し、濾液を除いた。更にＰＴ Ｗａｓｈ ２ Ｂｕｆｆｅｒ（６００μＬ）をｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに添加し、１３，０００×ｇで２分間遠心分離して洗浄した。Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに新しいエッペンチューブをセットし、ｄｄＷａｔｅｒ（５０μＬ）をメンブレン中央に滴下した後、３分間室温で静置した後、１３，０００×ｇで１分間遠心分離し、ＲＮＡ溶液を回収した。
超微量分光光度計（「Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ」Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、ＲＮＡ溶液の吸光度（２３０ｎｍ）を計測することで、溶液中のＲＮＡ量を定量した。
定量したＲＮＡ量から、ＲＮＡ量が２μｇとなるように、ＲＮＡ溶液と逆転写溶液を混合し、ｄｄＷａｔｅｒを加えて総量を１０μＬに調整した。ＰＣＲサーマルサイクラー（「ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ」Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、得られた溶液を３７℃で３０分逆転写反応に付した。その後、８５℃で５秒間加熱することにより逆転写反応を終結させ、４℃まで冷却した。
得られたｃＤＮＡ溶液（１μＬ）とｑＲＴ－ＰＣＲプライマー溶液（９μＬ）をｑＲＴ－ＰＣＲプレートに加え、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ｑＲＴ－ＰＣＲは、９５℃にて１分間加熱したのち、９５℃で１５秒間および５５℃で１分間の加熱を４０サイクル繰り返すことで行った。なお、ＮＲＡＳ ＲＮＡのｈｏｕｓｅ ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅとしてＢ２Ｍを用いた。ＮＲＡＳ ＲＮＡの相対的発現量を図１０に示す。図１０中、「＊」は、光照射した場合において、Ｂｌａｎｋ（光照射無し）に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
【0064】
図１０に示される結果の通り、試料の添加のみ、及び光照射のみの細胞においては、ＮＲＡＳ ＲＮＡの発現量に変化はなかった。ＺｎＡＰＣおよびＺｎＡＰＣ複合体存在下で光照射を行った細胞では、ＮＲＡＳ ＲＮＡの減少が見られた。この結果は、ＺｎＡＰＣが光照射によりＲＯＳを産生し、ＮＲＡＳ ＲＮＡを切断したためであると考えられ、図９の結果を裏付ける結果が得られた。
ＴＣＰＰ－ＰＥＧのみを添加し光照射した細胞について、図９の結果ではＮＲＡＳの発現に変化は見られなかったのに対し、ＮＲＡＳ ＲＮＡは有意に減少した。ＮＲＡＳ ＲＮＡが切断された場合、それに伴ってＮＲＡＳの発現は低下すると考えられるため、予想と反する結果が得られたが、ＴＣＰＰ－ＰＥＧもＺｎＡＰＣと同様に光照射によってＲＯＳを産生すると考えられるため、ＲＯＳにより細胞内の一部のＮＲＡＳ ＲＮＡが切断される可能性も十分に考えられる。
ＴＣＰＰ－ＰＥＧのみを添加し光照射した細胞について、図９の結果ではＮＲＡＳの発現に変化は見られなかったのに対し、ＮＲＡＳ ＲＮＡは有意に減少した。ＮＲＡＳ ＲＮＡが切断された場合、それに伴ってＮＲＡＳの発現は低下すると考えられるため、予想と反する結果が得られたが、ＴＣＰＰ－ＰＥＧもＺｎＡＰＣと同様に光照射によってＲＯＳを産生すると考えられるため、ＲＯＳにより細胞内の一部のＮＲＡＳ ＲＮＡが切断される可能性も十分に考えられる。
【0065】
試験例８： ＺｎＡＰＣ複合体の生体内循環性評価
（１）リンパ節への蓄積性評価
ＺｎＡＰＣをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解させてマウスに尾静脈投与すると、投与部で凝集することが課題であった。そこで、ＺｎＡＰＣ複合体の生体内循環性を評価した。
ＺｎＡＰＣをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解して、５μｇ／μＬ溶液を調製した。また、同じ濃度のＺｎＡＰＣに対して０．５モル等量のＴＣＰＰ－ＰＥＧを混合し、２：１複合体溶液を調製した。マウスの右脚にＰＢＳ、ＺｎＡＰＣ溶液、ＺｎＡＰＣ複合体溶液をそれぞれ２０μＬ（５ｍｇ／ｋｇ体重）皮下投与した（ＰＢＳ：Ｎ＝１，ＺｎＡＰＣおよびＺｎＡＰＣ複合体：Ｎ＝２）。投与から５分後、麻酔下にて右脚付け根のリンパ節を回収し、重量を測定した。
１５ｍＬ遠沈菅内でリンパ節に濃硝酸（８００μＬ）を添加し、ホットドライバスで８０℃にて１２時間加熱することで酸処理した。濃塩酸と濃硝酸を３：１で混合して王水を調製し、酸処理溶液に２００μＬ加え、更に８０℃にて２時間加熱した。２％硝酸を加えて総量を３ｍＬに調整した。この溶液をＩＣＰ発光分光分析法で分析し、Ｚｎを定量した。結果を図１１に示す。
（１）リンパ節への蓄積性評価
ＺｎＡＰＣをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解させてマウスに尾静脈投与すると、投与部で凝集することが課題であった。そこで、ＺｎＡＰＣ複合体の生体内循環性を評価した。
ＺｎＡＰＣをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解して、５μｇ／μＬ溶液を調製した。また、同じ濃度のＺｎＡＰＣに対して０．５モル等量のＴＣＰＰ－ＰＥＧを混合し、２：１複合体溶液を調製した。マウスの右脚にＰＢＳ、ＺｎＡＰＣ溶液、ＺｎＡＰＣ複合体溶液をそれぞれ２０μＬ（５ｍｇ／ｋｇ体重）皮下投与した（ＰＢＳ：Ｎ＝１，ＺｎＡＰＣおよびＺｎＡＰＣ複合体：Ｎ＝２）。投与から５分後、麻酔下にて右脚付け根のリンパ節を回収し、重量を測定した。
１５ｍＬ遠沈菅内でリンパ節に濃硝酸（８００μＬ）を添加し、ホットドライバスで８０℃にて１２時間加熱することで酸処理した。濃塩酸と濃硝酸を３：１で混合して王水を調製し、酸処理溶液に２００μＬ加え、更に８０℃にて２時間加熱した。２％硝酸を加えて総量を３ｍＬに調整した。この溶液をＩＣＰ発光分光分析法で分析し、Ｚｎを定量した。結果を図１１に示す。
【0066】
図１１に示される結果の通り、ＰＢＳのみの投与したマウスについても、リンパ節重量［ｇ］あたり約０．０３ｍｇのＺｎの蓄積が見られた。その理由としては、Ｚｎが主に酵素などの構成要素として、生体内に含まれるためであると考えられる。
ＺｎＡＰＣをＰＢＳに溶解して投与すると、リンパ節重量あたり０．０５６ｍｇのＺｎ蓄積が見られた。ＺｎＡＰＣは生体内循環性に乏しいものの、水溶液中で沈殿を生じない程度の水溶性を有しているため、投与のうち一部のＺｎＡＰＣがリンパ節に蓄積できたと考えられる。
ＺｎＡＰＣ複合体を投与した場合、０．０７６ｍｇ／ｇのＺｎの蓄積が見られ、ＺｎＡＰＣのみの投与と比較してＺｎ蓄積量が増加した。
ＺｎＡＰＣとＺｎＡＰＣ複合体について、投与したＺｎ相当量は同じであるため、ＺｎＡＰＣ複合体とすることでＺｎＡＰＣの生体内循環性が向上したといえる。よって、ＺｎＡＰＣのキャリアとしてＴＣＰＰ－ＰＥＧを用いることで、ＺｎＡＰＣをより安定に投与部から生体内で循環させ、腫瘍部への蓄積量を向上させることができる可能性が示唆された。
ＺｎＡＰＣをＰＢＳに溶解して投与すると、リンパ節重量あたり０．０５６ｍｇのＺｎ蓄積が見られた。ＺｎＡＰＣは生体内循環性に乏しいものの、水溶液中で沈殿を生じない程度の水溶性を有しているため、投与のうち一部のＺｎＡＰＣがリンパ節に蓄積できたと考えられる。
ＺｎＡＰＣ複合体を投与した場合、０．０７６ｍｇ／ｇのＺｎの蓄積が見られ、ＺｎＡＰＣのみの投与と比較してＺｎ蓄積量が増加した。
ＺｎＡＰＣとＺｎＡＰＣ複合体について、投与したＺｎ相当量は同じであるため、ＺｎＡＰＣ複合体とすることでＺｎＡＰＣの生体内循環性が向上したといえる。よって、ＺｎＡＰＣのキャリアとしてＴＣＰＰ－ＰＥＧを用いることで、ＺｎＡＰＣをより安定に投与部から生体内で循環させ、腫瘍部への蓄積量を向上させることができる可能性が示唆された。
【0067】
（２）腎臓への蓄積性評価
Ｚｎが生体内微量元素として補酵素などに含まれることから、生体内由来元素の影響を避けるために、本実験ではＺｎＡＰＣのモデル化合物としてＮｉＡＰＣを用いた。
ＮｉＡＰＣをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解して、５μｇ／μＬ溶液を調製した。また、同じ濃度のＮｉＡＰＣに対して０．５モル等量のＴＣＰＰ－ＰＥＧを混合し、２：１複合体溶液を調製した。７週齢のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウス（日本クレア社より入手）９匹を任意に３匹ずつ３群に分け、ＰＢＳ、ＮｉＡＰＣ溶液、又はＮｉＡＰＣ複合体溶液をそれぞれ５０μＬ（５ｍｇ／ｋｇ体重）尾静脈投与した。投与から３０分後、イソフルラン麻酔下にて血液を回収し、続いて心臓、肺、肝臓、腎臓、及び脾臓を摘出し、重量を測定した。
１５ｍＬ遠沈菅内で血液と各臓器に濃硝酸（８００μＬ）を添加し、ホットドライバスで８０℃にて２１時間加熱することで酸処理した。濃塩酸と濃硝酸を３：１で混合して王水を調製し、酸処理溶液に２００μＬ加え、更に８０℃にて３時間加熱した。２％硝酸を加えて総量を５ｍＬに調整した。脂肪など不溶性浮遊物が見られた溶液は、フィルター（水系，孔径：０．４５μｍ）を使って濾過した。この溶液をＩＣＰ発光分光分析法で分析し、Ｚｎを定量した。代表的に腎臓の結果を図１２に示す。
Ｚｎが生体内微量元素として補酵素などに含まれることから、生体内由来元素の影響を避けるために、本実験ではＺｎＡＰＣのモデル化合物としてＮｉＡＰＣを用いた。
ＮｉＡＰＣをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解して、５μｇ／μＬ溶液を調製した。また、同じ濃度のＮｉＡＰＣに対して０．５モル等量のＴＣＰＰ－ＰＥＧを混合し、２：１複合体溶液を調製した。７週齢のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウス（日本クレア社より入手）９匹を任意に３匹ずつ３群に分け、ＰＢＳ、ＮｉＡＰＣ溶液、又はＮｉＡＰＣ複合体溶液をそれぞれ５０μＬ（５ｍｇ／ｋｇ体重）尾静脈投与した。投与から３０分後、イソフルラン麻酔下にて血液を回収し、続いて心臓、肺、肝臓、腎臓、及び脾臓を摘出し、重量を測定した。
１５ｍＬ遠沈菅内で血液と各臓器に濃硝酸（８００μＬ）を添加し、ホットドライバスで８０℃にて２１時間加熱することで酸処理した。濃塩酸と濃硝酸を３：１で混合して王水を調製し、酸処理溶液に２００μＬ加え、更に８０℃にて３時間加熱した。２％硝酸を加えて総量を５ｍＬに調整した。脂肪など不溶性浮遊物が見られた溶液は、フィルター（水系，孔径：０．４５μｍ）を使って濾過した。この溶液をＩＣＰ発光分光分析法で分析し、Ｚｎを定量した。代表的に腎臓の結果を図１２に示す。
【0068】
図１２に示される結果の通り、ＰＢＳのみの投与したマウスには、腎臓重量［ｇ］あたり０．１μｇ以下とほとんどＮｉの分布は見られず、本実験では生体内元素の影響を排除できたことが示された。
ＮｉＡＰＣをＰＢＳに溶解して静脈投与すると、血液および各臓器にＮｉ蓄積が見られた。ＮｉＡＰＣは生体内循環性に乏しいものの、水溶液中で沈殿を生じない程度の水溶性を有しているため、投与のうち一部のＮｉＡＰＣが生体内を循環し、各臓器に分布したと考えられる。
ＮｉＡＰＣ複合体を投与した場合、ＮｉＡＰＣのみの投与と比較して、摘出した全ての臓器および血液にてＮｉ量が増加した。ＮｉＡＰＣとＮｉＡＰＣ複合体について、投与したＮｉ相当量は同じであるため、キャリアと混合し複合体とすることでＮｉＡＰＣの循環速度が増加したといえる。投与から３０分後に臓器を摘出したため体外に排泄される前であると考えられ、本実験から生体内滞留性や蓄積性を考察することは難しいが、試験例２の結果から複合体が約１００ｎｍ以下の粒子を形成していることも考慮すると、ＮｉＡＰＣ複合体とすることで糸球体ろ過を避けながら安定に循環でき、循環性、滞留性ともに向上していることが期待できる。
よって、ＺｎＡＰＣのキャリアとしてＴＣＰＰ－ＰＥＧを用いることで、ＺｎＡＰＣをより安定に生体内で循環させ、腫瘍部への蓄積量を向上させることができる可能性が示唆された。
ＮｉＡＰＣをＰＢＳに溶解して静脈投与すると、血液および各臓器にＮｉ蓄積が見られた。ＮｉＡＰＣは生体内循環性に乏しいものの、水溶液中で沈殿を生じない程度の水溶性を有しているため、投与のうち一部のＮｉＡＰＣが生体内を循環し、各臓器に分布したと考えられる。
ＮｉＡＰＣ複合体を投与した場合、ＮｉＡＰＣのみの投与と比較して、摘出した全ての臓器および血液にてＮｉ量が増加した。ＮｉＡＰＣとＮｉＡＰＣ複合体について、投与したＮｉ相当量は同じであるため、キャリアと混合し複合体とすることでＮｉＡＰＣの循環速度が増加したといえる。投与から３０分後に臓器を摘出したため体外に排泄される前であると考えられ、本実験から生体内滞留性や蓄積性を考察することは難しいが、試験例２の結果から複合体が約１００ｎｍ以下の粒子を形成していることも考慮すると、ＮｉＡＰＣ複合体とすることで糸球体ろ過を避けながら安定に循環でき、循環性、滞留性ともに向上していることが期待できる。
よって、ＺｎＡＰＣのキャリアとしてＴＣＰＰ－ＰＥＧを用いることで、ＺｎＡＰＣをより安定に生体内で循環させ、腫瘍部への蓄積量を向上させることができる可能性が示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】