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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024002576
(43)【公開日】2024-01-11
(54)【発明の名称】基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物
(51)【国際特許分類】
A01K 67/027 20240101AFI20231228BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20231228BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20231228BHJP
【ＦＩ】
A01K67/027
G01N33/15 Z
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022101848
(22)【出願日】2022-06-24
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （その１） 発行日 ２０２２年１月２０日 刊行物 第１０回日本プロテインホスファターゼ研究会 学術集会 抄録ＰＤＦ （その２） 開催日 ２０２２年１月２１日から２０２２年１月２２日 集会名、開催場所 第１０回日本プロテインホスファターゼ研究会 学術集会（オンライン開催） （その３） 開催日 ２０２２年３月８日 集会名、開催場所 第５回徳島大学統合的がん創薬研究クラスター合同ミーティング（オンライン開催） （その４） ウェブサイトの掲載日 ２０２１年９月２８日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｎｇｒｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｃａ２０２１／ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｎｇｒｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｃａ２０２１／ｊｐ／ａｂｓ＿ａｐｐ／ （その５） 開催日 ２０２１年９月３０日から２０２１年１０月２日（オンデマンド配信：２０２１年１０月１８日から２０２１年１１月１２日） 集会名、開催場所 第８０回日本癌学会学術総会 パシフィコ横浜（神奈川県横浜市西区みなとみらい１－１－１）、ライブ配信及びオンデマンド配信 （その６） ウェブサイトの掲載日 ２０２１年１０月２５日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ａｅｐｌａｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｂｓ２０２１／ｏｕｔｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ （その７） ウェブサイトの掲載日 ２０２１年１０月２５日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ａｅｐｌａｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｂｓ２０２１／ｐｒｏｇｒａｍ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ａｅｐｌａｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｂｓ２０２１／ｐｒｏｇｒａｍ．ｈｔｍｌ＃１Ｓ０４ａ （その８） 発行日 ２０２１年１０月２５日 刊行物 第９４回日本生化学会大会 プログラム集 （その９） 開催日 ２０２１年１１月３日から２０２１年１１月５日 集会名、開催場所 第９４回日本生化学会大会（Ｗｅｂ開催） （その１０） ウェブサイトの掲載日 ２０２２年４月２２日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｊａｃｐ．ｉｎｆｏ／ ｈｔｔｐｓ：／／ｊａｃｐ．ｉｎｆｏ／ｒｅｐｏｒｔ／ ｈｔｔｐｓ：／／ｊａｃｐ．ｉｎｆｏ／ｗｐ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０２２／０４／Ｎｏ．１０９．ｐｄｆ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構「次世代がん医療創生研究事業」「癌抑制遺伝子を標的とする癌治療法の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 聡
(72)【発明者】
【氏名】西尾 美希
(72)【発明者】
【氏名】曽山 弘敏
(72)【発明者】
【氏名】前濱 朝彦
(57)【要約】
【課題】基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の提供。
【解決手段】内因性のＴＡＺを活性化する工程を含む、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
【選択図】なし
【解決手段】内因性のＴＡＺを活性化する工程を含む、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
内因性のＴＡＺを活性化する工程を含む、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項2】
内因性のＴＡＺを活性化する工程が、
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、個体を出生させる工程を含む、請求項１に記載の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、個体を出生させる工程を含む、請求項１に記載の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項3】
胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステムが、プロゲステロン受容体遺伝子の発現依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムである、請求項２に記載の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項4】
内因性のＴＡＺを活性化する工程が、
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物において、
前記任意にノックアウトできるシステムにより、Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程を含み、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムであり、
前記Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程が、タモキシフェンを全身投与する工程を含む、請求項１に記載の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物において、
前記任意にノックアウトできるシステムにより、Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程を含み、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムであり、
前記Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程が、タモキシフェンを全身投与する工程を含む、請求項１に記載の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれかに記載の方法で作製された基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物に被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
被験物質が適用された基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項6】
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、出生した個体に対して、
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該個体の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該個体の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項7】
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物であり、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムである、非ヒト哺乳動物に対して、
タモキシフェンを全身投与する工程、
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムである、非ヒト哺乳動物に対して、
タモキシフェンを全身投与する工程、
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項8】
内腔細胞特異的にＭｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項9】
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物、当該動物の作製方法、及び当該動物を用いた底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
乳癌は、部位別癌罹患者数第１位で、日本では毎年１０万人近くの女性が罹患する。乳癌にはエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＨＥＲ２受容体のいずれかが陽性の乳癌と、これら３つの受容体を全くもたないトリプルネガティブ乳癌がある。これらの受容体があると、ホルモン療法や抗体療法などの分子標的療法で癌を抑制することができるが、トリプルネガティブ乳癌は、これらの受容体をもたないため、有効な分子標的療法がなく、特にトリプルネガティブの最多を占める基底細胞様乳癌は最も予後不良で治療抵抗性である。
【0003】
乳管は、乳汁を分泌して輸送する内腔細胞と、それを取り巻く基底細胞からなる。基底細胞様乳癌は、基底細胞の性質をもっていることから名づけられたが、この癌の起源は、基底細胞でなく内腔細胞由来であることが分かっている。しかし、内腔細胞起源の癌が、どのようにして基底細胞様の性質を獲得するかは不明であった。また、基底細胞様乳癌でＴＰ５３遺伝子の変異が多いことから、これが基底細胞乳癌の鍵分子と考えられたが、ＴＰ５３遺伝子を変異したマウスはなかなか基底細胞様乳癌ができず、他の鍵分子の存在が想定されるものの、その詳細は不明であった。
【0004】
ところで、ヒッポシグナル伝達系（Ｈｉｐｐｏ Ｐａｔｈｗａｙ）は、哺乳動物においては、ＭＳＴ、ＳＡＶ、ＭＯＢ、及びＬＡＴＳの４遺伝子をコアコンポーネントとする腫瘍抑制系のＰａｔｈｗａｙであり、ＹＡＰ１／ＴＡＺの機能を抑制する働きを有する。ＹＡＰ１／ＴＡＺは転写共役因子として、腫瘍促進に対し正にはたらく遺伝子（腫瘍促進遺伝子）である（例えば非特許文献１等を参照）。
【0005】
ＭＯＢには７つの相同分子があるが、このうちＭＯＢ１ＡとＭＯＢ１Ｂの２つのみがＬＡＴＳと結合できる。ＬＡＴＳは単独ではＹＡＰ１／ＴＡＺに対するそのキナーゼ活性は弱いものの、ＭＯＢ１Ａ／Ｂが結合することによって非常に強いキナーゼ活性を獲得し、ＹＡＰ１／ＴＡＺを抑制する。また、ＭＯＢ１ＡとＭＯＢ１Ｂとは相同性が極めて高く、互いにその機能を代償するため、いずれか一方をノックアウトするのみではＭＯＢの活性は消失しない。なお、ＭＯＢ１Ａ／ＭＯＢ１Ｂを二重に完全欠損（ホモ欠損）するマウスを作製したところ着床直後に致死（胎生致死）となったが、ＭＯＢ１Ｂのみをノックアウトしたところ正常な発達・発育を認めたことが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０２０／０１３１１３号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Bin Zhao et al, Nature Cell Biology, 13, 877-883 (2011)
【非特許文献2】Nishio M, et al. (2012) Cancer susceptibility and embryonic lethality in Mob1a/1b double-mutant mice. J Clin Invest 122(12):4505-4518.
【非特許文献3】Soyal SM, et al. (2005) Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis 41(2):58-66.
【非特許文献4】Srinivas S et al, BMC Dev Biol. 2001;1:4.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本開示は、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、ＴＡＺを活性化すること（より具体的には、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的に、又は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒ卜哺乳乳動物を利用すること）により、上記課題を解決できる可能性を見出し、さらに改良を重ねた。
【0010】
本開示は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
内因性のＴＡＺを活性化する工程を含む、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項２．
内因性のＴＡＺを活性化する工程が、
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、個体を出生させる工程を含む、項１に記載の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項２－１．
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方及びＴＰ５３遺伝子は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、個体を出生させる工程を含む、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項３．
胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステムが、プロゲステロン受容体遺伝子の発現依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムである、項２に記載の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項４．
内因性のＴＡＺを活性化する工程が、
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物において、
前記任意にノックアウトできるシステムにより、Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程を含み、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムであり、
前記Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程が、タモキシフェンを全身投与する工程を含む、項１に記載の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項４－１．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方及びＴＰ５３遺伝子は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物において、
前記任意にノックアウトできるシステムにより、Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子及びＴＰ５３遺伝子をノックアウ卜する工程を含み、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムであり、
前記Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子及びＴＰ５３遺伝子をノックアウ卜する工程が、タモキシフェンを全身投与する工程を含む、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項４－２．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方及びＴＰ５３遺伝子は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物において、
前記任意にノックアウトできるシステムにより、Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程を含み、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムであり、
前記Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程が、タモキシフェンを全身投与する工程を含む、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項５．
項１～４のいずれかに記載の方法で作製された基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物に被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
項６．
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、出生した個体に対して、
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該個体の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
項６－１．
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方及びＴＰ５３遺伝子は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、出生した個体に対して、
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該個体の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
項７．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物であり、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムである、非ヒト哺乳動物に対して、
タモキシフェンを全身投与する工程、
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
項７－１．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方及びＴＰ５３遺伝子は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物であって、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムである、非ヒト哺乳動物に対して、
タモキシフェンを全身投与する工程、
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
項８．
内腔細胞特異的にＭｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物。
項８－１．
内腔細胞特異的にＭｏｂ１ａ遺伝子、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子及びＴＰ５３遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物。
項８－２．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子及びＴＰ５３遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物。
項９．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物。
項１．
内因性のＴＡＺを活性化する工程を含む、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項２．
内因性のＴＡＺを活性化する工程が、
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、個体を出生させる工程を含む、項１に記載の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項２－１．
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方及びＴＰ５３遺伝子は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、個体を出生させる工程を含む、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項３．
胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステムが、プロゲステロン受容体遺伝子の発現依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムである、項２に記載の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項４．
内因性のＴＡＺを活性化する工程が、
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物において、
前記任意にノックアウトできるシステムにより、Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程を含み、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムであり、
前記Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程が、タモキシフェンを全身投与する工程を含む、項１に記載の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項４－１．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方及びＴＰ５３遺伝子は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物において、
前記任意にノックアウトできるシステムにより、Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子及びＴＰ５３遺伝子をノックアウ卜する工程を含み、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムであり、
前記Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子及びＴＰ５３遺伝子をノックアウ卜する工程が、タモキシフェンを全身投与する工程を含む、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項４－２．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方及びＴＰ５３遺伝子は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物において、
前記任意にノックアウトできるシステムにより、Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程を含み、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムであり、
前記Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する工程が、タモキシフェンを全身投与する工程を含む、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
項５．
項１～４のいずれかに記載の方法で作製された基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物に被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
項６．
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、出生した個体に対して、
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該個体の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
項６－１．
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方及びＴＰ５３遺伝子は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、出生した個体に対して、
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該個体の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
項７．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物であり、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムである、非ヒト哺乳動物に対して、
タモキシフェンを全身投与する工程、
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
項７－１．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方及びＴＰ５３遺伝子は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物であって、
前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムである、非ヒト哺乳動物に対して、
タモキシフェンを全身投与する工程、
被験物質を適用する工程、及び
被験物質が適用された当該非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法。
項８．
内腔細胞特異的にＭｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物。
項８－１．
内腔細胞特異的にＭｏｂ１ａ遺伝子、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子及びＴＰ５３遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物。
項８－２．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子及びＴＰ５３遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物。
項９．
全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物。
【発明の効果】
【0011】
基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1A】タモキシフェン投与後から２．５週間後のカルミン染色及びヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）結果を示す。
【図1B】タモキシフェン投与後から２．５週間後のＨＥ染色結果を示す。
【図1C】タモキシフェン投与後２．５週間後、及び５週間後の成体ＴＡＭ誘導性全身Ｍｏｂ１ａ／ｂダブルノックアウトマウス（ｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウス）の乳腺上皮における腺管上皮内癌（Ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ；ＤＣＩＳ）及び浸潤性乳管癌（Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＩＤＣ，ｌｏｗ－ｇｒａｄｅ）の割合を示す。
【図2】内腔細胞特異的Ｍｏｂ１ａ／ｂダブルノックアウトマウス（ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウス）作製におけるマウスの交配の詳細を示す。
【図3A】３、６、及び６０週齢のコントロールマウス及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスの乳腺のカルミン染色結果、及び４０週齢のコントロールマウス及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスの乳腺写真を示す。
【図3B】１、２、４、６、２０、４０、及び６０週齢のｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスにおける乳腺腫瘍グレードの割合を示す。
【図3C】コントロールマウス及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウス（乳腺上皮の低倍率（上段）及び高倍率（下段））のＨＥ染色写真を示す。
【図3D】６０週齢のｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスから分離した、肺、リンパ節及び肝臓組織のＨＥ染色写真を示す。
【図4A】１０週齢のコントロールマウス、及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスの乳腺上皮における免疫染色結果を示す。
【図4B】１０週齢のコントロールマウス、及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスにおける基底細胞マーカー（Ｋｒｔ１４、Ｋｒｔ５、Ｔｐ６３）及び内腔細胞マーカー（Ｋｒｔ８、Ｅｓｒ１、Ｆｏｘａ１、Ｅｒｂｂ２）のｍＲＮＡ発現量、並びに陽性対照として解析したＨｉｐｐｏ－ＴＡＺ／ＹＡＰ１下流標的遺伝子であるＣｔｇｆ及びＡｎｋｒｄ１のｍＲＮＡ発現量の測定結果を示す。
【図4C】１０週齢のコントロールマウス、及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスにおけるＣＤ２４ｈｉｇｈＣＤ４９ｆｍｅｄ内腔細胞及びＣＤ２４ｍｅｄＣＤ４９ｆｈｉｇｈ基底細胞を検出した結果を示す。
【図4D】２、６及び１０週齢のｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスから分離した腫瘍における免疫染色結果を示す。
【図5】コントロール、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯ、及びｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスのｐｒｅ－ｐｕｂｅｒｔｙ（１～３週齢）、ｐｕｂｅｒｔｙ ｖｉｒｇｉｎ（８～１２週齢）において、乳腺上皮におけるＴＡＺタンパク質の免疫染色結果を示す。
【図6A】コントロールマウス及びタモキシフェン投与後５週目のｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスの乳腺及び皮膚におけるＴＡＺとＹＡＰ染色結果を示す。
【図6B】コントロールマウス、並びにタモキシフェン投与後５週目のｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウス、ｒｏＭｏｂ１ＴＡＺ ＴＫＯマウス、及びｒｏＭｏｂ１ＹＡＰ１ ＴＫＯマウスの乳腺上皮におけるカルミン染色（上段）とＨＥ染色（下段）結果を示す。
【図7A】ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）添加／無添加で７日間培養した、ドキシサイクリン依存的にＴＡＺが活性化するホルモン受容体陽性ヒト乳癌用細胞株におけるＴＡＺ、基底細胞マーカー（ＫＲＴ５、及びＥＧＦＲ）、並びに内腔細胞マーカー（ＫＲＴ８、及びＥＳＲ）タンパク質の免疫蛍光染色結果を示す。
【図7B】ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）添加／無添加で７日間培養した、ドキシサイクリン依存的にＴＡＺが活性化するホルモン受容体陽性ヒト乳癌用細胞株における基底細胞マーカー遺伝子（ＫＲＴ１４、ＫＲＴ５、ＥＧＦＲ、及びＫＲＴ１７）、内腔細胞マーカー遺伝子（ＫＲＴ８、ＥＳＲ、ＦＯＸＡ１、及びＧＡＴＡ３）、並びにＴＡＺとその下流標的遺伝子ＣＴＧＦ、ＣＹＲ６１、及びＡＮＫＲＤ１のｍＲＮＡの発現量を示す。
【図8】正常乳腺、並びにＵＤＨ、ＡＤＨ、ＤＣＩＳ、及びＩＤＣを示す基底細胞様乳癌患者の病巣におけるＴＡＺ検出の免疫染色を行った。
【図9】基底細胞様乳癌、又はエストロゲン受容体陽性乳癌を有する患者からの正常乳腺組織、ＤＣＩＳ及びＩＤＣ組織における、核ＴＡＺ及びＹＡＰスコアを示す。
【図10A】基底細胞様乳癌又はエストロゲン受容体陽性乳癌患者からのＤＣＩＳ及びＩＤＣの切片におけるＴＰ５３を検出するための免疫染色結果を示す。
【図10B】１０週齢のｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウス及びｐｒＭｏｂ１ＴＰ５３ＴＫＯマウスの乳腺写真、乳腺のカルミン染色結果、およびＨＥ染色写真を示す。
【図10C】ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯ及びｐｒＭｏｂ１ＴＰ５３ＴＫＯマウスにおける腫瘍径、遠位浸潤の割合、並びに高度異形成を伴うＩＤＣ及び軽度異形成を伴うＩＤＣの割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
本開示は、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法を包含する。
本開示は、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法を包含する。
【0014】
本明細書において、「基底細胞様乳癌」とは、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、及びＨＥＲ２受容体のいずれもが陰性であり、基底細胞様マーカーを有する細胞を含む乳癌を指す。なお、浸潤性の乳癌は、上皮の下縁にある基底膜を超えて、下方に浸潤した乳癌を指す。
【0015】
非ヒト哺乳動物の種としては、例えばペット又は家畜、あるいは実験動物として用いられる非ヒト哺乳動物が好ましく、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、サル等が挙げられる。中でも、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギなど）が好ましい。
【0016】
本開示に包含される、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法は、内因性のＴＡＺを活性化する工程を含むことが好ましい。ＴＡＺは多くの哺乳類で既に知られており、例えばＴＡＺのアクセッション番号（ＮＣＢＩ）はＧｅｎｅ ＩＤ ９７０６４（マウス）、２５９３７（ヒト）で、ＴＡＺの別名はＷＷＴＲ１（ＷＷ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ １）である。その他、ＮＭ＿００１３４８３６２．２（ヒト）、ＮＭ＿００１１６８２８１．１（マウス）等が挙げられる。
【0017】
内因性のＴＡＺを活性化する方法としては、当該技術分野において公知の方法、任意の条件を採用することができる。例えば、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子をダブルノックアウトする方法等が挙げられる。
【0018】
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子は多くの哺乳類で既に知られており、例えばマウスのＭｏｂ１ａ ｍＲＮＡのアクセッション番号（ＮＣＢＩ）はＮＭ＿１４５５７１であり、マウスのＭｏｂ１ｂ ｍＲＮＡのアクセッション番号（ＮＣＢＩ）はＮＭ＿０２６７３５である。その他、ｇｅｎｅ ＩＤ ２３２１５７（Ｍｏｂ１ａ）、ｇｅｎｅ ＩＤ ６８４７３（Ｍｏｂ１ｂ）等が挙げられる。
【0019】
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子をダブルノックアウトする方法としては、例えば、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、個体を出生させる方法等が挙げられる。本明細書において、当該方法を用いる基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法を、「本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（Ｉ）」と表記することがある。
すなわち、Ｍｏｂ１ａ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子が胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にあってもよいし、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ａ遺伝子が胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にあってもよい。また、Ｍｏｂ１ａ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子が胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある場合には、当該方法でノックアウトされる遺伝子はＭｏｂ１ｂ遺伝子であり、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ａ遺伝子が胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある場合には、当該方法でノックアウトされる遺伝子はＭｏｂ１ａ遺伝子である。
すなわち、Ｍｏｂ１ａ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子が胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にあってもよいし、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ａ遺伝子が胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にあってもよい。また、Ｍｏｂ１ａ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子が胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある場合には、当該方法でノックアウトされる遺伝子はＭｏｂ１ｂ遺伝子であり、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ａ遺伝子が胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある場合には、当該方法でノックアウトされる遺伝子はＭｏｂ１ａ遺伝子である。
【0020】
ノックアウトされている遺伝子におけるノックアウトの方法は特に制限されず、例えば、遺伝子全体が欠損した状態であってもよいし、遺伝子の塩基配列が１又は２以上、遺伝子機能が失われるように置換、欠失、又は挿入された状態であってもよい。ノックアウトの手法も特に制限されず、公知の方法を用いることができる。例えば、胚性幹細胞に対して遺伝子組み替えを行い、初期胚（胚盤胞）の中に挿入し、そして生まれてくる生物のうちで、遺伝子組換え細胞が生殖系列に分化したものが、ノックアウトされた遺伝子を次世代に残すことができるので、これを交配してノックアウト生物を得ることができる。
【0021】
胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステムとしては、例えばＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムが挙げられる。当該システムは当該技術分野において周知である。Ｃｒｅタンパク質は部位特異的組換え酵素であり、ＤＮＡ分子の特定の配列（ｌｏｘＰ）同士の間で組換えを起こす。マウスを例に取ると、次のように説明することができる。発現特性が既知のプロモーターを利用して、Ｃｒｅを特定の組織あるいは特定の時期に生産するマウスを用意する。特定の組織でだけ遺伝子をオフにしたいなら、当該特定の組織だけで機能するプロモーターをさがし、その後ろにＣｒｅの遺伝子を繋げて、当該特定の組織でだけＣｒｅが生産されるようにする。次に、目的遺伝子の前後にｌｏｘＰを挿入したマウスを用意する。この２つのマウスを交配させて得られた子孫のうち、双方の遺伝子を持つものを選択する。当該選択されたマウスは、当該特定の組織でのみＣｒｅが発現し、よってｌｏｘＰ同士の間で組み換えが起こり、結果として当該特定の組織でのみ目的遺伝子がノックアウトされる。
【0022】
胎生期内腔細胞特異的にノックアウトする場合は、例えば、胎生期内腔細胞特異的に発現するプロゲステロン受容体遺伝子（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＧＲ）の発現特異的にＣｒｅが生産されるＰＧＲ－Ｃｒｅを用いることができる。これを利用して、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムのはたらく時期及び組織を、胎生期内腔細胞特異的に制御することが可能である。このようなＰＧＲ－Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムは、胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステムとして特に好適である。このような胎生期内腔細胞特異的に発現するプロゲステロン受容体遺伝子の発現依存的にはたらくＣｒｅ遺伝子を有するマウスと、目的遺伝子の前後にｌｏｘＰ配列が挿入されたマウスを交配することにより、内腔細胞特異的に、目的の遺伝子がノックアウトされたマウスを作製することができる。より具体的には、胎生期内腔細胞特異的に発現するプロゲステロン受容体遺伝子の発現依存的にはたらくＣｒｅ遺伝子を有するマウスとＭｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物とを交配することにより、内腔細胞特異的にＭｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされた個体を得ることができる。乳腺内腔細胞特異的にノックアウトする場合、ＰＧＲ－Ｃｒｅに代えて、Ｂｌｇ－Ｃｒｅ（Cell Stem Cell. 2010 Sep 3;7(3):403-17.）、Ｋ８－ＣｒｅＥＲＴ２（Nat Commun. 2017 Feb 13;8:14431.）、Ａｄｅｎｏ－Ｋ８ Ｃｒｅ(mammary ductal injection model)等を用いることができる。
【0023】
本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（Ｉ）（より具体的には、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、個体を出生させる方法）により、内腔細胞特異的にＭｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物を得ることができる。
【0024】
また、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子をダブルノックアウトする方法としては、例えば、全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物において、前記任意にノックアウトできるシステムにより、Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する方法等が挙げられる。本明細書において、当該方法を用いる基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法を、「本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（ＩＩ）」と表記することがある。
すなわち、Ｍｏｂ１ａ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子が任意にノックアウトできるシステム下にあってもよいし、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ａ遺伝子が任意にノックアウトできるシステム下にあってもよい。また、Ｍｏｂ１ａ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子が任意にノックアウトできるシステム下にある場合には、当該方法でノックアウトされる遺伝子はＭｏｂ１ｂ遺伝子であり、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ａ遺伝子が任意にノックアウトできるシステム下にある場合には、当該方法でノックアウトされる遺伝子はＭｏｂ１ａ遺伝子である。
すなわち、Ｍｏｂ１ａ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子が任意にノックアウトできるシステム下にあってもよいし、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ａ遺伝子が任意にノックアウトできるシステム下にあってもよい。また、Ｍｏｂ１ａ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子が任意にノックアウトできるシステム下にある場合には、当該方法でノックアウトされる遺伝子はＭｏｂ１ｂ遺伝子であり、Ｍｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされており、Ｍｏｂ１ａ遺伝子が任意にノックアウトできるシステム下にある場合には、当該方法でノックアウトされる遺伝子はＭｏｂ１ａ遺伝子である。
【0025】
ノックアウトされている遺伝子におけるノックアウトの方法については、上記の本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（Ｉ）で説明したのと同様である。
【0026】
任意にノックアウトできるシステムとしては、例えばＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムが挙げられる。Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムについては、上記の本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（Ｉ）で説明したのと同様である。
また、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムには、特定の薬剤（例えばタモキシフェン等）によりＣｒｅタンパク質の発現を誘導できるようにしたバリエーションも存在しており、これも周知である。より具体的には、例えば、Ｃｒｅと変異エストロゲン受容体の融合タンパク質であるＣｒｅ－ＥＲタンパク質は通常細胞質に存在するが、エストロゲン誘導体であるタモキシフェンと結合することにより核内に移行し、ｌｏｘＰ配列に対して組換えを起こす。これを利用してＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムのはたらく時期をタモキシフェン依存的に調節することが可能である。このような薬剤（タモキシフェン）依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムは、任意にノックアウトできるシステムとして特に好適である。
また、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムには、特定の薬剤（例えばタモキシフェン等）によりＣｒｅタンパク質の発現を誘導できるようにしたバリエーションも存在しており、これも周知である。より具体的には、例えば、Ｃｒｅと変異エストロゲン受容体の融合タンパク質であるＣｒｅ－ＥＲタンパク質は通常細胞質に存在するが、エストロゲン誘導体であるタモキシフェンと結合することにより核内に移行し、ｌｏｘＰ配列に対して組換えを起こす。これを利用してＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムのはたらく時期をタモキシフェン依存的に調節することが可能である。このような薬剤（タモキシフェン）依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムは、任意にノックアウトできるシステムとして特に好適である。
【0027】
また、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムの他、例えばテトラサイクリン発現調整システム（Ｔｅｔ－Ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）も前記任意にノックアウトできるシステムとして挙げられる。当該システムは、ドキシサイクリンの投与及び除去により目的遺伝子の発現をＯＮ及びＯＦＦとすることができるシステムであり、当該技術分野において周知である。
【0028】
本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（ＩＩ）としては、前記非ヒト哺乳動物にタモキシフェンを全身投与する工程を含むことが好ましい。投与方法は特に制限されず、例えば、腹腔内投与、経口投与、経血管投与、皮下投与、経皮投与等が挙げられる。
【0029】
本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（ＩＩ）（より具体的には、全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物において、前記任意にノックアウトできるシステムにより、Ｍｏｂ１ａ遺伝子又はＭｏｂ１ｂ遺伝子をノックアウ卜する方法）により、全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物を得ることができる。
【0030】
また、本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（Ｉ）及び（ＩＩ）は、さらに、ＴＰ５３遺伝子をノックアウトする工程を含んでいてもよい。ＴＰ５３遺伝子は多くの哺乳類で既に知られており、例えばマウスのＴＰ５３のアクセッション番号（ＮＣＢＩ）はＧｅｎｅ ＩＤ ７１５７（ヒト）、２２０５９（マウス）である。その他、ＮＭ＿００１２７６７６１．３（ヒト）、ＮＭ＿００１２７６７６１．３（マウス）等が挙げられる。
【0031】
ＴＰ５３遺伝子をノックアウトする方法としては、例えば、本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（Ｉ）において、ＴＰ５３遺伝子を、胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステムにより、ノックアウトする方法等が挙げられる。また、例えば、本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（ＩＩ）において、ＴＰ５３遺伝子を、任意にノックアウトできるシステムにより、ノックアウトする方法等が挙げられる。
【0032】
また、本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（Ｉ）及び（ＩＩ）に用いられる非ヒト哺乳動物（より具体的には、作製方法（Ｉ）においては、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物、作製方法（ＩＩ）においては、全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物）は、さらに、ＴＰ５３遺伝子がノックアウトされていてもよい。ノックアウトの方法については、上記の本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（Ｉ）で説明したのと同様である。
【0033】
ＴＰ５３遺伝子をノックアウトすることにより、例えば、基底細胞様乳癌の腫瘍サイズの増大、浸潤の程度増大、及び／又は悪性度の増大等が期待される。
【0034】
また、本開示は、内腔細胞特異的にＭｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物をも包含する。当該、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物は、前記本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（Ｉ）により作製することができる。
【0035】
また、本開示は、全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がノックアウトされた、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物をも包含する。当該、基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物は、前記本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（ＩＩ）により作製することができる。
【0036】
これらの基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物は、内因性のＴＡＺが活性化されていることが好ましい。
【0037】
また、これらの当該基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物は、さらにＴＰ５３遺伝子がノックアウトされていてもよい。
【0038】
また、本開示は、（Ａ）基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物に被験物質を適用する工程、及び（Ｂ）被験物質が適用された基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法をも包含する。
【0039】
また、本開示は、（Ａ－Ｉ）Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は胎生期内腔細胞特異的にノックアウトできるシステム下にある非ヒト哺乳動物から、出生した個体に対して、被験物質を適用する工程、及び（Ｂ）被験物質が適用された当該個体の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法をも包含する。
【0040】
また、本開示は、（Ａ－ＩＩ）全身において、Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子のうち、一方はノックアウ卜されており、もう一方は任意にノックアウトできるシステム下にある、非ヒト哺乳動物であって、前記任意にノックアウトできるシステムが、タモキシフェン依存的にはたらくＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムである、非ヒト哺乳動物に対して、タモキシフェンを全身投与する工程、及び被験物質を適用する工程、並びに（Ｂ）被験物質が適用された当該非ヒト哺乳動物の基底細胞様乳癌の抑制若しくは改善の程度を測定する工程を含む、基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングする方法をも包含する。
【0041】
被験物質は特に制限されず、例えば、化合物及び組成物であり得る。化合物としては、例えば低分子化合物や、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ等）やタンパク質（例えば抗体又はその一部等）、ポリマー等の高分子化合物であってよい。組成物としても、生物（例えば動物、植物、微生物等）から得た抽出物等であってもよく、化合物を２種以上組み合わせたものであってもよい。被験物質の適用方法についても特に制限されるものではなく、例えば、腹腔内投与、経口投与、経血管投与、皮下投与、経皮投与等が挙げられる。
なお、（Ａ－ＩＩ）工程においては、タモキシフェンと被験物質の適用時期は、同時であってもよく、タモキシフェンを投与した後に被験物質を適用してもよく、被験物質を適用した後にタモキシフェンを投与してもよい。タモキシフェンと被験物質の適用時期が同時でない場合、それらの適用間隔は、特に限定されないが、例えば、１、２、３、４、又は５週間程度とすることができる。例えば、タモキシフェンを全身投与した、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、又は５週間後に被験物質を適用してもよい。また、タモキシフェンと被験物質の適用方法は同じであってもよく、異なっていてもよい。タモキシフェンの投与部位や投与方法等については、上記の本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（ＩＩ）で説明したのと同様である。
なお、（Ａ－ＩＩ）工程においては、タモキシフェンと被験物質の適用時期は、同時であってもよく、タモキシフェンを投与した後に被験物質を適用してもよく、被験物質を適用した後にタモキシフェンを投与してもよい。タモキシフェンと被験物質の適用時期が同時でない場合、それらの適用間隔は、特に限定されないが、例えば、１、２、３、４、又は５週間程度とすることができる。例えば、タモキシフェンを全身投与した、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、又は５週間後に被験物質を適用してもよい。また、タモキシフェンと被験物質の適用方法は同じであってもよく、異なっていてもよい。タモキシフェンの投与部位や投与方法等については、上記の本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（ＩＩ）で説明したのと同様である。
【0042】
また、（Ｂ）工程において、癌の抑制若しくは改善の程度を測定する方法としては、特に制限されず、公知の方法を用いることができる。例えば癌組織を直接観察する方法や、癌組織を採取して染色（例えばＨＥ染色や免疫学的染色）を行ったうえで細胞観察し、各細胞の癌の程度から全体の癌の進行度を解析する方法等が挙げられるが、特にこれらに制限されるものではない。
【0043】
Ｍｏｂ１ａ遺伝子及びＭｏｂ１ｂ遺伝子がダブルノックアウトされた、本開示の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（Ｉ）又は（ＩＩ）により作製される基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物においては、Ｈｉｐｐｏ ＰａｔｈｗａｙにおけるＹＡＰ１及びＴＡＺのうち、ＹＡＰ１ではなく、ＴＡＺのはたらきにより癌化が起こっており、また、ＴＡＺをノックアウトすることにより、癌化は抑制される。このため、当該基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物は、ＴＡＺ依存性の基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物ということもできる。
【0044】
当該基底細胞様乳癌モデル非ヒト哺乳動物は、発癌がＴＡＺに依存していることから、ＴＡＺをターゲットとした基底細胞様乳癌治療薬候補物質をスクリーニングするために、特に有用であるということができる。
【0045】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件の任意の組み合わせを全て包含する。
【0046】
また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例0047】
本開示の内容を以下の実施例を用いて具体的に説明する。しかし、本開示はこれらに何ら限定されるものではない。下記において、特に言及する場合を除いて、実験は大気圧及び常温条件下で行っている。
【0048】
Ｍｏｂ１ａ／ｂコンディショナルダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスの作製
Ｍｏｂ１ｂ遺伝子をホモで欠損しており、Ｍｏｂ１ａ遺伝子がホモでタモキシフェン依存的Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステム下に存在するマウス（Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－，Ｒｏｓａ２６ＣｒｅＥＲＴ２）は、Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－マウス及びＲｏｓａ２６ＣｒｅＥＲ－Ｔｇマウスを交配することによって作製した。
Ｍｏｂ１ｂ遺伝子をホモで欠損しており、Ｍｏｂ１ａ遺伝子がホモでタモキシフェン依存的Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステム下に存在するマウス（Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－，Ｒｏｓａ２６ＣｒｅＥＲＴ２）は、Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－マウス及びＲｏｓａ２６ＣｒｅＥＲ－Ｔｇマウスを交配することによって作製した。
【0049】
なお、Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－マウスは非特許文献２及び３に記載の方法に従って作製した。Ｒｏｓａ２６ＣｒｅＥＲ－ＴｇマウスはThe Jackson Laboratoryから入手した（非特許文献４参照）。
【0050】
成体ＴＡＭ誘導性全身Ｍｏｂ１ａ／ｂダブルノックアウトマウス（ｒｏＭｏｂ１ＤＫＯ）の作製
生後８～１２週齢のＭｏｂ１ａ／ｂコンディショナルＤＫＯマウスに１ｍｇのタモキシフェン（ＴＡＭ；Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を腹腔内単回投与することにより、成体ＴＡＭ誘導性全身Ｍｏｂ１ａ／ｂダブルノックアウトマウス（Ｒｏｓａ２６ＣｒｅＥＲＴ２；Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－；ｒｏＭｏｂ１ＤＫＯと表記することがある）を作製した。
生後８～１２週齢のＭｏｂ１ａ／ｂコンディショナルＤＫＯマウスに１ｍｇのタモキシフェン（ＴＡＭ；Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を腹腔内単回投与することにより、成体ＴＡＭ誘導性全身Ｍｏｂ１ａ／ｂダブルノックアウトマウス（Ｒｏｓａ２６ＣｒｅＥＲＴ２；Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－；ｒｏＭｏｂ１ＤＫＯと表記することがある）を作製した。
【0051】
タモキシフェン投与開始から２．５週間後に乳腺上皮を採取し、カルミン染色及びヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行って観察した。観察結果を図１Ａ及びＢに示す。
【0052】
タモキシフェン投与後２．５週間後、及び５週間後のｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスの乳腺上皮における腺管上皮内癌（Ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ；ＤＣＩＳ）及び浸潤性乳管癌（Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＩＤＣ，ｌｏｗ－ｇｒａｄｅ）の割合を図１Ｃに示す。
【0053】
さらに、ｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスの生存率を図１Ｄに示す。
【0054】
これらの結果から、ｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスは、生後２．５週までに腺管上皮内癌を発症し、生後５週には全て浸潤性乳管癌を発症することが確認された。つまり、基底細胞様乳癌モデルマウスを得ることができた。
【0055】
内腔細胞特異的Ｍｏｂ１ａ／ｂダブルノックアウトマウス（ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯ）の作製
Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウスに最低６回以上戻し交配済）及びＰＧＲ（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）－Ｃｒｅ Ｔｇマウス（Ｃ５７ＢＬ／６背景；Ｌｙｄｏｎ博士より供与）を交配することにより、Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／＋，Ｍｏｂ１ｂ+／－，ＰＧＲ－Ｃｒｅ Ｔｇマウスを作製し、このマウスとＭｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－マウスをさらに交配することで、内腔細胞特異的Ｍｏｂ１ａがノックアウトされるマウス（Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－，ＰＧＲ－Ｃｒｅ Ｔｇ；ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯと標記）を作製した。マウスの交配の詳細を図２に示す。
Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウスに最低６回以上戻し交配済）及びＰＧＲ（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）－Ｃｒｅ Ｔｇマウス（Ｃ５７ＢＬ／６背景；Ｌｙｄｏｎ博士より供与）を交配することにより、Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／＋，Ｍｏｂ１ｂ+／－，ＰＧＲ－Ｃｒｅ Ｔｇマウスを作製し、このマウスとＭｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－マウスをさらに交配することで、内腔細胞特異的Ｍｏｂ１ａがノックアウトされるマウス（Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－，ＰＧＲ－Ｃｒｅ Ｔｇ；ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯと標記）を作製した。マウスの交配の詳細を図２に示す。
【0056】
３、６、及び６０週齢のコントロールマウス（Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－）及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスの乳腺についてカルミン染色を行った。また、４０週齢のコントロールマウス及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスの乳腺を肉眼で観察した。結果を図３Ａに示す。
【0057】
１、２、４、６、２０、４０、及び６０週齢のｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスにおける乳腺腫瘍グレードの割合を図３Ｂに示す。図中、ｕｓｕａｌ ｄｕｃｔａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ（ＵＤＨ）は、正常乳管過形成、ａｔｙｐｉｃａｌ ｄｕｃｔａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ（ＡＤＨ）は、異型乳管過形成、ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ（ＤＣＩＳ）は腺管上皮内癌、ｉｎｖａｓｉｖｅ ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＩＤＣ）は浸潤性乳管癌を示す。
【0058】
コントロールマウス及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウス（乳腺上皮の低倍率（上段）及び高倍率（下段））のＨＥ染色写真を図３Ｃに示す。
【0059】
６０週齢のｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスから分離した、肺、リンパ節及び肝臓組織のＨＥ染色写真を図３Ｄに示す。
【0060】
これらの結果から、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスは、加齢に伴い、ＵＤＨ、ＡＤＨ、ＤＣＩＳ、低度ＩＤＣ、高度ＩＤＣを順次発症していることが確認された。
【0061】
１０週齢のコントロールマウス、及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスの乳腺上皮において、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ５、ｐ６３、ＫＲＴ８、及びエストロゲン受容体を検出するために免疫染色を行った。結果を図４Ａに示す。
【0062】
１０週齢のコントロールマウス、及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスから分離したＥｐＣＡＭｍｅｄ／ｈｉｇｈ ｐｒｏｘｉｍａｌ ＭＥＣｓにおけるｑＰＣＲで決定した基底細胞マーカー（Ｋｒｔ１４、Ｋｒｔ５、Ｔｐ６３）及び内腔細胞マーカー（Ｋｒｔ８、Ｅｓｒ１、Ｆｏｘａ１、Ｅｒｂｂ２）のｍＲＮＡ発現量、並びに陽性対照として解析したＨｉｐｐｏ－ＴＡＺ／ＹＡＰ１下流標的遺伝子であるＣｔｇｆ及びＡｎｋｒｄ１のｍＲＮＡ発現量を図４Ｂに示す。
【0063】
１０週齢のコントロールマウス、及びｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスから分離したＥｐＣＡＭｍｅｄ／ｈｉｇｈ ｐｒｏｘｉｍａｌ ＭＥＣｓ中のＣＤ２４ｈｉｇｈＣＤ４９ｆｍｅｄ内腔細胞及びＣＤ２４ｍｅｄＣＤ４９ｆｈｉｇｈ基底細胞を検出した。結果を図４Ｃに示す。
【0064】
２、６及び１０週齢のｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスから分離した腫瘍におけるＫＲＴ８及びＫＲＴ５を検出するために、免疫染色を行った。さらに、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスから分離した乳腺腫瘍細胞中のＫＲＴ５陽性、ＫＲＴ８陽性／ＫＲＴ５陽性、及びＫＲＴ８陽性細胞のパーセンテージを算出した。結果を図４Ｄに示す。
【0065】
これらの結果から、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウスにおける乳癌は、まずは、内腔細胞の形質を獲得するものの、最終的には基底細胞様乳癌にシフトすることが確認された。
【0066】
基底細胞様乳癌モデルマウスの癌化メカニズムの検討
コントロール、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯ、及びｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスのｐｒｅ－ｐｕｂｅｒｔｙ（１～３週齢）、ｐｕｂｅｒｔｙ ｖｉｒｇｉｎ（８～１２週齢）において、乳腺上皮におけるＴＡＺタンパク質を検出するために免疫染色を行った。さらに、ｐｕｂｅｒｔｙ ｖｉｒｇｉｎのコントロールマウスの太い腺管及び細い腺管の内腔細胞及び基底細胞におけるＴＡＺ核染色強度を測定した。また、ｐｕｂｅｒｔｙ ｖｉｒｇｉｎのコントロール、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯ、及びｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスの太い腺管における内腔細胞及び基底細胞のＴＡＺ核染色強度を測定した。また、ｐｕｂｅｒｔｙ ｖｉｒｇｉｎのコントロール、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯ、及びｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスの太い腺管及び細い腺管の内腔細胞のＴＡＺ核染色強度を測定した。それぞれの結果を図５に示す。
コントロール、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯ、及びｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスのｐｒｅ－ｐｕｂｅｒｔｙ（１～３週齢）、ｐｕｂｅｒｔｙ ｖｉｒｇｉｎ（８～１２週齢）において、乳腺上皮におけるＴＡＺタンパク質を検出するために免疫染色を行った。さらに、ｐｕｂｅｒｔｙ ｖｉｒｇｉｎのコントロールマウスの太い腺管及び細い腺管の内腔細胞及び基底細胞におけるＴＡＺ核染色強度を測定した。また、ｐｕｂｅｒｔｙ ｖｉｒｇｉｎのコントロール、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯ、及びｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスの太い腺管における内腔細胞及び基底細胞のＴＡＺ核染色強度を測定した。また、ｐｕｂｅｒｔｙ ｖｉｒｇｉｎのコントロール、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯ、及びｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスの太い腺管及び細い腺管の内腔細胞のＴＡＺ核染色強度を測定した。それぞれの結果を図５に示す。
【0067】
これらの結果から、ＴＡＺは太い腺管の内腔細胞で特に強く活性化していることが確認された。
【0068】
コントロールマウス及びタモキシフェン投与後５週目のｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスの乳腺及び皮膚についてＴＡＺとＹＡＰを染色した。結果を図６Ａに示す。
【0069】
コントロールマウス、並びにタモキシフェン投与後５週目のｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウス、ｒｏＭｏｂ１ＴＡＺ ＴＫＯマウス、及びｒｏＭｏｂ１ＹＡＰ１ ＴＫＯマウスの乳腺上皮についてカルミン染色及びＨＥ染色を行った。なお、ｒｏＭｏｂ１ＴＡＺ ＴＫＯマウス、及びｒｏＭｏｂ１ＹＡＰ１ ＴＫＯマウスは、ｒｏＭｏｂ１ＤＫＯマウスと、Ｔａｚ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（Dr J. Wrana（トロント大学）から提供）、又はＹａｐ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（Yap1 flox/flox ＥＳ細胞（Knockout Mouse Project Repository, UC Davis, CA, USA.）を発生させて作製）を交配することにより、作製した。結果を図６Ｂに示す。
【0070】
これらの結果から、Ｍｏｂ１ａ／ｂのノックアウトにより乳腺においてＴＡＺが活性化することが確認された。また、ＴＡＺをノックアウトすることにより、癌が発症しないことが確認された。
【0071】
ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）添加／無添加で７日間培養した、ドキシサイクリン依存的にＴＡＺが活性化するホルモン受容体陽性ヒト乳癌用細胞株におけるＴＡＺ、基底細胞マーカー（ＫＲＴ５、及びＥＧＦＲ）、並びに内腔細胞マーカー（ＫＲＴ８及び、エストロゲン受容体）タンパク質の免疫蛍光染色を行った。結果を図７Ａに示す。
【0072】
ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）添加／無添加で７日間培養した、ドキシサイクリン依存的にＴＡＺが活性化するホルモン受容体陽性ヒト乳癌用細胞株における基底細胞マーカー遺伝子（ＫＲＴ１４、ＫＲＴ５、ＥＧＦＲ、及びＫＲＴ１７）、内腔細胞マーカー遺伝子（ＫＲＴ８、エストロゲン受容体（ＥＳＲ）、ＦＯＸＡ１、及びＧＡＴＡ３）、並びにＴＡＺとその下流標的遺伝子ＣＴＧＦ、ＣＹＲ６１、及びＡＮＫＲＤ１のｍＲＮＡの発現量を定量した。結果を図７Ｂに示す。
【0073】
これらの結果から、ホルモン受容体陽性ヒト乳癌用細胞株は、ＴＡＺを活性化することにより、基底細胞様乳癌に転換することが確認された。
【0074】
正常乳腺、並びにＵＤＨ、ＡＤＨ、ＤＣＩＳ、及びＩＤＣを示す基底細胞様乳癌患者の病巣においてＴＡＺ検出のために免疫染色を行った。また核及び細胞質のＴＡＺ染色の程度をスコアリングした。結果を図８に示す。
【0075】
これらの結果から、基底細胞様乳癌患者では、癌発症前からＴＡＺが活性化し、癌の進展とともにその活性はさらに増強することが確認された。
【0076】
基底細胞様乳癌、又はエストロゲン受容体陽性乳癌を有する患者からの正常乳腺組織、ＤＣＩＳ及びＩＤＣについて、核ＴＡＺ及びＹＡＰ１を定量化した。結果を図９に示す。
【0077】
これらの結果から、基底細胞様乳癌では、ＴＡＺが活性化されているのに対して、エストロゲン受容体陽性乳癌ではＴＡＺは活性化していないことが確認された。また、基底細胞様乳癌及びエストロゲン受容体陽性乳癌のいずれでも、ＹＡＰ１は活性化されていないことが確認された。
【0078】
基底細胞様乳癌又はエストロゲン受容体陽性乳癌患者からのＤＣＩＳ及びＩＤＣの切片においてＴＰ５３を検出するために、免疫染色を行った。また、ＴＰ５３変異の割合を算出した。結果を図１０Ａに示す。
【0079】
１０週齢のｐｒＭｏｂ１ＤＫＯマウス及びｐｒＭｏｂ１ＴＰ５３ＴＫＯマウスの乳腺を観察した。結果を図１０Ｂに示す。また、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯ及びｐｒＭｏｂ１ＴＰ５３ＴＫＯマウスにおける腫瘍径、遠位浸潤の割合、並びに高度異形成を伴うＩＤＣ及び軽度異形成を伴うＩＤＣの割合を図１０Ｃに示す。なお、ｐｒＭｏｂ１ＴＰ５３ＴＫＯマウスは、Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－マウスに代えて、Ｍｏｂ１ａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ，Ｍｏｂ１ｂ－／－，ＴＰ５３ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘをコントロールに用いた以外は、ｐｒＭｏｂ１ＤＫＯと同様に作製した。
【0080】
これらの結果から、基底細胞様乳癌の早期段階ではＴＰ５３変異は少ないこと、及びＴＰ５３をさらにノックアウトすることによって、腫瘍サイズ、浸潤の程度及び悪性度が増大することが確認された。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】