特開 2024-26160 ヒトサイトメガロウイルス免疫原性組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024026160

(43)【公開日】2024-02-28

(54)【発明の名称】ヒトサイトメガロウイルス免疫原性組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/12 20060101AFI20240220BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240220BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20240220BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240220BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240220BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240220BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240220BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240220BHJP

   C07K 14/045 20060101ALN20240220BHJP

   C12N 15/38 20060101ALN20240220BHJP

【ＦＩ】

A61K39/12 ZNA

A61K39/39

A61K9/107

A61K47/02

A61K9/127

A61K9/14

A61P37/04

A61P31/12

C07K14/045

C12N15/38

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023198785

(22)【出願日】2023-11-24

(62)【分割の表示】P 2020514916の分割

【原出願日】2018-09-11

(31)【優先権主張番号】17306179.7

(32)【優先日】2017-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】592055820

【氏名又は名称】サノフィ・パスツール

【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ ＰＡＳＴＥＵＲ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】パスカル・シャオー

(72)【発明者】

【氏名】ラファエラ・デュマ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン・ヘンスラー

(72)【発明者】

【氏名】シルヴィ・ピション

(72)【発明者】

【氏名】ファビエンヌ・ピラス－デゥーセ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】中和抗体レベルを高め、持続的免疫応答を誘導して長期防御を誘導するワクチン、より詳細には広範な免疫応答を誘導するＨＣＭＶワクチンを提供する。
【解決手段】ＨＣＭＶ ｇＢ抗原、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原およびＴｈ１誘導アジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。さらに、ＨＣＭＶワクチンとして使用するための免疫原性組成物を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

－ ＨＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；および
－ Ｔｈ１誘導アジュバント
を含む、免疫原性組成物。

【請求項2】

前記Ｔｈ１誘導アジュバントは、同じＨＣＭＶ ｇＢ抗原および同じＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む組成物中のＭＦ５９より、低いＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ、ｃ比、および／または高いＩＮＦ－γレベル、および／または低いＩＬ－５レベルをマウスにおいて誘導する、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項3】

前記Ｔｈ１誘導アジュバントは：
－ ＴＬＲ－４アゴニスト；または
－ ３５０～６５０ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗを有するポリアクリル酸ポリマー塩
を含む、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

前記Ｔｈ１誘導アジュバントは：
－ リポ多糖、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、第二世代の脂質アジュバント（ＳＬＡ）、非炭水化物骨格によって連結されたリン脂質二量体およびアミノアルキルグルコサミニドホスフェート、もしくはそれらの誘導体からなる群から選択されるＴＬＲ－４アゴニスト；または
－ ３５０～６５０ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗを有するポリアクリル酸ポリマー塩
を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

前記Ｔｈ１誘導アジュバントはＴＬＲ－４アゴニストを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

前記ＴＬＲ４アゴニストは、水性ナノ懸濁液、リン酸カルシウム、リポソーム、ビロソーム、ＩＳＣＯＭ、マイクロ粒子およびナノ粒子、またはエマルジョンなどの送達系との組合せである、請求項５に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

前記送達系は水中油型エマルジョンである、請求項６に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

前記ＴＬＲ－４アゴニストは、Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号：２８７１８０－６３－６）およびＧＬＡ（ＣＡＳ番号１２４６２９８－６３－４）ＴＬＲ－４アゴニストから選択される、請求項５～７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

前記Ｔｈ１誘導アジュバントは、３５０～６５０ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗを有する直鎖または分枝鎖ポリアクリル酸ポリマー塩を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

前記直鎖または分枝鎖ポリアクリル酸ポリマー塩はＰＡＡ２２５０００である、請求項９に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

前記ＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、細胞内タンパク質分解切断部位に１つまたはいくつかの変異を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

前記ＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、完全長ｇＢポリペプチド、膜貫通ドメインの少なくとも一部を欠く完全長ｇＢポリペプチド、膜貫通ドメインの実質的に全てを欠く完全長ｇＢポリペプチド、細胞内ドメインの少なくとも一部を欠く完全長ｇＢポリペプチド、細胞内ドメインの実質的に全てを欠く完全長ｇＢポリペプチド、または膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの実質的に両方を欠く完全長ｇＢポリペプチドである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項13】

前記ＨＣＭＶ ｇＢ抗原はｇＢｄＴｍである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項14】

前記ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原において、ｇＨ抗原は、膜貫通ドメインの少なくとも一部を欠き、好ましくはｇＨ抗原は、膜貫通ドメインの実質的に全てを欠く、請求項１～１１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

前記ｇＨは、ＵＬ７５遺伝子によってコードされる完全長ｇＨの外部ドメインを含む、請求項１４に記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

ＨＣＭＶ ｇＢおよびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合は唯一のＨＣＭＶ抗原である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項17】

ＨＣＭＶワクチンとして使用するための、請求項１～１６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項18】

前記ワクチンは、中和抗体レベルおよび／または持続を高める、請求項１７に記載の使用するための免疫原性組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原およびＴｈ１誘導アジュバントを含む免疫原性組成物に関する。本発明はさらに、ＨＣＭＶワクチンとして使用するための免疫原性組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ヘルペスウイルスファミリーに属する偏在性ウイルスである。該ウイルスは、表面に糖タンパク質スパイクを持つ脂質二重膜に包まれ、テグメントに囲まれたカプシドに含有された直鎖二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）からなる。このファミリーの他のメンバーのように、ＨＣＭＶは潜伏感染および再活性化の特徴を有する。ＨＣＭＶは多くの細胞を感染させ、潜伏する能力を有する。

【0003】

免疫正常宿主では、ほとんどのＨＣＭＶ感染は無症候性または極めて軽度であり、疲労、倦怠感、中程度の熱、リンパ節症、肝腫大もしくは肝臓酵素の軽微な増加などのいくつかの非特異的症状を伴う。しかし、異種親和性陰性単核球症（Ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｓ）が以前は健康な個体の約１０％で観察される。

【0004】

対照的に、子宮内で感染した新生児およびＡＩＤＳによって免疫抑制された成人、または固形臓器もしくは骨髄移植の関連では、臨床徴候は極めて重症になり得る。

【0005】

ＨＣＭＶ感染症の有病率は年齢とともに上昇し、社会経済的要因の影響を受ける。血清学的調査は、開発途上国および先進国の社会経済的下層群においてより高い有病率を示している。出産可能年齢の女性に関して、ＨＣＭＶ血清陽性女性の割合は、先進国の高および中所得層の約５０％から低所得集団の８０％以上にわたる。過去２０年間に異なる西欧諸国において異なる年齢クラス、女性および男性を含む一般集団で行われた調査により、幼児および思春期層のＨＣＭＶ血清有病率は４０～５０％にわたるが、より年上の対象（４０歳以上）では、ＨＣＭＶ血清有病率は８０％より高いことが世界的に示された。

【0006】

ＨＣＭＶは、尿、唾液、乳汁、精液、生殖器分泌物を含む感染者の分泌物に長期にわたって排出される；ＨＣＭＶは故に、水平伝播（子どもから子どもへ、子どもから親へ、およびセックスパートナー間の濃厚接触を通じた）または胎盤を通じたもしくは出生時の体液接触および授乳を通じた、もしくは血液製剤もしくは移植臓器への曝露による、母親から胎児もしくは乳児への垂直伝播のどちらかで伝播される。

【0007】

ＨＣＭＶは、先進国世界における先天性感染の最も一般的な原因である。先天性感染とは、新生児の出生前に母親から胎児へ伝播される感染を指す。米国では毎年、推定８０００人の乳児が先天性ＨＣＭＶ感染の結果、精神遅滞、失明および感音性難聴を含む障害をきたしている。

【0008】

先天的に感染した新生児のうち５％～１０％は、小頭症、脈絡網膜炎、頭蓋内石灰化、肝脾腫、肝炎、黄疸、高直接ビリルビン血症、血小板減少症、点状出血、および貧血などの主な徴候を出生時に有する。症候性先天性ＨＣＭＶ疾患を有するこれらの新生児のうち、死亡率は乳児期および生存者で約１０％であるが、５０～９０％が精神遅滞、脳性麻痺、感音性聴覚損失または視力障害などの後遺症を有する。

【0009】

先天性ＨＣＭＶ感染を有する多くの乳児は、出生時に無症候性である。出生時に無症候
性であり、新生児期にウイルススクリーニングによってＨＣＭＶ血清陽性と同定された乳児の約１５％は、聴覚損失または中枢神経系異常などの後遺症を有することが追跡研究により示されている。

【0010】

全体として、欧州および米国で毎年生まれる乳児約１７，０００人は永続的後遺症を有する。

【0011】

一次感染が妊娠後期に生じる場合より一次感染が妊娠第１期に生じる場合、先天性ＨＣＭＶ感染は頻度がより高く、より重症である。全体的に見て、妊娠中の一次ＨＣＭＶ感染は、胎児への４０％の伝播リスクを伴う。

【0012】

妊娠中の母体ＨＣＭＶ感染または先天性ＨＣＭＶ感染を予防または治療する有効な手段は、現在入手できない。

【0013】

ＨＣＭＶはまた、臓器および骨髄移植レシピエント並びにＡＩＤＳ患者における重要なウイルス病原体でもある。ＨＣＭＶ血清陰性固形臓器移植レシピエントのＨＣＭＶ関連罹患率は６０％に近い。固形臓器移植では、血清陰性患者がＨＣＭＶ陽性ドナーから移植片を受け取る場合、該疾患は最も重症である。対照的に、骨髄または幹細胞移植では、ＨＣＭＶ感染の起源が内因性感染の再活性化であることを示している血清陰性ドナーから細胞を受け取るＨＣＭＶ血清陽性対象では、該疾患は最も重症である。

【0014】

ＨＣＭＶは、同種移植レシピエントの約１５％で間質性肺炎、肝炎、胃腸疾患、骨髄抑制、および網膜炎を引き起こす。これらの直接的な終末器官疾患に加えて、ＨＣＭＶは、移植片拒絶反応、アテローム性動脈硬化の加速、および細菌または真菌感染につながる可能性がある免疫抑制などの間接的な影響を伴っている。

【0015】

ＨＣＭＶワクチンの開発は、それ故に、医学研究所ワクチン優先順位付け報告書において主要な公衆衛生目的と考えられている（非特許文献１）。多くの候補ワクチンが記載されているが、これまでのところ認可されたものはない（非特許文献２）。

【0016】

ＭＦ５９アジュバントを用いるサイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂワクチンは、移植レシピエントにおける第２相無作為化プラセボ対照試験で有望な結果を示した（非特許文献３）。出産可能年齢の女性における第２相プラセボ対照無作為化二重盲検試験は、ＭＦ５９アジュバントを用いる組換えＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質Ｂからなる同じワクチンをプラセボと比較して評価した。結果は、原発性ＨＣＭＶのＨＣＭＶ獲得を防ぐ上で５０％の効能を示した。しかし、免疫原性結果は、ｇＢ／ＭＦ５９製剤によって誘導される中和抗体（Ａｂ）のレベルが、第３回投与の投与１カ月後にピークレベルであり、次いで急速に減少することを示した（非特許文献４）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ２１ｓｔ ｃｅｎｔｕｒｙ：Ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｍａｋｉｎｇ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ；２０００年のＫａｔｈｌｅｅｎ Ｒ、Ｓｔｒａｔｔｏｎ、Ｊａｎｅ Ｓ、Ｄｕｒｃｈ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＲＳ．Ｅｄｉｔｏｒｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｐｒｉｏｒｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ

【非特許文献2】Ｐｌｏｔｋｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第６版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ編、２０１３、Ｓｃｈｌｅｉｓｓら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ、１０３２～１０４１頁

【非特許文献3】Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｌａｎｃｅｔ、２０１１、３７７（９７７３）：１２５６～６３頁

【非特許文献4】Ｐａｓｓら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｅｃｉｎｅ、２００９、３６０：１１９１～９頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

結果として、ＨＣＭＶワクチン効能を改善する必要、特に、中和抗体レベルを高め、持続的免疫応答を誘導して長期防御を誘導するワクチンを見出す必要がある。また、より詳細にはより広範な免疫応答を誘導するＨＣＭＶワクチンを見出す必要もある。

【課題を解決するための手段】

【0019】

予期しないことに、本発明の本発明者らは、これらの要件に適合する新たな免疫原性組成物をこのたび見出した。

【0020】

本発明は故に、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原およびＴｈ１誘導アジュバントを含む免疫原性組成物に関する。

【0021】

特に、前記Ｔｈ１誘導アジュバントは：
－ ＴＬＲ－４アゴニスト；または
－ ３５０～６５０ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗを有するポリアクリル酸ポリマー塩
を含む。

【0022】

１つの実施形態において、前記Ｔｈ１誘導アジュバントはＴＬＲ－４アゴニストを含む。

【0023】

特に、前記ＴＬＲ４アゴニストは、水性ナノ懸濁液、リン酸カルシウム、リポソーム、ビロソーム、ＩＳＣＯＭ、マイクロ粒子およびナノ粒子、またはエマルジョンなどの送達系との組合せである。

【0024】

より具体的には、前記送達系は水中油型エマルジョンである。

【0025】

特に、前記ＴＬＲ－４アゴニストは、Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号：２８７１８０－６３－６）およびＧＬＡ（ＣＡＳ番号１２４６２９８－６３－４）ＴＬＲ－４アゴニストから選択される。

【0026】

１つの実施形態において、前記Ｔｈ１誘導アジュバントは、３５０～６５０ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗを有する直鎖または分枝鎖ポリアクリル酸ポリマー塩、特にＰＡＡ２２５０００を含む。

【0027】

特に、前記ＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、細胞内タンパク質分解切断部位に１つまたはいくつかの変異を含む。

【0028】

さらに具体的には、前記ＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、完全長ｇＢポリペプチド、膜貫通ドメインの少なくとも一部を欠く完全長ｇＢポリペプチド、膜貫通ドメインの実質的に全てを欠く完全長ｇＢポリペプチド、細胞内ドメインの少なくとも一部を欠く完全長ｇＢポリペ
プチド、細胞内ドメインの実質的に全てを欠く完全長ｇＢポリペプチド、または膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの実質的に両方を欠く完全長ｇＢポリペプチドである。

【0029】

より具体的には、前記ＨＣＭＶ ｇＢ抗原はｇＢｄＴｍである。

【0030】

特に、前記ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原において、ｇＨ抗原は、膜貫通ドメインの少なくとも一部を欠き、好ましくはｇＨ抗原は、膜貫通ドメインの実質的に全てを欠く。

【0031】

より具体的には、前記ｇＨは、ＵＬ７５遺伝子によってコードされる完全長ｇＨの外部ドメインを含む。

【0032】

さらに具体的には、本発明による免疫原性組成物において、ＨＣＭＶ ｇＢおよびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体は唯一のＨＣＭＶ抗原である。

【0033】

本発明は、ＨＣＭＶワクチンとして使用するための本発明による免疫原性組成物にさらに関する。

【0034】

特に、前記ワクチンは、中和抗体レベルおよび／または持続を高める。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】研究スケジュールを示す図である。

【図2】種々のアジュバントを含むまたは含まないＣＭＶ－ｇＢ ２μｇおよび五量体で０、２０および２２７日時点で免疫されたマウスから２０～２５７日目に回収された血清中の、補体あり（パネルＡ）または補体なし（パネルＢ）上皮細胞での血清中和アッセイによって測定されたＨＣＭＶ ＢＡＤ－ｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＧＦＰ株に特異的な中和抗体価の動態を示す図である。

【図3】種々のアジュバントを含むまたは含まないＣＭＶ－ｇＢ ２μｇおよび五量体で０および２０日目に免疫されたマウスから３４日目に回収された血清中の、補体あり（パネルＡ）または補体なし（パネルＢ）上皮細胞および補体あり（パネルＣ）または補体なし（パネルＤ）線維芽細胞での血清中和アッセイによって測定されたＨＣＭＶ ＢＡＤ－ｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＧＦＰ株に特異的な中和抗体価を示す図である。

【図4】種々のアジュバントを含むまたは含まないＣＭＶ－ｇＢ ２μｇおよび五量体で０および２０日時点で免疫されたマウスから２０８日目に回収された血清中の、補体あり（パネルＡ）または補体なし（パネルＢ）上皮細胞および補体あり（パネルＣ）または補体なし（パネルＤ）線維芽細胞での血清中和アッセイによって測定されたＨＣＭＶ ＢＡＤ－ｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＧＦＰ株に特異的な中和抗体価を示す図である。

【図5】種々のアジュバントを含むまたは含まないＣＭＶ－ｇＢ ２μｇおよび五量体で０、２０および２２７日時点で免疫されたマウスから２５７日時点で回収された血清中の、補体あり（パネルＡ）または補体なし（パネルＢ）上皮細胞および補体あり（パネルＣ）または補体なし（パネルＤ）線維芽細胞での血清中和アッセイによって測定されたＨＣＭＶ ＢＡＤ－ｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＧＦＰ株に特異的な中和抗体価を示す図である。

【図6】種々のアジュバントを含むまたは含まないＣＭＶ－ｇＢ ２μｇおよび五量体で０、２１および２２７日時点で免疫されたマウスから３４、２０８および２５７日時点で回収された血清中のＥｌＩＳＡによって測定された、ＣＭＶ－ｇＢ（パネルＡ）またはＣＭＶ－五量体（パネルＢ）に特異的な抗ｇＢ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体価を示す図である。

【図7】ＭＦ５９または種々のアジュバントを含むＣＭＶ－ｇＢ ２μｇおよび五量体で０、２１および２２７日時点で免疫されたマウスからの各群に関する、３４、２０８および２５７日時点で計算された平均ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ抗体比を示す図である。

【図8】種々のアジュバントを含むまたは含まないＣＭＶ－ｇＢ ２μｇおよび五量体で０、２０および２２７日時点で免疫されたマウス由来の脾臓細胞で３４、２０８および２５７日時点でモニターされた、組換えＣＭＶ－ｇＢ（パネルＡ）またはＣＭＶ－五量体（パネルＢ）によるエクスビボ刺激時のＩＬ－５およびＩＦＮ－γサイトカイン分泌細胞頻度（サイトカイン分泌細胞／１０^６脾臓細胞）を示す図である。

【図9】種々のアジュバントを含むまたは含まないＣＭＶ－ｇＢ ２μｇおよび五量体で０、２０および２２７日時点で免疫されたマウス由来の、３４、２０８および２５７日時点のＣＭＶ－ｇＢ（パネルＡ）またはＣＭＶ－五量体（パネルＢ）どちらかに特異的な抗体分泌形質芽細胞のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃパーセンテージを示す図である。

【図10】種々のアジュバントを含むまたは含まないＣＭＶ－ｇＢ ２μｇおよび五量体で０、２０および２２７日時点に免疫されたマウス由来の、３４、２０８および２５７日時点のＣＭＶ－ｇＢ（パネルＡ）またはＣＭＶ－五量体（パネルＢ）どちらかに特異的な抗体分泌記憶Ｂ細胞のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃパーセンテージを示す図である。

【図11】ＰＡＡアジュバントと共に製剤化されたＣＭＶ－ｇＢおよびＣＭＶ－ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体の種々の用量でＤ０に免疫されたマウスからＤ２０に回収された血清中の、補体の存在下の上皮細胞ＡＲＰＥ－１９または線維芽細胞ＭＲＣ－５に関する血清中和アッセイによって測定されたＨＣＭＶ ＢＡＤ－ｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＧＦＰ株に特異的な中和抗体価を示す図である。

【図12】ＰＡＡアジュバントと共に製剤化されたＣＭＶ－ｇＢおよびＣＭＶ－ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体の種々の用量でＤ０およびＤ２１に免疫されたマウスからＤ３５に回収された血清中の、補体の存在下（１２Ａ）または非存在下（１２Ｂ）どちらかの上皮細胞ＡＲＰＥ－１９に関する血清中和アッセイによって測定されたＨＣＭＶ ＢＡＤ－ｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＧＦＰ株に特異的な中和抗体価を示す図である。

【図13】ＰＡＡアジュバントと共に製剤化されたＣＭＶ－ｇＢおよびＣＭＶ－ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体３μｇでＤ０およびＤ２１に免疫されたマウスからＤ３５に回収された脾臓細胞でのＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定された、ＣＭＶ－ｇＢ、ＣＭＶ－ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体（パネルＡ）またはＣＭＶ－五量体ペプチドプール（パネルＢ）どちらかによるエクスビボ刺激時のマウス脾臓細胞におけるＩＦＮ－γサイトカイン産生細胞定量化を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0036】

免疫原性組成物
以前に述べたように、本発明による免疫原性組成物は：
－ ＨＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；
－ Ｔｈ１誘導アジュバント
を含む。

【0037】

「ＨＣＭＶ」は、ヒトサイトメガロウイルスに使用され、およびヒトサイトメガロウイルスの任意の株である。

【0038】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」／「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」／「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」／「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、それぞれ「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」／「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」／「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」／「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」およびそれぞれ「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ」／「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」／「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」／「からなる（ｃｏｎｓｉ
ｓｔｅｄ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなる場合もあれば、またはさらなる何か、例えばＸ＋Ｙを含む場合もある。

【0039】

「抗原」は本明細書で使用される場合、当業者に公知の通常の意味を有する。特に、「抗原」とは、免疫学的応答の引き金を引く、１つまたはそれ以上のエピトープ（直鎖状、立体構造のどちらか、または両方）を含有する任意の分子を指す。

【0040】

本発明の文脈において、抗原は、タンパク質が十分な免疫原性を維持している限り、天然の配列に対する欠失、付加および置換などの修飾を有するタンパク質をさらに含む。これらの修飾は、例えば部位特異的変異誘発を介して故意にであってもよく、または宿主細胞において抗原の発現中に生じる変異などの偶然であってもよい。抗原はまた、コンセンサス配列によってコードされるタンパク質またはその断片でもあってもよい。

【0041】

本発明による免疫原性組成物において使用することができる抗原は、特にＨＣＭＶ ｇＢ抗原およびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原である。

【0042】

ＨＣＭＶ ｇＢ抗原
本発明によるＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、中和抗体を誘導する完全長ｇＢポリペプチドまたはｇＢ由来ポリペプチドである。

【0043】

ｇＢは、ＨＣＭＶゲノムのＵＬ５５遺伝子によってコードされる。ｇＢの天然型（すなわちｇｐ１３０）のサイズは、株により少し異なり得るオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のサイズに依存する。例えば、２７１７ｂｐ長であるＡＤ１６９株のＯＲＦは、９０６個のアミノ酸の完全長ｇＢをコードするのに対し、Ｔｏｗｎｅ株のＯＲＦは、９０７個のアミノ酸の完全長ｇＢをコードする。これらの２つの株のタンパク質配列は、参照によってその全体を組み入れるＵＳ２００２／０１０２５６２（図２）に記載されている。ｇＢの天然型は、通常は２３～２５アミノ酸長であるアミノ酸シグナル配列と、これに続く、残基アルギニン４６０からセリン４６１の間に細胞内タンパク質分解切断部位を含有する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインを含有する。通常、完全長ｇＢは、細胞で生じる翻訳後機構の結果としてアミノ酸シグナル配列が欠失されている。本発明の目的に適切な完全長ｇＢは、ＨＣＭＶ株ＴｏｗｎｅおよびＡＤ１６９、ならびに他の同等の株の完全長ｇＢの両方を包含することが十分に理解されるであろう。中和抗体を誘導するいくつかの抗原ドメインが記載されている。特に、該ドメインには、ｇｐ１３０のアミノ酸残基４６１から６８０の間に位置するドメインが挙げられ、このドメインは２つの不連続ドメイン、残基４６１から６１９の間のドメインおよび残基６２０から６８０の間のドメインにさらに分けられる（ＵＳ５，５４７，８３４）。該ドメインにはまた、アミノ酸残基５６０から６４０の間に位置する抗原ドメイン１（ＡＤ－１）（Ｓｃｈｏｐｐｅｌ Ｋ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９６、２１６：１３３～４５頁）、またはアミノ酸残基６５から８４の間（Ａｘｅｌｓｓｏｎ Ｆら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００７、２６：４１～６頁）もしくはアミノ酸残基２７から８４の間（Ｂｕｒｋｅ ＨＧら、ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、２０１５、１１：ｅ１００５２２７頁）に位置する抗原ドメイン２（ＡＤ－２）も挙げられる。それ故に、上記に引用した抗原ドメインの１つまたはいくつかに相同な配列をそのアミノ酸配列に含むポリペプチドもまた本発明の目的に適している。用語「～に相同な配列」は、ＴｏｗｎｅまたはＡＤ１６９株（ＵＳ２００２／０１０２５６２に記載されている）に由来する天然のｇＢと考えられる抗原ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性があるアミノ酸配列を意味することが意図される。典型的には、配列相同性は、少なくとも９０％の配列同一性に基づき、さらにより具体的には、配列相同性は完全（１００％の配列同一性）である。

【0044】

本明細書で使用される場合、第２の配列と少なくともｘ％の同一性を有する第１の配列は、両方の配列がグローバルアライメントにより最適に整列されるとき、第２のアミノ酸配列の全長と比べて、マッチした第２の配列のアミノ酸に同一である第１の配列のアミノ酸の数をｘ％が表すことを意味する。両方の配列は、ｘが最大であるとき最適に整列される。同一性のパーセンテージのアライメントおよび決定は、グローバルアライメントアルゴリズム、例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、４８、４４３～４５３頁（１９７０）に記載されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、例えば、ポリペプチド配列比較のための以下のパラメータ：比較マトリックス：ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８９、１０９１５～１０９１９頁（１９９２）からのＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップペナルティ：８およびギャップ長ペナルティ：２；ならびにポリヌクレオチド配列比較のための以下のパラメータ：比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０およびギャップ長ペナルティ：３を用いて、手動または自動で実行することができる。

【0045】

上記のパラメータと共に使用されるプログラムは、「ギャップ」プログラムとしてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩから公開されている。前述のパラメータは、それぞれ、ペプチド比較（末端ギャップに対するペナルティなしに加えて）および核酸比較のためのデフォルトパラメータである。

【0046】

特に本発明の目的に適しているｇＢ由来ペプチドまたはポリペプチドは、ＵＳ５，５４７，８３４に記載のｇｐ５５である。ｇｐ５５は、細胞内タンパク質分解切断部位でのｇＢの切断に由来する；そのアミノ酸配列は、セリン残基４６１からＣ末端の間にある配列に対応する。膜貫通配列の全てもしくは一部および細胞内Ｃ末端ドメインの全てもしくは一部（例えば、残基４６１から６４６の間の天然のｇＢのアミノ酸配列に相同な配列を有するペプチド）が欠失されたｇｐ５５または細胞内Ｃ末端ドメインの全てもしくは一部（例えば、残基４６１から６８０の間の天然のｇＢのアミノ酸配列に相同な配列を有するペプチド）が欠失されたｇｐ５５などの切断型のｇｐ５５も使用することができる。そのような切断型のｇｐ５５も、参照によってその全体を組み入れるＵＳ５，５４７，８３４に記載されている。

【0047】

細胞内タンパク質分解切断部位に、その後が無効にされるように１つまたはいくつかの変異を有する完全長ｇＢの変異型を使用することも可能である。特に、変異は、ｇｐ１３０の配列の残基４５７から４６０の間に位置し、より具体的には、アルギニン４６０および／またはリジン４５９および／またはアルギニン４５７に位置する。この態様において、完全長ｇＢの変異型は、全てのドメインが中和抗体の標的となる細胞外ドメイン全体を有する。そのような変異型は、組換えタンパク質として生産される時の宿主でのその分泌、およびその容易な下流精製を可能にするために、膜貫通配列の全てもしくは一部および／または細胞内Ｃ末端ドメインの全てもしくは一部が二次的に欠失される。そのようなｇＢ誘導体は、中和抗体の標的となる実質的に全てのドメインが保存される限り好ましい。

【0048】

したがって、本発明の１つの態様においてＨＣＭＶ ｇＢは、細胞内タンパク質分解切断部位に１つまたはいくつかの変異を含み、特にＨＣＭＶ ｇＢは、完全長ＨＣＭＶ ｇＢ、膜貫通ドメインの少なくとも一部を欠く完全長ＨＣＭＶ ｇＢ、膜貫通ドメインの実質的に全てを欠く完全長ｇＢポリペプチド、細胞内ドメインの少なくとも一部を欠く完全長ｇＢポリペプチド、細胞内ドメインの実質的に全てを欠く完全長ＨＣＭＶ ｇＢ、ならびに膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの実質的に両方を欠く完全長ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの群の中からさらに選択される。

【0049】

表現「細胞内ドメインの実質的に全てを欠く」または「膜貫通ドメインの実質的に全て
を欠く」は、前記ドメインに対応するアミノ酸配列の少なくとも８０％が欠失されることを意味する。

【0050】

本発明の文脈において、「ドメインの少なくとも一部を欠く」とは、ドメインの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％を欠くが、８０％未満を欠くことを意味する。

【0051】

１つの実施形態において、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、ｇＢの外部ドメイン、すなわち膜貫通配列の全ておよび細胞内Ｃ末端ドメインの全てが欠失された完全長ｇＢである。「外部ドメイン」は、膜を越えて細胞外空間に伸びる膜貫通アンカー型タンパク質の一部である。

【0052】

本発明によるＨＣＭＶ ｇＢ抗原はまた、他の変異および／または欠失および／または付加も含有してもよい。例えば、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、ＥＰ２６２７３５２に記載の細胞外ドメインに位置する融合ループ１（ＦＬ１）ドメインおよび融合ループ２（ＦＬ２）ドメインの少なくとも１つにおける少なくとも１個のアミノ酸の欠失または置換を含有してもよい。あるいはまたはさらに、該抗原は、ＥＰ２６２７３５２に記載のリーダー配列の少なくとも一部の欠失を含有してもよい。本発明によるＨＣＭＶ ｇＢ抗原はまた、ＷＯ２０１６０９２４６０に記載の疎水性表面１内（アミノ酸残基１５４～１６０および２３６～２４３）にグリコシル化部位をもたらす変異も含んでもよい。特に、前記グリコシル化部位は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ／Ｃモチーフを含むＮグリコシル化部位であり、ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である（が、好ましくはプロリンではない）。ＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、グリコシル化部位をもたらす変異を含んでもよく、前記グリコシル化部位は、ＷＯ２０１６０９２４６０に記載の、（１）疎水性表面２内（アミノ酸残基１４５～１６７および２３０～２５２）；または（２）融合ループ１（ＦＬ１）（アミノ酸残基１５５～１５７）および／もしくは融合ループ２（ＦＬ２）（アミノ酸残基２４０～２４２）から２０オングストローム以内の残基にある。ＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、ＷＯ２０１６０９２４６０に記載の、Ｃ末端の少なくとも１２残基長である異種配列を含んでもよい。特に、ｇＢタンパク質は、異種配列が外部ドメインのＣ末端で融合される融合タンパク質であってもよい。

【0053】

天然のＨＣＭＶ ｇＢは、ホモ三量体である関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）ｇＢおよびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ｇＢにおけるｇＢタンパク質の３Ｄ結晶学構造に基づき、ホモ三量体であると仮定されている（Ｈｅｌｄｗｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６、３１３：２１７～２２０頁；Ｂａｃｋｏｖｉｃら、ＰＮＡＳ、２００９、１０６（８）：２８８０～２８８５頁）。本発明によるＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、三量体（天然型）、および／または六量体（三量体天然型の二量体）、および／または十二量体（六量体の二量体）型であってもよい。特に、本発明による免疫原性組成物のＨＣＭＶ ｇＢ抗原部分は、実質的に単量体型ではなく、より具体的には単量体型ではない。表現「～は実質的に単量体型ではない」は、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原の２０％未満、特に１０％未満、特に５％未満が単量体型であることを意味する。

【0054】

実施形態によれば、ｇＢ抗原は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に、前記ｇＢ抗原は、配列番号１：ＳＳＴＲＧＴＳＡＴＨＳＨＨＳＳＨＴＴＳＡＡＨＳＲＳＧＳＶＳＱＲＶＴＳＳＱＴＶＳＨＧＶＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶＮＴＴＫＹＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＶＣＴＳＭＫＰＩＮＥＤＬＤＥＧＩＭＶＶＹＫＲＮＩＶＡＨＴＦＫＶＲＶＹＱＫＶＬＴＦＲＲＳＹＡＹＩＨＴＴＹＬＬＧＳＮＴＥＹＶＡＰＰＭＷＥＩＨＨＩＮＳＨＳＱＣＹＳＳＹＳＲＶＩＡＧＴＶＦＶＡＹＨＲＤＳＹＥＮＫＴＭＱＬＭＰＤＤＹＳＮＴＨＳＴＲＹＶＴＶＫＤＱＷＨＳＲＧＳＴＷ
ＬＹＲＥＴＣＮＬＮＣＭＶＴＩＴＴＡＲＳＫＹＰＹＨＦＦＡＴＳＴＧＤＶＶＤＩＳＰＦＹＮＧＴＮＲＮＡＳＹＦＧＥＮＡＤＫＦＦＩＦＰＮＹＴＩＶＳＤＦＧＲＰＮＳＡＬＥＴＨＲＬＶＡＦＬＥＲＡＤＳＶＩＳＷＤＩＱＤＥＫＮＶＴＣＱＬＴＦＷＥＡＳＥＲＴＩＲＳＥＡＥＤＳＹＨＦＳＳＡＫＭＴＡＴＦＬＳＫＫＱＥＶＮＭＳＤＳＡＬＤＣＶＲＤＥＡＩＮＫＬＱＱＩＦＮＴＳＹＮＱＴＹＥＫＹＧＮＶＳＶＦＥＴＴＧＧＬＶＶＦＷＱＧＩＫＱＫＳＬＶＥＬＥＲＬＡＮＲＳＳＬＮＬＴＨＮＴＴＱＴＳＴＤＧＮＮＡＴＨＬＳＮＭＥＳＶＨＮＬＶＹＡＱＬＱＦＴＹＤＴＬＲＧＹＩＮＲＡＬＡＱＩＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＮＳＳＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＬＳＳＩＳＴＶＤＳＭＩＡＬＤＩＤＰＬＥＮＴＤＦＲＶＬＥＬＹＳＱＫＥＬＲＳＳＮＶＦＤＬＥＥＩＭＲＥＦＮＳＹＫＱＲＶＫＹＶＥＤＫＲＬＣＭＱＰＬＱＮＬＦＰＹＬＶＳＡＤＧＴＴＶＴＳＧＮＴＫＤＴＳＬＱＡＰＰＳＹＥＥＳＶＹＮＳＧＲＫＧＰＧＰＰＳＳＤＡＳＴＡＡＰＰＹＴＮＥＱＡＹＱＭＬＬＡＬＶＲＬＤＡＥＱＲＡＱＱＮＧＴＤＳＬＤＧＱＴＧＴＱＤＫＧＱＫＰＮＬＬＤＲＬＲＨＲＫＮＧＹＲＨＬＫＤＳＤＥＥＥＮＶと少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性またはさらには１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0055】

好ましい実施形態においてｇＢ抗原は、配列番号１と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0056】

本発明の文脈において特に適切なＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、Ｃ末端ドメインの全てもしくは一部が欠失しているおよび／または膜貫通配列の全てもしくは一部が欠失している、切断部位が無効である切断型の完全長ｇＢである。特に好ましい切断型のｇＢは、参照によってその全体を組み入れるＵＳ６，１００，０６４に記載されている、ｇＢｄＴＭと呼ばれるものに対応する。ＵＳ６，１００，０６４では、シグナル配列は２４アミノ酸長と仮定され、アミノ酸位置がそれに応じて図１０に示された。本発明者らは、このシグナル配列が実際に２５アミノ酸長であることを発見した。ＵＳ６，１００，０６４の図１０において、Ｓｅｒ－１のＣ末端（すなわち、シグナル配列のＣ末端）を示した全てのアミノ酸位置は、そのため１から減らされなければならない。したがってｇＢｄＴＭは、細胞外ドメインが細胞質ドメインに直接連結されるように、切断部位の３個の変異（アルギニン４３２はスレオニンに置換され、リジン４３４はグルタミンに置換され、およびアルギニン４３５はスレオニンに置換される；番号を振り直した位置を考慮）、およびアミノ酸残基バリン６７６からアルギニン７５１の間の膜貫通領域の欠失（番号を振り直した位置を考慮）を有する。そのようなｇＢ由来ポリペプチドは、分泌型でこの産物を発現する組換え細胞によって産生されることから、精製がより容易である。得られた型は、これがｇＢ Ｔｏｗｎｅ株に由来する場合、シグナル配列および膜貫通領域が欠失された８０６アミノ酸長のポリペプチドである。

【0057】

本明細書に記載されたＨＣＭＶ ｇＢタンパク質またはそこから誘導されるペプチドもしくはポリペプチドは、当業者に周知の任意の方法によって合成することができる。そのような方法には、固相（Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５（１４）、２１４９～２１５４頁（１９６３））、もしく液相での従来の化学合成、構成的アミノ酸またはその誘導体からの酵素合成（Ｋ．Ｍｏｒｉｈａｒａ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５（６）、１６４～１７０頁（１９８７））、無細胞タンパク質合成（Ｋａｔｚｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３（３）、１５０～１５６頁（２００５））、および組換え技術による生物学的生産方法が挙げられる。

【0058】

例えば、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原は、組換え宿主細胞を用いた生物学的生産プロセスを使用して得ることができる。そのようなプロセスでは、本明細書に記載のＨＣＭＶ ｇＢ抗原をコードする核酸を含有する発現カセットが宿主細胞に導入され、該宿主細胞は、対応するタンパク質の発現を可能にする条件で培養される。それによって生産されたタンパク質が、次いで回収および精製される。タンパク質を精製するための方法は、当業者に周知である。得られた組換えタンパク質は、分画、クロマトグラフィー方法、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体等を使用する免疫親和性方法などの個別にまたは組み合わせて使用される方法によって、溶解物および細胞抽出物または培養培地上清から精製することができる。特に、得られた組換えタンパク質は、培養培地上清から精製される。

【0059】

ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質またはそこから誘導されるペプチドもしくはポリペプチドは、通常、組換えＤＮＡ法によって得られ、当業者に周知の方法に従って精製される。参照によってその全体を組み入れるＵＳ６，１００，０６４およびＵＳ２００２／０１０２５６２に記載された方法が、特に使用される。

【0060】

例えば、本発明によるｇＢ抗原は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物で産生される組換え糖タンパク質である。ＨＣＭＶのＴｏｗｎｅ株由来のｇＢ遺伝子は、ＵＳ６，１００，０６４に記載の細胞培養における分泌を促進するために、分子の切断部位および膜貫通部分を除去するように変異誘発することができる。分泌される分子は、１９個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を保持する８０６個のアミノ酸のポリペプチドであり、ｇＢｄＴｍとも呼ばれる。精製プロセスは、アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィー工程を必要とした。

【0061】

ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原
本発明による免疫原性組成物の別の抗原部分は、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原である。

【0062】

前記五量体複合体は、５つの成分の間でジスルフィド結合および非共有結合的相互作用によりアセンブルされて、立体構造エピトープを提示することができる機能複合体を形成する（Ｃｉｆｅｒｒｉら、ＰＮＡＳ、２０１５、１１２（６）：１７６７～１７７２頁；Ｗｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１４、３２（３０）：３７９６～３８０４頁）。

【0063】

前記複合体は既に記載されており、当業者によって公知である。前記複合体は、特にＲｙｃｋｍａｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００８年１月、６０～７０頁）および特許出願ＷＯ２０１４／００５９５９に記載されている。前記ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体は、修飾されたＨＣＭＶ ｇＨポリペプチドを特に含んでもよく、前記ポリペプチドは、膜貫通（ＴＭ）ドメインの少なくとも一部を欠く。いくつかの実施形態において、ｇＨポリペプチドは、天然のＴＭドメインの一部を保持してもよいが、タンパク質を脂質二重膜に滞留させるには十分ではない。好ましい実施形態においてｇＨポリペプチドは、膜貫通ドメインの実質的に全てを欠く。より好ましい実施形態においてｇＨポリペプチドは、完全長の天然のＴＭドメインを欠く。

【0064】

故に、ｇＨポリペプチドは、天然のｇＨ ＴＭドメインの最大１０個のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸）を含有し得る。

【0065】

本発明の文脈において、「ドメインの少なくとも一部を欠く」とは、ドメインの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％を欠くが、８０％未満を欠くことを意味する。

【0066】

表現「細胞内ドメインの実質的に全てを欠く」または「膜貫通ドメインの実質的に全てを欠く」は、前記ドメインに対応するアミノ酸配列の少なくとも８０％が欠失されることを意味する。

【0067】

あるいはまたはＴＭドメインの一部もしくは全てを欠くことに加えて、ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨの細胞内ドメインの一部または実質的に全てまたは全てを欠いてもよい。

【0068】

好ましい実施形態においてｇＨポリペプチドは、細胞内ドメインの実質的に全てを欠く。より好ましい実施形態においてｇＨポリペプチドは、完全長の天然の細胞内ドメインを欠く。

【0069】

好ましい実施形態において、ｇＨポリペプチドは、ＴＭドメインの全ておよび細胞内ドメインの全てを欠く。

【0070】

１つの実施形態において、前記ｇＨは、ＵＬ７５遺伝子によってコードされる完全長ｇＨの外部ドメインを含む。

【0071】

ＵＬ７５遺伝子によってコードされるＨＣＭＶ糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）は、不活性化に不可欠なビリオン糖タンパク質であり、アルファ、ベータおよびガンマヘルペスウイルスのメンバーの間で保存される。ｇＨはｇＬと安定な複合体を形成し、この複合体の形成はｇＨの細胞表面発現を促進する。ＨＳＶ－２およびＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ複合体の結晶構造に基づき、ｇＬサブユニットおよびｇＨのＮ末端残基は、ｇＢとの相互作用および膜融合の活性化に関与する球状ドメイン（「頭部」）を構造の一端に形成する。ウイルス膜の近位にあるｇＨのＣ末端ドメイン（「尾部」）もまた膜融合に関与する。１つの実施形態において、本明細書に記載された五量体複合体のｇＨポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に、ｇＨ抗原は、配列番号２：
ＲＹＧＡＥＡＶＳＥＰＬＤＫＡＦＨＬＬＬＮＴＹＧＲＰＩＲＦＬＲＥＮＴＴＱＣＴＹＮＮＳＬＲＮＳＴＶＶＲＥＮＡＩＳＦＮＦＦＱＳＹＮＱＹＹＶＦＨＭＰＲＣＬＦＡＧＰＬＡＥＱＦＬＮＱＶＤＬＴＥＴＬＥＲＹＱＱＲＬＮＴＹＡＬＶＳＫＤＬＡＳＹＲＳＦＳＱＱＬＫＡＱＤＳＬＧＥＱＰＴＴＶＰＰＰＩＤＬＳＩＰＨＶＷＭＰＰＱＴＴＰＨＧＷＴＥＳＨＴＴＳＧＬＨＲＰＨＦＮＱＴＣＩＬＦＤＧＨＤＬＬＦＳＴＶＴＰＣＬＨＱＧＦＹＬＩＤＥＬＲＹＶＫＩＴＬＴＥＤＦＦＶＶＴＶＳＩＤＤＤＴＰＭＬＬＩＦＧＨＬＰＲＶＬＦＫＡＰＹＱＲＤＮＦＩＬＲＱＴＥＫＨＥＬＬＶＬＶＫＫＤＱＬＮＲＨＳＹＬＫＤＰＤＦＬＤＡＡＬＤＦＮＹＬＤＬＳＡＬＬＲＮＳＦＨＲＹＡＶＤＶＬＫＳＧＲＣＱＭＬＤＲＲＴＶＥＭＡＦＡＹＡＬＡＬＦＡＡＡＲＱＥＥＡＧＡＱＶＳＶＰＲＡＬＤＲＱＡＡＬＬＱＩＱＥＦＭＩＴＣＬＳＱＴＰＰＲＴＴＬＬＬＹＰＴＡＶＤＬＡＫＲＡＬＷＴＰＮＱＩＴＤＩＴＳＬＶＲＬＶＹＩＬＳＫＱＮＱＱＨＬＩＰＱＷＡＬＲＱＩＡＤＦＡＬＫＬＨＫＴＨＬＡＳＦＬＳＡＦＡＲＱＥＬＹＬＭＧＳＬＶＨＳＭＬＶＨＴＴＥＲＲＥＩＦＩＶＥＴＧＬＣＳＬＡＥＬＳＨＦＴＱＬＬＡＨＰＨＨＥＹＬＳＤＬＹＴＰＣＳＳＳＧＲＲＤＨＳＬＥＲＬＴＲＬＦＰＤＡＴＶＰＡＴＶＰＡＡＬＳＩＬＳＴＭＱＰＳＴＬＥＴＦＰＤＬＦＣＬＰＬＧＥＳＦＳＡＬＴＶＳＥＨＶＳＹＶＶＴＮＱＹＬＩＫＧＩＳＹＰＶＳＴＴＶＶＧＱＳＬＩＩＴＱＴＤＳＱＴＫＣＥＬＴＲＮＭＨＴＴＨＳＩＴＡＡＬＮＩＳＬＥＮＣＡＦＣＱＳＡＬＬＥＹＤＤＴＱＧＶＩＮＩＭＹＭＨＤＳＤＤＶＬＦＡＬＤＰＹＮＥＶＶＶＳＳＰＲＴＨＹＬＭＬＬＫＮＧＴＶＬＥＶＴＤＶＶＶＤＡＴＤＳＲと少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性またはさらには１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0072】

好ましい実施形態においてｇＨポリペプチドは、配列番号２と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0073】

ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）は、ＵＬ１１５遺伝子によってコードされる。ｇＬは、ウイルス複製に不可欠であると考えられており、ｇＬの全ての既知の機能的特性はｇＨとの二量体化と直接関連がある。ｇＬ／ｇＨ複合体は、宿主細胞へのウイルスの侵入につながるウイルス膜および細胞膜の融合に必要とされる。

【0074】

１つの実施形態によれば、本明細書に記載された五量体複合体のｇＬポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に、ｇＬ抗原は、配列番号３：
ＡＡＶＳＶＡＰＴＡＡＥＫＶＰＡＥＣＰＥＬＴＲＲＣＬＬＧＥＶＦＱＧＤＫＹＥＳＷＬＲＰＬＶＮＶＴＧＲＤＧＰＬＳＱＬＩＲＹＲＰＶＴＰＥＡＡＮＳＶＬＬＤＥＡＦＬＤＴＬＡＬＬＹＮＮＰＤＱＬＲＡＬＬＴＬＬＳＳＤＴＡＰＲＷＭＴＶＭＲＧＹＳＥＣＧＤＧＳＰＡＶＹＴＣＶＤＤＬＣＲＧＹＤＬＴＲＬＳＹＥＲＳＩＦＴＥＨＶＬＧＦＥＬＶＰＰＳＬＦＮＶＶＶＡＩＲＮＥＡＴＲＴＮＲＡＶＲＬＰＶＳＴＡＡＡＰＥＧＩＴＬＦＹＧＬＹＮＡＶＫＥＦＣＬＲＨＱＬＤＰＰＬＬＲＨＬＤＫＹＹＡＧＬＰＰＥＬＫＱＴＲＶＮＬＰＡＨＳＲＹＧＰＱＡＶＤＡＲと少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性またはさらには１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0075】

好ましい実施形態においてｇＬポリペプチドは、配列番号３と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0076】

一実施形態によれば、本明細書に記載された五量体複合体のＵＬ１２８ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に、ＵＬ１２８抗原は、配列番号４：
ＥＥＣＣＥＦＩＮＶＮＨＰＰＥＲＣＹＤＦＫＭＣＮＲＦＴＶＡＬＲＣＰＤＧＥＶＣＹＳＰＥＫＴＡＥＩＲＧＩＶＴＴＭＴＨＳＬＴＲＱＶＶＨＮＫＬＴＳＣＮＹＮＰＬＹＬＥＡＤＧＲＩＲＣＧＫＶＮＤＫＡＱＹＬＬＧＡＡＧＳＶＰＹＲＷＩＮＬＥＹＤＫＩＴＲＩＶＧＬＤＱＹＬＥＳＶＫＫＨＫＲＬＤＶＣＲＡＫＭＧＹＭＬＱと少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性またはさらには１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0077】

好ましい実施形態においてＵＬ１２８ポリペプチドは、配列番号４と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0078】

ＵＬ１３０は、ＵＬ１３１Ａ～１２８遺伝子座の中心および最大の（２１４コドン）遺伝子である。遺伝子の概念上の翻訳は、推定ケモカインドメイン（アミノ酸４６～１２０）内の２つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位（Ａｓｎ８５およびＡｓｎ１１８）を含有する親水性タンパク質の前にある長い（２５個のアミノ酸）Ｎ末端シグナル配列、および固有のＣ末端領域の末端近くのさらなるＮグリコシル化部位（Ａｓｎ２０１）を予測する。ＵＬ１３０は、ＴＭドメインを欠いていると予測される。

【0079】

ＵＬ１３０は、感染細胞から非効率的に分泌されるが、ゴルジ成熟型としてビリオンエンベロープに取り込まれる内腔糖タンパク質であると報告されている（Ｐａｔｒｏｎｅら：「Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ＵＬ１３０ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｐｒｏｄｕｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉ
ｒｉｏｎ．」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７９（２００５）：８３６１～８３７３頁）。

【0080】

一実施形態によれば、本明細書に記載された五量体複合体のＵＬ１３０ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に、ＵＬ１３０抗原は、配列番号５：
ＳＰＷＳＴＬＴＡＮＱＮＰＳＰＬＷＳＫＬＴＹＳＫＰＨＤＡＡＴＦＹＣＰＦＩＹＰＳＰＰＲＳＰＬＱＦＳＧＦＱＲＶＬＴＧＰＥＣＲＮＥＴＬＹＬＬＹＮＲＥＧＱＴＬＶＥＲＳＳＴＷＶＫＫＶＩＷＹＬＳＧＲＮＱＴＩＬＱＲＭＰＲＴＡＳＫＰＳＤＧＮＶＱＩＳＶＥＤＡＫＩＦＧＡＨＭＶＰＫＱＴＫＬＬＲＦＶＶＮＤＧＴＲＹＱＭＣＶＭＫＬＥＳＷＡＨＶＦＲＤＹＳＶＳＦＱＶＲＬＴＦＴＥＡＮＮＱＴＹＴＦＣＴＨＰＮＬＩＶと少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性またはさらには１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0081】

好ましい実施形態においてＵＬ１３０ポリペプチドは、配列番号５と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0082】

ＵＬ１３１Ａとも呼ばれるＵＬ１３１の機能は、内皮細胞だけでなく上皮細胞においてもＨＣＭＶ複製に必要とされる。一実施形態によれば、本明細書に記載された五量体複合体のＵＬ１３１Ａポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に、ＵＬ１３１Ａ抗原は、配列番号６：
ＱＣＱＲＥＴＡＥＫＮＤＹＹＲＶＰＨＹＷＤＡＣＳＲＡＬＰＤＱＴＲＹＫＹＶＥＱＬＶＤＬＴＬＮＹＨＹＤＡＳＨＧＬＤＮＦＤＶＬＫＲＩＮＶＴＥＶＳＬＬＩＳＤＦＲＲＱＮＲＲＧＧＴＮＫＲＴＴＦＮＡＡＧＳＬＡＰＨＡＲＳＬＥＦＳＶＲＬＦＡＮと少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性またはさらには１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0083】

好ましい実施形態においてＵＬ１３１ポリペプチドは、配列番号６と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
配列番号２～６は、株ＢＥ／２８／２０１１（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＫＰ７４５６６９、Ｋｒｅｍｋｏｗら、２０１５）由来である。

【0084】

本発明の免疫原性組成物の五量体複合抗原部分において、ｇＨ、ｇＬおよびＵＬ１２８はジスルフィド結合を介して連結されるが、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａは非共有結合的相互作用によって五量体複合体に取り込まれる。例えば、ＵＬ１３０タンパク質および／またはＵＬ１３１Ａタンパク質は、非共有結合的相互作用によって五量体複合体に取り込まれる。さらに、ＵＬ１３０タンパク質および／またはＵＬ１３１Ａタンパク質は、非共有結合的相互作用によって連結される。

【0085】

五量体複合体のための一連の立体構造エピトープが知られている。例えば、Ｍａｃａｇｎｏ（Ｍａｃａｇｎｏら：「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１ ｃｏｍｐｌｅｘ．」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８４（２０１０）：１００５～１３頁）は、内皮、上皮、および骨髄細胞のＨＣＭＶ感染を中和するヒトモノクローナル抗体のパネルを単離した。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物の五量体複合抗原部分は、Ｍａｃａｇｎｏ（２０１０）によって同定された１つま
たはそれ以上の立体構造エピトープを有する。

【0086】

五量体複合抗原の各タンパク質は、挿入、欠失および置換などの変異が、抗原としてのタンパク質の使用にとって有害にならない限り、これらの変異を含有してもよい。さらに、そのような変異は、本発明による五量体複合体を形成するタンパク質の能力を妨げるべきではない。本発明の五量体複合体を形成する能力は、タンパク質精製を行うこと、ならびに非還元ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を分析することにより試験することができる。該タンパク質が複合体の一部を形成するならば、該タンパク質は全て非変性ＰＡＧＥゲルの単一のバンドに存在し得、および／またはサイズ排除クロマトグラムで単一のピークに存在し得る。

【0087】

前記五量体複合体の発現は、当業者に公知の方法に従って実現することができる。例えばＨｏｆｍａｎｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１５）に記載された方法に言及することができる。

【0088】

本発明の文脈において使用するための適切な発現系は当業者に周知であり、多くはＤｏｙｌｅ（Ｄｏｙｌｅ編 Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００８）に詳細に記載されている。一般に、必要とされた宿主においてポリペプチドを産生する核酸分子を維持、増殖および発現するのに適した任意の系またはベクターを使用することができる。適当なヌクレオチド配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第３版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）に記載された手法などの様々な周知のおよび日常的な手法のいずれかによって発現系に挿入することができる。一般に、コード遺伝子は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列が形質転換された宿主細胞でＲＮＡに転写されるように、プロモーター、および場合により、オペレーターなどの制御エレメントの制御下に置かれる。適切な発現系の例には、例えば以下に由来するベクター：細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス（バキュロウイルス（例えば特許出願ＷＯ２０１５１７０２８７に記載された）、パポーバウイルス（例えばＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなど）、またはそれらの組合せ、例えば、コスミドおよびファージミドを含む、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメントに由来するものを含む、例えば染色体系、エピソーム系およびウイルス由来系が挙げられる。ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドで含有および発現されるより大きなＤＮＡ断片を送達するのに使用することができる。

【0089】

ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原の５つの異なる組換えタンパク質を同時におよび等モル状態で発現するためには、いくつかの可能性がある。本発明の免疫原性組成物のＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原部分に関する第１の可能性（１）は、同じまたは類似の調節エレメント（プロモーター、エンハンサー、スプライスシグナル、終結シグナル・・・）の制御下の５つのＯＲＦ全て、および場合により細胞株選択のための選択系を含有する単一のベクターを構築することである。ベクターは５つの発現カセット（例えば、Ａｌｂｅｒｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２０１５、１２５（４）：１６０３～１６１９頁；またはＣｈｅｓｈｅｎｋｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００１、８（１１）：８４６～８５４頁に記載の）を含有してもよく、または５つの成分（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１）は、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原の５つのタンパク質へと適切なポリタンパク質成熟の引き金を引
くエレメントと単一のＯＲＦで融合される（例えば、Ｓｚｙｍｃｚａｋ－Ｗｏｒｋｍａｎら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１２、２０１２（２）：１９９～２０４頁に記載の自己切断配列）。その第２のケースでは、全ての切断が正しく生じると仮定して等モル性が保証されている。本発明の免疫原性組成物のＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原部分に関する別の可能性（２）は、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原の１つの成分、および場合により細胞株選択のための選択系を各々が発現する５つのベクターを構築することである。５つのベクターは、標的細胞株に同時トランスフェクトされる。可能性（１）から可能性（２）の間の任意の中間系もまた、必要とされるベクターの数を最小化し、各ベクターを妥当なサイズ（例えば１２ｋｂ未満）に維持するために設計される。

【0090】

適切な発現系には、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス（例えば特許出願ＷＯ２０１５１７０２８７に記載された））で感染させたもしくは形質転換された昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。無細胞翻訳系もまた、タンパク質を産生するのに使用することができる。

【0091】

適切な植物細胞遺伝子発現系の例には、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５，６５９，１２２号；米国特許第５，６０８，１４３号、およびＺｅｎｋ（１９９１）：「Ｃｈａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ： Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｓ ａ ｐｏｔ ｏｆ ｇｏａｌ．」Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０（１２）、３８６１～３８６３頁。Ｚｅｓｓ ＮａｕｋＵＭＫ Ｔｏｒｎｕ、１３：２５３～２５６頁に記載されたものが挙げられる。特に、導入遺伝子を含有する全植物が回収されるように、プロトプラストが単離および培養されて全再生植物をもたらす全ての植物が使用される。実際には、サトウキビ、テンサイ、綿、果樹および他の樹木、マメ科植物ならびに野菜の全ての主要な種を含むがこれらに限定されない全ての植物が、培養細胞または組織から再生される。

【0092】

ＨＥＫ２９３細胞は、リン酸カルシウムおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）方法を含む様々な手法による高いトランスフェクション能力のために、本発明による五量体複合体のＨＣＭＶタンパク質の一過性発現に適している。ＨＥＫ２９３の有用な細胞株は、ＥＢＶのＥＢＮＡ１タンパク質を発現するもの、例えば２９３－６Ｅである（Ｌｏｉｇｎｏｎら：「Ｓｔａｂｌｅ ｈｉｇｈ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＦＮａｌｐｈａ２ｂ ｉｎ ＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌｓ．」、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８（２００８）：６５頁）。形質転換されたＨＥＫ２９３細胞は、高レベルのタンパク質を増殖培地に分泌し、故に増殖培地から直接そのようなタンパク質複合体を精製できるようにすることが示されている。

【0093】

ＣＨＯ細胞は、ＨＣＭＶタンパク質の工業生産、および特に本発明による免疫原性組成物のＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原部分の工業生産に特に適切な哺乳動物宿主である。

【0094】

トランスフェクションは、リン酸カルシウム、電気穿孔の使用を含む当技術分野で周知の一連の方法によって、または細胞膜と融合し、積み荷を内側に堆積させるリポソームを生産するための材料とカチオン性脂質を混合することによって実行することができる。

【0095】

細胞上清または封入体から組換えタンパク質を精製するための方法は、当技術分野で周知である。特に、本発明による免疫原性組成物のＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原部分は、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。

【0096】

特に、本発明による免疫原性組成物は、ＨＣＭＶウイルスを含まない。
特に、本発明による免疫原性組成物は、ＨＣＭＶ ｇＢおよびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体が唯一のＨＣＭＶ抗原である、本明細書に記載の免疫原性組成物である。

【0097】

Ｔｈ１誘導アジュバント
「アジュバント」は本明細書で使用される場合、当業者に一般に公知の意味を有する。特に、アジュバントは、抗原の免疫原性を調節する薬剤または物質を指す。「免疫原性を調節する」は、抗原によって生成される免疫応答の規模および／または期間を増強することを含む。より具体的にはアジュバントは、抗原の存在下でアジュバントが誘導する免疫応答のタイプに従って分類することもできる。本発明による免疫原性組成物において使用することができるアジュバントは、Ｔｈ１誘導アジュバントである。

【0098】

「Ｔｈ１誘導」アジュバントは、抗原または抗原の組合せに対するＴｈ１応答を増強するアジュバントとして定義することができる。

【0099】

免疫応答は、体液性または細胞媒介性免疫応答（伝統的に、それぞれ抗体および細胞性エフェクター防御機構によって特徴付けられる）の２つの極端なカテゴリーに大別することができる。これらのカテゴリーの応答は、Ｔｈ１型応答（細胞媒介性応答）、およびＴｈ２型免疫応答（体液性応答）と呼ばれている。マウスでは、Ｔｈ１型応答は、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｃサブタイプ（マウス株に応じて）の抗体の生成によってしばしば特徴付けられが、ヒトでは、これらはＩｇＧ１およびＩｇＧ３型抗体に対応し得る。Ｔｈ２型免疫応答は、マウスのＩｇＧ１、ＩｇＡ、およびＩｇＭを含む広範囲の免疫グロブリンアイソタイプの生成によって特徴付けられる。Ｔｈ１型およびＴｈ２型免疫応答はまた、サイトカイン分泌の異なるパターンによっても特徴付けられる（Ｍｏｓｍａｎｎら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８９、７：１４５～１７３頁；Ｃｏｎｓｔａｎｔら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９７、１５：２９７～３２２頁）。Ｔｈ１型免疫応答は、Ｔリンパ球によるＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－２サイトカインの産生増加を伴うが、Ｔｈ－２型免疫応答は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、および／またはＩＬ－１０サイトカインの産生増加を伴う。Ｔｈ１およびＴｈ２型免疫応答の区別は絶対的でない。実際には、対象は、Ｔｈ１優位またはＴｈ２優位と言い表される免疫応答を支持することになる。伝統的に、ワクチン接種または感染後の免疫応答のＴｈ１：Ｔｈ２バランスの最良の指標には、抗原で刺激したときのインビトロでのＴリンパ球によるＴｈ１もしくはＴｈ２サイトカイン産生の直接測定、および／または抗原特異的抗体応答のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ、ｃ比の測定（少なくともマウスにおいて）が挙げられる。

【0100】

また、本発明による免疫原性組成物の態様において、免疫応答をＴｈ１型優位に誘導するアジュバントは、Ｔｈ１誘導アジュバントとみなされる。優先的には、本発明による免疫原性組成物において使用することができるアジュバントは、免疫応答をＴｈ１型優位に誘導する。

【0101】

以前に述べたように、これは、マウスにおけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ、ｃ比の測定によって決定することができる。ＩＮＦ－γの増加は、優位なＴｈ１応答のさらなる指標であ
る。好ましくは、ＩＬ－５の産生減少も観察される。

【0102】

好ましくは、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原およびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む本発明による免疫原性組成物において使用することができるＴｈ１誘導アジュバントは、同じＨＣＭＶ ｇＢ抗原および同じＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む組成物中のＭＦ５９より多くのＴｈ１偏向応答プロファイルを誘導する。

【0103】

ＭＦ５９は、特許出願ＷＯ９０／１４８３７、米国特許第６，２９９，８８４号および６，４５１，３２５号、ならびにＯｔｔら、「ＭＦ５９－－Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５、２７７～２９６頁）に記載されたスクアレンベースの水中油型エマルジョンである。

【0104】

特に、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原およびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む本発明による免疫原性組成物において使用することができるＴｈ１誘導アジュバントは、同じＨＣＭＶ ｇＢ抗原および同じＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む組成物中のＭＦ５９より低いＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ、ｃ比をマウスにおいて誘導する。

【0105】

より具体的には、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原およびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む本発明による免疫原性組成物において使用することができるＴｈ１誘導アジュバントは、同じＨＣＭＶ ｇＢ抗原および同じＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む組成物中のＭＦ５９より高いＩＮＦ－γレベルをマウスにおいて誘導する。

【0106】

さらにより具体的には、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原およびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む本発明による免疫原性組成物において使用することができるＴｈ１誘導アジュバントは、同じＨＣＭＶ ｇＢ抗原および同じＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む組成物中のＭＦ５９より低いＩＬ－５レベルをマウスにおいて誘導する。

【0107】

さらにより具体的には、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原およびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む本発明による免疫原性組成物において使用することができるＴｈ１誘導アジュバントは、同じＨＣＭＶ ｇＢ抗原および同じＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む組成物中のＭＦ５９より、低いＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ、ｃ比および高いＩＮＦ－γレベルをマウスにおいて誘導する。

【0108】

特に、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原およびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む本発明による免疫原性組成物において使用することができるＴｈ１誘導アジュバントは、同じＨＣＭＶ ｇＢ抗原および同じＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む組成物中のＭＦ５９より、低いＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ、ｃ比および低いＩＬ－５レベルをマウスにおいて誘導する。

【0109】

より具体的には、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原およびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む本発明による免疫原性組成物において使用する
ことができるＴｈ１誘導アジュバントは、同じＨＣＭＶ ｇＢ抗原および同じＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む組成物中のＭＦ５９より、低いＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ、ｃ比、高いＩＮＦ－γレベルおよび低いＩＬ－５レベルをマウスにおいて誘導する。

【0110】

特に、本発明による免疫原性組成物は：
－ ＨＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；および
－ Ｔｈ１誘導アジュバント
を含み、前記Ｔｈ１誘導アジュバントが、同じＨＣＭＶ ｇＢ抗原および同じＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む組成物中のＭＦ５９より、低いＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ、ｃ比、および／または高いＩＮＦ－γレベル、および／または低いＩＬ－５レベルをマウスにおいて誘導する、免疫原性組成物である。

【0111】

特に、本発明によるＴｈ１誘導アジュバントは：
－ ＴＬＲ－４アゴニスト；または
－ ３５０～６５０ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗを有する直鎖または分枝鎖ポリアクリル酸ポリマー塩
を含む。

【0112】

特に、本発明による免疫原性組成物は：
－ ＨＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；および
－ Ｔｈ１誘導アジュバント
を含み、前記Ｔｈ１誘導アジュバントが：
－ リポ多糖、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、第二世代の脂質アジュバント（ＳＬＡ）、非炭水化物骨格およびアミノアルキルグルコサミニドホスフェートによって連結されたリン脂質二量体、もしくはそれらの誘導体からなる群から選択されるＴＬＲ－４アゴニスト；または
－ ３５０～６５０ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗを有するポリアクリル酸ポリマー塩
を含む、免疫原性組成物である。

【0113】

１つの実施形態において、前記Ｔｈ１誘導アジュバントはＴＬＲ－４アゴニストを含む。

【0114】

ＴＬＲ（ｔｏｌｌ様受容体）アゴニストは、天然のＴＬＲリガンド、ＴＬＲリガンド模倣物、合成または化学的ＴＬＲリガンド、病原体関連分子パターンを含む細胞または粒子、微生物病原体、細菌、ウイルスおよびウイルス様粒子を意味すると理解される。

【0115】

ＴＬＲ４（４型ｔｏｌｌ様受容体）は、免疫系の抗原提示細胞によって発現される受容体である；ＴＬＲ４は、グラム細菌感染に対する初期防御機構に関与する。グラム細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）は、ＴＬＲ４の天然のリガンドである；ＴＬＲ４は受容体を活性化し、生化学的事象のカスケード、特にＮｆ－カッパＢ転写因子の活性化、および炎症促進性サイトカインの産生の引き金を引く。ＴＬＲ４経路を刺激する化合物の能力は、例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（２００１）、２７６巻（３）、１８７３～１８８０頁に記載されているような当業者に公知の方法によって
評価することができる。

【0116】

ＴＬＲ４アゴニストの例には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、またはその誘導体、特に、ＧＢ２２１１５０２もしくはＵＳ４９１２０９４に記載の３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）、またはその誘導体、グルコピラノシル脂質アジュバントもしくはＧＬＡとも呼ばれるリン酸化ヘキサアシル二糖（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｈｅｘａａｃｙｌ ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（ＣＡＳ番号１２４６２９８－６３－４）またはその誘導体、第二世代の脂質アジュバント（ＳＬＡ）（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１６、５（１１）：ｅ１０８頁またはＥＰ２４３７７５３またはＵＳ９４８０７４０に記載された）、またはその誘導体、ＷＯ９８／５０３９９もしくはＷＯ０１／０３４６１７に記載のアミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）、またはその誘導体、特に、ＵＳ６，１１３，９１８に記載されたＲＣ５２９、またはその誘導体、ならびにＵＳ２００３／０１５３５３２もしくはＵＳ２００５／０１６４９８８に記載の非炭水化物骨格によって連結された化学的化合物もしくはリン脂質二量体（ホモ二量体またはヘテロ二量体）、またはその誘導体、特に、以下の名称：ＥＲ８０３０２２（ＣＡＳ番号：２８７１８０－５６－７）、ＥＲ８０３０５８（ＣＡＳ番号：２８７１８０－５７－８）、ＥＲ８０３７３２（ＣＡＳ番号：２８７１０６－２９－０）、ＥＲ８０３７８９（ＣＡＳ番号：２８７１８０－６１－４）、ＥＲ８０４０５３（ＣＡＳ番号：２８７１８０－６２－５）、ＥＲ８０４０５７（ＣＡＳ番号：２８７１８０－６３－６）、ＥＲ８０４０５８（ＣＡＳ番号：２８７１８０－６５－８）、ＥＲ８０４０５９（ＣＡＳ番号：２８７１８０－６４－７）、ＥＲ８０４４４４２（ＣＡＳ番号：２８７１８０－７８－３）、ＥＲ８０４７６４（ＣＡＳ番号：２８７１８０－８７－４）、ＥＲ１１１２３２（ＣＡＳ番号：２８７１８０－４８－７）、ＥＲ１１２０２２（ＣＡＳ番号：２８７１８０－４６－５）、ＥＲ１１２０４８（ＣＡＳ番号：２８７１０６－０２－９）、ＥＲ１１２０６５（ＣＡＳ番号：２８７１８０－４９－８）、ＥＲ１１２０６６（ＣＡＳ番号：２８７１８０－５０－１）、ＥＲ１１３６５１（ＣＡＳ番号：２８７１８０－５１－２）、ＥＲ１１８９８９（ＣＡＳ番号：２８７１８０－５２－３）、ＥＲ１１９３２７（ＣＡＳ番号：２８７１８０－５４－５）およびＥＲ１１９３２８（ＣＡＳ番号：２８７１８０－５５－６）の下、ＵＳ２００３／０１５３５３２に同定および例示された化合物、またはその誘導体が挙げられる。これらの化合物は、１つまたはいくつかの不斉炭素を概ね有する。これらの化合物が１つまたはいくつかの不斉炭素を有するとき、化合物は、光学異性体の混合物としてまたは特異的異性体の形態で使用することができる。

【0117】

特に、前記ＴＬＲ－４アゴニストは、非炭水化物骨格によって連結されたリン脂質二量体およびＧＬＡ ＴＬＲ－４アゴニストから選択される。

【0118】

特に、ＴＬＲ４アゴニストは、非炭水化物骨格によって連結されたリン脂質二量体である。

【0119】

特に、ＴＬＲ４アゴニストは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの非炭水化物骨格によって連結された化学的化合物またはリン脂質二量体：
式Ｉの非炭水化物骨格によって連結された化合物またはリン脂質二量体

【化1】

【0120】

式ＩＩの非炭水化物骨格によって連結された化合物またはリン脂質二量体

【化2】

【0121】

式ＩＩＩの非炭水化物骨格によって連結された化合物またはリン脂質二量体

【化3】

【0122】

式ＩＶの非炭水化物骨格によって連結された化合物またはリン脂質二量体

【化4】

（式中、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの各々に関して、Ｒ１は：
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ_１～Ｃ_１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）、ここで、前記Ｃ_１～Ｃ_１４アルキルは、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_５アルコキシ、Ｃ_１～Ｃ_５アルキレンジオキシ、（Ｃ_１～Ｃ_５アルキル）アミノまたは（Ｃ_１～Ｃ_５アルキル）アリールと場合により置換され、ここで、前記（Ｃ_１～Ｃ_５アルキル）アリールの前記アリール部分は、Ｃ_１～Ｃ_５アルコキシ、（Ｃ_１～Ｃ_５アルキル）アミノ、（Ｃ_１～Ｃ_５アルコキシ）アミノ、（Ｃ_１～Ｃ_５アルキル）アミノ（Ｃ_１～Ｃ_５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ_１～Ｃ_５アルキル）アミノ（Ｃ_１～Ｃ_５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ_１～Ｃ_５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ_１～Ｃ_５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または－Ｏ－（Ｃ_１～Ｃ_５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ_１～Ｃ_５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ_１～Ｃ_５）アルキルと場合により置換されている；ｃ）ヒドロキシルまたはアルコキシと場合により置換されたＣ_２～Ｃ_１５直鎖または分枝鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ_６－Ｃ_１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－、ここで、前記アリーレンは、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロまたはアミノと場合により置換されている；
からなる群から選択され、
ａおよびｂは、独立に０、１、２、３または４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ’’、ｅ、ｅ’およびｅ’’は、独立に０、１、２、３または４であり；
Ｘ^１、Ｘ^２、Ｙ^１およびＹ^２は、空値、酸素、ＮＨおよびＮ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_１４アルキル））、およびＮ（Ｃ_１～Ｃ_１４アルキル）からなる群から独立に選択され；
Ｗ^１およびＷ^２は、カルボニル、メチレン、スルホンおよびスルホキシドからなる群から独立に選択され；
Ｒ^２およびＲ^５は：
ａ）オキソ、ヒドロキシルまたはアルコキシと場合により置換されている、Ｃ_２～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシルまたはアルコキシと場合により置換されている、Ｃ_２～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖アルケニルまたはジアルケニル、；
ｃ）オキソ、ヒドロキシルまたはアルコキシと場合により置換されている、Ｃ_２～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖アルコキシ；
ｄ）ＮＨ－（Ｃ_２～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖アルキル）、ここで、前記アルキル群は、オキソ、ヒドロキシまたはアルコキシと場合により置換されている；および
ｅ）

【化5】

（式中、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択され、ならびにＭおよびＮは、Ｃ_２～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖を含むアルキル、アルケニル、アルコキシ、アシルオキシ、アルキルアミノおよびアシルアミノからなる群から独立に選択される）からなる群から独立に選択され；
Ｒ^３およびＲ^６は、オキソまたはフルオロと場合により置換された、Ｃ_２～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖アルキルまたはアルケニルからなる群から独立に選択され；
Ｒ^４およびＲ^７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ_２～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖アルキルまたはアルケニル）、Ｃ_２～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖アルキル、Ｃ_２～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖アルコキ
シ、およびＣ_２～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖アルケニルからなる群から独立に選択され；ここで、前記アルキル、アルケニルまたはアルコキシ群は、ヒドロキシル、フルオロまたはＣ_１～Ｃ_５アルコキシと独立におよび場合により置換されている；
Ｇ_１、Ｇ_２、Ｇ_３およびＧ_４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_４アルキル））－からなる群から独立に選択され；
またはＧ_２Ｒ_４もしくはＧ_４Ｒ_７は、一緒に水素原子またはヒドロキシルであってもよく；
ならびにここで、式ＩＩＩに関して：
ａ’およびｂ’は、独立に２、３、４、５、６、７または８、好ましくは２であり；
Ｚ^１は、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）_２、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）_２、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ^８）（ＯＨ）からなる群から選択され、ここで、Ｒ^８は、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル鎖、－ＯＳ（Ｏ）_２ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）_２ＯＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＯＢ（ＯＨ）_２、－ＯＨ、－ＣＨ_３、－ＮＨ_２および－ＮＲ^９ _３であり、ここで、Ｒ^９はＣ_１～Ｃ_４アルキル鎖である；
Ｚ^２は、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）_２、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）_２、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ^１０）（ＯＨ）からなる群から選択され、ここで、Ｒ^１０は、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル鎖、－ＯＳ（ＯＨ）_２ＯＨ、－Ｓ（ＯＨ）_２ＯＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＯＢ（ＯＨ）_２、－ＯＨ、－ＣＨ_３、－ＮＨ_２および－ＮＲ^１１であり、ここで、Ｒ^１１はＣ_１～Ｃ_４アルキル鎖である；
ならびに式中、式ＩＶに関して：
Ｒ^１２は、ＨもしくはＣ_１～Ｃ_４アルキル鎖である）；
または式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの非炭水化物骨格によって連結された化合物またはリン脂質二量体の薬学的に許容される塩である。

【0123】

特に、本発明によるＴＬＲ４アゴニストは、式Ｉ

【化6】

の非炭水化物骨格によって連結された化学的化合物もしくはリン脂質二量体、
または非炭水化物骨格によって連結されたこの化合物もしくはリン脂質二量体の薬学的に許容される塩である。

【0124】

好ましくは、
Ｒ^１は、Ｃ（Ｏ）またはＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）であり（ｎは１、２、３または４）、
ａ、ｂ、ｄ、ｄ’、ｄ’’、ｅ、ｅ’およびｅ’’は独立に１または２であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２はＮＨであり、
Ｗ１およびＷ２はＣ（Ｏ）であり、
Ｒ^２およびＲ^５は、オキソと場合により置換されたＣ_１０～Ｃ_１５直鎖アルキル、ＮＨ－（Ｃ_１０～Ｃ_１５直鎖アルキル）、および

【化7】

（式中、ＭおよびＮは、独立にＣ２～Ｃ２０直鎖アルキルまたはアルケニルである）からなる群から独立に選択され、
Ｒ３およびＲ６は、Ｃ５～Ｃ１０直鎖アルキルであり、
Ｒ４およびＲ７は、水素、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ８～Ｃ１２直鎖アルキル）またはＣ（Ｏ）（Ｃ８ Ｃ１２直鎖アルケニル）からなる群から選択され、
Ｇ１およびＧ３は、酸素または－ＮＨ（ＣＯ）－であり、
Ｇ２およびＧ４は酸素である。

【0125】

特に、本発明によるＴＬＲ４アゴニストは、非炭水化物骨格によって連結された対称リン脂質二量体（ホモ二量体）である。より具体的には、非炭水化物骨格によって連結された対称リン脂質二量体は、トリアシルリン脂質（ｔｒｉａｃｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）の二量体である。より具体的には、前記ＴＬＲ－４アゴニストは、Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号：２８７１８０－６３－６）である。

【0126】

特に、前記ＴＬＲ－４アゴニストは、ＧＬＡ（ＣＡＳ番号１２４６２９８－６３－４）である。

【0127】

これらのＴＬＲ４アゴニストは、これらをリン酸カルシウム、リポソーム、ビロソーム、ＩＳＣＯＭ、マイクロ粒子およびナノ粒子、またはエマルジョンなどの送達系と組み合わせることもできる。

【0128】

そのため、特に、本発明によるＴＬＲ４アゴニストは、水性ナノ懸濁液、リン酸カルシウム、リポソーム、ビロソーム、ＩＳＣＯＭ、マイクロ粒子およびナノ粒子、またはエマルジョンなどの送達系との組合せである。

【0129】

そのような送達系は以前に記載されており、当業者に周知である。

【0130】

特に、前記ＴＬＲ－４アゴニストは、Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号：２８７１８０－６３－
６）およびＧＬＡ（ＣＡＳ番号１２４６２９８－６３－４）ＴＬＲ－４アゴニストから選択される。

【0131】

送達系と組み合わされるＴＬＲ４アゴニストの適切な製剤の例として、以下の化学式：

【化8】

を有する化合物の二ナトリウム塩である、化合物ＥＲ８０４０５７（現在はＥ６０２０と呼ばれる）（ＣＡＳ番号：２８７１８０－６３－６）をＴＬＲ４アゴニストとして含む水中油型エマルジョンを引用することができる。

【0132】

Ｅ６０２０の４個の不斉炭素は、全てＲ配置（Ｒ，Ｒ，Ｒ，Ｒ）である。そのようなエマルジョンは、例えばＷＯ２００４／０６０３９６に記載の顕微溶液化法、またはＷＯ２００７／０８０３０８に記載の転相温度プロセス（ＰＩＴプロセス）によって得ることができる。

【0133】

そのため、特に、本発明によるＴＬＲ４アゴニストは、水中油型エマルジョン、より具体的には、スクアレンベースの水中油型エマルジョンとの組合せである。

【0134】

本発明の目的に適した水中油型エマルジョンは、代謝性油（油の容量がエマルジョンの総容量の０．５～２０％（ｖ／ｖ）、特に１～１０％（ｖ／ｖ）、およびより具体的には１～５％（ｖ／ｖ）に相当する）、水溶液（水溶液の容量が総容量の８０～９９．５％（ｖ／ｖ）、特に９０～９９％（ｖ／ｖ）に相当する）および１つまたはいくつかの乳化剤（乳化剤の総量がエマルジョンの総量の０．００１～５％（ｗ／ｗ）、特に０．００１～２％（ｗ／ｗ）、およびより具体的には０．０１～２％（ｗ／ｗ）に相当する）を含む。代謝性油は一般に、アルカン、アルケン、アルキン、ならびにそれらの対応する酸およびアルコール、そのエーテルおよびエステル、およびその混合物を含むがこれらに限定されない、約６個～約３０個の炭素原子を有するものである。油は、エマルジョン組成物が投与されるヒト対象の身体によって代謝され、対象にとって実質的に毒性がない、本質的に任意の植物油、魚油、動物油または合成的に製造された油であってもよい。代謝性油は、２０～４０個の炭素を有する不飽和炭化水素、または２０～４０個の炭素原子を有する分枝鎖多価不飽和炭化水素、例えば、テルペノイドであてもよい。スクアレン、２，６，１
０，１５，１９，２３－ヘキサメチル－２，６，１０，１４，１８，２２－テトラコサヘキサエンとして知られる不飽和テルペノイド、およびその飽和類似体、スクアランがしばしば好ましい。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であり、または当技術分野で公知の方法によって得ることができる。一般に使用される別の油はトコフェロールである。組成物がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、εまたはξトコフェロールのいずれかが使用されるが、α－トコフェロールが好ましい。相当な数の適切な乳化剤（表面活性物質、界面活性剤等とも呼ばれる）が薬学で使用され、その多くは、十分に非毒性である限り本発明のエマルジョンの組成物において有用である。生物学的状況用に特異的に設計され、および生物学的状況で一般に使用される数多くの乳化剤がある。例えば、数多くの生物学的界面活性剤（表面活性物質）がそのためＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌによってリストされている。そのような表面活性物質は、４つの基本タイプ：アニオン性、カチオン性、双性イオン性、および非イオン性に分けられる。

【0135】

アニオン性界面活性剤の例には、アルギン酸、カプリル酸、コール酸、１－デカンスルホン酸、デオキシコール酸、１－ドデカンスルホン酸、Ｎ－ラウロイルサルコシン、およびタウロコール酸が挙げられる。

【0136】

カチオン性界面活性剤には、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルベンゼトニウム、および４－ピコリンドデシルスルフェートが挙げられる。

【0137】

双性イオン性界面活性剤の例には、３－［（３－コールアミドプロピル）－ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（一般にＣＨＡＰＳと略される）、３－［（コールアミドプロピル）ジメチオアンモニオ－２－ヒドロキシ－ｌ－プロパンスルホネート（一般にＣＨＡＰＳＯと略される）、Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート、ホスファチジルコリンおよびリゾ－アルファ－ホスファチジルコリンが挙げられる。

【0138】

非イオン性界面活性剤の例には、デカノイル－Ｎ－メチルグルカミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ｎ－ドデシル ベータ－Ｄ－グルコピラノシド、ポロキサマー、脂肪アルコールのエチレンオキシド縮合物（例えば、商品名Ｌｕｂｒｏｌで販売されているもの）、脂肪酸のポリオキシエチレンエーテル（特にＣ１２～Ｃ２０脂肪酸）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、商品名Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で販売されている）、およびソルビタン脂肪酸エステル（例えば、商品名Ｓｐａｎ（登録商標）で販売されている）が挙げられる。

【0139】

特に有用な表面活性物質群は、ソルビタンベースの非イオン性表面活性物質である。これらの表面活性物質は、ソルビトールを脱水して１，４－ソルビタンを得、次いでこれが１またはそれ以上の当量の脂肪酸と反応されることによって典型的には製造される。脂肪酸置換部分は、エチレンオキシドとさらに反応されて第２の表面活性物質群を得ることができる。

【0140】

脂肪酸置換ソルビタン表面活性物質は、１，４－ソルビタンを、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、または類似の長鎖脂肪酸などの脂肪酸と反応させて１，４－ソルビタンモノエステル、１，４－ソルビタンセスキエステルまたは１，４－ソルビタントリエステルを得ることによって典型的には作られる。これらの表面活性物質のいくつかに関する一般名には、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエート、およびソルビタントリオレエートが挙げられる。これらの表面活性物質は、Ｓ
ＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）という名称で市販されている。ＳＰＡＮ（登録商標）およびＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）表面活性物質は親油性であり、一般に油に可溶性または分散性である。これらはまた、ほとんどの有機溶媒に可溶性である。これらは水には一般に不溶性であるが、分散性である。一般にこれらの表面活性物質は、１．８～８．６の間の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）数を有する。そのような表面活性物質は、当技術分野で公知の手段によって容易に作ることができ、または市販されている。

【0141】

関連する表面活性物質群は、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステルおよびポリオキシエチレンソルビタントリエステルを含む。これらの材料は、典型的には、エチレンオキシドを１，４－ソルビタンモノエステルまたはトリエステルに付加して製造される。ポリオキシエチレンの付加は、親油性ソルビタンモノエステルまたはトリエステル表面活性物質を、水には一般に可溶性または分散性であり、有機液体には様々な程度に可溶性である親水性表面活性物質に変換する。ＴＷＥＥＮ（登録商標）表面活性物質は、エマルジョン安定性を促進するために、例えば、関連するソルビタンモノエステルまたはトリエステル表面活性物質と組み合わせることができる。ＴＷＥＥＮ（登録商標）表面活性物質は一般に、９．６～１６．７の間にあるＨＬＢ値を有する。ＴＷＥＥＮ（登録商標）表面活性物質は、数多くの製造業者、例えばＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ．、ウィルミントン、デラウエアから、登録商標ＡＴＬＡＳ（登録商標）表面活性物質で市販されている。

【0142】

単独で、またはＳＰＡＮ（登録商標）、ＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）表面活性物質と併用して使用することができる別の非イオン性表面活性物質群は、エチレンオキシドと長鎖脂肪酸との反応によって作られるポリオキシエチレン脂肪酸である。このタイプの最も一般的に利用可能な表面活性物質は、ＭＹＲＪ（登録商標）という名称で販売されており、ステアリン酸のポリオキシエチレン誘導体である。ＭＹＲＪ（登録商標）表面活性物質は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）表面活性物質と同じように親水性で、水に可溶性または分散性である。ＭＹＲＪ（登録商標）表面活性物質は、エマルジョンの形成において使用するために、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）表面活性物質、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）／ＳＰＡＮ（登録商標）もしくはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）表面活性物質混合物とブレンドしてもよい。ＭＹＲＪ（登録商標）表面活性物質は、当技術分野で公知の方法によって作ることができ、またはＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ．から市販されている。

【0143】

ポリオキシエチレンベースの非イオン性表面活性物質の別の群は、ラウリル、アセチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから得られるポリオキシエチレン脂肪酸エーテルである。これらの材料は、典型的には、エチレンオキシドを脂肪アルコールに付加して上記のように製造される。これらの表面活性物質の商品名は、ＢＲＩＪ（登録商標）である；ＢＲＩＪ（登録商標）表面活性物質は、表面活性物質のポリオキシエチレン部分のサイズに応じて親水性または親油性であり得る。これらの化合物の製造は当技術分野から利用可能であるが、これらの化合物はまた、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ．などの商業的供給源から容易に入手可能である。

【0144】

本発明の実践において使用することができる他の非イオン性表面活性物質は、例えば：ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンを含有する蜜蝋誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、グリセリン脂肪酸エステルまたは他のポリオキシエチレン酸アルコールもしくは１２～２２炭素原子の長鎖脂肪酸のエーテル誘導体である。好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、セテアレス－１２（Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）Ｂ１という名称で販売されている）、セテアレ
ス－２０（Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）Ｂ２）、ステアレス－２１（Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）Ｓ２１）、セテス－２０（Ｓｉｍｕｌｓｏｌ（登録商標）５８またはＢｒｉｊ（登録商標）５８）、セテス－１０（Ｂｒｉｊ（登録商標）５６）、ステアレス－１０（Ｂｒｉｊ（登録商標）７６）、ステアレス－２０（Ｂｒｉｊ（登録商標）７８）、オレス－１０（Ｂｒｉｊ（登録商標）９６またはＢｒｉｊ（登録商標）９７）およびオレス－２０（Ｂｒｉｊ（登録商標）９８またはＢｒｉｊ（登録商標）９９）からなる群から選択される。各化学名に帰する数は、化学式のエチレンオキシド単位の数に対応する。特定の態様において、ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（商標）Ｂ１という名称でＣｏｇｎｉｓ社によって提供されているＢＲＩＪ（登録商標）５６またはポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテルである。９未満のＨＬＢを有する特に適切なソルビタンエステルおよびマンニドエステルベースの表面活性物質の中でも、Ｄｅｈｙｍｕｌｓ ＳＭＯＴＭまたはＳｐａｎ（登録商標）８０という名称で販売されているソルビタンモノオレエートを挙げることができる。マンニドエステルベースの表面活性物質の中でも、Ｓｉｇｍａ社、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ８０（商標）の名称でＳｅｐｐｉｃ社によって販売されているマンニドモノオレエートを挙げることができる。

【0145】

本発明の組成物のエマルジョン部分で、２つ以上の表面活性物質を組み合わせることができる。

【0146】

本発明の組成物のＯ／Ｗエマルジョン部分の水溶液は、緩衝食塩水または純水である。本発明の組成物は非経口投与が意図されるため、組成物と生理学的流体の間のイオン濃度の差分による組成物の投与後の膨張または急速な吸収を防ぐために、ワクチンとして使用される最終緩衝溶液を、張度、すなわち、浸透圧が通常の生理学的流体と本質的に同じとなるように作ることが好ましい。通常の生理学的条件と適合するｐＨを維持するために、食塩水を緩衝することも好ましい。また、特定の場合では、ｇＢ抗原およびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原がＯ／Ｗエマルジョン中に存在するならば、これらの安定性を確実にするためにｐＨを特定のレベルに維持することも必要である場合がある。

【0147】

いずれの生理学的に許容される緩衝液も本明細書で使用することができるが、リン酸緩衝液が好ましい。酢酸、トリス、重炭酸、炭酸、クエン酸等などの他の許容される緩衝液が、リン酸緩衝液の代替物として使用される。水性成分のｐＨは、好ましくは６．０～８．０の間である。

【0148】

本発明の組成物のＯ／Ｗエマルジョン部分は、Ｏ／Ｗエマルジョンを製造する時点で付加し得る、またはＯ／Ｗエマルジョンが製造されたら付加し得る補足成分を含んでもよい。

【0149】

例には、ＷＯ２００７／０８０３０８に記載されたプロセスに従って得られたＥ６０２０を含有するスクアレンベースの水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョン、ＡＦ０４を示すことができる。

【0150】

ＧＬＡ（ＣＡＳ番号１２４６２９８－６３－４）ＴＬＲ－４アゴニストは、以下の化学式：

【化9】

を有する化合物である。

【0151】

ＧＬＡは、例えばＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒのカタログ、参照番号６９９８００で購入することができる（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバスター、米国）。

【0152】

特に、ＧＬＡは、リン酸カルシウム、リポソーム、ビロソーム、ＩＳＣＯＭ、マイクロ粒子およびナノ粒子、またはエマルジョンなどの送達系との組合せである。優先的には、ＧＬＡは、水中油型エマルジョン、より具体的には、スクアレンベースの水中油型エマルジョンとの組合せである。

【0153】

例には、ＧＬＡを含有するスクアレンベースの水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョン、ＧＬＡ－ＳＱＥＭを示すことができる。

【0154】

以下の表１には、１０％スクアレンの濃度でＧＬＡ－ＳＱＥＭ１００ｍＬを得るのに使用される種々の原料の量が述べられている。最終エマルジョンは、リン酸アンモニウム２２．５ｍＭにスクアレン４％（ｖ／ｖ）（３４ｍｇ／ｍｌ）およびＧＬＡ１００μｇ／ｍＬを含有する。

【0155】

【表1】

【0156】

油相は、槽で５５～６０℃の超音波処理によって製造される。次いで、水相が油相の上に添加される（秤量）。３０秒、２サイクル中、Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５（ＩＫＡ）で９５００ｒ／分の均質化後にプレエマルジョンが得られる。次いで、顕微溶液化がＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３で５５ｐｓｉの空気圧（１４５０～１６００ｂａｒの間の均質化圧力）で２０回通過中に行われる。エマルジョンは、次いで２５ｍＭアンモニウムリン酸緩衝液に２．５倍希釈されて、４％スクアレンで最終ＧＬＡ－ＳＱＥＭエマルジョンを得る。エマルジョンは、１０ｍｌシリンジおよびＡｃｒｏｄｉｓｃ ０．８～０．２μｍ Ｓｕｐｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅフィルター（ＰＡＬＬ ｎ°ＰＮ４１８７）を用いて約４０℃で滅菌濾過される。

【0157】

ＴＬＲ４アゴニストを含む他の適切なアジュバントは、リポソーム製剤に３Ｄ－ＭＰＬおよびＱＳ２１を含むＡＳ０１、または水中油型エマルジョンに製剤化された３Ｄ－ＭＰＬおよびＱＳ２１を含むＡＳ０２（Ｇａｒｃｏｎら、Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２００７、６（５）：７２３～７３９頁、ＥＰ０６７１９４８）である。

【0158】

１つの実施形態において、前記Ｔｈ１誘導アジュバントは、３５０～６５０ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗを有する直鎖または分枝鎖ポリアクリル酸ポリマー塩である。

【0159】

前記ポリマーは、直鎖または分枝鎖ポリアクリル酸ポリマーであるが、架橋ポリマーではない。

【0160】

「ポリアクリル酸ポリマー」とは、アクリル酸単位だけからなるポリマーを意味する。そのため、塩の形態では、前記ポリアクリル酸ポリマー塩は、アクリル酸の塩に対応する単位だけからなる、またはアクリル酸の遊離酸形態に対応する単位およびアクリル酸の塩に対応する単位だけからなる。

【0161】

直鎖または分枝鎖ポリアクリル酸ポリマーは、単量体としてのアクリル酸のみの重合に
よって得られる。重合は、ほとんどの場合、開始剤または触媒として酸化剤を使用するラジカル重合によって実行される。最も使用される酸化剤は、過硫酸塩（ペルオキシ二硫酸塩）、例えば過硫酸ナトリウムまたはカリウムである。分枝鎖ポリアクリル酸ポリマーは、例えば、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１１、４４、５９２８～５９３６頁に記載されている。本発明によるポリマーが直鎖である場合、そのＭａｒｋ Ｈｏｕｗｉｎｋの傾きは０．７より高いまたは０．７に等しい（Ｙａｎ Ｊ．Ｋ．、Ｐｅｉ Ｊ．Ｊ．、Ｍａ Ｈ．Ｌ．、Ｗａｎｇ Ｚ．Ｂ．２０１５．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｃｈａｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｃｕｒｄｌａｎ．Ｃａｒｂ．Ｃａｒｂ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．１２１、６４～７０頁）。

【0162】

ポリアクリル酸ポリマー塩は、固体形態（沈殿物または粉末）中または好ましくは液体製剤中にあってもよい。液体製剤は、ポリアクリル酸ポリマー塩および水溶液を含むことになる。好ましくは、そのような製剤は、５．５～８．０の範囲のｐＨを有する。このｐＨは、ＮａＯＨのような塩基を水溶液に取り込むことによって得ることができる。水溶液は、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ（２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール）、Ｈｅｐｅｓ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ヒスチジンまたはクエン酸緩衝液などの緩衝液を用いて得られる緩衝液水溶液であってもよい。液体製剤はまた、１つまたはいくつかのＮａＣｌなどの追加の塩を含んでもよい。

【0163】

特に、前記直鎖または分枝鎖ポリアクリル酸ポリマー塩は、アクリル酸の塩に対応する単位だけからなる、またはアクリル酸の遊離酸形態に対応する単位およびアクリル酸の塩に対応する単位だけからなる。

【0164】

有利には、前記ポリアクリル酸ポリマー塩は、前記ポリアクリル酸ポリマー塩の総乾燥重量に対して０．００５％未満、好ましくは０．００１％未満（ｗ／ｗ）の酸化剤を含み、および／または前記ポリアクリル酸ポリマー塩の総乾燥重量に対して０．００５％未満、好ましくは０．００１％未満（ｗ／ｗ）の過硫酸塩を含む。

【0165】

より具体的な実施形態において、前記ポリアクリル酸ポリマーはＮａ＋を用いた塩である。

【0166】

具体的な実施形態において、前記ポリアクリル酸ポリマー塩は約４以下、好ましくは約２．５以下の多分散指数を有する。

【0167】

具体的な実施形態において、前記ポリアクリル酸ポリマー塩は、３８０～６２０ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗおよび４以下の多分散指数を有する；または４００～６００ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗおよび４以下の多分散指数を有する；または３８０～６２０ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗおよび２．５以下の多分散指数を有する；または４００～６００ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗおよび２以下の多分散指数を有する。

【0168】

有利には、前記ポリアクリル酸ポリマー塩は、前記ポリアクリル酸ポリマー塩の総乾燥重量に対して、遊離酸形態または塩形態で０．００５％ｗ／ｗ未満のアクリル酸単量体を含む。

【0169】

有利な実施形態によれば、前記ポリアクリル酸ポリマー塩は、５．５～８．０の範囲のｐＨを有する液体製剤液体製剤中にある。

【0170】

有利な実施形態によれば、前記ポリアクリル酸ポリマー塩は、特にリン酸緩衝液、またはＴＲＩＳ、Ｈｅｐｅｓ、ヒスチジンもしくはクエン酸緩衝液を用いた緩衝液水溶液中にある。

【0171】

有利な実施形態によれば、前記ポリアクリル酸ポリマー塩は、透析濾過および滅菌される。

【0172】

ポリアクリル酸ポリマー塩またはポリアクリル酸ポリマー塩の液体製剤が透析濾過される場合、透析濾過後に滅菌が生じる。

【0173】

本発明によれば、重量平均分子量Ｍｗはサイズ排除クロマトグラフィーによって得られる。有利には、３つの検出器：右角度光散乱検出器、屈折率検出器および４キャピラリー示差粘度計が、サイズ排除クロマトグラフィーカラム後に使用される。Ｍｗの決定に使用されるｄｎ／ｄｃは、好ましくは、既知の濃度のポリアクリル酸ポリマーのパネルを備えた屈折率検出器を使用して決定される。過硫酸塩の含量および遊離酸形態または塩形態のアクリル酸単量体の含量は、導電率検出による高速陰イオン交換クロマトグラフィーによって決定することができる。

【0174】

そのようなポリマーを製造するプロセスは、例えば以下の連続工程：
ａ）ポリアクリル酸ポリマーの溶液を有する工程、
ｂ）不純物を取り除くために、ポリアクリル酸ポリマーの溶液を精製する工程、
および
ｃ）精製されポリアクリル酸ポリマーの溶液を滅菌する工程
を含む。

【0175】

そのようなポリマー塩の溶液を保管するプロセスは、例えば、上述した製造プロセスと、これに続く溶液中での得られたポリマーの保管工程を含む。

【0176】

特に、３５０～６５０ｋＤａの範囲の重量平均分子量Ｍｗを有する前記直鎖または分枝鎖ポリアクリル酸ポリマー塩は、ＰＡＡ２２５０００である。

【0177】

ＰＡＡ２２５０００と名付けられた製品（参照番号１８６１３、ナトリウム塩）は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ（エッペルハイム、ドイツ）から濃縮溶液の形態で得ることができる。これが水で希釈されて２０ｍｇ／ｍｌの濃度を得、１２時間の間、室温、撹拌下で維持される。ｐＨはＨＣｌで７．５５に調整され、溶液は、２ｋＤａカットオフ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、コートアボフ、フランス）を使用して１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液に対して室温で透析される（３連続槽）。溶液は、次いで滅菌のために０．２２μｍ ＰＶＤＦ膜を通じて濾過される。ポリマー塩の分子量が次いで測定され、４８８５５０Ｄａであり得る。ポリマー塩のＭｎは１２９０７０Ｄａであり得、このＩＰは３．８であり得る。

【0178】

ポリマーは、次いで、１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液にポリマー２０ｍｇ／ｍｌを含む溶液として＋４℃で保管される。この溶液は、次いで、ポリマー塩２ｍｇ／ｍｌを含む食塩水溶液を得るために、滅菌水で１０倍に濃縮されたＰＢＳ １Ｃと混合される。

【0179】

いずれの他のＴｈ１誘導アジュバントも、本発明の組成物において使用することができる。Ｔｈ１型免疫応答を優位に誘導することが知られているアジュバントの例として、以下のものが引用される：サポニン、例えばＷＯ８８０９３３６もしくはＵＳ５０５７５４０に記載されているもの、特にＱＳ２１およびその合成もしくは半合成類似体、ＴＬＲ３
アゴニスト、例えばポリＩ：Ｃおよびその誘導体、ＴＬＲ５アゴニスト、例えばフラジェリンおよびその誘導体、ＴＬＲ７アゴニストもしくはＴＬＲ７／８アゴニスト、例えばイミダゾキノリンおよびその誘導体、例えばＥＰ１３１８８３５に記載されているもの、ＴＬＲ８アゴニスト、例えばＶＴＸ－２３３７としても知られるモトリモド（Ｌｕら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２０１２、１８（２）：４９９～５０９頁に記載の）およびその誘導体もしくはＤｙｎａｖａｘによって開発されたＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、例えばＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよびその誘導体（例えばＶｏｌｌｍｅｒら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００５、５（５）：６７３～６８２頁に記載されている）、特にＩＳＳ１０１８もしくはＣｐＧ７９０９、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）アゴニスト、例えばＲＩＧ－Ｉアゴニスト、特にＫｉｎｅｔａ製５’三リン酸ＲＮＡもしくは低分子量アゴニスト、またはインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、特に環状ジヌクレオチド（例えばｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＧＡＭＰ）、Ｐａｙｎｅら、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ．１９９８、９２：７９～８７頁に記載のポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＰＰ）、Ｄａｒ Ａら、Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、２０１２、１４６（３～４）：２８９～９５頁に記載のポリ［ジ（ナトリウムカルボキシラトエチルフェノキシ）］ホスファゼン（ＰＥＣＰ）、またはカーボポールを含む、アジュバントまたはアジュバントの組合せ。

【0180】

これらのＴｈ１誘導アジュバントは、水性ナノ懸濁液、リン酸カルシウム、リポソーム、ビロソーム、ＩＳＣＯＭ、マイクロ粒子およびナノ粒子、エマルジョンなどの送達系と組み合わせることができる。

【0181】

本発明による免疫原性組成物のアジュバントおよび抗原は、任意の薬学的に許容されるビヒクルと共に製剤化することができる。本発明の文脈において、表現「薬学的に許容されるビヒクル」は、本発明による免疫原性組成物の生理学的活性、すなわち免疫応答を誘導するその能力を保持しながら、ヒトへの投与のための生理学的に許容されるビヒクルを指す。１つの例示的な薬学的に許容されるビヒクルは、生理食塩水緩衝液である。他の生理学的に許容されるビヒクルは当業者に公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａに記載されている。本明細書に記載の免疫原性組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤等などの生理学的条件に近づけるのに必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ヒト血清アルブミン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、塩酸Ｌ－アルギニン、サッカロース、Ｄ－トレハロース無水物、ソルビトール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび／または尿素を場合により含有してもよい。さらに、ワクチン組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、および保存剤を含む、薬学的に許容される添加剤を場合により含んでもよい。

【0182】

免疫原性組成物のｐＨは、通常は５．５～８の間、より好ましくは６．５～７．５の間（例えば約７）である。安定なｐＨは、緩衝液、例えばトリス緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、またはヒスチジン緩衝液の使用によって維持することができる。故に、免疫原性組成物は一般に緩衝液を含む。免疫原性組成物は、ヒトに関して等張であってもよい。免疫原性組成物はまた、ＮａＣｌなどの１つまたはいくつかの追加の塩も含んでもよい。

【0183】

免疫原性組成物は、従来の滅菌手法によって滅菌され、または滅菌濾過される。得られた水溶液は、液体形態で包装および保管され、または凍結乾燥される。凍結乾燥製造物は
、投与の前に滅菌水性担体で再構成される。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ＷＯ２００９１０９５５０に記載のプリル化プロセスを介してマイクロペレットとして包装および保管される。各マイクロペレットは、場合により水中油型エマルジョンと共に、ｇＢ抗原、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原およびＴｈ１誘導アジュバントを含み得る。あるいは、場合により水中油型エマルジョンとのｇＢ抗原、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原およびＴｈ１誘導アジュバントは、本発明の組成物を得るために水性再構成の前後に混合される異なるマイクロペレットに、単独でまたは任意の組合せで含まれる。

【0184】

本発明による免疫原性組成物のアジュバントおよび抗原部分は、製品間で不適合がなければ通常一緒に混合され、またはあるいはアジュバントは、対象への投与の直前にその場で添加することができる。

【0185】

１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原、ＨＣＭＶ
ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原およびＴｈ１誘導アジュバントの既製の混合物として製造される。

【0186】

別の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ヒト対象への投与の直前にその場で製造される。故に、本発明は、すぐに混合可能な様々な成分を含むキットを提供する。キットは、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原、Ｔｈ１誘導アジュバントおよび場合により水中油型エマルジョンを使用時まで別々に保たれるようにする。

【0187】

これらの成分は、キット内で互いに物理的に分離され、この分離は様々な方法で達成することができる。例えば、成分は、バイアルなどの別々の容器中にあってもよい。いくつかの構成において、全ての成分は使用時まで別々に保たれる。好ましくは、ｇＢ抗原およびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原は同じ容器中にあり、Ｔｈ１誘導アジュバントおよび場合により水中油型エマルジョンは別の容器中にある。バイアルの内容物は、次いで、例えば、１つのバイアルの内容物を取り出し、これを他のバイアルに添加することによって、または全てのバイアルの内容物を別々に取り出し、これらを新たな容器で混合することによって混合することができる。１つの例において、１つまたはそれ以上のキット成分はシリンジ中にあり、および他方はバイアルなどの容器中にある。シリンジは、混合のためにその内容物を別の容器に挿入するのに使用され（例えば、針を用いて）、混合物は次いでシリンジに吸引される。シリンジの混合された内容物は、次いで、典型的には新たな滅菌針を介して患者に投与される。別の構成において、キット成分は、同じシリンジ中で一緒に保持されるが、別々に保持される。シリンジが作動されると（例えば、患者への投与中に）、チャンバーの内容物が混合される。この構成は、使用時の別々の混合工程の必要性を回避する。キット成分は、一般に水性形態である。いくつかの構成において、１つまたはそれ以上の成分は、乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態でまたはマイクロペレットとして）であり、他の成分は水性形態である。乾燥成分を再活性化し、患者への投与用の水性組成物を得るために、成分は混合される。１つまたはそれ以上の凍結乾燥成分は、バイアル内またはシリンジ中にあってもよい。乾燥成分は、マンニトール、スクロース、またはドデシルマルトシドなどの安定剤、およびその混合物、例えばラクロース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物等を含んでもよい。いくつかの構成において、全ての成分は、同じ受容器またはいくつかの受容器に別々に保たれた乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態でまたはマイクロペレットとして）であり、キットは、ワクチンの再構成用の水溶液を含有する別の受容器を含有する。

【0188】

したがって、本発明は：（ｉ）ＨＣＭＶ ｇＢ抗原およびＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第１のキット成分、および（ｉｉ
）Ｔｈ１誘導アジュバントおよび場合により水中油型エマルジョンを含む第２のキット成分を含むキット；ならびにＨＣＭＶ感染を防ぐためのそのようなキットの使用を提供する。

【0189】

好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原およびＴｈ１誘導アジュバントの既製の混合物として、１つのバイアル／シリンジで利用可能である。

【0190】

本発明による免疫原性組成物は、粘膜投与（例えば、鼻腔内または舌下）、非経口投与（例えば、筋肉内、皮下、経皮、または皮内経路）、または経口投与によるなどの、任意の適切な経路により投与することができる。当業者に理解されるように、本発明のワクチンは、意図された投与経路と適合するように適切に製剤化される。

【0191】

本発明による免疫原性組成物は、単独でまたは適切な薬学的担体と共に投与することができ、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、またはエマルジョンなどの固体または液体形態であってもよい。

【0192】

エアロゾルとして使用するために、溶液または懸濁液中の本発明による免疫原性組成物は、適切な噴射剤、例えば、従来のアジュバントを含むプロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素噴射剤と一緒に加圧エアロゾル容器に包装することができる。本発明の材料はまた、ネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧形態で投与することもできる。

【0193】

使用
以前に述べたように、本発明はまた、ＨＣＭＶワクチンとして使用するための本明細書に記載の免疫原性組成物にも関する。

【0194】

特に、本発明によるＨＣＭＶワクチンは、サブユニットワクチンである。

【0195】

本発明は、本発明による免疫原性組成物の免疫学的に有効な量の投与を含む、それを必要とする患者におけるＨＣＭＶ感染の予防の方法にさらに関する。

【0196】

「ＨＣＭＶ」は、以前に記載されているように使用され、ＨＣＭＶ感染は、特に、妊娠中の母体ＨＣＭＶ感染または先天性感染に関し得る。

【0197】

特に、前記ワクチン／免疫原性組成物は、中和抗体レベルおよび／または持続を高める。より具体的には、ＨＣＭＶ ｇＢ抗原、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原およびＴｈ１誘導アジュバントを含む前記ワクチン／免疫原性組成物は、同じＨＣＭＶ ｇＢ抗原、同じＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原およびＭＦ５９アジュバントを含むワクチン／免疫原性組成物より高い中和抗体レベルおよび／または持続を誘導する。

【0198】

本明細書で使用される場合「ワクチン」とは、特にその薬剤により、対象を病気から防御または治療する免疫応答を誘導するために投与される免疫原性組成物を意味する。本発明のワクチンは、初（および／または反復）感染を防ぐために、感染の前に対象に投与する予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）（予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ））ワクチンとしての使用が意図される。先天性ＨＣＭＶ感染の特定の場合において、本発明は、母親から胎児または乳児への垂直ＨＣＭＶ伝播を防ぐために、思春期の少女および妊娠前の妊娠可能年齢の女性に対する予防ワクチンとしての使用が意図される。

【0199】

本発明による免疫原性組成物は、本明細書に記載された抗原およびアジュバントの免疫学的に有効な量を含む。「免疫学的に有効な量」は、対象に投与されたとき、使用された抗原に対する免疫応答を誘発するのに有効な量である。この量は、治療される対象の健康状態および体調、対象の年齢、抗体を産生する対象の免疫系の能力、所望の防御の程度、ワクチン製剤、医学的状況の治療担当医の評価に応じて異なり得る。この量は、当業者により日常的な方法によって決定される。

【0200】

本明細書で言及される「対象」は、「患者」と同じように使用され、ヒト、特に、ＣＭＶ血清状態が何であれ妊娠可能年齢の女性（１６～４５歳）および思春期の少女（１１～１５歳）、ならびに男性、子ども、または固形臓器または幹細胞移植の患者候補を指す。特に、前記患者または対象はＨＣＭＶに罹患しやすい。

【0201】

本明細書に記載の「中和抗体」は当業者に公知の意味を有し、例えば宿主細胞へのウイルスの侵入をブロックすること、および細胞から細胞へのウイルス播種をブロックすることによって、標的を直接中和する抗体をカバーすることが意図される。中和抗体は、標的から防御することができる機能的抗体である。中和抗体レベルおよび／または持続の増加を決定するのに利用可能な方法のいくつかの実例が、本出願の実験部分に提供されている。

【0202】

本発明によるワクチンは、ワクチンを投与するために一般に使用される任意の経路によって投与することができる。期待された免疫応答の誘導をもたらすレジメンを使用することができる。通常、免疫スケジュールは、数回の投与を含む。投与される免疫原性組成物の量は、所望の免疫応答を産生するのに十分であり、当業者によって決定される。

【0203】

本発明によるワクチンは、複数回投与で投与することができる。例えば、本発明によるワクチンは、１回、２回または３回投与で投与することができる。本発明によるワクチンが３回投与で投与される場合、初回投与および３回目の投与は、好ましくは約１２カ月離して投与される。例えば、本発明のワクチンは、初回投与、２回目の投与および３回目の投与で投与され、前記２回目の投与は、前記初回投与の約１カ月～３カ月後に投与されることになり、ならびに前記３回目の投与は、前記初回投与の約６カ月～１２カ月後に投与されることになる。あるいは、３回投与は、０カ月、約１～２カ月（例えば約１カ月半）および約６カ月で投与することができる。

【0204】

本発明によるワクチンは、２回投与で投与することができる。好ましくは、初回投与および２回目の投与は、約１、３、６、８または９カ月離して投与される。

【0205】

本発明によるワクチンは、単回投与で投与することができる。

【0206】

場合により、本発明によるワクチンのブースター投与が、最初の免疫後（すなわち、最初の免疫レジメンで計画された最終回投与の投与後）例えば６カ月～１０年後の間、例えば６カ月、１年、３年、５年または１０年の間に使用することができる。

【0207】

学術論文または抄録、公開特許出願、発行特許または任意の他の参考文献を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、引用される参考文献に示された全てのデータ、表、図および本文を含む全体を参照によって本明細書に組み入れる。

【0208】

本発明の範囲において、「使用するための免疫原性組成物」は、「免疫原性組成物の使用」と同等であること、ならびに特に「ワクチンとして使用するための免疫原性組成物」は、「ワクチンとしての免疫原性組成物の使用」および「ワクチンとして使用することが意図される医薬品を製造するための免疫原性組成物の使用」と同等であることが理解され
なければならない。

【0209】

以下の図面および実施例によって本発明をさらに例示する。

【実施例0210】

【表2】

【実施例0211】

材料および方法
材料
実施例で試験された製品
表３に製品を記載する。雌７週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、Ｄ０およびＤ２０およびＤ２２７に５０μｌの容量で、筋肉内（ＩＭ）経路（後肢、大腿四頭筋）によって免疫した。

【0212】

【表3】

【0213】

方法
群の定義
研究群を以下の表４に記載する。マウスを、以下の７群の１つに無作為に割り当てた。図１の研究スケジュールに要約されているように、脾臓を回収する（３４、２０８および２５７日目）ためにマウスの安楽死を必要とする時点分析に応じて、各群を３つの下位群、すなわちＡ＝＞Ａ１、Ａ２およびＡ３に区別した。３５匹／群を次のように含めた：下位群１および２については１０匹／下位群、ならびに８カ月の期間にわたって起こり得る、可能性のある併発死を補うために下位群３では１５匹。対照群については、わずか５匹／下位群を下位群Ａ１、Ａ２およびＡ３に含め、群Ｂについては、わずか５匹／下位群Ｂ１およびＢ２を含め、下位群Ｂ３には１０匹を含めた。

【0214】

【表4】

【表5】

【0215】

生物学的抽出および分析試験
生物学的抽出
血液試料を麻酔下で全ての動物から回収した。麻酔は、腹腔内経路により２００μｌの容量で投与したＩｍａｌｇｅｎｅ（登録商標）（ケタミン１．６ｍｇ）およびＲｏｍｐｕｎ（キシラジン０．３２ｍｇ）によって行った。血液およそ１ｍＬを、凝固活性剤および血清分離剤を含有するバイアル（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＳＳＴ参照番号３６７７８３）に回収した。＋４℃で一晩後、血液を２０分間に３０００ｒｐｍで遠心分離し、血清を回収し、分析まで－２０℃で保管した。

【0216】

細胞性応答アッセイに関して、脾臓を滅菌状態で回収し、脾臓採取後できる限り速やかに脾臓細胞を単離した。

【0217】

分析試験
血清中和アッセイ
この手法は、ＣＭＶ－ｇＢ＋五量体＋アジュバント免疫動物血清に存在する機能的中和抗体を滴定するのに使用される。ＭＲＣ５線維芽細胞およびＡＲＰＥ－１９細胞（ヒト上皮細胞）を感染させるサイトメガロウイルスの能力に基づき、ＣＭＶ－ｇＢおよび／またはＣＭＶ－五量体に対する特異的機能的抗体を含有する血清は、細胞のウイルス感染を阻害することができる。

【0218】

簡単には、マイクロ中和（ＭＮ）アッセイの前日に、２．５×１０^４ＭＲＣ５線維芽細胞またはＡＲＰＥ－１９細胞を９６ウェル黒プレートに分注した。Ｄ０日目、血清を５６℃で３０分間加熱不活性化した。９６ディープウェルプレートで１／１０から開始して１／１０２４０まで、血清試料をＤＭＥＭ／Ｆ１２ １％ＦＢＳに連続２倍希釈し、ＡＲＰＥ－１９またはＭＲＣ５細胞に関してそれぞれ、４．８９または４．７１ｌｏｇＦＦＵ／ｍｌを滴定しながら）、５％ＣＯ２細胞培養物インキュベーターで３７℃、６０分間、ＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス株（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００５、７９（１６）：１０３３０～１０３３８頁に記載の、Ｔｈｏｍａｓ Ｓｈｅｎｋにより提供された）４．２ｌｏｇＦＦＵ／ｍｌとインキュベートした。血清／ウイルス混合物を次いでＭＲＣ５またはＡＲＰＥ－１９細胞上に移し、５％ＣＯ２細胞培養物インキュベーターで３７℃でインキュベートした。インキュベーションは、ＭＲＣ－５細胞については３日間、ＡＲＰＥ細胞については４日間行った。

【0219】

培養上清の除去後、Ｄ３またはＤ４に、細胞をＰＢＳ中１％ホルマリン１００μｌで１時間、室温で固定した。次いでプレートをＰＢＳで３回洗浄し、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ蛍光プレートリーダーでの分析前に室温で風乾して各ウェルの感染細胞をカウントした。

【0220】

対照として、細胞対照（ウイルスなし）の２個のウェル、および４．２ｌｏｇＦＦＵ／ｍＬを含有するウイルス希釈液の半分に感染した細胞を含む６個のウェルが各プレートに存在した。これらの６個のウェルの平均により、特異的シグナル値の５０％として決定される血清中和の閾値を定義した。中和エンドポイント力価は、計算された５０％特異的シグナル値を下回る最終希釈の逆数として定義した。中和力価（μＰＲＮＴ５０）は、個々の血清ごとに感染細胞の５０％減少を誘導した最終希釈、すなわち、計算された５０％特異的シグナル値より低い感染細胞した最終希釈として定義した。幾何平均中和抗体価は群ごとに計算した。

【0221】

ＥＬＩＳＡアッセイ
ＣＭＶ－ｇＢ抗原またはＣＭＶ－五量体抗原に対する血清ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体を、ロボットＥＬＩＳＡアッセイによって以下の手順に従って滴定した。

【0222】

Ｄｙｎｅｘ ９６ウェルマイクロプレートを０．０５Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６（Ｓｉｇｍａ）中、ＣＭＶ－ｇＢまたはＣＭＶ－五量体１μｇ／ウェルで４℃、一晩コーティングした。次いで、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ乳汁（ＰＢＳ ｐＨ７．１、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１％（ｗ／ｖ）粉末脱脂乳（ＤＩＦＣＯ））１５０μＬ／ウェルでプレートを３７℃、少なくとも１時間ブロックした。全ての次なるインキュベーションは１００μＬの最終容量で実行し、その後ＰＢＳ ｐＨ７．１、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。血清試料の連続２倍希釈をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ－乳汁（１／１０００または１／１００００から開始）で行い、ウェルに添加した。プレートを３７℃で９０分間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ－乳汁中１／２０００で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）をウェルに添加し、プレートを３７℃で９０分間インキュベートした。プレートをさらに洗浄し、既製のＴｅｔｒａ Ｍｅｔｈｙｌ Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）基質溶液（ＴＥＢＵ）１００μＬ／ウェルと暗所で２０℃、３０分間インキュベートした。反応をＨＣｌ １Ｍ（Ｐｒｏｌａｂｏ）１００μＬ／ウェルで停止した。

【0223】

光学密度（ＯＤ）をプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍ～６５０ｎｍで測定した。滴定曲線から０．２～３．０のＯＤ値範囲について、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃ抗体価をＣｏｄＵｎｉｔソフトウェアを使用して計算した（各プレートにおける参照マウス過免疫血清）。任意のＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）で表されたこの参照のＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃ価は、１．０のＯＤを示す逆
数希釈ｌｏｇ１０に対応する。抗体検出の閾値は１０ ＥＬＩＳＡ単位（１．０ ｌｏｇ１０）であった。全ての最終力価をｌｏｇ１０（Ｌｏｇ）で表した。

【0224】

ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比は個々の算術値を使用して計算し、個々のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比の幾何平均は群ごとに計算した。

【0225】

ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴ
ＩＦＮ－γおよびＩＬ－５サイトカインを分泌する個々の細胞を検出し、数えるために、蛍光結合免疫スポット（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴ）を使用した。

【0226】

Ｄ０に、９６ウェルＩＰＦＬ底マイクロプレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）の膜を、３５％エタノール２５μＬで１分間プレウェッティングした。エタノールを次いで除去し、各ウェルをＰＢＳ １×２００μＬで２回洗浄した。マイクロプレートを次いで、それぞれ１／１００および１／５０で希釈したラット抗マウスＩＦＮ－γまたはラット抗マウスＩＬ－５抗体（１０μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。

【0227】

Ｄ１に、プレートをＰＢＳで洗浄し、次いでＲＰＭＩ １０％ ＦＢＳで３７℃、少なくとも２時間ブロックした。プレート洗浄後、新たに単離した５×１０^５脾臓細胞／ウェルを、マウスＩＬ－２（１０Ｕ／ｍｌ）の存在下、ＣＭＶ－ｇＢ抗原（０．１μｇ／ｍｌ）、ＣＭＶ－五量体（０．１μｇ／ｍｌ）または陽性対照としてコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ、２．５μｇ／ｍＬ）と一晩インキュベートした。

【0228】

Ｄ２に、プレートをＰＢＳ １×－ＢＳＡ ０．１％（２００μＬ／ウェル）で６回洗浄した。洗浄工程後、ビオチン化抗マウスＩＦＮ－γまたは抗マウスＩＬ５抗体１００μＬ／ウェルを、１μｇ／ｍＬでＰＢＳ１×－ＢＳＡ ０．１％に室温、２時間、暗所で添加した。プレートをＰＢＳ １×－ＢＳＡ ０．１％（２００μＬ／ウェル）でもう３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ １×－ＢＳＡ ０．１％中１μｇ／ｍＬのストレプトアビジン－ＰＥ １００μＬ／ウェルを、室温、暗所で１時間インキュベートした。

【0229】

プレートをＰＢＳ １×－ＢＳＡ ０．１％（２００μＬ／ウェル）で６回さらに洗浄した。読み取りまで暗所でプレートを５℃±３℃で保管した。

【0230】

ＩＦＮ－γまたはＩＬ５分泌細胞（ＩＦＮ－γＳＣまたはＩＬ５ ＳＣ）に対応する各スポットを、自動ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）を用いて数えた。結果を１０^６脾臓細胞あたりのＩＦＮ－γまたはＩＬ－５分泌細胞の数として表した。

【0231】

ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴアッセイ
抗原特異性に関係なく個々のＢ細胞分泌抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃまたは全ＩｇＧ）を検出し、数えるために、蛍光結合免疫スポット（ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴ）を使用した。

【0232】

Ｄ０に、９６ウェルＩＰＦＬ底マイクロプレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）の膜を、３５％エタノール２５μＬで１分間プレウェッティングした。エタノールを次いで除去し、各ウェルをＰＢＳ １×２００μＬで２回洗浄した。マイクロプレートを次いで、それぞれ１／６８、１／１００および１／１００で希釈したＣＭＶ－ｇＢ抗原（１０μｇ／ｍｌ、Ｓａｎｏｆｉ）、ＣＭＶ－五量体（１０μｇ／ｍｌ、ＮＡＣ）または全ＩｇＧ抗体（１０μｇ／ｍｌ、ＫＰＬ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。

【0233】

Ｄ１に、プレートをＰＢＳで洗浄し、次いでＲＰＭＩ １０％ ＦＢＳで３７℃、少なくとも２時間ブロックした。

【0234】

プレート洗浄後、ＣＭＶ－ ｇＢ抗原またはＣＭＶ－五量体については新たに単離した５×１０^５脾臓細胞／ウェル、全ＩｇＧ抗体については新たに単離した２．５×１０^５脾臓細胞／ウェルを５時間インキュベートした。

【0235】

５時間後、プレートをＰＢＳ １×で３回洗浄し、４℃で一晩保管した。

【0236】

Ｄ２に、プレートをＰＢＳ １×－ＢＳＡ ０．１％（２００μＬ／ウェル）で６回洗浄した。洗浄工程後、抗マウスＩｇＧ１ ＰＥまたは抗マウスＩｇＧ２ｃ ＦＩＴＣまたは抗マウス全ＩｇＧ抗体１００μＬ／ウェルを、それぞれ４、２または０．５μｇ／ｍＬでＰＢＳ１×－ＢＳＡ ０．１％に室温、２時間、暗所で添加した。プレートをＰＢＳ １×－ＢＳＡ ０．１％（２００μＬ／ウェル）でもう６回洗浄した。読み取りまで暗所でプレートを５℃±３℃で保管した。

【0237】

抗体分泌細胞（ＡＳＣ）（ＩｇＧ１ ＡＳＣ、ＩｇＧ２ｃ ＡＳＣまたは全ＩｇＧ ＡＣＳ）に対応する各スポットを、自動ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）を用いて数えた。結果を１０^６脾臓細胞あたりの抗体分泌細胞の数として表した。

【0238】

結果
体液性応答
２０～２５７日目の間のＡＲＰＥ－１９上皮細胞における中和抗体応答の縦断的分析
上皮細胞（ＡＲＰＥ－１９）でのＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス株に対する中和活性を、２０～２５７日目（すなわち、２０、３４、６２、９０、１１８、１５３、１８７、２２６および２５７日時点）に、下位群３からの全ての動物から毎月回収した個々の中間血清試料で血清中和アッセイによってモニターした。血清中和法は、材料および方法セクションに詳述されており、生データを表５ａ～ｂに示す。

【0239】

【表6】

【0240】

幾何平均力価（ＧＭＴ）および個々の中和力価を図２に示す。
Ｍ１＝Ｄ３４、Ｍ２＝Ｄ６２、Ｍ３＝Ｄ９０、Ｍ４＝Ｄ１１８、Ｍ５＝Ｄ１５３、Ｍ６＝
Ｄ１８７、Ｍ７＝Ｄ２２６、Ｍ８＝Ｄ２５７。

【0241】

それぞれ、図２パネルＡおよびＢに示したように、補体の存在下および非存在下、上皮ベースの中和アッセイで類似の動態中和抗体価プロファイルを検出した。

【0242】

非アジュバントＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与した群について、低い中和抗体応答が２０日時点で検出され（補体ありまたはなし、それぞれのＧＭＴ＝３３および３２）、次いで６２日目まで増加してプラトーに達した。ＧＭＴは、６２日目～２２６日目の間、補体の存在下または非存在下、９０～２１２または６５～１７０にわたった。補体の存在下または非存在下、それぞれのＧＭＴ＝１０２６または８１５で２５７日時点で検出されたように、２２６日時点の３回目の注射は中和抗体価をブーストした。

【0243】

全てのアジュバント群（ＭＦ５９、ＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭ）について、２０日目（すなわち、最初の注射の２０日後）に補体の存在下または非存在下の中和抗体価を検出した。ＭＦ５９をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与した群Ｃ３については、ＧＭＴはそれぞれ２２０または７４であり、他のアジュバント製剤を投与した群Ｄ３～Ｆ３については、ＧＭＴ≧３８３および≧８３であった。３４日時点で（すなわち、２回目の注射の１４日後）、全てのアジュバント群は、２回の注射後の応答のピークを示し、ＧＭＴは補体の存在下または非存在下、それぞれ３６２５～３０７５５または２０２０～８０４８にわたった。

【0244】

６カ月間（３４～２２６日目の間）にわたり、上皮ベースの中和抗体価は、補体の存在下または非存在下、それぞれ１０５８～８５０５または６５５～２８８３にわたる力価までわずかに減少した。同様に、補体の存在下または非存在下、それぞれ６７９２（すなわちＭＦ５９－）～３７１６６（すなわちＰＡＡ－）または５４４９（すなわちＭＦ５９－）～２８６５７（すなわちＰＡＡアジュバント群）にわたるＧＭＴで２５７日時点で検出されたように、２２６日時点の３回目の注射は中和抗体価をブーストした。

【0245】

種々のアジュバント群、すなわちＳＰＡ０９、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭをＭＦ５９参照と比較するために、２つの固定係数（群および時間）を用いる統計的混合モデルを、３４～２２６日目の間の反復中和抗体価で行った。

【0246】

表６に示される群比較に関して、補体の存在下では、ＭＦ５９をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与したマウスで得られた中和抗体価は、非アジュバントＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与したマウスで得られた中和抗体価より有意には優れていなかったのに対し、全ての他のアジュバント群（すなわちＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭ）は、ＭＦ５９をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与したマウスで得られた中和抗体価より有意に優れていた（全てのｐ値＜０．００１）。

【0247】

補体の非存在下では、ＭＦ５９をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与したマウスで得られた中和抗体価は、非アジュバントＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与したマウスで得られた中和抗体価より有意には優れていなかった。ＡＦ０４をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与したマウスで得られた中和抗体価は、ＭＦ５９をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与したマウスで得られた中和抗体価より有意には優れていなかったのに対し、全ての他のアジュバント群（すなわちＰＡＡおよびＧＬＡ－ＳＱＥＭ）は、ＭＦ５９をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与したマウスで得られた中和抗体価より有意に優れていた（全てのｐ値≦０．００９）。ＡＦ０４をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与したマウスで得られた中和抗体価は、非アジュバントＣＭＶ－ｇＢおよび五量体を投与したマウスで得られた中和抗体価より有意に優れていた（全てのｐ値＜０．００１
）。

【0248】

【表7】

【0249】

３４（Ｍ１）、２０８（Ｍ７）および２５７（Ｍ８）日時点の上皮細胞（ＡＲＰＥ－１９）および線維芽細胞（ＭＲＣ－５）における中和抗体応答の詳細
上皮細胞（ＡＲＰＥ－１９）および線維芽細胞（ＭＲＣ－５）におけるＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス株に対する中和活性を、下位群１、２および３からの全ての動物から、それぞれ３４日（２回目の免疫の２週間後）、２０８日（最初のワクチン接種シリーズの７カ月後）および２５７日（Ｍ７でのブースター注射の１カ月後）時点で回収した個々の血清試料での血清中和アッセイによってモニターした。血清中和法は、材料および方法セクションに詳述されており、生データを表７ａ～ｆに示す。

【0250】

【表8】

【表9】

【表10】

【0251】

幾何平均力価（ＧＭＴ）および個々の中和力価を、図３、図４および図５に示す。

【0252】

類似の中和抗体プロファイルが上皮および線維芽細胞ベースの中和アッセイの両方で観察された。より高い中和力価が上皮ベースの中和アッセイでモニターされ、補体の存在下または非存在下、ＧＭＴはそれぞれ少なくとも５倍または１１倍高かった。

【0253】

３４日時点に、すなわち２回目の注射の１４日後、非アジュバントＣＭＶ－ｇＢおよび五量体で免疫したマウスでは、中和抗体価が検出されないか、または低い中和抗体価が検出された（それぞれ、ＭＲＣ－５細胞でＧＭＴ≦８およびＡＲＰＥ－１９細胞でＧＭＴ≦４６）。全てのＣＭＶ－ｇＢおよび五量体アジュバント群について、著しいアジュバント効果が観察され、非アジュバント群と比べて、補体の存在または非存在に関係なく、ＭＲ
Ｃ－５でＳＮ力価の１４～最大３３７倍の増加およびＡＲＰＥ－１９細胞で４４～３１９倍の増加を認めた。

【0254】

補体の存在下のＡＲＰＥ－１９上皮細胞における中和抗体価に関して（図３、パネルＡ）、中和抗体価がＭＦ５９より有意に高いアジュバント効果がＰＡＡおよびＧＬＡ－ＳＱＥＭで観察された（少なくとも３～４．２倍高い、優位性の検定、片側ダネット補正、全てのｐ値＜０．００１）が、ＡＦ０４では観察されなかった（１．７倍高いのみ、ｐ値＝０．０８）。

【0255】

反対に、補体の非存在下のＡＲＰＥ－１９細胞における中和抗体価に関して（図３、パネルＢ）、ＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭアジュバントは、ＭＦ５９と比べて中和抗体価をわずかに増加させた（ＭＦ５９によって誘導されたものと比較した中和抗体価の１．５～２倍の増加）が、観察された差は統計的に有意ではなかった（全てのｐ値＞０．０９１）。

【0256】

補体の存在下のＭＲＣ－５線維芽細胞における中和抗体価に関して（図３、パネルＣ）、中和抗体価がＭＦ５９より有意に高いアジュバント効果が、全ての試験アジュバントＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭで観察された（少なくとも２．３～６倍高い、優位性の検定、片側ダネット補正、全てのｐ値≦０．００２）。

【0257】

最後に、補体の非存在下のＭＲＣ－５線維芽細胞における中和抗体価に関して（図３、パネルＤ）、ＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭによって誘導された中和抗体価は、ＭＦ５９で得られたものより有意に高いことは示されなかった（ｐ値＞０．０９３）。２０８日時点で（図４）、すなわち２回目の注射の７カ月後、非アジュバントＣＭＶ－ｇＢおよび五量体で免疫したマウスでは、中和抗体価が検出されないか、または低い中和抗体価が検出された（それぞれ、ＭＲＣ－５細胞でＧＭＴ≦５およびＡＲＰＥ－１９細胞でＧＭＴ≦５０）。アジュバント下位群２において、（下位群１からのマウスで）３４日時点で検出された力価と比較して、補体の有無がどうであれ、中和力価の有意な減少はＡＲＰＥ－１９上皮細胞では示されなかったのに対し、ＭＲＣ－５線維芽細胞では中和抗体価の有意な減少が証明された（補体の存在下で２．３～５．４倍の減少、全てのｐ値≦０．０１６；補体の非存在下で３～１０倍の減少、全てのｐ値＜０．００１）。

【0258】

補体の存在下または非存在下のＡＲＰＥ－１９上皮細胞における中和抗体価に関して（図４、パネルＡおよびＢ）、試験アジュバントとＭＦ５９ベンチマークの間に有意差は検出されなかった。補体の存在下のＭＲＣ－５線維芽細胞における中和抗体価に関して（図４、パネルＣ）、ＰＡＡおよびＧＬＡ－ＳＱＥＭによって誘導された中和抗体価は、ＭＦ５９によって誘導されたものより有意に高かった（少なくとも３．４～１１．９倍高い、優位性の検定、片側ダネット補正、全てのｐ値≦０．０１５）。

【0259】

最後に、補体の非存在下のＭＲＣ－５線維芽細胞における中和抗体価に関して（図４、パネルＤ）、ＰＡＡおよびＡＦ０４によって誘導された中和抗体価は、ＭＦ５９によって誘導されたものより有意に高かった（２～４．４倍の増加、優位性の検定、片側ダネット補正、全てのｐ値≦０．０１９）。

【0260】

２５７日時点に（図５）、すなわち３回目の注射の３０日後、非アジュバントＣＭＶ－ｇＢおよび五量体で免疫したマウスでは、３４日時点にＡＲＰＥ－１９細胞で検出された力価と比べて中和抗体価が有意に増加した（補体ありおよび補体なし、それぞれのＡＲＰＥ－１９細胞におけるＧＭＴ＝１０６２または８１５）。反対に、非アジュバントＣＭＶ－ｇＢおよび五量体で免疫したマウスでは、中和抗体価はＭＲＣ－５線維芽細胞で低いままであった（補体ありおよび補体なし、それぞれのＭＲＣ－５線維芽細胞におけるＧＭＴ
＝２９または１５）。

【0261】

ＭＦ５９を除く全てのアジュバント下位群３において、３回目の注射後の２５７日時点で検出された中和抗体価は、細胞タイプおよび補体の有無がどうであれ、２回目の注射後の３４日時点で検出されたものより有意に高かった（全てのｐ値≦０．００２）。

【0262】

２５７日時点のＭＦ５９参照とのアジュバント比較に関して、ＧＬＡ－ＳＱＥＭを除く全てのアジュバント（すなわちＰＡＡおよびＡＦ０４）は、細胞タイプおよび補体の有無がどうであれ、ＭＦ５９より高い中和抗体価を誘導した（優位性の検定、片側ダネット補正、全てのｐ値≦０．０５）。ＧＬＡ－ＳＱＥＭに関して、誘導された補体依存性中和抗体価は、ＭＦ５９によって誘導されたものに対して有意に高かった（ＡＲＰＥ－１９またはＭＲＣ－５細胞でそれぞれ５．３または８．９倍高い、優位性の検定、片側ダネット補正、全てのｐ値＜０．００１）のに対し、補体の非存在下では誘導された中和は、どの細胞タイプであれ有意には異ならなかった。

【0263】

Ｄ２０８に、すなわち２回目の注射の最大７カ月後、ｇＢ＋五量体＋ＡＦ０４またはＰＡＡまたはＧＬＡ－ＳＱＥＭを含む組成物は、ｇＢ＋五量体＋ＭＦ５９を含む組成物より高い中和抗体レベルを示し、抗体の機能性のより良好な持続を示した。Ｄ２５７、ブースト１カ月後の測定された中和抗体の増加は、記憶応答を反映し、ｇＢ＋五量体＋ＭＦ５９を含む組成物より高いｇＢ＋五量体＋ＡＦ０４またはＰＡＡまたはＧＬＡ－ＳＱＥＭを含む組成物の力価を示す。

【0264】

全てこれらの結果は、ｇＢ＋五量体＋ＡＦ０４またはＰＡＡまたはＧＬＡ－ＳＱＥＭを含む免疫原性組成物が、ｇＢ＋五量体＋ＭＦ５９を含む組成物より高い中和抗体レベルおよび持続を示すことを示している。

【0265】

ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体応答
種々のアジュバントと共にまたは種々のアジュバントなしで投与したＣＭＶ ｇＢおよび五量体抗原によって誘発されたＣＭＶ ｇＢ特異的および五量体特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体応答を、下位群１、２および３からの全ての動物から、それぞれ３４日（２回目の免疫の２週間後）、２０８日（最初のワクチン接種シリーズの７カ月後）および２５７日（Ｍ７でのブースター注射の１カ月後）時点で回収した個々の血清試料においてＥＬＩＳＡによって測定した。平均ＥＬＩＳＡ抗体価（ｌｏｇ１０ ＥＵ）を図６に示す。ＥＬＩＳＡ法は、材料および方法セクションに詳述されている。

【0266】

ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体応答に関して、どの分析時点であれ、ｇＢまたは五量体どちらのＣＭＶ抗原特異性に関係なく、類似のプロファイルが得られた。

【0267】

ＩｇＧ１抗体価に関して、全ての試験アジュバントは、非アジュバント群と比べてＩｇＧ１抗体価を有意に増加させた。ＭＦ５９と比べた場合、どの抗原および時点であれ、ＡＦ０４の有意差は示されなかった。ＭＦ５９よりＩｇＧ１価が有意に低いアジュバント効果が、３４および２０８日時点でＰＡＡについて観察された（少なくとも２．４倍の減少、全てのｐ値≦０．０４５、差の検定、片側ダネット補正）が、３回目のブースター注射後２５７日時点では観察されなかった。ＭＦ５９参照と比べて、ＧＬＡ－ＳＱＥＭは、全ての試験した時点で有意に低い抗ｇＢ ＩｇＧ１価（少なくとも２．５倍減少、全てのｐ値≦０．０３３、差の検定、片側ダネット補正）、および２０８および２５７日時点で低い抗五量体ＩｇＧ１価（少なくとも２．７倍減少、全てのｐ値≦０．００５、差の検定、片側ダネット補正）を誘導した。ＩｇＧ２ｃ抗体価に関して、全ての試験アジュバントは、非アジュバント群と比べてＩｇＧ２ｃ抗体価を有意に増加させた。ｇＢまたは五量体どちらかに特異的なＩｇＧ２ｃに関して、どの時点であれ、ＭＦ５９よりＩｇＧ２ｃ価が有
意に高いアジュバント効果が、全ての試験アジュバント、すなわちＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭについて観察された（少なくとも１１倍高い；全てのｐ値＜０．００１、差の検定、片側ダネット補正）。

【0268】

ＥＬＩＳＡ ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比
Ｔｈ２／Ｔｈ１配向を評価するために、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比を全てのアジュバント群について計算した。図７に詳述する。

【0269】

図７に示すように、ＣＭＶ－五量体について計算したＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比は、ＣＭＶ－ｇＢについて計算したものより低く、どの時点であれ一定となる傾向があった。スクアレン エマルジョンＭＦ５９は、Ｔｈ２偏向応答プロファイルを示し、どの時点であれＣＭＶ－ｇＢのＩｇＧ１／ＩｇＧ２比≧８５、またはＣＭＶ－五量体≧１８であった。全ての他の試験アジュバントに関して、ＭＦ５９より低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比が得られ、ＡＦ０４についてはｇＢに特異的なＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比≧７．１、および五量体に特異的なＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比≧２．１であり、ＰＡＡおよびＧＬＡ－ＳＱＥＭについては２．４または０．８（それぞれ、ｇＢおよび五量体に特異的）より下またはこれに等しかった。これは、ＭＦ５９より多いＴｈ１偏向応答プロファイル、ならびにＡＦ０４、ＰＡＡおよびＧＬＡ－ＳＱＥＭがＴｈ１誘導アジュバントであることを示している。

【0270】

細胞性応答
ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴによってモニターされたＩＬ５およびＩＦＮ－γサイトカイン分泌細胞
ＩＬ５およびＩＦＮ－γ分泌細胞頻度を、下位群１、２および３からの全ての動物から、それぞれ３４日（２回目の免疫の２週間後）、２０８日（最初のワクチン接種シリーズの７カ月後）および２５７日（Ｍ７でのブースター注射の１カ月後）時点で回収した脾臓細胞でのＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴによって測定した。ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴアッセイ中、各脾臓細胞懸濁液を、組換えＣＭＶ－ｇＢまたはＣＭＶ－五量体０．１μｇ／ｍｌのどちらかを用いて、エクスビボで一晩刺激した。

【0271】

ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴ法は、材料および方法セクションに詳述されている。

【0272】

図８に示すように、３４日時点、ＣＭＶ－ｇＢ刺激時（パネルＡ）に、ＭＦ５９アジュバントＣＭＶ－ｇＢおよび五量体群（６０の幾何平均 ＩＬ－５分泌細胞／１０^６脾臓細胞）を除いて、全ての群でＩＬ－５分泌細胞（ＳＣ）頻度は検出されないか、または極めて低いＩＬ－５分泌細胞（ＳＣ）頻度が検出された（幾何平均＜２２ ＩＬ－５分泌細胞／１０^６脾臓細胞）。同様に、全ての群でＩＦＮ－γ分泌細胞頻度は検出されないか、またはわずかなＩＦＮ－γ分泌細胞頻度が検出された（幾何平均＜２０ ＩＦＮ－γ分泌細胞／１０^６脾臓細胞）。

【0273】

反対に、ＣＭＶ－五量体刺激時に、高いサイトカイン分泌細胞頻度が検出された（図８、パネルＢ）。ＩＬ－５分泌細胞に関して、高いＩＬ－５ ＳＣ頻度がＭＦ５９を投与したマウスで検出された（４４４ ＩＬ－５ ＳＣ／１０^６脾臓細胞）。ＰＡＡおよびＧＬＡ－ＳＱＥＭを投与した群で検出されたＩＬ－５分泌物は、ＭＦ５９で得られたものより有意に低かった（ｐ値≦０．００２、差の検定、片側ダネット補正）のに対して、ＡＦ０４で有意差は記録されなかった。

【0274】

ＩＦＮ－γ分泌細胞頻度、全ての試験アジュバント、すなわちＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭに関して、ＭＦ５９と比べてＩＦＮ－γ産生の有意な８～最大２９倍の増加が記録された（全てのｐ値≦０．００１、差の検定、片側ダネット補正）。

【0275】

図８に示すように、２０８日時点で、ＩＬ－５およびＩＦＮ－γ分泌細胞頻度は両方とも、どの刺激抗原であれ低かった。

【0276】

２５７日時点で、ＣＭＶ－ｇＢおよびＣＭＶ－五量体刺激時のＩＬ－５およびＩＦＮ－γ応答は両方とも３４日時点と比較して増加していたが、Ｔｈ１／Ｔｈ２プロファイルは保存された。ＩＬ－５分泌細胞に関して、高いＩＬ－５ ＳＣ頻度がＭＦ５９を投与したマウスで検出された（ＣＭＶ－ｇＢまたは五量体刺激時、それぞれ２６８および２２８４
ＩＬ－５ ＳＣ／１０^６脾臓細胞）。

【0277】

ＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭを投与した群で検出されたＩＬ－５分泌物は、ＭＦ５９で得られたものより有意に低かった（ｐ値≦０．００３、差の検定、片側ダネット補正）。

【0278】

ＩＦＮ－γ分泌細胞頻度、全ての試験アジュバント、すなわちＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭに関して、ＭＦ５９と比べてＩＦＮ－γＳＣ頻度の有意な増加が記録された（全てのｐ値≦０．００１、差の検定、片側ダネット補正）。

【0279】

まとめると、全ての試験アジュバントは、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比によって示された傾向と一致する、ＭＦ５９より多くのＴｈ－１偏向全体的応答プロファイルを誘導した。

【0280】

ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比によって示された傾向と一致して、まとめると、全ての試験アジュバントは、Ｔｈ－１偏向全体的細胞性応答プロファイルを誘導し、一方ＭＦ５９は、Ｔｈ２偏向全体的細胞性応答プロファイルを誘導した。

【0281】

ＥＬＩＳＰＯＴによってモニターされたＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体分泌形質芽細胞
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体分泌形質芽細胞頻度を、下位群１、２および３からの全ての動物から、それぞれ３４日（２回目の免疫の２週間後）、２０８日（最初のワクチン接種シリーズの７カ月後）および２５７日（Ｍ７でのブースター注射の１カ月後）時点で回収した脾臓細胞でのエクスビボＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴによって測定した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ中、組換えＣＭＶ－ｇＢまたはＣＭＶ－五量体のどちらかでコーティングしたウェルに各脾臓細胞懸濁液を沈着させて、形質芽細胞表面に提示されたＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃ特異的抗体のどちらかを捕捉した。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ ＣＭＶ－ｇＢおよび五量体特異的抗体分泌細胞を、全ＩｇＧ分泌細胞に照らして数え、報告した；全ＩｇＧに対するＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃどちらかのパーセンテージを計算した。ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴ法は、材料および方法セクションに詳述されている。

【0282】

図９に提示するように、３４日時点のＩｇＧ１抗体分泌細胞（ＡＳＣ）頻度の平均は３．８％～２０．１２％の間にわたり、全ての試験アジュバント間に有意差はなかった。ＩｇＧ２ｃ ＡＳＣ頻度に関して、ＭＦ５９をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体をマウスに投与した場合、低い％が検出された。反対に、ＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭをアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体は、ＣＭＶ－ｇＢまたはＣＭＶ－五量体どちらの抗原特異性であれ、ＭＦ５９より有意に高い％のＩｇＧ２ｃ ＡＳＣを誘導した（全てのｐ値＜０．００１、差の検定、片側ダネット補正）。

【0283】

予想通り、２０８日時点の検出されたＡＳＣに関して応答は低かった。これは、最初のワクチン接種シリーズの６カ月後、低い割合の循環形質芽細胞がマウス脾臓で検出されたことを示している。

【0284】

３回目の注射の３０日後（２５７日時点）、ＡＳＣ頻度（ＣＭＶ－ｇＢまたはＣＭＶ－五量体に特異的なＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃのどちらか）は、２０８日時点と比較して増
加した。やはり、２５７日時点のＩｇＧ１ ＡＳＣ頻度の平均は３．１％～９％にわたり、全ての試験アジュバント間に有意差はなかった。ＩｇＧ２ｃ ＡＳＣ頻度に関して、ＭＦ５９をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体をマウスに投与した場合、低い％が検出された。反対に、ＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭをアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体は、ＣＭＶ－ｇＢまたはＣＭＶ－五量体どちらの抗原特異性であれ、ＭＦ５９より有意に高い％のＩｇＧ２ｃ ＡＳＣを誘導した（全てのｐ値＜０．００１、差の検定、片側ダネット補正）。

【0285】

ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴによってモニターされたＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体分泌記憶Ｂ細胞
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体分泌細胞頻度を、ＩＬ－２およびＲ８４８によるインビトロ刺激時に４日間培養した活性化および富化Ｂ細胞脾臓細胞において３４、２０８および２５７日時点でＦＬＵＯＳＰＯＴによって測定した。ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴ法は、材料および方法セクションに詳述されている。

【0286】

図１０に提示するように、３４日時点のＩｇＧ１抗体分泌細胞（ＡＳＣ）頻度の平均は１．２４％～４．６８％の間にわたり、全ての試験アジュバント間に有意差はなく、ＣＭＶ－ｇＢまたはＣＭＶ－五量体どちらかの抗原特異性に関してプロファイルは類似していた。ＩｇＧ２ｃ ＡＳＣ頻度に関して、ＭＦ５９をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体をマウスに投与した場合、低い％が検出された。反対に、ＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭをアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体は、ＣＭＶ－ｇＢまたはＣＭＶ－五量体どちらの抗原特異性であれ、ＭＦ５９より有意に高い％のＩｇＧ２ｃ ＡＳＣを誘導した（全てのｐ値＜０．００１、差の検定、片側ダネット補正）。

【0287】

２０８日時点の検出されたＡＳＣに関して、記憶Ｂ細胞は、ＣＭＶ－五量体に特異的なＩｇＧ１ ＡＳＣが主に検出され、％は試験アジュバントとは独立に１．６％～３．２４％にわたった。ＩｇＧ２ｃ ＡＳＣ頻度に関して、ＭＦ５９をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体をマウスに投与した場合、低い％が検出された。反対に、ＰＡＡ、ＡＦ０４およびＧＬＡ－ＳＱＥＭをアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体は、ＭＦ５９より有意に高い％のＩｇＧ２ｃ ＡＳＣを誘導した（全てのｐ値＜０．００１、差の検定、片側ダネット補正）。

【0288】

３回目の注射の３０日後（２５７日時点）、ＩｇＧ１ ＡＳＣ頻度の平均は１．１％～３．７５％の間にわたり、全ての試験アジュバント間に有意差はなかった。

【0289】

ＩｇＧ２ｃ ＡＳＣ頻度に関して、ＭＦ５９をアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体をマウスに投与した場合、低い％が検出された。反対に、ＰＡＡおよびＧＬＡ－ＳＱＥＭをアジュバントとして用いたＣＭＶ－ｇＢおよび五量体は、ＣＭＶ－ｇＢまたはＣＭＶ－五量体どちらの抗原特異性であれ、ＭＦ５９より有意に高い％のＩｇＧ２ｃ
ＡＳＣを誘導した（全てのｐ値＜０．００１、差の検定、片側ダネット補正）。

【0290】

これらの結果は、ｇＢ＋五量体＋ＰＡＡまたはＡＦ０４またはＧＬＡ－ＳＱＥＭを含む組成物による、ｇＢ＋五量体＋ＭＦ５９を含む組成物より高い記憶応答レベルを示している。防御持続の媒介因子であることが知られているこのより高い記憶細胞頻度は、優位なＴｈ１型応答プロファイルを保つことも明らかである。