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特開2024-26255ＦｃＲｎへの増強された結合及び延長された半減期を有するＦｃ変異体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024026255
(43)【公開日】2024-02-28
(54)【発明の名称】ＦｃＲｎへの増強された結合及び延長された半減期を有するＦｃ変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240220BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240220BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240220BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240220BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240220BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240220BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240220BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240220BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240220BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240220BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/00
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/21
C07K19/00
A61P35/00
A61P37/02
A61K39/395 N
C12P21/08
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023204313
(22)【出願日】2023-12-04
(62)【分割の表示】P 2020561607の分割
【原出願日】2019-01-25
(31)【優先権主張番号】62/622,468
(32)【優先日】2018-01-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】500034653
【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】ホワウェイ・チウ
(72)【発明者】
【氏名】ブライアン・マクネス
(57)【要約】 （修正有）
【課題】改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチド（例えば、抗体及びイムノアドヘシン）を提供する。
【解決手段】アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）若しくはグルタミン酸（Ｅ）、及び／又はアミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）若しくはグルタミン（Ｑ）を含み、ここでアミノ酸位置２５４はスレオニン（Ｔ）ではなく、そしてさらに：アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）若しくはチロシン（Ｙ）；又はアミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）を含み、ここでアミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドを提供する。
【選択図】なし
【解決手段】アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）若しくはグルタミン酸（Ｅ）、及び／又はアミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）若しくはグルタミン（Ｑ）を含み、ここでアミノ酸位置２５４はスレオニン（Ｔ）ではなく、そしてさらに：アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）若しくはチロシン（Ｙ）；又はアミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）を含み、ここでアミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドを提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）若しくはグルタミン酸（Ｅ）、及び／又はアミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）若しくはグルタミン（Ｑ）
を含み、ここでアミノ酸位置２５４はスレオニン（Ｔ）ではなく、そしてさらに：
アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）若しくはチロシン（Ｙ）；又は
アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）
を含み、
ここでアミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う、
改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
を含み、ここでアミノ酸位置２５４はスレオニン（Ｔ）ではなく、そしてさらに：
アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）若しくはチロシン（Ｙ）；又は
アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）
を含み、
ここでアミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う、
改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項2】
ａ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、及びアミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）；
ｂ） アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置４３４のフェニルアラニン（Ｆ）；
ｃ） アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）；
ｄ） アミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４のフェニルアラニン（Ｆ）；
ｅ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、及びアミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、［ここでチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；
ｆ） アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、［ここでチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；
ｇ） アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、［ここでチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；
ｈ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、［ここでチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；並びに
ｉ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のグルタミン酸（Ｅ）、及びアミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、［ここでスレオニン（Ｔ）はアミノ酸位置２５４に存在せず、ヒスチジン（Ｈ）はアミノ酸位置３１１に存在せず、そしてチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；
ここで、アミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う、
からなる群より選択される位置のアミノ酸置換の組み合わせを含む、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
ｂ） アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置４３４のフェニルアラニン（Ｆ）；
ｃ） アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）；
ｄ） アミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４のフェニルアラニン（Ｆ）；
ｅ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、及びアミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、［ここでチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；
ｆ） アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、［ここでチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；
ｇ） アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、［ここでチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；
ｈ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、［ここでチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；並びに
ｉ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のグルタミン酸（Ｅ）、及びアミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、［ここでスレオニン（Ｔ）はアミノ酸位置２５４に存在せず、ヒスチジン（Ｈ）はアミノ酸位置３１１に存在せず、そしてチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；
ここで、アミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う、
からなる群より選択される位置のアミノ酸置換の組み合わせを含む、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項3】
ａ） Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｗ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ、Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ、及びＴ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗからなる群より選択される二重アミノ酸置換、［ここで、スレオニン（Ｔ）はアミノ酸位置２５４に存在せず、ヒスチジン（Ｈ）はアミノ酸位置３１１に存在せず、そしてチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；又は
ｂ） Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ、及びＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗからなる群より選択される三重アミノ酸置換、［ここで、スレオニン（Ｔ）はアミノ酸位置２５４に存在せず、ヒスチジン（Ｈ）はアミノ酸位置３１１に存在せず、そしてチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；
ここで、アミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う、
を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
ｂ） Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ、及びＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗからなる群より選択される三重アミノ酸置換、［ここで、スレオニン（Ｔ）はアミノ酸位置２５４に存在せず、ヒスチジン（Ｈ）はアミノ酸位置３１１に存在せず、そしてチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］；
ここで、アミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う、
を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項4】
改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＦｃドメインである、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項5】
改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項6】
結合ポリペプチドはヒトＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項7】
結合ポリペプチドはラットＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項8】
結合ポリペプチドはヒト及びラットＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項9】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更された血清半減期を有する、請求項２～８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項10】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増加した血清半減期を有する、請求項９に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項11】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項12】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項１１に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項13】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項14】
単離された結合ポリペプチドは、非酸性高ｐＨでの結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比較して酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項15】
増強されたＦｃＲｎ結合親和性は、減少したＦｃＲｎ結合解離速度を含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項16】
酸性ｐＨは約６．０である、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項17】
酸性ｐＨは約６．０であり、そして非酸性ｐＨは約７．４である、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項18】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項19】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項20】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項21】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項22】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じ熱安定性を有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項23】
単離された結合ポリペプチドは、ＥＵナンバリングに従って、三重アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを有する改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じ熱安定性を有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項24】
単離された結合ポリペプチドは抗体である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項25】
単離された結合ポリペプチドはモノクローナル抗体である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項26】
単離された抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項２４～２５のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項27】
単離された抗体は全長抗体である、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項28】
単離された結合ポリペプチドは、１つ又はそれ以上のヒト標的に特異的に結合する、請求項１～２７のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項29】
請求項１～２８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸を含む単離された核酸分子。
【請求項30】
請求項２９に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項31】
ベクターは発現ベクターである、請求項３０に記載のベクター。
【請求項32】
請求項３０～３１のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項33】
宿主細胞は真核生物起源又は原核生物起源である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項34】
宿主細胞は哺乳動物起源である、請求項３２～３３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項35】
宿主細胞は細菌起源である、請求項３２～３３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項36】
請求項１～２８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項37】
請求項２４～２７のいずれか１項に記載の単離された抗体を含む医薬組成物。
【請求項38】
改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）を含む、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項39】
改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）を含む、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項40】
改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、及びアミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）を含む、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項41】
改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＦｃドメインである、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項42】
改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項43】
結合ポリペプチドはヒトＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項３８～４２のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項44】
結合ポリペプチドはラットＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項３８～４２のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項45】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増加した血清半減期を有する、請求項３８～４４のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項46】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項３８～４４のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項47】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項３８～４４のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項48】
単離された結合ポリペプチドは、非酸性高ｐＨでの結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項３８～４７のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項49】
増強されたＦｃＲｎ結合親和性は、減少されたＦｃＲｎ結合解離速度を含む、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項50】
酸性ｐＨは約６．０である、請求項４７又は４８に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項51】
酸性ｐＨは約６．０であり、そして非酸性ｐＨは約７．４である、請求項４７に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項52】
酸性ｐＨは約６．０である、請求項４８に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項53】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、請求項３８～５２のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項54】
単離された結合ポリペプチドはモノクローナル抗体である、請求項３８～５３のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項55】
抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項３８～５４のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項56】
単離された結合ポリペプチドは、１つ又はそれ以上のヒト標的に特異的に結合する、請求項３８～５５のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項57】
請求項３８～５６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸を含む単離された核酸分子。
【請求項58】
請求項５７に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項59】
請求項５８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項60】
請求項３８～５８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項61】
改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドであって、ここで改変されたＦｃドメインは：
アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）、及びアミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）又はグルタミン（Ｑ）、ここでアミノ酸位置２５４はスレオニン（Ｔ）ではない、を含み、そして：
アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）；及び
アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）
をさらに含む少なくとも４つのアミノ酸置換の組み合わせを含み、
ここでアミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う、
上記単離された結合ポリペプチド。
アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）、及びアミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）又はグルタミン（Ｑ）、ここでアミノ酸位置２５４はスレオニン（Ｔ）ではない、を含み、そして：
アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）；及び
アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）
をさらに含む少なくとも４つのアミノ酸置換の組み合わせを含み、
ここでアミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う、
上記単離された結合ポリペプチド。
【請求項62】
ａ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）；
ｂ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）；
ｃ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）
；
ｄ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４のフェニルアラニン（Ｆ）；又は
ｅ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）
ここでアミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う、
からなる群より選択される位置のアミノ酸置換の組み合わせを有する改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
ｂ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）；
ｃ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）
；
ｄ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４のフェニルアラニン（Ｆ）；又は
ｅ） アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）
ここでアミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う、
からなる群より選択される位置のアミノ酸置換の組み合わせを有する改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項63】
Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、及びＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、
からなる群より選択される四重アミノ酸置換、
ここでアミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う、
を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
からなる群より選択される四重アミノ酸置換、
ここでアミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う、
を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項64】
改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＦｃドメインである、請求項６１～６３のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項65】
改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項６１～６４のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項66】
結合ポリペプチドはヒトＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項６１～６５のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項67】
結合ポリペプチドはラットＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項６１～６５のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項68】
結合ポリペプチドはヒト及びラットＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項６１～６７のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項69】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項６１～６８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項70】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項６１～６９のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項71】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項６１～７０のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項72】
単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項６１～７１のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項73】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項６１～７２のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項74】
単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項６１～７３のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項75】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有し、そして非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項６１～７４のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項76】
単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有し、そして非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項６１～７５のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項77】
酸性ｐＨは約６．０である、請求項６１～７６のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項78】
非酸性ｐＨは約７．４である、請求項６１～７７のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項79】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更された血清半減期を有する、請求項６１～７８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項80】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少した血清半減期を有する、請求項６１～７９のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項81】
単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少した血清半減期を有する、請求項６１～８０のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項82】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、請求項６１～８１のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項83】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、請求項６１～８２のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項84】
単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、請求項６１～８３のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項85】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少した熱安定性を有する、請求項６１～８４のいずれか１項に記載の単離された結合
ポリペプチド。
ポリペプチド。
【請求項86】
単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少した熱安定性を有する、請求項６１～８５のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項87】
単離された結合ポリペプチドは抗体である、請求項６１～８６のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項88】
単離された結合ポリペプチドはモノクローナル抗体である、請求項６１～８７のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項89】
単離された抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項６１～８８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項90】
単離された抗体は全長抗体である、請求項６１～８９のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項91】
単離された結合ポリペプチドは１つ又はそれ以上の標的に特異的に結合する、請求項６１～９０のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項92】
請求項６１～９１のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸を含む単離された核酸分子。
【請求項93】
請求項９２に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項94】
ベクターは発現ベクターである、請求項９３に記載のベクター。
【請求項95】
請求項９３～９４のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項96】
宿主細胞は真核生物起源又は原核生物起源である、請求項９５に記載の宿主細胞。
【請求項97】
宿主細胞は哺乳動物起源である、請求項９５～９６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項98】
宿主細胞は細菌起源である、請求項９５～９６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項99】
請求項６１～９２のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項100】
請求項８７～９０のいずれか１項に記載の単離された抗体を含む医薬組成物。
【請求項101】
ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項102】
ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項103】
ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項104】
ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項105】
ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【請求項106】
改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＦｃドメインである、請求項１０１～１０５のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項107】
改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１０１～１０６のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項108】
結合ポリペプチドはヒトＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項１０１～１０７のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項109】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少した血清半減期を有する、請求項１０１～１０８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項110】
単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少した血清半減期を有する、請求項１０１～１０９のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項111】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有し、そして非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項１０１～１１０のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項112】
単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有し、そして非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する、請求項１０１～１１１のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項113】
酸性ｐＨは約６．０であり、そして非酸性ｐＨは約７．４である、請求項１１１又は１１２に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項114】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、請求項１０１～１１３のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項115】
単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する、請求項１０１～１１４のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項116】
単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少した熱安定性を有する、請求項１０１～１１５のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項117】
単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少した熱安定性を有する、請求項１０１～１１６のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項118】
単離された結合ポリペプチドはモノクローナル抗体である、請求項１０１～１１７のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項119】
抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項１１８に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項120】
単離された結合ポリペプチドは１つ又はそれ以上の標的に特異的に結合する、請求項１０１～１１９のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチド。
【請求項121】
請求項１０１～１２０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸を含む単離された核酸分子。
【請求項122】
請求項１２１に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項123】
請求項１２２の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項124】
請求項１０１～１２０のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項125】
治療有効量の請求項１～２８、３８～５８、６１～９１、及び１０１～１２０のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチドを被験体に投与すること、又は治療有効量の請求項３６～３７、６０、９９～１００、及び１２４のいずれか１項に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において疾患又は障害を処置する方法。
【請求項126】
疾患又は障害が癌である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項127】
癌は腫瘍である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項128】
疾患又は障害が自己免疫障害である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項129】
治療有効量の請求項１～２８及び３８～５８のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチドを被験体に投与すること、又は治療有効量の請求項３６、３７、及び６０のいずれか１項に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において癌を処置する方法。
【請求項130】
治療有効量の請求項６１～９１及び１０１～１２０のいずれか１項に記載の単離された結合ポリペプチドを被験体に投与すること、又は治療有効量の請求項９９、１００、及び
１２４のいずれか１項に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において自己免疫障害を処置する方法。
１２４のいずれか１項に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において自己免疫障害を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６２／６２２，４６８号（２０１８年１月２６日出願）に対して優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に加入される。
本出願は、米国仮特許出願第６２／６２２，４６８号（２０１８年１月２６日出願）に対して優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に加入される。
【背景技術】
【0002】
背景
新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との抗体の相互作用は、抗体及び他のＦｃ由来の治療剤の血清半減期の維持及び延長における決定因子である。ＦｃＲｎは、ＭＨＣクラス－Ｉ様α－ドメイン及びβ２－マクログロブリン（β２－ｍ）サブユニットのヘテロダイマーであり、これは抗体Ｆｃ重鎖上の領域を他のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と区別して認識する。ＦｃＲｎは様々な組織で発現されるが、これは主に血管内皮、腎臓及び血液脳関門において作用し、それぞれＩｇＧ分解、排出、及び炎症性応答の惹起を防止すると考えられる。
新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との抗体の相互作用は、抗体及び他のＦｃ由来の治療剤の血清半減期の維持及び延長における決定因子である。ＦｃＲｎは、ＭＨＣクラス－Ｉ様α－ドメイン及びβ２－マクログロブリン（β２－ｍ）サブユニットのヘテロダイマーであり、これは抗体Ｆｃ重鎖上の領域を他のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と区別して認識する。ＦｃＲｎは様々な組織で発現されるが、これは主に血管内皮、腎臓及び血液脳関門において作用し、それぞれＩｇＧ分解、排出、及び炎症性応答の惹起を防止すると考えられる。
【0003】
ＦｃＲｎへの抗体結合は高度にｐＨ依存性であり、そして相互作用は低ｐＨ（ｐＨ＜６．５）でのみ高い親和性で（高ナノモル濃度～低マイクロモル濃度）生じるが、生理学的ｐＨ（およそｐＨ７．４）では生じない。エンドソームを６．５未満のｐＨまで酸性化すると、ＩｇＧとＦｃＲｎとの間の相互作用は非常に有利となり、そしてＦｃＲｎ結合抗体の分解の阻害及び細胞表面への再循環の直接の原因となる。ｐＨの増加は相互作用を弱め、そして抗体の血流への放出を促進する。
【0004】
増強された結合が、野生型ＩｇＧ抗体と比較して延長された血清半減期の直接の結果として治療用抗体についての増加した有効性及び減少した投薬頻度をおそらくもたらすので、ハイスループット変異誘発アプローチを使用したＦｃ操作は、ＦｃＲｎ結合親和性を増強する変異体を同定するために広く追跡されてきた。しかし、ＦｃＲｎ結合親和性を増強する変異体は、予測されない結果を有し得る。例えば、とりわけＮ４３４Ｗ又はＰ２５７Ｉ／Ｑ３１１ＩのようなｐＨ６．０でＦｃＲｎ親和性の大幅な増加を示す特定のＩｇＧ変異体は、カニクイザル及びヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）トランスジェニックマウス研究において野生型又は重度に減少した血清半減期を有する（例えば、Ｋｕｏら ２０１１ 上記；非特許文献１；及び非特許文献２を参照のこと）。Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（ＱＬ）変異体は、動物モデルにおいてＩｇＧ骨格に特異的な結果を示した（例えば、非特許文献１；及び非特許文献３を参照のこと）。Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ、ＥＵナンバリング）変異体は、インビトロで１０倍の増強を示したが、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する親和性の２倍の減少のためにインビボで減少した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら ２００２ 上記を参照のこと）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：１７０９－１７１７
【非特許文献2】Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３５：８６－９４
【非特許文献3】Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：３４６－３５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
従って、ＦｃＲｎへの増強された結合及び延長された循環半減期を有する代替のＦｃ変異体の必要性が依然として残されている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
要旨
本発明は、以下の特徴の１つ又はそれ以上を有する新規なＩｇＧ抗体の発見に基づく：野生型ＩｇＧ抗体と比較して、増加した血清半減期、増強されたＦｃＲｎ結合親和性、増強された酸性ｐＨでのＦｃＲｎ結合親和性、増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性、及び同様の熱安定性。
本発明は、以下の特徴の１つ又はそれ以上を有する新規なＩｇＧ抗体の発見に基づく：野生型ＩｇＧ抗体と比較して、増加した血清半減期、増強されたＦｃＲｎ結合親和性、増強された酸性ｐＨでのＦｃＲｎ結合親和性、増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性、及び同様の熱安定性。
【0008】
従って、特定の局面において、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）若しくはグルタミン酸（Ｅ）、及び／又はアミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）若しくはグルタミン（Ｑ）を含み、ここでアミノ酸位置２５４はスレオニン（Ｔ）ではなく、そしてさらにアミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）若しくはチロシン（Ｙ）、又はアミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）を含み、ここでアミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0009】
特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは、改変されたヒトＦｃドメインである。特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0010】
特定の例となる実施態様において、結合ポリペプチドはヒトＦｃＲｎ結合親和性、ラットＦｃＲｎ結合親和性、又はヒト及びラットＦｃＲｎ結合親和性の両方を有する。
【0011】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、変更された血清半減期を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、増加した血清半減期を有する。
【0012】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、変更されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、非酸性高ｐＨでの結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、増強されたＦｃＲｎ結合親和性は、減少したＦｃＲｎ結合解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）を含む。
【0013】
特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０である。特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０であり、そして非酸性ｐＨは約７．４である。
【0014】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、変更されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメイン
を含む結合ポリペプチドと比較して、増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
を含む結合ポリペプチドと比較して、増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0015】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0016】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じ熱安定性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、ＥＵナンバリングに従って、三重アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを有する改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じ熱安定性を有する。
【0017】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、抗体、例えばモノクローナル抗体である。特定の例となる実施態様において、単離された抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。特定の例となる実施態様において、単離された抗体は全長抗体である。
【0018】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、１つ又はそれ以上のヒト標的に特異的に結合する。
【0019】
他の局面において、ａ）アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、及びアミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、ｂ）アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置４３４のフェニルアラニン（Ｆ）、ｃ）アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）、ｄ）アミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４のフェニルアラニン（Ｆ）、ｅ）アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、及びアミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、［ここでチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］、ｆ）アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、［ここでチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］、ｇ）アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、［ここで、チロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］、ｈ）アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、［ここでチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］、並びにｉ）アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のグルタミン酸（Ｅ）、及びアミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、［ここでスレオニン（Ｔ）はアミノ酸位置２５４に存在せず、ヒスチジン（Ｈ）はアミノ酸位置３１１に存在せず、そしてチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］、［ここでアミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う］からなる群より選択される位置のアミノ酸置換の組み合わせを含む、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0020】
特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＦｃドメインである。特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0021】
特定の例となる実施態様において、結合ポリペプチドはヒトＦｃＲｎ結合親和性、ラットＦｃＲｎ結合親和性、又はヒト及びラットＦｃＲｎ結合親和性の両方を有する。
【0022】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更された血清半減期を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増加した血清半減期を有する。
【0023】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、非酸性高ｐＨでの結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、増強されたＦｃＲｎ結合親和性は、減少したＦｃＲｎ結合解離速度を含む。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、ＥＵナンバリングに従って、二重アミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有する改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドよりも非酸性ｐＨで低いＦｃＲｎ結合親和性を有する。
【0024】
特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０である。特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０であり、そして非酸性ｐＨは約７．４である。
【0025】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0026】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0027】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じ熱安定性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、ＥＵナンバリングに従って三重アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを有する改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じ熱安定性を有する。
【0028】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、抗体、例えばモノクローナル抗体である。特定の例となる実施態様において、単離された抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。特定の例となる実施態様において、単離された抗体は全長抗体である。
【0029】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、１つ又はそれ以上のヒト標的に特異的に結合する。
【0030】
他の局面において、ａ）Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｗ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ、Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ、及びＴ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗからなる群より選択される二重アミノ酸置換、［ここでスレオニン（Ｔ）はアミノ酸位置２５４に存在せず、ヒスチジン（Ｈ）はアミノ酸位置３１１に存在せず、そしてチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］、又はｂ）Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ、及びＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗからなる群より選択される三重アミノ酸置換、［ここでスレオニン（Ｔ）
はアミノ酸位置２５４に存在せず、ヒスチジン（Ｈ）はアミノ酸位置３１１に存在せず、そしてチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供され、ここでアミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う。
はアミノ酸位置２５４に存在せず、ヒスチジン（Ｈ）はアミノ酸位置３１１に存在せず、そしてチロシン（Ｙ）はアミノ酸位置４３４に存在しない］を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供され、ここでアミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う。
【0031】
特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＦｃドメインである。特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0032】
特定の例となる実施態様において、結合ポリペプチドは、ヒトＦｃＲｎ結合親和性、ラットＦｃＲｎ結合親和性、又はヒト及びラットＦｃＲｎ結合親和性の両方を有する。
【0033】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更された血清半減期を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増加された血清半減期を有する。
【0034】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、非酸性高ｐＨでの結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、増強されたＦｃＲｎ結合親和性は、減少したＦｃＲｎ結合解離速度を含む。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、ＥＵナンバリングに従って、二重アミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有する改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドよりも非酸性ｐＨで低いＦｃＲｎ結合親和性を有する。
【0035】
特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０である。特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０であり、そして非酸性ｐＨは約７．４である。
【0036】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0037】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0038】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じ熱安定性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、ＥＵナンバリングに従って、三重アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを有する改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じ熱安定性を有する。
【0039】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、抗体、例えばモノクローナル抗体である。特定の例となる実施態様において、単離された抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。特定の例となる実施態様において、単離された抗体は全長抗体である。
【0040】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、１つ又はそれ以上のヒト標的に特異的に結合する。
【0041】
特定の局面において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）を含む、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0042】
特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは、改変されたヒトＦｃドメインである。特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0043】
特定の例となる実施態様において、結合ポリペプチドは、ヒトＦｃＲｎ結合親和性又はラットＦｃＲｎ結合親和性、又はヒト及びラットＦｃＲｎ結合親和性の両方を有する。
【0044】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増加した血清半減期を有する。
【0045】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、非酸性高ｐＨでの結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、増強されたＦｃＲｎ結合親和性は、減少したＦｃＲｎ結合解離速度を含む。
【0046】
特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０である。特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０であり、そして非酸性ｐＨは約７．４である。
【0047】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0048】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、モノクローナル抗体である。特定の例となる実施態様において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。
【0049】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、１つ又はそれ以上のヒト標的に特異的に結合する。
【0050】
特定の局面において、単離されたポリペプチドをコードする核酸を含む単離された核酸分子が提供される。
【0051】
特定の局面において、単離された核酸分子を含むベクターが提供される。特定の例となる実施態様において、ベクターは発現ベクターである。特定の局面において、単離された核酸分子を含む発現ベクターが提供される。
【0052】
特定の局面において、ベクターを含む宿主細胞が提供される。特定の局面において、発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【0053】
特定の例となる実施態様において、宿主細胞は真核細胞起源又は原核生物起源である。特定の例となる実施態様において、宿主細胞は哺乳動物起源である。特定の例となる実施態様において、宿主細胞は細菌起源である。
【0054】
特定の局面において、単離された結合ポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。
【0055】
特定の局面において、単離された抗体を含む医薬組成物が提供される。
【0056】
特定の局面において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）を含む、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0057】
特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは、改変されたヒトＦｃドメインである。特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0058】
特定の例となる実施態様において、結合ポリペプチドは、ヒトＦｃＲｎ結合親和性又はラットＦｃＲｎ結合親和性、又はヒト及びラットＦｃＲｎ結合親和性の両方を有する。
【0059】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、増加した血清半減期を有する。
【0060】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、非酸性高ｐＨでの結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、増強されたＦｃＲｎ結合親和性は、減少したＦｃＲｎ結合解離速度を含む。
【0061】
特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０である。特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０であり、そして非酸性ｐＨは約７．４である。
【0062】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0063】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドはモノクローナル抗体である。特定の例となる実施態様において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。
【0064】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは１つ又はそれ以上のヒト標的に特異的に結合する。
【0065】
特定の局面において、単離されたポリペプチドをコードする核酸を含む単離された核酸分子が提供される。
【0066】
特定の局面において、単離された核酸分子を含むベクターが提供される。特定の例となる実施態様において、ベクターは発現ベクターである。特定の局面において、単離された核酸分子を含む発現ベクターが提供される。
【0067】
特定の局面において、ベクターを含む宿主細胞が提供される。特定の局面において、発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【0068】
特定の例となる実施態様において、宿主細胞は真核生物起源又は原核生物起源である。特定の例となる実施態様において、宿主細胞は哺乳動物起源である。特定の例となる実施態様において、宿主細胞は細菌起源である。
【0069】
特定の局面において、単離された結合ポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。
【0070】
特定の局面において、単離された抗体を含む医薬組成物が提供される。
【0071】
特定の局面において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、及びアミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）を含む、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0072】
特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは、改変されたヒトＦｃドメインである。特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0073】
特定の例となる実施態様において、結合ポリペプチドは、ヒトＦｃＲｎ結合親和性又はラットＦｃＲｎ結合親和性、又はヒト及びラットＦｃＲｎ結合親和性の両方を有する。
【0074】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、増加した血清半減期を有する。
【0075】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、非酸性高ｐＨでの結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、増強されたＦｃＲｎ結合親和性は減少したＦｃＲｎ結合解離速度を含む。
【0076】
特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０である。特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０であり、そして非酸性ｐＨは約７．４である。
【0077】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、変更されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0078】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、モノクローナル抗体である。特定の例となる実施態様において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。
【0079】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは１つ又はそれ以上のヒト標的に特異的に結合する。
【0080】
特定の局面において、単離されたポリペプチドをコードする核酸を含む単離された核酸分子が提供される。
【0081】
特定の局面において、単離された核酸分子を含むベクターが提供される。特定の例となる実施態様において、ベクターは発現ベクターである。特定の局面において、単離された核酸分子を含む発現ベクターが提供される。
【0082】
特定の局面において、ベクターを含む宿主細胞が提供される。特定の局面において、発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【0083】
特定の例となる実施態様において、宿主細胞は真核生物起源又は原核生物起源である。特定の例となる実施態様において、宿主細胞は哺乳動物起源である。特定の例となる実施態様において、宿主細胞は細菌起源である。
【0084】
特定の局面において、単離された結合ポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。
【0085】
特定の局面において、単離された抗体を含む医薬組成物が提供される。
【0086】
特定の局面において、改変されたＦｃドメインが：アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）、及びアミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）又はグルタミン（Ｑ）を含み、ここでアミノ酸位置２５４はスレオニン（Ｔ）ではなく、そしてさらに：アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）；及びアミノ酸位置２５２チロシン（Ｙ）を含む［ここでアミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う］少なくとも４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む、改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0087】
特定の局面において、ａ）アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）；ｂ）アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）；ｃ）アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）；ｄ）アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７のグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４のフェニルアラニン（Ｆ）；又はｅ）アミノ酸位置２５２のチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６のアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７のトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４のチロシン（Ｙ）［ここでアミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う］からなる群より選択される位置でのアミノ酸置換の組み合わせを有する改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0088】
特定の局面において、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、及びＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙからなる群より選択される四重アミノ酸置換、［ここでアミノ酸置換はＥＵナンバリングに従う］を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0089】
特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＦｃドメインである。特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0090】
特定の例となる実施態様において、結合ポリペプチドはヒトＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、結合ポリペプチドはラットＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、結合ポリペプチドはヒト及びラットＦｃＲｎ結合親和性を有する。
【0091】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。
【0092】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。
【0093】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。
【0094】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有し、そして非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有し、そして非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。
【0095】
特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０である。特定の例となる実施態様において、非酸性ｐＨは約７．４である。
【0096】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更された血清半減期を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少した血清半減期を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少した血清半減期を有する。
【0097】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0098】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少した熱安定性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少した熱安定性を有する。
【0099】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは抗体である。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドはモノクローナル抗体である。特定の例となる実施態様において、単離された抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。特定の例となる実施態様において、単離された抗体は全長抗体である。
【0100】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは１つ又はそれ以上の標的に特異的に結合する。
【0101】
特定の局面において、単離されたポリペプチドをコードする核酸を含む単離された核酸分子が提供される。
【0102】
特定の局面において、単離された核酸分子を含むベクターが提供される。
【0103】
特定の例となる実施態様において、ベクターは発現ベクターである。
【0104】
特定の局面において、ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【0105】
特定の例となる実施態様において、宿主細胞は真核生物起源又は原核生物起源である。特定の例となる実施態様において、宿主細胞は哺乳動物起源である。特定の例となる実施態様において、宿主細胞は細菌起源である。
【0106】
特定の局面において、単離された結合ポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。
【0107】
特定の局面において、単離された抗体を含む医薬組成物が提供される。
【0108】
特定の局面において、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0109】
特定の局面において、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0110】
特定の局面において、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0111】
特定の局面において、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）、及びアミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0112】
特定の局面において、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ酸位置４３４にチロシン（Ｙ）を含む改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチドが提供される。
【0113】
特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは改変されたヒトＦｃドメインである。特定の例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0114】
特定の例となる実施態様において、結合ポリペプチドはヒトＦｃＲｎ結合親和性を有する。
【0115】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少した血清半減期を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少した血清半減期を有する。
【0116】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性、及び非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性、及び非酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。
【0117】
特定の例となる実施態様において、酸性ｐＨは約６．０であり、そして非酸性ｐＨは約７．４である。
【0118】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0119】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドのように減少した熱安定性を有する。特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む結合ポリペプチドと比較して減少した熱安定性を有する。
【0120】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドはモノクローナル抗体である。特定の例となる実施態様において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。
【0121】
特定の例となる実施態様において、単離された結合ポリペプチドは１つ又はそれ以上の標的に特異的に結合する。
【0122】
特定の局面において、単離されたポリペプチドをコードする核酸を含む単離された核酸分子が提供される。
【0123】
特定の局面において、単離された核酸分子を含む発現ベクターが提供される。
【0124】
特定の局面において、発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【0125】
特定の局面において、単離された結合ポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。
【0126】
特定の局面において、治療有効量の単離された結合ポリペプチドを被験体に投与すること、又は治療有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において疾患又は障害を処置する方法が提供される。
【0127】
特定の例となる実施態様において、疾患又は障害は癌である。特定の例となる実施態様において、癌は腫瘍である。
【0128】
特定の例となる実施態様において、疾患又は障害は自己免疫障害である。
【0129】
特定の局面において、治療有効量の単離された結合ポリペプチドを被験体に投与すること、又は治療有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において癌を処置する方法が提供される。
【0130】
特定の局面において、治療有効量の単離された結合ポリペプチドを被験体に投与すること、又は治療有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において自己免疫障害を処置する方法が提供される。
【0131】
本発明の前述の及び他の特徴及び利点は、添付の図面と併せて、例となる実施態様の以下の詳細な説明からより十分に理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0132】
【図1】図１Ａ～図１Ｂは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と相互作用するＦｃＲｎの構造を示す。図１Ａは、α－ドメイン（灰色）及びβ２－ｍ（明るい灰色）ｈＦｃＲｎサブユニットと複合した、「グリカン」と名前を付けられた棒として示されるグリコシル化を含めて、１つのＦｃモノマー（暗い灰色のリボン）を示すｈＦｃＲｎとＩｇＧ１ Ｆｃ（ｐｄｂ：４ｎ０ｕ）との間の相互作用を示す。ＦｃＲｎとの相互作用に関与する抗体残基の大部分は、ＣH２－ＣH３境界部（点線）のすぐ隣でグリコシル化部位の反対側のループに位置する。図１Ｂは、図１Ａに対して７５°回転したＩｇＧ１ Ｆｃ結晶構造（ｐｄｂ：５ｄ４ｑ）の表面の描写を示す。ＦｃＲｎ結合境界部は、ＣH２及びＣH３ドメインの残基から構成される。示されるように、飽和ライブラリーは、棒として示される１１の位置において構築された：Ｍ２５２；Ｉ２５３；Ｓ２５４；Ｔ２５６；Ｋ２８８；Ｔ３０７；Ｋ３２２；Ｅ３８０；Ｌ４３２；Ｎ４３４及びＹ４３６。これらの残基の全てはＦｃＲｎに接近しているか又は直接接触している。ｐＨ依存性の原因である重要なヒスチジン残基（Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｈ４３５）の表面は、目的の位置の近くに集まっており、示されるとおりである。
【図2-1】図２Ａ～図２Ｄは、Ｏｃｔｅｔスクリーニングアッセイ及び結果を示す。図２Ａは、Ｏｃｔｅｔスクリーニングアッセイを図式的に示す。ＮｉＮＴＡバイオセンサーがヒスチジンタグ化抗原を捕捉し、続いて、ラットＦｃＲｎ （ｒＦｃＲｎ）結合カイネティクスのために抗体変異体を捕捉する。図２Ｂは、ｒＦｃＲｎ会合段階の開始に整列された、野生型（実線）、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ（ＡＡＡ）変異体（短い破線）、ＬＳ（短い一点鎖線）、ＹＴＥ（長い破線）、Ｈ４３５Ａ（長い一点鎖線）及びＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ（長い二点鎖線）抗体のｐＨ６．０でのｒＦｃＲｎ結合カイネティクスプロフィールを示す。Ｈ４３５Ａ及びＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ変異体はＦｃＲｎ結合をほとんど示さないか、全く示さなかった。ＹＴＥ変異体は、Ｏｃｔｅｔ ｒＦｃＲｎ結合アッセイにおいて試験された最も遅いＦｃＲｎ解離速度を有する。図２Ｃは、Ｏｃｔｅｔスクリーニングから得られた変異体のサブセットによる、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合カイネティクスの正規化を図式的に示す。大部分の変異体はｒＦｃＲｎへの有意な結合を保持したが、いくつかは偽（ｍｏｃｋ）対照（点線）と類似しており、全てのｒＦｃＲｎ結合の喪失を示した（長い破線、点線の下に位置する（模擬））。２つの変異体（実線）は、野生型抗体（太い長い破線）よりも遅いｒＦｃＲｎ解離速度を有していた。図２Ｄは、残基位置により分離された観察可能なｒＦｃＲｎ結合カイネティクスとともに、全ての点変異についてのｒＦｃＲｎ解離速度の散布図分析を示す。飽和変異体は、以下の４つのｒＦｃＲｎ解離速度型のうちの１つに分類される：無結合（示されていない）、より速い結合（黒色）、野生型様結合（白色）、より遅い結合（灰色）。１８の変異体は、野生型抗体（黒い破線）より有意に遅いｒＦｃＲｎ解離速度を示した。
【図3】図３は、ベンチマーク及び野生型変異体のヒト及びラットＦｃＲｎとのｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＢｉａｃｏｒｅカイネティクスを図式的に示す。野生型（左上）、ＡＡＡ変異体（右上）、Ｍ４２８／Ｎ４３４Ｓ（ＬＳ）変異体（左下）及びＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）変異体（右下）の一連の濃度についての全てのＦｃＲｎ結合曲線を、それぞれヒト（第一及び第三列）及びラット（第二及び第四列）ＦｃＲｎについてｐＨ６．０（第一及び第三行）及びｐＨ７．４（第二及び第四行）に示す。ＡＡＡ、ＬＳ及びＹＴＥ変異体は、野生型抗体よりもＦｃＲｎからの遅い解離速度を示した。概して、抗体は、野生型と比較して、約１０倍増加した親和性でｒＦｃＲｎに結合する。ＬＳ変異体は、ｐＨ７．４で最も緊密な親和性、そしてｐＨ７．４でｈＦｃＲｎに対して最も大きい残留結合を有するが、ｒＦｃＲｎはＹＴＥ変異体に最も緊密に結合した。
【図4A】図４Ａは、リード飽和変異体のヒト及びラットＦｃＲｎとのｐＨ６．０でのＢｉａｃｏｒｅカイネティクスを図式的に示す。１８のリード飽和変異体についての一連の濃度のＦｃＲｎ結合速度トレースを示す。Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、Ｎ４３４Ｙ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｑ及びＴ３０７Ｗは、ヒト及びラットＦｃＲｎの両方からのより遅い解離速度を有していた。残りの変異体はラットＦｃＲｎのみに特異的であった。
【図4B】図４Ｂは、ＷＴ、ベンチマーク及びリード単一飽和変異体のヒトＦｃＲｎとのｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合カイネティクスを図式的に示す。ＷＴ、ＬＳ、ＹＴＥ及び１８の飽和変異体の一連の濃度を用いたヒトＦｃＲｎとのｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合センサーグラム。組み合わせライブラリーに使用した単一飽和変異体は太字で下線を付している。
【図5-1】図５Ａ～図５Ｄは、ヒト及びラットＦｃＲｎの両方からのｐＨ６．０でのより遅い解離速度を有する複数の変異体を示すデータを表す。図５Ａ及び５Ｂは、様々な変異体のＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。図５Ａは、ＹＴＥ変異体（長い一点鎖線）、ＬＳ変異体（長い二点鎖線）、野生型（ＷＴ；点線）、及びリード飽和変異体（リード；様々な濃さの実線）についてのｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎの解離速度を示す。図５Ａにおいて、正規化されたセンサーグラムは、ＷＴと比較して改善されたｈＦｃＲｎ解離速度を示すことが示される。図５Ｂは、ＡＡＡ変異体（点線）、ＬＳ変異体（二点鎖線）、ＹＴＥ変異体（一点鎖線）、野生型（実線）及びリード飽和変異体（様々な頻度及び濃さ）についてのｐＨ６．０でのラットＦｃＲｎの解離速度を示す。１１のリード抗体の各々の代表的なインジェクションを明確さのために示す。これらのリード単一変異体は、野生型と比較して、ヒト及びラットＦｃＲｎからの改善された解離速度を示した。図５Ｃ及び図５Ｄは、リード飽和（白色丸）及び野生型（黒色丸）抗体変異体についてのヒト（図５Ｃ）及びラット（図５Ｄ）ＦｃＲｎについてのＢｉａｃｏｒｅ動力学的測定から得られた結合及び解離速度を使用した結合親和性プロットを示す。ベンチマーク変異体を示す：ＡＡＡ（右下に向いた対角線）、ＬＳ（点線）及びＹＴＥ（左下に向いた対角線）。ＦｃＲｎ解離速度における改善にも関わらず、変異体の大部分は、より遅い結合カイネティクスに起因してヒト又はラットＦｃＲｎに対してより緊密な親和性を有していなかった。１１の変異体は両方の種のＦｃＲｎからのより遅い解離速度を有していた。
【図6-1】図６Ａ～図６Ｄは、リード飽和変異の組み合わせが、ＦｃＲｎ解離速度及び結合親和性をさらに改善したことを示すデータを表す。図６Ａ及び図６Ｂは、それぞれヒト及びラットＦｃＲｎについてのＦｃＲｎ解離速度を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。図６Ａは、野生型（点線）及びＬＳ変異体（長い二点鎖線）と比較した、単一（破線）、二重（明るい灰色の実線）、三重（灰色の実線）及び四重（黒色の実線）組み合わせ変異体の代表的な変異体のヒトＦｃＲｎについての正規化されたセンサーグラムを示す。図６Ｂは、野生型（点線）及びＹＴＥ変異体（実線）と比較した、単一（長い二点鎖線）、二重（長い一点鎖線）、三重（長い破線）、及び四重（短い破線）組み合わせ変異体の代表的変異体のラットＦｃＲｎについての正規化されたセンサーグラムを示す。複数の変異の組み込みは、ベンチマーク変異体よりも高い程度までＦｃＲｎについての解離速度を減少させ、そして結合親和性を増強した。図６Ｃ及び図６Ｄは、ヒト（図６Ｃ）又はラット（図６Ｄ）ＦｃＲｎについての解離速度の関数として結合速度を示す組み合わせ飽和変異体のプロットを示し、これは変異体の大部分がベンチマーク変異体と比較してｐＨ６．０でＦｃＲｎに対して増強された結合を有していることを明らかにした。ヒト及びラットＦｃＲｎに対する最も緊密な結合変異体は、それぞれ四重及び三重の組み合わせであった。
【図7-1】図７Ａ～図７Ｄは、ｐＨ６．０での増強されたＦｃＲｎ結合が相互作用のｐＨ依存性を破壊したことを示すデータを表す。図７Ａ及び図７Ｂは、野生型（点線）、並びにＬＳ変異体（図７Ａ、実線）及びＹＴＥ変異体（図７Ｂ、実線）と比較した、単一（長い二点鎖線）、二重（長い一点鎖線）、三重（長い破線）及び四重（短い破線）組み合わせ変異体のｐＨ７．４でのＢｉａｃｏｒｅ ＦｃＲｎ結合カイネティクスの代表的なセンサーグラムを示す。ＦｃＲｎ結合を増強する変異の数を増加させることにより、生理的ｐＨでより高い残留結合が生じ、大部分の二重、三重及び四重変異体は両方の種のＦｃＲｎに対して丈夫な結合を示した。図７Ｃ及び７Ｄは、全ての飽和変異体のヒト（図７Ｃ）又はラット（図７Ｄ）ＦｃＲｎに対するｐＨ７．４での定常状態ＲＵ
【数1】
【図8-1】図８Ａ～図８Ｃは、ベンチマーク変異体のＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィー及び示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）から得られたデータを表す。図８Ａは、ＷＴ（黒い実線）、ＡＡＡ（点線）、ＬＳ（長い二点鎖線）、ＹＴＥ（長い一点鎖線）、Ｈ４３５Ａ（明るい灰色の実線）及びＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ（ＡＱ；暗い灰色の実線）変異体についての正規化した溶出プロフィールを示す。ｐＨはグラフの上部に示される。ＦｃＲｎ結合ヌル（ｎｕｌｌ）変異体（Ｈ４３５Ａ、Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ）は、カラムに結合せず、フロースルー（＜１０ｍＬ）で溶出する。ＡＡＡ、ＬＳ及びＹＴＥ変異体は、ＷＴ抗体よりも高いｐＨで溶出する。図８Ｂは、ＷＴ（黒色）、ＬＳ（灰色）及びＹＴＥ（暗い灰色）変異体のＤＳＦプロフィールを示す。ＹＴＥはＷＴ及びＬＳと比較して不安定化していた。図８Ｃは、ＷＴ及びＬＳ変異体（垂直点線）と比較した、組み合わせ変異体に使用される７つのリード単一変異体のＦｃＲｎアフィニティカラム溶出プロフィールを示す。２つの変異体（Ｎ４３４Ｆ／Ｙ）はＬＳよりも高いｐＨで溶出し、これらの変異を含有する変異体についてのＦｃＲｎとの相互作用に関する減少したｐＨ依存性を表す。
【図9-1】図９Ａ～図９Ｄは、組み合わせ変異体がｐＨ依存性及び熱安定性を有意に乱すということを示すデータを表す。図９Ａは、単一（長い二点鎖線）、二重（長い一点鎖線）、三重（長い破線）及び四重変異体（短い破線）の代表的なＦｃＲｎアフィニティクロマトグラムを示す。ＦｃＲｎ結合を増強する変異の数の増加は、溶出をより高いｐＨ値にシフトさせた；ＬＳ変異体（小さい点の垂直線）。図９Ｂは、単一（白色の丸）、二重（水平縞）、三重（垂直縞）及び四重（格子縞）変異体を含むリード飽和及び組み合わせ変異体についての溶出ｐＨの箱ひげ図を示し、これは、ＦｃＲｎ増強変異体の数が増加するにつれてより高いｐＨ値になる傾向を示した。図９Ｃは、ＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィーからの溶出ｐＨとＢｉａｃｏｒｅを使用したｈＦｃＲｎ解離速度との間の高い相関（Ｒ2＝０．９４）が、改善されたＦｃＲｎ解離カイネティクスとともに抗体－ＦｃＲｎ相互作用のｐＨ依存性の喪失を明らかにしたということを示す。ＡＡＡ（右下への対角線）、ＬＳ（点線）及びＹＴＥ（左下への対角線）変異体は、二重変異体と類似したｈＦｃＲｎ解離速度及び溶出ｐＨ値を有していた。図９Ｄは、組み合わせ飽和変異体のＤＳＦから得られたＴmの箱ひげ図が、さらなるＦｃＲｎ結合増強変異がＷＴ、単一又はベンチマーク変異体と比較して抗体を不安定化するということを明らかにしたことを示す。
【図10】図１０Ａ～図１０Ｂは、７つのリード変異体のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー及びＤＳＦから得られたデータを表す。図１０Ａは、Ｍ２５２Ｙ（実線）、Ｔ２５６Ｄ（短い一点鎖線）、Ｔ２５６Ｅ（長い破線）、Ｔ３０７Ｑ（長い一点鎖線）、Ｔ３０７Ｗ（長い二点鎖線）、Ｎ４３４Ｆ（点線）及びＮ４３４Ｙ（短い破線）変異体のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーを示す。クロマトグラムは、野生型及びＬＳ抗体（垂直点線）と比較して溶出ｐＨのシフトを明らかにした。Ｎ４３４Ｆ及びＮ４３４Ｙは、ＬＳ変異体（垂直点線）よりも高い溶出ｐＨ（約ｐＨ８．３）を有していた。特定の溶出体積でのｐＨは、参照のためにクロマトグラムの上に示される。図１０Ｂは７つのリード変異体のＤＳＦプロフィールを示し、これは７つのリード単一変異体のうちどれも、ＹＴＥ変異体（垂直点線）と同じ程度まで抗体を不安定化しなかったということを示した。Ｔ３０７Ｑ（長い一点鎖線）を除いて全ての変異体は、ＷＴ（垂直点線）と比較して不安定化された。
【図11-1】図１１Ａ～図１１Ｃは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合がＭ２５２Ｙを含有する組み合わせ変異体において減少したことを示すデータを表す。図１１Ａは、ＷＴ（黒色）、ＬＳ（灰色）及びＹＴＥ（暗い灰色）変異体のＦｃγＲＩＩＩａ結合センサーグラムがＹＴＥにより減少した結合応答を明らかにしたということを示す。図１１Ｂは、示されるように、ベンチマーク、単一及び組み合わせ変異体のＦｃγＲＩＩＩａ結合応答の箱ひげ図を示す。Ｍ２５２Ｙ変異を有する変異体は、四重変異体の全てを含めて、ＦｃγＲＩＩＩａに対する減少した結合応答を含む。Ｎ４３４Ｆ／Ｙとの組み合わせは、典型的にはＦｃγＲＩＩＩａとの増加した応答を示す。図１１Ｃは、ＷＴ及びＹＴＥ変異体（水平点線）と比較して７つのリード単一変異体のＦｃγＲＩＩＩａ結合応答を示す。Ｍ２５２Ｙ変異は、ＷＴと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合を示すが、６つはこの受容体に対してＷＴ様の又は増加した結合を示す。
【図12-1】図１２Ａ～１２Ｄは、７つのリード組み合わせ変異体のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー、ＤＳＦ、及びＦｃγＲＩＩＩａ結合から得られたデータを表す。図１２Ａは、野生型抗体及びＬＳ変異体（それぞれ垂直点線及び垂直実線）と比較した、７つのリード組み合わせ変異体のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラムを示す。各リード変異体は、ＬＳ変異体に近い溶出ｐＨを有していた。図１２Ｂは、ＹＴＥ及び野生型変異体（示されるように垂直点線）と比較したリード組み合わせ変異体のＤＳＦプロフィールを示す。７つのリード変異体のうち６つは、ＹＴＥ変異体と同様か又はＹＴＥ変異体よりも不安定化されたＴmを有していた：ＭＤＷＮ（長い二点鎖線）；ＹＴＷＮ（長い破線）；ＹＤＴＮ（実線）；ＹＥＴＮ（長い一点鎖線）；ＹＤＱＮ（点線）；ＹＥＱＮ （短い一点鎖線）。ＭＤＱＮ変異体は、野生型抗体と同様のＴmを有していた（短い破線）。図１２Ｃは、野生型（より大きな点線）及びＹＴＥ変異体（太く長い破線）と比較した、７つのリード変異体のＦｃγＲＩＩＩａ結合カイネティクスのＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。Ｍ２５２Ｙ含有変異体、ＹＤＴＮ（実線）、ＹＤＱＮ（短い一点鎖線）、ＹＴＷＮ（長い破線）、ＹＥＴＮ（長い一点鎖線）及びＹＥＱＮ（より小さい点線）はそれぞれ、ＹＴＥと類似した様式で減少した定常状態ＲＵを有していた。（Ｄ）は、７つのリード変異体、野生型及びＹＴＥ変異体の定常状態ＲＵを示す。ＭＤＷＮ及びＭＤＱＮ変異体のみが、野生型抗体と同様のＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性を有していた。図１２Ｅ～図１２Ｈは、３つのリード変異体が一連の鍵となる抗体特質を表したことを示すデータを表す。図１２Ｅは、ＷＴ及びＬＳ（垂直点線）と比較した、ＤＱ（実線）、ＤＷ（点線）及びＹＤ（破線）変異体のＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィー溶出プロフィールを示す。各二重変異体は、ＷＴとＬＳとの間の溶出ｐＨを示した。図１２Ｆは、ＹＴＥ及びＷＴ変異体（垂直点線）と比較した３つの変異体のＤＳＦ蛍光プロフィールが、ＹＤ（破線）及びＤＷ（点線）がＹＴＥと比較してわずかに不安定化されたが、ＤＱ（実線）はＷＴと同様であることを明らかにしたことを示す。図１２Ｇは、ＷＴ及びＹＴＥ（水平の点線）と比較したＦｃγＲＩＩＩａ結合センサーグラムを示す。ＹＤ（破線）はＹＴＥと同様の結合応答を示したが、ＤＱ（実線）及びＤＷ（点線）は、ＷＴと比較してわずかな減少を示した。図１２Ｈは、均一ブリッジングＲＦ ＥＬＩＳＡが、３つのリード変異体及びＹＴＥがＬＳと異なり有意に減少したか又はＷＴ様のＲＦ結合を示したということを示すデータを表す。＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０１。
【図13-1】図１３Ａ～図１３Ｄは、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのリード組み合わせ変異体のＦｃＲｎカイネティクスの比較を示すデータを表す。図１３Ａ及び図１３Ｂは、ｐＨ６．０での野生型（点線）及びいずれかのＬＳ（ｈＦｃＲｎ、図１３Ａ、太く長い破線）又はＹＴＥ（ｒＦｃＲｎ、図１３Ｂ、太く長い破線）と比較した、ヒトＦｃＲｎ（図１３Ａ）又はラットＦｃＲｎ（図１３Ｂ）についてのリード組み合わせ変異体のＢｉａｃｏｒｅ ＦｃＲｎセンサーグラムを示す。各組み合わせ変異体は、変更された結合速度及び解離速度にもかかわらずそれぞれのＦｃＲｎに対して全体でより緊密な結合親和性を有していた。図１３Ｃ及び図１３Ｄは、ｐＨ７．４でのＢｉａｃｏｒｅ ＦｃＲｎセンサーグラムを示す。各ｈＦｃＲｎリード変異体は、ＬＳ変異体と比較して同様の又は減少した定常状態ＦｃＲｎ結合応答を有していた。ＭＤＱＮ及びＭＤＷＮ変異体のみが、ＹＴＥ変異体よりも少ないｒＦｃＲｎ結合をｐＨ７．４で示した。
【図14】図１４は、特定の実施態様に従う飽和ライブラリーのＯｃｔｅｔ ｒＦｃＲｎ結合解離速度を示す表である。野生型（ＷＴ）及び野生型様（ＷＴ様）種は白い四角で示される；ＷＴ種は示されているとおりである。野生型と比較してほとんどｒＦｃＲｎ結合を有していないか全く有していない変異体は暗い灰色の四角で示される。野生型と比較してより速いｒＦｃＲｎ解離速度有する変異体は明るい灰色の四角で示され、そして野生型と比較してより遅いｒＦｃＲｎ解離速度を有する変異体は黒い四角で示される。
【図15】図１５Ａ～図１５Ｃは、ＣＭ５センサーチップを使用して開発された新しい結合アッセイを表す。図１５Ａはアッセイの図式である。図１５ＢはＦｃＲｎの直接固定化を示す。図１５Ｃはビオチン化ＦｃＲｎのストレプトアビジン捕捉を示す。
【図22】図２２Ａ～図２２Ｉは、ＤＱ、ＤＷ及びＹＤ変異体がＩｇＧ１骨格間で転移可能であったことを示す複数のプロットを表す。プロットａ～ｃは、低ｐＨで類似したカイネティクスを示すＷＴ（明るい灰色）、ＬＳ（暗い灰色）、ＤＱ（黒色塗りつぶし）、ＤＷ（点線）及びＹＤ（破線）変異体を用いた３つのＩｇＧ１骨格におけるｐＨ６．０での正規化されたＦｃＲｎ正規化センサーグラムを表す。これら３つの変異体、ＤＱ、ＤＷ及びＹＤは、ＬＳ変異体よりもわずかに速い結合速度及び解離速度を有していたが、より緊密なＦｃＲｎ結合親和性を維持していた。プロットｄ～ｆは、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合センサーグラムを表す；ＬＳベンチマーク変異体（黒色塗りつぶし）。プロットｇ～ｉは、ＷＴ（灰色）、ＬＳ（暗い灰色）、ＤＱ（黒色実線）、ＤＷ（白抜き）及びＹＤ（白抜き四角）変異体を含む各抗体骨格についてのｐＨ６．０でのと比較したｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合応答を表す。ＤＱ、ＤＷ及びＹＤは、ｐＨ６．０での増強された結合及びｐＨ７．４での最小の結合を有する改善されたＦｃＲｎ特徴を示す。
【図23-1】図２３Ａ～図２３Ｃは、ｍＡｂ２骨格における３つのリード変異体がカニクイザルＦｃＲｎに対する結合を同様に改善するということを示す。図２３Ａは、ｈＦｃＲｎと類似した結合カイネティクス及び親和性を示すＷＴ（灰色）、ＬＳ（暗い灰色）、ＤＱ（黒色実線）、ＤＷ（点線）及びＹＤ（破線）のｐＨ６．０での正規化されたｃＦｃＲｎ結合センサーグラムを表す。図２３Ｂは、３つの変異体についてのｃＦｃＲｎ結合応答が生理的ｐＨで劇的に減少したことを表すが；ＬＳ（暗い灰色）、ｈＦｃＲｎと同様の様式でＷＴ（灰色）より高い結合を示した。図２３Ｃは、ＷＴ（灰色）、ＬＳ（暗い灰色）、ＤＱ（黒い塗りつぶし）、ＤＷ（白抜き）及びＹＤ（白抜き四角）のｐＨ７．４での残留ｃＦｃＲｎ結合応答の、ｐＨ６．０でのｃＦｃＲｎ結合親和性との比較を表し、３つの変異体全てがｈＦｃＲｎで観察された改善されたＦｃＲｎ結合特性を維持した。
【図24】図２４Ａ～図２４Ｂは、リード変異体が抗体血清半減期を延長したことを示す。ＷＴ（黒い実線と黒い丸）、ＬＳ（白い丸と黒い破線）、ＤＱ（明るい灰色の丸と明るい灰色の実線）、ＤＷ（暗い灰色の丸と暗い灰色の実線）及びＹＤ（黒い丸と黒い点線）抗体の、カニクイザル（図２４Ａ）及びｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（図２４Ｂ）における時間の関数として血漿抗体濃度の薬物動態プロフィール。３つのリード変異体は全て、ＷＴと比較して抗体半減期を延長する。
【図25】図２５は、ｐＨ６．０での結合親和性の関数としてｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する全ての飽和変異体の定常状態ＲＵのプロットを表す。ｐＨ７．４での残留ＦｃＲｎ結合のｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合親和性との比較を示す。ｐＨ６．０及びｐＨ７．４の両方での改善されたＦｃＲｎ結合特性を有する四重組み合わせを、プロットの右上四半部において枠で囲んで示す。単一（白い丸）、二重（明るい灰色の丸）、三重（暗い灰色の丸）、及び四重（黒色の四角）変異体、さらにはベンチマークＡＡＡ、ＬＳ、及びＹＴＥ変異体（示されるとおり）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0133】
詳細な説明
本開示は、変更されたＦｃ新生児型受容体（ＦｃＲｎ）結合親和性を有する結合ポリペプチド（例えば、抗体）を提供する。特定の実施態様において、結合ポリペプチドは、野生型（例えば未改変）Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較してＦｃＲｎ結合親和性を増強する改変されたＦｃドメインを含む。本開示はまた、結合ポリペプチドをコードする核酸、結合ポリペプチドを製造するための組み換え発現ベクター及び宿主細胞、並びに本明細書に開示される結合ポリペプチドを含む医薬組成物も提供される。疾患を処置するために本開示の結合ポリペプチドを使用する方法もまた提供される。
本開示は、変更されたＦｃ新生児型受容体（ＦｃＲｎ）結合親和性を有する結合ポリペプチド（例えば、抗体）を提供する。特定の実施態様において、結合ポリペプチドは、野生型（例えば未改変）Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較してＦｃＲｎ結合親和性を増強する改変されたＦｃドメインを含む。本開示はまた、結合ポリペプチドをコードする核酸、結合ポリペプチドを製造するための組み換え発現ベクター及び宿主細胞、並びに本明細書に開示される結合ポリペプチドを含む医薬組成物も提供される。疾患を処置するために本開示の結合ポリペプチドを使用する方法もまた提供される。
【0134】
免疫グロブリンのＦｃドメインは、非抗原結合機能に関与し、そしてエフェクター分子の結合、例えばＦｃＲｎの結合により媒介されるいくつかのエフェクター機能を有する。図１Ａに説明されるように、ＦｃドメインはＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインから構成される。ＦｃＲｎとの相互作用に関与する残基の大部分は、ＣH２－ＣH３境界部（図１Ａ、点線）に直接隣接し、グリコシル化部位の反対にあるループに位置する。図１Ｂは、ＩｇＧ１ Ｆｃ結晶構造（ｐｄｂ：５ｄ４ｑ）の表面描写を説明し、そしてＦｃＲｎ結合境界部を構成するＣＨ２及びＣＨ３ドメインにおける残基を示す。本開示は、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドを提供する。改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは、抗体、又はイムノアドヘシン、又はＦｃ融合タンパク質であり得る。
【0135】
特定の実施態様において、結合ポリペプチドは、抗体の抗原依存性エフェクター機能、特に結合ポリペプチドの循環半減期（例えば、血清半減期）を変更するアミノ酸置換を含む改変されたＦｃドメインを含み得る。いくつかの実施態様において、結合ポリペプチドは、野生型（すなわち、未改変）Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、結合ポリペプチドの血清半減期を変更するアミノ酸置換を含む改変されたＦｃドメインを含み得る。いくつかの実施態様において、結合ポリペプチドは、野生型（すなわち、未改変）Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、結合ポリペプチドの血清半減期を増加するアミノ酸置換を含む改変されたＦｃドメインを含み得る。いくつかの実施態様において、結合ポリペプチドは、野生型（すなわち、未改変）Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、結合ポリペプチドの血清半減期を減少するアミノ酸置換を含む改変されたＦｃドメインを含み得る。
【0136】
特定の実施態様において、循環半減期（例えば、血清半減期）を変更する（すなわち、増加させるか又は減少させる）改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは、循環半減期を変更する変異に加えて１つ又はそれ以上の変異を含有する。特定の実施態様において、循環半減期を変更する変異に加えて１つ又はそれ以上の変異は、１つ又はそれ以上
の所望の生化学的特徴、例えば、ほぼ同じ免疫原性の未変更の抗体全体と比較した場合に、減少した又は増強されたエフェクター機能、非共有結合で二量体化する能力、腫瘍の部位に局在化する増加した能力、減少した血清半減期、増加した血清半減期、及び同様のものの１つ又はそれ以上をもたらす。
の所望の生化学的特徴、例えば、ほぼ同じ免疫原性の未変更の抗体全体と比較した場合に、減少した又は増強されたエフェクター機能、非共有結合で二量体化する能力、腫瘍の部位に局在化する増加した能力、減少した血清半減期、増加した血清半減期、及び同様のものの１つ又はそれ以上をもたらす。
【0137】
本明細書に記載される結合ポリペプチドは、これらの置換を欠いている結合ポリペプチドと比較した場合に、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への増加したか又は減少した結合のいずれを示してもよく、従って、それぞれ増加したか又は減少した血清半減期を有する。ＦｃＲｎに対して改善された親和性を有するＦｃドメインは、より長い血清半減期を有すると期待され、そしてこのような分子は、投与される抗体の長い半減期が所望される場合、例えば、慢性の疾患又は障害を処置するために、哺乳動物を処置する方法において有用性を有する。対照的に、減少したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃドメインは、より短い血清半減期を有すると期待され、そしてこのような分子はまた、例えば、短縮された循環時間が有利であり得る場合、例えばインビボ診断用画像化のため、又は出発抗体が長期間循環中に存在する場合毒性の副作用を有する状況において、哺乳動物への投与のために有用である。減少したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃドメインはまた、胎盤を通過する可能性が低く、従って、妊婦における疾患又は障害の処置においても有用である。さらに、減少したＦｃＲｎ結合親和性が所望され得る他の適用としては、脳、腎臓、及び／又は肝臓に局在される適用が挙げられる。
【0138】
当然のことながら、この開示に記載される方法は、特定の方法に限定されず、このような方法及び条件として本明細書に開示される実験条件は変わり得る。また当然のことながら、本明細書に使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的のみのためのものであり、限定することは意図されない。
【0139】
さらに、本明細書に記載される実験は、他の指示がなければ、当業者の技術範囲内の従来の分子及び細胞生物学並びに免疫学的技術を使用する。このような技術は当業者に周知であり、そして文献において十分に説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ ａｌ．、ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９８７－２００８）（全ての補遺を含む）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ） ｂｙ ＭＲ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ １４、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （２０１３、２nd ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと。
【0140】
別の定義がなければ、本明細書において使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。潜在的な曖昧性の事象において、本明細書に提供される定義は、辞書又は外部の定義に先行する。文脈により別の必要がなければ、単数形は複数を含むものとし、複数形は単数を含むものとする。別の記述がなければ、「又は」は「及び／又は」を意味する。用語「含むこと」、さらには「含む」及び「含まれる」のような他の形態の使用は限定ではない。
【0141】
一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は周知であり、そして当該分野で一般的に使用されている。本明細書において提供される方法及び技術は、通常は当該分野で周知の従来の方法に従って行われ、そして他の記載がなければ、本明細書の全体を通して引用され、そして考察される様々な一般的及びより具体的な参考文献において記載されるとおりである。酵素反応及び精製技術は、当
該分野で一般的に遂行されているか又は本明細書に記載されるように、製造者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び医学及び医薬化学に関連して使用される命名法、並びにそれらの実験手順及び技術は、当該分野において周知であり一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬製剤、処方、及び送達、並びに患者の処置のために標準的な技術が使用される。
該分野で一般的に遂行されているか又は本明細書に記載されるように、製造者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び医学及び医薬化学に関連して使用される命名法、並びにそれらの実験手順及び技術は、当該分野において周知であり一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬製剤、処方、及び送達、並びに患者の処置のために標準的な技術が使用される。
【0142】
本開示がより容易に理解され得るように選択した用語が以下で定義される。
【0143】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマー鎖を指し、そして文脈により矛盾がなければ、天然又は人工のタンパク質、ポリペプチドアナログ又はタンパク質配列の変異体、又はそれらのフラグメントを包含する。ポリペプチドはモノマーでもポリマーでもよい。ポリペプチドフラグメントは、例えば少なくとも約５つの連続したアミノ酸、少なくとも約１０の連続したアミノ酸、少なくとも約１５の連続したアミノ酸、又は少なくとも約２０の連続したアミノ酸を含む。
【0144】
用語「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」は、その由来する起源若しくは供給源のために、その天然の状態で伴っている天然で付随する成分が付随していないか；同じ種由来の他のタンパク質を実質的に含まないか異なる種由来の細胞により発現されるか；又は天然に存在しない、タンパク質又はポリペプチドを指す。従って、化学合成されるか又はそれが天然で由来する細胞とは異なる細胞系で合成されるタンパク質又はポリペプチドは、その天然で付随する成分から「単離されている」だろう。タンパク質又はポリペプチドはまた、当該分野で周知のタンパク質精製技術を使用した単離により、天然で付随する成分を実質的に含まないようにされ得る。
【0145】
本明細書で使用される用語「結合タンパク質」又は「結合ポリペプチド」は、目的の標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）に選択的に結合する原因である少なくとも１つの結合部位を含有するタンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体又はイムノアドヘシンを指すものとする。例となる結合部位としては、抗体可変ドメイン、受容体のリガンド結合部位、又はリガンドの受容体結合部位が挙げられる。特定の局面において、結合タンパク質又は結合ポリペプチドは、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上）の結合部位を含む。特定の局面において、結合タンパク質又は結合ポリペプチドは治療用酵素ではない。
【0146】
用語「リガンド」は、別の物質に結合することができるか、又は結合されることができる物質を指す。同様に、用語「抗原」は、それに対して抗体が生成され得るいずれかの物質を指す。「抗原」は抗体結合基質を参照して一般的に使用され、そして「リガンド」は受容体結合基質を参照する場合にしばしば使用されるが、これらの用語は互いに区別されず、そして広範囲の重複する化学実体を包含する。疑念を避けるために、抗原及びリガンドは本明細書全体を通して交換可能に使用される。抗原／リガンドは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アプタマー、多糖、糖分子、炭水化物、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成分子、無機分子、有機分子、及びそれらのいずれかの組み合わせであり得る。
【0147】
本明細書で使用される用語「特異的に結合する」は、多くとも約１ｘ１０-6Ｍ、約１ｘ１０-7Ｍ、約１ｘ１０-8Ｍ、約１ｘ１０-9Ｍ、約１ｘ１０-10Ｍ、約１ｘ１０-11Ｍ、約１ｘ１０-12Ｍ若しくはそれ以下の解離定数（Ｋｄ）で抗原に結合し、かつ／又は非特異的
抗原に対するその親和性よりも少なくとも約２倍大きい親和性で抗原に結合する、抗体又はイムノアドヘシンの能力を指す。
抗原に対するその親和性よりも少なくとも約２倍大きい親和性で抗原に結合する、抗体又はイムノアドヘシンの能力を指す。
【0148】
本明細書で使用される用語「抗体」は、目的の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対して有意な既知の特異的免疫反応活性を有するような集合体（例えば、インタクトな抗体分子
、イムノアドヘシン、又はそれらの変異体）を指す。抗体及び免疫グロブリンは、それらの間に鎖間共有結合を有するか又は有していない軽鎖及び重鎖を含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的に十分に理解されている。
、イムノアドヘシン、又はそれらの変異体）を指す。抗体及び免疫グロブリンは、それらの間に鎖間共有結合を有するか又は有していない軽鎖及び重鎖を含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的に十分に理解されている。
【0149】
以下により詳細に考察されるように、「抗体」という総称は、生化学的に区別することができる５つの異なるクラスの抗体を含む。抗体の全ての５つのクラスが明確に本開示の範囲内であるが、以下の考察は概してＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子に関するものである。ＩｇＧに関して、免疫グロブリンは、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖、及び分子量５３，０００～７０，０００の２つの同一の重鎖を含む。４つの鎖はジスルフィド結合で「Ｙ」の配置で接合されており、ここで軽鎖は「Ｙ」の口の部分で重鎖を囲んでおり、そして可変領域まで続く。
【0150】
免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパ又はラムダ軽鎖のいずれかと結合され得る。一般に、軽鎖及び重鎖は、互いに共有結合で結合しており、そして２つの重鎖の「尾」部分は、ジスルフィド共有結合により、又は免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、若しくは遺伝子操作された宿主細胞のいずれかにより生成された場合には非共有結合により結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ配置の分岐末端でＮ末端から各鎖の一番下でＣ末端まで伸びる。当業者には当然のことながら、重鎖がガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、又はイプシロン（ε）として（その中にいくるかのサブクラスがある（例えば、γｌ～γ４）として分類される。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ ＩｇＧ、又はＩｇＥと決定するのはこの鎖の性質である。免疫グロブリンアイソタイプサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１など）は十分に特徴づけされており、そして機能を特殊化することが知られている。これらのクラス及びアイソタイプの各々の改変されたバージョンは、本開示を考慮して当業者に容易に認識可能であり、従って、本開示の範囲内である。
【0151】
軽鎖及び重鎖の両方が、構造的及び機能的相同性に分割される。用語「領域」は、免疫グロブリン又は抗体鎖の一部又は部分を指し、そして定常領域又は可変領域だけでなく該領域のさらに別個の部分を含む。例えば、軽鎖可変領域は、本明細書で定義されるように「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」の間に組み入れられた「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」を含む。
【0152】
免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の領域は、「定常領域」の場合は様々なクラスメンバー内での配列変化が比較的無いことに基づいて、又は「可変領域」の場合には様々なクラスメンバーの領域内での有意な変化に基づいて、「定常」（Ｃ）領域又は「可変」（Ｖ）領域として定義され得る。用語「定常領域」及び「可変領域」はまた機能的にも使用され得る。この関連で、当然のことながら、免疫グロブリン又は抗体の可変領域は、抗原認識及び特異性を決定する。逆に、免疫グロブリン又は抗体の定常領域は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などのような重要なエフェクター機能をもたらす。様々な免疫グロブリンクラスのサブユニット構造及び三次元配置は周知である。
【0153】
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域は折りたたまれてドメインとなる。用語「ドメイン」は、例えば、β－プリーツシート及び／又は鎖間ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループ（例えば、３～４つのペプチドループ）を含む重鎖又は軽鎖の球状領域を指す。免疫グロブリンの軽鎖上の定常領域ドメインは、交換可能に「軽鎖定常領域」、「ＣＬ領域」又は「ＣＬドメイン」と呼ばれる。重鎖上の定常ドメイン（例えば、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン）は、交換可能に「重鎖定常領域ドメイン」「ＣＨ」領域ドメイン又は「ＣＨドメイン」と呼ばれる。軽鎖上の可変ドメインは、交換可能に「軽鎖可変領域ドメイン」、「ＶＬ領域ドメイン」又は「ＶＬドメイン」
と呼ばれる。重鎖上の可変ドメインは、交換可能に「重鎖可変領域ドメイン」、「ＶＨ領域ドメイン」又は「ＶＨドメイン」と呼ばれる。
と呼ばれる。重鎖上の可変ドメインは、交換可能に「重鎖可変領域ドメイン」、「ＶＨ領域ドメイン」又は「ＶＨドメイン」と呼ばれる。
【0154】
慣習により、可変定常領域のアミノ酸のナンバリングは、それらが抗原結合部位又は免疫グロブリン若しくは抗体のアミノ末端からより離れるにつれて増加する。各重鎖及び軽鎖免疫グロブリン鎖のＮ末端は可変領域であり、そしてＣ末端は定常領域である。ＣＨ３及びＣＬドメインは、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。従って、軽鎖免疫グロブリンのドメインは、ＶＬ－ＣＬ配向で配置されているが、重鎖のドメインはＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３配向で配置される。
【0155】
各可変領域ドメインの帰属は、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７ ａｎｄ
１９９１）の定義に従う。Ｋａｂａｔはまた、広く使用されているナンバリング法も提供し（Ｋａｂａｔナンバリング）、このナンバリング法では、異なる重鎖可変領域間又は異なる軽鎖可変領域間の対応する残基は同じ番号に割り当てられる。ＶＬドメインのＣＤＲ１、２及び３はまた、本明細書においてそれぞれＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と呼ばれる。ＶＨドメインのＣＤＲ１、２及び３もまた本明細書においてそれぞれＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と呼ばれる。そのように示される場合、ＣＤＲの帰属はＫａｂａｔの代わりにＩＭＧＴ(R)（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．、Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ＆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７：５５－７７；２００３）に従う。重鎖定常領域のナンバリングはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７ ａｎｄ １９９１）に記されるようにＥＵインデックスに従う。
１９９１）の定義に従う。Ｋａｂａｔはまた、広く使用されているナンバリング法も提供し（Ｋａｂａｔナンバリング）、このナンバリング法では、異なる重鎖可変領域間又は異なる軽鎖可変領域間の対応する残基は同じ番号に割り当てられる。ＶＬドメインのＣＤＲ１、２及び３はまた、本明細書においてそれぞれＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と呼ばれる。ＶＨドメインのＣＤＲ１、２及び３もまた本明細書においてそれぞれＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と呼ばれる。そのように示される場合、ＣＤＲの帰属はＫａｂａｔの代わりにＩＭＧＴ(R)（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．、Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ＆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７：５５－７７；２００３）に従う。重鎖定常領域のナンバリングはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７ ａｎｄ １９９１）に記されるようにＥＵインデックスに従う。
【0156】
本明細書で使用される用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、そして用語「ＶＬドメイン」は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ末端可変ドメインを含む。
【0157】
本明細書で使用される用語「ＣＨ１ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでおよそ位置１１４～２２３（ＥＵ位置１１８～２１５）から伸びる免疫グロブリン重鎖の第一の（最もアミノ末端側）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、そしてアミノ末端は免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に隣接し、そして免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の一部を形成しない。
【0158】
本明細書で使用される用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに繋ぐ重鎖分子の部分を含む。ヒンジ領域は約２５残基を含み、そして可動性であり、従って２つのＮ末端抗原結合領域が独立して移動することを可能にする。ヒンジ領域は、３つの個別のドメインに細分化することができる：上部、中間、及び下部ヒンジドメイン（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６１：４０８３）。
【0159】
本明細書で使用される用語「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでおよそ位置２４４～３６０（ＥＵ位置２３１～３４０）に伸びる重鎖免疫グロブリン分子の一部を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密に対合していない点で独特である。むしろ、２つのＮ連結分枝炭化水素鎖は、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間にある。一実施態様において、本開示の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）から誘導されたＣＨ２ドメインを含む。
【0160】
本明細書で使用される用語「ＣＨ３ドメイン」は、ＣＨ２ドメインのＮ末端から約１１０残基伸びる重鎖免疫グロブリン分子の一部、例えばＫａｂａｔナンバリングシステムのおよそ位置３６１～４７６（ＥＵ位置３４１～４４５）を含む。ＣＨ３ドメインは、典型的には抗体のＣ末端部分を形成する。しかし、いくつかの免疫グロブリンにおいて、さらなるドメインがＣＨ３ドメインから伸びて分子のＣ末端部分を形成し得る（例えば、ＩｇＭのμ鎖及びＩｇＥのｅ鎖におけるＣＨ４ドメイン）。一実施態様において、本開示の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）から誘導されるＣＨ３ドメインを含む。
【0161】
本明細書で使用される用語「ＣＬドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔ位置約１０７ＡからＫａｂａｔ位置約２１６まで伸びる軽鎖における免疫グロブリンの定常領域ドメインを含む。ＣＬドメインはＶＬドメインに隣接する。一実施態様において、本開示の結合ポリペプチドは、カッパ軽鎖（例えば、ヒトカッパ軽鎖）から誘導されたＣＬドメインを含む。
【0162】
本明細書で使用される用語「Ｆｃ領域」は、パパイン切断部位（すなわち、ＩｇＧの残基２１６、重鎖定常領域の最初の残基を１１４とみなす）のすぐ上流のヒンジ領域から開始し、そして抗体のＣ末端で終わる重鎖定常領域の一部と定義される。従って、完全Ｆｃ領域は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
【0163】
本明細書で使用される用語「天然Ｆｃ」又は「野生型Ｆｃ」は、抗体の消化から生じたか又は他の手段により製造され、モノマー形態又はマルチマー形態の、ヒンジ領域を含有し得る、非抗原結合フラグメントの配列を含む分子を指す。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、典型的にはヒト起源であり、そしてＩｇＧ１及びＩｇＧ２のようないずれの免疫グロブリンでもよい。天然Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有結合により連結されてダイマー又はマルチマーとなり得るモノマーポリペプチドから作成される。天然Ｆｃ分子のモノマーサブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、及びＩｇＧＡ２）に依存して１～４の範囲に及ぶ。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合ダイマーである。本明細書で使用される用語「天然Ｆｃ」は、モノマー、ダイマー及びマルチマー形態の総称である。
【0164】
本明細書で使用される用語「Ｆｃ変異体」又は「改変されたＦｃ」は、天然／野生型Ｆｃから改変されているがＦｃＲｎに対する結合部位をなお含む分子又は配列を指す。従って、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含み得る。さらに、天然Ｆｃは、本明細書に記載される抗体様結合ポリペプチドに必要ない構造的特徴又は生物学的活性をもたらすので除去することができる領域を含む。従って、用語「Ｆｃ変異体」は：（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現の際のＮ末端異種性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、又は（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすか又はこれらに関与する、１つ若しくはそれ以上の天然Ｆｃ部位若しくは残基を欠いている分子若しくは配列、又は１つ若しくはそれ以上のＦｃ部位若しくは残基が改変されている分子若しくは配列を含む。
【0165】
特定の例となる実施態様において、本明細書において特徴づけられるＦｃ変異体は、野生型Ｆｃを含むＩｇＧ抗体と比較して、増加した血清半減期、増強されたＦｃＲｎ結合親和性、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性、増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性、及び／又は同様の熱安定性のうちの１つ又はそれ以上を有する。
【0166】
本明細書で使用される用語「Ｆｃドメイン」は、上で定義されるとおりの天然／野生型Ｆｃ及びＦｃ変異体配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃ分子と同様に、用語「Ｆｃドメイン」は、抗体全体から消化されても又は他の手段により製造されても、モノマー形態又はマルチマー形態の分子を含む。
【0167】
上に示されるように、抗体の可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインは、三次元抗原結合部位を規定する可変領域（Ｆｖ）を組み合わさって形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より詳細には、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖の可変領域の各々上の相補性決定領域（ＣＤＲ）により規定される。本明細書で使用される用語「抗原結合部位」は、抗原（例えば、細胞表面又は可溶性抗原）に特異的に結合する（免疫反応する）部位を含む。抗原結合部位は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域を含み、そしてこれらの可変領域により形成された結合部位は、抗体の特異性を決定する。抗原結合部位は、抗体ごとに異なる可変領域により形成される。本開示の変更された抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を含む。
【0168】
特定の実施態様において、本開示の結合ポリペプチドは、結合ポリペプチドの選択された抗原との会合をもたらす少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、必ずしも同じ免疫グロブリン分子から誘導される必要はない。この関連で、可変領域は、液性応答を開始し、そして所望の抗原に対して免疫グロブリンを生成するために導入され得るいずれかの型の動物に由来し得るか又は由来するものである。そのようなものとして、結合ポリペプチドの可変領域は、例えば哺乳動物起源であり得、例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカクザルなど）、オオカミ（ｌｕｐｉｎｅ）、又はラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ及び関連種）であり得る。
【0169】
天然に存在する抗体において、抗体は水性環境でその三次元構造をとるので、各モノマー抗体に存在する６つのＣＤＲは、抗原結合部位を形成するように特異的に位置づけられたアミノ酸の短い不連続な配列である。重鎖及び軽鎖の可変ドメインの残りは、アミノ配列においてより低い分子間可変性を示し、そしてフレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は大部分β－シート立体構造をとり、ＣＤＲはβ－シート構造を接続し、そしていくつかの場合ではβ－シート構造の一部を形成するループを形成する。従って、これらのフレームワーク領域は、鎖間非共有相互作用により正しい方向で６つのＣＤＲの位置づけをもたらす足場を形成するように作用する。位置づけられたＣＤＲにより形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対する表面相補性を規定する。この相補性表面は、免疫反応性抗原エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。
【0170】
例となる結合ポリペプチドとしては抗体変異体が挙げられる。本明細書で使用される用語「抗体変異体」としては、それらが天然に存在しないように変更された抗体の合成及び操作された形態、例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むが２つの完全重鎖を含まない抗体（例えば、ドメイン欠失抗体又はミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ））；２つ又はそれ以上の異なる抗体に又は単一の抗原上の異なるエピトープに結合するように変更された多選択性形態（例えば、二重特異的、三重特異的など））；ｓｃＦｖ分子に接合された重鎖分子などが挙げられる。さらに、用語「抗体変異体」は、抗体の多価形態（例えば、三価、四価など）、同じ抗原の３つ、４つ又はそれ以上のコピーに結合する抗体を含む。
【0171】
本明細書で使用される用語「結合価」は、ポリペプチドにおける潜在的な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、１つの標的分子又は標的分子上の特異的部位に特異的に結合する。ポリペプチドが１つより多くの標的結合部位を含む場合、各標的結合部位は、同じか又は異なる分子に特異的に結合し得る（例えば、異なるリガンド若しくは異なる抗
原、又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合し得る）。主題の結合ポリペプチドは、典型的にはヒト抗原分子に特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。
原、又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合し得る）。主題の結合ポリペプチドは、典型的にはヒト抗原分子に特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。
【0172】
用語「特異性」は、所定の標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）に特異的に結合する（例えば、免疫反応する）能力を指す。結合ポリペプチドは、単一特異性であり得、そして標的に特異的に結合する１つ若しくはそれ以上の結合部位含有し、又はポリペプチドは多選択性であり得、そして同じか若しくは異なる標的に特異的に結合する２つ若しくはそれ以上の結合部位を含有し得る。特定の実施態様において、結合ポリペプチドは同じ標的の２つの異なる（例えば、非オーバーラップ）部分に対して特異的である。特定の実施態様において、結合ポリペプチドは１つより多くの標的に対して特異的である。腫瘍細胞上に発現される抗原に結合する抗原結合部位を含む例となる結合ポリペプチド（例えば、抗体）は当該分野で公知であり、そしてこのような抗体からの１つ又はそれ以上のＣＤＲが本明細書に記載される抗体に含まれ得る。
【0173】
本明細書で使用される用語「抗原」又は「標的抗原」は、結合ポリペプチドの結合部位により結合される能力がある分子又は分子の一部を指す。標的抗原は１つ又はそれ以上エピトープを有し得る。
【0174】
用語「約」又は「ほぼ」は、所定の値又は範囲の約２０％以内、例えば約１０％以内、約５％以内、又は約１％若しくはそれ以下以内を意味する。
【0175】
本明細書で使用される「投与する」又は「投与」は、身体の外側に存在する物質（例えば、本明細書において提供される単離された結合ポリペプチド）を、限定されないが、例えば肺（例えば、吸入）、粘膜（例えば、鼻腔内）、皮内、静脈内、筋内送達及び／又は本明細書に記載されるか若しくは当該分野で公知のいずれかの他の物理的送達方法により、患者中に注入するか又はその他の方法で物理的に送達する行動を指す。疾患又はその症状が管理されているか又は処置されている場合、物質の投与は典型的には疾患又はその症状の開始後に起こる。疾患又はその症状が予防されている場合、物質の投与は、典型的には疾患又はその症状の発生前に起こり、そして長く継続されて疾患関連症状の出現又は規模を延期し得るか又は減少し得る。
【0176】
本明細書で使用される用語「組成物」は、特定された成分（例えば、本明細書において提供される単離された結合ポリペプチド）を、場合により特定された量で、さらには特定された成分の組み合わせから直接又は間接的に生じるいずれかの生成物を、場合により特定された量で含有する製品を包含することを意図される。
【0177】
「有効量」は、その薬剤を必要とする個体において所望の生理学的結果を達成するために十分な活性薬剤（例えば、本開示の単離された結合ポリペプチド）の量を意味する。有効量は、処置しようとする個体の健康及び身体状態、処置しようとする個体の分類学的群、組成物の処方、個々の医学状態の評価、及び他の関連する因子に依存して個体間で変化し得る。
【0178】
本明細書で使用される用語「被験体」及び「患者」は交換可能に使用される。本明細書で使用される被験体は哺乳動物、例えば非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例えば、サル及びヒト）であり得る。特定の実施態様において、本明細書で使用される用語「被験体」は、脊椎動物、例えば哺乳動物を指す。哺乳動物としては、限定することなく、ヒト、非ヒト霊長類、野生（ｗｉｌｄ）動物、野生（ｆｅｒａｌ）動物、家畜、スポーツ動物、及びペットが挙げられる。
【0179】
本明細書で使用される用語「治療」は、疾患又はそれに関連する症状の予防、管理、処
置及び／又は寛解において使用され得るいずれかのプロトコル、方法及び／又は薬剤を指す。いくつかの実施態様において、用語「治療」は、被験体における感染に対する免疫応答又はそれに関連する症状の調節において使用され得るいずれかのプロトコル、方法及び／又は薬剤を指す。いくつかの実施態様において、用語「治療（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」及び「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、医療関係者のような当業者に公知の疾患若しくはそれに関連する症状の予防、管理、処置及び／若しくは寛解において有用な、生物学的治療、支持療法、並びに／又は他の治療を指す。他の実施態様において、用語「治療（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」及び「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、医療関係者のような当業者に公知の被験体における感染に対する免疫応答又はそれに関連する症状の調節において有用な、生物学的治療、支持療法、並びに／又は他の治療を指す。
置及び／又は寛解において使用され得るいずれかのプロトコル、方法及び／又は薬剤を指す。いくつかの実施態様において、用語「治療」は、被験体における感染に対する免疫応答又はそれに関連する症状の調節において使用され得るいずれかのプロトコル、方法及び／又は薬剤を指す。いくつかの実施態様において、用語「治療（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」及び「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、医療関係者のような当業者に公知の疾患若しくはそれに関連する症状の予防、管理、処置及び／若しくは寛解において有用な、生物学的治療、支持療法、並びに／又は他の治療を指す。他の実施態様において、用語「治療（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」及び「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、医療関係者のような当業者に公知の被験体における感染に対する免疫応答又はそれに関連する症状の調節において有用な、生物学的治療、支持療法、並びに／又は他の治療を指す。
【0180】
本明細書で使用される用語「処置する」、「処置」及び「処置すること」は１つ又はそれ以上の治療（本明細書において提供される単離された結合ポリペプチドのような１つ又はそれ以上の予防用又は治療用の薬剤を含むがこれらに限定されない）の投与の結果として生じた、疾患又はそれに関連する症状の進行、重症度及び／又は期間の減少又は寛解を指す。本明細書において使用される用語「処置することはまた、処置されている被験体の疾患経過を変更することにも言及し得る。処置の治療効果としては、限定することなく、疾患の発生又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の直接的又は間接的な病理的帰結の減少、疾患の進行速度を減少させること、疾患状態の寛解又は緩和、及び緩解又は改善された予後が挙げられる。
【0181】
結合ポリペプチド
一局面において、本開示は、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチド（例えば、抗体、イムノアドヘシン、抗体変異体、及び融合タンパク質）を提供する。本明細書において開示される結合ポリペプチドは、改変されたＦｃドメインを含むいずれの結合ポリペプチドも包含する。特定の実施態様において、結合ポリペプチドは抗体、又はイムノアドヘシン又はそれらの誘導体である。いずれの供給源又は種由来の抗体も本明細書において開示される結合ポリペプチドにおいて使用され得る。適切な抗体としては、限定することなく、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体が挙げられる。適切な抗体としては、限定することなく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、全長抗体、又は単鎖抗体が挙げられる。
一局面において、本開示は、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチド（例えば、抗体、イムノアドヘシン、抗体変異体、及び融合タンパク質）を提供する。本明細書において開示される結合ポリペプチドは、改変されたＦｃドメインを含むいずれの結合ポリペプチドも包含する。特定の実施態様において、結合ポリペプチドは抗体、又はイムノアドヘシン又はそれらの誘導体である。いずれの供給源又は種由来の抗体も本明細書において開示される結合ポリペプチドにおいて使用され得る。適切な抗体としては、限定することなく、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体が挙げられる。適切な抗体としては、限定することなく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、全長抗体、又は単鎖抗体が挙げられる。
【0182】
いずれの免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ）及び種由来のＦｃドメインも本明細書に開示される結合ポリペプチドにおいて使用され得る。異なる種又はＩｇクラス由来のＦｃドメインの部分を含むキメラＦｃドメインもまた使用され得る。特定の実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。いくつかの実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。他の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。いくつかの実施態様において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。いくつかの実施態様において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。他の種及び／又はＩｇクラス若しくはアイソタイプのＦｃドメインの場合、当業者には当然のことながら、本明細書に記載されるアミノ酸置換のいずれも適切に適合され得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４、又はＹ４３６、及びそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４、及びＹ４３６から選択されるいずれか２つのアミノ酸位置に二重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、
Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４、及びＹ４３６から選択されるいずれか３つのアミノ酸位置に三重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４、及びＹ４３６から選択されるいずれか４つのアミノ酸位置に四重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、又はＹ４３６、及びそれらの組み合わせから選択されるいずれかのアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４、及びＹ４３６から選択されるいずれか３つのアミノ酸位置に三重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４、及びＹ４３６から選択されるいずれか４つのアミノ酸位置に四重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、又はＹ４３６、及びそれらの組み合わせから選択されるいずれかのアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
【0183】
いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ（すなわち、アミノ酸位置２５２のチロシン）、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｎ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｅ３８０Ｃ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、Ｎ４３４Ｙ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、又はＹ４３６Ｗ、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、又はＴ２５６Ｅである］；Ｋ２８８［ここで置換はＫ２８８Ｄ、又はＫ２８８Ｎである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、又はＴ３０７Ｗである］；Ｅ３８０［ここで置換はＥ３８０Ｃである］；Ｎ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、又はＮ４３４Ｙである］；Ｙ４３６［ここで置換はＹ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、又はＹ４３６Ｗである］から選択される二重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、又はＴ２５６Ｅである］；Ｋ２８８［ここで置換はＫ２８８Ｄ、又はＫ２８８Ｎである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、又はＴ３０７Ｗである］；Ｅ３８０［ここで置換はＥ３８０Ｃである］；Ｎ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、又はＮ４３４Ｙである］；Ｙ４３６［ここで置換はＹ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、又はＹ４３６Ｗである］から選択される三重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、又はＴ２５６Ｅである］；Ｋ２８８［ここで置換はＫ２８８Ｄ、又はＫ２８８Ｎである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、又はＴ３０７Ｗである］；Ｅ３８０［ここで置換はＥ３８０Ｃである］；Ｎ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｐ、又はＮ４３４Ｙである］；Ｙ４３６［ここで置換はＹ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、又はＹ４３６Ｗである］から選択される四重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｎ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｅ３８０Ｃ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、又はＹ４３６Ｗ、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸位置のいずれかにアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、アミノ酸位置Ｎ４３４はフェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｎ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｅ３８０Ｃ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、又はＹ４３６Ｗ、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４はチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｎ、Ｔ３０７Ａ、
Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｅ３８０Ｃ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、又はＹ４３６Ｗ、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸位置のいずれかにアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、アミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｆ、Ｔ３０７Ｍ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｅ３８０Ｃ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｎ、又はＹ４３６Ｗ、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸位置のいずれかにアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、アミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
【0184】
特定の実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７、又はＮ４３４、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含み得る。特定の実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７、及びＮ４３４から選択されるいずれか２つのアミノ酸位置に二重アミノ酸置換を含み得る。特定の実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７、及びＮ４３４から選択されるいずれか３つのアミノ酸位置に３重アミノ酸置換を含み得る。特定の実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従ってアミノ酸位置Ｍ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７、及びＮ４３４に四重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２、Ｔ２５６、又はＴ３０７、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
【0185】
例となる実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、又はＴ２５６Ｅである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ｑ、又はＴ３０７Ｗである］；又はＮ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、又はＮ４３４Ｙである］、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含み得る。特定の実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、又はＴ２５６Ｅである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ｑ、又はＴ３０７Ｗである］；又はＮ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、又はＮ４３４Ｙである］から選択されるいずれか２つのアミノ酸位置に二重アミノ酸置換を含み得る。特定の実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、又はＴ２５６Ｅである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ｑ、又はＴ３０７Ｗである］；又はＮ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、又はＮ４３４Ｙである］から選択されるいずれか３つのアミノ酸位置に三重アミノ酸置換を含み得る。特定の実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２［ここで置換はＭ２５２Ｙである］；Ｔ２５６［ここで置換はＴ２５６Ｄ、又はＴ２５６Ｅである］；Ｔ３０７［ここで置換はＴ３０７Ｑ、又はＴ３０７Ｗである］；又はＮ４３４［ここで置換はＮ４３４Ｆ、又はＮ４３４Ｙである］から選択されるアミノ酸位置に四重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ｑ、又はＴ３０７Ｗから選択されるアミノ酸置換、及びそれらのいずれかの組み合わせを含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４はフェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ｑ、又はＴ３０７Ｗから選択されるアミノ酸置換、及びそれらのいずれかの組み合わせを含むことが所望され得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４はチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ｑ、又はＴ３０７Ｗから選択されるアミノ酸置換、及びそれらのいずれかの組み合わせを含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
【0186】
特定の実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｔ２５６Ｄ、若しくはＴ２５６Ｅ、及び／又はＴ３０７Ｗ、若しくはＴ３０７Ｑから選択されるアミノ酸置換を含み得、そしてＮ４３４Ｆ、若しくはＮ４３４Ｙ、又はＭ２５２Ｙから選択されるアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、Ｔ２５６Ｄ、若しくはＴ２５６Ｅ、及び／又はＴ３０７Ｗ、若しくはＴ３０７Ｑから選択されるアミノ酸置換を含み、そしてアミノ酸置換Ｍ２５２Ｙをさらに含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４はフェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従ってＴ２５６Ｄ、若しくはＴ２５６Ｅ、及び／又はＴ３０７Ｗ、若しくはＴ３０７Ｑから選択されるアミノ酸置換を含み、そしてアミノ酸置換Ｍ２５２Ｙをさらに含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４はチロシン（Ｙ）で置換されていない。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従って、Ｔ２５６Ｄ、若しくはＴ２５６Ｅ、及び／又はＴ３０７Ｗ、若しくはＴ３０７Ｑから選択されるアミノ酸置換を含み、そしてさらにアミノ酸置換Ｍ２５２Ｙを含むことが望ましくあり得、ここでアミノ酸位置Ｎ４３４は置換されていない（すなわち、アミノ酸位置Ｎ４３４は野生型である）。
【0187】
いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｗ、Ｍ２５２Ｙ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｎ４３４Ｙ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ、Ｔ２５６Ｄ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ２５６Ｄ／Ｎ４３４Ｙ、Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ、Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ、Ｔ２５６Ｅ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ２５６Ｅ／Ｎ４３４Ｙ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｆ、及びＴ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙから選択される二重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ２５２Ｔ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、Ｔ２５６Ｄ／３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ２５６Ｄ／３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ２５６Ｄ／３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｔ２５６Ｄ／３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、Ｔ２５６Ｅ／３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ２５６Ｅ／３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ２５６Ｅ／３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、及びＴ２５６Ｅ／３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙから選択される三重アミノ酸置換を含み得る。
【0188】
いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従って、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙ、及びＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗ／Ｎ４３４Ｙから選択される四重アミノ酸置換を含み得る。
【0189】
いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインが、ＥＵナンバリングに従ってアミノ酸位置Ｎ４３４に野生型アミノ酸を含むことが望ましくあり得る。いくつかの実施態様において、ＦｃドメインがＥＵナンバリングに従ってアミノ酸位置Ｎ４３４にフェニルアラニン（Ｆ）もチロシン（Ｙ）も含まないことが望ましくあり得る。いくつかの実施態様において、Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従ってアミノ酸位置Ｎ４３４にチロシン（Ｙ）を含まないことが望ましくあり得る。いくつかの実施態様において、改変され
たＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｗ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ、Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ、及びＴ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗから選択される二重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ、及びＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗから選択される三重アミノ酸置換を含み得る。
たＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ３０７Ｗ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ、Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ、及びＴ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗから選択される二重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従ってＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ、及びＭ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｗから選択される三重アミノ酸置換を含み得る。
【0190】
一実施態様において、ＦｃＲｎ結合が変更された結合ポリペプチドは、本明細書に開示される１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。一実施態様において、増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する結合ポリペプチドは、本明細書に開示される１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。一実施態様において、増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する結合ポリペプチドは、本明細書に開示される２つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。一実施態様において、増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する結合ポリペプチドは、本明細書に開示される３つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。
【0191】
いくつかの実施態様において、結合ポリペプチドは種特異的ＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。一実施態様において、結合ポリペプチドはヒトＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。一実施態様において、結合ポリペプチドはラットＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。いくつかの実施態様において、結合ポリペプチドは異種間ＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。このような結合ポリペプチドは、１つ又はそれ以上の異なる種にわたって交差反応性であると言われる。一実施態様において、結合ポリペプチドはヒト及びラットＦｃＲｎ結合親和性の両方を示し得る。
【0192】
新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体のＦｃ領域と相互作用して、正常リソソーム分解のレスキューにより再循環を促進する。このプロセスは、酸性ｐＨ（例えば、６．５未満のｐＨ）でエンドソームにおいて発生するが、血流の生理的ｐＨ条件下（例えば、非酸性ｐＨ）では発生しないｐＨ依存性プロセスである。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む本開示の結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは、７未満のｐＨで、例えば、約ｐＨ６．５で、約ｐＨ６．０で、約ｐＨ５．５で、約ｐＨ５．０で、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは、７未満のｐＨで、例えば約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．０、約ｐＨ５．５、約ｐＨ５．０で、非酸性高ｐＨでの結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。非酸性高ｐＨは、例えば７より高いｐＨ、約ｐＨ７、約ｐＨ７．４、約ｐＨ７．６、約ｐＨ７．８、約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．５、約ｐＨ９．０であり得る。
【0193】
特定の実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じＦｃＲｎ結合親和性を非酸性ｐＨで示すことが望ましくあり得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドが、ＥＵナンバリングに従って二重アミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有する改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドより低いＦｃＲｎ結合親和性を非酸性ｐＨで示すことが望ましくあり得る。従って、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドが、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合に対して最小の摂動を示すことが望ましくあり得る。
【0194】
いくつかの実施態様において、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少した（すなわち、より遅い）ＦｃＲｎ解離速度を揺する。いくつかの実施態様において、非酸性高ｐＨでの結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比較して増強されたＦｃＲｎ結合親和性を酸性ｐＨで有する、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは、非酸性高ｐＨでの結合ポリペプチドのＦｃＲｎ解離速度と比較して酸性ｐＨでより遅いＦｃＲｎ解離速度を有する。
【0195】
いくつかの実施態様において、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、非酸性ｐＨでより高いＦｃＲｎ結合親和性を示す、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドが提供される。いくつかの実施態様において、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨでより高いＦｃＲｎ結合親和性を示す、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドが提供される。いくつかの実施態様において、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、非酸性ｐＨでより高いＦｃＲｎ結合親和性を示し、そして野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して、酸性ｐＨでより高いＦｃＲｎ結合親和性を示す改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドが提供される。従って、特定の実施態様において、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合の喪失を示す改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドが提供される。
【0196】
特定の実施態様は、本明細書に記載される変更されたＦｃＲｎ結合親和性を示すＦｃ変異に加えて、例えば、ほぼ同じ免疫原性の変更されていない抗体全体と比較した場合に、減少又は増強されたエフェクター機能、非共有結合で二量体化する能力、腫瘍部位に局在化する増加した能力、減少した血清半減期、増加した血清半減期及び同様のもののような所望の生化学的特徴をもたらすように欠失されているか又は別の方法で変更されている、定常領域ドメインの１つ若しくはそれ以上における少なくとも１つのアミノ酸及び／又は可変領域の１つ若しくはそれ以上における少なくとも１つのアミノ酸を含む抗体を含む。
【0197】
特定の他の実施態様において、結合ポリペプチドは、異なる抗体アイソタイプから誘導された定常領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の２つ又はそれ以上に由来する定常領域）を含む。他の実施態様において、結合ポリペプチドは、キメラヒンジ（すなわち、異なる抗体アイソタイプのヒンジドメインから誘導されたヒンジ部分を含むヒンジ、例えば、ＩｇＧ４分子由来の上部ヒンジドメイン及びＩｇＧ１中間ヒンジドメイン）を含む。
【0198】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、当該分野で公知の技術を使用してエフェクター機能を増加又は減少するように変異され得る。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む本開示の結合ポリペプチドは、Ｆｃ受容体に対する変更された結合親和性を有する。いくつかの異なる型のＦｃ受容体があり、これらはそれらが認識する抗体の型に基づいて分類される。例えば、Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）はＩｇＧクラス抗体に結合し、Ｆｃ－アルファ受容体（ＦｃαＲ）はＩｇＡクラス抗体に結合し、そしてＦｃ－イプシロン受容体（ＦｃεＲ）はＩｇＥクラス抗体に結合する。ＦｃγＲは、いくつかのメンバー、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂを含むファミリーに属する。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して変更されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較して増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは
、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較してほぼ同じＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドと比較してほぼ同じＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0199】
他の実施態様において、本明細書に記載される診断及び処置方法における使用のための結合ポリペプチドは、グリコシル化を減少するか又は除去するように変更された定常領域、例えば、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する。例えば、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチド（例えば、抗体又はイムノアドヘシン）は、抗体Ｆｃのグリコシル化を変更するアミノ酸置換をさらに含み得る。例えば、該改変されたＦｃドメインは、減少したグリコシル化を有し得る（例えば、Ｎ－又はＯ－連結グリコシル化）。
【0200】
減少した又は変更されたグリコシル化をもたらす例となるアミノ酸置換は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０１８５７２号（その全体が参照により本明細書に加入される）。いくつかの実施態様において、結合ポリペプチドはグリコシル化を除去するように改変される。このような結合ポリペプチドは「アグリ（ａｇｌｙ）」結合ポリペプチドと呼ばれ得る（例えば、「アグリ抗体」）。理論に束縛されないが、「アグリ」結合ポリペプチドはインビボで改善された安全性及び安定性プロフィールを有し得ると考えられている。アグリ結合ポリペプチドは、いずれのアイソタイプ又はサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のものでよい。多数の当該分野で認識された方法が、「アグリ」抗体又は変更されたグリカンを有する抗体を製造するために利用可能である。例えば、可変されたグリコシル化経路（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ欠失）を有する遺伝子操作された宿主細胞（例えば、改変された酵母、例えば、ピキア（Ｐｉｃｃｈｉａ）、又はＣＨＯ細胞）を使用してこのような抗体を製造することができる。
【0201】
特定の実施態様において、結合ポリペプチドは、１つ又はそれ以上のエフェクター機能を媒介する抗体定常領域（例えば、ＩｇＧ定常領域、例えばヒトＩｇＧ定常領域、例えばヒトＩｇＧ１定常領域）を含み得る。例えば、Ｃ１－複合体の抗体定常領域への結合は、補体系を活性化し得る。補体系の活性化は、細胞病原体のオプソニン化及び溶解において重要である。補体系の活性化は炎症応答も刺激し、そしてまた自己免疫過感受性に関与する。さらに、抗体はＦｃドメインを介して様々な細胞上の受容体に結合する（抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位は細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュー受容体）を含む様々なクラスの抗体に特異的な多数のＦｃ受容体がある。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は、多数の重要かつ多用な生物学的応答を惹起し、これらとしては、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体のクリアランス、抗体被覆標的細胞のキラー細胞による溶解（抗体依存性細胞介在性細胞傷害、又はＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症メディエーターの放出、経胎盤移行並びに免疫グロブリン産生の制御が挙げられる。いくつかの実施態様において、結合ポリペプチド（例えば、抗体又はイムノアドヘシン）はＦｃ－ガンマ受容体に結合する。代替の実施態様において、結合ポリペプチドは１つ若しくはそれ以上のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）を欠いており、かつ／又はＦｃγ受容体に結合することができない定常領域を含み得る。
【0202】
抗体を含めて、低い熱力学的安定性を有するタンパク質は、ミスフォールディング及び凝集の増加した傾向を有し、そして有用な治療剤としてのタンパク質の活性、有効性、及び可能性を制限するか又は妨害するだろう。特定の実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じ熱安定性を有する。いくつかの実施態様において、改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドは、三重アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）を有する改変されたＦｃドメインを含む結合ポリペプチドとほぼ同じ熱安定性を有する。
【0203】
改変の結果として得られた生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティ及び他の生
化学的効果、例えば腫瘍局在化、体内分布及び血清半減期は、過度の実験なしに周知の免疫学的技術を使用して容易に測定及び定量され得る。
化学的効果、例えば腫瘍局在化、体内分布及び血清半減期は、過度の実験なしに周知の免疫学的技術を使用して容易に測定及び定量され得る。
【0204】
特定の実施態様において、本開示の結合ポリペプチドは、抗体の抗原結合フラグメントを含み得る。用語「抗原結合フラグメント」は、抗原に結合するか又は抗原結合（すなわち、特異的結合）についてインタクトな抗体と（すなわち、それらが由来するインタクト抗体）と競合する免疫グロブリン又は抗体のポリペプチドフラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、当該分野で周知の組み換え又は生化学的方法により製造され得る。例となる抗原結合フラグメントとしては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及び（Ｆａｂ’）２が挙げられる。例となる実施態様において、本開示の結合ポリペプチドは、抗原結合フラグメント及び改変されたＦｃドメインを含む。
【0205】
いくつかの実施態様において、結合ポリペプチドは単鎖可変領域配列（ＳｃＦｖ）を含む。単鎖可変領域配列は、１つ又はそれ以上の抗原結合部位、例えば、可動性リンカーによりＶＨドメインに連結されたＶＬドメインを有する単一のポリペプチドを含む。ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配置で又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配置で構築され得る。抗原結合部位を構成するＶＬ及びＶＨドメインを連結する可動性ヒンジは、約１０～約５０アミノ酸残基を含む。ペプチドの接続は当該分野で公知である。結合ポリペプチドは、少なくとも１つのｓｃＦｖ及び／又は少なくとも１つの定常領域を含み得る。一実施態様において、本開示の結合ポリペプチドは、改変されたＦｃドメインに連結されるか融合された少なくとも１つのｓｃＦｖを含み得る。
【0206】
いくつかの実施態様において、本開示の結合ポリペプチドは、ＳｃＦｖ分子（例えば、変更されたＳｃＦｖ分子）を有する抗体をコードするＤＮＡ配列を融合することにより製造される多価（例えば、四価）抗体である。例えば、一実施態様において、ＳｃＦｖ分子（例えば、変更されたＳｃＦｖ分子）がそのＮ末端又はＣ末端で可動性リンカー（例えば、ｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）を介して抗体のＦｃフラグメントに連結されるように、これらの配列を組み合わせる。別の実施態様において、本開示の四価抗体は、ＳｃＦｖ分子を接続ペプチドに融合し、これを改変されたＦｃドメインに融合して、ＳｃＦｖ－Ｆａｂ四価分子を構築することにより製造され得る。
【0207】
別の実施態様において、本開示の結合ポリペプチドは変更されたミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）である。本開示の変更されたミニボディは、それぞれがＳｃＦｖ分子を含む２つのポリペプチド鎖から構築されたダイマー分子であり、これは接続ペプチドを介して改変されたＦｃドメインに融合される。ミニボディは、ＳｃＦｖ成分を構築し、そして当該分野で記載された方法を使用してペプチド成分を接続することにより製造され得る（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号又はＷＯ ９４／０９８１７Ａｌを参照のこと）。別の実施態様において、四価ミニボディはが構築され得る。四価ミニボディは、２つのＳｃＦｖ分子が可動性リンカーを使用して連結されること以外はミニボディと同じやり方で構築され得る。次いで、連結されたｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ構築物を改変されたＦｃドメインに接合する。
【0208】
別の実施態様において、本開示の結合ポリペプチドは二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）を含む。二特異性抗体は、ダイマー四価分子であり、同じポリペプチド鎖上のＶＬ及びＶＨドメインが相互作用できないように、それぞれがｓｃＦｖ分子に似たポリペプチドを有するが、両方の可変ドメインを接続する通常は短い（１０未満、例えば、約１～約５つの）アミノ酸残基リンカーを有する。代わりに、ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、第二のポリペプチド鎖上の（それぞれ）ＶＨ及びＶＬドメインと相互作用する（例えば、ＷＯ０２／０２７８１を参照のこと）。本開示の二特異性抗体は、改変されたＦｃドメインに融合されたｓｃＦｖ様分子を含む。
【0209】
他の実施態様において、結合ポリペプチドは、同じポリペプチド鎖上に連続して１つ又はそれ以上の可変ドメインを含む多価抗体、例えば、タンデム可変ドメイン（ＴＶＤ）ポリペプチドを含む。例となるＴＶＤポリペプチドは、米国特許第５，９８９，８３０号に記載される「ダブルヘッド（ｄｏｕｂｌｅ ｈｅａｄ）」又は「デュアル－Ｆｖ」構成を含む。２つの異なる抗体の可変ドメインは２つの別々の鎖（１つの重鎖及び１つの軽鎖）上で縦列配置で発現され、ここで一方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーで分離された２つの連続したＶＨドメインを含み（ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２）、そして他方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーにより連続して接続される相補的ＶＬドメインからなる（ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２）。クロスオーバーダブルヘッド構成において、２つの異なる抗体の可変ドメインが縦列配置で２つの別個のポリペプチド鎖上に発現され（１つの重鎖及び１つの軽鎖）、ここで一方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーにより分離された２つのＶＨドメインを有し（ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２）、そして他方のポリペプチド鎖は、連続してペプチドリンカーにより反対方向で接続された相補的ＶＬドメインからなる（ＶＬ２－リンカー－ＶＬ１）。「二重－Ｆｖ」形式に基づくさらなる抗体変異体としては、二重－可変－ドメイン（Ｄｕａｌ－Ｖａｒｉａｂｌｅ－Ｄｏｍａｉｎ）ＩｇＧ （ＤＶＤ－ＩｇＧ）二重特異性抗体（米国特許第７，６１２，１８１号を参照のこと）及びＴＢＴＩ形式（ＵＳ ２０１０／０２２６９２３ Ａ１を参照のこと）が挙げられる。いくつかの実施態様において、結合ポリペプチドは、改変されたＦｃドメインに融合された同じポリペプチド上に連続して１つ又はそれ以上の可変ドメインを含む多選択性又は多価抗体を含む。
【0210】
別の例となる実施態様において、結合ポリペプチドは、「ダブルヘッド」構成に基づくクロスオーバー二重可変ドメインＩｇＧ（ＣＯＤＶ－ＩｇＧ）二重特異性抗体（ＵＳ２０１２０２５１５４１ Ａ１を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）。
【0211】
別の例となる実施態様において、結合ポリペプチドはイムノアドヘシンである。本明細書で使用される「イムノアドヘシン」は、免疫グロブリン定常ドメイン（すなわち、Ｆｃ領域）に連結された、１つ又はそれ以上の結合ドメインを含む結合ポリペプチド（例えば、受容体、リガンド又は細胞接着分子由来）を指す（例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ
ａｌ．１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ ８（２）：１０４－１１５、及びＩｓａａｃｓ （１９９７） Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．３６：３０５を参照のこと、これらはそれら全体として参照により本明細書に加入される）。イムノアドヘシンは、それらの国際一般名（ＩＮＮ）において末尾「－セプト（－ｃｅｐｔ）」により識別される。抗体と同様に、イムノアドヘシンは長い循環半減期を有し、アフィニティーベースの方法により容易に精製され、そして二価性によりもたらされるアビディティーの有利性を有する。市販の治療用イムノアドヘシンの例としては、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ(R)）、アバタセプト
（ＯＲＥＮＣＩＡ(R)）、リロナセプト（ＡＲＣＡＬＹＳＴ(R)）、アフリベルセプト（ＺＡＬＴＲＡＰ(R)／ＥＹＬＥＡ(R)）、及びベラタセプト（ＮＵＬＯＪＩＸ(R)）が挙げら
れる。
ａｌ．１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ ８（２）：１０４－１１５、及びＩｓａａｃｓ （１９９７） Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．３６：３０５を参照のこと、これらはそれら全体として参照により本明細書に加入される）。イムノアドヘシンは、それらの国際一般名（ＩＮＮ）において末尾「－セプト（－ｃｅｐｔ）」により識別される。抗体と同様に、イムノアドヘシンは長い循環半減期を有し、アフィニティーベースの方法により容易に精製され、そして二価性によりもたらされるアビディティーの有利性を有する。市販の治療用イムノアドヘシンの例としては、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ(R)）、アバタセプト
（ＯＲＥＮＣＩＡ(R)）、リロナセプト（ＡＲＣＡＬＹＳＴ(R)）、アフリベルセプト（ＺＡＬＴＲＡＰ(R)／ＥＹＬＥＡ(R)）、及びベラタセプト（ＮＵＬＯＪＩＸ(R)）が挙げら
れる。
【0212】
特定の実施態様において、結合ポリペプチドは免疫グロブリン様ドメインを含む。適切な免疫グロブリン様ドメインとしては、限定することなく、フィブロネクチンドメイン（例えば、Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：９５－１０９を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、ＤＡＲＰｉｎ（例えば、Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３ （１５－１６）：６９５－７０１を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、プロテインＡのＺドメイン（Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００８） ＦＥＢＳ Ｊ．２７５ （１１）：２６６８－７
６を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、リポカリン（例えば、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（２００８） ＦＥＢＳ Ｊ．２７５ （１１）：２６７７－８３を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｓ）（例えば、Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２ （１）：１７２－８５を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、アフィチン（Ａｆｆｉｔｉｎｓ）（例えば、Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００８）． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３ （５）：１０５８－６８を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）（例えば、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ
ａｌ．（２００５） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３ （１２）：１５５６－６１を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒｓ）（例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２ （５）：３１９６－３２０４を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、及びクニッツドメインペプチド（例えば、Ｎｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ９ （２）：２６１－８を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）が挙げられる。
６を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、リポカリン（例えば、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（２００８） ＦＥＢＳ Ｊ．２７５ （１１）：２６７７－８３を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｓ）（例えば、Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２ （１）：１７２－８５を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、アフィチン（Ａｆｆｉｔｉｎｓ）（例えば、Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００８）． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３ （５）：１０５８－６８を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）（例えば、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ
ａｌ．（２００５） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３ （１２）：１５５６－６１を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒｓ）（例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２ （５）：３１９６－３２０４を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）、及びクニッツドメインペプチド（例えば、Ｎｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ９ （２）：２６１－８を参照のこと、これはその全体として参照により本明細書に加入される）が挙げられる。
【0213】
本開示の結合ポリペプチド及びイムノアドヘシンについて、実質的にいずれの抗原も結合ポリペプチドにより標的にされ得、これらとしては、限定されないが、タンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフ、及び／又は標的抗原のエピトープが挙げられ、これにはサイトカインのような可溶性因子及び膜結合因子の両方、並びに膜貫通受容体が含まれる。
【0214】
本明細書に記載される改変されたＦｃドメインを含む本開示の結合ポリペプチドは、既知の「親」抗体のＣＤＲ配列又は可変ドメイン配列を含み得る。いくつかの実施態様において、親抗体及び本開示の抗体は、本明細書に開示されるＦｃドメインに対する改変を除いて類似するか又は同一の配列を共有し得る。
【0215】
核酸及び発現ベクター
一局面において、本発明は、本明細書に開示される結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドを発現させることを含む結合ポリペプチドの製造方法もまた提供される。
一局面において、本発明は、本明細書に開示される結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドを発現させることを含む結合ポリペプチドの製造方法もまた提供される。
【0216】
本明細書に開示される結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、典型的には、特許請求される抗体又はイムノアドヘシンの所望の量を製造するために使用され得る宿主細胞中への導入のための発現ベクターに挿入される。従って、特定の局面において、本発明は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びにこれらのベクター及びポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【0217】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、明細書及び特許請求の範囲の目的のために、所望の遺伝子を細胞に導入しそして発現させるために使用されるベクターを意味するために本明細書において使用される。当業者に公知のように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスからなる群より容易に選択され得る。一般に、ベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子おクローニングを促進するための適切な制限部位、並びに真核生物細胞又は原核生物細胞に進入し、かつ／又は複製する能力を含む。
【0218】
多数の発現ベクター系が使用され得る。例えば、ベクターの１つのクラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロ
ウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）、又はＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスから誘導されるＤＮＡエレメントを利用する。その他は、配列内リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を含む。さらに、ＤＮＡをそれらの染色体中に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ又はそれ以上のマーカーを導入することにより選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤抵抗性（例えば、抗生物質）又は銅のような重金属に対する抵抗性を備え得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させようとするＤＮＡ配列に直接連結されても、同時形質転換により同じ細胞中に導入されてもよい。さらなるエレメントもｍＲＮＡの最適な合成のために必要であるかもしれない。これらのエレメントはシグナル配列、スプライスシグナル、さらには転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルを含み得る。幾つかの実施態様において、クローンされた可変領域遺伝子は、上で考察されるように合成された重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子（例えばヒト遺伝子）とともに発現ベクター中に挿入される。
ウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）、又はＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスから誘導されるＤＮＡエレメントを利用する。その他は、配列内リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を含む。さらに、ＤＮＡをそれらの染色体中に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ又はそれ以上のマーカーを導入することにより選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤抵抗性（例えば、抗生物質）又は銅のような重金属に対する抵抗性を備え得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させようとするＤＮＡ配列に直接連結されても、同時形質転換により同じ細胞中に導入されてもよい。さらなるエレメントもｍＲＮＡの最適な合成のために必要であるかもしれない。これらのエレメントはシグナル配列、スプライスシグナル、さらには転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルを含み得る。幾つかの実施態様において、クローンされた可変領域遺伝子は、上で考察されるように合成された重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子（例えばヒト遺伝子）とともに発現ベクター中に挿入される。
【0219】
他の実施態様において、本明細書に記載される結合ポリペプチドは、ポリシストロニック構築物を使用して発現され得る。このような発現系において、抗体の重鎖及び軽鎖のような目的の複数の遺伝子産物が、単一のポリシストロニック構築物から産生され得る。これらの系は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有利に使用して、比較的高いレベルのポリペプチドを真核生物宿主細胞において生じる。適合するＩＲＥＳ配列は米国特許第６，１９３，９８０号（これは参照により本明細書に加入される）に開示される。当業者には当然のことながら、このような発現系を使用して、本出願に開示される全種類のポリペプチドを効率的に製造し得る。
【0220】
より一般的に、本開示の結合ポリペプチドをコードするベクター又はＤＮＡ配列が製造されると、発現ベクターは適切な宿主細胞中に導入され得る。すなわち、宿主細胞が形質転換され得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知の様々な技術により達成され得る。これらとしては、限定されないが、トランスフェクション（電気泳動及び電気穿孔を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡを用いた細胞融合、マイクロインジェクション、及びインタクトなウイルスを用いた感染が挙げられる。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ、Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｃｈａｐｔｅｒ ２４．２、ｐｐ．４７０－４７２ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ、Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ １９８８）を参照のこと。形質転換された細胞を、軽鎖及び重鎖の産生のために適した条件下で増殖させ、そして重鎖及び／又は軽鎖タンパク質合成についてアッセイする。例となるアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は蛍光活性化セルソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
【0221】
本明細書において使用される用語「形質転換」は、遺伝子型を変化させ、結果としてレシピエント細胞における変化を生じる、ＤＮＡのレシピエント宿主細胞への導入を指すために広義で使用されるものとする。
【0222】
同じように、「宿主細胞」は、組み換えＤＮＡ技術を使用して構築され、そして少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを用いて形質転換された細胞を指す。組み換え宿主からのポリペプチドの単離のためのプロセスの記載において、用語「細胞」及び「細胞培養物」は、別に明確に特定されていなければ、抗体の供給源を示すために交換可能に使用される。換言すると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心分離された全細胞から、又は培地及び懸濁した細胞の両方を含有する細胞培養物のいずれかからを意味し得る。
【0223】
一実施態様において、結合ポリペプチドの発現のために使用される宿主細胞株は、真核生物起源又は原核生物起源のものである。一実施態様において、結合ポリペプチドの発現のために使用される宿主細胞株は、細菌起源のものである。一実施態様において、結合ポリペプチドの発現のために使用される宿主細胞株は哺乳動物起源のものである；当業者は、そこで発現させようとする所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を決定することができる。例となる宿主細胞株としては、限定されないが、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系統、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系統）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を有するＣＶＩ由来細胞）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞） ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。一実施態様において、細胞株は、それらから発現された抗体の変更されたグリコシル化、例えば、フコース欠損（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．（Ｃｒｕｃｅｌｌ）又はＦＵＴ８－ノックアウトＣＨＯ細胞株（ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴTM細胞）（Ｂｉｏｗａ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ））をもたらす。一実施態様において、ＮＳ０細胞が使用され得る。宿主細胞株は、典型的には商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又は公開された文献から入手可能である。
Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又は公開された文献から入手可能である。
【0224】
インビトロ製造は、大量の所望の結合ポリペプチドを得るためのスケールアップを可能にする。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養のための技術は当該分野で公知であり、そして例えば、エアリフトリアクター若しくは連続撹拌リアクター中の均一懸濁培養、又は例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ若しくはセラミックカートリッジにおいて固定若しくは捕捉された細胞培養が挙げられる。必要な場合及び／又は所望される場合、ポリペプチドの溶液は、慣用のクロマトグラフィー方法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ－セルロース上でのクロマトグラフィー及び／又は（イムノ－）アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。
【0225】
結合ポリペプチドをコードする１つ又はそれ上の遺伝子はまた、細菌又は酵母又は植物細胞のような非哺乳動物細胞において発現され得る。これに関して、当然のことながら、細菌のような様々な単細胞非哺乳動物微生物も形質転換され得る；すなわち、培養又は発酵で増殖することができる。形質転換を受けやすい細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）又はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の系統のような腸内細菌科；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバチルス科；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のメンバーが挙げられる。さらに当然のことながら、細菌において発現される場合、ポリペプチドは封入体の一部になり得る。ポリペプチドは、単離され、精製され、次いで機能性分子中に組み立てられなければならない。
【0226】
原核生物に加えて、真核微生物も使用され得る。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は一般的にパン酵母は、真核微生物の中で最も広く使用されるが、多数の他の系統が一般に利用可能である。酵母類における発現のために、例えばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９ （１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、７：１４１ （１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１０：１５７ （１９８０））が一般的に使用される。このプラスミドはＴＲＰ１遺伝子を既に含有しており、これが例えばトリプトファンにおける増殖する能力を欠いた酵母の変異株のための選択マーカーをもたらす、ＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４－１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：１２ （１９７７））。次いで酵母宿主細胞ゲノムの特徴と
してのｔｒｐｌ損傷は、トリプトファンの存在しない場合の増殖により形質転換を検出するために有効な環境を提供する。
してのｔｒｐｌ損傷は、トリプトファンの存在しない場合の増殖により形質転換を検出するために有効な環境を提供する。
【0227】
処置方法
一局面において、本発明は、有効量の本明細書に開示される結合ポリペプチドを投与することを含む、それを必要とする患者を処置又は診断する方法を提供する。特定の実施態様において、本開示は、このような処置における哺乳動物被験体における障害、例えば、腫瘍性障害の診断及び／又は処置のためのキット及び方法を提供する。特定の例となる実施態様において、被験体はヒトである。
一局面において、本発明は、有効量の本明細書に開示される結合ポリペプチドを投与することを含む、それを必要とする患者を処置又は診断する方法を提供する。特定の実施態様において、本開示は、このような処置における哺乳動物被験体における障害、例えば、腫瘍性障害の診断及び／又は処置のためのキット及び方法を提供する。特定の例となる実施態様において、被験体はヒトである。
【0228】
本開示の結合ポリペプチドは、多数の様々な適用において有用である。例えば、一実施態様において、主題の結合ポリペプチドは、結合ポリペプチドの結合ドメインにより認識されるエピトープを保有する細胞を減少させるか又は除去するために有用である。別の実施態様において、主題の結合ポリペプチドは、循環中の可溶性抗原の濃度を低減するか又は可溶性抗原を除去する際に有効である。別の実施態様において、主題の結合ポリペプチドはＴ－細胞エンゲイジャー（ｅｎｇａｇｅｒｓ）である。一実施態様において、結合ポリペプチドは、腫瘍サイズを低減し得、腫瘍成長を阻害し得、かつ／又は腫瘍保有動物の生存期間を延長し得る。従って、本開示はまた、ヒト又は他の動物において、有効非毒性量の改変された抗体を上記ヒト又は他の動物に投与することにより腫瘍を処置する方法に関する。
【0229】
一実施態様において、主題の結合ポリペプチドは疾患又は障害の処置のために有用である。例えば、主題の結合ポリペプチドは、抗体関連障害、又は抗体応答性障害、状態若しくは疾患の処置のために有用である。本明細書で使用される用語「抗体関連障害」又は「抗体応答性障害」又は［状態」又は「疾患」は、本開示の抗体又は結合ポリペプチドを含む医薬組成物の投与により寛解され得る疾患又は障害を指すか又は記載する。
【0230】
一実施態様において、主題の結合ポリペプチドは癌の処置のために有用である。本明細書で使用される用語「癌」又は「癌性」は、典型的に未制御の細胞増殖により特徴づけられる生理的状態を指す。癌の例としては、限定されないが、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、及び白血病又はリンパ系腫瘍が挙げられる。上記癌のより特定の例としては、有棘細胞癌（例えば、上皮有棘細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌又は胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）癌又は腎（ｒｅｎａｌ）癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、さらには頭頸部癌が挙げられる。
【0231】
別の実施態様において、主題の結合ポリペプチドは、他の障害の処置に有用であり、これらとしては、限定されないが、感染性疾患、自己免疫障害、炎症性障害、肺疾患、神経又は神経変性疾患、肝臓疾患、脊椎の疾患、子宮の疾患、抑うつ障害及び同様のものが挙げられる。感染性疾患の非限定的な例としては、ＲＮＡウイルス（例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザ）、パラミクソウイルス（例えば、呼吸器多核体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）、コロナウイルス、アルファウイルス（例えば、チクングニアウイルス） レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）及び同様のもの）又はＤＮＡウイルスにより引き起こされるものが挙げられる。感染性疾患の例としてはまた、限定することなく、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）により引き起こされる細菌性感染症、及び例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）により引き起こされるものを含む他の感染性疾患が挙げられる。他の感染性疾患としては、限定することなく、マラリア、ＳＡＲＳ、黄熱病、ライム病、リーシュマニア症、炭疽病及び髄膜炎が挙げられる。例となる自己免疫障害としては、限定されないが、乾癬、関節リウマチ、シェーグレン症候群、移植片拒絶、グレーブス病、重症筋無力症及びループス（例えば、全身性エリテマトーデス）が挙げられる。従って、本開示は、例えば、増強された半減期を有する主題の結合ポリペプチドの使用から利益を受けるであろう様々な状態を処置する方法に関する。
ｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）により引き起こされる細菌性感染症、及び例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）により引き起こされるものを含む他の感染性疾患が挙げられる。他の感染性疾患としては、限定することなく、マラリア、ＳＡＲＳ、黄熱病、ライム病、リーシュマニア症、炭疽病及び髄膜炎が挙げられる。例となる自己免疫障害としては、限定されないが、乾癬、関節リウマチ、シェーグレン症候群、移植片拒絶、グレーブス病、重症筋無力症及びループス（例えば、全身性エリテマトーデス）が挙げられる。従って、本開示は、例えば、増強された半減期を有する主題の結合ポリペプチドの使用から利益を受けるであろう様々な状態を処置する方法に関する。
【0232】
当業者は、慣用の実験により、悪性病変を処置する目的のためになるであろう改変された結合ポリペプチドの有効非毒性量を決定することができる。例えば、本開示の結合ポリペプチドの治療活性量は、被験体の病期（例えば、ステージＩ対ステージＩＶ）、年齢、性別、医学的合併症（例えば、免疫抑制状態又は疾患）及び体重、並びに被験体において改変された抗体が所望の応答を惹起する能力にような因子に従って変化し得る。投薬レジメンは、最適な治療応答を生じるように調整され得る。例えば、いくつかに分けられた用量が毎日投与されてもよく、又は治療状況の緊急事態により示されるにつれて比例的に用量を低減してもよい。
【0233】
一般に、本開示において提供される組成物は、いずれかの新生物を予防的又は治療的に処置するために使用され得、改変された抗体により癌性細胞を標的化することを可能にする抗原性マーカーを含む。
【0234】
医薬組成物及びその投与
本開示の結合ポリペプチドを製造しそして被験体に投与する方法は、当業者に周知であるか又は容易に決定される。本開示の結合ポリペプチドの投与経路は、経口、非経口、吸入又は局所によるものであり得る。本明細書で使用される用語非経口としては、静脈内、動脈内、腹腔内、筋内、皮下、直腸又は膣投与が挙げられる。全てのこれらの投与形態は、本開示の範囲内であると明確に検討されるが、投与形態は、注射用液剤、特に静脈内若しくは動脈内注射又は点滴用だろう。通常は、注射に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸又はクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。いくつかの実施態様において、結合ポリペプチドは、有害な細胞集団の部位に直接送達され得、それにより患部組織の治療剤への曝露を増加させる。
本開示の結合ポリペプチドを製造しそして被験体に投与する方法は、当業者に周知であるか又は容易に決定される。本開示の結合ポリペプチドの投与経路は、経口、非経口、吸入又は局所によるものであり得る。本明細書で使用される用語非経口としては、静脈内、動脈内、腹腔内、筋内、皮下、直腸又は膣投与が挙げられる。全てのこれらの投与形態は、本開示の範囲内であると明確に検討されるが、投与形態は、注射用液剤、特に静脈内若しくは動脈内注射又は点滴用だろう。通常は、注射に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸又はクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。いくつかの実施態様において、結合ポリペプチドは、有害な細胞集団の部位に直接送達され得、それにより患部組織の治療剤への曝露を増加させる。
【0235】
非経口投与のための製剤としては、滅菌水性又は非水性液剤、懸濁剤、及び乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、生理食塩水及び緩衝化媒体を含めて、水、アルコール性／水溶液、エマルション又は懸濁液を含む。本開示の組成物及び方法において、薬学的に許容しうる担体としては、限定されないが、０．０１～０．１Ｍ、例えば、０．０５Ｍリン酸緩衝液、又は０．８％食塩水が挙げられる。他の一般的な日経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、体液及び栄養補給剤、電解質補給剤、例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの、及び同様のものが挙げられる。保存料並びに例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどのような他の添加剤も存在していてもよい。より詳細には、注射可能用途に適した医薬組成物としては、滅菌水性液剤（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射可能液剤又は分散剤の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。このような場合、組成物は無菌でなければならず、そして容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである
。これは製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、そして典型的には細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して守られる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、及び同様のもの）を含有する溶媒又は分散媒体、及びそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合には必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。
。これは製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、そして典型的には細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して守られる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、及び同様のもの）を含有する溶媒又は分散媒体、及びそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合には必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。
【0236】
微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール及び同様のものにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムが組成物中に含まれる。吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることにより、注射可能組成物の延長された吸収が起こり得る。
【0237】
いずれの場合にも、滅菌注射可能液剤は、必要量の活性化合物（例えば、それ自体、又は他の活性薬剤と組み合わせた改変された結合ポリペプチド）を、本明細書において列挙された成分のうちの１つ又は組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込み、続いて滅菌濾過することにより製造され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を滅菌ビヒクルに組み込むことにより製造され、これは基本の分散媒体及び上で列挙したものからの必要な他の成分を含有する。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌散剤の場合、例となる製造方法としては真空乾燥及び凍結乾燥が挙げられ、これにより、前もって滅菌濾過したその溶液からの活性成分といずれかのさらなる所望の成分との粉末が得られる。注射のための製剤は、当該分野公知の方法に従って、加工され、アンプル、バッグ、瓶、シリンジ又はバイアルのような容器中に充填され、そして無菌条件下で密封される。さらに、製剤はパッケージングされてキットの形態で販売され得る。このような製品は、典型的には、付随する組成物が、自己免疫若しくは腫瘍性障害に罹患しているか又は自己免疫若しくは腫瘍性障害にかかりやすい被験体を処置するために有用であるということを示すラベル又は添付文書を有する。
【0238】
上記の状態の処置ための本開示の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理状態、患者がヒトであるか動物であるか、他の投与される薬物、及び処置が予防的であるか治療的であるかを含む多くの様々な因子に依存して変動する。通常は、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置され得る。処置投薬量は、安全性及び有効性を最適化するために当業者の公知の慣用の方法を使用して滴定され得る。
【0239】
本開示の結合ポリペプチドは多くの場合に投与され得る。単回投薬間の間隔は、毎週、毎月又は毎年であり得る。間隔は、患者における改変された結合ポリペプチド又は抗原の血中レベルを測定することにより示されるにつれて不規則でもよい。いくつかの方法では、投薬量は、改変された結合ポリペプチドの血漿濃度約１～１０００μｇ／ｍｌ、そしていくつかの方法では約２５～３００μｇ／ｍｌを達成するように調整される。あるいは、結合ポリペプチドは徐放製剤として投与され得、この場合、必要とされる投与頻度はより低い。抗体について、投薬量及び頻度は患者における抗体の半減期に依存して変わる。一般に、ヒト化抗体は最も長い半減期を示し、キメラ抗体及び非ヒト抗体がこれに続く。
【0240】
投薬量及び投与頻度は、処置が予防的か又は治療的かによって変わり得る。予防的適用において、本抗体を含有する組成物又はそのカクテルは、患者の抵抗性を増強するためにまだ疾患状態ではない患者に投与される。このような量は、「予防有効用量」と定義される。この使用において、正確な量は、この場合もやはり患者の健康状態及び全身の免疫に依存するが、一般に、用量あたり約０．１～約２５ｍｇ、特に用量あたり約０．５～約２
．５ｍｇの範囲に及ぶ。比較的低い投薬量が、比較的低頻度の間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は彼らの寿命の残りの間処置を受け続ける。治療適用において、比較的高い投薬量（例えば、用量あたり抗体約１～４００ｍｇ／ｋｇ、放射性免疫複合体については約５～２５ｍｇの投薬量、そして細胞毒－薬物改変抗体についてはより高い用量がより一般的に使用される）が比較的短い間隔で、疾患の進行が減少するか若しくは終結するまで、又は患者が疾患症状の部分的若しくは完全な寛解を示すまで、必要とされることもある。その後、患者は予防的レジメンを投与され得る。
．５ｍｇの範囲に及ぶ。比較的低い投薬量が、比較的低頻度の間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は彼らの寿命の残りの間処置を受け続ける。治療適用において、比較的高い投薬量（例えば、用量あたり抗体約１～４００ｍｇ／ｋｇ、放射性免疫複合体については約５～２５ｍｇの投薬量、そして細胞毒－薬物改変抗体についてはより高い用量がより一般的に使用される）が比較的短い間隔で、疾患の進行が減少するか若しくは終結するまで、又は患者が疾患症状の部分的若しくは完全な寛解を示すまで、必要とされることもある。その後、患者は予防的レジメンを投与され得る。
【0241】
本開示の結合ポリペプチドは、処置（例えば、予防的又は治療的）を必要とする障害又は状態を処置する際に有効である他の薬剤と組み合わせて場合により投与され得る。90Ｙ－標識された本開示の改変抗体の有効な単回処置投薬量（すなわち、治療有効量）は、約５と約７５ｍＣｉとの間、例えば約１０と約４０ｍＣｉとの間である。131Ｉ－改変抗体
の有効単回処置非骨髄除去的（ｎｏｎ－ｍａｒｒｏｗ ａｂｌａｔｉｖｅ）投薬量は、約５と約７０ｍＣｉとの間、又は約５と約４０ｍＣｉとの間範囲に及ぶ。131Ｉ－標識抗体
の有効単回処置除去的（ａｂｌａｔｉｖｅ）投薬量（すなわち、自家骨髄移植を必要とし得る）は、約３０と約６００ｍＣｉとの間、例えば約５０と約５００ｍＣｉとの間に及ぶ。キメラ抗体と併せて、マウス抗体と比べてより長い循環半減期のために、ヨウ素－１３１標識キメラ抗体の有効単回処置非骨髄除去的投薬量は、約３０ｍＣｉ未満のような約５と約４０ｍＣｉとの間の範囲に及ぶ。例えば、111Ｉｎ標識についての画像化基準は、典
型的には約５ｍＣｉ未満である。
の有効単回処置非骨髄除去的（ｎｏｎ－ｍａｒｒｏｗ ａｂｌａｔｉｖｅ）投薬量は、約５と約７０ｍＣｉとの間、又は約５と約４０ｍＣｉとの間範囲に及ぶ。131Ｉ－標識抗体
の有効単回処置除去的（ａｂｌａｔｉｖｅ）投薬量（すなわち、自家骨髄移植を必要とし得る）は、約３０と約６００ｍＣｉとの間、例えば約５０と約５００ｍＣｉとの間に及ぶ。キメラ抗体と併せて、マウス抗体と比べてより長い循環半減期のために、ヨウ素－１３１標識キメラ抗体の有効単回処置非骨髄除去的投薬量は、約３０ｍＣｉ未満のような約５と約４０ｍＣｉとの間の範囲に及ぶ。例えば、111Ｉｎ標識についての画像化基準は、典
型的には約５ｍＣｉ未満である。
【0242】
結合ポリペプチドはすぐ上で記載されるように投与され得るが、他の実施態様では、結合ポリペプチドは別の方法で健常患者に第一選択治療として投与され得るということは強調されなければならない。このような実施態様において、結合ポリペプチドは、正常又は平均的赤色骨髄予備能（ｒｅｄ ｍａｒｒｏｗ ｒｅｓｅｒｖｅｓ）を有する患者及び／又は処置を受けたことがなく、かつ処置を受けていない患者に投与され得る。本明細書で使用される、補助治療と併せて又は組み合わせた改変された抗体又はイムノアドヘシンの投与は、治療及び開示される抗体の、順次的、同時の、同一の広がりを持つ、同時発生的な、併用の、又は同時期に起こる投与又は適用を意味する。当業者には当然のことながら、組み合わせた治療レジメンの様々な構成要素の投与又は適用は、処置の全体的な有効性を増強するために時間を調整され得る。
【0243】
以前に考察されるように、本開示の結合ポリペプチド、イムノアドヘシン又はそれらの組み合わせは、哺乳動物障害のインビボでの処置のために薬学的有効量で投与され得る。これに関して、当然のことながら、開示される結合ポリペプチドは、投与を容易にし、そして活性薬剤の安定性を促進するために製剤化される。
【0244】
本開示に従う医薬組成物は、生理食塩水、非毒性緩衝液、保存料などのような薬学的に許容しうる非毒性の無菌担体を含み得る。本出願の目的のために、治療剤に結合された又は結合されていない、薬学的有効量の結合ポリペプチド、イムノアドヘシン又はそれらの組み合わせは、抗原への有効な結合を達成するため、及び利益を達成するため、例えば疾患若しくは障害の症状を寛解させるため、又は物質若しくは細胞を検出するために、十分な量を意味すると考えられるものとする。腫瘍細胞の場合、改変された結合ポリペプチドは、腫瘍性又は免疫反応性の細胞上の免疫反応性抗原と相互作用し、そしてそれらの細胞の死滅を増加をもたらすことができる。当然ながら、本開示の医薬組成物は、改変された結合ポリペプチドの薬学的有効量を提供するために単回用量又は複数回用量で投与され得る。
【0245】
本開示の範囲に沿って、開示の結合ポリペプチドは、上述の処置方法に従って、治療効果又は予防効果を生じるために十分な量でヒト又は他の動物に投与され得る。本開示の結
合ポリペプチドは、このようなヒト又は他の動物に、本開示の抗体を従来の薬学的に許容しうる担体又は希釈剤と公知の技術に従って混合することにより製造された従来の投薬形態で投与され得る。薬学的に許容しうる担体又は希釈剤の形態及び特徴が、混合しようとする活性成分の量、投与経路及び補完お周知の変数により決定されるということは当業者により認識されるだろう。さらに当業者には当然のことながら、本開示に記載される結合ポリペプチドの１種又はそれ以上を含むカクテルが特に有効であることが判明し得る。
合ポリペプチドは、このようなヒト又は他の動物に、本開示の抗体を従来の薬学的に許容しうる担体又は希釈剤と公知の技術に従って混合することにより製造された従来の投薬形態で投与され得る。薬学的に許容しうる担体又は希釈剤の形態及び特徴が、混合しようとする活性成分の量、投与経路及び補完お周知の変数により決定されるということは当業者により認識されるだろう。さらに当業者には当然のことながら、本開示に記載される結合ポリペプチドの１種又はそれ以上を含むカクテルが特に有効であることが判明し得る。
【0246】
本明細書において言及されるか又は引用される論文、特許、及び特許出願、並びに全ての他の書類及び電子的に利用可能な情報の内容は、各個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により加入されると示されるの同じ程度まで、それら全体として参照により本明細書に加入される。出願人らは、いずれかのこのような論文、特許、特許出願、又は他の物理的及び電子的書類からのいずれか及び全ての材料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を有する。
【0247】
本発明はその特定の実施態様を参照して記載されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更が為され得、そして等価物が置き換えられ得るということが当業者により理解されるべきである。本明細書に記載される方法の他の適切な改変及び適合が、本明細書に開示される実施態様の範囲から逸脱することなく適切な等価物を使用して為され得るということが当業者に明らかとなるだろう。さらに、多くの改変が、特定の状況、材料、物質の組成物、方法、工程段階を、本発明の目的、精神及び範囲に適合させるために為され得る。全てのこのような改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲内であることが意図される。特定の実施態様を詳細に記載してきたが、これらは以下の実施例を参照することによりより明確に理解され、これら実施例は、説明の目的のみのために含まれ、かつ限定することを意図されない。
【実施例0248】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明され、これらはさらなる限定と解釈されるべきではない。
【0249】
実施例１：材料及び方法
タンパク質試薬：
以下のタンパク質を発現させて単離した：Ｃ末端８ｘヒスチジンタグを有する抗原；ｒＦｃＲｎ （ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１３５９、ｐ５１サブユニット：残基２３～２９８；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０７１５１、β２－ｍ：残基２１～１１９）；ビオチン化カニクイザルＦｃＲｎ （ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ８ＳＰＶ９、ｐ５１サブユニット：Ｃ末端Ａｖｉ－タグを有する残基２４～２９７；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ８ＳＰＷ０、β２－ｍ：残基２１～１１９）；ビオチン化ｈＦｃＲｎ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ５５８９９、ｐ５１サブユニット：Ｃ末端Ａｖｉ－タグを有する残基２４～２９７；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ６１７６９、β２－ｍ：残基２１～１１９）；ヒトＣＤ１６ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０８６３７、ＦｃγＲＩＩＩａ：Ｃ末端ＨＰＣ４タグ及び位置１５８のバリン（Ｖ１５８）を有する残基１７～２０８）。Ｈ４３５Ａ及びＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ重鎖変異体をＨＥＫ２９３条件培地から得た。ｍＡｂ２変異体をＥｖｉｔｒｉａによりクローンし、そして懸濁液ＣＨＯ Ｋ１条件培地からｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ アフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、その後の実験のために緩衝液をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４に交換した。
タンパク質試薬：
以下のタンパク質を発現させて単離した：Ｃ末端８ｘヒスチジンタグを有する抗原；ｒＦｃＲｎ （ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１３５９、ｐ５１サブユニット：残基２３～２９８；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０７１５１、β２－ｍ：残基２１～１１９）；ビオチン化カニクイザルＦｃＲｎ （ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ８ＳＰＶ９、ｐ５１サブユニット：Ｃ末端Ａｖｉ－タグを有する残基２４～２９７；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ８ＳＰＷ０、β２－ｍ：残基２１～１１９）；ビオチン化ｈＦｃＲｎ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ５５８９９、ｐ５１サブユニット：Ｃ末端Ａｖｉ－タグを有する残基２４～２９７；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ６１７６９、β２－ｍ：残基２１～１１９）；ヒトＣＤ１６ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０８６３７、ＦｃγＲＩＩＩａ：Ｃ末端ＨＰＣ４タグ及び位置１５８のバリン（Ｖ１５８）を有する残基１７～２０８）。Ｈ４３５Ａ及びＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ重鎖変異体をＨＥＫ２９３条件培地から得た。ｍＡｂ２変異体をＥｖｉｔｒｉａによりクローンし、そして懸濁液ＣＨＯ Ｋ１条件培地からｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ アフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、その後の実験のために緩衝液をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４に交換した。
【0250】
飽和ライブラリー構築：
リーダーＤＮＡ配列を有するＷＴ ＩｇＧ１ ｍＡｂ１抗体重鎖及び軽鎖を、それぞれｐＢＨ６４１４及びｐＢＨ６３６８哺乳動物発現プラスミドにＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を使用して組み込んだ。飽和ライブラリーを、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特
異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びＮＮＫ（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ）及びＷＷＣ（Ｗ＝Ａ／Ｔ）プライマー（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて作製して、全ての可能なアミノ酸を以下の位置に導入した：Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４及びＹ４３６（ＥＵナンバリング）。ｍＡｂ１骨格における３つの対照変異体の重鎖ＤＮＡ配列、ＡＡＡ（Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ）、ＬＳ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）及びＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）を、ＬａｋｅＰｈａｒｍａによるｐＢＨ６４１４ベクターに構築した。
リーダーＤＮＡ配列を有するＷＴ ＩｇＧ１ ｍＡｂ１抗体重鎖及び軽鎖を、それぞれｐＢＨ６４１４及びｐＢＨ６３６８哺乳動物発現プラスミドにＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を使用して組み込んだ。飽和ライブラリーを、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特
異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びＮＮＫ（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ）及びＷＷＣ（Ｗ＝Ａ／Ｔ）プライマー（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて作製して、全ての可能なアミノ酸を以下の位置に導入した：Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｋ３２２、Ｅ３８０、Ｌ４３２、Ｎ４３４及びＹ４３６（ＥＵナンバリング）。ｍＡｂ１骨格における３つの対照変異体の重鎖ＤＮＡ配列、ＡＡＡ（Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ）、ＬＳ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）及びＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）を、ＬａｋｅＰｈａｒｍａによるｐＢＨ６４１４ベクターに構築した。
【0251】
組み合わせ飽和ライブラリーを、ｍＡｂ１重鎖の部位特異的変異誘発によりＱ５変異誘発キット（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ）並びにＴ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｎ４３４Ｆ及びＮ４３４Ｙプライマーを用いてＷＴ及びＭ２５２ＹテンプレートをＰＣＲ反応で用いて得た。Ａｂ３骨格への変異組み込みを、Ｑ５変異誘発キット（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ）を使用してＭ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ、Ｔ３０７Ｑ及びＴ３０７Ｗプライマーを用いて行った。全てのＦｃ変異体の作製を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｉｎｃ．）により確認した。
【0252】
組み換え抗体発現及び精製：
条件培地スクリーニングのために、ｍＡｂ１の変異重鎖及び野生型軽鎖を含有するＤＮＡを、発現のためのＥｘｐｉ２９３哺乳動物細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍＬに製造者の指示書に従ってトランスフェクトした。細胞を３７℃、５％二酸化炭素及び湿度８０％で毎分９００回転（ＲＰＭ）で振盪しながら２ｍＬ ９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）において通気膜で密封してインキュベートした。条件培地をトランスフェクションの５日後に集め、そして使用するまで－８０℃で保存した。ｍＡｂ１及びＡｂ３骨格におけるリード変異体を、３０ｍＬスケールで０．２μｍ通気キャップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を備えた１２５ｍＬのフラスコで発現させた。１２５ｍＬ培養フラスコを発現期間全体の間１２５ＲＰＭで振盪した。条件培地をトランスフェクションの５日後に集め、そして０．２２μｍ、５０ｍＬコニカルフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に通して濾過し、そして４℃で精製まで保存した。
条件培地スクリーニングのために、ｍＡｂ１の変異重鎖及び野生型軽鎖を含有するＤＮＡを、発現のためのＥｘｐｉ２９３哺乳動物細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍＬに製造者の指示書に従ってトランスフェクトした。細胞を３７℃、５％二酸化炭素及び湿度８０％で毎分９００回転（ＲＰＭ）で振盪しながら２ｍＬ ９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）において通気膜で密封してインキュベートした。条件培地をトランスフェクションの５日後に集め、そして使用するまで－８０℃で保存した。ｍＡｂ１及びＡｂ３骨格におけるリード変異体を、３０ｍＬスケールで０．２μｍ通気キャップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を備えた１２５ｍＬのフラスコで発現させた。１２５ｍＬ培養フラスコを発現期間全体の間１２５ＲＰＭで振盪した。条件培地をトランスフェクションの５日後に集め、そして０．２２μｍ、５０ｍＬコニカルフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に通して濾過し、そして４℃で精製まで保存した。
【0253】
ｍＡｂ１及びＡｂ３の単離を、１ｍＬ ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。ＰＢＳ ｐＨ７．４の１０カラム体積での洗浄工程の後、抗体を０．１Ｍクエン酸ｐＨ３．０（Ｓｉｇｍａ）５カラム体積で溶出し、そして１Ｍ ｔｒｉｓ塩基ｐＨ９．０（Ｓｉｇｍａ）０．５ｍＬで中和した。溶出された抗体を、ＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換し、そして３０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎコンセントレーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してその後の試験のために＞１ｍｇ ｍＬ-1に濃縮した。精製した抗体の濃度を、２８０ｎｍでのそれらのＵＶ吸光度（ＵＶ280）から適切な吸光係数を用いて決定した。
【0254】
Ｏｃｔｅｔ条件培地スクリーニング及び分析：
ｍＡｂ１変異体を含有する条件培地のスクリーニングを、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサーを備えたＯｃｔｅｔ ＱＫ ３８４（ＰＡＬＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。Ｈｉｓタグ化抗原を１５μｇ ｍＬ-1で３００秒間ＰＢＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ） ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ－ＢＳＡ ７．４）中に捕捉し、続いて２０秒ＰＢＳＴ－ＢＳＡ ｐＨ７．４で洗浄した。ＰＢＳＴ－ＢＳＡ ｐＨ７．４を用いて１：１希釈した条件培地において２００秒間抗体を捕捉した。ｐＨ６．０緩衝液中での緩衝液洗浄工程の後に、ＦｃＲｎ結合カイネティクスを、２００ｎＭ ｒＦｃＲｎを使用して、ｐＨ６．０でのそれぞれ１５０秒２００秒の結合及び解離回数について得た。Ｏｃｔｅｔスクリーニングの間の全ての工程において、温度は３０℃であり、振盪速度は１０００ＲＰＭであった。ｒＦｃＲｎ結
合カイネティクスプロフィールを、ＦｃＲｎ結合フェーズの開始に対して補正し、Ｏｃｔｅｔ ７．１解析ソフトウェアを使用して１：１結合モデルにモデル化した。
ｍＡｂ１変異体を含有する条件培地のスクリーニングを、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサーを備えたＯｃｔｅｔ ＱＫ ３８４（ＰＡＬＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。Ｈｉｓタグ化抗原を１５μｇ ｍＬ-1で３００秒間ＰＢＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ） ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ－ＢＳＡ ７．４）中に捕捉し、続いて２０秒ＰＢＳＴ－ＢＳＡ ｐＨ７．４で洗浄した。ＰＢＳＴ－ＢＳＡ ｐＨ７．４を用いて１：１希釈した条件培地において２００秒間抗体を捕捉した。ｐＨ６．０緩衝液中での緩衝液洗浄工程の後に、ＦｃＲｎ結合カイネティクスを、２００ｎＭ ｒＦｃＲｎを使用して、ｐＨ６．０でのそれぞれ１５０秒２００秒の結合及び解離回数について得た。Ｏｃｔｅｔスクリーニングの間の全ての工程において、温度は３０℃であり、振盪速度は１０００ＲＰＭであった。ｒＦｃＲｎ結
合カイネティクスプロフィールを、ＦｃＲｎ結合フェーズの開始に対して補正し、Ｏｃｔｅｔ ７．１解析ソフトウェアを使用して１：１結合モデルにモデル化した。
【0255】
ＦｃＲｎ結合カイネティクス：
ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合カイネティクスを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＦｃＲｎの直接固定化又はビオチンＣＡＰｔｕｒｅキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかを用いて改変されたプロトコルを使用して測定した（例えば、Ａｂｄｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、ＭＡｂｓ （２０１５） ７：３３１－３４３；Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１６） ５０２：５３－６３を参照のこと）。直接固定化のために、ビオチン化ＦｃＲｎを、濃度２０μｇ ｍＬ-1で、１８０秒（ｓ）間１０μＬ 分-1で１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中にて、Ｃ１センサーチップの表面上約２０ＲＵにアミンカップリング化学（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介して固定化した。ビオチンＣＡＰｔｕｒｅキットを用いて、ＣＡＰｔｕｒｅ試薬をＣＡＰチップ表面上に結合ＲＵ ＞２，０００ ＲＵまで捕捉し、続いて、０．１μｇ ｍＬ-1 ＦｃＲｎを適切なチャネルにおいて２４ｓ ３０ｕＬ分-1で最終結合ＲＵ 約２ＲＵまで捕捉した。ＦｃＲｎ結合カイネティクス実験のためのランニングバッファは、０．０５％界面活性剤Ｐ－２０（ＰＢＳ－Ｐ＋、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含むＰＢＳ、ｐＨ６．０又は７．４であった。１０００ｎＭ抗体からの４倍段階希釈の一連の濃度を、０ｎＭ対照を含めて各変異体について四連で行った。動力学的測定を、それぞれ１８０及び３００秒の結合及び解離回数について流量１０μＬ 分-1で得た。Ｃ１及びＣＡＰセンサーチップを、それぞれ１０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて３０秒間５０μＬ 分-1で、又は６Ｍグアニジン塩酸塩、２５０ｍＭ水酸化ナトリウム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１２０ｓ ５０ｕＬ分-1を用いて再生し、続いてさらに６０～９０秒間ＰＢＳ－Ｐ＋ ｐＨ６．０中での安定化工程を行った。ｐＨ７．４定常状態ＲＵ測定を、全ての変異体について１０００ｎＭで三連で、ＦｃＲｎの捕捉レベルが両方の方法について１０倍～２０倍増加した事以外は、上記と同じＣ１又はＣＡＰセンサーチップ及び動力学的パラメーターを使用して得た。
ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合カイネティクスを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＦｃＲｎの直接固定化又はビオチンＣＡＰｔｕｒｅキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかを用いて改変されたプロトコルを使用して測定した（例えば、Ａｂｄｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、ＭＡｂｓ （２０１５） ７：３３１－３４３；Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１６） ５０２：５３－６３を参照のこと）。直接固定化のために、ビオチン化ＦｃＲｎを、濃度２０μｇ ｍＬ-1で、１８０秒（ｓ）間１０μＬ 分-1で１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中にて、Ｃ１センサーチップの表面上約２０ＲＵにアミンカップリング化学（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介して固定化した。ビオチンＣＡＰｔｕｒｅキットを用いて、ＣＡＰｔｕｒｅ試薬をＣＡＰチップ表面上に結合ＲＵ ＞２，０００ ＲＵまで捕捉し、続いて、０．１μｇ ｍＬ-1 ＦｃＲｎを適切なチャネルにおいて２４ｓ ３０ｕＬ分-1で最終結合ＲＵ 約２ＲＵまで捕捉した。ＦｃＲｎ結合カイネティクス実験のためのランニングバッファは、０．０５％界面活性剤Ｐ－２０（ＰＢＳ－Ｐ＋、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含むＰＢＳ、ｐＨ６．０又は７．４であった。１０００ｎＭ抗体からの４倍段階希釈の一連の濃度を、０ｎＭ対照を含めて各変異体について四連で行った。動力学的測定を、それぞれ１８０及び３００秒の結合及び解離回数について流量１０μＬ 分-1で得た。Ｃ１及びＣＡＰセンサーチップを、それぞれ１０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて３０秒間５０μＬ 分-1で、又は６Ｍグアニジン塩酸塩、２５０ｍＭ水酸化ナトリウム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１２０ｓ ５０ｕＬ分-1を用いて再生し、続いてさらに６０～９０秒間ＰＢＳ－Ｐ＋ ｐＨ６．０中での安定化工程を行った。ｐＨ７．４定常状態ＲＵ測定を、全ての変異体について１０００ｎＭで三連で、ＦｃＲｎの捕捉レベルが両方の方法について１０倍～２０倍増加した事以外は、上記と同じＣ１又はＣＡＰセンサーチップ及び動力学的パラメーターを使用して得た。
【0256】
ｐＨ６．０での濃度シリーズについての動力学的パラメーターを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して、アビディティ効果により二価モデルにフィッティングした。例えば、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０）１８４：１９６８－１９７６を参照のこと。各濃度シリーズを、独立してフィッティングして、平均結合及び解離速度並びに結合親和性を得た。見かけの結合親和性を二価モデルからの第一の結合及び解離速度から計算した。ｐＨ７．４での残留結合を、各抗体１０００ｎＭを応答比較と同時に三連で使用して測定した。各反復の定常状態応答を平均して、平均及び標準偏差を得た。
【0257】
ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー：
一実施態様において、ＦｃＲｎアフィニティーカラムを、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３、ｍＡｂｓ ５：５７６－５８６から適合されたプロトコルから作製した。１ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＰ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ；Ｓｉｇｍａ））を１ｍＬ分-1で５カラム体積用いて平衡化し、続いてビオチン化ｃｙｎｏＦｃＲｎを４ミリグラム注入した。カラムを結合緩衝液で洗浄し、使用するまで４℃で保存した。
一実施態様において、ＦｃＲｎアフィニティーカラムを、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３、ｍＡｂｓ ５：５７６－５８６から適合されたプロトコルから作製した。１ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＰ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ；Ｓｉｇｍａ））を１ｍＬ分-1で５カラム体積用いて平衡化し、続いてビオチン化ｃｙｎｏＦｃＲｎを４ミリグラム注入した。カラムを結合緩衝液で洗浄し、使用するまで４℃で保存した。
【0258】
ＦｃＲｎアフィニティカラムを、低ｐＨ緩衝液（２０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ；Ｓｉｇｍａ）ｐＨ５．５；１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）を５カラ
ム体積用いて平衡化した後、各抗体３００μｇを注入した。抗体溶液のｐＨを、低ｐＨ緩衝液を用いてｐＨ５．５に調整した。低ｐＨ緩衝液で１０カラム体積洗浄した後、抗体を高ｐＨ緩衝液（２０ｍＭ １，３－ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビストリスプロパン；Ｓｉｇｍａ） ｐＨ９．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）との線形ｐＨグラジエントにより３０カラム体積にわたって１ｍＬ分-1で１ｍＬフラクションで溶出し、そしてＵＶ280でモニタリングした。ＦｃＲｎアフィニティカラムを、その後
の１０カラム体積の低ｐＨ緩衝液でその後の実行のために又は結合緩衝液で貯蔵のために再平衡化した。全ての改変体を三連で行った。
ム体積用いて平衡化した後、各抗体３００μｇを注入した。抗体溶液のｐＨを、低ｐＨ緩衝液を用いてｐＨ５．５に調整した。低ｐＨ緩衝液で１０カラム体積洗浄した後、抗体を高ｐＨ緩衝液（２０ｍＭ １，３－ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビストリスプロパン；Ｓｉｇｍａ） ｐＨ９．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）との線形ｐＨグラジエントにより３０カラム体積にわたって１ｍＬ分-1で１ｍＬフラクションで溶出し、そしてＵＶ280でモニタリングした。ＦｃＲｎアフィニティカラムを、その後
の１０カラム体積の低ｐＨ緩衝液でその後の実行のために又は結合緩衝液で貯蔵のために再平衡化した。全ての改変体を三連で行った。
【0259】
各変異体についてのＦｃＲｎアフィニティカラム溶出プロフィールを、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ １１（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）で等式１を使用して単一ガウシアン分布にモデル化し、ＵＶ280極大での溶出体積を決定した。
ここでｘ0はＵＶ280ピーク極大での溶出体積であり、ｙ0はベースラインＵＶ280吸光度であり、そしてａ及びｂは分布の半値全幅に関連する。各フラクションのｐＨをＣｏｒｎｉｎｇ Ｐｉｎｎａｃｌｅ ５４０ ｐＨメーターにより測定し、そして線形回帰を使用して溶出体積に対して補正した。
【数2】
【0260】
別の実験において、ＦｃＲｎアフィニティカラムを、１ｍＬストレプトアビジンＨＰ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でビオチン化ｈＦｃＲｎを用いてＳｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３、ｍＡｂｓ ５：５７６－５８６から適合させた。このカラムに、低ｐＨ緩衝液（２０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ；Ｓｉｇｍａ）ｐＨ５．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の各抗体３００ｕｇをＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＫＴＡ）で注入した。低及び高ｐＨ緩衝液（２０ｍＭ １，３－ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビストリスプロパン；Ｓｉｇｍａ） ｐＨ９．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて生成された線形ｐＨグラジエントにより３０カラム体積にわたって０．５ｍＬ分-1で、吸光度及びｐＨをモニタリングして抗体を溶出した。その後の実行のためにカラムを低ｐＨ緩衝液で再平衡化した。全ての変異体を三連で行った。ＦｃＲｎアフィニティーカラム溶出プロフィールを、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ １１ （Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）で単一ガウシアン分布にフィッティングして、ＵＶ280極大からの溶出体積ｐＨを決定した
。
。
【0261】
示差走査蛍光定量法：
示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）実験を、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６実時間系サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）で２０μＬ反応で行った。抗体サンプル及びＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の５０００ｘストックをＰＢＳ ｐＨ７．４でそれぞれ０．４ｍｇ ｍＬ-1及び１０ｘに希釈した。抗体及びＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅを１：１比で９６ウェルＰＣＲプレートにて混合し、そして接着性ｍｉｃｒｏｓｅａｌ（ＢｉｏＲａｄ）で密封して、各抗体の最終濃度を０．２ｍｇ ｍＬ-1及び５ｘ Ｓｙｐｒｏ
Ｏｒａｎｇｅ色素にした。全ての抗体変異体を三連で行った。サーマルサイクラープログラムは、２０℃での２分の平衡化工程、続いて一定一定の温度勾配０．５℃／５秒で最終温度１００℃からなるものであった。各ウェルの蛍光測定を、Ｓｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅ蛍光に適したＦＡＭ励起波長（４８５ｎｍ）及びＲＯＸ発光（６２５ｎｍ）検出器を使用して得た（例えば、Ｂｉｇｇａｒ ｅｔ ａｌ．２０１２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５３：２３１－２３８を参照のこと）。ＤＳＦ蛍光強度プロフィール及び一次導関数をＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒからエクスポートし、そしてＳｉｇｍａｐｌｏ
ｔ １１で解析した。Ｔmは蛍光強度プロフィールにおける第一の遷移の中点として定義
された。
示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）実験を、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６実時間系サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）で２０μＬ反応で行った。抗体サンプル及びＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の５０００ｘストックをＰＢＳ ｐＨ７．４でそれぞれ０．４ｍｇ ｍＬ-1及び１０ｘに希釈した。抗体及びＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅを１：１比で９６ウェルＰＣＲプレートにて混合し、そして接着性ｍｉｃｒｏｓｅａｌ（ＢｉｏＲａｄ）で密封して、各抗体の最終濃度を０．２ｍｇ ｍＬ-1及び５ｘ Ｓｙｐｒｏ
Ｏｒａｎｇｅ色素にした。全ての抗体変異体を三連で行った。サーマルサイクラープログラムは、２０℃での２分の平衡化工程、続いて一定一定の温度勾配０．５℃／５秒で最終温度１００℃からなるものであった。各ウェルの蛍光測定を、Ｓｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅ蛍光に適したＦＡＭ励起波長（４８５ｎｍ）及びＲＯＸ発光（６２５ｎｍ）検出器を使用して得た（例えば、Ｂｉｇｇａｒ ｅｔ ａｌ．２０１２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５３：２３１－２３８を参照のこと）。ＤＳＦ蛍光強度プロフィール及び一次導関数をＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒからエクスポートし、そしてＳｉｇｍａｐｌｏ
ｔ １１で解析した。Ｔmは蛍光強度プロフィールにおける第一の遷移の中点として定義
された。
【0262】
ＦｃγＲＩＩＩａ結合カイネティクス：
結合カイネティクス及び親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定した（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９９：６５２－６６５）。アセテートｐＨ４．５中５０μｇ ｍＬ-1の抗ＨＰＣ４抗体（Ｒｏｃｈｅ）を、ＣＭ５センサーチップの表面に６００秒間 １０μｌ分-1でアミン化学を用いてカップリングして最終密度＞２０，０００ＲＵとした。ＦｃγＲＩＩＩａ結合カイネティクス実験のためのランニングバッファは、０．０５％界面活性剤Ｐ－２０（ＨＢＳ－Ｐ＋、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び２ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ2、Ｆｌｕｋａ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝化食塩水ｐＨ７．４であった。各速
度論的追跡を、１．２５μｇ ｍＬ-1 ＨＰＣ４タグ化ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ１５８の捕捉から３０秒間５μｌ分-1で開始した。各変異体３００ｎＭでの結合及び解離カイネティクスを、各変異体について１２０～１８０秒間各工程について５μｌ分－１で測定した。動力学的測定が完了すると、ＣＭ５チップを、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を追加したＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液で再生した。次の動力学的測定の前に、ＣＭ５チップを１２０秒間ＣａＣｌ2を含むＨＢＳ－Ｐ＋で洗浄した。
結合カイネティクス及び親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定した（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９９：６５２－６６５）。アセテートｐＨ４．５中５０μｇ ｍＬ-1の抗ＨＰＣ４抗体（Ｒｏｃｈｅ）を、ＣＭ５センサーチップの表面に６００秒間 １０μｌ分-1でアミン化学を用いてカップリングして最終密度＞２０，０００ＲＵとした。ＦｃγＲＩＩＩａ結合カイネティクス実験のためのランニングバッファは、０．０５％界面活性剤Ｐ－２０（ＨＢＳ－Ｐ＋、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び２ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ2、Ｆｌｕｋａ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝化食塩水ｐＨ７．４であった。各速
度論的追跡を、１．２５μｇ ｍＬ-1 ＨＰＣ４タグ化ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ１５８の捕捉から３０秒間５μｌ分-1で開始した。各変異体３００ｎＭでの結合及び解離カイネティクスを、各変異体について１２０～１８０秒間各工程について５μｌ分－１で測定した。動力学的測定が完了すると、ＣＭ５チップを、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を追加したＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液で再生した。次の動力学的測定の前に、ＣＭ５チップを１２０秒間ＣａＣｌ2を含むＨＢＳ－Ｐ＋で洗浄した。
【0263】
一実験において、ＦｃγＲＩＩＩａ動力学的実験を、ＦｃＲｎ結合について記載した方法と同様の方法でｐＨ７．４で分析した。ＷＴ、ベンチマーク、リード単一及び組み合わせ変異体について、１０００ｎＭからの一連の３倍段階希釈でカイネティクスを得て、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性を決定した。各濃度及び反復での定常状態ＲＵを決定し、抗体濃度の関数としてプロットし、そして等式２に示されるように定常状態モデルに対してフィッティングした。
ここでオフセットは０ｎＭ抗体でのベースラインＲＵであり、Ｒmaxは高抗体濃度でのプ
ラトーＲＵであり、［抗体］は抗体の濃度であり、そしてＫD,appは変異体とＦｃγＲＩ
ＩＩａとの間の相互作用の見かけの結合親和性である。
【数3】
ラトーＲＵであり、［抗体］は抗体の濃度であり、そしてＫD,appは変異体とＦｃγＲＩ
ＩＩａとの間の相互作用の見かけの結合親和性である。
【0264】
別の実験において、ＦｃγＲＩＩＩａ速度実験を、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合について記載される方法と同様の方法で平均定常状態結合応答を使用して分析した。全ての変異体について、３００ｎＭ抗体の定常状態ＲＵを三連で決定して平均した。ＷＴと比較した応答変化の倍率変化（応答倍率変化）を、各骨格における変異体間の比較のために決定した。
【0265】
等電点電気泳動
リード変異体の等電点（ｐＩ）を、Ｍａｕｒｉｃｅ Ｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）でのキャピラリー電気泳動を使用して決定した。各２００μＬサンプルは、０．３５％メチルセルロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）、４％ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ３－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１０ｍＭアルギニン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）、０．２ｍｇ ｍＬ-1抗体並びに４．０５及び９．９９ ｐＩマーカー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を含有していた。サンプルをキャピラリー中に１分間１５００Ｖでロードし、続いて６分間３０００Ｖの分離フェーズ、そしてトリプトファン蛍光を使用してモニタリングした。各変異体についてｐＩをＭａｕｒｉｃｅ Ｃソフトウェアを使用して決定し、そして主要な種についての蛍光極大におけるｐＨと定義した。
リード変異体の等電点（ｐＩ）を、Ｍａｕｒｉｃｅ Ｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）でのキャピラリー電気泳動を使用して決定した。各２００μＬサンプルは、０．３５％メチルセルロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）、４％ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ３－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１０ｍＭアルギニン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）、０．２ｍｇ ｍＬ-1抗体並びに４．０５及び９．９９ ｐＩマーカー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を含有していた。サンプルをキャピラリー中に１分間１５００Ｖでロードし、続いて６分間３０００Ｖの分離フェーズ、そしてトリプトファン蛍光を使用してモニタリングした。各変異体についてｐＩをＭａｕｒｉｃｅ Ｃソフトウェアを使用して決定し、そして主要な種についての蛍光極大におけるｐＨと定義した。
【0266】
均一ブリッジングリウマトイド因子（ＲＦ）ＥＬＩＳＡ
抗体をビオチン化し、そしてＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ及びＭｉｘ－ｎ－ＳｔａｉｎTMジゴキシゲニン抗体標識キット（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を使用して製造者の指示書に従ってジゴキシゲン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎ）標識した。ビオチン化されかつジゴキシゲニン標識された抗体４μｇ ｍＬ-1を含有するストック溶液を各変異体について製造し、そして１：１の比で３００Ｕ／ｍＬ ＲＦ（Ａｂｃａｍ）と混合した。室温で２０時間インキュベートした後、各抗体－ＲＦ混合物１００μＬをＳｔｒｅｐｔａｗｅｌｌプレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に加え、そして室温で２時間インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ ｐＨ７．４で３回プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合抗ジゴキシゲニン二次抗体（Ａｂｃａｍ）の１：２０００希釈１００μＬを各ウェルに加えた。２時間室温でインキュベートした後、ウェルを洗浄し、そしてＴＭＢ基質（Ａｂｃａｍ）１００μＬで１５分間室温にて処理した。停止溶液（Ａｂｃａｍ）１００μＬを用いて反応を停止させ、そして吸光度を４５０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー測定した。抗体－ＲＦ混合物を含まないウェルはブランク減算を提供し、そして実験を３回繰り返した。Ｐ値をスチューデントｔ検定を使用して決定した。
抗体をビオチン化し、そしてＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ及びＭｉｘ－ｎ－ＳｔａｉｎTMジゴキシゲニン抗体標識キット（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を使用して製造者の指示書に従ってジゴキシゲン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎ）標識した。ビオチン化されかつジゴキシゲニン標識された抗体４μｇ ｍＬ-1を含有するストック溶液を各変異体について製造し、そして１：１の比で３００Ｕ／ｍＬ ＲＦ（Ａｂｃａｍ）と混合した。室温で２０時間インキュベートした後、各抗体－ＲＦ混合物１００μＬをＳｔｒｅｐｔａｗｅｌｌプレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に加え、そして室温で２時間インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ ｐＨ７．４で３回プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合抗ジゴキシゲニン二次抗体（Ａｂｃａｍ）の１：２０００希釈１００μＬを各ウェルに加えた。２時間室温でインキュベートした後、ウェルを洗浄し、そしてＴＭＢ基質（Ａｂｃａｍ）１００μＬで１５分間室温にて処理した。停止溶液（Ａｂｃａｍ）１００μＬを用いて反応を停止させ、そして吸光度を４５０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー測定した。抗体－ＲＦ混合物を含まないウェルはブランク減算を提供し、そして実験を３回繰り返した。Ｐ値をスチューデントｔ検定を使用して決定した。
【0267】
インビボ薬物動態
薬物動態研究をカニクイザル及びｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（Ｔｇ３２系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）で行なった。サル研究において、ｍＡｂ２骨格におけるＷＴ、ＬＳ、ＤＱ、ＤＷ及びＹＤ変異体を単一静脈内用量２．５ｍｇ／ｋｇとして腕頭静脈中に用量１．５ｍＬ／ｋｇで、３匹の未処置の雄性カニクイザルに投与した。血液サンプル（０．５ｍＬ）を伏在静脈の静脈穿刺により投薬の：０．００３５、０．１７、１、３、７、１４、２１及び２８日後に８回サンプリングして集めた。集めたら、血液サンプルを４℃で１０分間１５００ｇで遠心分離し、そして－８０℃で保存した。
薬物動態研究をカニクイザル及びｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（Ｔｇ３２系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）で行なった。サル研究において、ｍＡｂ２骨格におけるＷＴ、ＬＳ、ＤＱ、ＤＷ及びＹＤ変異体を単一静脈内用量２．５ｍｇ／ｋｇとして腕頭静脈中に用量１．５ｍＬ／ｋｇで、３匹の未処置の雄性カニクイザルに投与した。血液サンプル（０．５ｍＬ）を伏在静脈の静脈穿刺により投薬の：０．００３５、０．１７、１、３、７、１４、２１及び２８日後に８回サンプリングして集めた。集めたら、血液サンプルを４℃で１０分間１５００ｇで遠心分離し、そして－８０℃で保存した。
【0268】
ｈＦｃＲｎマウスにおいて、抗体変異体を、単回静脈内用量２．５ｍｇ／ｋｇとして尾静脈中に用量体積５ｍｌ／ｋｇで投与した。各時点において、血液２０μｌを伏在静脈から充填済みヘパリンキャピラリーを使用して集めた。集めた血液サンプルをマイクロチューブに移し、そして１５００ｇで１０分間４℃にて遠心分離した。血漿サンプルを集め、各時点についてプールし（６マウス／サンプル）、そして分析前に－８０℃で保存した。
【0269】
全てのインビボ研究は、Ｓａｎｏｆｉ研究機関動物管理基本方針を遵守して行われた。サル及びマウス研究は、仏国「Ｍｉｎｉｓｔeｒｅ ｄｅ ｌ’Ｅｎｓｅｉｇｎｅｍｅｎ
ｔ Ｓｕｐｅｒｉｅｕｒ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ」及び独国「Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｅｓｉｄｉｕｍ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ」により承認された。
各時点での各ｍＡｂ２変異体の濃度を、ボトムアップ（ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイにより決定した。血漿アリコートの沈殿後に、血漿ペレットをタンパク質変性、還元、アルキル化、トリプシン消化及び固相抽出にかけた後に代替ペプチドを分析した。較正標準を、ｍＡｂ２変異体を血漿中に１．００、２．００、５．００、１０．０、２０．０、５０．０、１００、２００及び４００μｇ ｍＬ-1で添加することにより調製した。ペプチド分離を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで逆相ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１ｘ１５０ｍｍ、３．５μＭ、３００Å、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて流量３００μＬ分-1で水中０．１％ギ酸及びアセトニトリル中０．１％ギ酸の段階的グラジエントで行った。検出のために、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ５５００質量分析計をポジティブイオンモードでソース温度７００℃、イオンスプレー電圧５５００Ｖ、カーテン及びネブライザーガス４０及びコリジョンガスｍｉｄで使用した。データ取り込み時間（ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅｓ）は２０ｍｓであり、そしてエントランス電位は各トランジションについて１０Ｖであった。ｍＡｂ２骨格の２つの独特の代替ペプチドについ
ての複数の反応モニタリングトランジションを、標準及び対照と比較してＡｎａｌｙｓｔソフトウェアのＭＱＩＩＩ統合アルゴリズムからのピーク面積を使用して濃度決定に使用して。クリアランス速度及び血清半減期を、Ｐｈｏｅｎｉｘソフトウェア（Ｃｅｒｔａｒａ）を使用して時間の関数としての抗体濃度の非コンパートメントモデルから得た。いずれの理論にも束縛されないが、標的媒介薬物動態（ｔａｒｇｅｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＴＭＤＤ）及び／又は抗薬物抗体（ＡＤＡ）干渉が推測されるため、濃度の急な減少を示す全ての時点を平均血漿濃度から除外した。
ｔ Ｓｕｐｅｒｉｅｕｒ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ」及び独国「Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｅｓｉｄｉｕｍ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ」により承認された。
各時点での各ｍＡｂ２変異体の濃度を、ボトムアップ（ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイにより決定した。血漿アリコートの沈殿後に、血漿ペレットをタンパク質変性、還元、アルキル化、トリプシン消化及び固相抽出にかけた後に代替ペプチドを分析した。較正標準を、ｍＡｂ２変異体を血漿中に１．００、２．００、５．００、１０．０、２０．０、５０．０、１００、２００及び４００μｇ ｍＬ-1で添加することにより調製した。ペプチド分離を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで逆相ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１ｘ１５０ｍｍ、３．５μＭ、３００Å、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて流量３００μＬ分-1で水中０．１％ギ酸及びアセトニトリル中０．１％ギ酸の段階的グラジエントで行った。検出のために、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ５５００質量分析計をポジティブイオンモードでソース温度７００℃、イオンスプレー電圧５５００Ｖ、カーテン及びネブライザーガス４０及びコリジョンガスｍｉｄで使用した。データ取り込み時間（ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅｓ）は２０ｍｓであり、そしてエントランス電位は各トランジションについて１０Ｖであった。ｍＡｂ２骨格の２つの独特の代替ペプチドについ
ての複数の反応モニタリングトランジションを、標準及び対照と比較してＡｎａｌｙｓｔソフトウェアのＭＱＩＩＩ統合アルゴリズムからのピーク面積を使用して濃度決定に使用して。クリアランス速度及び血清半減期を、Ｐｈｏｅｎｉｘソフトウェア（Ｃｅｒｔａｒａ）を使用して時間の関数としての抗体濃度の非コンパートメントモデルから得た。いずれの理論にも束縛されないが、標的媒介薬物動態（ｔａｒｇｅｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＴＭＤＤ）及び／又は抗薬物抗体（ＡＤＡ）干渉が推測されるため、濃度の急な減少を示す全ての時点を平均血漿濃度から除外した。
【0270】
実施例２：条件培地における飽和点変異のＯｃｔｅｔスクリーニング
ＦｃＲｎは、Ｆｃ受容体の大部分に共通している、ＭＨＣクラス－Ｉ様α－ドメイン及びβ２－マクログロブリン（β２－ｍ）サブユニットのヘテロダイマー（図１Ａ）であり、そして抗体Ｆｃ重鎖上の領域は、他のＦｃγＲと明らかに異なる（例えば、Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：７８１２－７８２４；及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．２００１前出を参照のこと）。
ＦｃＲｎは、Ｆｃ受容体の大部分に共通している、ＭＨＣクラス－Ｉ様α－ドメイン及びβ２－マクログロブリン（β２－ｍ）サブユニットのヘテロダイマー（図１Ａ）であり、そして抗体Ｆｃ重鎖上の領域は、他のＦｃγＲと明らかに異なる（例えば、Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：７８１２－７８２４；及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．２００１前出を参照のこと）。
【0271】
ＷＴ抗体より遅いＦｃＲｎ解離速度を有する変異体を同定するために、バイオレイヤー干渉法（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（ＢＬＩ）ベースのアッセイを、条件培地中の抗体変異体をハイスループット様式でスクリーニングするために設計した（図２Ａ）。このアッセイは、ＷＴ抗体と比較して、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対する親和性を増強する（ＡＡＡ、ＬＳ及びＹＴＥ）か又は減少する（Ｈ４３５Ａ、Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ）いくつかのベンチマーク変異体を使用して開発された。ＮｉＮＴＡバイオセンサーはｈｉｓタグ化抗原を捕捉し、続いて各抗体変異体をｐＨ７．４で捕捉して条件培地を模倣する（図２Ａ）。約２５倍遅いヒトＩｇＧ１からの解離速度を有し、そしてヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）よりもＯｃｔｅｔ研究に適しているラットＦｃＲｎ（ｒＦｃＲｎ）へのｐＨ６．０でに結合カイネティクスを、６つの変異体の各々について測定した（図２Ｂ）。Ｈ４３５Ａ（図２Ｂ、長い一点鎖線）及びＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ（図２Ｂ、長い二点鎖線）変異体は、ＦｃＲｎ結合カイネティクスをほとんど示さないか又は全く示さなかった（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら２００１年、前出；Ｍｅｄｅｓａｎら、１９９７年、前出；及びＲａｇｈａｖａｎら、１９９５年、前出も参照のこと）。ＡＡＡ（図２Ｂ、短い破線）、ＬＳ（図２Ｂ、短い一点鎖線）及びＹＴＥ（図２Ｂ、長い破線）変異体は全て、ＷＴ（図２Ｂ、実線）と比較してより遅い解離速度を示し、２～７．３分の１の間のＦｃＲｎ解離速度に減少した。これは、Ｏｃｔｅｔスクリーニングが、摂動を受けたｒＦｃＲｎ解離カイネティクスを有する変異体を区別するために適しているということを実証した。
【0272】
ＩｇＧ１抗体、ｍＡｂ１は、減少したＦｃＲｎ解離速度を有する変異体をスクリーニングするための飽和変異誘発ライブラリーを作製するためのモデル系として役立った。ｍＡｂ１のＦｃ領域の１１の位置を、それらのＦｃＲｎ境界部に近いこと又は直接的寄与に基づいて選択した（図１Ａ及び１Ｂ）（例えば、Ｏｇａｎｅｓｙａｎら、２０１４年、前出；及びＳｈｉｅｌｄｓら２００１年、前出）。これらの位置での全ての点変異は、部位特異的変異誘発を使用して構築され、そして発現のためにＥｘｐｉ２９３細胞でトランスフェクトされた。条件培地スクリーニングを、飽和ライブラリー変異体のために上記のように行った。変異体のサブセットについての正規化されたＦｃＲｎ結合Ｏｃｔｅｔセンサーグラムを図２Ｃ（長い破線）に野生型（図２Ｃ、太い長い破線）及び偽のネガティブコントロール（図２Ｃ、点線）とともに示す。偽物は観察可能なＦｃＲｎ結合を示さなかった。速度プロフィールにおいてシグナル変化をほとんど示さないか又は全く示さなかったので、いくつかの変異体はｒＦｃＲｎの結合を明らかに破壊していた（図２Ｃ、長い破線、点線下に位置する（偽））。改善されたＦｃＲｎ解離速度を有する変異体についてのカットオフを、ＷＴ抗体の平均よりも低い３つの標準偏差として定義した。図２Ｃに示される変異のサブセットにおいて、２つ（図２Ｃ、実線）は野生型抗体と比較して解離速度を有
意に減少した（図２Ｃ、太い長い破線）が、残りの変異体は、同様の（図２Ｃ、短い一点鎖線）又はより速い（図２Ｃ、点線上の長い破線（偽））ｒＦｃＲｎ解離速度を有していた。
意に減少した（図２Ｃ、太い長い破線）が、残りの変異体は、同様の（図２Ｃ、短い一点鎖線）又はより速い（図２Ｃ、点線上の長い破線（偽））ｒＦｃＲｎ解離速度を有していた。
【0273】
単一点変異の全てについてのｒＦｃＲｎ解離速度を図２Ｄ及び図１４に点及び変異ごとに示す。図１４において、データは野生型と比較したｒＦｃＲｎ解離速度の倍数変化に依存して４つのカテゴリーのうちの１つに分類され、そして野生型種は黒い四角で示される。
【0274】
図１４において、飽和ライブラリーの１１の位置における全ての可能な置換についてｒＦｃＲｎ解離速度の倍率変化を、ＷＴ抗体の平均に対して正規化し、そしてカラーコード化した。全ての変異体は４つのカテゴリーのうちの１つに分類される：結合ほとんど無しから全く無し（暗い灰色）、より速いｒＦｃＲｎ解離速度（灰色）、ＷＴ様ｒＦｃＲｎ解離速度（水平線）及びより遅いｒＦｃＲｎ解離速度（グリッド）。複数の変異体が、ＷＴ抗体よりも遅いｒＦｃＲｎ解離速度を有していた（グリッド）。
【0275】
図１４において暗い灰色の変異体は、偽物と同様の様式でｒＦｃＲｎへの結合をほとんど示さないか又はは全く示さず（図２Ｃ、点線）、そしてＭ２５２、Ｉ２５３及びＳ２５４ループに局在していた。Ｉ２５３での唯一の変異はメチオニン及びバリンであり、そして両方ともｒＦｃＲｎ解離速度を有意に増加させ、さらにＦｃＲｎ相互作用に対するＩ２５３の重要性を支持する。別の１２０の変異体（図２Ｄ及び図１４、明るい灰色四角）は、各ＣH２及びＣH３ドメインに位置するｒＦｃＲｎと相互作用を約５０％不安定化した。２５の変異体はＷＴ様解離速度を有しており（図２Ｄ及び図１４、白色四角）。１１の位置のうちの８つは、少なくとも１つのＷＴ様変異を有している（図１４、白色四角）。以下の変異は、野生型と比較して有意に減少したｒＦｃＲｎ解離速度を有していた（図２Ｄ及び図１４、黒色四角）：Ｍ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ／Ｅ、Ｋ２８８Ｄ／Ｎ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｍ／Ｑ／Ｗ、Ｅ３８０Ｃ、Ｎ４３４Ｆ／Ｐ／Ｙ及びＹ４３６Ｈ／Ｎ／Ｗ。Ｍ２５２Ｙ、Ｎ４３４Ｆ及びＮ４３４Ｙ変異は、ＷＴ抗体の２分の１の速度より大きい解離速度を有していた（図２Ｄ）。これらの変異を発現させ、そしてさらなるインビトロＦｃＲｎ速度特徴づけのためにプロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。
【0276】
実施例３：ｐＨ６．０でのＢｉａｃｏｒｅ ＦｃＲｎ結合カイネティクス
ＡＡＡ、ＬＳ及びＹＴＥ変異体は、Ｂｉａｃｏｒｅを使用したＦｃＲｎ結合カイネティクス測定においてヒト及びラットＦｃＲｎに対するｐＨ６．０でのポジティブコントロールとして役立つ。ＦｃＲｎへの濃度依存性結合が、野生型、ベンチマーク（図３）及びリード（図４Ａ及び４Ｂ）を含む全ての変異体について観察され、そしてヒト及びラットＦｃＲｎの単回注射の結合プロフィールをそれぞれ図５Ａ及び５Ｂに示す。野生型抗体は、ヒト及びラットＦｃＲｎについてそれぞれ２３８０±４７０ｎＭ及び２０７±４３ｎＭ親和性の結合親和性を有していた（表１）。
ＡＡＡ、ＬＳ及びＹＴＥ変異体は、Ｂｉａｃｏｒｅを使用したＦｃＲｎ結合カイネティクス測定においてヒト及びラットＦｃＲｎに対するｐＨ６．０でのポジティブコントロールとして役立つ。ＦｃＲｎへの濃度依存性結合が、野生型、ベンチマーク（図３）及びリード（図４Ａ及び４Ｂ）を含む全ての変異体について観察され、そしてヒト及びラットＦｃＲｎの単回注射の結合プロフィールをそれぞれ図５Ａ及び５Ｂに示す。野生型抗体は、ヒト及びラットＦｃＲｎについてそれぞれ２３８０±４７０ｎＭ及び２０７±４３ｎＭ親和性の結合親和性を有していた（表１）。
【0277】
【表1】
【表2】
【0278】
表１に示される全てのデータは、各列の上部に示される実験技術を使用して得られた。
【0279】
精製されたタンパク質を使用したＯｃｔｅｔによるｒＦｃＲｎ解離速度は、条件培地におけるスクリーニングから得られた速度定数と比較して測定された。溶出ｐＨを、ＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィーにより三連で（ｎ＝３）決定し、そしてＤＳＦは三連で熱安定性を調査した（ｎ＝３）。ヒト及びラットＦｃＲｎに対するＦｃＲｎ結合カイネティクスを、Ｂｉａｃｏｒｅから一連の抗体濃度を用いて二連で（ｎ＝２）得て、独立してフィッティングした。各変異体についてのヒト及びラットＦｃＲｎとのｐＨ７．４での定常状態結合応答（ＲＵ）を、１０００ｎＭ抗体を用いて三連で（ｎ＝３）Ｂｉａｃｏｒｅを使用して測定した。各測定についての単位は以下のとおりである：Ｏｃｔｅｔ ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎ解離速度（ｘ１０-3秒-1）；溶出ｐＨ（無単位）；ＤＳＦ Ｔm（℃
）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０ ｈＦｃＲｎ結合速度（ｘ１０4Ｍ-1秒-1）、解離速度
（ｘ１０-1秒-1）及びＫD,app（ｘ１０9Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎ結合速度（ｘ１０4Ｍ-1秒-1）、解離速度（ｘ１０-3秒-1）及びＫD,app （ｘ１０9Ｍ）；並びにＢｉａｃｏｒｅ ｐＨ７．４定常状態結合応答（ＲＵ）。
）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０ ｈＦｃＲｎ結合速度（ｘ１０4Ｍ-1秒-1）、解離速度
（ｘ１０-1秒-1）及びＫD,app（ｘ１０9Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎ結合速度（ｘ１０4Ｍ-1秒-1）、解離速度（ｘ１０-3秒-1）及びＫD,app （ｘ１０9Ｍ）；並びにＢｉａｃｏｒｅ ｐＨ７．４定常状態結合応答（ＲＵ）。
【0280】
図５Ｂにおいて、ＡＡＡ（点線）、ＬＳ（二点鎖線）及びＹＴＥ（一点鎖線）変異体は、ＷＴと比較して１．６倍と１０．４倍との間増強された結合親和性を有していた。ｈＦｃＲｎに対して最も緊密な親和性を有していたが、ｒＦｃＲｎはＹＴＥについてより緊密な親和性を有していたので、最も緊密なＦｃＲｎ親和性を有するベンチマーク変異体のアイデンティテイは種特異的であった（表２Ａ）。
【0281】
【表3】
【表4】
【0282】
ヒト及びラットＦｃＲｎの両方についてのリード変異体の大部分（図５Ａ及び５Ｂ、様々な色調の実線）は、ＷＴ又はベンチマーク変異体よりも有意に遅い結合速度を有していた（＜２分の１）（表１）。ＦｃＲｎの両方の種について増強された結合速度を示したのはＮ４３４Ｆ及びＮ４３４Ｙ変異のみであった。理論に束縛されることなく、ｈＦｃＲｎとのより遅い結合カイネティクスの結果として、リード変異体のみかけの結合親和性は、ｒＦｃＲｎと違って一般的にＷＴより弱い（図５Ｃ及び５Ｄ、表１）。ｒＦｃＲｎについての親和性はＹＴＥより弱い（図５Ｄ、左下への対角線、表２Ａ）。いずれの理論に束縛されることなく、これらの結果は、単一の変異はＬＳ及びＹＴＥ変異体を上回るように親和性を増強するために十分でなかったということを示した。ＦｃＲｎ解離速度の順位付け（ｈＦｃＲｎに対する変異体の弱い結合親和性に起因する）は、ヒト及びラットＦｃＲｎに対する減少した解離速度を有するサブセットを明らかにした：Ｍ２５２Ｙ、Ｎ４３４Ｆ／Ｐ／Ｙ、Ｔ２５６Ｄ／Ｅ及びＴ３０７Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｗ（表２Ａ）。これらの変異体は、ベンチマーク変異体を上回るＦｃ領域のＦｃＲｎ結合能をさらに改善するために組み合わせてさらに興味が持たれる。
【0283】
リード変異体についてのインビトロ特徴づけパラメーターを表２Ｂに示す。
【0284】
【表5】
【0285】
表２Ｂにおいて、全てのデータは、各列の上部の実験技術を使用して得られた。ＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィー、ＤＳＦ及びＦｃγＲＩＩＩａ結合は三連で行った（ｎ＝３）。ヒト及びラットＦｃＲｎに対するＦｃＲｎ結合カイネティクスを四連で得、そして独立してフィッティングした。単位：ＤＳＦ Ｔm （℃）；ＦｃγＲＩＩＩａ結合
（ＷＴと比べた倍率変化）、Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０ ｈＦｃＲｎ結合速度（ｘ１０4Ｍ-1秒-1）、解離速度（ｘ１０-1秒-1）及びＫD,app（ｘ１０9Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ
ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎ ＫD,app （ｘ１０9Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ７．４ ｈＦ
ｃＲｎ及びｒＦｃＲｎ定常状態ＲＵ（ＲＵ）。
（ＷＴと比べた倍率変化）、Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０ ｈＦｃＲｎ結合速度（ｘ１０4Ｍ-1秒-1）、解離速度（ｘ１０-1秒-1）及びＫD,app（ｘ１０9Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ
ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎ ＫD,app （ｘ１０9Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ７．４ ｈＦ
ｃＲｎ及びｒＦｃＲｎ定常状態ＲＵ（ＲＵ）。
【0286】
実施例４：組み合わせ変異体はＦｃＲｎ結合解離速度をさらに減少させる
Ｔ３０７及びＮ４３４にように、複数のリード変異が単一の位置に位置しており（図１４黒い四角）、ここでより遅いＦｃＲｎ解離カイネティクスを示したそれぞれ６つ及び３つの変異が同定された。これらの位置においてｈＦｃＲｎに対する最も遅いＦｃＲｎ解離速度を有する変異のみを組み合わせ変異体の作製に使用した。この場合、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｎ４３４Ｆ及びＮ４３４Ｙは、二重、三重及び四重変異体を得るためにＭ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ及びＴ２５６Ｅと混合プライマーＰＣＲ及び部位特異的変異誘発を使用して混合された。合計で、組み合わせライブラリーは、７つのリード単一、１８の二重、２０の三重、８つの四重変異体及びＷＴ抗体を含む５４の変異体からなっていた。これらの変異体の命名は以下のとおりである：野生型バックグラウンドは、Ｍ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７及びＮ４３４を含み、そしてＭＴＴＮとして再分類される。そのため、三重変異体ＹＴＱＹは、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ｙ変異を含有するが、位置２５６にＷＴスレオニンを維持する。
Ｔ３０７及びＮ４３４にように、複数のリード変異が単一の位置に位置しており（図１４黒い四角）、ここでより遅いＦｃＲｎ解離カイネティクスを示したそれぞれ６つ及び３つの変異が同定された。これらの位置においてｈＦｃＲｎに対する最も遅いＦｃＲｎ解離速度を有する変異のみを組み合わせ変異体の作製に使用した。この場合、Ｔ３０７Ｑ、Ｔ３０７Ｗ、Ｎ４３４Ｆ及びＮ４３４Ｙは、二重、三重及び四重変異体を得るためにＭ２５２Ｙ、Ｔ２５６Ｄ及びＴ２５６Ｅと混合プライマーＰＣＲ及び部位特異的変異誘発を使用して混合された。合計で、組み合わせライブラリーは、７つのリード単一、１８の二重、２０の三重、８つの四重変異体及びＷＴ抗体を含む５４の変異体からなっていた。これらの変異体の命名は以下のとおりである：野生型バックグラウンドは、Ｍ２５２、Ｔ２５６、Ｔ３０７及びＮ４３４を含み、そしてＭＴＴＮとして再分類される。そのため、三重変異体ＹＴＱＹは、Ｍ２５２Ｙ、Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ｙ変異を含有するが、位置２５６にＷＴスレオニンを維持する。
【0287】
単一変異を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅを使用したｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合カイネティクスを使用して、どの組み合わせ変異体が親和性を改善したかを決定した。単一（長い二点鎖線）、二重（長い一点鎖線）、三重（長い破線）及び四重（短い破線）の各々の代表的ＦｃＲｎ結合速度トレースを図６Ａ及び６Ｂに、ＷＴ（点線）及びＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ：ＬＳ（長い二点鎖線）；ｒＦｃＲｎ：ＹＴＥ （実線））のそれぞれの種について最も緊密な親和性を有するベンチマーク変異体と比較して示す。ｈＦｃＲｎ結合及び解離速度（図６Ｃ）は、２つの単一、１５の二重、１８の三重及び８つの四重変異体が、ＬＳ変異体（図６Ｃ、点線）よりも増強された結合親和性を有していることを明らかにした。同様に、１つの三重変異体を除いて全ての組み合わせは、ＹＴＥ（図６Ｄ、左下への対角線）よりも緊密なｒＦｃＲｎに対する親和性を有していた。ｈＦｃＲｎの場合、追加のＦｃＲｎ増強変異がさらに結合親和性を増加させた（図６Ｃ）。ｈＦｃＲｎへの最も緊密な親和性を有する５つの組み合わせは、全て四重変異体（図６Ｃ、格子柄）であり、結合親和性は野生型より約５００倍高かった。最も高い親和性を有する変異体は二重変異体であったので（図６Ｄ、水平線）、同様の現象はｒＦｃＲｎでは起こらなかった（図６Ｄ）。三重（図６Ｄ、垂直線）及び四重（図６Ｄ、格子柄）変異体は、典型的には解離速度のわずかな減少（２倍未満）しか示さなかったが、減少した結合速度も示した（図６Ｄ）。いずれの理論にも拘束されないが、これらの結果は、ＦｃＲｎ見かけの結合親和性に関してｒＦｃＲｎが到達したより低い限界がおそらく存在する（約０．５ｎＭ）が、ｈＦｃＲｎでは存在しない（図６Ｂ）ということを示唆する。合計で、４０より多くの組み合わせ変異体が、ベンチマーク変異体よりも緊密な親和性を有しており、そしてさらなる特徴づけが、インビボ研究のために最も好ましい特性を有する組み合わせを選択するために必要とされる。
【0288】
実施例５：組み合わせ変異体は生理的ｐＨで有意な結合を保持する
ｐＨ６．０での有意に改善されたＦｃＲｎ親和性の結果として、ｐＨ依存性に対する効果を、ＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィー及びｐＨ７．４でのＢｉａｃｏｒｅ定常状態測定を使用して調べた。ＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィーは、線形ｐＨグラジエントを使用して、変異によるｐＨ依存性の摂動を直接測定する。弱いＦｃＲｎ結合を有するＨ４３５Ａ及びＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑは、ｐＨにかかわらずカラムに結合しなかった（図８Ａ）。ＷＴは生理的ｐＨ付近（ｐＨ７．３７±０．０５）で溶出したが、ＡＡＡ、ＬＳ及びＹＴＥはより高いｐＨを必要とした（表２Ｂ）。全ての組み合わせ変異体及び７つのリード単一変異体は、アフィニティカラムから溶出するためにＷＴより高いｐＨを必要とした（図８Ａ及び８Ｃ）。Ｎ４３４Ｆ／Ｙ変異体はＬＳより高いｐＨで溶出し（表２Ｂ）、これは、科学的理論に束縛されることを意図しないが、これらたの変異体が、単独及び組み合わせの両方でｐＨ依存性を破壊したことを示す。代表的なクロマトグラムは、変異の数につれてより高い溶出ｐＨへの明らかなシフトを示した（図９Ａ及び９Ｂ）。溶出ｐＨとｈＦｃＲｎ解離速度との間の強い相関（Ｒ２＝０．９４）（図９Ｃ）は、ｐＨ６．０でのより遅いＦｃＲｎ解離速度が、ＦｃＲｎ変異体についての増加した溶出ｐＨに直接寄与したことを示す。
ｐＨ６．０での有意に改善されたＦｃＲｎ親和性の結果として、ｐＨ依存性に対する効果を、ＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィー及びｐＨ７．４でのＢｉａｃｏｒｅ定常状態測定を使用して調べた。ＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィーは、線形ｐＨグラジエントを使用して、変異によるｐＨ依存性の摂動を直接測定する。弱いＦｃＲｎ結合を有するＨ４３５Ａ及びＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑは、ｐＨにかかわらずカラムに結合しなかった（図８Ａ）。ＷＴは生理的ｐＨ付近（ｐＨ７．３７±０．０５）で溶出したが、ＡＡＡ、ＬＳ及びＹＴＥはより高いｐＨを必要とした（表２Ｂ）。全ての組み合わせ変異体及び７つのリード単一変異体は、アフィニティカラムから溶出するためにＷＴより高いｐＨを必要とした（図８Ａ及び８Ｃ）。Ｎ４３４Ｆ／Ｙ変異体はＬＳより高いｐＨで溶出し（表２Ｂ）、これは、科学的理論に束縛されることを意図しないが、これらたの変異体が、単独及び組み合わせの両方でｐＨ依存性を破壊したことを示す。代表的なクロマトグラムは、変異の数につれてより高い溶出ｐＨへの明らかなシフトを示した（図９Ａ及び９Ｂ）。溶出ｐＨとｈＦｃＲｎ解離速度との間の強い相関（Ｒ２＝０．９４）（図９Ｃ）は、ｐＨ６．０でのより遅いＦｃＲｎ解離速度が、ＦｃＲｎ変異体についての増加した溶出ｐＨに直接寄与したことを示す。
【0289】
生理的条件下での残留結合活性を測定するために、ＦｃＲｎ結合速度実験をｐＨ７．４でＢｉａｃｏｒｅを使用して行った。いくつかの変異体は、信頼性の無いカイネティクスを示しこのｐＨで結合をほとんど示さないか全く示さなかったので、定常状態ＲＵを残留ＦｃＲｎ結合親和性の尺度として使用した。単一（長い二点鎖線）、二重（長い一点鎖線）、三重（長い破線）及び四重（短い破線）変異体の代表的速度トレースをＬＳ（図７Ａ、実線）及びＹＴＥ（図７Ｂ、実線）と比較して図７Ａ及び７Ｂに示した。これら２つの変異体は、ｐＨ７．４でそれぞれヒト及びラットＦｃＲｎに対して最も高い残留結合を示した。リード単一変異体の大部分は、ＷＴと比較してわずかに上昇したＦｃＲｎ結合を有していたが（４．３±１．０ＲＵ）、Ｎ４３４Ｆ／Ｙ変異を除いて、ＡＡＡ（１３．１±１．７ ＲＵ）、Ｌ（１８．５±２．６ ＲＵ）及びＹＴＥ（１３．１±１．６ ＲＵ）
より低かった（表２Ａ及び２Ｂ）。組み合わせ変異体はまた、Ｎ４３４Ｆ／Ｙより同等に高い程度までｐＨ７．４でのＦｃＲｎｎの両方の種への有意な残留結合を有していた（図７Ａ及び７Ｂ）。いずれの理論にも束縛されないが、インビボ研究に理想的な候補は、低ｐＨで増加したＦｃＲｎ結合を有するが（例えば、ＡＡＡ、ＬＳ及びＹＴＥ変異体）、ＷＴと同じ様式で、高ｐＨで低レベルの結合を維持する変異体である。図７Ｃ及び７Ｄに示されるプロットにおいて、これらの組み合わせは、各ｐＨでそれぞれヒト及びラットＦｃＲｎに対するＬＳ及びＹＴＥ変異体の親和性により指定された左下四半部を占めるだろう。
より低かった（表２Ａ及び２Ｂ）。組み合わせ変異体はまた、Ｎ４３４Ｆ／Ｙより同等に高い程度までｐＨ７．４でのＦｃＲｎｎの両方の種への有意な残留結合を有していた（図７Ａ及び７Ｂ）。いずれの理論にも束縛されないが、インビボ研究に理想的な候補は、低ｐＨで増加したＦｃＲｎ結合を有するが（例えば、ＡＡＡ、ＬＳ及びＹＴＥ変異体）、ＷＴと同じ様式で、高ｐＨで低レベルの結合を維持する変異体である。図７Ｃ及び７Ｄに示されるプロットにおいて、これらの組み合わせは、各ｐＨでそれぞれヒト及びラットＦｃＲｎに対するＬＳ及びＹＴＥ変異体の親和性により指定された左下四半部を占めるだろう。
【0290】
実施例６：ＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィー
組み合わせ変異体は、ｐＨ６．０での見かけの結合親和性とｐＨ７．４での定常状態ＲＵとの間に中程度のポジティブな相関（ｈＦｃＲｎ：Ｒ2＝０．６９、ｒＦｃＲｎ：Ｒ2＝０．７１）を示した（図７Ｃ及び７Ｄ）。いずれの理論にも束縛されないが、これらの結果は、ｐＨ６．０でのより高い親和性が、典型的にはｐＨ７．４でのより高い残留ＦｃＲｎ結合につながるということを示す。これらの変異体は、血流中のＦｃＲｎに結合されたままになり得、そして高いＦｃＲｎ親和性ａｂｄｅｇ変異と同様に、短い血清半減期を有するか、かつ／又はそれらのクリアランスを促進する（例えば、Ｓｗｉｅｒｃｚら、２０１４年前出；及びＶａｃｃａｒｏら、２００５年前出）。抗体－ＦｃＲｎ相互作用はｐＨ依存性であり、そして低ｐＨ（＜ｐＨ６．５）でしか発生しないので飽和変異体は、疎水性又は電荷由来寄与による相互作用を強化し得、これは重要なヒスチジン残基の脱プロトン化を妨害し得（図１Ｂ、示されるとおり）、そして生理学的ｐＨでこの相互作用を弱める。
組み合わせ変異体は、ｐＨ６．０での見かけの結合親和性とｐＨ７．４での定常状態ＲＵとの間に中程度のポジティブな相関（ｈＦｃＲｎ：Ｒ2＝０．６９、ｒＦｃＲｎ：Ｒ2＝０．７１）を示した（図７Ｃ及び７Ｄ）。いずれの理論にも束縛されないが、これらの結果は、ｐＨ６．０でのより高い親和性が、典型的にはｐＨ７．４でのより高い残留ＦｃＲｎ結合につながるということを示す。これらの変異体は、血流中のＦｃＲｎに結合されたままになり得、そして高いＦｃＲｎ親和性ａｂｄｅｇ変異と同様に、短い血清半減期を有するか、かつ／又はそれらのクリアランスを促進する（例えば、Ｓｗｉｅｒｃｚら、２０１４年前出；及びＶａｃｃａｒｏら、２００５年前出）。抗体－ＦｃＲｎ相互作用はｐＨ依存性であり、そして低ｐＨ（＜ｐＨ６．５）でしか発生しないので飽和変異体は、疎水性又は電荷由来寄与による相互作用を強化し得、これは重要なヒスチジン残基の脱プロトン化を妨害し得（図１Ｂ、示されるとおり）、そして生理学的ｐＨでこの相互作用を弱める。
【0291】
ＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィーは、ＦｃＲｎ相互作用ｐＨ依存性の摂動を直接測定するために線形ｐＨグラジエントを使用する（例えば、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら、２０１３年前出を参照のこと）。ＡＡＡ、ＬＳ、ＹＴＥ、Ｈ４３５Ａ及びＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ変異体を用いたＦｃＲｎ アフィニティクロマトグラフィーは、Ｈ４３５Ａ（図８Ａ、明るい灰色の実線）及びＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ（図８Ａ、ＡＱ、暗い灰色の実線）がＦｃＲｎにｐＨ５．５でも結合せず、フォロースルーで溶出するということを明らかにした。野生型抗体は、生理的ｐＨ付近（ｐＨ７．３７±０．０５）で溶出したが、Ｏｃｔｅｔ（図２）及びＢｉａｃｏｒｅ（図３）により野生型より遅い解離速度及びより緊密なＦｃＲｎ結合親和性を有するＡＡＡ、ＬＳ及びＹＴＥは、カラムから解離するためにかなり高いｐＨ（ＡＡＡ：７．９４±０．０６；ＬＳ：８．２９±０．０３；ＹＴＥ：８．１４±０．０３）を必要とした。溶出プロフィールは、組み合わせライブラリーの変異体の全てが、アフィニティカラムから溶出するために野生型より高いｐＨを必要とするということを明らかにした。単一（長い二点鎖線）、二重（長い一点鎖線）、三重（長い破線）及び四重（短い破線）変異体についての代表的な平均溶出ｐＨを図９Ａに示す。７つのリード単一変異体は、カラムから解離するためにＷＴと比較してより高いｐＨを必要としたが（図１０Ａ、表３）、ｈＦｃＲｎに対して野生型様カイネティクスを有するもの（Ｋ２８８Ｄ／Ｎ、Ｙ４３６Ｈ／Ｈ／Ｗ）は全て野生型と同様のｐＨで溶出した。
【0292】
【表6】
【0293】
全てのデータを各列の上部の実験技術を使用して得られた。溶出ｐＨをＦｃＲｎアフィニティクロマトグラフィーにより三連で（ｎ＝３）決定し、そしてＤＳＦにより三連で（ｎ＝３）熱安定性を調べた。ヒト及びラットＦｃＲｎに対するＦｃＲｎ結合カイネティクスを、一連の抗体濃度（ｎ＝４）を用いてＢｉａｃｏｒｅから得、そして独立してフィッティングした。各測定についての単位は以下のとおりである：溶出ｐＨ（無単位）；ＤＳＦ Ｔm（℃）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０ ｈＦｃＲｎ 結合速度（ｘ１０4Ｍ-1秒-1）、解離速度（ｘ１０-1秒-1）及びＫD,app（ｘ１０9Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０
ｒＦｃＲｎ 結合速度（ｘ１０4Ｍ-1秒-1）、解離速度（ｘ１０-3秒-1）及びＫD,app
（ｘ１０9Ｍ）。
ｒＦｃＲｎ 結合速度（ｘ１０4Ｍ-1秒-1）、解離速度（ｘ１０-3秒-1）及びＫD,app
（ｘ１０9Ｍ）。
【0294】
Ｎ４３４Ｆ／Ｙ変異体は、両方ともＬＳ変異体より高いｐＨで溶出し（Ｎ４３４Ｆ：８．３０±０．０５；Ｎ４３４Ｙ：８．４６±０．０２）、そしてｐＨ７．４でかなりのＦｃＲｎ結合を示した（表４）。これらの結果は、これらの変異体が単独でｐＨ依存性を破壊し得るということを示す。一般に、平均溶出ｐＨは、ＦｃＲｎ結合増強変異の数が増えるにつれて増加した（図９Ｂ）。強い相関（Ｒ2＝０．９４）が、ｈＦｃＲｎ解離速度と
比較して溶出ｐＨで現れた（図９Ｃ）；いずれの理論にも束縛されないが、相互作用のｐ
Ｈ依存性の破壊が、ｐＨ６．０で組み合わせライブラリーについて観察されたより遅いＦｃＲｎ解離速度に直接寄与するということを示す。
比較して溶出ｐＨで現れた（図９Ｃ）；いずれの理論にも束縛されないが、相互作用のｐ
Ｈ依存性の破壊が、ｐＨ６．０で組み合わせライブラリーについて観察されたより遅いＦｃＲｎ解離速度に直接寄与するということを示す。
【0295】
実施例７：熱安定性
低い熱力学的安定性を有する抗体を含めて大部分のタンパク質は、ミスフォールディング及び凝集の増加した傾向を有し、そしてそれらの活性、有効性及び新規治療剤としての可能性を限定するか又は妨げる。各変異体の熱安定性をＤＳＦを使用して決定し、そして報告された融解温度（Ｔm）をＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ蛍光強度プロフィールにおける
第一遷移の中点として定義した。６９．０±０．２℃のＴmを有するＷＴと比較して、Ｌ
Ｓ変異体はＷＴに似ており（６８．５±０．３℃）、そしてＡＡＡ及びＹＴＥは、約８℃（ＡＡＡ：６１．３±０．６℃；ＹＴＥ：６１．２±０．３℃）だけ熱的に不安定化されている（図８Ｂ、９Ｂ、及び１０Ｂ；並びに表２Ｂ、３及び４）。６９．０±０．２℃のＴmを有するＷＴ及びＬＳと比較して、ＡＡＡ及びＹＴＥ変異体は、ＤＳＦにより約８℃
だけ低い熱安定性を有していた。
低い熱力学的安定性を有する抗体を含めて大部分のタンパク質は、ミスフォールディング及び凝集の増加した傾向を有し、そしてそれらの活性、有効性及び新規治療剤としての可能性を限定するか又は妨げる。各変異体の熱安定性をＤＳＦを使用して決定し、そして報告された融解温度（Ｔm）をＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ蛍光強度プロフィールにおける
第一遷移の中点として定義した。６９．０±０．２℃のＴmを有するＷＴと比較して、Ｌ
Ｓ変異体はＷＴに似ており（６８．５±０．３℃）、そしてＡＡＡ及びＹＴＥは、約８℃（ＡＡＡ：６１．３±０．６℃；ＹＴＥ：６１．２±０．３℃）だけ熱的に不安定化されている（図８Ｂ、９Ｂ、及び１０Ｂ；並びに表２Ｂ、３及び４）。６９．０±０．２℃のＴmを有するＷＴ及びＬＳと比較して、ＡＡＡ及びＹＴＥ変異体は、ＤＳＦにより約８℃
だけ低い熱安定性を有していた。
【0296】
【表7】
【0297】
野生型骨格中に導入された変異は太字で下線を付されている。全てのデータは列の上部に示される実験技術を使用して得られた。溶出ｐＨ及びＴmを三連で決定した（ｎ＝３）
。ヒト及びラットＦｃＲｎに対するｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合カイネティクスをＢｉａｃｏｒｅ（ｎ＝４）から得て、独立してフィッティングした。ｐＨ７．４での定常状態ＦｃＲｎ結合応答を、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して単一抗体濃度で三連で測定した。ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を、一連の抗体濃度から二連でＢｉａｃｏｒｅを使用して決定した。各測定についての単位は以下のとおりである：溶出ｐＨ（無単位）；ＤＳＦ Ｔｍ（℃）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０ ｈＦｃＲｎ結合速度（ｘ１０5Ｍ-1秒-1）、解離速度（
ｘ１０-2秒-1）及びＫD,app（ｘ１０9Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎ 結合速度（ｘ１０5Ｍ-1秒-1）、解離速度（ｘ１０-3秒-1）及びＫD,app（ｘ１０9Ｍ）；
Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ７．４定常状態結合応答（ＲＵ）及びＦｃγＲＩＩＩａ ＫD,app （ｘ１０9Ｍ）。
。ヒト及びラットＦｃＲｎに対するｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合カイネティクスをＢｉａｃｏｒｅ（ｎ＝４）から得て、独立してフィッティングした。ｐＨ７．４での定常状態ＦｃＲｎ結合応答を、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して単一抗体濃度で三連で測定した。ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を、一連の抗体濃度から二連でＢｉａｃｏｒｅを使用して決定した。各測定についての単位は以下のとおりである：溶出ｐＨ（無単位）；ＤＳＦ Ｔｍ（℃）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０ ｈＦｃＲｎ結合速度（ｘ１０5Ｍ-1秒-1）、解離速度（
ｘ１０-2秒-1）及びＫD,app（ｘ１０9Ｍ）；Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ６．０ ｒＦｃＲｎ 結合速度（ｘ１０5Ｍ-1秒-1）、解離速度（ｘ１０-3秒-1）及びＫD,app（ｘ１０9Ｍ）；
Ｂｉａｃｏｒｅ ｐＨ７．４定常状態結合応答（ＲＵ）及びＦｃγＲＩＩＩａ ＫD,app （ｘ１０9Ｍ）。
【0298】
１８のリード飽和変異体のうち１２は、野生型と比較して減少したＴmを有しており、
そしてＴ３０７変異体のいくつか（Ｔ３０７Ｅ／Ｆ／Ｍ／Ｑ）は、わずかな安定性を示した（表４）。組み合わせに使用した７つの単一変異体のうちの１つ（図１０Ｂ及び表４）は、ＹＴＥと比較して有意に不安定化していた（図８Ｂ及び表５）。二重（図９Ｄ、水平線）、三重（図９Ｄ、垂直線）及び四重（図９Ｄ、格子柄）変異体を加えることにより、単一変異体（図９Ｄ、白色丸）と比較して全体的な熱安定性のさらなる減少がもたらされた。複数の変異体が、ＡＡＡ又はＹＴＥよりも低いＴmを示し（６１．２±０．℃）、こ
れらの変異体の＞６０％はＴ３０７Ｗを含有していた。四重変異体（図９Ｄ、格子柄）は、融解温度の独特な二峰性分布を示し、Ｔ３０７Ｑを含有する組み合わせは、Ｔ３０７Ｗを有するものより約６℃高い熱安定性を有していた（図９Ｄ）。
そしてＴ３０７変異体のいくつか（Ｔ３０７Ｅ／Ｆ／Ｍ／Ｑ）は、わずかな安定性を示した（表４）。組み合わせに使用した７つの単一変異体のうちの１つ（図１０Ｂ及び表４）は、ＹＴＥと比較して有意に不安定化していた（図８Ｂ及び表５）。二重（図９Ｄ、水平線）、三重（図９Ｄ、垂直線）及び四重（図９Ｄ、格子柄）変異体を加えることにより、単一変異体（図９Ｄ、白色丸）と比較して全体的な熱安定性のさらなる減少がもたらされた。複数の変異体が、ＡＡＡ又はＹＴＥよりも低いＴmを示し（６１．２±０．℃）、こ
れらの変異体の＞６０％はＴ３０７Ｗを含有していた。四重変異体（図９Ｄ、格子柄）は、融解温度の独特な二峰性分布を示し、Ｔ３０７Ｑを含有する組み合わせは、Ｔ３０７Ｗを有するものより約６℃高い熱安定性を有していた（図９Ｄ）。
【0299】
実施例８：Ｆｃ変異体はＦｃγＲＩＩＩａとの結合相互作用を変更する
ＦｃＲｎとの相互作用に加えて、Ｆｃ領域ヒンジ及びＣH２ドメインは、ＦｃγＲＩＩ
Ｉａを含む他のＦｃ受容体との相互作用の原因である。組み合わせ飽和ライブラリーのために使用された７つの単一変異体のうちの５つはＣH２ドメイン内に位置し、これらの受
容体と相互作用する能力は、相互作用境界部から遠いそれらの位置にもかかわらず、野生型と比較して損なわれ得る。ｐＨ７．４でＦｃＲｎ結合と同様の方法でＦｃγＲＩＩＩａ結合を測定するためにＢｉａｃｏｒｅを使用することにより、ＹＴＥ（図１１Ａ、暗い灰色）変異体が野生型（図１１Ａ、黒色）と比較して結合応答の約５０％の減少を示すということが明らかとなった。いずれの理論にも束縛されないが、ＹＴＥについての減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合は、Ｍ２５２Ｙ変異体が単独でこの受容体に対する有意に減少した親和性を有しているので（図１１Ｂ、一番下白色丸）、Ｍ２５２Ｙ変異の結果である。他の単一変異は、この減少した親和性を共有しておらず（図１１Ｂ、白色丸）、そしてＮ４３４Ｆ／Ｙ変異体は単独で結合を１６～４０％増強した。これらの効果はそれらの対応する組み合わせの全てではないが大部分に転移された。例えば、Ｍ２５２Ｙ含有組み合わせは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の１７％と７２％との間の減少を有していた（表５）。
ＦｃＲｎとの相互作用に加えて、Ｆｃ領域ヒンジ及びＣH２ドメインは、ＦｃγＲＩＩ
Ｉａを含む他のＦｃ受容体との相互作用の原因である。組み合わせ飽和ライブラリーのために使用された７つの単一変異体のうちの５つはＣH２ドメイン内に位置し、これらの受
容体と相互作用する能力は、相互作用境界部から遠いそれらの位置にもかかわらず、野生型と比較して損なわれ得る。ｐＨ７．４でＦｃＲｎ結合と同様の方法でＦｃγＲＩＩＩａ結合を測定するためにＢｉａｃｏｒｅを使用することにより、ＹＴＥ（図１１Ａ、暗い灰色）変異体が野生型（図１１Ａ、黒色）と比較して結合応答の約５０％の減少を示すということが明らかとなった。いずれの理論にも束縛されないが、ＹＴＥについての減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合は、Ｍ２５２Ｙ変異体が単独でこの受容体に対する有意に減少した親和性を有しているので（図１１Ｂ、一番下白色丸）、Ｍ２５２Ｙ変異の結果である。他の単一変異は、この減少した親和性を共有しておらず（図１１Ｂ、白色丸）、そしてＮ４３４Ｆ／Ｙ変異体は単独で結合を１６～４０％増強した。これらの効果はそれらの対応する組み合わせの全てではないが大部分に転移された。例えば、Ｍ２５２Ｙ含有組み合わせは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の１７％と７２％との間の減少を有していた（表５）。
【0300】
【表8】
【0301】
１つの変異体ＭＤＱＦ（図１１Ｂ、三重変異体カテゴリー中最高）は、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の劇的な１４０％増加を示した。従って、組み合わせ飽和ライブラリーは、特定のエフェクター機能を有する治療用抗体に合わせるために利用され得る広範囲のＦｃ受容体機能を有する変異体を提供した。
【0302】
図１１Ｃは、ＷＴ及びＹＴＥ変異体と比較した、７つのリード単一変異体のＦｃγＲＩＩＩａ結合応答の箱ひげ図を示す。
【0303】
実施例９：７つのリード組み合わせはＦｃＲｎ相互作用のｐＨ依存性のバランスを取る
いずれの理論にも束縛されないが、インビボでのさらなる研究のための候補変異体は、図７Ｃ及び７Ｄに示されるプロットの左下四半部を占めていた。７つの変異体はｈＦｃＲｎについてこれらの基準を満たし、５つの二重及び２つの三重組み合わせ（ＭＤＱＮ、ＭＤＷＮ、ＹＤＴＮ、ＹＥＴＮ、ＹＴＷＮ、ＹＤＱＮ及びＹＥＱＮ）を含んでおり、そしてＮ４３４位置に変異を含有していなかった（表３）。これらの組み合わせの各々は、ＦｃＲｎアフィニティカラムからＡＡＡ（ｐＨ７．９４±０．０６）とＬＳ（ｐＨ８．２９±０．０３）との間で溶出し、ＹＤＱＮは最も高いｐＨ８．５１±０．１４で溶出し（図１２Ａ、表５）、ｐＨ依存性におけるわずかな摂動のみ、そしてｐＨ７．４でより高い残留結合を示した（表２Ａ）。変異体の１つ（ＭＤＱＮ）は野生型様熱安定性を有しており、そして６つはＹＴＥ変異体と比較して同様又は減少したＴmを有していた（図１２Ｂ、表
４）。ＦｃγＲＩＩＩａ結合アッセイにおいて、５つの組み合わせ変異体はＹＴＥと同様の減少を示した（表４）。単一変異を用いたさらなる調査により、Ｍ２５２ＹがＦｃγＲＩＩＩａ結合に有意に影響を及ぼし、そしていずれの理論にも束縛されないが、この効果をこの変異を含む組み合わせに対して転移するということがわかった。残りの６つの単一変異はＷＴ様であるか、又はこの受容体に対してわずかに改善された結合を有していた。
いずれの理論にも束縛されないが、インビボでのさらなる研究のための候補変異体は、図７Ｃ及び７Ｄに示されるプロットの左下四半部を占めていた。７つの変異体はｈＦｃＲｎについてこれらの基準を満たし、５つの二重及び２つの三重組み合わせ（ＭＤＱＮ、ＭＤＷＮ、ＹＤＴＮ、ＹＥＴＮ、ＹＴＷＮ、ＹＤＱＮ及びＹＥＱＮ）を含んでおり、そしてＮ４３４位置に変異を含有していなかった（表３）。これらの組み合わせの各々は、ＦｃＲｎアフィニティカラムからＡＡＡ（ｐＨ７．９４±０．０６）とＬＳ（ｐＨ８．２９±０．０３）との間で溶出し、ＹＤＱＮは最も高いｐＨ８．５１±０．１４で溶出し（図１２Ａ、表５）、ｐＨ依存性におけるわずかな摂動のみ、そしてｐＨ７．４でより高い残留結合を示した（表２Ａ）。変異体の１つ（ＭＤＱＮ）は野生型様熱安定性を有しており、そして６つはＹＴＥ変異体と比較して同様又は減少したＴmを有していた（図１２Ｂ、表
４）。ＦｃγＲＩＩＩａ結合アッセイにおいて、５つの組み合わせ変異体はＹＴＥと同様の減少を示した（表４）。単一変異を用いたさらなる調査により、Ｍ２５２ＹがＦｃγＲＩＩＩａ結合に有意に影響を及ぼし、そしていずれの理論にも束縛されないが、この効果をこの変異を含む組み合わせに対して転移するということがわかった。残りの６つの単一変異はＷＴ様であるか、又はこの受容体に対してわずかに改善された結合を有していた。
【0304】
３つの組み合わせ変異体を、それらのＦｃＲｎ結合特性、熱安定性及びＦｃγＲＩＩＩａ結合に基づいてさらなる研究のために選択した。ＤＱ（Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ）、ＤＷ（Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ）及びＹＤ（Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ）はそれぞれ、ＬＳ変異体（図１２Ｅ）のような最適なＦｃＲｎ結合特性をもたらした（表２Ｂ）。各変異体は、一定範囲の機能性をもたらす多様な熱安定性及びＦｃγＲＩＩＩａ結合特性を提供する（図１２Ｆ及び１２Ｇ、表２Ｂ）。図１２Ｈは均一ブリッジングＲＦのプロットである。
【0305】
それぞれヒト及びラットＦｃＲｎの両方についてのｐＨ６．０での見かけの結合親和性のＬＳと比較した増強（図１３Ａ、濃い長い破線）及びＹＴＥ変異体（図１３Ｂ、濃い長い破線）は、結合速度と解離速度との間の妥協（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）である（図１３Ａ及び１３Ｂ、表４）。典型的に、より速い解離速度を有する組み合わせは、より速い結合速度も有し、その逆も当てはまる。この観察は、ヒトＦｃＲｎとラットＦｃＲｎとの間で維持された（表４）。さらに、これらの変異体の全ては、ｐＨ７．４でｈＦｃＲｎに対してＬＳ変異体（図１３Ｃ、濃い長い破線）よりも低い定常状態応答を有していた。これらの結果はｒＦｃＲｎと一致せず、５つのＭ２５２Ｙ含有変異体、ＹＤＴＮ、ＹＥＴＮ、ＹＴＷＮ、ＹＤＱＮ及びＹＥＱＮは、ＹＴＥと比較してｐＨ７．４で上昇したＦｃＲｎ結合を有していた（図１３、表５）。ＭＤＱＮ及びＭＤＷＮ変異体だけがヒトＦｃＲｎとラットＦｃＲｎとの間で交差反応性である組み合わせであった。さらに、これら２つの変異体は、Ｍ２５２Ｙ含有変異体と同様の程度まではＦｃγＲＩＩＩａとの相互作用を摂動しなかった（図１２Ｃ及び１２Ｄ並びに表５；ＭＤＱＮ：６００±４ ｎＭ；ＭＤＷＮ：５１２±３０ｎＭ；ＷＴ：４６７±９９ｎＭ）。従って、鍵となるＦｃＲｎ相互作用位置における飽和及び組み合わせ変異誘発は、相互作用のｐＨ依存性のバランスを取り、Ｆｃ受容体での機能性を維持し、インイボでＦｃＲｎ機能性を増強し得、そして治療用抗体の血清半減期を延長し得るリード変異体の同定をもたらした。
【0306】
実施例１０：リード組み合わせ変異体のリウマトイド因子結合特徴
これらの変異は抗体表面電荷及び免疫原性を変更し得るので、リード変異体の等電点及びＲＦ結合を調べた。より酸性の抗体が抗体薬物動態を延長すると考えられた。ＷＴ及びＬＳ対照と比較して、３つのリード全てが、Ｔ２５６Ｄ置換の結果として約０．２ｐＨ単位のｐＩの減少を生じた。ＦｃＲｎ増強変異は、オーバーラップしている相互作用境界部に起因して、リウマトイド因子（ＲＦ）のような宿主抗体への結合を同時に変更する。均一ブリッジングＥＬＩＳＡを、リード変異体についてＲＦ結合の変化を測定するために適合させた。興味深いことに、ＬＳが、及びＹＴＥは、ＷＴと比較したＲＦ結合において完全に反対のシフトを示した（図１２Ｈ）。ＬＳはＲＦ結合を有意に増加させたが、ＹＴＥ
は有意な減少（ｐ＜０．００１）を示した。ＹＤ（ｐ＜０．００１）及びＤＷ（ｐ＜０．０１）もまたＲＦ結合を有意に減少したが、ＤＱはＷＴと同様の応答を生じた。いずれの理論にも束縛されないが、これらの結果は、ＤＱ、ＤＷ及びＹＤが、ＬＳと比較して免疫原性の利点をもたらし得るということを示す。ＹＤ、ＤＷ及びＤＱ変異体は、ベンチマークＹＴＥ及びＬＳ変異体に優る改善されたＦｃＲｎ結合特性と併せて影響され得る鍵となる抗体特徴の範囲を表す。
これらの変異は抗体表面電荷及び免疫原性を変更し得るので、リード変異体の等電点及びＲＦ結合を調べた。より酸性の抗体が抗体薬物動態を延長すると考えられた。ＷＴ及びＬＳ対照と比較して、３つのリード全てが、Ｔ２５６Ｄ置換の結果として約０．２ｐＨ単位のｐＩの減少を生じた。ＦｃＲｎ増強変異は、オーバーラップしている相互作用境界部に起因して、リウマトイド因子（ＲＦ）のような宿主抗体への結合を同時に変更する。均一ブリッジングＥＬＩＳＡを、リード変異体についてＲＦ結合の変化を測定するために適合させた。興味深いことに、ＬＳが、及びＹＴＥは、ＷＴと比較したＲＦ結合において完全に反対のシフトを示した（図１２Ｈ）。ＬＳはＲＦ結合を有意に増加させたが、ＹＴＥ
は有意な減少（ｐ＜０．００１）を示した。ＹＤ（ｐ＜０．００１）及びＤＷ（ｐ＜０．０１）もまたＲＦ結合を有意に減少したが、ＤＱはＷＴと同様の応答を生じた。いずれの理論にも束縛されないが、これらの結果は、ＤＱ、ＤＷ及びＹＤが、ＬＳと比較して免疫原性の利点をもたらし得るということを示す。ＹＤ、ＤＷ及びＤＱ変異体は、ベンチマークＹＴＥ及びＬＳ変異体に優る改善されたＦｃＲｎ結合特性と併せて影響され得る鍵となる抗体特徴の範囲を表す。
【0307】
実施例１１：リード組み合わせ変異体は他の抗体に転移可能である
図１５Ａに示されるように、新しい結合アッセイをＣＭ５センサーチップを使用して開発した。結合アッセイは、ビオチン化ＦｃＲｎを捕捉するためにＣＭ５センサーチップ上にストレプトアビジンを約３０ＲＵまで固定化する工程を含み、これは必要に応じて補充される。抗体結合カイネティクスをｐＨ６．０及び７．４で測定し、そして再生のためにｐＨ８．５にした。図１５Ｂ及び１５Ｃは、新しい結合アッセイを使用したＦｃＲｎの直接固定化及びビオチン化ＦｃＲｎのストレプトアビジン捕捉を示す。
図１５Ａに示されるように、新しい結合アッセイをＣＭ５センサーチップを使用して開発した。結合アッセイは、ビオチン化ＦｃＲｎを捕捉するためにＣＭ５センサーチップ上にストレプトアビジンを約３０ＲＵまで固定化する工程を含み、これは必要に応じて補充される。抗体結合カイネティクスをｐＨ６．０及び７．４で測定し、そして再生のためにｐＨ８．５にした。図１５Ｂ及び１５Ｃは、新しい結合アッセイを使用したＦｃＲｎの直接固定化及びビオチン化ＦｃＲｎのストレプトアビジン捕捉を示す。
【0308】
抗体－２のｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合：マウスＦｃＲｎ、リード抗体－２変異体は、ＬＳ変異体（破線）及び野生型（黒色）よりも遅い解離速度を示す（図１６Ａ）。ヒトＦｃＲｎについて、リード変異体は全てより速い結合速度を有するが、ＬＳ（破線）と同様の解離速度であった（図１６Ｂ）。
【0309】
抗体－２のｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合：全ての変異体は、ＬＳ（破線）と比較してｐＨ７．４で減少したヒト結合を示した（図１７Ａ）。抗体－１バックグラウンドと同様に、ＤＷ（ＭＤＷＮ）及びＤＱ（ＭＤＱＮ）変異体もまた、ｐＨ７．４でマウス（ラット）ＦｃＲｎに対してより低い残留結合を示した（図１７Ｂ）。
【0310】
リード変異体は、ＬＳと比較してｐＨ６．０でより高い結合親和性、及び ｐＨ７．４でより低い残留結合を維持した（図１８）。重要なことには、変異体はＦｃＲｎ結合に対してほとんど影響なく異なるＩｇＧ１バックグラウンド間で転移可能であることが見いだされた。図１９に示されるように、ＬＳはバックグラウンドにかかわらず同様の溶出ｐＨを有していた。抗体－２バックグラウンドにおいて、ＷＴ、ＤＱ及びＤＷは、おそらく抗体－２バックグラウンドにおけるｐＨ６．０でのより緊密な結合の結果として、抗体－１バックグラウンドにおいてより高い溶出ｐＨを示した。
【0311】
抗体－２バックグラウンド変異体は全て、図２０に示されるように、わずかに増加した熱安定性を示した。
【0312】
図２１に示されるように、抗体－１バックグラウンドと同様に、ＹＤ（ＹＤＴＮ）は、ＦｃγＲＩＩＩａ結合応答（左）及び親和性（右）において減少を示した。ＤＱ（明るい灰色）及びＤＷ（暗い灰色）は、抗体－２バックグラウンドにおいて、ＷＴ（黒色）と同様のＦｃγＲＩＩＩａ結合特性を示した。ＬＳについてのＦｃγＲＩＩＩａ結合に対する効果は、抗体－１と抗体－２との間で一致していた。
【0313】
従って、抗体－２バックグラウンドにおけるリード変異体は、抗体－１バックグラウンドにおける同じリード変異体と比較して、ＦｃＲｎ結合、ｐＨ依存性、熱安定性、またはＦｃγＲＩＩＩａ結合に有意に影響を及ぼさない。
【0314】
一実施態様において、ＤＱ（Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ）、ＤＷ（Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗ）及びＹＤ（Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ）変異体を、さらなるＩｇＧ１抗体及び組み換えＦｃフラグメントに組み込んだ：ｍＡｂ２は、ｍＡｂ１と異なる抗原を認識し、そしてＡｂ３はＦｃフラグメントである。各場合に、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合カイネティクス（図
２２）は、溶出ｐＨ、熱安定性及びＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性に加えて高度に類似していた（表２Ｂ、及び表６）。いずれの理論にも束縛されないが、これらの結果は、ＤＱ、ＤＷ及びＹＤ変異体が、それらの改善されたＦｃＲｎ結合特性を、Ｆｃドメインからなるタンパク質に付与するということを示す。
２２）は、溶出ｐＨ、熱安定性及びＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性に加えて高度に類似していた（表２Ｂ、及び表６）。いずれの理論にも束縛されないが、これらの結果は、ＤＱ、ＤＷ及びＹＤ変異体が、それらの改善されたＦｃＲｎ結合特性を、Ｆｃドメインからなるタンパク質に付与するということを示す。
【0315】
【表9】
【0316】
実施例１２：リード変異体はインビボ血漿抗体排出半減期を延長した
ＤＱ、ＤＷ及びＹＤ変異体の薬物動態（ＰＫ）を、カニクイザル及びｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（系統Ｔｇ３２）を用いてＷＴ及びＬＳ対照と比較して、それらの抗体循環半減期について調べた（例えば、Ａｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｍａｂｓ（２０１６）８：１０６４－１０７８を参照のこと）。カニクイザルＦｃＲｎを用いたＦｃＲｎ結合研究は、ｈＦｃＲｎと同様の結合親和性を明らかにした（図２３Ａ－２３Ｂ；表６）。各動物にＷＴ、ＬＳ、ＤＱ、ＤＷまたはＹＤ変異体を静脈注射し、そして抗体濃度を質量分析アプローチにより定量して、サル（図２４Ａ）及びｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（図２４Ｂ）においてクリアランス速度及び血清半減期を決定した。クリアランス速度及び血清半減期は、時間の関数として抗体濃度の非コンパートメントモデルから得た。３つ全てのリード変異体及びＬＳは、サル及びマウスの両方においてＷＴと比較して有意に減少したクリアランス速度を示した（ｐ＜０．００１）。ＷＴ抗体の血漿半減期は、サル及びマウスにおいてそれぞれ９．９±０．５日及び１１．７日であった。さらに、ＬＳベンチマーク及び同定された変異体は、両方の種において野生型と比較して排出半減期の有意な増加を示した（サル及びマウスにおいてそれぞれ２．５倍及び１．７倍の増加）（表７）。ＤＱ、ＤＷ及びＹＤは、ＬＳベンチマークと比較して半減期の同様の延長を示した（表７）。飽和変異誘発により本明細書において同定されたＤＱ、ＤＷ及びＹＤ変異は、マウスおよび非ヒト霊長類動物モデルの両方において、それらのＷＴカウンターパートよりも有意に延長された血漿半減期を示した。
ＤＱ、ＤＷ及びＹＤ変異体の薬物動態（ＰＫ）を、カニクイザル及びｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（系統Ｔｇ３２）を用いてＷＴ及びＬＳ対照と比較して、それらの抗体循環半減期について調べた（例えば、Ａｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｍａｂｓ（２０１６）８：１０６４－１０７８を参照のこと）。カニクイザルＦｃＲｎを用いたＦｃＲｎ結合研究は、ｈＦｃＲｎと同様の結合親和性を明らかにした（図２３Ａ－２３Ｂ；表６）。各動物にＷＴ、ＬＳ、ＤＱ、ＤＷまたはＹＤ変異体を静脈注射し、そして抗体濃度を質量分析アプローチにより定量して、サル（図２４Ａ）及びｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（図２４Ｂ）においてクリアランス速度及び血清半減期を決定した。クリアランス速度及び血清半減期は、時間の関数として抗体濃度の非コンパートメントモデルから得た。３つ全てのリード変異体及びＬＳは、サル及びマウスの両方においてＷＴと比較して有意に減少したクリアランス速度を示した（ｐ＜０．００１）。ＷＴ抗体の血漿半減期は、サル及びマウスにおいてそれぞれ９．９±０．５日及び１１．７日であった。さらに、ＬＳベンチマーク及び同定された変異体は、両方の種において野生型と比較して排出半減期の有意な増加を示した（サル及びマウスにおいてそれぞれ２．５倍及び１．７倍の増加）（表７）。ＤＱ、ＤＷ及びＹＤは、ＬＳベンチマークと比較して半減期の同様の延長を示した（表７）。飽和変異誘発により本明細書において同定されたＤＱ、ＤＷ及びＹＤ変異は、マウスおよび非ヒト霊長類動物モデルの両方において、それらのＷＴカウンターパートよりも有意に延長された血漿半減期を示した。
【0317】
【表10】
【0318】
表７において、クリアランス速度及び血漿半減期を、ｍＡｂ２を使用して決定した。各クリアランス速度及び半減期は、カニクイザルについてｎ＝３の平均であり、そしてｎ＝６ ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスのプールから単一の評価であった。ＷＴに対する倍率及びＬＳに対する倍率は、それぞれＷＴ及びＬＳと比較して相対的改善を示す。＊ＡＤＡ形成のためにｎ＝２、＊＊部分的皮下投与経路のためにｎ＝２
【0319】
実施例１３：ｐＨ６．０及びｐＨ７．４で増強されたＦｃＲｎ結合を有する組み合わせ変異体
実施例２に記載されるようなＯｃｔｅｔスクリーニング（ＢＬＩベースのスクリーニング）に基づいて、様々な単一、二重、三重、及び四重変異体を生成し、そしてｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎへのそれらの結合を評価した（表８）。
実施例２に記載されるようなＯｃｔｅｔスクリーニング（ＢＬＩベースのスクリーニング）に基づいて、様々な単一、二重、三重、及び四重変異体を生成し、そしてｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎへのそれらの結合を評価した（表８）。
【0320】
【表11】
【表12】
【0321】
表８において、様々な単一、二重、三重、及び四重の変異体、さらにはベンチマーク変異体（ＡＡＡ、ＬＳ、ＹＴＥ）についてのｐＨ６．０でのＦｃＲｎに対する結合親和性及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対する定常状態結合を示す。
【0322】
これらの値を図２５にプロットした。図２５は、ｐＨ６．０での結合親和性及びｐＨ７．４でのＲＵを示す。示されるように、ベンチマーク変異体ＬＳは、試験されたベンチマーク変異体（ＡＡＡ、ＬＳ、ＹＴＥ）のうちｐＨ６．０で最も緊密な結合親和性及びｐＨ７．４で最大の残留結合を有していた。
【0323】
図２５に示されるいくつかの組み合わせ変異体が、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４で増強されたＦｃＲｎ結合親和性を示したと決定された。組み合わせ変異体のいずれかがｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で、ＭＳＴ－ＨＮ変異体（本明細書で「ＹＴＥＫＦベンチマーク」と呼ばれ、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｈｉｓ４３３及びＡｓｎ４３４～Ｔｙｒ２５２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｕ２５６、Ｌｙｓ４３３及びＰｈｅ４３４に変異を含有する）よりも緊密な結合を示したか否かを調べるために、以下の方法論の両方を行った。ビオチン化されたヒト、カニクイザル及びマウスＦｃＲｎの捕捉を、ビオチン捕捉（Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ）法（図式については図２６を参照のこと）により行った。ｐＨ６．０について、１０００ｎＭからの一連の濃度（５点）を二連で行った。ｐＨ７．４について、単一の濃度（１０００ ｎＭ）の注射を三連で行った（各ＦｃＲｎの捕捉レベルを１０倍増加させてこのｐＨでの結合を観察した）。結合：１８０秒；解離：３００秒。
【0324】
ＹＴＥＫＦベンチマーク及び様々な組み合わせ変異体のｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎ 結合カイネティクスを図２７に示す。図２７に示されるように、全ての試験した変異体は、野生型（ＷＴ）と比較してヒトＦｃＲｎに対して２桁分より緊密な親和性を示した。
【0325】
図２８Ａ及び２８Ｂは、ＹＴＥＫＦベンチマークと比較したｐＨ６．０（図２８Ａ）及びｐＨ７．４（図２８Ｂ）での組み合わせ変異体のＦｃＲｎ結合カイネティクスを示す。図２８Ａにおいて、変異体の大部分はＹＴＥＫＦベンチマークよりも遅い解離速度を示し、そして同様の又はより遅い結合速度を有していた。図２８Ｂにおいて、ＹＴＥＫＦはｐＨ７．４で有意な結合を示し、そして４つの変異体はより高い残留結合を示す。
【0326】
【表13】
【0327】
表９において、選択組み合わせ変異体、さらにはＹＴＥＫＦベンチマーク及びＷＴについてｐＨ６．０でのＦｃＲｎへの結合親和性及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎへの定常状態結合を示す。
【0328】
図２９は、表９に示される選択組み合わせ抗体についてのｐＨ６．０での結合親和性及びｐＨ７．４でのＲＵの比較を示す。表９及び図２９に示されるように、４つの四重変異体は、ＹＴＥＫＦベンチマークと比較してＦｃＲｎについてｐＨ６．０及びｐＨ７．４でより高い親和性を有することが見いだされた。４つの四重変異体はＴ２５６Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、及びＮ４３４Ｙ変異で有利に働いた。これらの四重変異体は、親和性においてＷＴ及びＹＴＥＫＦよりもそれぞれ約５００倍及び３倍の改善（ｐＨ６．０）を示した。
【0329】
他の特徴づけパラメーター、例えば、熱安定性、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合、及び溶出ｐＨを決定し、そして表１０に示した。
【0330】
【表14】
【0331】
表１０に示されるように、全てのリード四重変異体は、熱的に不安定化されていることが見いだされ、そして減少したＦｃγＲＩＩＩａ結合能を示した。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図12-4】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23-1】
【図23-2】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【手続補正書】
【提出日】2023-12-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）若しくはグルタミン酸（Ｅ）、及び／又はアミノ酸位置３０７にトリプトファン（Ｗ）若しくはグルタミン（Ｑ）
を含み、ここでアミノ酸位置２５４はスレオニン（Ｔ）ではなく、そしてさらに：
アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）若しくはチロシン（Ｙ）；又は
アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）
を含み、
ここでアミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う、
改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
を含み、ここでアミノ酸位置２５４はスレオニン（Ｔ）ではなく、そしてさらに：
アミノ酸位置４３４にフェニルアラニン（Ｆ）若しくはチロシン（Ｙ）；又は
アミノ酸位置２５２にチロシン（Ｙ）
を含み、
ここでアミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う、
改変されたＦｃドメインを含む単離された結合ポリペプチド。
【外国語明細書】