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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024026695
(43)【公開日】2024-02-28
(54)【発明の名称】非特異的な核酸増幅を抑制する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20240220BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240220BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z ZNA
C12N15/09 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024001838
(22)【出願日】2024-01-10
(62)【分割の表示】P 2019176436の分割
【原出願日】2019-09-27
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】山越 奈々
(72)【発明者】
【氏名】山▲崎▼ 友実
(72)【発明者】
【氏名】林 哲太郎
(72)【発明者】
【氏名】二階堂 愛
(57)【要約】
【課題】 ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応において非特異的な核酸増幅を抑制する手法を提供すること。
【解決手段】 本発明は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応で起こり得る非特異的な核酸増幅を抑制する方法を提供する。好ましくは、前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度を０ｍＭより多く５０ｍＭ以下とする。カオトロピック剤は、好ましくはグアニジニウムイオン、尿素イオン、ヨウ化物イオン、リチウムイオン及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種である。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応で起こり得る非特異的な核酸増幅を抑制する方法を提供する。好ましくは、前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度を０ｍＭより多く５０ｍＭ以下とする。カオトロピック剤は、好ましくはグアニジニウムイオン、尿素イオン、ヨウ化物イオン、リチウムイオン及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種である。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅を抑制する方法であって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする方法。
【請求項2】
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に供する鋳型ＲＮＡ含有生体試料を、カオトロピック剤を含む細胞溶解剤で処理することにより、カオトロピック剤を含む鋳型ＲＮＡ含有生体試料液を調製し、該カオトロピック剤を含む鋳型ＲＮＡ含有生体試料液とＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液とを混合することにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中で鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が０ｍＭより多く５０ｍＭ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が０ｍＭより多く２０ｍＭ以下である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
前記カオトロピック剤がグアニジニウムイオン、尿素イオン、ヨウ化物イオン、リチウムイオン及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種類のカオトロピック剤である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記カオトロピック剤がグアニジニウム塩である請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
前記カオトロピック剤がグアニジンチオシアン酸塩である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液が更に無機塩を含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
前記無機塩が、カリウム塩、マンガン塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の安定化方法であって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする、方法。
【請求項11】
カオトロピック剤を含有するＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
【請求項12】
カオトロピック剤を含有する細胞溶解液を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅の抑制方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＲＴ－ＲａｍＤＡ法は、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程により、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる増幅逆転写法である（特許文献１）。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法は従来の逆転写反応よりもｃＤＮＡを１０～１００倍に増加可能であることが報告されている。そのため従来難しかった微量なＲＮＡからの低発現遺伝子の検出や検出遺伝子数の拡充が可能であり、有望な核酸増幅技術として期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第２０１６／０５２６１９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明者等は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行う際に、時に非特異的な核酸増幅が発生して、電気泳動で検出した際に高分子側にスメアリングが認められるケースがあり、このような意図しない非特異的な核酸増幅を抑制する手法の開発が必要であるという知見を得た。理論に束縛されることは望まないが、この非特異的な増幅が発生する一つの原因として、不適切なプライマー同士のアニーリングや異常増幅産物の凝集体の発生によることが想定され得る。そこで、本発明は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法において発生する上記のような非特異的な核酸増幅を抑制するための手段の提供を１つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者等は、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、ＲＴ－ＲａｍＤＡ方法において、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中に鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させてＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことにより、非特異的な核酸増幅反応を抑制できることを見出し、本発明の完成に至った。
【0006】
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
［項１］ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅を抑制する方法であって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする方法。
［項２］ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に供する鋳型ＲＮＡ含有生体試料を、カオトロピック剤を含む細胞溶解剤で処理することにより、カオトロピック剤を含む鋳型ＲＮＡ含有生体試料液を調製し、該カオトロピック剤を含む鋳型ＲＮＡ含有生体試料液とＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液とを混合することにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中で鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させる、項１に記載の方法。
［項３］ 前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が０ｍＭより多く５０ｍＭ以下である、項１又は２に記載の方法。
［項４］ 前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が０ｍＭより多く２０ｍＭ以下である、項１から３のいずれかに記載の方法。
［項５］ 前記カオトロピック剤がグアニジニウムイオン、尿素イオン、ヨウ化物イオン、リチウムイオン及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種類のカオトロピック剤である項１から４のいずれかに記載の方法。
［項６］ 前記カオトロピック剤がグアニジニウム塩である項１から５のいずれかに記載の方法。
［項７］ 前記カオトロピック剤がグアニジンチオシアン酸塩である項１から６のいずれかに記載の方法。
［項８］ 前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液が更に無機塩を含む、項１から７のいずれかに記載の方法。
［項９］ 前記無機塩が、カリウム塩、マンガン塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である、項８に記載の方法。
［項１０］ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の安定化方法であって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする、方法。
［項１１］ カオトロピック剤を含有するＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液を含む、項１から１０のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
［項１２］ カオトロピック剤を含有する細胞溶解液を含む、項１から１０のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
［項１］ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅を抑制する方法であって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする方法。
［項２］ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に供する鋳型ＲＮＡ含有生体試料を、カオトロピック剤を含む細胞溶解剤で処理することにより、カオトロピック剤を含む鋳型ＲＮＡ含有生体試料液を調製し、該カオトロピック剤を含む鋳型ＲＮＡ含有生体試料液とＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液とを混合することにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中で鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させる、項１に記載の方法。
［項３］ 前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が０ｍＭより多く５０ｍＭ以下である、項１又は２に記載の方法。
［項４］ 前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が０ｍＭより多く２０ｍＭ以下である、項１から３のいずれかに記載の方法。
［項５］ 前記カオトロピック剤がグアニジニウムイオン、尿素イオン、ヨウ化物イオン、リチウムイオン及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種類のカオトロピック剤である項１から４のいずれかに記載の方法。
［項６］ 前記カオトロピック剤がグアニジニウム塩である項１から５のいずれかに記載の方法。
［項７］ 前記カオトロピック剤がグアニジンチオシアン酸塩である項１から６のいずれかに記載の方法。
［項８］ 前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液が更に無機塩を含む、項１から７のいずれかに記載の方法。
［項９］ 前記無機塩が、カリウム塩、マンガン塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である、項８に記載の方法。
［項１０］ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の安定化方法であって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする、方法。
［項１１］ カオトロピック剤を含有するＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液を含む、項１から１０のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
［項１２］ カオトロピック剤を含有する細胞溶解液を含む、項１から１０のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
【発明の効果】
【0007】
本発明により、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅反応を効果的に抑制することができる。これにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法における定量性を損なうことなく、再現性が高く、安定したＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方または両方を意味する。
【0010】
一つの実施態様において、本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅を抑制する方法は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法を行うにあたり、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中で鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させてＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことを特徴とする。このようにＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中でカオトロピック剤を共存させて鋳型ＲＮＡからのｃＤＮＡ増幅を行うことにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応で起こり得る非特異的な核酸増幅を、効果的に抑制・低減することができる。また、本発明の方法は、非特異的な核酸増幅を抑えて安定的に再現性良くＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができるという観点から、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の安定化方法ということもできる。
【0011】
・ＲＴ－ＲａｍＤＡ法（鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる増幅逆転写法）
ＲＴ－ＲａｍＤＡ法とは、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含む、核酸の増幅方法である。従って、本発明におけるＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は少なくとも上記の各成分（即ち、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質）を含むものである。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッド鎖のうちのｃＤＮＡ鎖をＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素により無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３’側のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡから剥がされ、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなｃＤＮＡ鎖が合成される。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法の詳細については、米国特許出願公開公報２０１７／０２７５６８５（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ法とは、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含む、核酸の増幅方法である。従って、本発明におけるＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は少なくとも上記の各成分（即ち、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質）を含むものである。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッド鎖のうちのｃＤＮＡ鎖をＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素により無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３’側のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡから剥がされ、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなｃＤＮＡ鎖が合成される。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法の詳細については、米国特許出願公開公報２０１７／０２７５６８５（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
【0012】
一つの実施形態において、本発明は、上記のＲＴ－ＲａｍＤＡ法を行う際に起こり得る非特異的な核酸増幅を抑制することを特徴とする。本明細書において、「非特異的な核酸増幅」とは特に限定されず、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法において正常な特異的増幅産物以外の増幅産物が発生することを指す。例えば、増幅産物の直鎖状多量体（コンカテマー）の形成、増幅産物の直鎖状多量体（コンカテマー）の凝集体の形成、プライマー同士の直鎖状多量体（コンカテマー）の形成、プライマー同士の直鎖状多量体（コンカテマー）の凝集体の形成、プライマーのミスマッチアニーリング形成、及び／又はプライマーダイマー形成等の非特異的な増幅産物の形成が挙げられる。本発明は、上記で列挙した全ての非特異的な増幅産物の形成を抑制するものでなくてもよく、例えば、上記で列挙した非特異的な増幅産物の形成のうちの少なくとも１つの形成を抑制するものであり得る。
本明細書において、非特異的な核酸増幅が抑制されているかどうかの判断基準としては、例えば、カオトロピック剤を使用していない場合と比較して、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中にカオトロピック剤を共存させた場合に、初期鋳型量とＣｔ値との間での直線関係が改善すること、及び／又はＰＣＲ効率が改善すること（例えば、ＰＣＲ効率がより１００％に近付くこと）が挙げられる。
本明細書において、非特異的な核酸増幅が抑制されているかどうかの判断基準としては、例えば、カオトロピック剤を使用していない場合と比較して、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中にカオトロピック剤を共存させた場合に、初期鋳型量とＣｔ値との間での直線関係が改善すること、及び／又はＰＣＲ効率が改善すること（例えば、ＰＣＲ効率がより１００％に近付くこと）が挙げられる。
【0013】
・カオトロピック剤
本発明においては、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中にカオトロピック剤を共存させることを一つの特徴とする。カオトロピック剤は、水素結合、ファンデルワールス力および疎水性効果などの非共有結合力により仲介される分子間相互作用の安定化を阻害する成分をいう。そのためカオトロピック剤は、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの巨大分子の三次元構造を破壊し、それらを変性させることが可能である。従って、過剰量のカオトロピック剤の使用は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に影響を与えることも懸念される。しかしながら、理論には束縛されないが、本発明者らの検討結果から、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に所与の条件でカオトロピック剤を共存させることによって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応において、例えばプライマーのミスアニーリングを防ぐ作用及び／又は異常増幅産物の凝集体等を適切に解す作用等が発揮されて、意図しない非特異的な核酸増幅を抑制でき、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を安定化させることができると推察され得る。
本発明においては、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中にカオトロピック剤を共存させることを一つの特徴とする。カオトロピック剤は、水素結合、ファンデルワールス力および疎水性効果などの非共有結合力により仲介される分子間相互作用の安定化を阻害する成分をいう。そのためカオトロピック剤は、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの巨大分子の三次元構造を破壊し、それらを変性させることが可能である。従って、過剰量のカオトロピック剤の使用は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に影響を与えることも懸念される。しかしながら、理論には束縛されないが、本発明者らの検討結果から、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に所与の条件でカオトロピック剤を共存させることによって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応において、例えばプライマーのミスアニーリングを防ぐ作用及び／又は異常増幅産物の凝集体等を適切に解す作用等が発揮されて、意図しない非特異的な核酸増幅を抑制でき、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を安定化させることができると推察され得る。
【0014】
本発明に用いられ得るカオトロピック剤としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、グアニジニウムイオン、尿素イオン、ヨウ化物イオン、リチウムイオン及びこれらの塩（例えば、塩酸塩、チオシアン酸塩、過塩素酸塩等）からなる群より選択される少なくとも１種を用いることができる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を阻害する影響が比較的小さく、また、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅を高度に抑制できるという観点から、カオトロピック剤としては、グアニジニウムイオン及び／又はその塩を用いるのが好ましく、グアニジニウム塩を用いることがより好ましく、グアニジンチオシアン酸塩及び／又はグアニジン塩酸塩を用いることが更に好ましく、なかでもグアニジンチオシアン酸塩を用いることが特に好ましい。
【0015】
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の添加量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、前述のように過剰量のカオトロピック剤がＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に存在すると、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応が阻害されやすくなる懸念がある。従って、本発明において使用するカオトロピック剤の濃度は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中の終濃度として、例えば、５０ｍＭ以下であることが好ましく、４０ｍＭ以下であることがより好ましく、３０ｍＭ以下であることが更に好ましく、２０ｍＭ以下であることが特に好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度の下限値は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、一例として、０ｍＭより多い量とすることができ、１ｍＭ以上であることが好ましく、３ｍＭ以上であることがより好ましく、５ｍＭ以上であることが更に好ましく、７ｍＭ以上であることが更により好ましく、１０ｍＭ以上であることが特に好ましい。
【0016】
・鋳型ＲＮＡ
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いる鋳型ＲＮＡとしては、組織や細胞から抽出されたＲＮＡ、組織や細胞からの抽出処理後に更に精製されたＲＮＡ（例えば、エタノール沈殿、カラム精製等の当該分野で公知の任意の精製手段により処理された精製ＲＮＡ）等の任意のＲＮＡであり得る。簡便には、鋳型ＲＮＡとして、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法による解析を望む生体試料（細胞や組織等）を細胞溶解剤で溶解した試料（本明細書では、これを「鋳型ＲＮＡ含有生体試料」ともいう）を、更なる抽出・精製工程を経ずに、そのままＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いることもできる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれる鋳型ＲＮＡの量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実に精度よくＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは０．１ｐｇ／μｌ～１０ｎｇ／μｌ、より好ましくは０．１ｐｇ／μｌ～１ｎｇ／μｌとすることができる。本発明において、鋳型ＲＮＡとして「鋳型ＲＮＡ含有生体試料」を用いる場合は、該生体試料中に含まれる鋳型ＲＮＡの量が上記濃度範囲内となるような量で使用すればよい。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いる鋳型ＲＮＡとしては、組織や細胞から抽出されたＲＮＡ、組織や細胞からの抽出処理後に更に精製されたＲＮＡ（例えば、エタノール沈殿、カラム精製等の当該分野で公知の任意の精製手段により処理された精製ＲＮＡ）等の任意のＲＮＡであり得る。簡便には、鋳型ＲＮＡとして、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法による解析を望む生体試料（細胞や組織等）を細胞溶解剤で溶解した試料（本明細書では、これを「鋳型ＲＮＡ含有生体試料」ともいう）を、更なる抽出・精製工程を経ずに、そのままＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いることもできる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれる鋳型ＲＮＡの量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実に精度よくＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは０．１ｐｇ／μｌ～１０ｎｇ／μｌ、より好ましくは０．１ｐｇ／μｌ～１ｎｇ／μｌとすることができる。本発明において、鋳型ＲＮＡとして「鋳型ＲＮＡ含有生体試料」を用いる場合は、該生体試料中に含まれる鋳型ＲＮＡの量が上記濃度範囲内となるような量で使用すればよい。
【0017】
核酸増幅対象となる鋳型ＲＮＡを抽出する細胞・組織の種類は特に制限されず、いかなる種類の細胞・組織であってもよい。例えば、細胞の個数は、セルソーターにより適宜調整することができる。例えば、少数（例えば１～１００個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１又は２個、より好ましくは１個）の細胞から抽出されたＲＮＡを使用することもできる。
細胞からＲＮＡを抽出する方法は、通常、細胞溶解成分を含む細胞溶解剤を用いて、細胞を溶解する工程を含む。
細胞溶解剤は、例えば、細胞溶解成分として界面活性剤を含むもの等であり得る。界面活性剤としては、例えば、アニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム）、カチオン性界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ノニオン性界面活性剤（例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、及び両イオン性界面活性剤（例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸）等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、細胞溶解剤は、細胞溶解成分としてプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＫ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、これら２種以上の組合せ等を任意に含むものであってもよい。更に特定の実施形態では、本発明で用いる細胞溶解剤は、カオトロピック剤（例えば、尿素、過塩素酸リチウム塩、グアニジン塩酸塩等のグアニジニウム塩等）を含んでいてもよいし、他の特定の実施形態では、細胞溶解剤はカオトロピック剤を含まないものであってもよい。細胞溶解剤は、通常、前記のような細胞溶解成分を、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）等の水性溶媒に溶解した水溶液の形態で使用される。
細胞からＲＮＡを抽出する方法は、通常、細胞溶解成分を含む細胞溶解剤を用いて、細胞を溶解する工程を含む。
細胞溶解剤は、例えば、細胞溶解成分として界面活性剤を含むもの等であり得る。界面活性剤としては、例えば、アニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム）、カチオン性界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ノニオン性界面活性剤（例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、及び両イオン性界面活性剤（例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸）等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、細胞溶解剤は、細胞溶解成分としてプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＫ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、これら２種以上の組合せ等を任意に含むものであってもよい。更に特定の実施形態では、本発明で用いる細胞溶解剤は、カオトロピック剤（例えば、尿素、過塩素酸リチウム塩、グアニジン塩酸塩等のグアニジニウム塩等）を含んでいてもよいし、他の特定の実施形態では、細胞溶解剤はカオトロピック剤を含まないものであってもよい。細胞溶解剤は、通常、前記のような細胞溶解成分を、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）等の水性溶媒に溶解した水溶液の形態で使用される。
【0018】
特定の実施形態において、本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、カオトロピック剤を含む細胞溶解剤を用いて生体試料（例えば、細胞、組織等）を溶解して得られる鋳型ＲＮＡ含有生体試料を用いることができる。このようなカオトロピック剤を含む細胞溶解剤で処理して得た鋳型ＲＮＡ含有生体試料は、更なる抽出・精製工程を経ていなければ、そのままカオトロピック剤を含む生体試料液となるため、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液と混合した場合に、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中にカオトロピック剤が持ち込まれることとなる。このようなカオトロピック剤を含む生体試料液を鋳型ＲＮＡ含有生体試料として用いる場合、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に別途、カオトロピック剤を添加する必要がないという利点がある。
【0019】
カオトロピック剤を含む細胞溶解剤で生体試料を溶解して得られる生体試料液を鋳型ＲＮＡ含有生体試料として用いる場合、カオトロピック剤を別途添加しても添加しなくても、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液におけるカオトロピック剤の総量の終濃度が、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは４０ｍＭ以下、更に好ましくは３０ｍＭ以下、特に好ましくは２０ｍＭ以下となるような細胞溶解液を使用することが好ましい。同様に、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液におけるカオトロピック剤の総量の終濃度の下限値が、例えば、０ｍＭより多い量、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは３ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上、更により好ましくは７ｍＭ以上、とりわけ１０ｍＭ以上となるように調整された細胞溶解液を使用することが好ましい。
【0020】
・ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素
ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素は、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を切断する活性を有する酵素であることが好ましい。当該酵素としては、例えば、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、非特異的ＤＮＡ分解酵素を使用することができる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれるＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実に精度よくＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、０．０１Ｕ／μｌ～０．１Ｕ／μｌとすることができる。
ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素は、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を切断する活性を有する酵素であることが好ましい。当該酵素としては、例えば、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、非特異的ＤＮＡ分解酵素を使用することができる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれるＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実に精度よくＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、０．０１Ｕ／μｌ～０．１Ｕ／μｌとすることができる。
【0021】
二本鎖特異的分解酵素（二本鎖特異的ヌクレアーゼ；ＤＳＮとも言う）は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、甲殻類由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。具体的な例としては、以下のものが挙げられる。
・ Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａ ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）ＤＳＮ
・ Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）ｄｓＤＮａｓｅ
・ Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）ＤＳＮ
・ その他のＤＳＮホモログ
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。上記の中では、エビ由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体が好ましい。
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することができる。市販品としては、ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、Ｈｌ－ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、ｄｓＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｓｈｒｉｍｐ ＤＮａｓｅ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄｓＤＮａｓｅ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）などを挙げることができる。
・ Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａ ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）ＤＳＮ
・ Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）ｄｓＤＮａｓｅ
・ Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）ＤＳＮ
・ その他のＤＳＮホモログ
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。上記の中では、エビ由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体が好ましい。
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することができる。市販品としては、ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、Ｈｌ－ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、ｄｓＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｓｈｒｉｍｐ ＤＮａｓｅ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄｓＤＮａｓｅ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）などを挙げることができる。
【0022】
非特異的ＤＮＡ分解酵素としては、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有し、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖、一本鎖ＲＮＡを切断する活性を実質的に有さず、好ましくは、一本鎖ＤＮＡを切断する活性がＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性に比較して低くなる酵素を挙げることができる。非特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。このような非特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することもでき、例えば、ＤＮａｓｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、ＤＮａｓｅＩ）等を用いることが可能である。
非特異的ＤＮＡ分解酵素は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、ほ乳類由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体、より好ましくはウシ由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。
非特異的ＤＮＡ分解酵素は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、ほ乳類由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体、より好ましくはウシ由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。
【0023】
上記改変体とは、天然由来のアミノ酸配列を改変することによって得られる酵素を意味する。具体的には、天然由来のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる酵素、並びに天然由来のアミノ酸配列において１又は数個（例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなる酵素である。
【0024】
・一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は更に、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含んでいてもよい。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、通常、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素とともに使用される。なかでも、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素として、非特異的ＤＮＡ分解酵素を用いる場合に、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含むことが好ましい。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質としては、例えば、Ｔ４ジーン３２プロテイン、ＲｅｃＡ、ＳＳＢ（Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液が一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む場合、その一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の添加量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、１０ｎｇ／μｌ～１００ｎｇ／μｌとすることができる。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は更に、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含んでいてもよい。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、通常、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素とともに使用される。なかでも、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素として、非特異的ＤＮＡ分解酵素を用いる場合に、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含むことが好ましい。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質としては、例えば、Ｔ４ジーン３２プロテイン、ＲｅｃＡ、ＳＳＢ（Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液が一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む場合、その一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の添加量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、１０ｎｇ／μｌ～１００ｎｇ／μｌとすることができる。
【0025】
・プライマー
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いるプライマーとしては、鋳型ＲＮＡに対する特異的なプライマー、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、これら２種以上の組合せが挙げられる。オリゴｄＴプライマーとランダムプライマーとを組み合わせて用いる場合、それらのモル比は、例えば、オリゴｄＴプライマー：ランダムプライマーの比率が１：５～１：１５とすることができ、好ましくは１：８～１：１２である。
ランダムプライマーとしては、例えば、完全ランダムプライマー、ＮＳＲ（Ｎｏｔ Ｓｏ Ｒａｎｄｏｍ）プライマーが挙げられる。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いるプライマーとしては、鋳型ＲＮＡに対する特異的なプライマー、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、これら２種以上の組合せが挙げられる。オリゴｄＴプライマーとランダムプライマーとを組み合わせて用いる場合、それらのモル比は、例えば、オリゴｄＴプライマー：ランダムプライマーの比率が１：５～１：１５とすることができ、好ましくは１：８～１：１２である。
ランダムプライマーとしては、例えば、完全ランダムプライマー、ＮＳＲ（Ｎｏｔ Ｓｏ Ｒａｎｄｏｍ）プライマーが挙げられる。
【0026】
完全ランダムプライマーとは、種々の塩基配列を有するプライマーの混合物であり、各塩基配列は完全にランダムな塩基配列である。完全ランダムプライマーは、ｒＲＮＡ配列と完全に一致する（又は完全に相補的な）配列を含み得る。完全ランダムプライマーとしては、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘキサマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマー、これらの組合せなどが例示できる。例えば、完全ランダムヘキサマーは、４種類のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）で可能な全ての塩基配列（４６種類）の混合物であってもよい。
【0027】
ＮＳＲプライマーとは、完全ランダムプライマーから、ｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するプライマーを除去したものである。除去するｒＲＮＡ配列としては、例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列、２８Ｓ ｒＲＮＡ配列、１２Ｓ ｒＲＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列、これらの組合せが挙げられる。
ＮＳＲプライマーとしては、例えば、完全ランダムヘキサマーからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するヘキサマーを除外したものが挙げられる。また、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマーなどのプライマーセットからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するものを除外したものをＮＳＲプライマーとすることもできる。
このようなＮＳＲプライマーを使うことにより、ｍＲＮＡ等をより高感度に解析することができる。
ＮＳＲプライマーとしては、例えば、完全ランダムヘキサマーからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するヘキサマーを除外したものが挙げられる。また、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマーなどのプライマーセットからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するものを除外したものをＮＳＲプライマーとすることもできる。
このようなＮＳＲプライマーを使うことにより、ｍＲＮＡ等をより高感度に解析することができる。
【0028】
ＮＳＲプライマーの詳細については、１） Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｉｎｇ ｆｏｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｖｏｌ． ６， Ｎｏ． ９， ２００９， ｐｐ． ６４７－６４９、２） Ｏｚｓｏｌａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｔｔｏｍｏｌｅ－ｌｅｖｅｌＲＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ２０， ２０１０， ｐｐ． ５１９－５２５、３） 米国特許出願公開公報２０１０／００２９５１１（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
プライマーの長さは、アニーリングの観点から、例えば５塩基以上、好ましくは６塩基以上であり、合成の観点から、例えば３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、より好ましくは２０塩基以下である。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中における、プライマーの濃度は、特に制限されないが、例えば１～１０μＭ、好ましくは２～６μＭ、より好ましくは３～５μＭである。
プライマーの長さは、アニーリングの観点から、例えば５塩基以上、好ましくは６塩基以上であり、合成の観点から、例えば３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、より好ましくは２０塩基以下である。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中における、プライマーの濃度は、特に制限されないが、例えば１～１０μＭ、好ましくは２～６μＭ、より好ましくは３～５μＭである。
【0029】
・デオキシリボヌクレオチド（基質）
デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが好ましい。デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートとしては、例えば、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）、これらの誘導体、これら２種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物等が好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれるデオキシリボヌクレオチド（基質）の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、０．１～５ｍＭとすることができる。
デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが好ましい。デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートとしては、例えば、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）、これらの誘導体、これら２種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物等が好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれるデオキシリボヌクレオチド（基質）の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、０．１～５ｍＭとすることができる。
【0030】
・ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いるＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素は、逆転写活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）を有する任意のタンパク質（酵素）であって、ＲＮａｓｅＨ活性を有さないものをいう。ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の例としては、例えば、トリ骨髄芽球ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）、ヒト免疫ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＨＩＶ－ＲＴ）、ＥＩＲＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、Ｃ．ヒドロゲノホルマンス（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｇｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）Ｉ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ、これらの変異体、及びこれらの誘導体が挙げられる。これらのうち、ＭＭＬＶ－ＲＴが好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれるＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、０．２～２Ｕ／μｌとすることができる。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いるＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素は、逆転写活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）を有する任意のタンパク質（酵素）であって、ＲＮａｓｅＨ活性を有さないものをいう。ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の例としては、例えば、トリ骨髄芽球ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）、ヒト免疫ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＨＩＶ－ＲＴ）、ＥＩＲＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、Ｃ．ヒドロゲノホルマンス（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｇｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）Ｉ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ、これらの変異体、及びこれらの誘導体が挙げられる。これらのうち、ＭＭＬＶ－ＲＴが好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれるＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、０．２～２Ｕ／μｌとすることができる。
【0031】
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、最初からＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素を含む試薬として提供されてもよいし、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行う前にＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に添加するように用時調製可能なものであってもよい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に用時調製で添加する場合に用いられるＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素は、そのままの状態若しくは凍結乾燥させた状態のものであってもよいし、又は、水（好ましくは、ヌクレアーゼフリー水）で希釈した状態のものであってもよい。例えば、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中のＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写産物の終濃度が上記範囲内となるように、例えば、１／２０～１／３０になるように希釈して用いられるものとすることができる。
【0032】
・無機塩
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、更に無機塩を含むことが好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中で更に無機塩を共存させることにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応をより一層効率的に行うことが可能となる。本発明に用いられ得る無機塩の種類は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、カリウム塩、マンガン塩、及び／又はマグネシウム塩を挙げることができ、好ましくはカリウム塩を挙げることができる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に無機塩を共存させる場合、その反応液中終濃度は特に限定されないが、一例として、２０～１００ｍＭとすることができる。
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、更に無機塩を含むことが好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中で更に無機塩を共存させることにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応をより一層効率的に行うことが可能となる。本発明に用いられ得る無機塩の種類は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、カリウム塩、マンガン塩、及び／又はマグネシウム塩を挙げることができ、好ましくはカリウム塩を挙げることができる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に無機塩を共存させる場合、その反応液中終濃度は特に限定されないが、一例として、２０～１００ｍＭとすることができる。
【0033】
・ＤＮＡポリメラーゼ
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、ＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよいし、含まなくてもよい。本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液がＤＮＡポリメラーゼを含む場合、任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、例えば、下記のようなＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない：Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ（商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、これらの変異体
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、ＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよいし、含まなくてもよい。本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液がＤＮＡポリメラーゼを含む場合、任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、例えば、下記のようなＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない：Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ（商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、これらの変異体
【0034】
・ＲＮａｓｅ阻害剤
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、ＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいてもよい。ＲＮａｓｅ阻害剤は、特に制限されず、例えば、ヒト胎盤由来、ラット肺由来、又はブタ肝臓由来のタンパク質が挙げられる。
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、ＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいてもよい。ＲＮａｓｅ阻害剤は、特に制限されず、例えば、ヒト胎盤由来、ラット肺由来、又はブタ肝臓由来のタンパク質が挙げられる。
【0035】
・添加剤
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、他の添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、緩衝剤、塩、これら２種以上の組合せが挙げられる。
緩衝剤としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビス－トリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、モプス（Ｍｏｐｓ）、テス（Ｔｅｓ）、タプス（Ｔａｐｓ）、ピペス（Ｐｉｐｅｓ）、ギャプス（Ｃａｐｓ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。緩衝剤は、通常、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）に溶解され、水溶液の形態で使用される。
塩としては、例えば、塩化物（例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン）、酢酸塩（例えば、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン）、硫酸塩（例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン）、これら２種以上の組合せが挙げられる。
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、他の添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、緩衝剤、塩、これら２種以上の組合せが挙げられる。
緩衝剤としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビス－トリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、モプス（Ｍｏｐｓ）、テス（Ｔｅｓ）、タプス（Ｔａｐｓ）、ピペス（Ｐｉｐｅｓ）、ギャプス（Ｃａｐｓ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。緩衝剤は、通常、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）に溶解され、水溶液の形態で使用される。
塩としては、例えば、塩化物（例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン）、酢酸塩（例えば、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン）、硫酸塩（例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン）、これら２種以上の組合せが挙げられる。
【0036】
・インキュベーション
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応は、解析対象とする鋳型ＲＮＡと共に、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質、並びに、必要に応じて一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、他の任意の成分を含むＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液を、所定条件下でインキュベーションすることにより核酸増幅反応させる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応におけるインキュベーションは、等温条件で行ってもよいし、熱サイクル条件で行ってもよい。その後、必要に応じて逆転写酵素を失活してもよい。逆転写の失活方法は、特に限定されるわけではないが、例えば、９０～１００℃で所定時間（例えば１～１０分）インキュベーションする方法であってもよい。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応は、解析対象とする鋳型ＲＮＡと共に、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質、並びに、必要に応じて一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、他の任意の成分を含むＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液を、所定条件下でインキュベーションすることにより核酸増幅反応させる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応におけるインキュベーションは、等温条件で行ってもよいし、熱サイクル条件で行ってもよい。その後、必要に応じて逆転写酵素を失活してもよい。逆転写の失活方法は、特に限定されるわけではないが、例えば、９０～１００℃で所定時間（例えば１～１０分）インキュベーションする方法であってもよい。
【0037】
（１）等温条件
インキュベーションを等温条件で行う場合、例えば２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度、好ましくは３０～４５℃の間の所定の温度、より好ましくは３５～４０℃の間の所定の温度、例えば３７℃で所定の時間（例えば５～１８０分、好ましくは１０～１５０分）行うことができる。
２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは、２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～６０分）インキュベーションしてもよい。
２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションの後、例えば５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でインキュベーションしてもよい。５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で５～１５分インキュベーションしてもよい。
インキュベーションを等温条件で行う場合、例えば２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度、好ましくは３０～４５℃の間の所定の温度、より好ましくは３５～４０℃の間の所定の温度、例えば３７℃で所定の時間（例えば５～１８０分、好ましくは１０～１５０分）行うことができる。
２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは、２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～６０分）インキュベーションしてもよい。
２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションの後、例えば５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でインキュベーションしてもよい。５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で５～１５分インキュベーションしてもよい。
【0038】
（２）熱サイクル条件
インキュベーションを熱サイクル条件で行う場合、例えば２０℃以上３０℃未満の間の所定の温度Ｔ１（例えば２５℃）と３０～４５℃の間の所定の温度Ｔ２（例えば３７℃）とを組み合わせて、Ｔ１で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とＴ２で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とを１サイクルとして、これを好ましくは１０～４０サイクル、より好ましくは１５～３５サイクル繰り返して行ってもよい。なお、上記の熱サイクルに先立って、例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば１～５分）インキュベーションしてもよい。また、上記の熱サイクルの後、例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）インキュベーションしてもよい。
インキュベーションを熱サイクル条件で行う場合、例えば２０℃以上３０℃未満の間の所定の温度Ｔ１（例えば２５℃）と３０～４５℃の間の所定の温度Ｔ２（例えば３７℃）とを組み合わせて、Ｔ１で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とＴ２で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とを１サイクルとして、これを好ましくは１０～４０サイクル、より好ましくは１５～３５サイクル繰り返して行ってもよい。なお、上記の熱サイクルに先立って、例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば１～５分）インキュベーションしてもよい。また、上記の熱サイクルの後、例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）インキュベーションしてもよい。
【0039】
本発明による核酸の増幅方法は、微量のＲＮＡ（例えば、１細胞から数百細胞相当の微量ＲＮＡ）を用いたＲＴ－ＰＣＲ法またはＲＴ－ｑＰＣＲ法の一部として使用することができる。
本発明による核酸の増幅方法は、微量のＲＮＡ（例えば、１細胞から数百細胞相当の微量ＲＮＡ）を用いたＲＮＡシーケンス法に利用することができる。
本発明による核酸の増幅方法は、微量のＲＮＡ（例えば、１細胞から数百細胞相当の微量ＲＮＡ）を用いたＲＮＡシーケンス法に利用することができる。
【0040】
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応終了後にＰＣＲ法又はｑＰＣＲ法を行う場合、そのＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中の成分（例えば、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素等の酵素類等）をそのまま含んでいてもよいし、それらの成分を失活させたものであってもよい。これらのＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液は、ＤＮＡ増幅反応を行うための成分（例えば、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼ等）を添加したものであってもよいし、またＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液がＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡ増幅反応に必要な成分を含んでいる場合には、そのＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液はそのままＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液となり得、両組成物は相互に互換可能に呼称され得る。
ＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液等のＤＮＡ増幅のために用いられるプライマーとしては、ＤＮＡ（ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを含む）に対して特異的なプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）が好ましい。
更に、ＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液等のＤＮＡ増幅用組成物は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤、金属イオン（マグネシウムイオンなど）、蛍光色素、蛍光標識したプローブ、これら２種以上の組合せを含んでいてもよい。
ＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液等のＤＮＡ増幅のために用いられるプライマーとしては、ＤＮＡ（ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを含む）に対して特異的なプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）が好ましい。
更に、ＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液等のＤＮＡ増幅用組成物は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤、金属イオン（マグネシウムイオンなど）、蛍光色素、蛍光標識したプローブ、これら２種以上の組合せを含んでいてもよい。
【0041】
ＰＣＲ反応又はｑＰＣＲ反応等でのＤＮＡ増幅を熱サイクル条件で行う場合、その熱サイクル条件下でのインキュベーションは、例えば８０℃以上１００℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば１０～３０秒）と５０～７０℃の間の所定の温度で所定の時間（例えば３０秒～２分）とを１サイクルとして、これを好ましくは１０～５０サイクル、より好ましくは１５～４０サイクル繰り返して行ってもよいが、これらに限定されない。
【0042】
本発明はさらに、上記した本発明の方法に用いられ得る、非特異的な核酸増幅を抑制できるキットに関する。このような本発明のキットは、非特異的な核酸増幅が抑えられて安定して精度よくＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができるＲＮＡ解析キット等として提供され得る。前記のような本発明のキットは、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中に鋳型ＲＮＡとカオトロピック剤とを共存させるように構成されている限り、特に限定されない。例えば、本発明のキットは、カオトロピック剤を含むＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液（例えば、カオトロピック剤を含むプレミックス型ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応用試薬）及び／又はカオトロピック剤を含む細胞溶解液（例えば、カオトロピック剤を含むプレミックス型細胞溶解試薬）を備えたキットであり得る。つまり、カオトロピック剤は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応用試薬及び細胞溶解試薬の一方又は両方に含むことができるが、好ましくは、鋳型ＲＮＡと混合後のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の総量が、終濃度で０ｍＭより多く５０ｍＭ以下になるように調整された量であるのがよい。本発明のキットは、さらに所望により、核酸増幅反応を実施するのに必要な他の試薬、緩衝液など含むものでもよい。他の試薬としては、プライマー、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸などを挙げることができる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液、及び、必要に応じて添付され得る細胞溶解液、他の試薬等は、１つの容器中に全てを含む態様で提供されてもよいし、別々の容器に各試薬を含む態様で提供されてもよい。
【実施例0043】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0044】
実施例１：ＲＴ－ＲａｍＤＡ法におけるグアニジンチオシアネート（グアニジニンチオシアン酸塩）による非特異的な核酸増幅抑制（精製ＲＮＡ ５ｐｇ～１０ｎｇ）
本実施例では、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法におけるカオトロピック剤による非特異的核酸増幅への影響を確認する目的で、以下の試験を行った。
サンプル溶液（ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）に、グアニジンチオシアネートを添加し、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応により１本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。その後、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）にて、グアニジンチオシアネートの有無による増幅曲線の比較を行った。具体的には、以下の手法により行った。
本実施例で用いる核酸断片サンプルは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ５ｐｇ～１０ｎｇを用いた。
このＲＮＡ５ｐｇ～１０ｎｇをＲＴ－ＲａｍＤＡ法で逆転写反応するために、本実施例で使用したサンプル溶液（ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）に含まれる成分とそのサンプル溶液中の終濃度を以下の表１に示す。
本実施例では、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法におけるカオトロピック剤による非特異的核酸増幅への影響を確認する目的で、以下の試験を行った。
サンプル溶液（ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）に、グアニジンチオシアネートを添加し、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応により１本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。その後、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）にて、グアニジンチオシアネートの有無による増幅曲線の比較を行った。具体的には、以下の手法により行った。
本実施例で用いる核酸断片サンプルは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ５ｐｇ～１０ｎｇを用いた。
このＲＮＡ５ｐｇ～１０ｎｇをＲＴ－ＲａｍＤＡ法で逆転写反応するために、本実施例で使用したサンプル溶液（ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）に含まれる成分とそのサンプル溶液中の終濃度を以下の表１に示す。
【表1】
【0045】
精製ＲＮＡを上記組成に添加したサンプル溶液（ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）１０μｌを用いて、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法を行った。この方法では２５℃１０分、３０℃１０分、３７℃３０分、５０℃５分、及び９５℃５分の各等温条件下で反応を行った。
その後、以下の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）にてＤＮＡ量の比較を行った。
具体的には、前述のサンプル溶液（ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）中でＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った後、ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）で５倍希釈し、希釈したサンプル溶液 ２μｌをｑＰＣＲ反応に用いた。このＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後のｑＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、以下の条件で行った。
ｑＰＣＲ反応用溶液［２０μｌ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標） ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ社）、６ｐｍｏｌ フォワードプライマー、６ｐｍｏｌ リバースプライマー、２μｌ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液、ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ］を９５℃１分処理して酵素を活性化したのち、９５℃１５秒の変性及び６０℃１分の伸長反応を４０サイクル行った。
その後、以下の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）にてＤＮＡ量の比較を行った。
具体的には、前述のサンプル溶液（ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）中でＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った後、ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）で５倍希釈し、希釈したサンプル溶液 ２μｌをｑＰＣＲ反応に用いた。このＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後のｑＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、以下の条件で行った。
ｑＰＣＲ反応用溶液［２０μｌ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標） ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ社）、６ｐｍｏｌ フォワードプライマー、６ｐｍｏｌ リバースプライマー、２μｌ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液、ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ］を９５℃１分処理して酵素を活性化したのち、９５℃１５秒の変性及び６０℃１分の伸長反応を４０サイクル行った。
【0046】
融解曲線分析は、９５℃１５秒、６０℃１５秒、及び９５℃１５秒で行った。
標的遺伝子としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるβａｃｔｉｎを使用した。
標的遺伝子としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるβａｃｔｉｎを使用した。
【0047】
各遺伝子のプライマーは、以下のとおりである。
βａｃｔｉｎ（ｍＲＮＡ）
フォワードプライマー：ＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧ（配列番号１）
リバースプライマー：ＣＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＣ（配列番号２）
βａｃｔｉｎ（ｍＲＮＡ）
フォワードプライマー：ＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧ（配列番号１）
リバースプライマー：ＣＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＣ（配列番号２）
【0048】
【0049】
上記表１及び図１の結果に示されるように、グアニジンチオシアネートを添加していない条件１ではＣｔ値として算出できない増幅曲線が発生しており、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応において非特異的な核酸増幅増が発生しており、定量的な測定ができていない。一方でグアニジンチオシアネートを添加した条件２～４では安定した増幅曲線が得られている。ＰＣＲ効率においても条件１に比べ条件２～４のＰＣＲ効率が１００％に近く、非特異的な増幅産物が抑制されていると考えられる。このことからグアニジンチオシアネートにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な増幅が抑制されることが明らかとなった。また、この結果から、鋳型ＲＮＡの量が比較的多い場合（例えば、鋳型ＲＮＡ量が１００ｐｇ～１０ｎｇとなる場合）は、グアニジンチオシアネートの量が少ないとき（例えば、１５ｍＭ以下、又は１０ｍＭ以下のとき）の方が、Ｃｔ値が低くなり、良好な結果を示すことが確認された。
【0050】
なお、上記開示した実施形態および実施例はすべて例示であり制限的なものではない。また、実施形態および実施例に開示された内容を組み合わせた実施形態及び実施例も本発明の範囲に含まれる。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲によって有効であり、特許請求の範囲の記載と均等の意味および範囲内のすべての変更・修正・置き換え等を含むものである。
【産業上の利用可能性】
【0051】
本発明は、微量なＲＮＡからの低発現遺伝子の検出や検出遺伝子数の拡充を可能にするＲＴ－ＲａｍＤＡ方法において、非特異的な核酸増幅を効果的に抑制できので、より一層高精度で安定したＲＮＡ解析が可能となる。
【図1】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅を抑制する方法であって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする方法。