ホーム > 特許ランキング > 高砂熱学工業株式会社
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024026822
(43)【公開日】2024-02-28
(54)【発明の名称】除染効果の判定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/06 20060101AFI20240220BHJP
C12Q 1/26 20060101ALN20240220BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/06
C12Q1/26
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024005402
(22)【出願日】2024-01-17
(62)【分割の表示】P 2019179598の分割
【原出願日】2019-09-30
(71)【出願人】
【識別番号】000169499
【氏名又は名称】高砂熱学工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】高橋 秀人
(72)【発明者】
【氏名】荒川 宏樹
(72)【発明者】
【氏名】五味 弘
(57)【要約】
【課題】短時間かつ高感度に除染効果を判定する方法を提供することを課題とする。
【解決手段】除染中に除染対象空間に設置していたバイオロジカル・インジケーター（ＢＩ）を除染後に回収する工程、前記ＢＩに含まれる生菌を培養する工程、前記培養液中の、生菌外のＡＴＰを除去する工程、前記生菌内のＡＴＰを抽出する工程、及び抽出したＡＴＰを発光させ発光量を測定する工程
を含む、除染効果の判定方法。
【選択図】図１２
【解決手段】除染中に除染対象空間に設置していたバイオロジカル・インジケーター（ＢＩ）を除染後に回収する工程、前記ＢＩに含まれる生菌を培養する工程、前記培養液中の、生菌外のＡＴＰを除去する工程、前記生菌内のＡＴＰを抽出する工程、及び抽出したＡＴＰを発光させ発光量を測定する工程
を含む、除染効果の判定方法。
【選択図】図１２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
除染中に除染対象空間に設置していたバイオロジカル・インジケーター（ＢＩ）を除染後に回収する工程、
前記ＢＩに含まれる生菌を培養する工程、
前記培養液中の、生菌外のＡＴＰを除去する工程、
前記生菌内のＡＴＰを抽出する工程、及び
抽出したＡＴＰを発光させ発光量を測定する工程
を含む、除染効果の判定方法。
前記ＢＩに含まれる生菌を培養する工程、
前記培養液中の、生菌外のＡＴＰを除去する工程、
前記生菌内のＡＴＰを抽出する工程、及び
抽出したＡＴＰを発光させ発光量を測定する工程
を含む、除染効果の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細菌の除染効果を判定する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
医薬品や化粧品等の製造施設や、臨床医学や基礎生化学の実験施設等では、厳密な細菌の除染が求められている。
一般に、二酸化塩素やホルムアルデヒド等のガスを用いて、殺菌・滅菌対象の物を密閉空間に入れたり、実験室や手術室等の空間そのものを殺菌・滅菌対象として閉鎖したりした後、該空間内に前記ガスを発生させて充満させる、燻蒸消毒が行われている。
通常、バイオロジカル・インジケーター（ＢＩ）という細菌を担持したものを除染対象空間に設置しておいて、除染後に回収したＢＩ中の生菌数を計測することにより、除染効果を判定する。
一般に、二酸化塩素やホルムアルデヒド等のガスを用いて、殺菌・滅菌対象の物を密閉空間に入れたり、実験室や手術室等の空間そのものを殺菌・滅菌対象として閉鎖したりした後、該空間内に前記ガスを発生させて充満させる、燻蒸消毒が行われている。
通常、バイオロジカル・インジケーター（ＢＩ）という細菌を担持したものを除染対象空間に設置しておいて、除染後に回収したＢＩ中の生菌数を計測することにより、除染効果を判定する。
【0003】
生菌数の測定方法としては、日本薬局方に規定されている培養法や蛍光活性染色法が行われている（非特許文献１）。
培養法では、培養によって1個の菌が1個のコロニーを形成することを利用して、培養した試料中のコロニー数を試料中の菌数として定量する。しかしながら、検出感度が高い一方、培養時間に約１週間を要するという難点がある。
蛍光活性染色法では、１個の菌をそのまま用いて蛍光染色により検出・定量するため１時間程度で判定ができる。しかしながら、除染現場で実施する方法としては現実的ではない。
また、ガス測定法も生菌の有無を判定する方法として用いられているが（非特許文献１）、培養液の色の変化を確認することにより生菌の有無を判定するにとどまり、生菌数の定量には適さないうえ、２日から２週間程度の培養期間を要するという難点がある。
培養法では、培養によって1個の菌が1個のコロニーを形成することを利用して、培養した試料中のコロニー数を試料中の菌数として定量する。しかしながら、検出感度が高い一方、培養時間に約１週間を要するという難点がある。
蛍光活性染色法では、１個の菌をそのまま用いて蛍光染色により検出・定量するため１時間程度で判定ができる。しかしながら、除染現場で実施する方法としては現実的ではない。
また、ガス測定法も生菌の有無を判定する方法として用いられているが（非特許文献１）、培養液の色の変化を確認することにより生菌の有無を判定するにとどまり、生菌数の定量には適さないうえ、２日から２週間程度の培養期間を要するという難点がある。
【0004】
除染後の効果判定に時間がかかると、除染対象の施設や設備の稼働再開に悪影響が生じるリスクがある。すなわち、判定結果を待っている間は施設や設備の稼働を停止することになり機会損失が生じるし、一方で判定結果を待たずに稼働を再開すると、その後に陽性判定が出た場合に製品を廃棄するなどの損失が生じうる。
これまで、短時間で感度良く除染効果を判定することは需要がありながらも実現されてこなかった。
これまで、短時間で感度良く除染効果を判定することは需要がありながらも実現されてこなかった。
【0005】
ところで、医薬品原料などの生細胞数を高感度に測定する方法として、ＡＴＰ発光計測法が開示されている（特許文献１）。この方法では、生細胞を含みうる試料中の、死細胞に由来するＡＴＰを分解により排除し、かつ生細胞に由来するＡＴＰを増殖させた後に抽出し、蛍光発光を用いてＡＴＰ量を測定することにより、生細胞を計測するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許５９６０４２１号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】第１７改正日本薬局方「生物発光・蛍光法」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、短時間にかつ高感度に除染効果を判定する方法を提供することを課題とする
。
。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記課題を解決するため鋭意研究をしたところ、本発明者らは、除染後に回収したＢＩ中の生菌の有無をＡＴＰ発光計測法を用いて測定することにより、短時間にかつ高感度に除染効果を判定できることに想到し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］除染中に除染対象空間に設置していたバイオロジカル・インジケーター（ＢＩ）を除染後に回収する工程、
前記ＢＩに含まれる生菌を培養する工程、
前記培養液中の、生菌外のＡＴＰを除去する工程、
前記生菌内のＡＴＰを抽出する工程、及び
抽出したＡＴＰを発光させ発光量を測定する工程
を含む、除染効果の判定方法。
［２］前記生菌外のＡＴＰを除去する工程が、ＡＴＰ分解酵素の添加により行われる、［１］に記載の方法。
［３］前記生菌を培養する工程の後、かつ生菌内のＡＴＰを抽出する工程の前に、生菌内のＡＴＰを増加させる工程を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記生菌を培養する工程と同時及び／又は後に、芽胞の発芽を促進させる工程を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］前記生菌を培養する工程において、予め定めておいた陰性・陽性の統計的有意差が表れる時間培養する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ＢＩに担持された菌が芽胞形成菌である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記芽胞形成菌が、バチルス（Bacillus）属細菌及びゲオバチルス（Geobacillus
）属細菌からなる群より選択される、［６］に記載の方法。
［８］ＢＩを設置した除染対象空間に対して、二酸化塩素、過酸化水素、酸化エチレン、ホルムアルデヒド、蒸気、乾熱、及びガンマ線からなる群より選択されるいずれかを用いて除染を行う工程、及び
前記工程の後に、［１］～［７］のいずれかに記載の方法により除染効果を判定する工程を含む、除染方法。
［９］前記除染を行う工程が酸化エチレン、二酸化塩素、又は乾熱を用いて行われる場合に、ＢＩに担持された菌がBacillus atrophaeousであり、
前記除染を行う工程が低温蒸気を用いて行われる場合に、ＢＩに担持された菌がBacillus subtillusであり、
前記除染を行う工程がガンマ線を用いて行われる場合に、ＢＩに担持された菌がBacillus pumilusであり、
前記除染を行う工程が高温蒸気、過酸化水素、又はホルムアルデヒドを用いて行われる場合に、ＢＩに担持された菌がGeobacillus stearothermophilusである、［８］に記載の除染方法。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］除染中に除染対象空間に設置していたバイオロジカル・インジケーター（ＢＩ）を除染後に回収する工程、
前記ＢＩに含まれる生菌を培養する工程、
前記培養液中の、生菌外のＡＴＰを除去する工程、
前記生菌内のＡＴＰを抽出する工程、及び
抽出したＡＴＰを発光させ発光量を測定する工程
を含む、除染効果の判定方法。
［２］前記生菌外のＡＴＰを除去する工程が、ＡＴＰ分解酵素の添加により行われる、［１］に記載の方法。
［３］前記生菌を培養する工程の後、かつ生菌内のＡＴＰを抽出する工程の前に、生菌内のＡＴＰを増加させる工程を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記生菌を培養する工程と同時及び／又は後に、芽胞の発芽を促進させる工程を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］前記生菌を培養する工程において、予め定めておいた陰性・陽性の統計的有意差が表れる時間培養する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ＢＩに担持された菌が芽胞形成菌である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記芽胞形成菌が、バチルス（Bacillus）属細菌及びゲオバチルス（Geobacillus
）属細菌からなる群より選択される、［６］に記載の方法。
［８］ＢＩを設置した除染対象空間に対して、二酸化塩素、過酸化水素、酸化エチレン、ホルムアルデヒド、蒸気、乾熱、及びガンマ線からなる群より選択されるいずれかを用いて除染を行う工程、及び
前記工程の後に、［１］～［７］のいずれかに記載の方法により除染効果を判定する工程を含む、除染方法。
［９］前記除染を行う工程が酸化エチレン、二酸化塩素、又は乾熱を用いて行われる場合に、ＢＩに担持された菌がBacillus atrophaeousであり、
前記除染を行う工程が低温蒸気を用いて行われる場合に、ＢＩに担持された菌がBacillus subtillusであり、
前記除染を行う工程がガンマ線を用いて行われる場合に、ＢＩに担持された菌がBacillus pumilusであり、
前記除染を行う工程が高温蒸気、過酸化水素、又はホルムアルデヒドを用いて行われる場合に、ＢＩに担持された菌がGeobacillus stearothermophilusである、［８］に記載の除染方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、除染後に回収したＢＩ中の生菌の有無を短時間にかつ高感度に測定することにより除染効果を判定できる。特に、１２時間以内という早期判定が実現されることにより、除染対象施設や設備の稼働を妨げて損失が生じることを避けられる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】二酸化塩素ガス発生システムの概略構成の側面図を示す。
【図2】二酸化塩素ガス発生システムの概略構成の上面図を示す。
【図3】二酸化塩素ガス発生装置の概略構成の斜視図を示す。
【図4】二酸化塩素ガス発生装置の概略構成の分解斜視図を示す。
【図5】二酸化塩素ガス発生装置の容器の一例を示す。
【図6】二酸化塩素ガ分解生装置の概略構成の透視図を示す。
【図7】ガス発生システムの動作フローを示す。
【図8】加湿空気の流れを説明する図を示す。
【図9】二酸化塩素ガスの流れを説明する図を示す。
【図10】残留ガスの処理の流れを説明する図を示す。
【図11】培養時間の経過により陽性を説明する図を示す。
【図12】死菌のみを担持したＢＩ（●）と、死菌と生菌とを担持したＢＩ（△）とで、ＡＴＰ発光計測法により測定したＡＴＰ量を比較するグラフ（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明の実施形態について説明する。以下に示す実施形態は、本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の技術的範囲を以下の形態に限定するものではない。
【0013】
本発明の方法は、除染中に除染対象空間に設置していたバイオロジカル・インジケーター（ＢＩ）を除染後に回収する工程、前記ＢＩに含まれる生菌を培養する工程、前記培養液中の、生菌外のＡＴＰを除去する工程、前記生菌内のＡＴＰを抽出する工程、及び抽出したＡＴＰを発光させ発光量を測定する工程を含む。
【0014】
＜ＢＩの回収工程＞
本発明の方法では、まず除染中に除染対象空間に設置していたバイオロジカル・インジケーター（ＢＩ）を除染後に回収する。
除染対象空間は、実験室や製造施設、あるいは除染対象設備を格納した空間等であり、通常は密閉空間で、その中にＢＩが除染中を通して設置される。
本発明の方法では、まず除染中に除染対象空間に設置していたバイオロジカル・インジケーター（ＢＩ）を除染後に回収する。
除染対象空間は、実験室や製造施設、あるいは除染対象設備を格納した空間等であり、通常は密閉空間で、その中にＢＩが除染中を通して設置される。
【0015】
＜除染方法＞
除染法は、特に限定されないが、例えば、二酸化塩素、過酸化水素、酸化エチレン、ホルムアルデヒド、高温蒸気、低温蒸気、乾熱、及びガンマ線からなる群より選択されるいずれかを用いてたものが挙げられる。例えば、二酸化塩素ガスを用いる除染方法では、密閉空間に濃度１０～３００ｐｐｍの二酸化塩素ガスを導入して１～５時間燻煙する。
なお、本明細書において、「除染」の語は「除菌」「滅菌」「減菌」の何れかを指すものであってよい。
除染法は、特に限定されないが、例えば、二酸化塩素、過酸化水素、酸化エチレン、ホルムアルデヒド、高温蒸気、低温蒸気、乾熱、及びガンマ線からなる群より選択されるいずれかを用いてたものが挙げられる。例えば、二酸化塩素ガスを用いる除染方法では、密閉空間に濃度１０～３００ｐｐｍの二酸化塩素ガスを導入して１～５時間燻煙する。
なお、本明細書において、「除染」の語は「除菌」「滅菌」「減菌」の何れかを指すものであってよい。
【0016】
除染法の一例として、二酸化塩素ガスを用いる除染方法について、図面に基づいて説明する。なお、除染方法は、以下に説明する実施形態に限定されるものではない。例えば以下の説明では、滅菌室を例に説明するが、二酸化塩素ガス発生システムは、胞子、カビ、バクテリアなどの殺菌や滅菌、ウイルスの不活化のみならず、チャタテムシなどのような微小昆虫を殺虫する方法であってもよい。この場合、二酸化塩素ガス発生システムはチャタテムシ自体のみならず、その食料源であるカビも殺菌対象とするため、その除染効果をも判定することができる。
【0017】
（二酸化塩素ガス発生システムの構成）
図１は、二酸化塩素ガスを用いる除染方法の一例に係る二酸化塩素ガス発生システム（以下、単にガス発生システムともいう）１００の概略構成の側面図を示す。図２は、二酸化塩素ガス発生システム１００の概略構成の上面図を示す。
図１は、二酸化塩素ガスを用いる除染方法の一例に係る二酸化塩素ガス発生システム（以下、単にガス発生システムともいう）１００の概略構成の側面図を示す。図２は、二酸化塩素ガス発生システム１００の概略構成の上面図を示す。
【0018】
ガス発生システム１００は、箱型の筐体１内に、二酸化塩素ガス発生装置（以下、単にガス発生装置ともいう）２、加湿器３、ファン４、二酸化塩素ガス分解装置（以下、単にガス分解装置ともいう）５、制御装置６を備える。ガス発生システム１００は、燻蒸消毒
の必要な密閉された空間である滅菌室７の壁７１の外側に設けられており、筐体１の下部に設けられた取込口１１から滅菌室７内の空気を取込み、筐体１の上部に設けられた送風口１２から二酸化塩素ガスを滅菌室７に送り出す。滅菌室７の壁７１には、取込口１１及び送風口１２に対応する位置に開口が設けられている。これにより、滅菌室７とガス発生システム１００は、取込口１１及び送風口１２によって連通している。取込口１１から取込まれる空気を性状別にみると、運転態様によりガス発生装置２稼働前の滅菌室７内の空気（二酸化塩素ガスを含まない空気）、ガス発生装置２の稼働中の二酸化塩素ガスを含む空気、ガス発生装置２の稼働後の空気（残存ガスを含む空気）、加湿器３によって加湿された空気が含まれる。送風口１２から送り出される空気には、ガス発生装置２の稼働前、かつ、加湿器３の稼働中の加湿された空気（ここでは循環空気）、ガス発生装置２の稼働中の二酸化塩素ガスを含む空気が含まれる。なお、送風口１２、取込口１１は滅菌室７の壁７１に設けた開口と、ダクトを用いて連通させてもよい。また、ガス発生システム１００は、使用するときのみ設置する構成としてもよく、取り外す際には壁７１の開口を閉塞できるようにしておけばよい。例えば壁７１の開口にダンパなどの開閉可能な装置を設けておけば、ガス発生システム１００を使用するときには送風口１２、取込口１１を壁７１の開口に接続してダンパを開状態とし、使用しないときにはガス発生システム１００を壁７１から取り外しダンパを閉状態とすることもできる。また、二酸化塩素ガス発生システム１００は室内に設置してもよい。この場合、送風口１２を上記のようにガス発生システム１００の上部の側面に設けてもよいし、ガス発生システム１００の上面に設けて上方にガスを送風する構成としてもよい。
の必要な密閉された空間である滅菌室７の壁７１の外側に設けられており、筐体１の下部に設けられた取込口１１から滅菌室７内の空気を取込み、筐体１の上部に設けられた送風口１２から二酸化塩素ガスを滅菌室７に送り出す。滅菌室７の壁７１には、取込口１１及び送風口１２に対応する位置に開口が設けられている。これにより、滅菌室７とガス発生システム１００は、取込口１１及び送風口１２によって連通している。取込口１１から取込まれる空気を性状別にみると、運転態様によりガス発生装置２稼働前の滅菌室７内の空気（二酸化塩素ガスを含まない空気）、ガス発生装置２の稼働中の二酸化塩素ガスを含む空気、ガス発生装置２の稼働後の空気（残存ガスを含む空気）、加湿器３によって加湿された空気が含まれる。送風口１２から送り出される空気には、ガス発生装置２の稼働前、かつ、加湿器３の稼働中の加湿された空気（ここでは循環空気）、ガス発生装置２の稼働中の二酸化塩素ガスを含む空気が含まれる。なお、送風口１２、取込口１１は滅菌室７の壁７１に設けた開口と、ダクトを用いて連通させてもよい。また、ガス発生システム１００は、使用するときのみ設置する構成としてもよく、取り外す際には壁７１の開口を閉塞できるようにしておけばよい。例えば壁７１の開口にダンパなどの開閉可能な装置を設けておけば、ガス発生システム１００を使用するときには送風口１２、取込口１１を壁７１の開口に接続してダンパを開状態とし、使用しないときにはガス発生システム１００を壁７１から取り外しダンパを閉状態とすることもできる。また、二酸化塩素ガス発生システム１００は室内に設置してもよい。この場合、送風口１２を上記のようにガス発生システム１００の上部の側面に設けてもよいし、ガス発生システム１００の上面に設けて上方にガスを送風する構成としてもよい。
【0019】
（ガス発生装置）
次に、図１、図２に加え、図３、図４も参照しながら、ガス発生装置２について説明する。図３は、二酸化塩素ガス発生装置２の概略構成の斜視図を示す。図４は、二酸化塩素ガス発生装置２の概略構成の分解斜視図を示す。ガス発生装置２は、台座２１、ヒータ２２、容器２３、タンク２４、ファンフィルタユニット２５、遮蔽体２６、ヒータの制御装置２７を備える。
次に、図１、図２に加え、図３、図４も参照しながら、ガス発生装置２について説明する。図３は、二酸化塩素ガス発生装置２の概略構成の斜視図を示す。図４は、二酸化塩素ガス発生装置２の概略構成の分解斜視図を示す。ガス発生装置２は、台座２１、ヒータ２２、容器２３、タンク２４、ファンフィルタユニット２５、遮蔽体２６、ヒータの制御装置２７を備える。
【0020】
台座２１は、ヒータ２２や容器２３を支持する。台座２１は、四角形であり、全体として直方体を形成するガス発生装置２の底面を形成する。なお、台座２１の対向する二つの辺には、ガス発生装置２を把持するための把持部２８が設けられている。
【0021】
ヒータ２２は、台座２１の中央部に設けられ、載置される４つの容器２３を加熱する。ヒータ２２は、ガス発生装置の制御装置２７からの電力供給を受け、ガス発生装置の制御装置２７の指示に従って稼働する。ガス発生装置の制御装置２７は、電源、ＣＰＵ、メモリを含み、ＣＰＵがメモリに格納された制御プログラムを実行して、ヒータ２２を制御する。ヒータ２２は、外部からの電力供給を受けるようにし、ガス発生システム１００を制御する制御装置６によって制御してもよい。
【0022】
容器２３には、ペレット状亜塩素酸ナトリウムが投入され、後述するタンク２４を介して酸性液が供給される。なお、ペレット状亜塩素酸ナトリウムは予め容器２３に入れておいてもよいし、電子制御で容器２３に投入される装置を用いてもよい。容器２３が加熱され、容器２３の内部でペレット状亜塩素酸ナトリウムと酸性液とが化学反応し、二酸化塩素ガスが発生する。ここで、図５は、二酸化塩素ガス発生装置の容器の一例を示す。図５に示す容器２３は、仕切り材２３１により、容器２３の内部が複数の部屋２３２に仕切られている。図５では、容器２３は、中央に位置する上面視四角形の中央の部屋２３２ａと、この中央の部屋２３２ａの周囲に位置する４つの周囲の部屋２３２ｂとを備える。仕切り材２３１は、容器２３から取り外し自在である。また、仕切り材２３１には、複数の円形の貫通孔２３３が設けられ、各部屋は連通している。円形の貫通孔２３３は、矩形状、スリットとすることができるが、ペレット状亜鉛酸ナトリウムが通過しない大きさとする
ことが好ましい。ペレット状亜鉛酸ナトリウムは、例えば円柱形状のペレットとすることができる。ペレット状亜鉛酸ナトリウムは、他の形状でもよい。ペレット状亜塩素酸ナトリウムは、亜塩素酸ナトリウム粉末にバインダを混合してペレット錠剤またはタブレット錠剤に加工することにより、任意の大きさ、形状とすることができる。バインダとして、水溶性高分子化合物であるカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコールなどが利用できる。ペレット状亜塩素酸ナトリウムは、固体であるため、保管や運搬等が容易であり、人体に付着しても肌を荒らす心配が少ない。なお、容器２３内への酸性液の供給に先立って、ペレット状亜塩素酸ナトリウムを予め容器２３内に配置しておいてもよい。
ことが好ましい。ペレット状亜鉛酸ナトリウムは、例えば円柱形状のペレットとすることができる。ペレット状亜鉛酸ナトリウムは、他の形状でもよい。ペレット状亜塩素酸ナトリウムは、亜塩素酸ナトリウム粉末にバインダを混合してペレット錠剤またはタブレット錠剤に加工することにより、任意の大きさ、形状とすることができる。バインダとして、水溶性高分子化合物であるカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコールなどが利用できる。ペレット状亜塩素酸ナトリウムは、固体であるため、保管や運搬等が容易であり、人体に付着しても肌を荒らす心配が少ない。なお、容器２３内への酸性液の供給に先立って、ペレット状亜塩素酸ナトリウムを予め容器２３内に配置しておいてもよい。
【0023】
タンク２４は、酸性液を貯留する。貯留された酸性液は、ノズル２９を介して、容器２３に供給される。酸性液は、例えば、リンゴ酸、クエン酸、酢酸などの食用有機酸を用いることができる。これにより、塩酸や硫酸などの酸を用いる場合と比較して、より安全かつ容易に二酸化塩素ガスを発生させることができる。酸性液には、食用の酸性水溶液、例えば、酒石酸、フマル酸、コハク酸、グルコン酸、乳酸、酢酸、アジピン酸、フィチン酸、アスコルビン酸、あるいはこれらの混合物を用いることができる。なお、塩酸や硫酸などの酸を用いる場合には、ｐＨが３以下の酸性液を用いた方がよく、これにより確実かつ迅速に二酸化塩素を発生させることができる。
【0024】
ファンフィルタユニット２５は、容器２３の上方に設けられ、容器２３から発生する二酸化塩素ガスを濾過して粒子状の物質を捕捉し、二酸化塩素ガスを送り出す。ファンフィルタユニット２５は、側面から見ると上からＨＥＰＡフィルタ、内蔵ファンの順に配置され、内蔵ファンは上向き気流が形成されるような羽根形状で設置されている。
【0025】
遮蔽体２６は、四角形の遮蔽体（例えばビニールカーテンなど）が４枚組み合わされることで容器２３の周囲を囲み、台座２１及びファンフィルタユニット２５とともにガス発生装置２の内部空間を形成する。遮蔽体２６の３方向の下部には、ガス発生装置２の内部に周囲の空気を取り込むための隙間３０が設けられている。ファンフィルタユニット２５の内蔵ファンが稼働すると、隙間３０を介して、周囲の空気が取り込まれる。ガス発生装置２で発生した二酸化塩素ガスやミストが隙間３０から漏えいするのを抑制する必要があることから、隙間３０からの空気を取り込む速度を所定以上にする必要がある。例えば、吸引速度は、１５ｃｍ／ｓ以上とすることが好ましく、このような吸引速度を実現できるように、ファンフィルタユニット２５の内蔵ファンの風量、隙間３０の総面積を設定することが好ましい。滅菌室７から取込まれた空気が、取込口１１、ガス発生装置２、ファンフィルタユニット２５、送風口１２を流れる経路は、後述の第一経路に相当する。
【0026】
（加湿器）
加湿器３は、ガス発生装置２の背面に設けられ、滅菌室７から取込まれた空気を加湿する。ここでは、ガス発生装置２への導入空気と加湿器2への導入空気が仕切りで区画され
、両者が各々の流路を形成している。滅菌室７の相対湿度は、取込口１１近傍に設置された湿度センサ９より取得することができる。加湿器３は、外部からの電力供給を受け、制御装置６の指示に従って稼働する。制御装置６は、ＣＰＵ、メモリを含み、ＣＰＵがメモリに格納された制御プログラムを実行し、湿度センサ９で検知された相対湿度に基づいて、加湿器３を制御する。なお、加湿器３を制御する加湿器の制御装置を別途設けてもよい。滅菌室７から取込まれた空気が、取込口１１、加湿器３、送風口１２を流れる経路は、後述の第三経路に相当する。
加湿器３は、ガス発生装置２の背面に設けられ、滅菌室７から取込まれた空気を加湿する。ここでは、ガス発生装置２への導入空気と加湿器2への導入空気が仕切りで区画され
、両者が各々の流路を形成している。滅菌室７の相対湿度は、取込口１１近傍に設置された湿度センサ９より取得することができる。加湿器３は、外部からの電力供給を受け、制御装置６の指示に従って稼働する。制御装置６は、ＣＰＵ、メモリを含み、ＣＰＵがメモリに格納された制御プログラムを実行し、湿度センサ９で検知された相対湿度に基づいて、加湿器３を制御する。なお、加湿器３を制御する加湿器の制御装置を別途設けてもよい。滅菌室７から取込まれた空気が、取込口１１、加湿器３、送風口１２を流れる経路は、後述の第三経路に相当する。
【0027】
（ファン）
ファン４は、ファンフィルタユニット２５と加湿器３の上方（下流）に設けられ、二酸化塩素ガス又は加湿された空気を滅菌室７に向けて水平方向に送り出す。ファン４は、外
部からの電力供給を受け、制御装置６の指示に従って稼働する。制御装置６は、ＣＰＵ、メモリを含み、ＣＰＵがメモリに格納された制御プログラムを実行して、ファン４を制御する。
ファン４は、ファンフィルタユニット２５と加湿器３の上方（下流）に設けられ、二酸化塩素ガス又は加湿された空気を滅菌室７に向けて水平方向に送り出す。ファン４は、外
部からの電力供給を受け、制御装置６の指示に従って稼働する。制御装置６は、ＣＰＵ、メモリを含み、ＣＰＵがメモリに格納された制御プログラムを実行して、ファン４を制御する。
【0028】
（ガス分解装置）
次に、図１、図２に加え、図６も参照しながら、ガス分解装置５について説明する。図６は、二酸化塩素ガス分解装置の概略構成の透視図を示す。ガス分解装置５は、箱型のガス分解装置の筐体５１内に、入口５２、パンチング板などで形成された整流板５６、プレフィルタ５３、メインフィルタ５４、アフターフィルタ５５、整流板５６、ガス分解装置のファン５８、出口５７を空気の流れる順に配置して備え、ガス発生装置２から滅菌室７内に放出された二酸化塩素ガスの残留ガスを取込み、分解する。この入口５２から出口５７までが後述の第二経路を形成する。
次に、図１、図２に加え、図６も参照しながら、ガス分解装置５について説明する。図６は、二酸化塩素ガス分解装置の概略構成の透視図を示す。ガス分解装置５は、箱型のガス分解装置の筐体５１内に、入口５２、パンチング板などで形成された整流板５６、プレフィルタ５３、メインフィルタ５４、アフターフィルタ５５、整流板５６、ガス分解装置のファン５８、出口５７を空気の流れる順に配置して備え、ガス発生装置２から滅菌室７内に放出された二酸化塩素ガスの残留ガスを取込み、分解する。この入口５２から出口５７までが後述の第二経路を形成する。
【0029】
入口５２は、ガス分解装置の筐体５１の滅菌室７側の一方の角部近傍に設けられ、ここではガス発生装置２と上端を接してその下方に配置され、取込口１１と連通しており、滅菌室７の空気を取り込む。
【0030】
プレフィルタ５３は、取込まれた空気の流れにおいて、プレフィルタ５３、メインフィルタ５４、アフターフィルタ５５の中で最上流側に設けられ、取込まれた空気に含まれる埃やごみを捕捉する。プレフィルタ５３は、例えば所謂重量法において捕集率７０％程度の性能を有するものによって構成することができる。
【0031】
メインフィルタ５４は、プレフィルタ５３とアフターフィルタ５５との間、換言すると取込まれた空気の流れにおいて、プレフィルタ５３よりも下流側、かつアフターフィルタ５５よりも上流側に設けられ、取込まれた空気に含まれる二酸化塩素ガス（残存ガス）を分解する。図６に示す例では、メインフィルタ５４は、酸化マンガン粉末や過マンガン酸塩を含有させた活性炭やゼオライトの多孔質の粉末をバインダで粒状ペレットに固めたものが通気性のある板状の基材（ウレタンフォームなど）の表面に固着させたものが、角度を交互に変えて積層され、横断面視において、直線がくり返し屈曲するプリーツ構造を有している。なお、メインフィルタ５４は、通気性のあるハニカム構造体の接ガス表面にバインダで酸化マンガン粉末や過マンガン酸塩を含有させた活性炭やゼオライトの多孔質の粉末を固着したハニカムフィルタとしてもよい。
【0032】
アフターフィルタ５５は、取込まれた空気の流れにおいて、プレフィルタ５３、メインフィルタ５４、アフターフィルタ５５の中で最下流側に設けられ、メインフィルタ５４の粉じん等の飛散を抑制する。二酸化塩素ガス分解装置がクリーンルーム仕様の滅菌室に適用される場合には、アフターフィルタ５５には、ＨＥＰＡ仕様または準ＨＥＰＡ仕様の高性能フィルタが使用することが望ましい。しかし、クリーンルーム以外の低い清浄度の滅菌室に適用する場合には、アフターフィルタ５５は、例えば所謂比色法において捕集率６５％程度の性能を有するものによって構成することができる。
【0033】
整流板５６は、メインフィルタ５４の入口側及びアフターフィルタ５５の出口側に設けられ、取込まれた空気の流れを均一化する。これにより、メインフィルタ５４による二酸化塩素ガスの分解性能がより向上する。なお、整流板５６を入口５２側のみに設置し、ガス分解装置５は、より簡易な構成としてもよい。
【0034】
出口５７は、平面視において、上記入口５２と対角の角部近傍で同一平面に設けられ、加湿器３が設けられた経路と連通している。入口５２と出口が対角に位置することで、所謂ショートサーキットが抑制される。
【0035】
ガス分解装置のファン５８は、滅菌室７の残存ガスをガス分解装置５に引き込み、プレフィルタ５３、メインフィルタ５４、アフターフィルタ５５を通過させる。なお、滅菌室７から取込まれた空気が、入口５２、ガス分解装置５、出口５７を流れる経路は、後述の第二経路に相当する。ファン５８は、ガス分解装置５の下流側に設けることで、ファン５８には二酸化塩素ガスが分解された空気が流れるので、ファン５８が二酸化塩素ガスにより腐食することを防止することができる。
【0036】
なお、ガス発生システム１００は、上記に加えて、ガス発生システム１００を移動させるキャスタ、各フィルタの点検、又は交換などのメンテナンスを行う点検扉を更に備える構成としてもよい。
【0037】
（制御装置）
制御装置６は、ガス発生システム１００の外側に設けられ、操作パネル、ディスプレイ、ＣＰＵ、メモリを含み、ＣＰＵがメモリに格納された制御プログラムを実行して、ガス発生システム１００を制御する。
制御装置６は、ガス発生システム１００の外側に設けられ、操作パネル、ディスプレイ、ＣＰＵ、メモリを含み、ＣＰＵがメモリに格納された制御プログラムを実行して、ガス発生システム１００を制御する。
【0038】
（ガス発生システムの動作）
次に、ガス発生システムの動作について説明する。図７は、ガス発生システムの動作フローを示す。以下の説明では、動作に対応する制御プログラムを制御装置６のメモリに格納しておき、ＣＰＵが制御プログラムを実行し、ガス発生システムを制御する場合を例に説明する。但し、ガス発生システム１００は、ガス発生システムの管理者からの指示をＣＰＵが受け付け、指示に従って、ガス発生システム１００を制御してもよい。
次に、ガス発生システムの動作について説明する。図７は、ガス発生システムの動作フローを示す。以下の説明では、動作に対応する制御プログラムを制御装置６のメモリに格納しておき、ＣＰＵが制御プログラムを実行し、ガス発生システムを制御する場合を例に説明する。但し、ガス発生システム１００は、ガス発生システムの管理者からの指示をＣＰＵが受け付け、指示に従って、ガス発生システム１００を制御してもよい。
【0039】
ステップＳ０１では、加湿器３、ファンフィルタユニット２５、ファン４が稼働する。これら各装置の稼働は、ＣＰＵが、管理者からの指示を受け付けて実行してもよく、また、制御装置６にタイマを内蔵し、所定時間になると自動的に各装置を稼働してもよい。加湿器３などの各装置が稼働するとステップＳ０２へ進む。
【0040】
ステップＳ０２では、滅菌室７内が所定の相対湿度に達すると加湿器３が停止され、ガス発生装置２が稼働する。具体的には、ＣＰＵは、滅菌室７内の相対湿度に関する情報を取得し、既定の相対湿度に達したか否か判断する。例えば、滅菌室７内の相対湿度が５５％～６５％に達すると、既定の相対湿度に達したと判断される。滅菌室７内の相対湿度が既定の相対湿度に達すると、ＣＰＵは加湿器３を停止させ、ガス発生装置２を稼働させる。具体的には、ＣＰＵは、タンク２４に貯留された酸性液をノズル２９を介して容器２３に供給し、かつ、ヒータ２２を稼働させ、容器２３を加熱する。ガス発生装置２が稼働すると、ステップＳ０３へ進む。
【0041】
ステップＳ０３では、滅菌室７内が所定の二酸化塩素ガス濃度、例えば４００ｐｐｍに達すると、ガス発生装置２が停止（すなわちガス発生装置２のヒータ２２を停止）され、所定時間例えば３時間だけ放置される。室内が所定の二酸化塩素濃度に達したことを判定する方法としては、市販の二酸化塩素濃度計を用いることができる。また、室の容積別に予め試験的に求めたガス発生装置を稼働させてから所定の濃度に達するまでの時間に基づいて、ガス発生装置を稼働させてから当該時間が経過したら所定の二酸化塩素濃度に達したと判定してもよい。
【0042】
次に、ステップＳ０４では、分解装置のファン５８が稼働する。具体的には、ＣＰＵは、ガス分解装置のファン５８を所定時間稼働させる。ガス分解装置のファン５８を稼働させる所定時間は、ガス分解装置のファン５８の稼働時間と、二酸化塩素ガスの濃度の減少速度との関係に基づいて、安全濃度になる時間を予め算出することで得ることができる。安全濃度には、ＷＨＯが定める１日８時間作業者が許容される安全な最大濃度０．１ｐｐ
ｍが例示される。例えば、ガス発生システム１００によれば、３００ｐｐｍ以上の濃度の二酸化塩素を３０分程度で０．１ｐｐｍ以下まで低減することができる。以上により、ガス発生システムの動作が終了する。なお、ファン４及びファンフィルタユニット２５は、滅菌室７の使用状況に応じて継続して稼働することができる。
ｍが例示される。例えば、ガス発生システム１００によれば、３００ｐｐｍ以上の濃度の二酸化塩素を３０分程度で０．１ｐｐｍ以下まで低減することができる。以上により、ガス発生システムの動作が終了する。なお、ファン４及びファンフィルタユニット２５は、滅菌室７の使用状況に応じて継続して稼働することができる。
【0043】
（空気の流れ）
次に、空気の流れについて説明する。図８は、加湿空気の流れを説明する図を示す。図８（Ａ）は、ガス発生システム１００の正面図、図８（Ｂ）は、ガス発生システム１００の側面図、図８（Ｃ）は、ガス発生システム１００の背面図を示す。図８（ａ）は図８（Ａ）に対応する上面図、図８（ｂ）は図８（Ｂ）に対応する上面図、図８（ｃ）は図８（Ｃ）に対応する上面図である。
次に、空気の流れについて説明する。図８は、加湿空気の流れを説明する図を示す。図８（Ａ）は、ガス発生システム１００の正面図、図８（Ｂ）は、ガス発生システム１００の側面図、図８（Ｃ）は、ガス発生システム１００の背面図を示す。図８（ａ）は図８（Ａ）に対応する上面図、図８（ｂ）は図８（Ｂ）に対応する上面図、図８（ｃ）は図８（Ｃ）に対応する上面図である。
【0044】
図８は、上述したステップＳ０１における状態を示し、加湿器３、ファンフィルタユニット２５、ファン４が稼働している。そのため、滅菌室７内から取込まれた空気は、取込口１１、非稼働のガス発生装置２、ファンフィルタユニット２５、送風口１２を流れる第一経路と、取込口１１、加湿器３、送風口１２を流れる第三経路を循環する。第一経路では、ファンフィルタユニット２５の内蔵ファンが稼働すると、３方向に形成された隙間３０を介して、周囲の空気が取り込まれ、滅菌室７からの空気が第一経路を通る。第一経路を通る空気は、ファンフィルタユニット２５を通過することで不純物が捕捉される。また、第三経路を通る空気が、第一経路のうちガス発生装置２の外側と空気取り入れ流路を共有し、加湿器３によって加湿されることで、滅菌室７内の相対湿度が徐々に高まる。
【0045】
図９は、二酸化塩素ガスの流れを説明する図を示す。図９（Ａ）は、ガス発生システム１００の正面図、図９（Ｂ）は、ガス発生システム１００の側面図、図９（Ｃ）は、ガス発生システム１００の背面図を示す。図９（ａ）は図９（Ａ）に対応する上面図、図９（ｂ）は図９（Ｂ）に対応する上面図、図９（ｃ）は図９（Ｃ）に対応する上面図である。
【0046】
図９は、上述したステップＳ０２における状態を示し、ファンフィルタユニット２５、ファン４に加えて、ガス発生装置２が稼働している。図８の例と同様に、滅菌室７内から取込まれた空気は、第一経路と、第三経路を循環する。但し、ガス発生装置２が稼働しているため、ガス発生装置２で発生した二酸化塩素ガスが第一経路を通る。また、ファンフィルタユニット２５では、二酸化塩素ガスに含まれる不純物も捕捉される。また、加湿器３が停止しているため、第三経路を通る空気は、加湿されることなく、第三経路を単に通過する。
【0047】
図１０は、残留ガスの処理の流れを説明する図を示す。図１０（Ａ）は、ガス発生システム１００の正面図、図１０（Ｂ）は、ガス発生システム１００の側面図、図１０（Ｃ）は、ガス発生システム１００の背面図を示す。図１０（ａ）は図１０（Ａ）に対応する上面図、図１０（ｂ）は図１０（Ｂ）に対応する上面図、図１０（ｃ）は図１０（Ｃ）に対応する上面図である。
【0048】
図１０は、上述したステップＳ０４における状態を示し、ファンフィルタユニット２５、ファン４に加えて、ガス分解装置のファン５８が稼働している。そのため、滅菌室７内から取込まれた空気は、第一経路と、取込口１１、第一経路の入口側と連通した入口５２、ガス分解装置５、第三経路の入口近くと連通した出口５７を流れる第二経路を循環する。但し、ガス発生装置２が非稼働であるため、第一経路を通る空気は、新たな化学物質を付与されずファンフィルタユニット２５を通過することで不純物が捕捉される。また、第二経路を通る空気は、ガス分解装置５を通過することで、残存ガスが分解される。
【0049】
（効果）
以上、説明した二酸化塩素ガス発生システム１００は、ガス発生装置２を備えることで、他の塩素、次亜塩素酸ソーダ、過酸化水素と比較して、殺菌や滅菌をより安全に実施することができる。また、二酸化塩素ガスは、塩素のような強い臭いがしないことから、殺菌や滅菌を実施する際の臭いの不快感を低減することができる。更に、二酸化塩素ガスは、単位重量当たりの殺菌力が高く、胞子、かび、バクテリア、ウイルス等に優れた滅菌および殺菌効果を発揮し、発がん性物質を生成することもない。また、ガス発生システム１００は、ガス分解装置５を備えることで、二酸化塩素ガスを従来よりも短時間で分解することができる。メインフィルタ５４に酸化マンガン粉末や過マンガン酸塩を含有させた活性炭やゼオライトの多孔質の粉末を含んだ濾材を用いることで、従来の活性炭と比較して、二酸化塩素ガスの分解性能をより向上し、安全濃度になるまでの分解時間をより短くすることができる。
以上、説明した二酸化塩素ガス発生システム１００は、ガス発生装置２を備えることで、他の塩素、次亜塩素酸ソーダ、過酸化水素と比較して、殺菌や滅菌をより安全に実施することができる。また、二酸化塩素ガスは、塩素のような強い臭いがしないことから、殺菌や滅菌を実施する際の臭いの不快感を低減することができる。更に、二酸化塩素ガスは、単位重量当たりの殺菌力が高く、胞子、かび、バクテリア、ウイルス等に優れた滅菌および殺菌効果を発揮し、発がん性物質を生成することもない。また、ガス発生システム１００は、ガス分解装置５を備えることで、二酸化塩素ガスを従来よりも短時間で分解することができる。メインフィルタ５４に酸化マンガン粉末や過マンガン酸塩を含有させた活性炭やゼオライトの多孔質の粉末を含んだ濾材を用いることで、従来の活性炭と比較して、二酸化塩素ガスの分解性能をより向上し、安全濃度になるまでの分解時間をより短くすることができる。
【0050】
＜培養工程＞
次いで、ＢＩに含まれる生菌を培養する工程を行う。培養は、通常用いられる、培地、温度、時間等の条件で行うことができる。
次いで、ＢＩに含まれる生菌を培養する工程を行う。培養は、通常用いられる、培地、温度、時間等の条件で行うことができる。
【0051】
培養時間は、後述のＡＴＰ発光量の測定において陰性と陽性とに統計的有意差が表れる時間を、予め調整して定めておいて、その時間培養することが好ましい。
図１１を参照して説明すると、ある時点でのＡＴＰ発光量は、正規分布の出現確率（出現割合）となる。培養時間が短い段階では、生菌の増加が十分ではないため、正規分布の山が陰性と陽性とで重なり、偽陽性や偽陰性が生じる場合がある。培養時間を長くすることにより、陰性と陽性とで正規分布の山が分離し、陰性・陽性判定の精度が上がる。一方で、培養時間を長く設けることで、迅速な効果判定が達成されない場合がある。そこで、予め、十分なサンプル数の陽性対照及び陰性対照のサンプルで、培養時間ごとのＡＴＰ発光量の検量線を作成し、適切な統計処理を行って、所望の精度で陰性と陽性が統計的有意差をもって区別されるのに必要な培養時間（最小時間）を算出しておく。
図１１を参照して説明すると、ある時点でのＡＴＰ発光量は、正規分布の出現確率（出現割合）となる。培養時間が短い段階では、生菌の増加が十分ではないため、正規分布の山が陰性と陽性とで重なり、偽陽性や偽陰性が生じる場合がある。培養時間を長くすることにより、陰性と陽性とで正規分布の山が分離し、陰性・陽性判定の精度が上がる。一方で、培養時間を長く設けることで、迅速な効果判定が達成されない場合がある。そこで、予め、十分なサンプル数の陽性対照及び陰性対照のサンプルで、培養時間ごとのＡＴＰ発光量の検量線を作成し、適切な統計処理を行って、所望の精度で陰性と陽性が統計的有意差をもって区別されるのに必要な培養時間（最小時間）を算出しておく。
【0052】
本発明の方法における培養工程を行うに際しては、少なくともかかる最小時間培養すればよい。
また、複数のＢＩを用いて、かかる最小時間の経過前から、後述の培養工程以降の工程から測定工程までを経時的に行ってもよい。ＡＴＰ発光量が上昇傾向の場合は陽性の可能性が高く、一定または下降傾向の場合は、陰性の可能性が高い。それにより、統計的有意差が表れるのに必要な培養時間が経過するよりも前に、いち早く陰性・陽性の判定結果を手に入れることができる。
また、複数のＢＩを用いて、かかる最小時間の経過前から、後述の培養工程以降の工程から測定工程までを経時的に行ってもよい。ＡＴＰ発光量が上昇傾向の場合は陽性の可能性が高く、一定または下降傾向の場合は、陰性の可能性が高い。それにより、統計的有意差が表れるのに必要な培養時間が経過するよりも前に、いち早く陰性・陽性の判定結果を手に入れることができる。
【0053】
なお、出現確率（出現割合）の正規分布の山をシャープにすることにより、陰性と陽性との山の裾野が重なりにくくなり明確に区別しやすくなる。測定サンプル数（ｎ数）を多くすることにより、正規分布の山をシャープにすることができる。
【0054】
＜生菌外ＡＴＰ除去工程＞
前記培養工程と同時に、又は前記培養工程に次いで、前記培養液中の、生菌外のＡＴＰを除去する工程を行う。
生菌外のＡＴＰの除去は、ＡＴＰ分解酵素の添加により行うことが好ましい。分解酵素は、当技術分野で公知であり、公知のATP分解酵素を単独で又は組み合わせて、適当な反
応条件（時間、温度及びpH）で使用することができる。具体的には、特許第３５４７８８２号に記載のＡＴＰ分解酵素、例えばアデノシンリン酸デアミナーゼ、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、アデノシントリホスファターゼなどが挙げられる。また、ＡＴＰ発光計測法を実施するためのキットが市販されており、キット添付のＡＴＰ分解酵素を使用することができる。
酵素反応は、使用するＡＴＰ分解酵素の種類、測定対象の菌種などに応じて異なるが、
25～50℃、好ましくは30～45℃において、1分以上、好ましくは1分～6時間、より好まし
くは5分～2時間かけて行う。
前記培養工程と同時に、又は前記培養工程に次いで、前記培養液中の、生菌外のＡＴＰを除去する工程を行う。
生菌外のＡＴＰの除去は、ＡＴＰ分解酵素の添加により行うことが好ましい。分解酵素は、当技術分野で公知であり、公知のATP分解酵素を単独で又は組み合わせて、適当な反
応条件（時間、温度及びpH）で使用することができる。具体的には、特許第３５４７８８２号に記載のＡＴＰ分解酵素、例えばアデノシンリン酸デアミナーゼ、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、アデノシントリホスファターゼなどが挙げられる。また、ＡＴＰ発光計測法を実施するためのキットが市販されており、キット添付のＡＴＰ分解酵素を使用することができる。
酵素反応は、使用するＡＴＰ分解酵素の種類、測定対象の菌種などに応じて異なるが、
25～50℃、好ましくは30～45℃において、1分以上、好ましくは1分～6時間、より好まし
くは5分～2時間かけて行う。
【0055】
＜生菌内ＡＴＰ増加工程＞
好ましい態様では、生菌を培養する工程の後、かつ生菌内のＡＴＰを抽出する工程の前に、生菌内のＡＴＰを増加させる工程を行う。より好ましい態様では、生菌内のＡＴＰを増加させる工程は、生菌外のＡＴＰを除去する工程と同時に行われる。
ＡＴＰの増加は、メタノール、糖、アラニン、硝酸カリウム、又はこれらの組み合わせ等を添加することにより行うことができる。
添加するメタノールの濃度は、最終濃度50％未満、好ましくは0.1～30％、より好まし
くは0.1～5％、例えば1％である。
糖としては、グルコース、フルクトース及びスクロースからなる群より選択される少なくとも1つを用いることができる。糖は、最終濃度が0.8 mM以下、好ましくは0.1 mM以下
となるように添加する。
アラニンは、最終濃度が0.5 mM以下、好ましくは0.1 mM以下となるように添加する。
好ましい実施形態では、メタノールの最終濃度が1％であり、糖の最終濃度が0.1 mMで
あり、アラニンの最終濃度が0.1 mMである。
好ましい態様では、生菌を培養する工程の後、かつ生菌内のＡＴＰを抽出する工程の前に、生菌内のＡＴＰを増加させる工程を行う。より好ましい態様では、生菌内のＡＴＰを増加させる工程は、生菌外のＡＴＰを除去する工程と同時に行われる。
ＡＴＰの増加は、メタノール、糖、アラニン、硝酸カリウム、又はこれらの組み合わせ等を添加することにより行うことができる。
添加するメタノールの濃度は、最終濃度50％未満、好ましくは0.1～30％、より好まし
くは0.1～5％、例えば1％である。
糖としては、グルコース、フルクトース及びスクロースからなる群より選択される少なくとも1つを用いることができる。糖は、最終濃度が0.8 mM以下、好ましくは0.1 mM以下
となるように添加する。
アラニンは、最終濃度が0.5 mM以下、好ましくは0.1 mM以下となるように添加する。
好ましい実施形態では、メタノールの最終濃度が1％であり、糖の最終濃度が0.1 mMで
あり、アラニンの最終濃度が0.1 mMである。
【0056】
＜発芽促進工程＞
好ましい態様では、生菌を培養する工程と同時及び／又は後に、発芽を促進させる工程を行う。
発芽の促進は、糖、アラニン、硝酸カリウム、又はこれらの組み合わせ等を添加することにより行うことができる。
糖としては、グルコース、フルクトース及びスクロースからなる群より選択される少なくとも1つを用いることができる。糖は、最終濃度が0.8 mM以下、好ましくは0.1 mM以下
となるように添加する。
アラニンは、最終濃度が0.5 mM以下、好ましくは0.1 mM以下となるように添加する。
硝酸カリウムは、最終濃度が0.5 mM以下、好ましくは0.1 mM以下となるように添加する。
好ましい実施形態では、糖の最終濃度が0.1 mMであり、アラニンの最終濃度が0.1 mMであり、硝酸カリウムの最終濃度が0.1 mMである。
また、培養工程で使用する培地（ＳＣＤ培地など）に、グルコースなどの糖が既に含まれている場合は、発芽促進工程において糖を添加しなくてもよい。
なお、前述のＡＴＰ増加工程と発芽促進工程においては、一方の工程の操作により、他方の工程の効果が得られることは妨げられない。
好ましい態様では、生菌を培養する工程と同時及び／又は後に、発芽を促進させる工程を行う。
発芽の促進は、糖、アラニン、硝酸カリウム、又はこれらの組み合わせ等を添加することにより行うことができる。
糖としては、グルコース、フルクトース及びスクロースからなる群より選択される少なくとも1つを用いることができる。糖は、最終濃度が0.8 mM以下、好ましくは0.1 mM以下
となるように添加する。
アラニンは、最終濃度が0.5 mM以下、好ましくは0.1 mM以下となるように添加する。
硝酸カリウムは、最終濃度が0.5 mM以下、好ましくは0.1 mM以下となるように添加する。
好ましい実施形態では、糖の最終濃度が0.1 mMであり、アラニンの最終濃度が0.1 mMであり、硝酸カリウムの最終濃度が0.1 mMである。
また、培養工程で使用する培地（ＳＣＤ培地など）に、グルコースなどの糖が既に含まれている場合は、発芽促進工程において糖を添加しなくてもよい。
なお、前述のＡＴＰ増加工程と発芽促進工程においては、一方の工程の操作により、他方の工程の効果が得られることは妨げられない。
【0057】
これらの工程の後、メタノール、糖、アラニン、硝酸カリウム等をフィルタでろ過して除く工程を行ってもよい。
【0058】
＜ＡＴＰ抽出工程＞
次いで、前記生菌内のＡＴＰを抽出する工程を行う。この工程は、生菌の細胞壁を破壊して生菌内からＡＴＰを遊離させるものである。
生菌内ＡＴＰの抽出方法としては、公知の方法、例えば、試料にＡＴＰ抽出液を添加し、生菌内ＡＴＰを菌体外に抽出する方法を用いることができる。ＡＴＰ抽出液は、生菌内からＡＴＰを抽出することができるものであれば限定されるものではなく、さらにＡＴＰ分解酵素を失活できるものも知られている。そのようなＡＴＰ抽出液は公知であり、市販されている。例えば、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、界面活性剤（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなど）、リゾチームなどが挙げられる。使用するＡＴＰ抽出液の種類に応じて、試料への添加量、反応条件などを適宜選択する。
次いで、前記生菌内のＡＴＰを抽出する工程を行う。この工程は、生菌の細胞壁を破壊して生菌内からＡＴＰを遊離させるものである。
生菌内ＡＴＰの抽出方法としては、公知の方法、例えば、試料にＡＴＰ抽出液を添加し、生菌内ＡＴＰを菌体外に抽出する方法を用いることができる。ＡＴＰ抽出液は、生菌内からＡＴＰを抽出することができるものであれば限定されるものではなく、さらにＡＴＰ分解酵素を失活できるものも知られている。そのようなＡＴＰ抽出液は公知であり、市販されている。例えば、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、界面活性剤（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなど）、リゾチームなどが挙げられる。使用するＡＴＰ抽出液の種類に応じて、試料への添加量、反応条件などを適宜選択する。
【0059】
また、ＡＴＰ抽出と同時または先んじて、ＡＴＰ分解酵素を周知の適当な手法で除去又
は失活させることが好ましい。例えば、フィルタによるろ過で酵素を除去してもよいし、ＡＴＰ分解酵素の阻害剤を添加することが挙げられる。ただし、ＡＴＰ除去工程からＡＴＰ抽出工程を３０分以内に行えば、ＡＴＰ分解酵素が生菌内ＡＴＰに作用する前に生菌内ＡＴＰの抽出を行えるので、酵素の除去工程又は失活工程を省くことができる。
は失活させることが好ましい。例えば、フィルタによるろ過で酵素を除去してもよいし、ＡＴＰ分解酵素の阻害剤を添加することが挙げられる。ただし、ＡＴＰ除去工程からＡＴＰ抽出工程を３０分以内に行えば、ＡＴＰ分解酵素が生菌内ＡＴＰに作用する前に生菌内ＡＴＰの抽出を行えるので、酵素の除去工程又は失活工程を省くことができる。
【0060】
＜測定工程＞
次いで、抽出したＡＴＰを発光させ発光量を測定する工程を行う。
抽出したＡＴＰを発光させ、測定するには、ＡＴＰ発光計測法において一般的に採用されている方法、例えば、ルシフェリン－ルシフェラーゼ発光反応を利用することができる。ルシフェリン－ルシフェラーゼ発光反応は、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含む発光試薬を試料に添加して行う。発光試薬と抽出されたＡＴＰとが反応して発光が生じるため、その発光量を測定する。発光試薬としては、天然型ルシフェラーゼ及び変異型ルシフェラーゼのいずれでもよく、市販品を用いることができる。
次いで、抽出したＡＴＰを発光させ発光量を測定する工程を行う。
抽出したＡＴＰを発光させ、測定するには、ＡＴＰ発光計測法において一般的に採用されている方法、例えば、ルシフェリン－ルシフェラーゼ発光反応を利用することができる。ルシフェリン－ルシフェラーゼ発光反応は、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含む発光試薬を試料に添加して行う。発光試薬と抽出されたＡＴＰとが反応して発光が生じるため、その発光量を測定する。発光試薬としては、天然型ルシフェラーゼ及び変異型ルシフェラーゼのいずれでもよく、市販品を用いることができる。
【0061】
発光の測定は、当技術分野で公知の発光測定方法により、例えばルミノメーター、発光プレートリーダーを用いて、又は光電子増倍管を用いたフォトンカウンティングにより実施することができる。発光量を測定することにより、ＢＩ中の生菌を測定することができる。なお、本発明において「生菌の測定」とは、ＢＩ中の生菌の存在を検出すること、及び／又は生菌の数を測定することを意味する。本発明の方法により、ＢＩ中の生菌を高感度、例えば1 mol/CFUを超えるATP内包量で、測定することが可能である。
【0062】
本発明において、培養工程より後の一連の工程は、１つのチューブ内で連続的に行ってもよい。例えば、上下二層に区切られたチューブの下層には発光試薬を収納し、上層にはＡＴＰ抽出試薬を収納したチューブを用いる。まず、任意の時間で採取し生菌外ＡＴＰ消去液を添加した培養液を、上層のＡＴＰ抽出試薬に添加して抽出工程を行う。さらに、上下二層を区切る隔壁を破壊するなどして、下層の発光試薬と混和することにより発光工程を行う。そのようなチューブとしては、ルシパックPen-AQUA（キッコーマンバイオケミファ株式会社）等の市販品を用いることもできる。
このように１つのチューブ内で連続的に工程を行うことにより、本発明の方法を自動化することができる。また、これにより、培養時間の経過によるＡＴＰ値の変化を効率的に観察することができる。
このように１つのチューブ内で連続的に工程を行うことにより、本発明の方法を自動化することができる。また、これにより、培養時間の経過によるＡＴＰ値の変化を効率的に観察することができる。
【0063】
＜対象菌＞
本発明におけるＢＩに担持された菌は、特に限定されないが芽胞形成菌であることが好ましい。芽胞形成菌としては、例えば、バチルス（Bacillus）属細菌やゲオバチルス（Geobacillus）属細菌が挙げられ、より具体的にはBacillus atrophaeous、Bacillus subtillus、Bacillus pumilus、Geobacillus stearothermophilus等が挙げられる。例えば市販
の「Mesalabs社製：ACD/6」はBacillus atrophaeousが担持されているので、これを使用
してもよい。
具体的な除染方法と、その効果判定に用いるＢＩに担持される菌との組み合わせとしては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない。酸化エチレン、二酸化塩素、又は乾熱による除染方法の場合は、Bacillus atrophaeousがＢＩに担持されることが好ましい。低温蒸気による除染方法の場合は、Bacillus subtillusがＢＩに担持されることが好ましい。ガンマ線による除染方法の場合は、Bacillus pumilusがＢＩに担持されることが好ましい。高温蒸気、過酸化水素、ホルムアルデヒドによる除染方法の場合は、Geobacillus stearothermophilusがＢＩに担持されることが好ましい。
本発明におけるＢＩに担持された菌は、特に限定されないが芽胞形成菌であることが好ましい。芽胞形成菌としては、例えば、バチルス（Bacillus）属細菌やゲオバチルス（Geobacillus）属細菌が挙げられ、より具体的にはBacillus atrophaeous、Bacillus subtillus、Bacillus pumilus、Geobacillus stearothermophilus等が挙げられる。例えば市販
の「Mesalabs社製：ACD/6」はBacillus atrophaeousが担持されているので、これを使用
してもよい。
具体的な除染方法と、その効果判定に用いるＢＩに担持される菌との組み合わせとしては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない。酸化エチレン、二酸化塩素、又は乾熱による除染方法の場合は、Bacillus atrophaeousがＢＩに担持されることが好ましい。低温蒸気による除染方法の場合は、Bacillus subtillusがＢＩに担持されることが好ましい。ガンマ線による除染方法の場合は、Bacillus pumilusがＢＩに担持されることが好ましい。高温蒸気、過酸化水素、ホルムアルデヒドによる除染方法の場合は、Geobacillus stearothermophilusがＢＩに担持されることが好ましい。
【0064】
＜判定＞
ＡＴＰ発光量により測定されたＢＩ中の生菌量に基づき、予め定めておいた閾値を基準として、陰性／陽性の判定を行い、除染の効果を評価する。閾値は、除染対象に応じて、
任意に定めることができる。
ＡＴＰ発光量により測定されたＢＩ中の生菌量に基づき、予め定めておいた閾値を基準として、陰性／陽性の判定を行い、除染の効果を評価する。閾値は、除染対象に応じて、
任意に定めることができる。
【0065】
本発明の方法を用いることにより、除染後のＢＩに含まれる生菌を、短時間、例えば１２時間以内に高感度に検出し測定することができるため、除染効果の判定に非常に有効である。
【実施例0066】
以下に本発明を具体的に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0067】
以下の操作は、コンタミネーションが起こらないように、全て安全キャビネット内で行った。
（１）バイオロジカルインジケータ（ＢＩ）作成
０．１ｍＬ当たり１０６ＣＦＵのBacillus atrophaeusを含む40 vol％エタノールベー
スの芽胞菌懸濁液（Mesalabs社製：SSGE/6）を、ポリスチレン製滅菌シャーレに０．１ｍＬ滴下し、そのまま蓋をして２４±１℃で１２時間乾燥することにより、ＢＩシャーレを作製した。
（１）バイオロジカルインジケータ（ＢＩ）作成
０．１ｍＬ当たり１０６ＣＦＵのBacillus atrophaeusを含む40 vol％エタノールベー
スの芽胞菌懸濁液（Mesalabs社製：SSGE/6）を、ポリスチレン製滅菌シャーレに０．１ｍＬ滴下し、そのまま蓋をして２４±１℃で１２時間乾燥することにより、ＢＩシャーレを作製した。
【0068】
（２）二酸化塩素ガスによる除染
事前評価にて、芽胞状態の３×１０６ＣＦＵのBacillus atrophaeusのＢＩにおける、
芽胞菌死滅条件は、湿度６０％の時二酸化塩素ガス濃度と除染時間の積の値（ＣＴ値）が１３００ｐｐｍ・時間であることを確認した。
チャンバ内を温度２３℃、湿度６０％となるように調整した後、チャンバ内に（１）で作成したＢＩシャーレを設置した。固体と液体を混合する方式の二酸化塩素ガス発生装置を用いて、チャンバ内に二酸化塩素ガスを導入し、その後一定時間除染を行った。ＣＴ値が１３００ｐｐｍ・時間に到達したところで、吸着分解装置を用いてチャンバ内の二酸化塩素ガスを安全濃度である０．１ｐｐｍまで低減した後、ＢＩシャーレを回収した。
事前評価にて、芽胞状態の３×１０６ＣＦＵのBacillus atrophaeusのＢＩにおける、
芽胞菌死滅条件は、湿度６０％の時二酸化塩素ガス濃度と除染時間の積の値（ＣＴ値）が１３００ｐｐｍ・時間であることを確認した。
チャンバ内を温度２３℃、湿度６０％となるように調整した後、チャンバ内に（１）で作成したＢＩシャーレを設置した。固体と液体を混合する方式の二酸化塩素ガス発生装置を用いて、チャンバ内に二酸化塩素ガスを導入し、その後一定時間除染を行った。ＣＴ値が１３００ｐｐｍ・時間に到達したところで、吸着分解装置を用いてチャンバ内の二酸化塩素ガスを安全濃度である０．１ｐｐｍまで低減した後、ＢＩシャーレを回収した。
【0069】
（３）芽胞死菌の回収及び死菌液作成
回収したＢＩシャーレに、培養液（３ｍＬ）を投入し、シャーレ上にいる芽胞死菌をサンプルチューブに全量回収した（芽胞死菌３×１０６ＣＦＵ／３ｍＬ）。ボルテックスミキサーを用いてサンプルチューブ内の芽胞死菌を均一撹拌後、１ｍＬを別のサンプルチューブに分注し、「死菌サンプル」を作成した。
回収したＢＩシャーレに、培養液（３ｍＬ）を投入し、シャーレ上にいる芽胞死菌をサンプルチューブに全量回収した（芽胞死菌３×１０６ＣＦＵ／３ｍＬ）。ボルテックスミキサーを用いてサンプルチューブ内の芽胞死菌を均一撹拌後、１ｍＬを別のサンプルチューブに分注し、「死菌サンプル」を作成した。
【0070】
（４）芽胞生菌液の作成
（１）で作成したＢＩシャーレ（除染未実施）に、培養液（３ｍＬ）を投入し、シャーレ上にいる芽胞死菌をサンプルチューブに全量回収した（芽胞死菌３×１０６ＣＦＵ／３ｍＬ）。これを、培養液を用いて、１０倍段階希釈して１０１ＣＦＵ／ｍＬの芽胞生菌液を作成した。
（１）で作成したＢＩシャーレ（除染未実施）に、培養液（３ｍＬ）を投入し、シャーレ上にいる芽胞死菌をサンプルチューブに全量回収した（芽胞死菌３×１０６ＣＦＵ／３ｍＬ）。これを、培養液を用いて、１０倍段階希釈して１０１ＣＦＵ／ｍＬの芽胞生菌液を作成した。
【0071】
（５）死菌＋生菌サンプル作成
サンプルチューブに、（３）で作成した芽胞死菌液（０．９ｍＬ）と、（４）で作成した芽胞生菌液（０．１ｍＬ）とを添加し、１ｍＬ当たり死菌１０６ＣＦＵと生菌１００ＣＦＵレベルとを含む試験サンプル（「死菌＋生菌サンプル」）を作成した。
サンプルチューブに、（３）で作成した芽胞死菌液（０．９ｍＬ）と、（４）で作成した芽胞生菌液（０．１ｍＬ）とを添加し、１ｍＬ当たり死菌１０６ＣＦＵと生菌１００ＣＦＵレベルとを含む試験サンプル（「死菌＋生菌サンプル」）を作成した。
【0072】
（６）菌培養
設定温度３５℃の恒温培養器内に、「死菌サンプル」と「死菌＋生菌サンプル」を所定本数投入し、培養した。
設定温度３５℃の恒温培養器内に、「死菌サンプル」と「死菌＋生菌サンプル」を所定本数投入し、培養した。
【0073】
（７）ＡＴＰ発光量測定
所定時間培養後、取り出した各サンプル液にＡＴＰ消去試薬（キッコーマンバイオケミファ株式会社）を０．１ｍＬ添加し、撹拌後３０分間放置した。
ルシパックPen-AQUA（キッコーマンバイオケミファ株式会社）を用いて、添付のプロトコルに従い操作し、ルミテスターでＡＴＰ発光量を測定した。
なお、ＡＴＰ消去試薬は、ＡＴＰ分解酵素とＭＥＳ緩衝液２－モルホリノエタンスルホン酸を含む。発光試薬は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、酢酸マグネシウム、ほすほえのーるピルビン酸、ピロリン酸、及びピルベートオルトホスフェートジキナーゼを含む。抽出試薬は、塩化ベンザルコニウムを含む。
所定時間培養後、取り出した各サンプル液にＡＴＰ消去試薬（キッコーマンバイオケミファ株式会社）を０．１ｍＬ添加し、撹拌後３０分間放置した。
ルシパックPen-AQUA（キッコーマンバイオケミファ株式会社）を用いて、添付のプロトコルに従い操作し、ルミテスターでＡＴＰ発光量を測定した。
なお、ＡＴＰ消去試薬は、ＡＴＰ分解酵素とＭＥＳ緩衝液２－モルホリノエタンスルホン酸を含む。発光試薬は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、酢酸マグネシウム、ほすほえのーるピルビン酸、ピロリン酸、及びピルベートオルトホスフェートジキナーゼを含む。抽出試薬は、塩化ベンザルコニウムを含む。
【0074】
図１２に結果を示す。培養開始から１２時間以内に、「死菌サンプル」に比べて「死菌＋生菌サンプル」におけるＡＴＰ量は有意に増加が認められた。生菌に由来するＡＴＰを精度よく検出することができたことから、本方法により除染後のＢＩに含まれる生菌を精度よく検出することで除染効果を短時間に判定できることが分かる。
【符号の説明】
【0075】
１・・・筐体
２・・・二酸化塩素ガス発生装置
３・・・加湿器
４・・・ファン
５・・・二酸化塩素ガス分解装置
６・・・制御装置
７・・・滅菌室
５２・・・入口
５３・・・プレフィルタ
５４・・・メインフィルタ
５５・・・アフターフィルタ
５６・・・整流板
５７・・・出口
１１・・・取込口
１２・・・送風口
１００・・・二酸化塩素ガス発生システム
２・・・二酸化塩素ガス発生装置
３・・・加湿器
４・・・ファン
５・・・二酸化塩素ガス分解装置
６・・・制御装置
７・・・滅菌室
５２・・・入口
５３・・・プレフィルタ
５４・・・メインフィルタ
５５・・・アフターフィルタ
５６・・・整流板
５７・・・出口
１１・・・取込口
１２・・・送風口
１００・・・二酸化塩素ガス発生システム
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】