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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024026903
(43)【公開日】2024-02-29
(54)【発明の名称】ｓｉＲＮＡ及び医薬組成物並びに予防及び／又は治療剤
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240221BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240221BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240221BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20240221BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240221BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240221BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 P
A61P27/02 ZNA
A61P9/10
A61P27/06
A61K31/713
A61K48/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020183608
(22)【出願日】2020-11-02
(71)【出願人】
【識別番号】503286424
【氏名又は名称】カルナバイオサイエンス株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】313004104
【氏名又は名称】原 英彰
(71)【出願人】
【識別番号】520428753
【氏名又は名称】中村 信介
(74)【代理人】
【識別番号】100113044
【弁理士】
【氏名又は名称】吉田 智子
(72)【発明者】
【氏名】柚木 芳
(72)【発明者】
【氏名】澤 匡明
(72)【発明者】
【氏名】中村 信介
(72)【発明者】
【氏名】原 英彰
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA331
4C084ZA332
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA33
(57)【要約】
【課題】ＢＡＺＦの発現を抑制するｓｉＲＮＡを有効成分とする医薬組成物、具体的にはＢＡＺＦの発現を抑制することを通じてＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等の各種眼内血管新生疾患の予防及び／又は治療剤を提供すること。
【解決手段】配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とすることを特徴とするｓｉＲＮＡ、及びそれを有効成分として含有する医薬組成物である。
【選択図】なし
【解決手段】配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とすることを特徴とするｓｉＲＮＡ、及びそれを有効成分として含有する医薬組成物である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とすることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
【請求項2】
３’末端に１又は数塩基のオーバーハング用の配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項3】
ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部のリボースの２’位の水酸基が、化学修飾されたものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項4】
化学修飾が、水酸基のメトキシ基による置換であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項5】
下記のいずれかの配列番号の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
i）配列番号２（sense鎖）及び３（antisense鎖）
ii）配列番号４（sense鎖）及び５（antisense鎖）
iii）配列番号６（sense鎖）及び７（antisense鎖）
i）配列番号２（sense鎖）及び３（antisense鎖）
ii）配列番号４（sense鎖）及び５（antisense鎖）
iii）配列番号６（sense鎖）及び７（antisense鎖）
【請求項6】
配列番号４及び５の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項５に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項7】
配列番号６及び７の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項５に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項8】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項9】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、血管新生に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項10】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、眼内血管新生疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項11】
眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症から選択される疾患である請求項１０に記載の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＢＡＺＦ（BCL6 associated zinc finger protein）の発現を抑制する新規なｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）及び当該ｓｉＲＮＡを有効成分とする眼内血管新生疾患等の予防及び／又は治療剤並びに当該ｓｉＲＮＡを有効成分とする医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【0002】
眼内血管新生疾患として、例えば増殖糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症及び加齢黄斑変性症等の後眼部疾患は、網膜における病的な血管新生により惹起される疾患で不可逆的な視野欠損や失明を引き起こすことが知られており、当該血管新生には血管内皮細胞増殖因子（Vascular endothelial growth factor;ＶＥＧＦ）が関与していることが明らかにされている（非特許文献１）。
特許文献１には、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用に対し、ＢＡＺＦが制御の鍵となることが記載されている。
特許文献１には、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用に対し、ＢＡＺＦが制御の鍵となることが記載されている。
【0003】
また、例えば特許文献２には、ＢＡＺＦの発現を抑制し得る、二本鎖ｓｉＲＮＡの具体的な配列が記載されている（特許文献２の配列番号１及び２）。
【0004】
しかしながら、特許文献２記載のｓｉＲＮＡは、本発明における配列番号１のヌクレオチド配列（１４６８位～１４８６位）よりも更に下流の１８２７位～１８４５位付近を標的とするものであり、本発明のｓｉＲＮＡと相違する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】ＷＯ２０１０／１８７６４号公報
【特許文献2】特許第５６６５２１３号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】日薬理誌 １３５、１４９－１５２（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、眼内血管新生疾患の予防及び／又は治療に有用な薬剤を見出すべく鋭意検討を行った結果、ＢＡＺＦの発現を有効に抑制するｓｉＲＮＡ配列を見出し、更にそれを有効成分とする薬剤が、ＢＡＺＦの発現の抑制を通じて、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用による血管新生、特に眼内血管の新生を抑制することを見出して本発明を完成させたものであって、その目的とするところは、新規なｓｉＲＮＡ、医薬組成物及び眼内血管新生疾患等の予防及び／又は治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上述の目的は、下記第一の発明から第十一の発明によって、達成される。
【0009】
＜第一の発明＞
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とすることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とすることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
【0010】
配列番号１：ACACCAAAGUGCACUACCA
【0011】
＜第二の発明＞
３’末端に１又は数塩基のオーバーハング用の配列を有することを特徴とする、第一の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
３’末端に１又は数塩基のオーバーハング用の配列を有することを特徴とする、第一の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
【0012】
＜第三の発明＞
ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部の糖（リボース）の２’位の水酸基が、化学修飾されたものであることを特徴とする、第一の発明又は第二の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部の糖（リボース）の２’位の水酸基が、化学修飾されたものであることを特徴とする、第一の発明又は第二の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
【0013】
＜第四の発明＞
化学修飾が、水酸基のメトキシ基による置換であることを特徴とする、第一の発明乃至第三の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡ。
化学修飾が、水酸基のメトキシ基による置換であることを特徴とする、第一の発明乃至第三の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡ。
【0014】
＜第五の発明＞
下記のいずれかの配列番号の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする、第一の発明乃至第四の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡ。
i）配列番号２（sense鎖）及び３（antisense鎖）
ii）配列番号４（sense鎖）及び５（antisense鎖）
iii）配列番号６（sense鎖）及び７（antisense鎖）
下記のいずれかの配列番号の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする、第一の発明乃至第四の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡ。
i）配列番号２（sense鎖）及び３（antisense鎖）
ii）配列番号４（sense鎖）及び５（antisense鎖）
iii）配列番号６（sense鎖）及び７（antisense鎖）
【0015】
＜第六の発明＞
配列番号４及び５の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする第五の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
配列番号４及び５の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする第五の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
【0016】
＜第七の発明＞
配列番号６及び７の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする第五の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
配列番号６及び７の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする第五の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
【0017】
＜第八の発明＞
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、医薬組成物。
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、医薬組成物。
【0018】
＜第九の発明＞
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、血管新生に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、血管新生に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。
【0019】
＜第十の発明＞
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、眼内血管新生疾患の予防及び／又は治療剤。
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、眼内血管新生疾患の予防及び／又は治療剤。
【0020】
＜第十一の発明＞
眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症から選択される疾患である第十の発明に記載の予防及び／又は治療剤。
眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症から選択される疾患である第十の発明に記載の予防及び／又は治療剤。
【発明の効果】
【0021】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等を、ＢＡＺＦの発現を抑制することを通じて、予防及び／又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0024】
［本発明のｓｉＲＮＡ］
本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号１に示されるヒト・サルに共通なヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とする配列を有し、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用を有意に抑制することを特徴とするものである。
本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号１に示されるヒト・サルに共通なヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とする配列を有し、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用を有意に抑制することを特徴とするものである。
【0025】
本願発明者等は、ＢＡＺＦ（ＢＣＬ６Ｂ；Ref Seq（mRNA）；NM 181844）の核酸配列中の、種々の部位をターゲットとして、ｓｉＲＮＡのデザインを行い、種々検討した結果、配列番号１に示した、下記＃５の部位に対するｓｉＲＮＡ（以下、ｓｉＢＡＺＦ＃５等と記載する場合がある。）が、極めて効果的であることを見出した。
【0026】
＃５；１４６８位～１４８６位（配列番号１）
【0027】
《ｓｉＲＮＡの配列》
従って、本発明の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とするｓｉＲＮＡ（二本鎖）としては、
Ａ）ＢＡＺＦ（ＢＣＬ６Ｂ）遺伝子の核酸配列中の、１４６８位～１４８６位（配列番号１）に相当する１９塩基配列からなる配列（センス鎖）と、
Ｂ）Ａ）と二本鎖を形成し得る配列（アンチセンス鎖）
からなるものが挙げられる。
従って、本発明の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とするｓｉＲＮＡ（二本鎖）としては、
Ａ）ＢＡＺＦ（ＢＣＬ６Ｂ）遺伝子の核酸配列中の、１４６８位～１４８６位（配列番号１）に相当する１９塩基配列からなる配列（センス鎖）と、
Ｂ）Ａ）と二本鎖を形成し得る配列（アンチセンス鎖）
からなるものが挙げられる。
【0028】
また、本発明のｓｉＲＮＡには、上記のＡ）及び／又はＢ）に、Ａ）とＢ）が二本鎖を形成し得る限りにおいて下記の種々の改変、修飾を施したもの等も含まれる。
【0029】
尚、二本鎖を形成し得るとは、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができることを意味し、必ずしも、対応する構成塩基同士が完全に相補対を形成している必要は無い。
【0030】
（核酸配列の改変）
上述のＡ）及び／又はＢ）の改変とは、より具体的には、Ａ）及び／又はＢ）の核酸配列に、１乃至数個の塩基（ヌクレオチド）の、置換、欠失、付加及び／又は挿入等（以下、改変と記載することがある。）が施されていることを意味する。
上述のＡ）及び／又はＢ）の改変とは、より具体的には、Ａ）及び／又はＢ）の核酸配列に、１乃至数個の塩基（ヌクレオチド）の、置換、欠失、付加及び／又は挿入等（以下、改変と記載することがある。）が施されていることを意味する。
【0031】
置換、付加及び／又は挿入する塩基は、リボースに結合するもののほか、後述するｄＴｄＴ等のように、デオキシリボースに結合しているものであっても良い。
【0032】
但し、置換、欠失、付加及び／又は挿入は、ｓｉＲＮＡ効果を失わないようなものが好ましく、例えば、標的となる配列番号１のＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド等が挙げられる。
【0033】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を言い、例えば、J. Sambrookら、Molecular Cloning、 A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（特に11.45節“Conditions for Hybridization of oligonucleotide Probes等）及び Elbashir SM、Lendeckel W、Tuschl T.、Genes Dev. 2001 Jan 15;15(2):188-200. doi: 10.1101/gad.862301に記載されている条件等が挙げられる。
【0034】
上記の付加の一例としては、下記のオーバーハング用の配列等が挙げられる。
【0035】
（オーバーハング用の配列の付加）
本発明のｓｉＲＮＡは、上記のｓｉＲＮＡの３’末端に１又は数塩基のオーバーハング用の配列を有することが好ましい。
本発明のｓｉＲＮＡは、上記のｓｉＲＮＡの３’末端に１又は数塩基のオーバーハング用の配列を有することが好ましい。
【0036】
オーバーハング用の配列とは、アニーリングによって、センス鎖及びアンチセンス鎖からなる二本鎖ｓｉＲＮＡとなった際に、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の、主に３’末端側を突出させるための配列を意味する。
【0037】
１又は数塩基とは、具体的には２塩基が一般的であるが、これに限定されるものでは無い。
【0038】
オーバーハング用の配列としては、公知のものが使用できるが、例えばｄＴｄＴ等が、オーバーハングの効果が確立されているという点で好ましい。
【0039】
（核酸を構成する糖部分の修飾）
本発明のｓｉＲＮＡは、相補的な塩基配列を有する核酸との安定的なハイブリッドの形成能の向上及び／又はヌクレアーゼ耐性の向上等の点で、ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部の糖（リボース）の２’位の水酸基が、化学修飾されたものであることが好ましい。
本発明のｓｉＲＮＡは、相補的な塩基配列を有する核酸との安定的なハイブリッドの形成能の向上及び／又はヌクレアーゼ耐性の向上等の点で、ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部の糖（リボース）の２’位の水酸基が、化学修飾されたものであることが好ましい。
【0040】
本発明において、化学修飾とは、糖（リボース）の２’位の水酸基を、下記のような置換基で置換することを意味する。
【0041】
・メトキシ基
・２－メトキシエトキシ基
・３－アミノプロピルオキシ基
・２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノオキシ）エトキシ基
・フルオロ基
・２－メトキシエトキシ基
・３－アミノプロピルオキシ基
・２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノオキシ）エトキシ基
・フルオロ基
【0042】
中でも、例えばＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体、Toll like receptor）を介する免疫応答を回避するためには、メトキシ基で置換（ＯＨのＯＭｅ化）することが好ましい。
【0043】
また、ＲＮＡｉ活性（ｓｉＲＮＡ効果）を十分に発揮するためには、対象となるｓｉＲＮＡ分子を構成する糖（リボース）の２’位水酸基のうち、全てではなく一部のみが化学修飾されていることが好ましい。
【0044】
一部のみを化学修飾する方法としては、例えば、ホスホロアミダイト法を用いた核酸自動合成装置を用いてｓｉＲＮＡを合成する場合、原料となるアミダイトとして、特定の塩基を含むアミダイトの一部又は全部の、２’位水酸基のみをＯＭｅ化しておくこと等によって、ｓｉＲＮＡ分子を構成する全ての糖（リボース）の２’位水酸基が化学修飾されることを防ぐことができる。
【0045】
上記特定の塩基としては、ＴＬＲの活性化を効果的に抑制することが知られている点で、ＵやＧ等が好ましいものとして挙げられる。
【0046】
化学修飾は、上記Ａ）、Ｂ）の少なくとも一方において施されていれば良い。
【0047】
本発明のｓｉＲＮＡの具体的としては、例えば下記のいずれかの組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡが、好ましいものとして挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではなく、これらの二本鎖ＲＮＡに、センス鎖とアンチセンス鎖が二本鎖を形成し得る限りにおいて、上述のような塩基自体の改変（１乃至数個の塩基（ヌクレオチド）の、置換、欠失、付加及び／又は挿入）が施されたもの等も含まれる。
【0048】
【表1】
【0049】
尚、上記表１の配列中、細字はＲＮＡ、太字のｄＴはＤＮＡ（オーバーハング用の配列）を表す。
【0050】
また、表１中のＵｍ、Ｇｍとは、それぞれの塩基が結合している糖（リボース）２’位の水酸基がメトキシ基で置換されていることを意味するが、この置換は、２’ＯＭｅ（又は２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌ）等と表現される場合がある。
【0051】
《ｓｉＲＮＡの製法》
上述の本発明のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ）は、例えば核酸自動合成装置や形質転換細胞等を用いて人工的に合成する方法、
天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する方法、
天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失、置換、付加及び／又は挿入する方法、
目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やＲＮＡポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させる方法、
あるいはこれらを組み合わせた方法
等の方法によって製造することができる。
上述の本発明のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ）は、例えば核酸自動合成装置や形質転換細胞等を用いて人工的に合成する方法、
天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する方法、
天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失、置換、付加及び／又は挿入する方法、
目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やＲＮＡポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させる方法、
あるいはこれらを組み合わせた方法
等の方法によって製造することができる。
【0052】
尚、上記の核酸自動合成装置を用いる方法としては、具体的には、アミダイトを用いたホスホロアミダイト法等が挙げられるが、これに限られるものではない。
【0053】
また、ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部の糖（リボース）の２’位の水酸基が化学修飾された本発明のｓｉＲＮＡは、材料であるアミダイト中の糖（リボース）、又は合成後のヌクレオチドを構成する糖（リボース）の、一部又は全部の２’位の水酸基を、公知の方法に従って、上述の置換基で置換（保護）し、必要に応じて適宜、その一部の置換基を脱保護すること等によって行うことができる。
【0054】
《ｓｉＲＮＡの用途》
本発明のｓｉＲＮＡは、後述する本発明の医薬組成物や予防及び／又は治療剤として用いることができる他、実験室内における、実験・研究試薬（ＢＡＺＦ発現抑制剤又は血管新生阻害剤）としても利用価値の高いものである。
本発明のｓｉＲＮＡは、後述する本発明の医薬組成物や予防及び／又は治療剤として用いることができる他、実験室内における、実験・研究試薬（ＢＡＺＦ発現抑制剤又は血管新生阻害剤）としても利用価値の高いものである。
【0055】
［本発明の医薬組成物］
本発明の医薬組成物は、上記の本発明のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とするものである。
具体的には、以下の本発明の予防及び／又は治療剤の項で詳述したもの等が、医薬組成物の一例として挙げられる。
本発明の医薬組成物は、上記の本発明のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とするものである。
具体的には、以下の本発明の予防及び／又は治療剤の項で詳述したもの等が、医薬組成物の一例として挙げられる。
【0056】
［本発明の疾患の予防及び／又は治療剤］
本発明の疾患の予防及び／又は治療剤は、上記本発明のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするものであって、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等を、ＢＡＺＦの発現を抑制することを通じて、予防及び／又は治療することができるものである。
本発明の疾患の予防及び／又は治療剤は、上記本発明のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするものであって、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等を、ＢＡＺＦの発現を抑制することを通じて、予防及び／又は治療することができるものである。
【0057】
（添加剤）
本発明の医薬組成物或いは本発明の予防及び／又は治療剤（以下、医薬組成物等と記載する場合がある。）は、有効成分である本発明のｓｉＲＮＡ単独で、或いはｓｉＲＮＡを医薬上許容される添加剤とともに使用して、各々製剤化することができる。
本発明の医薬組成物或いは本発明の予防及び／又は治療剤（以下、医薬組成物等と記載する場合がある。）は、有効成分である本発明のｓｉＲＮＡ単独で、或いはｓｉＲＮＡを医薬上許容される添加剤とともに使用して、各々製剤化することができる。
【0058】
医薬上許容される添加剤としては、例えば、下記のようなものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0059】
ショ糖、デンプン等の有機系の賦形剤
セルロース、メチルセルロース等の結合剤
デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤
ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑沢剤（滑剤）
メントール等の芳香剤
安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤
クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤
メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤
界面活性剤等の分散剤
水、生理食塩水等の希釈剤
セルロース、メチルセルロース等の結合剤
デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤
ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑沢剤（滑剤）
メントール等の芳香剤
安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤
クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤
メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤
界面活性剤等の分散剤
水、生理食塩水等の希釈剤
【0060】
（核酸導入用試薬）
本発明のｓｉＲＮＡの標的細胞内への導入を促進するために、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物等、或いは実験試薬等には、更に公知の核酸導入用試薬を含有させることができる。
本発明のｓｉＲＮＡの標的細胞内への導入を促進するために、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物等、或いは実験試薬等には、更に公知の核酸導入用試薬を含有させることができる。
【0061】
具体的な核酸導入用試薬としては、例えば下記のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0062】
アテロコラーゲン、リポソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リポフェクタミン（lipofectamine：登録商標）、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム：ジオクトアデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（Ｌ－α－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ－ジ－ｎ－ヘキサアデシル－Ｎ，Ｎ－ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ－ｎ－ヘキサアデシル－Ｎ，Ｎ－ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ポリブレン、或いはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。
【0063】
また、本発明の医薬組成物等は、以下の血管新生制御に係る分子標的薬等との合剤あるいはそれぞれの特性を活かした組み合わせで使用することもできる。
【0064】
ＶＥＧＦに対するヒト型モノクローナル抗体医薬、ＶＥＧＦに対するＲＮＡアプタマー医薬、Notch1、Notch1遺伝子、CBF-1、CBF-1遺伝子、HEY1、HEY1遺伝子、HEY2、HEY2遺伝子、HES1、HES1遺伝子等に対する各種核酸医薬
【0065】
（剤形）
本発明の医薬組成物等の剤形は、例えば硝子体内注射剤等の注射剤、点眼薬、吸入製剤等が挙げられる。
本発明の医薬組成物等の剤形は、例えば硝子体内注射剤等の注射剤、点眼薬、吸入製剤等が挙げられる。
【0066】
（有効成分の含有量）
本発明の医薬組成物等中の、有効成分ｓｉＲＮＡの含有量は、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、後述する投与量との関係で適宜選択すれば良い。
本発明の医薬組成物等中の、有効成分ｓｉＲＮＡの含有量は、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、後述する投与量との関係で適宜選択すれば良い。
【0067】
（製造方法）
本発明の医薬組成物等は、上記の成分を用いて、周知の方法で製剤化することができる。
本発明の医薬組成物等は、上記の成分を用いて、周知の方法で製剤化することができる。
【0068】
尚、リポソームへのｓｉＲＮＡ封入法としては、例えば下記のような、公知の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0069】
リピドフィルム法（ボルテックス法）、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、凍結融解法、リモートローディング法等
【0070】
（投与経路）
本発明の医薬組成物等の投与経路としては、全身投与と局所投与があり、具体的には、静注等の静脈投与、筋注等の筋肉内投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、粘膜投与、吸入、眼内投与等が挙げられ、治療目的の疾患、症状等に応じて、適宜選択することができる。例えば、加齢黄斑変性症のように病巣部が特定されている疾患の場合には、硝子体内投与もしくは点眼等の局所投与が好ましい。
本発明の医薬組成物等の投与経路としては、全身投与と局所投与があり、具体的には、静注等の静脈投与、筋注等の筋肉内投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、粘膜投与、吸入、眼内投与等が挙げられ、治療目的の疾患、症状等に応じて、適宜選択することができる。例えば、加齢黄斑変性症のように病巣部が特定されている疾患の場合には、硝子体内投与もしくは点眼等の局所投与が好ましい。
【0071】
（投与方法）
投与方法は、特に制限されず、適宜、従来公知のデリバリーシステムを利用できる。
投与方法は、特に制限されず、適宜、従来公知のデリバリーシステムを利用できる。
【0072】
例えば、アテロコラーゲンを用いた局所投与法、全身投与法が好ましい。
【0073】
前記アテロコラーゲンは、例えば、局所止血剤として既に臨床応用されており、また、前記アテロコラーゲンを用いたｓｉＲＮＡの局所投与法は、ＶＥＧＦを分子標的とした動物実験でその有意性が示されている（Ｔａｋｅｉ Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４（１０）：３３６５－３３７０、２００４）。
【0074】
また、その他のデリバリーシステムとして、生体内での分解を防ぎ、細胞内透過性を高めるための化学修飾（Ｒｏｓｓｉ ＪＪ．、Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）：１５５－１５６、２００４； Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）：１７３－１７８、２００４）やカチオニックリポソーム（Ｙａｎｏ Ｊら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０（２２）：７７２１－７７２６、２００４）を用いたデリバリーシステムを利用しても良い。
【0075】
さらに、必要に応じて、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを発現するｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、遺伝子治療技術を利用したデリバリーシステムを利用することもできる。
【0076】
（投与量）
本発明の医薬組成物等の投与量は、投与経路、症状、年齢、性別、体重、医薬組成物等の形態等によって異なるため、一概には規定できないが、例えば、医薬組成物等中の有効成分（ｓｉＲＮＡ）の量が、遺伝子として０．０００１～１００ｍｇ、好ましくは、０．００１～１０ｍｇ等を、数日乃至数ヶ月に１回程度等投与するのが好ましい。
本発明の医薬組成物等の投与量は、投与経路、症状、年齢、性別、体重、医薬組成物等の形態等によって異なるため、一概には規定できないが、例えば、医薬組成物等中の有効成分（ｓｉＲＮＡ）の量が、遺伝子として０．０００１～１００ｍｇ、好ましくは、０．００１～１０ｍｇ等を、数日乃至数ヶ月に１回程度等投与するのが好ましい。
【実施例0077】
本発明の内容を以下の試験例及び実施例等でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。
【0078】
試験例１
ヒト網膜毛細血管内皮細胞におけるＢＡＺＦの発現抑制効果確認試験
ヒト網膜毛細血管内皮細胞におけるＢＡＺＦの発現抑制効果確認試験
【0079】
《材料と方法》
ヒト網膜毛細血管内皮細胞（Human retinal microvascular endothelial cells; HRMEC, Cell systems製）を３．０×１０４cells/mlとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
ヒト網膜毛細血管内皮細胞（Human retinal microvascular endothelial cells; HRMEC, Cell systems製）を３．０×１０４cells/mlとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
【0080】
細胞培養には、分裂促進因子（mitogen）の一種であるCulture boost（登録商標）を含むCS-C Complete Medium（Cell systems製）を使用した。２４時間培養後、Lipofectamine（登録商標）RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてControl ｓｉＲＮＡ（ＢＡＺＦをターゲットとしないｓｉＲＮＡ，MISSION（登録商標）siRNA Universal Negative Control（SIC001）Sigma-Aldrich製，以下ｓｉＣｏｎｔと記載する。）、表１に記載のｓｉＢＡＺＦ＃５、ｓｉＢＡＺＦ＃５－４及びｓｉＢＡＺＦ＃５－６それぞれを終濃度２５ｎＭとなるように添加し２４時間培養した。
更に、１０％ＦＢＳ含有培地（Culture boost（登録商標）を含まない）へ培地交換し、６時間の培養を行った。
ＰＢＳに溶解したＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、R&D systems製）を添加し、更に１時間培養した。
更に、１０％ＦＢＳ含有培地（Culture boost（登録商標）を含まない）へ培地交換し、６時間の培養を行った。
ＰＢＳに溶解したＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、R&D systems製）を添加し、更に１時間培養した。
【0081】
尚、比較対象のためのＶＥＧＦを添加しない群に関しては、ＰＢＳを添加した。
【0082】
NucleoSpin（登録商標）RNA kit（Takara製）を用いてＲＮＡを抽出し、PrimeScript （登録商標）RT reagent kit （Takara製）を用いてｃＤＮＡを作製した。
【0083】
ＲＴ－ＰＣＲは、TB Green Premix Ex Taq （登録商標）II（Takara製）を用いて、９５℃で３０秒を１サイクル、９５℃で５秒、６０℃で３０秒を４０サイクルの反応により行った。
【0084】
尚、使用したプライマーの配列は、以下の通りである。
ＢＡＺＦ forward：CGGGAAGTGAATTTTTCAGC（配列番号８）
ＢＡＺＦ reverse：TGGTAAGGCTTTTCCCCTGT（配列番号９）
ＢＡＺＦ forward：CGGGAAGTGAATTTTTCAGC（配列番号８）
ＢＡＺＦ reverse：TGGTAAGGCTTTTCCCCTGT（配列番号９）
【0085】
GAPDH forward：CCTGCACCACCAACTGCTTA（配列番号１０）
GAPDH reverse：GGCCATCCACAGTCTTCTGAG（配列番号１１
（Eurofins Genomics社（東京）製）
GAPDH reverse：GGCCATCCACAGTCTTCTGAG（配列番号１１
（Eurofins Genomics社（東京）製）
【0086】
使用したｓｉＲＮＡは、上述の表１に記載のｓｉＢＡＺＦ＃５、ｓｉＢＡＺＦ＃５－４、ｓｉＢＡＺＦ＃５－６である。
【0087】
【0088】
従って、ＢＡＺＦのヌクレオチド配列の一部である配列番号１（＃５）を標的とするｓｉＢＡＺＦ（ｓｉＢＡＺＦ＃５、ｓｉＢＡＺＦ＃５－４及びｓｉＢＡＺＦ＃５－６）、なかでも特にｓｉＢＡＺＦ＃５－４は、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等を、ＢＡＺＦの発現を抑制することを通じて、予防及び／又は治療することができる。
【0089】
実施例１
ｓｉＢＡＺＦ＃５
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５）を、以下の通り作成した。
ｓｉＢＡＺＦ＃５
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５）を、以下の通り作成した。
【0090】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドを、それぞれ対応するＲＮＡ合成用アミダイト試薬を用いたホスホロアミダイト法によって核酸自動合成装置を用いて合成し、次いで、常法に従って塩基部脱保護及び２’位水酸基の脱保護を行い、一本鎖の状態でカラム精製し、脱塩、次いでセンス鎖とアンチセンス鎖のアニーリングを行い、凍結乾燥し、表１記載のｓｉＲＮＡを作製した。
【0091】
実施例２
ｓｉＢＡＺＦ＃５－４
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５－４）を、以下の通り作成した。
ｓｉＢＡＺＦ＃５－４
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５－４）を、以下の通り作成した。
【0092】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドを、対応するＲＮＡ合成用アミダイト試薬および２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌ修飾型アミダイト試薬を用いたホスホロアミダイト法によって核酸自動合成装置を用いて合成し、次いで、常法に従って塩基部脱保護及びリボース２’位水酸基の置換基の脱保護を行い、一本鎖の状態でカラム精製し、脱塩、次いでセンス鎖とアンチセンス鎖のアニーリングを行い、凍結乾燥し、表１記載のｓｉＲＮＡを作製した。
【0093】
実施例３
ｓｉＢＡＺＦ＃５－６
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５－６）を、実施例２の方法と同様にして表１記載のｓｉＲＮＡを作製した。
ｓｉＢＡＺＦ＃５－６
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５－６）を、実施例２の方法と同様にして表１記載のｓｉＲＮＡを作製した。
【産業上の利用可能性】
【0094】
本発明のＢＡＺＦの発現を抑制するｓｉＲＮＡを有効成分とする医薬は、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等を、ＢＡＺＦの発現を抑制することを通じて、予防及び／又は治療することができる。
【図1】
【配列表】