特開 2024-27144 脂質および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024027144

(43)【公開日】2024-02-29

(54)【発明の名称】脂質および組成物

(51)【国際特許分類】

   C07C 279/14 20060101AFI20240221BHJP

   C07C 321/14 20060101ALI20240221BHJP

   C07C 237/12 20060101ALI20240221BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240221BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240221BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240221BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240221BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240221BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240221BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20240221BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240221BHJP

   C12N 15/88 20060101ALN20240221BHJP

   C07K 5/06 20060101ALN20240221BHJP

   C07D 233/64 20060101ALN20240221BHJP

【ＦＩ】

C07C279/14

C07C321/14

C07C237/12

A61K48/00

A61K31/7105

A61K31/713

A61P43/00 111

A61K9/127

A61K47/18

A61K47/20

A61K47/22

C12N15/113 Z

C12N15/88 Z

C07K5/06

C07D233/64

【審査請求】未請求

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023217284

(22)【出願日】2023-12-22

(62)【分割の表示】P 2023513066の分割

【原出願日】2022-04-11

(31)【優先権主張番号】P 2021066762

(32)【優先日】2021-04-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】591222566

【氏名又は名称】相互薬工株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】507219686

【氏名又は名称】静岡県公立大学法人

(74)【代理人】

【識別番号】110000523

【氏名又は名称】アクシス国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】小穴 哲央

(72)【発明者】

【氏名】林田 順

(72)【発明者】

【氏名】▲高▼木 利典

(72)【発明者】

【氏名】田中 陽平

(72)【発明者】

【氏名】尾▲崎▼ 奈穂子

(72)【発明者】

【氏名】浅井 知浩

(57)【要約】

【課題】核酸等の導入化合物を生体内の標的細胞または組織などへ効果的に送達することができる脂質および組成物を提供する。
【解決手段】本発明の脂質は、下記式（Ｉ）で表される脂質である。

（式中、Ｒ¹は、炭素数３２～４８の炭化水素基であり、Ｒ²は、１つの任意のアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖であり、Ｒ³は、塩基性アミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖である。）
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）で表される脂質。

【化1】

（式中、Ｒ¹は、炭素数３２～４８の炭化水素基であり、Ｒ²は、１つの任意のアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖であり、Ｒ³は、塩基性アミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖である。）

【請求項2】

Ｒ²は、親水性アミノ酸の側鎖または親水性アミノ酸の誘導体の側鎖である、請求項１に記載の脂質。

【請求項3】

Ｒ²は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖である、請求項１または２に記載の脂質。

【請求項4】

Ｒ²は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖である、請求項１～３のいずれかに記載の脂質。

【請求項5】

Ｒ³はリジン、ヒスチジン、アルギニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖である、請求項１～４のいずれかに記載の脂質。

【請求項6】

Ｒ³は、アルギニンの側鎖またはアルギニンの誘導体の側鎖である、請求項１～５のいずれかに記載の脂質。

【請求項7】

Ｒ¹は、炭素数３２～４８の分岐状の炭化水素基である、請求項１～６のいずれかに記載の脂質。

【請求項8】

Ｒ¹は、下記式（ＩＩ）で表される、請求項７に記載の脂質。

【化2】

（式中、Ｒ¹¹は、炭素数ａの直鎖状の炭化水素基であり、Ｒ¹²は、炭素数ｂの直鎖状の炭化水素基であり、
ここで、ａとｂは、３１≦ａ＋ｂ≦４７を満たす。）

【請求項9】

下記式（Ｉａ）～（Ｉｌ）のいずれかで表される、請求項１～８のいずれかに記載の脂質。

【化3】

【化4】

【請求項10】

導入化合物の細胞内導入用である、請求項１～９のいずれかに記載の脂質。

【請求項11】

導入化合物が核酸である、請求項１０に記載の脂質。

【請求項12】

核酸がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸であるか、またはｍＲＮＡである、請求項１１に記載の脂質。

【請求項13】

核酸がｓｉＲＮＡまたはｍＲＮＡである、請求項１２に記載の脂質。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれかに記載の脂質と導入化合物との組成物。

【請求項15】

複数の前記脂質が集合して脂質ナノ粒子を形成し、前記脂質ナノ粒子の内部に導入化合物が包含される、請求項１４に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脂質および組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

生体内の標的細胞または組織などの対象内への化合物（例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸およびこれらの誘導体、例えばＲＮＡｉ薬剤を含む生物活性薬物など）のデリバリーは、一般に脂質などの担体分子が用いられている。しかし、例えば担体分子が生体内の分解酵素で分解されたり、細胞膜の透過が制限されたりし、化合物を対象に到達させることが困難になることがある。また、化合物を対象へ到達させることができても効率的に到達できなければ、化合物による所望の効果を得るために、望ましい投与量よりも高い投与量の導入化合物の使用を要することとなり、細胞毒作用および副作用のリスクを増大させ得る。したがって、標的細胞や組織への効率的な侵入が可能な担体分子が求められている。

【0003】

このような問題に対して、例えば、特許文献１は、脂質を含有する微粒子内に核酸としてｓｉＲＮＡを封入することにより、封入されたｓｉＲＮＡを血しょう中での分解から保護し、かつ脂溶性の細胞膜への透過を可能とすることを開示している。また、特許文献２～４は、ｓｉＲＮＡ等の核酸医薬の送達に用いられ、生分解能を向上させた脂質を開示している。特許文献５は、ＲＮＡｉ剤などの生物活性薬物を送達するためのカチオン性脂質化合物を開示している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特表２０１２－５３００５９号公報

【特許文献2】国際公開第２０１１／１５３４９３号

【特許文献3】国際公開第２０１３／０８６３５４号

【特許文献4】国際公開第２０１３／１５８５７９号

【特許文献5】特開２０１６－５１４１０９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、最近の進展にもかかわらず、生体内の標的細胞または組織などの対象内への導入するための化合物（以下、導入化合物とも称す）を対象内へ効果的に送達できる脂質が依然として求められている。
したがって、本発明は、核酸等の導入化合物を生体内の標的細胞または組織などへ効果的に送達することができる脂質および組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の脂質は、下記式（Ｉ）で表される脂質である。

【化1】

（式中、Ｒ¹は、炭素数３２～４８の炭化水素基であり、Ｒ²は、１つの任意のアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖であり、Ｒ³は、塩基性アミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖である。）

【0007】

また、本発明の組成物は、上記の脂質と導入化合物との組成物である。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、核酸等の導入化合物を生体内の標的細胞または組織などへ効果的に送達することができる脂質および組成物を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0009】

［脂質］
以下に、本発明の実施形態について例示説明する。
本実施形態の脂質は、下記式（Ｉ）で表される。

【化2】

（式中、Ｒ¹は、炭素数３２～４８の炭化水素基であり、Ｒ²は、１つの任意のアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖であり、Ｒ³は、塩基性アミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖である。）
より詳細には、本実施形態の脂質は、炭化水素基（Ｒ¹）を含む脂質親和性領域（テイル）と、当該炭化水素とエステル結合により連結する、２つのアミノ酸またはその誘導体（ジペプチド）を含む親水性領域（ヘッド）と、を有する両親媒性分子とすることができる。
なお、親水性領域の２つのアミノ酸部分（残基）について、脂質親和性領域から数えて１つ目、２つ目のアミノ酸部分に対応するアミノ酸またはアミノ酸の誘導体をそれぞれ第１アミノ酸、第２アミノ酸とも称す。

【0010】

本実施形態の脂質によれば、核酸等の導入化合物を生体内の標的細胞または組織などへ効果的に送達することができる。
具体的には、本実施形態の脂質の親水性領域が２つのアミノ酸由来の部分で形成されているので、本実施形態の脂質の生体への影響を適切に抑制することができる。また、本実施形態の脂質は、親水性領域の末端（Ｒ³）側が、塩基性アミノ酸由来であり、適度なカチオン性を有することとなり、当該脂質を含むリポソームなどの脂質ナノ粒子を、核酸などの細胞内への導入化合物が包含された状態で作製しやすく、また、脂質ナノ粒子が細胞の細胞膜を透過しやすくすることができる。さらに、本実施形態の脂質におけるこのような親水性領域は、リポソームなどの脂質ナノ粒子と、細胞内導入化合物との相性を向上させることができる。
さらに、脂質親和性領域が炭素数３２～４８の炭化水素基（Ｒ¹）であることにより、リポソームなどの脂質ナノ粒子の膜を膜の安定性等確保しつつ適切に形成することができる。
以上より、本実施形態の脂質を用いることにより、核酸等の導入化合物を生体内の標的細胞または組織などへ効果的に送達することができる。

【0011】

なお、本実施形態の脂質には、式（Ｉ）で表される化合物の他、その薬剤学的に許容される塩も含まれる。薬剤学的に許容される塩とは、生物学的有効性と本発明の化合物の特性を保持し、典型的には、生物学的にまたは他の点で望ましくないことはない塩を言う。
より詳細には、本実施形態の脂質は、例えば親水性領域がプロトン化して陽イオンを形成したりまたは脱プロトン化して陰イオンを形成し得る。脂質の陽イオンと対になり得る陰イオンとしては、薬剤学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン；酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン等の有機酸イオン等が挙げられる。また、脂質の陰イオンと対になる陽イオンとしては、薬剤学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、アンモニウムイオン、トリアルキルアンモニウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等が挙げられる。

【0012】

ここで、本実施形態において、式（Ｉ）中のＲ¹は、炭素数３２～４８の炭化水素基である。炭化水素基の炭素数を３２～４８にすることにより、リポソームなどの脂質ナノ粒子の膜の安定性が向上するとともに膜自体が大きくなりすぎるのを防止することができる。
ここで「炭化水素基」としては、例えば、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキルアルキル基などが挙げられ、好ましくは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基である。

【0013】

Ｒ¹は、分岐状の炭化水素基であっても直鎖状の炭化水素基であってもよいが、分岐状であることが好ましい。また、Ｒ¹の炭素数は３２～４６であることが好ましく、より好ましくは３２～４４であり、さらに好ましくは３６～４４である。これにより、脂質ナノ粒子の膜の安定性がより向上するとともに膜自体が大きくなりすぎるのをさらに防止することができる。
さらに、本実施形態において、Ｒ¹の炭化水素基は、飽和していてもよいが不飽和であることが好ましく、また、当該不飽和結合はシス型であることがより好ましい。

【0014】

本実施形態において、Ｒ¹としては下記式（ＩＩ）で表される炭化水素基であることが好ましい。

【化3】

（式中、Ｒ¹¹は、炭素数ａの炭化水素基であり、Ｒ¹²は、炭素数ｂの炭化水素基であり、ここで、ａとｂは、３１≦ａ＋ｂ≦４７を満たす。）

【0015】

Ｒ¹¹およびＲ¹²は、特に限定されないが例えば、直鎖状の炭化水素基とすることができ、また、好ましくは炭素１～４６の直鎖状の炭化水素基である。Ｒ¹¹およびＲ¹²は、より好ましくは炭素数６～２２の直鎖状の炭化水素基、より好ましくは炭素数１０～２２の直鎖状の炭化水素基であり、さらに好ましくは炭素数１７～２２の直鎖状の炭化水素基であり、よりさらに好ましくは炭素数１８～２２の直鎖状の炭化水素基である。これにより、脂質ナノ粒子の膜の安定性がより向上するとともに膜自体が大きくなりすぎるのをさらに防止することができる。

【0016】

Ｒ¹¹およびＲ¹²は、上記の炭素数の炭化水素基であって、少なくともいずれか一方が不飽和炭化水素基であることが好ましい。また、さらに好ましくは、Ｒ¹¹およびＲ¹²の両方は、上記の炭素数の不飽和炭化水素基である。また、Ｒ¹¹およびＲ¹²の少なくともいずれか一方が不飽和炭化水素基である場合には、１つの不飽和炭化水素基内の不飽和結合の数は、３つ以下であることが好ましく、より好ましくは２つ以下であり、最も好ましくは１つである。
また、Ｒ¹¹およびＲ¹²の両方が不飽和炭化水素基である場合には、Ｒ¹¹とＲ¹²中の末端炭素から数えた不飽和基の位置は、Ｒ¹¹とＲ¹²で同じ位置であることが好ましい。

【0017】

また、Ｒ¹¹についての炭素数ａおよびＲ¹²についての炭素数ｂとが、１≦ｂ－ａ≦２０であることが好ましく、より好ましくは１≦ｂ－ａ≦１８であり、さらに好ましくは１≦ｂ－ａ≦１５であり、よりさらに好ましくは１≦ｂ－ａ≦１０であり、最も好ましくは１＝ｂ－ａである。
さらに、炭素数ａ、ｂが、３１≦ａ＋ｂ≦４５であることが好ましく、３１≦ａ＋ｂ≦４３であることがより好ましく、３５≦ａ＋ｂ≦４３であることがさらに好ましい。

【0018】

Ｒ¹¹およびＲ¹²は、特に限定されないが例えば、好ましくは炭素数１０～２２の直鎖飽和炭化水素基（即ち、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシル、ｎ－トリデシル、ｎ－テトラデシル、ｎ－ペンタデシル、ｎ－ヘキサデシル、ｎ－ヘプタデシル、ｎ－オクタデシル、ｎ－ノナデシル、ｎ－エイコシル）または炭素数１０～２２の直鎖不飽和炭化水素基（例えば、シス－９－テトラデセン－１－イル、シス－８－ペンタデセン－１－イル、シス－９－ヘキサデセン－１－イル、シス－８－ヘプタデセン－１－イル、シス－９－オクタデセン－１－イル、シス－８－ノナデセン－１－イル、シス－１１－オクタデセン－１－イル、シス－９－エイコセン－１－イル、シス－１１－エイコセン－１－イル、シス－１２－ヘンイコセン－１－イル、シス－１３－ドコセン－１－イル等のモノ不飽和炭化水素基、シス－８－シス－１１－ヘプタデスジエン－１－イル、シス－９－シス－１２－オクタデスジエン－１－イル等のジ不飽和炭化水素基、シス－８－シス－１１－シス－１４－ヘプタデストリエン－１－イル、シス－９－シス－１２－シス－１５－オクタデストリエン－１－イル、シス－８－シス－１０－シス－１２－ヘプタデストリエン－１－イル、シス－９－シス－１１－シス－１３－オクタデストリエン－１－イル等のトリ不飽和炭化水素基、シス－３－シス－７－シス－１１－シス－１４－ヘプタデステトラエン－１－イル、シス－４－シス－８－シス－１２－シス－１５－オクタデステトラエン－１－イル、シス－４－シス－７－シス－１０－シス－１３－ノナデステトラエン－１－イル、シス－５－シス－８－シス－１１－シス－１４－エイコサテトラエン－１－イル等のテトラ不飽和炭化水素基など）である。
Ｒ¹¹およびＲ¹²は、好ましくは炭素数１６～２４の直鎖不飽和炭化水素基であり、より好ましくは炭素数１８～２２の直鎖不飽和炭化水素基であり、さらに好ましくは、Ｒ¹¹はシス－８－ヘプタデセン－１－イル、シス－８－シス－１１－ヘプタデスジエン－１－イル、シス－１２－ヘンイコセン－１－イルであり、Ｒ¹²はシス－９－オクタデセン－１－イル、シス－９－シス－１２－オクタデスジエン－１－イル、シス－１３－ドコセン－１－イルであり、最も好ましくは、Ｒ¹¹はシス－８－ヘプタデセン－１－イルであり、Ｒ¹²はシス－９－オクタデセン－１－イルである。

【0019】

本実施形態において、式（Ｉ）中のＲ²は、１つの任意のアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖である。アミノ酸としては、２０種類の天然アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｒａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ）、並びに修飾および非天然アミノ酸（例えば、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、β－アラニン、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、５－アミノ吉草酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、２－アミノピメリン酸、２－アミノスベリン酸、ホモセリン、アミノマロン酸、ホモアルギニン、グリコシアミン、２，４－ジアミノブチル酸、アミノフェニルアラニン等）が挙げられる。
好ましくは、Ｒ²は、親水性アミノ酸の側鎖または親水性アミノ酸の誘導体の側鎖である。これにより、より効果的に核酸等の導入化合物を生体内の標的細胞または組織などへ送達することができる。親水性アミノ酸としては、特に限定されないが例えば、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、システイン、２－アミノアジピン酸、２－アミノピメリン酸、２－アミノスベリン酸、ホモセリン、アミノマロン酸が挙げられる。
また、好ましくは、Ｒ²は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖であり、より好ましくは、Ｒ²は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である。これにより、より効果的に核酸等の導入化合物を生体内の標的細胞または組織などへ送達することができる。
さらに、好ましくは、Ｒ²は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖であり、より好ましくは、Ｒ²は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンおよびトレオニンの側鎖である。これにより、細胞毒性をより抑制しつつ、細胞質へ効果的に核酸等の導入化合物を送達することができる。
なお、Ｒ²が親水性アミノ酸の誘導体の側鎖である場合、親水性アミノ酸の誘導体も親水性を示すことが好ましく、例えば極性基や電荷を有することができる官能基を備えることで親水性を示すことができる。

【0020】

なお、アミノ酸の誘導体の側鎖とは、
（ｉ）－ＮＨＲ⁴または－Ｎ（Ｒ⁴）₂基で置き換えられた－ＮＨ₂基（ここで、各Ｒ⁴は、独立して、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであって、置換されてもよく、または置換されなくてもよい）、
（ｉｉ）－Ｏ－ＰＯ₃Ｈ₂、－ＯＲ⁴または－ＯＣＯＲ⁴基で置き換えられた－ＯＨ基（ここで、各Ｒ⁴は、独立して、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであって、置換されてもよく、または置換されなくてもよい）、
（ｉｉｉ）－ＣＯＯＲ⁴基で置き換えられた－ＣＯＯＨ基（ここで、各Ｒ⁴は、独立して、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであって、置換されてもよく、または置換されなくてもよい）、
（ｉｖ）－ＣＯＮ（Ｒ⁴）₂基で置き換えられた－ＣＯＯＨ基（ここで、各Ｒ⁴は、独立して、Ｈでもよく、あるいはアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであって、置換されてもよく、または置換されなくてもよい）、
（ｖ）－Ｓ－Ｓ－ＣＨ₂－ＣＨ（ＮＨ₂）－ＣＯＯＨまたは－Ｓ－Ｓ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－ＣＨ（ＮＨ₂）－ＣＯＯＨで置き換えられた－ＳＨ基、
（ｖｉ）－ＣＨ（ＮＨ₂）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨＲ⁴－基で置き換えられた－ＣＨ₂－基（ここで、各Ｒ⁴は、独立して、Ｈでもよく、あるいはアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであって、置換されてもよく、または置換されなくてもよい）、
（ｖｉｉ）－ＣＨ₂－ＮＨ₂、－ＣＨ₂－ＯＨ、－ＣＨ₂Ｒ⁴基で置き換えられた－ＣＨ₃基（ここで、各Ｒ⁴は、独立して、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであって、置換されてもよく、または置換されなくてもよい）、および／または、
（ｖｉｉｉ）ハロゲンで置き換えられた、炭素原子に結合するＨ、
を有するものが挙げられる。
また、上記のＲ⁴は好ましくはアルキルであり、より好ましくは炭素数１～６のアルキルであり、さらに好ましくは炭素数１～３のアルキルであり、よりさらに好ましくは炭素数１のアルキルである。

【0021】

また、本明細書において、アミノ酸にはＬ体、Ｄ体およびラセミ体も含まれるが、Ｌ体であることが好ましい。

【0022】

なお、Ｒ²が、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、メチオニン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸の誘導体の側鎖である場合において、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、メチオニン、セリンおよびトレオニンの誘導体の側鎖とは、例えば下記が挙げられる。
すなわち、Ｒ²がアスパラギン酸またはグルタミン酸の場合には、誘導体の側鎖とは、（ｉｉｉ）－ＣＯＯＲ⁴基で置き換えられた－ＣＯＯＨ基、（ｖｉ）－ＣＨ（ＮＨ₂）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨＲ⁴－基で置き換えられた－ＣＨ₂－基、および／または、（ｖｉｉｉ）ハロゲンで置き換えられた、炭素原子に結合するＨ、を有するものが挙げられる。
また、ヒスチジンまたはメチオニンの場合には、誘導体の側鎖とは、（ｖｉ）－ＣＨ（ＮＨ₂）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨＲ⁴－基で置き換えられた－ＣＨ₂－基、および／または、（ｖｉｉｉ）ハロゲンで置き換えられた、炭素原子に結合するＨ、を有するものが挙げられる。
さらに、Ｒ²がセリンの場合には、誘導体の側鎖とは、（ｉｉ）－Ｏ－ＰＯ₃Ｈ₂、－ＯＲ⁴または－ＯＣＯＲ⁴基で置き換えられた－ＯＨ基、（ｖｉ）－ＣＨ（ＮＨ₂）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨＲ⁴－基で置き換えられた－ＣＨ₂－基、および／または、（ｖｉｉｉ）ハロゲンで置き換えられた、炭素原子に結合するＨ、を有するものが挙げられる。
また、Ｒ²がトレオニンの場合には、誘導体の側鎖とは、（ｉｉ）－Ｏ－ＰＯ₃Ｈ₂、－ＯＲ⁴または－ＯＣＯＲ⁴基で置き換えられた－ＯＨ基、（ｖｉｉ）－ＣＨ₂－ＮＨ₂、－ＣＨ₂－ＯＨ、－ＣＨ₂Ｒ⁴基で置き換えられた－ＣＨ₃基、および／または、（ｖｉｉｉ）ハロゲンで置き換えられた、炭素原子に結合するＨ、を有するものが挙げられる。
なお、上記のいずれのアミノ酸についての誘導体の側鎖とは、好ましくは、（ｖｉ）－ＣＨ（ＮＨ₂）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨＲ⁴－基で置き換えられた－ＣＨ₂－基を有するもの（トレオニンの場合には、（ｖｉｉ）－ＣＨ₂－ＮＨ₂、－ＣＨ₂－ＯＨ、－ＣＨ₂Ｒ⁴基で置き換えられた－ＣＨ₃基）であることが好ましく、より好ましくは、－ＣＨＲ⁴－基で置き換えられた－ＣＨ₂－基を有するもの（トレオニンの場合には、－ＣＨ₂Ｒ⁴基で置き換えられた－ＣＨ₃基）である。
また、上記のＲ⁴は、Ｈでもよく、あるいはアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであって、置換されてもよく、または置換されなくてもよい。また、Ｒ⁴が分子内に複数存在する場合には相互に独立して上記より選択される。さらに、Ｒ⁴は、好ましくはアルキルであり、より好ましくは炭素数１～６のアルキルであり、さらに好ましくは炭素数１～３のアルキルであり、よりさらに好ましくは炭素数１のアルキルである。

【0023】

本実施形態において、式（Ｉ）中のＲ³は、塩基性アミノ酸の側鎖または当該塩基性アミノ酸の誘導体の当該側鎖であり、好ましくは、Ｒ³は、塩基性アミノ酸の側鎖である。より好ましくは、Ｒ³は、リジン、ヒスチジン、アルギニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖であり、さらに好ましくは、Ｒ³は、リジン、ヒスチジン、アルギニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である。またより好ましくは、Ｒ³は、アルギニンの側鎖またはアルギニンの誘導体の側鎖であり、さらに好ましくは、Ｒ³はアルギニンの側鎖である。
このようにすることにより、細胞質へ効果的に核酸等の導入化合物を送達することができる。

【0024】

なお、塩基性アミノ酸とは、天然アミノ酸並びに修飾および非天然アミノ酸のうち塩基性を示す残基を有するアミノ酸が挙げられ、具体的には、特に限定されないが例えば、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ホモアルギニン、グリコシアミン、オルニチン、２，４－ジアミノブチル酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、アミノフェニルアラニン等を挙げることができる。

【0025】

Ｒ³が、塩基性アミノ酸の誘導体の側鎖である場合、それらの側鎖は、上記のアミノ酸の誘導体の側鎖として挙げた（ｉ）～（ｖｉｉｉ）を有する側鎖とすることができる。また、この場合、Ｒ⁴は好ましくはアルキルであり、より好ましくは炭素数１～６のアルキルであり、さらに好ましくは炭素数１～３のアルキルであり、よりさらに好ましくは炭素数１のアルキルである。
なお、Ｒ³が、塩基性アミノ酸の誘導体の側鎖である場合、塩基性アミノ酸の誘導体も塩基性を示すことが好ましく、例えばアミノ基やプロトンを受容可能な官能基を備えることで塩基を示すことができる。

【0026】

なおＲ³が、リジン、ヒスチジン、アルギニンからなる群より選択されるアミノ酸の誘導体の側鎖である場合において、リジン、ヒスチジン、アルギニンの誘導体の側鎖とは、例えば下記が挙げられる。
すなわち、Ｒ³がリジンの場合には、誘導体の側鎖とは、（ｉ）－ＮＨＲ⁴または－Ｎ（Ｒ⁴）₂基で置き換えられた－ＮＨ₂基、および／または、（ｖｉ）－ＣＨ（ＮＨ₂）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨＲ⁴－基で置き換えられた－ＣＨ₂－基を有するものが挙げられる。
また、Ｒ³がヒスチジンの場合には、誘導体の側鎖とは、（ｖｉ）－ＣＨ（ＮＨ₂）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨＲ⁴－基で置き換えられた－ＣＨ₂－基を有するものが挙げられる。
さらに、Ｒ³がアルギニンの場合には、誘導体の側鎖とは、（ｖｉ）－ＣＨ（ＮＨ₂）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨＲ⁴－基で置き換えられた－ＣＨ₂－基を有するものが挙げられる。
なお、上記のいずれのアミノ酸についての誘導体の側鎖とは、好ましくは、（ｖｉ）－ＣＨ（ＮＨ₂）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－ＣＨＲ⁴－基で置き換えられた－ＣＨ₂－基を有するものであることが好ましく、より好ましくは、－ＣＨＲ⁴－基で置き換えられた－ＣＨ₂－基を有するものである。
また、上記のＲ⁴は、Ｈでもよく、あるいはアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであって、置換されてもよく、または置換されなくてもよい。また、Ｒ⁴が分子内に複数存在する場合には相互に独立して上記より選択される。さらに、Ｒ⁴は、好ましくはアルキルであり、より好ましくは炭素数１～６のアルキルであり、さらに好ましくは炭素数１～３のアルキルであり、よりさらに好ましくは炭素数１のアルキルである。

【0027】

本実施形態において、式（Ｉ）中のＲ²は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖であり、且つ、Ｒ³は、リジン、ヒスチジン、アルギニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖であることが好ましく、より好ましくは、式（Ｉ）中のＲ²は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖であり、且つ、Ｒ³は、リジン、ヒスチジン、アルギニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である。
また、式（Ｉ）中のＲ²は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖または当該アミノ酸の誘導体の側鎖であり、且つ、Ｒ³は、アルギニンの側鎖またはアルギニンの誘導体の側鎖であることが好ましく、より好ましくは、式（Ｉ）中のＲ²は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖であり、且つ、Ｒ³は、アルギニンの側鎖である。

【0028】

上記式（Ｉ）で表される脂質の具体例としては、特に限定されないが例えば以下の式（１ａ）～（１ｌ）で示される脂質が挙げられる。また、下記の式（１ａ）～（１ｌ）で示される脂質のうち、式（１a）、（１ｂ）、（１e）、（１ｌ）がより好ましい。

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

【化13】

【化14】

【化15】

【0029】

［脂質の製造方法］
式（Ｉ）で表される化合物は特に限定されないが例えば次のようにして製造することができる。
まず、脂質親和性領域（Ｒ¹－Ｏ－）に対応する脂肪族アルコール（Ｒ¹－ＯＨ）と、脂質親和性領域から数えて１つ目の第１アミノ酸部分（－Ｏ－ＣＯ－ＣＲ²－ＮＨ－）に対応するアミノ酸（ＨＯ₂Ｃ－ＣＲ²－ＮＨ₂）または当該アミノ酸の誘導体（当該アミノ酸および当該アミノ酸の誘導体を第１アミノ酸とも称す）と、２つ目の第２アミノ酸部分（－ＮＨ－ＣＯ－ＣＲ³－ＮＨ₂）に対応するアミノ酸またはアミノ酸の誘導体（当該アミノ酸または当該アミノ酸の誘導体を第２アミノ酸とも称す）と、を準備する。

【0030】

続いて、脂肪族アルコールのヒドロキシ基と第１アミノ酸のカルボキシ基とをエステル化し、次いで、上記のエステル化体のアミノ基と第２アミノ酸のカルボキシ基とをアミド化する。このようにすることにより、本実施形態の脂質を得ることができる。
なお、エステル化反応やアミド化反応を行うに当たり、各化合物が所望の官能基で反応するように、第１アミノ酸や第２アミノ酸の官能基を保護基で予め保護することもできる。
また、第１アミノ酸と第２アミノ酸とをアミド化し、次いで、アミド化体と脂肪族アルコールとをエステル化することもできる。

【0031】

なお、脂肪族アルコール（Ｒ¹－ＯＨ）は、所望の脂肪酸又は脂肪族ケトンを還元反応することにより得ることができるが、例えば脂肪族アルコール（Ｒ¹－ＯＨ）のＲ¹が下記式（ＩＩ）で表される（すなわち、第２級アルコールの場合）には、次のようにして脂肪族アルコール（Ｒ¹－ＯＨ）を得ることができる。

【化16】

【0032】

まず、Ｒ¹¹の炭化水素基の１位にカルボキシ基を有する脂肪酸（蟻酸のカルボニル炭素にＲ¹¹が付加した脂肪酸)および、例えばＲ¹²の炭化水素基の１位にヒドロキシ基を有する脂肪族アルコールを準備する（なお、Ｒ¹²の炭化水素基の１位にカルボキシ基を有する脂肪酸および、例えばＲ¹¹の炭化水素基の１位にヒドロキシ基を有する脂肪族アルコールを準備してもよいが、ここでは前者の場合について説明する）。
次いで、前記Ｒ¹²の１位にヒドロキシ基を有する脂肪族アルコールから、例えば、そのヒドロキシ基のハロゲン化等を経ることにより有機金属試薬を得る。そして、前記Ｒ¹¹の１位にカルボキシ基を有する脂肪酸と当該有機金属試薬とを反応させることにより、Ｒ¹が式（ＩＩ）で表される脂肪族アルコールを得ることができる。

【0033】

ここで、本実施形態の脂質の具体的な製造方法について、上記の式（Ｉａ）の脂質（第１アミノ酸としてアスパラギン酸、第２アミノ酸部分としてアルギニン）を用いて下記に説明する。
下記の例では、アスパラギン酸を脂肪族アルコールとエステル化する前に、アスパラギン酸のカルボキシ基およびアミノ基に保護基（それぞれｔ－Ｂｕ基、Ｆｍｏｃ基）を付加させ、そして、脂肪族アルコール（ａ）とアスパラギン酸（ｂ）とをエステル化する。

【化17】

【0034】

続いて、下記に示すように、上記の過程で得たエステル化体（ｃ）のアミノ基に付加させた保護基（－Ｆｍｏｃ）を脱離させ、脱離させたエステル化体（ｄ）のアミノ基とアルギニン（ｅ）のカルボキシ基とをアミド化する。この例では、アルギニンをアミド化する前に、アルギニンのアミノ基およびグアニジノ基には保護基（それぞれＦｍｏｃ基、Ｐｂｆ基）が付加されている。

【化18】

【0035】

上記のようにして得られたアミド化体（ｆ）は、この例では保護基を有することから、保護基を脱離させることにより、式（Ｉａ）の脂質を得ることができる。

【化19】

【0036】

［導入化合物］
ここで、本実施形態の脂質は、所定の導入化合物を細胞内に導入するための細胞内導入用として用いることができる。具体的な導入化合物としては、核酸、ペプチド、タンパク質などが挙げられる。導入化合物は、生物学的に活性な物質とすることができ、細胞または臓器に送達され細胞内に導入されると、細胞、臓器、または他の身体組織もしくは系に望ましい変化をもたらす物質であり得、感染症、疾患、障害、病態等の治療や予防に有用であり得る。
また、導入化合物は、細胞毒素、放射性イオン、化学療法薬、ワクチン、免疫応答を誘発する化合物（治療薬及び／または予防薬）であり得る。ワクチンには、インフルエンザ、麻疹、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、狂犬病、髄膜炎、百日咳、破傷風、ペスト、肝炎、結核、及びコロナウイルスなどの感染症に関連する１つ以上の状態に対する免疫を提供できる化合物及び製剤が含まれる。また、ワクチンには、上記の感染症由来の抗原及び／またはエピトープをコードする核酸、具体的にはｍＲＮＡが含まれ得る。また、ワクチンには、がん細胞などの腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する化合物及び製剤も含まれ、腫瘍細胞由来の抗原、エピトープ、及び／またはネオエピトープをコードする核酸、具体的にはｍＲＮＡが含まれ得る。免疫応答を誘発する化合物には、ワクチン、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）、及びその他の種が含まれるが、これらに限定されない。

【0037】

本実施形態において、核酸としては、ヌクレオチドおよび／または該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であれば、いかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体があげられる。また、ヌクレオチドおよび／または該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子を少なくとも一つ含む誘導体も、本実施形態における核酸に含まれる。さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， ３２， ６２４（１９９９）］、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１２３， ４６５３（２００１）］、ペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２２， ６９００（２０００）］等もあげられる。なお、本実施形態において、ＲＮＡ中のウリジンＵと、ＤＮＡにおいてはチミンＴとは、それぞれ読み替えることができる。
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等があげられる。

【0038】

本実施形態において、核酸としては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられ、ｍＲＮＡは、任意の天然に存在するかもしくは天然に存在しない、またはそうでなければ修飾されたポリペプチドを含む、目的のポリペプチドをコードしてもよい。ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは任意のサイズものであってよく、任意の二次構造または活性を有してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、細胞内で発現すると治療効果を発揮し得る。

【0039】

また、本実施形態において、核酸としては、好ましくは標的遺伝子の発現を抑制する核酸もあげられ、より好ましくはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸があげられる。

【0040】

本実施形態において、標的遺伝子としては、ｍＲＮＡを産生して発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、腫瘍または炎症に関連する遺伝子が好ましく、例えば血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、以下ＶＥＧＦと略す）、血管内皮増殖因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＶＥＧＦＲと略す）、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ、以下ＫＬＦと略す）、Ｅｔｓ転写因子、核因子、低酸素誘導因子、細胞周期関連因子、染色体複製関連因子、染色体修復関連因子、微小管関連因子、増殖シグナル経路関連因子、増殖関連転写因子、アポトーシス関連因子等のタンパク質をコードする遺伝子等があげられ、具体的にはＶＥＧＦ遺伝子、ＶＥＧＦＲ遺伝子、線維芽細胞増殖因子遺伝子、線維芽細胞増殖因子受容体遺伝子、血小板由来増殖因子遺伝子、血小板由来増殖因子受容体遺伝子、肝細胞増殖因子遺伝子、肝細胞増殖因子受容体遺伝子、ＫＬＦ遺伝子、Ｅｔｓ転写因子遺伝子、核因子遺伝子、低酸素誘導因子遺伝子、細胞周期関連因子遺伝子、染色体複製関連因子遺伝子、染色体修復関連因子遺伝子、微小管関連因子遺伝子（例えば、ＣＫＡＰ５遺伝子等）、増殖シグナル経路関連因子遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ遺伝子等）、増殖関連転写因子遺伝子、アポトーシス関連因子（例えば、ＢＣＬ－２遺伝子等）等が挙げられる。

【0041】

また、本実施形態において、標的遺伝子としては、例えば、肝臓、肺、腎臓または脾臓において発現する遺伝子が好ましく、例えば前記の腫瘍または炎症に関連する遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルスゲノム、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、アポリポタンパク質（ＡＰＯ）、ヒドロキシメチルグルタリル（ＨＭＧ）ＣｏＡ還元酵素、ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）、第１２因子、グルカゴン受容体、グルココルチコイド受容体、ロイコトリエン受容体、トロンボキサンＡ２受容体、ヒスタミンＨ１受容体、炭酸脱水酵素、アンギオテンシン変換酵素、レニン、ｐ５３、チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、ナトリウム依存性グルコース輸送担体、腫瘍壊死因子、インターロイキン等のタンパク質をコードする遺伝子等があげられる。

【0042】

標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えば蛋白質等をコードする遺伝子（標的遺伝子）のｍＲＮＡの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含み、かつ標的遺伝子の発現を抑制する核酸であれば、例えばｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）等の二本鎖核酸、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、アンチセンス核酸、リボザイム等の一本鎖核酸等、いずれの核酸を用いてもよいが、二本鎖核酸が好適に用いられる。
標的遺伝子のｍＲＮＡの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸といい、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸ともいう。センス鎖核酸は、標的遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸そのもの等、アンチセンス鎖核酸と対合して二重鎖形成部ができる核酸をいう。
二本鎖核酸とは、二本の鎖が対合し二重鎖形成部を有する核酸をいう。二重鎖形成部とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖形成部を構成する塩基対は、通常１５～２７塩基対であり、１５～２５塩基対が好ましく、１５～２３塩基対がより好ましく、１５～２１塩基対がさらに好ましく、１５～１９塩基対が特に好ましい。

【0043】

二重鎖形成部のアンチセンス鎖核酸としては、標的遺伝子のｍＲＮＡの一部配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸、または該核酸において１～３塩基、好ましくは１～２塩基、より好ましくは１塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつ標的蛋白質の発現抑制活性を有する核酸が好適に用いられる。二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸長は、通常１５～３０塩基からなるが、１５～２９塩基が好ましく、１５～２７塩基がより好ましく、１５～２５塩基がさらに好ましく、１７～２３塩基が特に好ましく、１９～２１塩基が最も好ましい。
二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖、センス鎖のいずれか一方、または両方の核酸は、二重鎖形成部に続く３’側または５’側に二重鎖を形成しない追加の核酸を有してもよい。この二重鎖を形成しない部分を突出部（オーバーハング）ともいう。
突出部を有する二本鎖核酸としては、少なくとも一方の鎖の３’末端または５’末端に１～４塩基、通常は１～３塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、２塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、ｄＴｄＴまたはＵＵからなる突出部を有するものがより好ましく用いられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。
また、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のｍＲＮＡと一部または全てが一致する配列、または、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のｍＲＮＡの相補鎖の塩基配列と一致する配列を用いてもよい。さらに、標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えばＤｉｃｅｒ等のリボヌクレアーゼの作用により前記の二本鎖核酸を生成する核酸分子（国際公開第２００５／０８９２８７号）や、３’末端や５’末端の突出部を有していない二本鎖核酸などを用いることもできる。

【0044】

また、前記の二本鎖核酸がｓｉＲＮＡである場合、アンチセンス鎖は、５’末端側から３’末端側に向って少なくとも１～１７番目の塩基の配列が、標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１７塩基の配列と相補的な塩基の配列であり、好ましくは、該アンチセンス鎖は、５’末端側から３’末端側に向って１～１９番目の塩基の配列が、標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１９塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、１～２１番目の塩基の配列が、標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する２１塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、１～２５番目の塩基の配列が、標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する２５塩基の配列と相補的な塩基の配列である。

【0045】

さらに、本実施形態において、核酸がｓｉＲＮＡである場合、好ましくは該核酸中の糖の１０～７０％、より好ましくは１５～６０％、さらに好ましくは２０～５０％が、２’位において修飾基で置換されたリボースである。本実施形態において、リボースの２’位において修飾基で置換されたとは、２’位の水酸基が修飾基に置換されているものを意味し、リボースの２’位の水酸基と立体配置が同じであっても異なっていてもよいが、好ましくはリボースの２’位の水酸基と立体配置が同じである。２’位において修飾基で置換されたリボースは、糖部修飾ヌクレオチドにおける２’－修飾ヌクレオチドに包含され、２’位において修飾基で置換されたリボースの修飾基は、２’－修飾ヌクレオチドの修飾基と同義である。

【0046】

本実施形態において、核酸には、核酸の構造中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体を包含する。

【0047】

また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の５’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ５’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の３’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ３’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。

【0048】

一本鎖の核酸としては、標的遺伝子の連続する１５～２７塩基、好ましくは１５～２５塩基、より好ましくは１５～２３塩基、さらに好ましくは１５～２１塩基、特に好ましくは１５～１９塩基からなる配列の相補配列からなる核酸、または該核酸において１～３塩基、好ましくは１～２塩基、より好ましくは１塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつ標的蛋白質の発現抑制活性を有する核酸であればいずれでもよい。該一本鎖の核酸長は、１５～３０塩基以下、好ましくは１５～２９塩基、より好ましくは１５～２７塩基、さらに好ましくは１５～２５塩基、特に好ましくは１５～２３塩基の一本鎖核酸が好適に用いられる。
一本鎖核酸として、上記の二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を、スペーサー配列（スペーサーオリゴヌクレオチド）を介して連結したものを用いてもよい。スペーサーオリゴヌクレオチドとしては６～１２塩基の一本鎖核酸分子が好ましく、その５’末端側の配列は２個のＵであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡの配列からなる核酸があげられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれるアンチセンス鎖およびセンス鎖の順番はどちらが５’側になってもよい。該一本鎖核酸としては、ステムループ構造によって二重鎖形成部を有するｓｈＲＮＡ等の一本鎖核酸であることが好ましい。ｓｈＲＮＡ等の一本鎖核酸は、通常５０～７０塩基長である。
リボヌクレアーゼ等の作用により、上記の一本鎖核酸または二本鎖核酸を生成するように設計した、７０塩基長以下、好ましくは５０塩基長以下、さらに好ましくは３０塩基長以下の核酸を用いてもよい。

【0049】

なお、本実施形態で用いられる核酸は、既知のＲＮＡまたはＤＮＡ合成法、およびＲＮＡまたはＤＮＡ修飾法を用いて製造すればよい。

【0050】

［組成物］
つづいて、本実施形態に係る組成物について説明する。
本実施形態の組成物は、上記の式（Ｉ）で表される脂質と、上記の導入化合物とを含有し、より具体的には、複数の式（Ｉ）で表される脂質が集合して形成され、内部に導入化合物が包含される脂質ナノ粒子を含むことができる。

【0051】

本実施形態の組成物は、式（Ｉ）で表される脂質の２種以上を組み合わせて含有してもよく、あるいは、導入化合物の細胞内導入効率や低細胞毒性などの本発明の利点を損なわない範囲であれば、上記式（Ｉ）で表される脂質以外の分子、例えば、両親媒性分子（例えば、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン等の生体膜由来のリン脂質など）、カチオン性脂質分子、界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、コール酸ナトリウム、オクチルグルコシド、Ｎ－Ｄ－グルコ－Ｎ－メチルアルカンアミド類など）、ポリエチレングリコール修飾脂質、糖脂質、ペプチド脂質、蛋白質、ステロールなどをさらに含有してもよい。

【0052】

なお、ポリエチレングリコール修飾脂質としては、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（ＰＥＧ２０００－ジミリスチルグリセロール）、ＰＥＧ２０００－ＤＰＧ（ＰＥＧ２０００－ジパルミトイルグリセロール）、ＰＥＧ２０００－ＤＳＧ（ＰＥＧ２０００－ジステアロイルグリセロール）、ＰＥＧ５０００－ＤＭＧ（ＰＥＧ５０００－ジミリスチルグリセロール）、ＰＥＧ５０００－ＤＰＧ（ＰＥＧ５０００－ジパルミトイルグリセロール）、ＰＥＧ５０００－ＤＳＧ（ＰＥＧ５０００－ジステアロイルグリセロール）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ（Ｎ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン）、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（Ｒ－３－［（ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）等が挙げられる。ポリエチレングリコール修飾脂質は、１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
ステロールとしては、コレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β－シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロール、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）等が挙げられる。ステロールは、１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。

【0053】

本実施形態において、脂質ナノ粒子の形成は、上記の式（Ｉ）で表される脂質が集合して組織化されることで形成され得る。ここで「組織化」とは、上記式（Ｉ）で表される脂質と、任意で含有させることができる、式（Ｉ）で表される脂質以外の分子とを含む構成分子同士が、疎水結合等の非共有結合を介して集合することをいう。組織化された集合体としては、構成分子の疎水部同士が疎水結合し形成される二重膜、リポソーム、多重ベシクル、ひも状会合体、ディスク状会合体、ラメラ状会合体、ロッド状会合体等及びこれらの混合物が含まれる。組織化される過程で、導入化合物を内部に包含させることで脂質ナノ粒子を得ることができる。

【0054】

本実施形態の組成物は、上述した成分の他にも、その他の添加剤として、ショ糖、ブドウ糖、ソルビトール、乳糖等の糖；グルタミン、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン等のアミノ酸；クエン酸、リン酸、酢酸、乳酸、炭酸、酒石酸等の酸の塩等を含有してもよい。

【0055】

本実施形態の組成物は、医薬組成物として製剤化されていてもよい。医薬組成物の剤型としては、例えば注射剤が挙げられる。

【0056】

本実施形態の組成物は、例えば、凍結乾燥等により溶媒を除去した粉末状態であってもよく、液体状態であってもよい。組成物が粉末状態である場合には、使用前に薬学的に許容される媒体に懸濁又は溶解させて注射剤として用いることができる。組成物が液体状態である場合には、そのままで又は薬学的に許容される媒体に懸濁又は溶解させて注射剤として用いることができる。

【0057】

薬学的に許容される媒体としては、滅菌水；生理食塩水；ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液等が挙げられる。本実施形態の組成物は、更に、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール等の溶解補助剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤等の添加剤を含有していてもよい。

【0058】

本実施形態の組成物の脂質ナノ粒子の粒子径は、平均粒子径を算出することができ、脂質ナノ粒子の粒子径（平均粒子径）は、２５０ｎｍ以下が好ましく、より好ましくは２００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１５０ｎｍ以下であり、さらにより好ましくは１３０ｎｍ以下であり、最も好ましくは１２０ｎｍ以下である。また、脂質ナノ粒子の粒子径（平均粒子径）は、１０ｎｍ以上であることが好ましく、より好ましくは３０ｎｍ以上である。
また、脂質ナノ粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は、０．４以下であることが好ましく、より好ましくは０．３以下であり、さらに好ましくは０．２以下である。
粒子径および／または多分散指数が上記範囲であることにより、生体内の標的細胞または組織などの対象に到達させやすくすることができる。
平均粒子径や多分散指数は、実施例の欄に記載の方法で測定することができる。

【0059】

実施形態の組成物は、非特異的な吸着や免疫反応を抑制する観点から、例えばｐＨ７．４のＴｒｉｓ－ＨＣｌ中で測定した組成物の電荷が低いことが好ましい。
ｐＨ７．４のＴｒｉｓ－ＨＣｌ中で測定した組成物の電荷は、実施例の欄に記載の方法で測定することができる。

【0060】

本実施形態の組成物の脂質ナノ粒子は、特に限定されることはなく公知の方法により形成することができる。
組成物の製造方法としては、例えば、導入化合物を含むクエン酸緩衝液などの水溶液と、本実施形態の脂質を少なくとも含有する極性有機溶媒含有溶液とを調製する工程と、水溶液と極性有機溶媒含有溶液とを混合し混合液を得る工程と、混合液中の極性有機溶媒を除去する工程と、を備える。この組成物の製造方法によれば、導入化合物が効率よく内部に封入された脂質ナノ粒子を含む組成物を得ることができる。

【0061】

極性有機溶媒含有溶液には、本実施形態の脂質以外の分子、例えば、両親媒性分子（例えば、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン等の生体膜由来のリン脂質など）、カチオン性脂質分子、界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、コール酸ナトリウム、オクチルグルコシド、Ｎ－Ｄ－グルコ－Ｎ－メチルアルカンアミド類など）、ポリエチレングリコール修飾脂質、糖脂質、ペプチド脂質、蛋白質、コレステロール等のステロールなどをさらに含有してもよい。
また、極性有機溶媒含有溶液の極性有機溶媒としては、特に限定されないが、溶媒の極性や脂質ナノ粒子の形成後の溶媒の除去の容易性の観点より、例えばエタノール、ｔ－ブタノールなどのアルコールが挙げられる。

【0062】

混合液を得る工程は、例えばボルテックスミキサーやマイクロ流路を用いて行うことができる。また、混合液を得る工程により、混合液中において導入化合物を内部に封入された脂質ナノ粒子を形成させることができる。
極性有機溶媒を除去する工程では、例えば透析濾過、限外濾過または減圧下での蒸発により極性有機溶媒の含有量を低減させることができる。

【0063】

なお、混合液を得る工程および極性有機溶媒の含有量を低減させる工程の間に、インキュベーション工程をおこなうこともきる。

【0064】

本実施形態において、例えば、本実施形態の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、例えば癌または炎症の生じた臓器または部位へ送達され、送達臓器または部位の細胞内に本実施形態の組成物中の核酸などの導入化合物を導入することができる。癌または炎症の生じた臓器または部位としては、特に限定されないが、例えば胃、大腸、肝臓、肺、脾臓、膵臓、腎臓、膀胱、皮膚、血管、眼球等があげられる。また、本実施形態の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、例えば血管、肝臓、肺、脾臓および／または腎臓へ送達され、送達臓器または部位の細胞内に本実施形態の組成物中の導入化合物を導入することができる。肝臓、肺、脾臓および／または腎臓の細胞は、正常細胞、癌もしくは炎症に関連した細胞またはその他の疾患に関連した細胞のいずれでもよい。
本実施形態の組成物中の導入化合物が核酸であり、核酸がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸であれば、ほ乳類の細胞内に、遺伝子の発現を抑制する核酸等を導入することができ、遺伝子等の発現の抑制ができる。投与対象は、人であることが好ましい。
また、本実施形態の組成物における標的遺伝子が、例えば腫瘍または炎症に関連する遺伝子であれば、本実施形態の組成物を、癌または炎症疾患の治療剤または予防剤、好ましくは固形癌または血管もしくは血管近傍の炎症の治療剤または予防剤として使用することができる。具体的には、本実施形態の組成物における標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子等であれば、血管平滑筋の増殖や血管新生等を抑制できるので、本実施形態の組成物を、例えば血管平滑筋の増殖や血管新生を伴う癌または炎症疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。
即ち、本実施形態では、上記説明した本実施形態の組成物を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法も提供する。投与対象は、人であることが好ましく、癌または炎症疾患に罹患している人がより好ましい。

【0065】

本実施形態の組成物は、例えば血液成分等の生体成分(例えば血液、消化管等)中での前記核酸の安定化、副作用の低減または標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器への薬剤集積性の増大等を目的とする製剤としても使用できる。

【0066】

さらに、本実施形態の組成物中の導入化合物が核酸であり、核酸が感染症や腫瘍細胞由来の抗原等をコードするｍＲＮＡであれば、特異的免疫応答を誘導するように指向することができ、したがって、感染症や腫瘍を含む幅広い種類の疾患のための、広範な治療的および予防的ｍＲＮＡワクチンを開発することに適用され得る。

【0067】

本実施形態の組成物の投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、口腔内、気道内、直腸内、皮下、皮内、筋肉内または静脈内等の非経口投与または経口投与を挙げることができ、好ましくは静脈内投与または筋肉内投与を挙げることができる。また、本実施形態の組成物をｍＲＮＡワクチンとして使用する場合には筋肉内投与が好ましい。
組成物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なる。

【0068】

以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明の脂質および組成物は、上記の例に限定されることは無く、本発明の脂質および組成物には、適宜変更を加えることができる。

【実施例0069】

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、限定するものと解釈されるべきではない。なお、最終生成物、中間体、および出発物質の構造は、例えば標準的な分析方法、例えばＭＳまたはＮＭＲにより確認される。下記の実施例において使用される略語は当業者に周知の慣用的な略語である。いくつかの略語を以下に示す。
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＭＡＰ：Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＭｓＣｌ：メタンスルホニルクロリド

【0070】

¹ＨＮＭＲスペクトルは、日本電子株式会社製核磁気共鳴装置、ＪＮＭ－ＥＣＺ４００Ｓ、４００ＭＨｚの分光計で記録した。すべての化学シフトはクロロホルムに対する百万分率（δ）で報告されている。以下の略語が信号パターンを示すために使用される：Ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑはカルテット＝、ｑｕｉｎ＝クインテット、Ｍ＝マルチプレット、ｂｒ＝ブロード。
ＭＳデータは、高速液体クロマトグラフィータンデム型質量分析計（装置名：ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムＡＣＱＵＩＴＹ ＴＱＤ；日本ウォーターズ株式会社製）を用いてＥＳＩ＋のイオンモードで測定した。測定条件は、キャピラリー電圧４．０ｋＶ、コーン電圧３０Ｖ、ソース温度１００℃、脱溶媒ガス温度２５０℃とした。

【0071】

＜脂質の合成＞
以下に示す実施例および比較例の脂質を合成した。
［実施例１］
３－（２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－４－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（以下、脂質（Ｉａ）とも称す）の合成
脂質（Ｉａ）は、脂質親和性領域が炭素数３６個の炭化水素基であり、親水性領域が、Ａｓｐ（第１アミノ酸）、Ａｒｇ（第２アミノ酸）由来のジペプチドである。以下に、脂質（Ｉａ）の合成方法について説明する。

【0072】

工程（ａ１）：Ｎ－メトキシ－Ｎ－メチロールアミドの合成

【化20】

オレイン酸（４２．４ｇ、１５０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２．７５ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２１．９ｇ、２２５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的のＮ－メトキシ－Ｎ－メチロールアミドを定量的に得た。

【0073】

工程（ａ２）：（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルメタンスルホン酸の合成

【化21】

オレイルアルコール（１００．０ｇ、３７２．４５ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１１３．０７ｇ、１．１１７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（９００ｍＬ）に溶解し０℃まで冷却した溶液中に、ＭｓＣｌ（６３．９ｇ、５５８．７ｍｍｏｌ）を添加した。添加後室温まで昇温させ、室温にて２時間反応させた。反応終了後、ジクロロメタン及びトリエチルアミンを減圧下で濃縮し、得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を10％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘプタン）にて精製し、目的の（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルメタンスルホン酸を定量的に得た。

【0074】

工程（ａ３）：（Ｚ）－１－ブロモオクタデカ－９－エンの合成

【化22】

上記の工程（ａ２）で得た（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルメタンスルホン酸（１３５ｇ、３９０ｍｍｏｌ）、臭化リチウム（１６１ｇ、１８５０ｍｍｏｌ）をアセトン（３００ｍＬ）に溶解し、還流下で１時間反応させた。反応終了後、減圧下で溶媒を濃縮し、得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン）にて精製し、目的の（Ｚ）－１－ブロモオクタデカ－９－エンを定量的に得た。

【0075】

工程（ａ４）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オンの合成

【化23】

マグネシウム（３．７３ｇ、１５４ｍｍｏｌ）、ジエチルエーテル（２５ｍＬ）中に、工程（ａ３）で得た（Ｚ）－１－ブロモオクタデカ－９－エン（４０．７ｇ、１２３ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（２５０ｍＬ）溶液を撹拌しながら滴下した。滴下終了後１時間攪拌し、続けて工程（ａ１）で得たＮ－メトキシ－Ｎ－メチロールアミド（２０ｇ、６１．４ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（１２５ｍＬ）溶液を滴下した。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）にて原料消失を確認した時点を反応終了とした。反応終了後、反応系中に水を加えクエンチし、酢酸エチルにて抽出し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オンを定量的に得た。

【0076】

工程（ａ５）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オールの合成

【化24】

工程（ａ４）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オン（３１．９ｇ、６１．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１２０ｍＬ）、メタノール（１２０ｍＬ）に溶かした溶液中に、水素化ホウ素ナトリウム（１１．７ｇ、３０９ｍｍｏｌ）を添加し、反応させた。反応終了後、減圧下で溶媒を濃縮し、得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オールを定量的に得た。

【0077】

工程（ａ６）：４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アスパルテートの合成

【化25】

工程（ａ５）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オール（４．０ｇ、７．７ｍｍｏｌ）と、予めアスパラギン酸のアミノ基およびカルボキシ基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、ｔＢｕ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ（３．８ｇ、９．２ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（２．３ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（０．２８ｇ、２．３ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アスパルテートを得た（３．５ｇ、３．８ｍｍｏｌ、５０％）。

【0078】

工程（ａ７）：４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）アスパルテートの合成

【化26】

工程（ａ６）で得た４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アスパルテート（３．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（４０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）アスパルテートを得た（１．２ｇ、１．７ｍｍｏｌ、５３％）。

【0079】

工程（ａ８）：４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルアスパルテートの合成

【化27】

工程（ａ７）で得た４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）アスパルテート（１．０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）と、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（１．８８ｇ、２．９ｍｍｏｌ）（ＴＣＩ製）と、ＤＣＣ（０．４２ｇ、２．９ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（９ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルアスパルテートを得た（１．８ｇ、１．４ｍｍｏｌ、９４％）。

【0080】

工程（ａ９）：４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルアスパルテートの合成

【化28】

工程（ａ８）で得た４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルアスパルテート（１．８ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（６ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルアスパルテートを得た（０．９ｇ、１．１ｍｍｏｌ、７３％）。

【0081】

工程（ａ１０）：３－（２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－４－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（脂質（Ｉａ））の合成

【化29】

工程（ａ９）で得た４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルアスパルテート（０．９ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の３－（２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－４－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（脂質（Ｉａ））を得た（０．３ｇ、０．３７ｍｍｏｌ、３６％）。

【0082】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ5.47-5.13 (4H), 4.93-4.61 (2H), 4.13-3.73 (1H), 3.36-2.90 (2H), 2.89-2.42 (2H), 2.11-1.76 (10H), 1.57-1.42 (6H), 1.42-0.98 (46H), 0.98-0.25 (6H)
[C₄₆H₈₇N₅O₅H]⁺: 790.73

【0083】

［実施例２］
４－（２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－５－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－５－オキソペンタン酸（以下、脂質（Ｉｂ）とも称す）の合成
脂質（Ｉｂ）は、脂質（Ｉａ）の第１アミノ酸をＧｌｕに変更した脂質である。以下に、脂質（Ｉｂ）の合成方法について説明する。なお、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）の工程と同じであるため省略する。

【0084】

工程（ｂ６）：５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）グルタメートの合成

【化30】

工程（ａ５）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オール（３．０ｇ、５．７ｍｍｏｌ）と、予めグルタミン酸のアミノ基およびカルボキシ基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、ｔＢｕ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ（４．９２ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（２．６ｇ、１３ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（０．２４ｇ、１．９ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）グルタメートを得た（６．８ｇ、７．６ｍｍｏｌ、７９％）。

【0085】

工程（ｂ７）：５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）グルタメートの合成

【化31】

工程（ｂ６）で得た５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）グルタメート（３．６ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（４０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）グルタメートを得た（１．６ｇ、２．３ｍｍｏｌ、５８％）。

【0086】

工程（ｂ８）：５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルグルタメートの合成

【化32】

工程（ｂ７）で得た５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）グルタメート（１．６ｇ、２．３ｍｍｏｌ）と、予めアルギニンのアミノ基およびグアニジノ基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、Ｐｂｆ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（２．９５ｇ、４．５ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（０．６５ｇ、４．５ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルグルタメートを得た（２．８ｇ、２．１ｍｍｏｌ、９２％）。

【0087】

工程（ｂ９）：５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルグルタメートの合成

【化33】

工程（ｂ８）で得た５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルグルタメート（２．８ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（６ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルグルタメートを得た（１．２ｇ、１．４ｍｍｏｌ、６８％）。

【0088】

工程（ｂ１０）：４－（２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－５－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－５－オキソペンタン酸（脂質（Ｉｂ））の合成

【化34】

工程（ｂ９）で得た５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎｗ－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）アルギニルグルタメート（１．２ｇ、１．４ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の４－（２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－５－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－５－オキソペンタン酸（脂質（Ｉｂ））を得た（０．３ｇ、０．３７ｍｍｏｌ、２７％）。

【0089】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ5.43-5.19 (4H), 5.09-4.96 (1H), 4.91-4.74 (1H), 4.69-4.46 (1H), 3.71-3.52 (2H), 3.33-2.99 (2H), 2.58-2.31 (2H), 2.03-1.84 (8H), 1.81-1.69 (2H), 1.68-1.42 (6H), 1.41-0.98 (46H), 0.96-0.71 (6H)
[C₄₇H₈₉N₅O₅H]⁺:804.75

【0090】

［実施例３］
（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルアルギニルヒスチジネート（以下、脂質（Ｉｃ）とも称す）の合成
脂質（Ｉｃ）は、脂質（Ｉａ）の第１アミノ酸をＨｉｓに変更した脂質である。以下に、脂質（Ｉｃ）の合成方法について説明する。なお、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）の工程と同じであるため省略する。

【0091】

工程（ｃ６）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮａ－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｔ－トリチルヒスチジネートの合成

【化35】

工程（ａ５）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オール（３．０ｇ、５．８ｍｍｏｌ）と、予めヒスチジンのアミノ基およびイミダゾール基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、Ｔｒｔ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（４．３ｇ、６．９ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（１．８ｇ、８．６ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（０．１０ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮａ－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｔ－トリチルヒスチジネートを得た（３．８ｇ、３．４ｍｍｏｌ、５８％）。

【0092】

工程（ｃ７）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル－Ｎｔ－トリチルヒスチジネートの合成

【化36】

工程（ｃ６）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮａ－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｔ－トリチルヒスチジネート（３．８ｇ、３．４ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（４０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル－Ｎｔ－トリチルヒスチジネートを得た（２．０ｇ、２．２ｍｍｏｌ、５３％）。

【0093】

工程（ｃ８）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮａ－（Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニル）－Ｎｔ－トリチルヒスチジネートの合成

【化37】

工程（ｃ７）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル－Ｎｔ－トリチルヒスチジネート（２．２ｇ、３．０ｍｍｏｌ）と、予めアルギニンのアミノ基およびグアニジノ基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、Ｐｂｆ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（１．７ｇ、２．６ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（０．６７ｇ、３．５ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（２７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮａ－（Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニル）－Ｎｔ－トリチルヒスチジネートを得た（２．３ｇ、１．６ｍｍｏｌ、７２％）。

【0094】

工程（ｃ９）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮａ－（Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニル）－Ｎｔ－トリチルヒスチジネートの合成

【化38】

工程（ｃ８）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮａ－（Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニル）－Ｎｔ－トリチルヒスチジネート（２．３ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（６ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮａ－（Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニル）－Ｎｔ－トリチルヒスチジネートを得た（１．５ｇ、１．２ｍｍｏｌ、７５％）。

【0095】

工程（ｃ１０）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルアルギニルヒスチジネート（脂質（Ｉｃ））の合成

【化39】

工程（ｃ９）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮａ－（Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニル）－Ｎｔ－トリチルヒスチジネート（１．５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルアルギニルヒスチジネート（脂質（Ｉｃ））を得た（０．２ｇ、０．２６ｍｍｏｌ、２２％）。

【0096】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ7.86-7.44 (1H), 7.09-6.74 (1H), 5.40-5.22 (4H), 4.91-4.78 (1H), 4.16-3.97 (1H), 3.78-3.31 (3H), 3.27-3.06 (2H), 2.10-1.84 (8H), 1.84-1.60 (2H), 1.60-1.47 (6H), 1.36-1.00 (46H), 0.93-0.76 (6H)
[C₄₈H₈₉N₇O₃H]⁺:812.74

【0097】

［実施例４］
（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－３－ヒドロキシプロピオネート（以下、脂質（Ｉｄ）とも称す）の合成
脂質（Ｉｄ）は、脂質（Ｉａ）の第１アミノ酸をＳｅｒに変更した脂質である。以下に、脂質（Ｉｄ）の合成方法について説明する。なお、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）までの工程と同じであるため省略する。

【0098】

工程（ｄ６）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮ－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチル）セリネートの合成

【化40】

工程（ａ５）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オール（３．０ｇ、５．７ｍｍｏｌ）と、予めセリンのアミノ基およびヒドロキシ基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、ｔＢｕ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（２．７ｇ、６．９ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（１．８ｇ、８．７ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（７０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮ－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチル）セリネートを得た（３．７ｇ、４．２ｍｍｏｌ、７２％）。

【0099】

工程（ｄ７）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＯ－（ｔｅｒｔ－ブチル）セリネートの合成

【化41】

工程（ｄ６）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮ－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチル）セリネート（３．７ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（４０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＯ－（ｔｅｒｔ－ブチル）セリネートを得た（２．４ｇ、３．６ｍｍｏｌ、８６％）。

【0100】

工程（ｄ８）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮ－（Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニル）－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチル）セリネートの合成

【化42】

工程（ｄ７）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＯ－（ｔｅｒｔ－ブチル）セリネート（２．４ｇ、３．６ｍｍｏｌ）と、予めアルギニンのアミノ基およびグアニジノ基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、Ｐｂｆ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（２．８ｇ、４．３ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（１．１ｇ、５．４ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（４４ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（２４ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮ－（Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニル）－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチル）セリネートを得た（３．０ｇ、２．４ｍｍｏｌ、６８％）。

【0101】

工程（ｄ９）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＯ－（ｔｅｒｔ－ブチル）－Ｎ－（Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５ －イル）アルギニル）セリネートの合成

【化43】

工程（ａ８）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮ－（Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニル）－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチル）セリネート（３．０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（６ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＯ－（ｔｅｒｔ－ブチル）－Ｎ－（Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニル）セリネートを得た（１．８ｇ、１．８ｍｍｏｌ、７２％）。

【0102】

工程（ｄ９）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルアルギニルセリネート（脂質（Ｉｄ））の合成

【化44】

工程（ｄ８）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＯ－（ｔｅｒｔ－ブチル）－Ｎ－（Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニル）セリネート（１．８ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルアルギニルセリネート（脂質（Ｉｄ））を得た（０．２０ｇ、０．２６ｍｍｏｌ、１５％）。

【0103】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ5.33 (dd, 4H), 4.81 (s, 2H), 4.70-3.46 (m, 3H), 3.46-2.81 (m, 2H), 2.27-1.85 (m, 10H), 1.85-1.37 (m, 6H), 1.37-0.93 (m, 46H), 0.87 (td, 6H)
[C₄₅H₈₇N₅O₄H]⁺:762.92

【0104】

［実施例５］
（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－３－ヒドロキシブタノエート（以下、脂質（Ｉｅ）とも称す）の合成
脂質（Ｉｅ）は、脂質（Ｉａ）の第１アミノ酸をＴｈｒに変更した脂質である。以下に、脂質（Ｉｅ）の合成方法について説明する。なお、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）までの工程と同じであるため省略する。

【0105】

工程（ｅ６）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）ブタノエートの合成

【化45】

工程（ａ５）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オール（５．０ｇ、９．６ｍｍｏｌ）と、予めトレオニンのアミノ基およびヒドロキシ基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、ｔＢｕ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（４．６ｇ、１２ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（２．６ｇ、１３ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（０．２４ｇ、１．９ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）ブタノエートを得た（６．８ｇ、７．６ｍｍｏｌ、７９％）。

【0106】

工程（ｅ７）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－２－アミノ－３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）ブタノエートの合成

【化46】

工程（ｅ６）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）ブタノエート（５．０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（４０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－２－アミノ－３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）ブタノエートを得た（２．０ｇ、３．０ｍｍｏｌ、５３％）。

【0107】

工程（ｅ８）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－５－（３－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）グアニジノ）ペンタナミド）ブタノエートの合成

【化47】

工程（ｅ７）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－２－アミノ－３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）ブタノエート（２．０ｇ、３．０ｍｍｏｌ）と、予めアルギニンのアミノ基およびグアニジノ基に保護基（それぞれＢｏｃ基、Ｐｂｆ基）を付加させたＢｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（１．７ｇ、３．３ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（０．７３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（３６ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－５－（３－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）グアニジノ）ペンタナミド）ブタノエートを得た（３．１ｇ、２．６ｍｍｏｌ、８８％）。

【0108】

工程（ｅ９）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－３－ヒドロキシブタノエート（脂質（Ｉｅ））の合成

【化48】

工程（ｅ８）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－５－（３－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）グアニジノ）ペンタナミド）ブタノエート（２．０ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（２Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－３－ヒドロキシブタノエート（脂質（Ｉｅ））を得た（０．３ｇ、０．３８ｍｍｏｌ、２０％）。

【0109】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ5.45-5.19 (4H), 4.88-4.76 (1H), 4.45-4.32 (1H), 4.30-4.10(2H), 3.28-2.98 (2H), 2.16-1.88 (10H), 1.88-1.62 (2H), 1.62-1.48(4H), 1.39-0.94 (49H), 0.93-0.78 (6H)
[C₄₆H₈₉N₅O₄H]⁺:776.72

【0110】

［実施例６］
（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルアルギニルメチオニネート（以下、脂質（Ｉｆ）とも称す）の合成
脂質（Ｉｆ）は、脂質（Ｉａ）の第１アミノ酸をＭｅｔに変更した脂質である。以下に、脂質（Ｉｆ）の合成方法について説明する。なお、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）の工程と同じであるため省略する。

【0111】

工程（ｆ６）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）メチオニネートの合成

【化49】

工程（ａ５）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オール（３．０ｇ、５．８ｍｍｏｌ）と、予めメチオニンのアミノ基に保護基（Ｆｍｏｃ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（２，７ｇ、６．９ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（１．８ｇ、８．７ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（７０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）メチオニネートを得た（２．９ｇ、３．４ｍｍｏｌ、５８％）。

【0112】

工程（ｆ７）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルメチオニネートの合成

【化50】

工程（ｆ６）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）メチオニネート（２．９ｇ、３．４ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１５ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルメチオニネートを得た（１．９ｇ、２．９ｍｍｏｌ、８７％）。

【0113】

工程（ｆ８）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニルメチオニネートの合成

【化51】

工程（ｆ７）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルメチオニネート（１．９ｇ、２．９ｍｍｏｌ）と、予めアルギニンのアミノ基とグアニジノ基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、Ｐｂｆ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（２．３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（０．９０ｇ、４．４ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（３６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニルメチオニネートを得た（２．６ｇ、２．１ｍｍｏｌ、７１％）。

【0114】

工程（ｆ９）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニルメチオニネートの合成

【化52】

工程（ｆ８）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニルメチオニネート（２．６ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１５ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニルメチオニネートを得た（１．３ｇ、１．２ｍｍｏｌ、５８％）。

【0115】

工程（ｆ１０）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮ－（２－アミノ－５－グアニジノ－１－イミノペンチル）－Ｓ－エチルホモシステイネート（脂質（Ｉｆ））の合成

【化53】

工程（ｆ９）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮｗ－（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）アルギニルメチオニネート（１．３ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルＮ－（２－アミノ－５－グアニジノ－１－イミノペンチル）－Ｓ－エチルホモシステイネート（脂質（Ｉｆ））を得た（０．２１ｇ、０．２６ｍｍｏｌ、２２％）。

【0116】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ5.34 (d, 4H), 5.03 (s, 1H), 4.78 (d, 1H), 3.10-2.82 (m, 5H), 2.22-1.72 (m, 13H), 1.70-1.60 (2H), 1.60-1.36 (m, 6H), 1.24 (s, 46H), 0.99-0.76 (m, 6H)
[C₄₇H₉₁N₅O₃SH]⁺:806.73

【0117】

［実施例７］
３－（２，６－ジアミノヘキサナミド）－４－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（以下、脂質（Ｉｇ）とも称す）の合成
脂質（Ｉｇ）は、脂質（Ｉａ）の第２アミノ酸をＬｙｓに変更した脂質である。以下に、脂質（Ｉｇ）の合成方法について説明する。なお、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程および脂質親和性領域と第１アミノ酸とを結合する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ７）の工程と同じであるため省略する。

【0118】

工程（ｇ８）：４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルアスパラギン酸の合成

【化54】

工程（ａ７）で得た４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）アスパラギン酸（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）と、予めリシンのアミノ基およびグアニジノ基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、Ｂｏｃ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（１．２ｇ、２．６ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（０．６７ｇ、３．３ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（２７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（２２ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルアスパラギン酸を得た（１．７ｇ、１．５ｍｍｏｌ、６８％）。

【0119】

工程（ｇ９）：４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルアスパルテートの合成

【化55】

工程（ｇ８）で得た４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルアスパラギン酸（１．７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１５ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルアスパルテートを得た（０．８８ｇ、０．９６ｍｍｏｌ、６５％）。

【0120】

工程（ｇ１０）：３－（２，６－ジアミノヘキサナミド）－４－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸の合成

【化56】

工程（ｄ９）で得た４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルアスパルテート（０．８８ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の３－（２，６－ジアミノヘキサナミド）－４－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（脂質（Ｉｇ））を得た（０．２６ｇ、０．３４ｍｍｏｌ、３５％）。

【0121】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ5.32 (t, 4H), 4.90-4.62 (m, 1H),4.14（m, 1H）3.02 (s, 2H), 2.95-2.60 (m, 1H), 2.12-1.81 (m, 8H), 1.72 (s, 2H), 1.65-1.42 (m, 6H), 1.35-0.98 (m, 48H), 0.86 (t, 6H)
[C₄₆H₈₇N₃O₅H]⁺:762.74

【0122】

［実施例８］
４－（２，６－ジアミノヘキサナミド）－５－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－５－オキソペンタン酸（以下、脂質（Ｉｈ）とも称す）の合成
脂質（Ｉｈ）は、脂質（Ｉａ）の第１アミノ酸をＧｌｕに、第２アミノ酸をＬｙｓに変更した脂質である。以下に、脂質（Ｉｈ）の合成方法について説明する。なお、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程および脂質親和性領域と第１アミノ酸とを結合する工程は、脂質（Ｉｂ）の工程（ｂ１）～工程（ｂ７）までの工程と同じであるため省略する。

【0123】

工程（ｈ８）：５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルグルタミン酸の合成

【化57】

工程（ｂ７）で得た５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）グルタミン酸（１．５ｇ、２．１ｍｍｏｌ）と、予めリシンのアミノ基およびグアニジノ基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、Ｂｏｃ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（１．２ｇ、２．６ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（０．６６ｇ、３．２ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（２６ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（２１ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルグルタミン酸を得た（１．７ｇ、１．５ｍｍｏｌ、７０％）。

【0124】

工程（ｈ９）：５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルグルタミン酸の合成

【化58】

工程（ｇ８）で得た５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルグルタミン酸（１．７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１５ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルグルタミン酸を得た（１．１ｇ、１．２ｍｍｏｌ、７８％）。

【0125】

工程（ｈ１０）：４－（２，６－ジアミノヘキサナミド）－５－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－５－オキソペンタン酸の合成

【化59】

工程（ｄ９）で得た４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）リシルアスパルテート（１．１ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の４－（２，６－ジアミノヘキサナミド）－５－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－５－オキソペンタン酸（脂質（Ｉｈ））を得た（０．２３ｇ、０．２９ｍｍｏｌ、２５％）。

【0126】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ7.94 (1H), 6.98 (1H), 5.39-5.25 (4H), 4.88-4.78 (1H), 4.60-4.31 (1H), 4.20-4.07 (1H), 3.51-3.43 (1H), 3.36-3.23 (2H), 3.14-2.91 (2H), 2.05-1.81 (8H), 1.82-1.70 (2H), 1.54-1.38 (6H), 1.37-1.13 (48H), 0.89-0.79 (6H)
[C₄₇H₈₉N₃O₅H]⁺:776.70

【0127】

［実施例９］
４－（２－アミノ－３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパナミド）－５－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－５－オキソペンタン酸（以下、脂質（Ｉｉ）とも称す）の合成
脂質（Ｉｉ）は、脂質（Ｉａ）の第１アミノ酸をＧｌｕに、第２アミノ酸をＨｉｓに変更した脂質である。以下に、脂質（Ｉｉ）の合成方法について説明する。なお、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程および脂質親和性領域と第１アミノ酸とを結合する工程は、脂質（Ｉｂ）の工程（ｂ１）～工程（ｂ７）の工程と同じであるため省略する。

【0128】

工程（ｉ８）：５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎａ－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）Ｎｔ－トリチルヒスチジルグルタミン酸の合成

【化60】

工程（ｂ７）で得た５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）グルタミン酸（１．５ｇ、２．１ｍｍｏｌ）と、予めヒスチジンのアミノ基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、Ｔｒｔ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（１．６ｇ、２．６ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（０．６６ｇ、３．２ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（２６ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（２１ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎａ－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）Ｎｔ－トリチルヒスチジルグルタミン酸を得た（１．８ｇ、１．４ｍｍｏｌ、６５％）。

【0129】

工程（ｉ９）：５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎｔ－トリチルヒスチジルグルタミン酸の合成

【化61】

工程（ｉ８）で得た５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）Ｎｔ－トリチルヒスチジルグルタミン酸（１．８ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１５ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎｔ－トリチルヒスチジルグルタミン酸を得た（１．１ｇ、１．０ｍｍｏｌ、７３％）。

【0130】

工程（ｉ１０）：４－（２－アミノ－３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパナミド）－５－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－５－オキソペンタン酸の合成

【化62】

工程（ｉ９）で得た５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）Ｎｔ－トリチルヒスチジルグルタミン酸（１．１ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の４－（２－アミノ－３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパナミド）－５－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－５－オキソペンタン酸（脂質（Ｉｉ））を得た（０．１４ｇ、０．１８ｍｍｏｌ、１８％）。

【0131】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.34 (d, J = 15.1 Hz, 4H), 4.86 (s, 1H), 3.83-3.47 (m, 1H), 3.35-2.83 (m, 3H), 2.29 (s, 2H), 2.03 (d, J = 34.8 Hz, 10H), 1.66-1.36 (m, 6H), 1.24 (s, 46H), 0.96-0.74 (m, 6H)
[C₄₇H₈₄N₄O₅H]⁺:785.65

【0132】

［実施例１０］
（６Ｚ，９Ｚ，２７Ｚ，３０Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－６，９，２７，３０－テトラエン－１８－イル２－（２－アミノ－５－グアニジノペンタンアミド）－３－ヒドロキシブタノエート（以下、脂質（Ｉｊ）とも称す）の合成
脂質（Ｉｊ）は、脂質（Ｉｅ）の脂質親和性領域の炭化水素基の不飽和結合の数を変更した脂質である。

【0133】

【化63】

合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）の工程と同様な手順で行った。また、脂質親和性領域に対して第１アミノ酸、第２アミノ酸を結合する工程は、脂質（Ｉｅ）の合成工程のうち、脂質親和性領域に対して第１アミノ酸、第２アミノ酸を結合する工程（工程（ｅ６）～工程（ｅ８））と同様な手順で行い、（６Ｚ，９Ｚ，２７Ｚ，３０Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－６，９，２７，３０－テトラエン－１８－イル２－（２－アミノ－５－グアニジノペンタンアミド）－３－ヒドロキシブタノエート（脂質（Ｉｊ））を得た。

【0134】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ5.43-5.18 (8H), 4.88-4.76(1H), 4.46-4.36(1H), 4.34-4.18 (2H), 3.30-2.94 (2H), 2.78-2.72(4H), 2.10-1.82 (10H), 1.81-1.42 (6H), 1.40-0.97 (37H), 0.93-0.69 (6H)
[C₄₆H₈₅N₅O₄H]⁺:772.70

【0135】

［実施例１１］
４－（２－アミノ－５－グアニジノペンタンアミド）－５－オキソ－５－（（（９Ｚ，３０Ｚ）－テトラコンタ－９，３０－ジエン－１８－イル）オキシ）ペンタン酸（以下、脂質（Ｉｋ）とも称す）の合成
脂質（Ｉｋ）は、脂質（Ｉｂ）の脂質親和性領域の炭化水素基の炭素数を変更した脂質である。

【0136】

【化64】

合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）の工程と同様な手順で行った。また、脂質親和性領域に対して第１アミノ酸、第２アミノ酸を結合する工程は、脂質（Ｉｂ）の合成工程のうち、脂質親和性領域に対して第１アミノ酸、第２アミノ酸を結合する工程（工程（ｂ６）～工程（ｂ１０））と同様な手順で行い、４－（２－アミノ－５－グアニジノペンタンアミド）－５－オキソ－５－（（（９Ｚ，３０Ｚ）－テトラコンタ－９，３０－ジエン－１８－イル）オキシ）ペンタン酸（脂質（Ｉｋ））を得た。

【0137】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.47-5.18 (4H),4.88-4.76(1H), 4.46-4.36(1H), 4.34-4.18 (1H), 4.16-3.92 (1H), 3.46-2.85 (2H), 2.56-2.10 (3H), 2.09-1.95 (10H), 1.77-1.57 (2H), 1.57-1.42 (4H), 1.41-1.06 (54H), 0.93-0.78 (6H)
[C₅₁H₉₇N₅O₅H]⁺:860.74

【0138】

［実施例１２］
４－（２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－５－オキソ－５－（（（１０Ｚ，３４Ｚ）－テトラテトラコンタ－１０，３４－ジエン－２２－イル）オキシ）ペンタン酸（以下、脂質（Ｉｌ）とも称す）の合成
脂質（Ｉｌ）は、脂質（Ｉｂ）の脂質親和性領域の炭化水素基の炭素数を変更した脂質である。

【0139】

【化65】

合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）の工程と同様な手順で行った。また、脂質親和性領域に対して第１アミノ酸、第２アミノ酸を結合する工程は、脂質（Ｉｂ）の合成工程のうち、脂質親和性領域に対して第１アミノ酸、第２アミノ酸を結合する工程（工程（ｂ６）～工程（ｂ１０））と同様な手順で行い、４－（２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－５－オキソ－５－（（（１０Ｚ，３４Ｚ）－テトラテトラコンタ－１０，３４－ジエン－２２－イル）オキシ）ペンタン酸（脂質（Ｉｌ））を得た。

【0140】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ5.46-5.18 (4H), 4.95-4.70 (1H), 4.70-4.41 (1H), 4.26-3.81 (1H), 3.40-2.66 (2H), 2.65-2.11 (2H), 2.08-1.81 (10H), 1.81-1.43 (8H), 1.42-0.98 (62H), 0.98-0.78 (7H)
[C₅₅H₁₀₅N₅O₅H]⁺:916.92

【0141】

［比較例１］
（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル２－アミノ－３－ヒドロキシブタノエート（以下、脂質（ＣＥａ）とも称す）の合成

【化66】

脂質（ＣＥａ）は、脂質親和性領域が炭素数３６個の炭化水素基であり、親水性領域が、Ｔｈｒ（第１アミノ酸）である。
脂質（ＣＥａ）の合成方法は、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程については、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）までの工程と同じである。また、脂質親和性領域に対して第１アミノ酸を結合させる工程は、脂質（Ｉｅ）の工程（ｅ６）、工程（ｅ７）、工程（ｅ９）の工程と同様な手順で行った。

【0142】

¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.44-5.25 (m, 4H), 5.12-4.89 (m, 1H), 3.86 (d, J = 4.6 Hz, 2H), 1.98 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 1.72-1.33 (m, 4H), 1.42-1.06 (m, 49H), 0.97-0.76 (m, 6H)

【0143】

［比較例２］
３－グアニジノ－４－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（以下、脂質（ＣＥｂ）とも称す）の合成

【化67】

脂質（ＣＥｂ）は、脂質（ＣＥａ）の第１アミノ酸をグアニジノ基を有する化合物に変更した脂質である。以下に、脂質（ＣＥｂ）の合成方法について説明する。なお、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程およびその後の一部の工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ７）の工程と同じであるため省略する。

【0144】

工程：４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（Ｅ）－Ｎ，Ｎ’－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）カルバミミドイル）アスパルテートの合成

【化68】

４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）アスパルテート（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）と、Ｎ，Ｎ’－ジ－ＢＯＣ－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン（０．７４ｇ、２．４ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（０．２６ｇ、２．６ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチした。有機相を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（Ｅ）－Ｎ，Ｎ’－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）カルバミミドイル）アスパルテートを得た（１．８８ｇ、２．０ｍｍｏｌ、９３％）。

【0145】

工程：３－グアニジノ－４－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－４－オキソブタン酸（脂質（ＣＥｂ））の合成

【化69】

４－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（Ｅ）－Ｎ，Ｎ’－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）カルバミミドイル）アスパルテート（１．８８ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡとも表記する）（５ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の脂質（ＣＥｂ）を得た（０．６６ｇ、０．９８ｍｍｏｌ、６１％）。

【0146】

¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.44-5.25 (m, 4H), 4.87 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.48-3.31 (m, 1H), 3.20-3.16 (t, 1H), 2.09-1.86 (m, 8H),1.78-1.52 (m,4H), 1.38-1.18 (m, 46H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H)

【0147】

［比較例３］
４－グアニジノ－５－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－５－オキソペンタン酸（以下、脂質（ＣＥｃ）とも称す）の合成

【化70】

脂質（ＣＥｃ）は、脂質（ＣＥａ）の第１アミノ酸をグアニジノ基を有する化合物に変更した脂質である。以下に、脂質（ＣＥｃ）の合成方法について説明する。なお、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程およびその後の一部の工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）および工程（ｂ６）、（ｂ７）の工程と同じであるため省略する。

【0148】

工程：５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（Ｚ）－Ｎ，Ｎ’－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）カルバミミドイル）グルタメートの合成

【化71】

５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）グルタメート（１．０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）と、Ｎ，Ｎ’－ジ－ＢＯＣ－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン（０．４８ｇ、１．６ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（０．１７ｇ、１．７ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチした。有機相を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（Ｚ）－Ｎ，Ｎ’－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）カルバミミドイル）グルタメートを得た（１．３４ｇ、１．４ｍｍｏｌ、１００％）。

【0149】

工程：４－グアニジノ－５－（（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）オキシ）－５－オキソペンタン酸（脂質（ＣＥｃ））の合成

【化72】

５－（ｔｅｒｔ－ブチル）１－（（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル）（（Ｚ）－Ｎ，Ｎ’－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）カルバミミドイル）グルタメート（１．３４ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を、トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡとも表記する）（５ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の脂質（ＣＥｃ）を得た（０．４５ｇ、０．６７ｍｍｏｌ、４４％）。

【0150】

¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.44-5.25 (m, 4H), 4.87 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.48-3.31 (m, 1H), 3.20-3.16 (ｍ, 2H), 2.09-1.86 (m, 10H),1.78-1.52 (m,4H), 1.38-1.18 (m, 46H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H)

【0151】

［比較例４］
（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルリシネート（以下、脂質（ＣＥｄ）とも称す）の合成

【化73】

脂質（ＣＥｄ）は、脂質（ＣＥａ）の第１アミノ酸をＬｙｓに変更した脂質である。以下に、脂質（ＣＥｄ）の合成方法について説明する。なお、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）までの工程と同じであるため省略する。

【0152】

工程（ＣＥｄ１）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル Ｎ２，Ｎ６－ビス（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）リシネートの合成

【化74】

工程（ａ５）で得た（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－オール（２．０ｇ、３．９ｍｍｏｌ）と、Ｎ^α，Ｎ^ε－ビス［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ）（４．５５ｇ、７．７ｍｍｏｌ）とＤＣＣ（２．０ｇ、７．７ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル Ｎ２，Ｎ６－ビス（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）リシネートを得た（３．８ｇ、３．５ｍｍｏｌ、９０％）。

【0153】

工程（ＣＥｄ２）：（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルリシネートの合成

【化75】

（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イル Ｎ２，Ｎ６－ビス（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）リシネート（３．５ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（６ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の脂質（ＣＥｄ）を得た（１．５ｇ、２．３ｍｍｏｌ、７２％）。

【0154】

¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.44-5.25 (m, 4H), 4.87 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.48-3.31 (m, 1H), 3.20-3.16 (t, 1H), 2.70-2.66 (t, 1H), 2.09-1.86 (m, 10H),1.78-1.52 (m,4H), 1.38-1.18 (m, 50H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H)

【0155】

［比較例５］
（６Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－６，１４－ジエン－１０－イルリシネート（以下、脂質（ＣＥｅ）とも称す）の合成

【化76】

脂質（ＣＥｅ）は、脂質（ＣＥｄ）の脂質親和性領域の炭化水素基の炭素数を変更した脂質である。脂質（ＣＥｅ）の合成方法において、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）の工程と同様な手順で行った。また、脂質親和性領域に対して、第１アミノ酸を付加させる工程は、脂質（ＣＥｄ）の工程（ＣＥｄ１）、工程（ＣＥｄ２）と同様に行い、脂質（ＣＥｅ）を得た。

【0156】

¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.44-5.25 (m, 4H), 4.87 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.48-3.31 (m, 1H), 3.20-3.16 (t, 1H), 2.70-2.66 (t, 1H), 2.09-1.86 (m, 24H), 1.38-1.18 (m, 8H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H)

【0157】

［比較例６］
（７Ｚ，２５Ｚ）－ドトリアコンタ－７，２５－ジエン－１６－イルリシネート（以下、脂質（ＣＥｆ）とも称す）の合成

【化77】

脂質（ＣＥｆ）は、脂質（ＣＥｄ）の脂質親和性領域の炭化水素基の炭素数を変更した脂質である。脂質（ＣＥｆ）の合成方法において、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）の工程と同様な手順で行った。また、脂質親和性領域に対して、第１アミノ酸を付加させる工程は、脂質（ＣＥｄ）の工程（ＣＥｄ１）、工程（ＣＥｄ２）と同様に行い、脂質（ＣＥｆ）を得た。

【0158】

¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.44-5.25 (m, 4H), 4.87 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.48-3.31 (m, 1H), 3.20-3.16 (t, 1H), 2.70-2.66 (t, 1H), 2.09-1.86 (m, 8H), 1.54-1.66 (4H,),1.38-1.18 (m, 42H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H)

【0159】

［比較例７］
（９Ｚ，３５Ｚ）－テトラテトラコンタ－９，３５－ジエン－２２－イルリシネート（以下、脂質（ＣＥｇ）とも称す）の合成

【化78】

脂質（ＣＥｇ）は、脂質（ＣＥｄ）の脂質親和性領域の炭化水素基の炭素数を変更した脂質である。脂質（ＣＥｇ）の合成方法において、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）の工程と同様な手順で行った。また、脂質親和性領域に対して、第１アミノ酸を付加させる工程は、脂質（ＣＥｄ）の工程（ＣＥｄ１）、工程（ＣＥｄ２）と同様に行い、脂質（ＣＥｇ）を得た。

【0160】

¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.44-5.25 (m, 4H), 4.87 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.48-3.31 (m, 1H), 3.20-3.16 (t, 1H), 2.70-2.66 (t, 1H), 2.09-1.86 (m, 10H), 1.54-1.66 (4H,),1.38-1.18 (m, 58H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H)

【0161】

［比較例８］
（３Ｚ，１５Ｚ）－ドコサ－３，１５－ジエン－７－イルリシネート（以下、脂質（ＣＥｈ）とも称す）の合成

【化79】

脂質（ＣＥｈ）は、脂質（ＣＥｄ）の脂質親和性領域の炭化水素基の炭素数を変更した脂質である。脂質（ＣＥｈ）の合成方法において、脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）の工程と同様な手順で行った。また、脂質親和性領域に対して、第１アミノ酸を付加させる工程は、脂質（ＣＥｄ）の工程（ＣＥｄ１）、工程（ＣＥｄ２）と同様に行い、脂質（ＣＥｈ）を得た。

【0162】

¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.44-5.25 (m, 4H), 4.87 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.48-3.31 (m, 1H), 3.20-3.16 (t, 1H), 2.70-2.66 (t, 1H), 2.09-1.86 (m, 8H), 1.54-1.66 (6H),1.38-1.18 (m, 22H), 1.09 (3H, t, J = 7.5 Hz), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 3H)

【0163】

［比較例９］
（３Ｚ，１９Ｚ）－オクタコサ－３，１９－ジエン－７－イルリシネート（以下、脂質（ＣＥｉ）とも称す）の合成

【化80】

脂質（ＣＥｉ）は、脂質（ＣＥｄ）の脂質親和性領域の炭化水素基の炭素数を変更した脂質である。脂質（ＣＥｉ）の合成方法において、脂質親和性領域を合成する工程は、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）の工程と同様な手順で行った。また、脂質親和性領域に対して、第１アミノ酸を付加させる工程は、脂質（ＣＥｄ）の工程（ＣＥｄ１）、工程（ＣＥｄ２）と同様に行い、脂質（ＣＥｉ）を得た。

【0164】

¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.44-5.25 (m, 4H), 4.87 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.48-3.31 (m, 1H), 3.20-3.16 (t, 1H), 2.70-2.66 (t, 1H), 2.09-1.86 (m, 14H), 1.54-1.66 (14H),1.38-1.18 (m, 30H), 1.09 (3H, t, J = 7.5 Hz), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 3H)

【0165】

［比較例１０］
３－（２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－４－（２，３－ビス（（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エノイル）オキシ）プロポキシ）－４－オキソブタン酸（以下、脂質（ＣＥｊ）とも称す）の合成

【化81】

脂質（ＣＥｊ）は、脂質（Ｉａ）の脂質親和性領域の炭化水素基を変更した脂質である。以下に、脂質（ＣＥｊ）の合成方法について説明する。

【0166】

【化82】

（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）メタノール（５．０ｇ、３７．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した溶液に水素化ナトリウム（１．２ｇ、５０．３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で翌日まで撹拌し、０℃まで冷却して４－メトキシベンジルクロリド（７．１ｇ、４５．４ｍｍｏｌ）滴下した。室温で１時間撹拌した後に水でクエンチし、ヘプタンにて抽出し、有機相をイオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の４－（（（４－メトキシベンジル）オキシ）メチル）－２，２－ジメチル－１，３－ジオキソランを得た（８．６ｇ、３４．１ｍｍｏｌ、９０％）。

【0167】

【化83】

４－（（（４－メトキシベンジル）オキシ）メチル）－２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン（８．６ｇ、３４．１ｍｍｏｌ）を水（４０ｍＬ）と酢酸（１６０ｍＬ）に溶解し、５０℃に昇温して１時間反応した。反応終了後に減圧下で濃縮して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の３－（（４－メトキシベンジル）オキシ）プロパン－１，２－ジオールを得た（６．４ｇ、３０．０ｍｍｏｌ、８８％）。

【0168】

【化84】

３－（（４－メトキシベンジル）オキシ）プロパン－１，２－ジオール（６．４ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）と、オレイン酸（１０．２ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（７．４ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（０．３７ｇ、３．０ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の３－（（４－メトキシベンジル）オキシ）プロパン－１，２－ジイルジオレエートを得た（１０．２ｇ、１３．８ｍｍｏｌ、４６％）。

【0169】

【化85】

３－（（４－メトキシベンジル）オキシ）プロパン－１，２－ジイルジオレエート（１０．２ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１２０ｍＬ）と水（１２ｍＬ）に溶解し、それに２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（ＤＤＱ）（６．０ｇ、４９．２ｍｍｏｌ）を添加したものを室温で翌日まで攪拌した。反応終了後に結晶をろ過によって除去してろ液を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の３－ヒドロキシプロパン－１，２－ジイルジオレエートを得た（６．５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ、７６％）。

【0170】

【化86】

３－ヒドロキシプロパン－１，２－ジイルジオレエート（２．０ｇ、３．２ｍｍｏｌ）と、予めアスパラギン酸のアミノ基およびカルボニル基に保護基（それぞれＦｍｏｃ基、ｔＢｕ基）を付加させたＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ（１．５９ｇ、３．８ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（１．３３ｇ、６．４ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（０．２ｇ、１．６ｍｍｏｌ）とをジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の１－（２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロピル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アスパラギン酸を得た（３．１ｇ、３．０ｍｍｏｌ、９５％）。

【0171】

【化87】

１－（２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロピル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アスパラギン酸（３．１ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（６ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の１－（２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロピル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）アスパラギン酸を得た（１．７５ｇ、２．２ｍｍｏｌ、７２％）。

【0172】

【化88】

１－（２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロピル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）アスパラギン酸（１．７５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）と、予めアルギニンのアミノ基およびグアニジノ基に保護基（Ｂｏｃ基）を付加させたＢｏｃ－Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２－ＯＨ（１．７２ｇ、２．６ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（０．５５ｇ、２．６ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（２７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）とをジクロロメタン（１３ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の１－（２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロピル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）Ｎ２，Ｎｗ，Ｎｗ’－トリス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アルギニルアスパルテートを得た（１．６ｇ、１．２ｍｍｏｌ、５８％）。

【0173】

【化89】

１－（２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロピル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）Ｎ２，Ｎｗ，Ｎｗ’－トリス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アルギニルアスパルテート（１．６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（４ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の１－（２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロピル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）アルギニルアスパルテートを得た（０．３０ｇ、０．３３ｍｍｏｌ、２６％）。

【0174】

¹H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-D) δ5.32 (m, 4H), 5.30-5.18(m,1H), 4.90-4.75 (m, 1H), 4.35-4.05（m, 4H), 3.15-3.02 (4H), 2.95-2.20 (m, 4H), 2.12-1.81 (m, 10H), 1.65-1.42 (m, 12H), 1.35-0.98 (m, 28H), 0.86 (t, 6H)

【0175】

［比較例１１］
３－（２－アミノ－５－グアニジノペンタナミド）－４－（（２，３－ビス（（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エノイル）オキシ）プロピル）アミノ）－４－オキソブタン酸（以下、脂質（ＣＥｋ）とも称す）の合成

【化90】

脂質（ＣＥｋ）は、脂質（Ｉａ）の脂質親和性領域の炭化水素基を変更した脂質である。以下に、脂質（ＣＥｋ）の合成方法について説明する。

【0176】

【化91】

Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ（３．４ｇ、８．３ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（２．３ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（０．１０ｇ、８．３ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（１０５ｍＬ）に溶解し、混合溶液を室温で２時間攪拌した。この溶液に、ＤＭＦ（５５ｍＬ）に溶解した３－アミノ－１，２－プロパンジオール（４．０ｇ、７．７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的のｔｅｒｔ－ブチル ３－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－（（２，３－ジヒドロキシプロピル）アミノ）－４－オキソブタノエートを得た（３．５ｇ、７．２ｍｍｏｌ、８７％）。

【0177】

【化92】

ｔｅｒｔ－ブチル ３－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－（（２，３－ジヒドロキシプロピル）アミノ）－４－オキソブタノエート（３．５ｇ、７．５ｍｍｏｌ）と、オレイン酸（４．４７ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）と、ＤＣＣ（３．８９ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（０．０９ｇ、０．８ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の３－（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－４－オキソブタンアミド）プロパン－１，２－ジイル ジオレエートを得た（３．４ｇ、３．４ｍｍｏｌ、４５％）。

【0178】

【化93】

３－（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－４－オキソブタンアミド）プロパン－１，２－ジイル ジオレエート（３．５ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（６ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の３－（２－アミノ－４－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－４－オキソブタンアミド）プロパン－１，２－ジイル ジオレエートを得た（３．２ｇ、３．２ｍｍｏｌ、９１％）。

【0179】

【化94】

３－（２－アミノ－４－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－４－オキソブタンアミド）プロパン－１，２－ジイル ジオレエート（１．０ｇ、１．３ｍｍｏｌ）と、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（０．９ｇ、１．４ｍｍｏｌ）（ＴＣＩ製）と、ＤＣＣ（０．３１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）と、ＤＭＡＰ（０．０３ｇ、０．３ｍｍｏｌ）と、をジクロロメタン（１３ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、水でクエンチし、析出したジシクロヘキシルウレアをろ過によって除去した。ろ液を濃縮した残渣を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の８－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエチル）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６，９－トリオキソ－５－（３－（３－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）グラニジノ）プロピル）－２－オキサ－４，７，１０－トリアザトリデカン－１２，１３－ジオールジウレアートを得た（１．６８ｇ、１．２ｍｍｏｌ、９３％）。

【0180】

【化95】

８－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエチル）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６，９－トリオキソ－５－（３－（３－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）グラニジノ）プロピル）－２－オキサ－４，７，１０－トリアザトリデカン－１２，１３－ジオールジウレアート（１．６８ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（６ｍＬ）に溶解した。室温で翌日まで撹拌した後、減圧下、溶媒を濃縮した。残渣を酢酸エチルに分散させ、析出物をろ過によって除去した。ろ液を酢酸エチルに溶解し、有機相を１０％塩酸、飽和重曹水、イオン交換水で洗浄後、有機相を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン）にて精製し、目的の３－（２－（２－アミノ－５－（３－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）グアニジノ）ペンタンアミド）－４－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－４－オキソブタンアミド）プロパン－１，２－ジエチル ジオレインを得た（１．２ｇ、１．０ｍｍｏｌ、８５％）。

【0181】

【化96】

３－（２－（２－アミノ－５－（３－（（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）スルホニル）グアニジノ）ペンタンアミド）－４－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－４－オキソブタンアミド）プロパン－１，２－ジエチル ジオレイン（１．２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（４ｍＬ）に溶解した。室温で１時間撹拌した後、減圧下溶媒を濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）にて精製し、目的の脂質（ＣＥｋ）を得た（０．２４ｇ、０．２７ｍｍｏｌ、２７％）。

【0182】

¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.34 (d, J = 17.4 Hz, 4H), 5.08 (s, 1H), 4.94-4.64 (1H), 4.21 (s, 1H), 4.02 (s, 1H), 3.39 (s, 1H), 3.01 (s, 1H), 2.43-2.14 (m, 4H), 1.99 -1.70 (m,10H), 1.55 (s, 5H), 1.26 (m, 46H), 0.86 (t, J = 6.6 Hz, 6H)

【0183】

［比較例１２］
（９Ｚ，２７Ｚ）－ヘキサトリアコンタ－９，２７－ジエン－１８－イルメチオニネート（以下、脂質（ＣＥｌ）とも称す）の合成

【化97】

脂質（ＣＥｌ）は、脂質（ＣＥａ）の第１アミノ酸をＭｅｔに変更した脂質である。
脂質（ＣＥｌ）の合成方法は、合成工程中の脂質親和性領域を合成する工程については、脂質（Ｉａ）の工程（ａ１）～工程（ａ５）までの工程と同じである。また、脂質親和性領域に対して第１アミノ酸を結合させる工程は、脂質（Ｉｆ）の工程（ｆ６）、工程（ｆ７）の工程と同様な手順で行った。

【0184】

¹H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 5.44-5.25 (m, 4H), 4.87 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.48-3.31 (m, 1H), 3.20-3.16 (t, 1H), 2.70-2.66 (t, 1H),2.19（s,3H）, 2.09-1.86 (m, 10H),1.78-1.52 (m,4H), 1.38-1.18 (m, 46H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H)

【0185】

［参考例１］
脂質（ｒ１）（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、ＳＭ１０２－３３４７４）は各評価を比較するため参考の脂質として用いた。

【化98】

【0186】

＜評価＞
つづいて、上記の実施例および比較例の脂質を用いて、ｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを内包する脂質ナノ粒子を含む組成物を作製し各評価を行った。

【0187】

［脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）の作製]
Ａ．脂質溶液、クエン酸バッファーの調製
まず、実施例および比較例の脂質を用いて脂質溶液を調製した。調製は次の手順で行った。
（ｉ）実施例および比較例の所定の脂質（１０ｍＭ、以下、メイン脂質とも称す。）のエタノール溶液、当該メイン脂質とは異なるヘルパー脂質（ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）：１０ｍＭ）のエタノール溶液、コレステロール（１０ｍＭ）のエタノール溶液を作製した。
（ｉｉ）上記（ｉ）で調製した各溶液をメイン脂質／ヘルパー脂質／コレステロール＝４５／１０／４５（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）になるように混合して脂質溶液を得た。

【0188】

次いで、クエン酸バッファーを調製した。具体的には、１ｍＭのクエン酸水溶液５０ｍＬと１ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液５０ｍＬをそれぞれ作製した。ｐＨ計で確認しながらクエン酸水溶液とクエン酸ナトリウム水溶液を混合し、ｐＨ＝４．５の１ｍＭクエン酸バッファーを調製した。

【0189】

Ｂ．脂質ナノ粒子の作製
続いて、マイクロ流路を用いて脂質ナノ粒子を作製した。マイクロ流路法はマイクロリアクターを用いて脂質溶液とｓｉＲＮＡ溶液またはｍＲＮＡ溶液を混合させることで脂質ナノ粒子を作製する方法である。なお、ｓｉＲＮＡ溶液としては、２１塩基対のｓｉＲＮＡをＲＦＷ（ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ）に溶解した溶液を用い、ｍＲＮＡ溶液としては、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（製造元）のＣｌｅａｎＣａｐ ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ（型番Ｌ－７６０２－１００）を用いた。
まず、ｓｉＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の作製方法について、以下に手順を記す。
（ｉ）上記脂質溶液と上記１ｍＭクエン酸バッファー、洗浄用のエタノールを２５℃に設定したインキュベーターで保温した。
（ｉｉ）マイクロ流路（ＹＭＣ社製、ＫＣ－Ｍ－Ｓ－ＳＵＳ）を、脂質溶液側はエタノール、ｓｉＲＮＡ溶液側はＲＦＷを流して洗浄した。
（ｉｉｉ）必要量の１ｍＭクエン酸バッファーとｓｉＲＮＡ溶液を混合し、ｓｉＲＮＡクエン酸バッファー溶液を作製した。
（ｉｖ）脂質溶液０．３３ｍＬ、ｓｉＲＮＡクエン酸バッファー溶液１．６６ｍＬをそれぞれ別のシリンジにとり、それぞれのポンプにセットした。なお、脂質溶液とｓｉＲＮＡクエン酸バッファー溶液とは、総流量３．３ｍＬ／ｍｉｎとなるように、また、総脂質とｓｉＲＮＡとのモル比が７０００：１、脂質濃度１．７ｍＭ、溶媒比（アルコール濃度）２４．１％となるように設定した。
（ｖ）装置をスタートさせ、流路内で脂質溶液とｓｉＲＮＡクエン酸バッファー溶液を激しく混合した。最初の約７５０μＬ分を廃棄して残りの溶液をエッペンドルフチューブに回収した。

【0190】

次いで、ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の作製方法について、以下に手順を記す。
（ｉ）上記脂質溶液と上記１ｍＭクエン酸バッファーを２５℃に設定したインキュベーターで保温した。
（ｉｉ）マイクロ流路（ＹＭＣ社製、ＫＣ－Ｍ－Ｓ－ＳＵＳ）を、脂質溶液側は脂質溶液のエタノール、ｍＲＮＡ溶液側はＲＦＷを流して洗浄した。
（ｉｉｉ）必要量の１ｍＭクエン酸バッファーとｍＲＮＡ溶液を混合し、ｍＲＮＡクエン酸バッファー溶液を作製した。なお、ここでの１ｍＭクエン酸バッファーは、酸性の１ｍＭクエン酸バッファーを用いてｐＨ４．５に調整されたものを用いた。
（ｉｖ）脂質溶液０．５２２ｍＬ、ｍＲＮＡクエン酸バッファー溶液１．４７８ｍＬをそれぞれ別のシリンジにとり、それぞれのポンプにセットした。なお、脂質溶液とｍＲＮＡクエン酸バッファー溶液の量は、脂質とｍＲＮＡとの重量比が３０：１になるように調整した量である。
（ｖ）脂質溶液の流量を６８５．７μＬ／ｍｉｎ、ｍＲＮＡクエン酸バッファー溶液の流量を２．９１４ｍＬ／ｍｉｎの設定で装置をスタートさせ、流路内で脂質溶液とｍＲＮＡクエン酸バッファー溶液を激しく混合した。最初の約１３．７５秒間を廃棄して残りの溶液をエッペンドルフチューブに回収した。

【0191】

なお、参考例１の脂質（ｒ１）を用いた、ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の作製方法を以下説明する。
脂質（ｒ１）を用いた、ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の作製は、下記の点を変更した以外、各実施例の脂質を用いた、ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の作製方法と同様にして行った。
脂質溶液の作製については次のようにした。（ｉ）脂質（ｒ１）（１０ｍＭ）のエタノール溶液、ヘルパー脂質（ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）：１０ｍＭ）のエタノール溶液、コレステロール（１０ｍＭ）のエタノール溶液、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（１０ｍＭ）のエタノール溶液を作製した。（ｉｉ）上記（ｉ）で調製した各溶液をメイン脂質／ヘルパー脂質／コレステロール／ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ＝５０／１０／３８．５／１．５（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）になるように混合して脂質溶液を得た。
続いてｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の作製方法については、（ｉｖ）脂質溶液とｍＲＮＡクエン酸バッファー溶液の量を、脂質（ｒ１）とｍＲＮＡとの重量比が１９．３５：１になるように調整した以外、各実施例の脂質を用いた、ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の作製方法と同様にして行った。

【0192】

続いて、上記のようにして得られたｓｉＲＮＡまたはｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子含有溶液を透析膜（ＲＥＰＬＩＧＥＮ社製、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用い透析をすることで、使用したエタノールなどの有機溶媒やバッファーに含まれる塩などを除去した。以下に手順を示す。
（ｉ）透析膜を必要な長さに切り水につけて活性化させた。
（ｉｉ）活性化した透析膜の水気を切り、クリップで下方を留めて下方より脂質ナノ粒子含有溶液が漏れないようにした。
（ｉｉｉ）透析膜内に脂質ナノ粒子含有溶液をピペットで計量しながら入れ、入れ終わってからクリップで上方を留めた。
（ｉｖ）大量の水を満たした容器(ビーカーなど)に入れ、スターラーで透析膜が緩やかに回るくらいの速度で撹拌した。途中で数回水を交換しつつ、ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔで攪拌した。
（ｖ）透析終了後、透析膜を水から取り出した。ハサミを使って開放し、ピペットで計量しながら内容物を別の容器に移した。

【0193】

[脂質ナノ粒子の粒子径、多分散指数、ゼータ電位の測定]
上記の操作で得られた透析後の脂質ナノ粒子含有溶液をそれぞれ３０μＬ量りとり、当該脂質ナノ粒子含有溶液を超純水８００μＬを加えて希釈し、希釈した調製液を用いてゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ Ｕｌｔｒａ）により粒子径（ｎｍ）、多分散指数（ＰＤＩ）を測定した。粒子径は、超純水中でＺ－平均で評価した。また、ゼータ電位は、希釈溶液にｐＨ７．４ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用いて測定した。

【0194】

［脂質ナノ粒子のｓｉＲＮＡ内封率およびｍＲＮＡ内封率の評価］
脂質ナノ粒子のｓｉＲＮＡ内封率およびｍＲＮＡ内封率を次のようにして得た。まず、脂質ナノ粒子含有溶液に界面活性剤（シグマアルドリッチ社製、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、Ｘ－１００（還元型））を加え、脂質ナノ粒子を崩壊させて内封されているｓｉＲＮＡまたはｍＲＮＡを遊離させた。脂質ナノ粒子含有溶液と界面活性剤の量は、脂質ナノ粒子含有溶液に界面活性剤を加えた後の溶液４０μＬ中に、ｓｉＲＮＡまたはｍＲＮＡが２ｐｍｏｌ、界面活性剤が１％になるように調整した。次いで、当該溶液にリボグリーン試薬（ｓｉＲＮＡと作用して蛍光を発する試薬。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標） ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標） ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）を加え、蛍光強度計（ＴＥＣＡＮ社製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）で励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍの条件で蛍光強度を測定した。具体的には、当該溶液１０μＬにクエン酸バッファー６５μＬ加えて希釈した溶液に、リボグリーン試薬を２０００分の１に希釈した試薬７５μＬを添加して、蛍光強度を測定した。これにより、溶液中に存在する全ｓｉＲＮＡ量または全ｍＲＮＡ量を相対的に測定することができる。
続いて、脂質ナノ粒子含有溶液に界面活性剤を加えない状態でリボグリーン試薬を加え、同様に蛍光強度計で蛍光強度を測定した。界面活性剤を加えないことにより、脂質ナノ粒子に内封されずに溶液中に遊離しているｓｉＲＮＡまたはｍＲＮＡの量を相対的に測定することができる。
そして、上記のようにして得た、界面活性剤を加えた溶液より得た蛍光強度を蛍光強度ａ、界面活性剤を加えた溶液より得た蛍光強度を蛍光強度ｂとし、式（ａ－ｂ）／ａ×１００により、脂質ナノ粒子のｓｉＲＮＡ内封率（％）またはｍＲＮＡ内封率（％）を得た。なお、各蛍光強度ａ、ｂは、各溶液についての測定を３回行った結果の算術平均値からブランクを引いた値である。なお、ブランクは、細胞や脂質ナノ粒子が入っていない水を入れたウェルに対して同じ操作を行って測定した。

【0195】

［細胞実験１］
各実施例および各比較例の脂質を用いて作製した、ｓｉＲＮＡを内封させた脂質ナノ粒子を評価するためにＨＴ１０８０－ＥＧＦＰ（ヒト／線維肉腫）細胞を用いて細胞実験を行った。この細胞は緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＥＧＦＰ）を持たせた細胞である。細胞を溶解させた溶液の蛍光強度を測定することでＥＧＦＰの発現を容易に確認できるため、ＥＧＦＰの発現を抑制するｓｉＲＮＡを内封させた脂質ナノ粒子を作用させ、蛍光強度の低下を観察することで、用いた脂質ナノ粒子の性能を評価することができる。以下、細胞実験の手順を示す。

【0196】

Ａ．細胞の準備
（ｉ）液体培地（ＤＭＥＭ/Ｈａｍ’ｓＦ１２、ＦＢＳ＋、Ｐ／Ｓ＋）（ＦＢＳ：ウシ胎児血清、Ｐ／Ｓ：抗生物質）を冷蔵庫から取り出し３７℃設定の恒温器で調温した。
（ｉｉ）－８０℃の冷凍庫から細胞入りのクライオチューブを取り出し３７℃設定の恒温器で一気に解凍した。
（ｉｉｉ）解凍した細胞のストック液を蓋付き試験管に採取した。
（ｉｖ）細胞が入っていたチューブを液体培地で洗い、洗浄液も試験管に採取した。
（ｖ）試験管を遠心分離器にかけ、細胞を沈殿させた。
（ｖｉ）上清を吸い取り、液体培地を添加し優しくタップして細胞を分散させた。
（ｖｉｉ）分散させた液体培地を少量採取し、細胞数を顕微鏡で観察、計数した。
（ｖｉｉｉ）２４ウェルプレートに、１ウェルあたり２×１０⁴個の細胞数になるように細胞を播種した。なお、後述のＬＤＨアッセイ用のプレートには、９６ウェルプレートに、１ウェルあたり４×１０³個の細胞数になるように細胞を播種した。
（ｉｘ）２４ウェルプレートまたは９６ウェルプレートをインキュベーターに入れ、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で２４時間細胞を培養した。

【0197】

Ｂ．トランスフェクション
作製した脂質ナノ粒子を細胞に導入した。
（ｉ）上記Ａの（ｉ）と同様に調温した液体培地（ＦＢＳ－、Ｐ／Ｓ－）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％になるように添加した。
（ｉｉ）インキュベーターから２４ウェルプレートを取り出し、２４ウェルプレート中の液体培地上清を吸い取り、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。
（ｉｉｉ）洗浄した２４ウェルプレートに上記（ｉ）で作製した液体培地を４００μＬ添加した。また、濃度を調製したＬＮＰ溶液を１００μＬ添加した。
（ｉｖ）２４ウェルプレートをインキュベーターに入れ、細胞を培養した（２４時間）。
（ｖ）２４時間後、２４ウェルプレート中の液体培地上清を吸い取り、ＦＢＳ１０％入り液体培地（ＦＢＳ＋／Ｐ／Ｓ＋）を５００μＬ添加した。
（ｖｉ）２４ウェルプレートをインキュベーターに入れ、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で２４時間細胞を培養した。

【0198】

なお、後述のＬＤＨアッセイ用の細胞への脂質ナノ粒子の導入は、下記の通りに行った。
（ｉ）インキュベーターから９６ウェルプレートを取り出した。
（ｉｉ）９６ウェルプレート中の液体培地上清を吸い取り、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。
（ｉｉｉ）洗浄した９６ウェルプレートにＦＢＳ１０％入り液体培地（ＦＢＳ＋／Ｐ／Ｓ＋）を１６０μＬ添加した。また濃度を調製したＬＮＰ溶液を４０μＬ添加した。
（ｉｖ）９６ウェルプレートをインキュベーターに入れ、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で２４時間細胞を培養した。

【0199】

Ｃ．毒性の評価（ＣＣＫ－８アッセイ、ＬＤＨアッセイ）
実施例１～９について、ＣＣＫ－８アッセイまたはＬＤＨアッセイを行うことで、生細胞の代謝活性を測定し相対的に生存している細胞数を定量して脂質ナノ粒子の毒性を評価した。
（ａ）ＣＣＫ－８アッセイ
（ｉ）上記Ａの（ｉ）と同様に調温した液体培地（ＦＢＳ－，Ｐ／Ｓ－）に、ＦＢＳが１０％、生細胞数測定キット（同仁化学研究所製、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｋｉｔ－８）が１０％になるように添加した。
（ｉｉ）インキュベーターから２４ウェルプレートを取り出した。液体培地を除去し、上記（ｉ）で作製した生細胞数測定キット入りの液体培地を３１５μＬ添加した。
（ｉｉｉ）インキュベーター内で１時間熟成した。
（ｉｖ）２４ウェルプレートを取り出しプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）で測定波長４５０ｎｍ、対象波長６３０ｎｍの条件で吸光度を測定した。吸光度は、脂質ナノ粒子を添加していない対照の細胞の吸光度を１．００として算出した。得られた値が０．８０以上１．００以下を◎（優）、０．５０以上０．８０未満を〇（良）、０．２０以上０．５０未満を△（可）、０．２０未満を×（不可）として評価した。

【0200】

（ｂ）ＬＤＨアッセイ
ＬＤＨアッセイは製細胞数測定キット（同仁化学研究所製、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ＬＤＨ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ－ＷＳＴ）を用いて下記のように行った。
（ｉ）ポジコンウェルに溶解バッファー２０μＬを加え、３７℃、３０分間インキュベーター内でインキュベーションした。
（ｉｉ）各ウェルから上澄み１００μＬを取り、測定用の９６ウェルプレートに移した。
（ｉｉｉ）全てのウェルに、キットに付属の試薬の混合液１００μＬを加え、遮光下、室温で３０分間呈色反応を行った。
（ｉｖ）全てのウェルにキットに付属のｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬５０μＬを加えた。
（ｖ）９６ウェルプレートをプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）で測定波長４９０ｎｍ、対象波長６３０ｎｍの条件で測定し吸光度を算出した。吸光度は、脂質ナノ粒子無添加の対照の細胞の吸光度を１．００として算出した。得られた値が０．５以下を◎（優）、０．５超１．０以下を〇（良）、１．０超６．０未満を△（可）、６．０以上を×（不可）として評価した。

【0201】

Ｄ．ノックダウン効果の評価（ＧＦＰアッセイ）
ＧＦＰアッセイを行うことで、細胞のＥＧＦＰ発現量を測定して脂質ナノ粒子による緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＥＧＦＰ）のノックダウン効果を評価した。
（ｉ）２４ウェルプレートをインキュベーターから取り出しＰＢＳで洗浄した。
（ｉｉ）細胞を破壊するためにプロテアーゼインヒビターを加えた１％オクチルグルコシド液を添加した。ピペットで撹拌して細胞を溶解させた。
（ｉｉｉ）細胞溶解液をエッペンドルフチューブに移し、遠心分離器にかけた。
（ｉｖ）上清を１５０μＬ採取し、蛍光測定用のプレートに添加した。
（ｖ）プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）で励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍの条件で蛍光強度を測定した。蛍光強度は、脂質ナノ粒子無添加の対照の細胞の蛍光強度を１００％として算出した。

【0202】

［細胞実験２］
実施例１、２、５の脂質（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｅ）について、ｍＲＮＡを内封させた脂質ナノ粒子を評価するためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて細胞実験を行った。この細胞に脂質ナノ粒子をトランスフェクションさせ所定のタンパク質を産生させた量を測定することで、用いた脂質ナノ粒子の性能を評価することができる。以下、細胞実験の手順を示す。

【0203】

Ａ．細胞の播種
（ｉ）液体培地（ＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、ＦＢＳ＋、Ｐ／Ｓ＋）を３７℃設定の恒温器で調温した。
（ｉｉ）－８０℃の冷凍庫から細胞入りのクライオチューブを取り出し３７℃設定の恒温器で一気に解凍した。
（ｉｉｉ）試験管を遠心分離器にかけ、細胞を沈殿させた。
（ｉｖ）上清を吸い取り、液体培地を添加し優しくタップして細胞を分散させた。
（ｖ）分散させた液体培地を少量採取し、細胞数を顕微鏡で観察、計数した。
（ｖｉ）３つの２４ウェルブラックプレートに、１ウェルあたり１×１０⁴個／μＬの細胞数になるように細胞を播種した。２４ウェルブラックプレートをインキュベーターに入れ、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で２４時間細胞を培養した。

【0204】

Ｂ．トランスフェクション
（ｉ）ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子含有溶液を、ｍＲＮＡ濃度が１００ｎｇ／２０μＬ（＝０．００５μｇ／μＬ）となるように濃縮した。
（ｉｉ）液体培地（ＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、ＦＢＳ－、Ｐ／Ｓ－）とＦＢＳを３７℃に温め、必要分の液体培地とＦＢＳとを混合し（このときの液体培地中のＦＢＳ濃度：１２．５％）、調製した液体培地を０．２２μｍフィルターに通して濾過滅菌した。
（ｉｉｉ）細胞を培養した２４ウェルブラックプレート中の液体培地上清を吸い取り、１つのウェル当たり８０μＬの調製液体培地を添加した。
（ｉｖ）ＲＦＷおよび上記の濃度を調製した脂質ナノ粒子含有溶液を、１つのウェル当たり２０μＬ添加した。
（ｖ）２４ウェルブラックプレートをインキュベーターに入れ、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で２４時間細胞を培養した。

【0205】

Ｃ．タンパク質発現効果の評価（ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）の検出）
タンパク質発現効果の評価をＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイのキットを用いて行った。
（ｉ）上記のＢ．（ｖ）にて培養した細胞をインキュベーターから取り出し、室温で静置した。
（ｉｉ）プレート中における上清を２０μＬ採取し、新しい９６ウェルホワイトプレートに添加した。
（ｉｉｉ）キットに付属の１００ＸＣｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅとＧａｕｓｓｉａ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを室温に戻し、それぞれ１：１００で混合して調製した。調整した溶液を多連ピペットを用いて、１つのウェル当たり５０μＬで上清に添加した。
（ｉｖ）アルミニウム箔でプレートを遮光し、１０分静置した後、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）で発光量を測定し(測定時間：２秒間）、得られた発光量を指標としてタンパク質発現量を算出した。

【0206】

Ｄ．毒性の評価（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ）
（ｉ）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｆｌｕｏｒ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（ＣＴＦ）アッセイの試薬を３７℃の湯浴にて完全に解凍させた。
（ｉｉ）ＧＦ－ＡＦＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅをボルテックスミキサーにて均一に混合した。
（ｉｉｉ）ＣＴＦアッセイ試薬（キット）に付属のバッファーとＧＦ－ＡＦＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅとをそれぞれ１０ｍＬ：１０μＬの混合比で、必要量混合した。
（ｉｖ）混合したＣＴＦ試薬混合物を、上記のＢ．（ｖ）で培養した細胞を含む２４ウェルブラックプレートに、１つのウェル当たり１００μＬで添加し、速やかにアルミニウム箔で遮光した後、３０秒間プレートシェイカーで振とうした。
（ｖ）プレートをインキュベーターに入れ、２４ウェルブラックプレートをインキュベーターに入れ、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で３０分間細胞を培養した。
（ｖｉ）プレートリーダーで蛍光強度を測定した（励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長５０５ｎｍ）。得られた測定結果より、脂質ナノ粒子を添加していない細胞の蛍光強度を１として生存する細胞数を算出した。生存する細胞数が０．８超１．００以下を◎（優）、０．５０超０．８０以下を〇（良）、０．２０超０．５０以下を△（可）、０．２０以下を×（不可）として評価した。

【0207】

［ｉｎ ｖｉｖｏ動物実験］
ｍＲＮＡを内封させた脂質ナノ粒子を評価するためにマウスを用いて実験を行った。マウスに脂質ナノ粒子を含む溶液を注射しトランスフェクションし、産生した所定のタンパク質の量を測定することで、用いた脂質ナノ粒子の性能を評価することができる。以下、実験の手順を示す。

【0208】

Ａ．脂質ナノ粒子含有溶液の調整
実施例２、１１、１２の脂質（Ｉｂ）、（Ｉｋ）、（Ｉｌ）を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ動物実験用の脂質ナノ粒子含有溶液を調整した。上記の［脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）の作製]に記載される脂質溶液の調整方法の（ｉｉ）において、脂質溶液を、メイン脂質／ヘルパー脂質／コレステロール＝４５／１０／４５になるように混合して、さらに混合液に１．５ｍｏｌ％になるようにポリエチレングリコール修飾脂質（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）を添加して作製した点を変更した以外は、上記の［脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）の作製]の方法と同様にして脂質ナノ粒子含有溶液を調整した。
また、実施例２の脂質（Ｉｂ）より形成した脂質ナノ粒子含有溶液については、比較のために、ポリエチレングリコール修飾脂質を添加しないで作製した脂質ナノ粒子含有溶液も、ｉｎ ｖｉｖｏ動物実験に使用した。

【0209】

Ｂ．投与用溶液の調整
実施例２、１１、１２の脂質（Ｉｂ）、（Ｉｋ）、（Ｉｌ）より形成した脂質ナノ粒子含有溶液を、遠心式限外ろ過フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－２，１０ｋ）を用いて、目的の濃度（ｍＲＮＡとして０．０３１２５μｇ／μＬ）まで濃縮した（６，０００ｘｇ）。次いで、最終的なスクロース濃度が０．３Ｍとなるように、濃縮した脂質ナノ粒子含有溶液に１．５Ｍスクロース溶液を添加して投与用溶液を得た。

【0210】

Ｃ．投与および測定
投与用溶液５０μＬ（ｍＲＮＡ量として、１．２５μｇ／マウス）をマウスの左後肢に筋肉内投与した。そして投与から所定時間（２、４、６、８、２４時間）が経過する１０分前に、３０ｍｇ／ｍＬルシフェリン溶液／ＰＢＳ（－）を１５０ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙの用量でマウスに腹腔内投与した。ルシフェリン溶液を投与して１０分後に、イソフルラン麻酔下で、投与から所定時間における発光量をｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製、ＩＶＩＳ）にて測定し、タンパク質発現量を算出した。

【0211】

＜評価結果＞
（１）ｓｉＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の評価結果について
各実施例および各比較例の脂質を用いて得た、ｓｉＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の評価結果を表１、２に示す。

【0212】

【表1】

【0213】

【表2】

【0214】

表１に示すように、実施例１～１２の脂質より得た脂質ナノ粒子は、粒子径やＰＤＩが低くなっている。このように脂質ナノ粒子の粒子径やＰＤＩが低いと、脂質ナノ粒子を標的細胞や組織へ到達させやすくすることができる。具体的には、粒子径やＰＤＩが低いので、例えば標的組織が腫瘍である場合には、脂質ナノ粒子が腫瘍の血管の細孔の大きさよりも小さくなる傾向があり、組織内へ脂質ナノ粒子を到達させやすくすることができる。
また、実施例１～１２の脂質より得た脂質ナノ粒子は、ｐＨ７．４のＴｒｉｓ－ＨＣｌ中で測定した電荷が低くなっている。生体の血液は約ｐＨ７．４の環境であり、そのような環境下で、脂質ナノ粒子のカチオン性が強い（電荷が大きい）と、非特異的な吸着や免疫反応が生じ、或いは、脂質ナノ粒子が毒性を有したり、または標的細胞や組織に到達される前に代謝されやすくなる。実施例１～１２の脂質より得た脂質ナノ粒子はｐＨ７．４において電荷が低い（０ｍＶに近い）のでの毒性や代謝の懸念を抑制することができる。

【0215】

また、表１に示すように、実施例１～１２の脂質より得た脂質ナノ粒子は高いｓｉＲＮＡの内封率を有している。したがって、ｓｉＲＮＡを内封する脂質ナノ粒子を効率よく得ることができる。

【0216】

さらに、表１のＧＦＰアッセイおよび毒性の細胞実験の結果に示すように、実施例１～１２の脂質より得た脂質ナノ粒子は、ＧＦＰアッセイの結果が低い値となっている。したがって、ＨＴ１０８０－ＥＧＦＰ（ヒト／線維肉腫）細胞の緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＥＧＦＰ）が効果的にノックダウンされていること、つまり、脂質ナノ粒子が細胞内に到達してｓｉＲＮＡにより当該遺伝子の発現が阻害されていることが分かる。したがって、実施例１～１２の脂質を用いることで、効果的にｓｉＲＮＡを細胞内に送達することができる。

【0217】

また、表１の実施例１～６に示されるように、第１アミノ酸が親水性アミノ酸である脂質（実施例１～５）は、第１アミノ酸が親水性でない脂質（実施例６）よりもＧＦＰアッセイの結果が良好であることがわかる。したがって、第１アミノ酸が親水性アミノ酸である脂質は、より効果的に、核酸等の導入化合物を生体内の標的細胞または組織などへ送達することができる。

【0218】

また、表１に示す、ＣＣＫアッセイやＬＤＨアッセイは細胞毒性に関連する評価であるが、実施例１～３、５、６の脂質は、細胞毒性も低くいことが分かる。なお、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入するためには、ｍＲＮＡを細胞内に導入する場合よりも比較的多い脂質を用いているが、実施例１～３、５、６の脂質は比較的多い脂質を細胞へ適用させたとしても、毒性を低減させることができる。

【0219】

また、実施例１０～１２の脂質は、脂質親和性領域が実施例１～９の脂質と異なる脂質である。実施例５と実施例１０の結果より、脂質親和性領域の炭化水素基において、不飽和結合の数が変化しても良好な結果が得られることが分かる。さらに実施例２、１１、１２の結果より、脂質親和性領域の炭化水素基の炭素数を変化させても、所望の範囲（具体的には、式（Ｉ）中のＲ¹の炭化水素基の炭素数が３２～４８個）であれば、良好な結果が得られることが分かる。

【0220】

つづいて、表２の比較例１～４、１２は、それぞれ同じ脂質親和性領域と、相互に異なる１つのアミノ酸からなる親水性領域とを有する脂質を用いた結果を示している。表２の比較例１に示すように、比較例１、１２の脂質より得た脂質ナノ粒子は、粒子径やＰＤＩが大きい値になっている。したがって、比較例１、１２のような１つのアミノ酸を親水性領域とする脂質では、導入化合物を標的細胞や組織へ到達させることが困難であることがわかる。他方、表２の比較例２～４に示されるように、比較例２～４の脂質より得た脂質ナノ粒子は、比較例１の場合よりも粒子径やＰＤＩが大きい値ではないものの、ＧＦＰアッセイの結果が大きい値になっている。したがって、比較例２～４のように親水性領域が１つのアミノ酸であっても当該アミノ酸の側鎖が塩基性を有する脂質は、アミノ酸の側鎖が塩基性でない脂質（比較例１、１２）に比べて粒子径やＰＤＩが改善され得るものの、導入化合物を細胞内に効率的に導入させにくいことがわかる。また、各実施例に示されるような、２つのアミノ酸からなる親水性領域を有する脂質が有効であることが分かる。

【0221】

また、表２の比較例５～１０では、比較例４の脂質に対して、脂質親和性領域の炭化水素基の炭素数を変化させた脂質の結果を示している。具体的には、脂質親和性領域の炭化水素基の炭素数が３６個である比較例４の脂質と比較して、炭素数が２０個である比較例５の脂質、炭素数が２２個である比較例８の脂質、炭素数が２８個である比較例９の脂質は、粒子径およびＰＤＩのいずれか一方または両方が大きく悪化している。これに対して、炭素数が３２個である比較例６の脂質、炭素数が４４個である比較例７の脂質は、比較例４の脂質と比較して、粒子径およびＰＤＩが同等であると認められる。したがって、表２の比較例４～９の結果より、脂質親和性領域の炭化水素基の炭素数を３２～４８個の範囲外にすると、粒子径およびＰＤＩのいずれか一方または両方が大きく悪化することが分かる。
さらに、比較例８、９の脂質は、脂質親和性領域の分岐した炭化水素基について、分岐鎖の間での炭素数に差（１０個または１６個）がある脂質である。比較例８、９の脂質は、比較例６、７の脂質のように分岐鎖の間での炭素数に差がない脂質と比較して、粒子径およびＰＤＩが悪化している。したがって、脂質親和性領域の炭化水素基が分岐している場合には、分岐した炭化水素基の間での炭素数の差が小さい方が良好な結果が得られることが分かる。

【0222】

さらに、表１の実施例１の脂質、表２の比較例１０、１１の脂質を用いた結果より、脂質親和性領域と、親水性領域との結合部分において、エステル基やアミド基を介して結合を形成するよりも、炭化水素基である脂質親和性領域とアミノ酸部分である親水性領域とが直接結合する方が良好な結果が得られることが分かる。

【0223】

（２）ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の評価結果について
続いて、実施例１、２、５の脂質を用いて作製した、ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の評価結果を表３に示す。

【0224】

【表3】

【0225】

実施例１、２、５の脂質を用いて得た、ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子は、上記のｓｉＲＮＡを含有させた脂質ナノ粒子と同様に、粒子径やＰＤＩが低くなっており、脂質ナノ粒子を標的細胞や組織へ到達させやすくなっている。
また、実施例１、２、５の脂質より得た脂質ナノ粒子は、ｐＨ７．４のＴｒｉｓ－ＨＣｌ中で測定した電荷が低くなっており、生体内で、非特異的な吸着や免疫反応が生じることを抑制することができる。

【0226】

また、表３に示すように、実施例１、２、５の脂質より得た脂質ナノ粒子は高いｍＲＮＡの内封率を有している。したがって、ｍＲＮＡを内封する脂質ナノ粒子を効率よく得ることができる。

【0227】

さらに、表３のタンパク質発現量およびＣＴＦアッセイ（毒性に関する評価）の結果に示すように、実施例１、２、５の脂質より得た脂質ナノ粒子は、所望のタンパク質を一定量発現させており、つまり、脂質ナノ粒子が細胞内に到達して脂質ナノ粒子が含有するｍＲＮＡによりタンパク質が発現していることが分かる。したがって、実施例１、２、５の脂質は、効果的にｍＲＮＡを細胞内に送達することができる。
また、表３に示すように実施例１、２、５の脂質は、細胞実験において生存している細胞数が多い。したがって、実施例１、２、５の脂質は、ｍＲＮＡを標的細胞や組織へ送達させるために用いた場合には細胞毒性も低くいことが分かる。

【0228】

なお、表３には、ｍＲＭＡワクチンの脂質として使用されている参考例１の脂質（ｒ１）を用いた例も示しているところ、実施例１、２、５の脂質を用いた結果は、参考例１の脂質を用いた結果と比較して良好な結果であることがわかる。

【0229】

（３）ｉｎ ｖｉｖｏ動物実験の評価結果について
続いて、実施例２、１１、１２の脂質を用いて作製した、ｉｎ ｖｉｖｏ動物実験用の脂質ナノ粒子の評価結果を表４に示す。

【0230】

【表4】

【0231】

実施例２の結果より、脂質ナノ粒子含有溶液を調整する際に、ポリエチレングリコール修飾脂質を存在させることにより、タンパク質発現量を大きく向上させることができることが分かる。また、実施例１１、１２の結果から分かるように、実施例１１、１２の脂質より作製した脂質ナノ粒子含有溶液を用いた場合でも、タンパク質発現量を大きく向上させることができることが分かる。
したがって、本実施形態の脂質は、脂質ナノ粒子含有溶液を調整する際に、本実施形態の脂質以外の分子を存在させることで、より良好な特性を得られることが想定される。

【産業上の利用可能性】

【0232】

本発明によれば、細胞質へ効果的に核酸等の導入化合物を送達することができる脂質および組成物を提供することができる。