特開 2024-28207 ヘパリン起因性血小板減少症を診断するための血小板活性化試験

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024028207

(43)【公開日】2024-03-01

(54)【発明の名称】ヘパリン起因性血小板減少症を診断するための血小板活性化試験

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20240222BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 N

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023132754

(22)【出願日】2023-08-17

(31)【優先権主張番号】22190892.4

(32)【優先日】2022-08-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】510259921

【氏名又は名称】シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス プロダクツ ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ゲアリンデ・クリスト

(72)【発明者】

【氏名】マティーアス・エーム

(72)【発明者】

【氏名】ヘルベルト・シュヴァルツ

(57)【要約】

【課題】本発明は、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）を確定するための機能的かつ容易に自動化可能な試験に関する。
【解決手段】反応におけるプロトロンビンフラグメントＦ１＋２の形成を測定する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を検出するための方法であって、以下の工程：
ｉ． サンプルを、血小板含有試薬、およびＰＦ４結合性非分枝多糖もしくはＰＦ４結合性ポリアニオンまたは非分枝多糖もしくはポリアニオンに結合したＰＦ４タンパク質からなる複合体と混合することによって、反応混合物を用意する工程；
ｉｉ． 反応混合物をインキュベートする工程；および次いで
ｉｉｉ． 反応混合物中のプロトロンビンフラグメントＦ１＋２（Ｆ１＋２）の量を決定する工程；
ｉｖ． このように決定された反応混合物中のＦ１＋２の量を、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含んでいないことがわかっているドナーの体液サンプルを含む反応混合物中のＦ１＋２の量に関する所定の基準値と比較する工程；および
ｖ． 決定された反応混合物中のＦ１＋２の量が基準値を超えているならば、サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在を確定する工程
を含む、方法。

【請求項2】

血小板含有試薬は、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含んでいないことがわかっている１人またはそれ以上の健常なドナーのヒト血小板を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

反応混合物中のＦ１＋２の量は、少なくとも１種の抗Ｆ１＋２特異的抗体を反応混合物と接触させることによって決定される、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項4】

第１および第２の抗Ｆ１＋２抗体、または第１のＦ１＋２特異的抗体およびＦ１＋２と第１の抗体とからなる免疫複合体に対する特異性を有する第２の抗体、ならびに
シグナル形成系の第１および第２の成分が互いに空間的近傍に導かれる際に検出可能なシグナルが生成されるように相互作用する、シグナル形成系の第１および第２の成分
を反応混合物と混合し、第１の抗Ｆ１＋２抗体は、シグナル形成系の第１の成分と会合しているか、または反応混合物のインキュベーション中にそれと会合し、第２の抗Ｆ１＋２抗体または免疫複合体特異的抗体は、シグナル形成系の第２の成分と会合しているか、または反応混合物のインキュベーション中にそれと会合する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

シグナル形成系の第１および第２の成分が各々粒状固相を含み、反応混合物中の粒状固相の凝集が測定される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

シグナル形成系の第１の成分は化学発光剤でシグナル形成系の第２の成分は光増感剤であるか、またはその逆であり、反応混合物における化学発光が測定される、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

得られた反応混合物は、血小板の除去のための遠心分離工程に供されない、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

ヘパリン起因性血小板減少症を診断または予測するための方法であって、患者の体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在が請求項１～７のいずれか１項に記載の方法を使用して検出される、方法。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか１項に記載の方法を行うための試験キットであって、以下の構成要素：
ａ． 血小板を含む第１の試薬；
ｂ． ＰＦ４結合性非分枝多糖もしくはＰＦ４結合性ポリアニオンまたは非分枝多糖もしくはポリアニオンに結合したＰＦ４タンパク質からなる複合体を含む、第２の試薬；および
ｃ． 少なくとも１種の試薬が抗Ｆ１＋２特異的抗体を含む、Ｆ１＋２を検出するための１種またはそれ以上の試薬
を含む、試験キット。

【請求項10】

第２の試薬が、
ヘパリン、未分画ヘパリン、分画ヘパリン、デキストラン硫酸、およびフコイダンからなる群からのＰＦ４結合性非分枝多糖；または
ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルリン酸、ポリビニルホスホン酸、ポリスチレン硫酸、およびポリスチレンスルホン酸からなる群からのＰＦ４結合性ポリアニオン；または
上述の非分枝多糖のうちの１つに結合したＰＦ４タンパク質からなる、もしくは上述のポリアニオンのうちの１つに結合したＰＦ４タンパク質からなる複合体
を含む、請求項９に記載の試験キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の分野に属し、ヘパリン起因性血小板減少症を確定するための機能的かつ容易に自動化可能な試験に関する。

【背景技術】

【0002】

ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）は、ヘパリン療法の一部として生じることのある血栓疾患であり、命にかかわる血栓塞栓性合併症を引き起こすことがある。罹患患者は、ヘパリンおよび血小板第４因子（ＰＦ４）から構成される複合体に結合する抗体、いわゆる抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を産生する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、抗体が結合したＰＦ４／ヘパリン複合体は血小板表面に結合し、血小板の活性化を引き起こす。これにより、血小板数の低減および血栓塞栓症のリスクの増大がもたらされる。

【0003】

ＨＩＴ診断には基本的に２つの試験原理が使用される。第１の試験原理は、患者の体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の直接検出に基づいている。この目的のために、サンプルをＰＦ４／ヘパリン複合体、またはＰＦ４および他の適切なポリアニオン（ポリビニルスルホン酸など）から構成される複合体と接触させ、従来の免疫学的試験法（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用してサンプル中に存在するあらゆる抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の結合を検出する。しかし、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の検出に感度を有するが、十分に特異的ではないという欠点がある。すなわち、陽性のＨＩＴの診断には抗体の検出は不十分であり、一方、陰性結果は合理的な確実性でＨＩＴを除外しない。したがって、第２の試験原理に基づく機能試験による確認が推奨される。

【0004】

第２の機能試験原理は、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の血小板活性化作用の検出に基づいている。この試験原理では、１人またはそれ以上の正常なドナーからの洗浄した血小板を患者の血漿もしくは血清サンプルおよびヘパリンと混合し、血小板の活性化を既知の活性化マーカーに基づいて、例えば、放出されたセロトニンの量に基づいて（セロトニン放出アッセイ）、または視覚的に検出可能な血小板凝集反応（ＨＩＰＡ試験）に基づいて測定する。患者のサンプルが抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含んでいれば、正常なサンプル（そのような抗体を有さない）と比較して増大した血小板活性化を確定することができる。

【0005】

２つの上述の機能試験原理は、複雑な手作業を必要とし、したがって訓練された作業員でなければ行うことができないことから、今まで従来の検査室では行うことや自動化することができなかった。さらにまた、セロトニン放出アッセイは、遠心分離工程による血小板の除去および放射性材料の使用を必要とする。

【0006】

特許文献１は、体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を検出するための異なる方法であって、以下の工程：
ｉ． サンプルを、血小板含有試薬、およびＰＦ４結合性非分枝多糖またはＰＦ４結合性ポリアニオンと混合することによって、反応混合物を用意する工程；
ｉｉ． 反応混合物をインキュベートする工程；および次いで
ｉｉｉ． 反応混合物中のＰＦ４の量を決定する工程；
ｉｖ． このように決定された反応混合物中のＰＦ４の量を、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含んでいないことがわかっているドナーの体液サンプルを含む反応混合物中のＰＦ４の量に関する所定の基準値と比較する工程；および
ｖ． 決定された反応混合物中のＰＦ４の量が基準値を超えているならば、サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在を確定する工程
を含む方法を記載している。

【0007】

被験サンプル、血小板、およびヘパリン（または機能的に等価なＰＦ４結合性多糖もしくはポリアニオン）を含む反応混合物中の放出ＰＦ４の定量的決定によって、サンプルが抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含んでいるのかどうか、よって患者がヘパリン起因性血小板減少症を患っているのかどうかを確定することが可能になる。

【0008】

上述の方法の１つの欠点は、ヘパリン起因性血小板減少症の存在は血小板の活性化を引き起こす抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在を検出することで決定することができるが、患者の凝固促進（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｔｏｒｙ）状態（すなわち、既に実際に上昇した凝固活性であり、血栓事象を患う特に高い急性リスクを有する患者の特徴である）が常に特定されるとは限らないことである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】ＥＰ３４１３０５１Ａ１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、本発明の目的は、体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を検出するための機能的方法であって、単なる抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在の検出および関連するヘパリン起因性血小板減少症の決定だけでなく、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体に誘導される血小板活性化によって引き起こされる可能性が最も高い、患者の凝固促進状態の指標を加えて提供する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

被験サンプル、血小板、およびヘパリン（または機能的に等価なＰＦ４結合性多糖もしくはポリアニオン）を含む反応混合物中のプロトロンビンフラグメントＦ１＋２（Ｆ１＋２）の定量的決定によって、まず、該サンプルが抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含んでいるのかどうか、よってヘパリン起因性血小板減少症が存在するのかどうかを確定することが可能になることが見出された。抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含むサンプルは、前記反応混合物中でトロンビンの形成を明らかに引き起こすので、トロンビンが形成されるときに形成されるプロトロンビンフラグメントＦ１＋２の反応混合物中の増加量は、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在、よってヘパリン起因性血小板減少症の存在を示すだけでなく、加えて患者の凝固促進状態の評価も可能になる。反応で生じるプロトロンビンフラグメント Ｆ１＋２の量が多くなればなるほど、凝固促進活性が大きくなり、よって患者が血栓事象を患う急性リスクが大きくなる。これによって、特にリスクのある患者を特定することが可能になる。

【0012】

よって、本発明は、体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を検出するための方法を提供する。本方法は、以下の工程：
ｉ． サンプルを、血小板含有試薬、およびＰＦ４結合性非分枝多糖もしくはＰＦ４結合性ポリアニオンまたは非分枝多糖もしくはポリアニオンに結合したＰＦ４タンパク質からなる複合体と混合することによって、反応混合物を用意する工程；
ｉｉ． 反応混合物をインキュベートする工程；および次いで
ｉｉｉ． 反応混合物中のプロトロンビンフラグメントＦ１＋２（Ｆ１＋２）の量を決定する工程；
ｉｖ． このように決定された反応混合物中のＦ１＋２の量を、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含んでいないことがわかっているドナーの体液サンプルを含む反応混合物中のＦ１＋２の量に関する所定の基準値と比較する工程；および
ｖ． 決定された反応混合物中のＦ１＋２の量が基準値を超えているならば、サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在を確定する工程
を含む。

【発明を実施するための形態】

【0013】

体液サンプルは、好ましくはヒトに由来する。好ましくは、体液サンプルは、実質的に血小板を含まない体液サンプル、特に血漿である。

【0014】

反応混合物を用意するのに必要とされる血小板含有試薬は、好ましくは、洗浄され、再懸濁されたヒト血小板の懸濁液である。血小板は、好ましくは、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含んでいないことがわかっている１人またはそれ以上の健常なドナーに由来する。適切な血小板含有試薬は、血小板濃縮血漿を得るために、例えば、好ましくはヒルジンも添加されたクエン酸全血サンプルを遠心分離することによって製造される。クエン酸溶液およびアピラーゼを血小板濃縮血漿に再度添加し、遠心分離を再度行い、次いで無細胞の上清を捨てる。最後に、ペレット化された血小板を緩衝懸濁溶液中に懸濁させる。

【0015】

体液サンプルは、ＰＦ４結合性非分枝多糖またはＰＦ４結合性ポリアニオンとさらに混合される。検出しようとする抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体が結合する複合体をＰＦ４と形成する、多数のＰＦ４結合性物質が公知である。適切な非分枝多糖は、例えば、ヘパリン、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、分画ヘパリン（ＬＭＷＨ）、デキストラン硫酸、およびフコイダンである。適切なポリアニオンは、例えば、ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルリン酸、ポリビニルホスホン酸、ポリスチレン硫酸、およびポリスチレンスルホン酸である。

【0016】

特に好ましいのは、低分子量のデキストラン硫酸、好ましくは６～１０キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有するデキストラン硫酸の使用である。何故なら、それらによって、望ましくない二次作用、例えば、内因性凝固系の活性化または血小板接着の弱化、が最低限となることが保証されるからである。

【0017】

本発明による方法の別の実施形態では、体液サンプルは、代替的に、非分枝多糖（好ましくは上述のもののうちの１つ）またはポリアニオン（好ましくは上述のもののうちの１つ）に結合したＰＦ４タンパク質からなる複合体と混合される。

【0018】

反応混合物中のＦ１＋２の量を決定する前に、ＰＦ４結合性非分枝多糖またはポリアニオンとサンプル中に存在するＰＦ４タンパク質との間の複合体形成を可能にするために、サンプル中に含まれると推定される抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体と、形成されたこの複合体との（または代替的に、添加された複合体との）結合を可能にするために、そして最後に、この抗体が結合した複合体と血小板表面との結合による血小板の活性化を可能にするために、反応混合物は、ある時間インキュベートされる。典型的なインキュベーション時間は、好ましくは＋３７℃で、５～１５分の間である。

【0019】

十分なインキュベーションの後、反応混合物中のＦ１＋２の量を決定するための工程が行われる。反応混合物中のＦ１＋２の量の決定は、様々な方法によって行うことができる。好ましいのは、反応混合物中のＦ１＋２の量が、少なくとも１種のＦ１＋２特異的結合相手、例えば抗Ｆ１＋２特異的抗体を反応混合物と接触させることによって決定される、結合アッセイである。これは、例えば、反応混合物（全部または一部）を固相に会合されたＦ１＋２結合相手と接触させることによって行ってもよい。未結合の構成物質は洗浄することによって除去され、固相に結合されたＦ１＋２ペプチドの量を決定するために第２の標識されたＦ１＋２結合相手が使用される（ＥＬＩＳＡ技法）。特に適した抗Ｆ１＋２抗体は、切断されていないプロトロンビンに結合しないモノクローナルＦ１＋２特異的抗体である。プロトロンビンに結合しないそのような特異的Ｆ１＋２抗体の生成および使用は、例えば、ＥＰ３０３９８３Ａ２（Ｐｅｌｚｅｒら）、ＵＳ５，８３０，６８１（Ｈｕｒｓｔｉｎｇら）、またはＵＳ２００３／０２１９８４５Ａ１（Ｒｕｉｚら）に記載されている。抗Ｆ１＋２抗体の特異性には、それらがＦ１＋２フラグメントの少なくとも４つのカルボキシ末端アミノ酸（Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＯＨ）を含むエピトープに結合することが重要である。Ｆ１＋２の濃度を決定するのにサンドイッチイムノアッセイが一般に使用されるので、２種の抗Ｆ１＋２抗体が必要とされる。ＥＰ１５４１６７６－Ａ１（Ｔｅｉｇｅｌｋａｍｐら）は、Ｆ１＋２フラグメントのＮ末端側半分のエピトープに結合し、よってインタクトなプロトロンビンにも結合する抗体について記載しているが、これらの抗体は、サンドイッチイムノアッセイにおいてＦ１＋２ネオエピトープ特異的一次抗体と組み合わせて二次抗体として使用するのに特に適している。

【0020】

特に好ましいのは、未結合の構成物質の除去を省くことができる、よって洗浄工程を省くことができる、均一系イムノアッセイである。この目的のために、反応混合物（全部または一部）を第１および第２の抗Ｆ１＋２抗体と混合し、そしてシグナル形成系の第１および第２の成分と混合する。シグナル形成系の成分は、シグナル形成系の第１および第２の成分が互いに空間的近傍に導かれる際に検出可能なシグナルが生成されるように相互作用する。この場合、第１の抗Ｆ１＋２抗体は、シグナル形成系の第１の成分と会合しているか、または反応混合物のインキュベーション中にそれと会合し、第２の抗Ｆ１＋２抗体は、シグナル形成系の第２の成分と会合しているか、または反応混合物のインキュベーション中にそれと会合する。

【0021】

本発明による方法の別の実施形態では、Ｆ１＋２特異的イムノアッセイは、Ｆ１＋２に対する特異性を有する第１の抗体の使用、およびＦ１＋２と第１の抗体とからなる免疫複合体に対する特異性を有する第２の抗体の使用を含む。

【0022】

この種のＦ１＋２特異的イムノアッセイは、ＥＰ２１６８９８５－Ａ１（Ａｌｔｈａｕｓら）に記載されている。これは、プロトロンビンフラグメントＦ１＋２のカルボキシ末端ネオエピトープに対する特異性を有する抗体または抗体フラグメントが結合したプロトロンビンフラグメンＦ１＋２を含む免疫複合体に特異的に結合する抗体について記載しているが、ここでは、該抗体は、プロトロンビンフラグメントＦ１＋２またはＦ２単体、およびプロトロンビンフラグメントＦ２／Ｆ１＋２のカルボキシ末端ネオエピトープに対する特異性を有する抗体もしくは抗体フラグメント単体には結合しない。このアッセイ形式によって、洗浄および分離工程のない直接的で均一なサンドイッチイムノアッセイを実施可能にするのに十分に高い特異性が保証される。

【0023】

均一系Ｆ１＋２イムノアッセイの一実施形態では、シグナル形成系の成分は、粒状固相、例えばラテックス粒子であり、その凝集は、濁度法または比濁法によって決定される。この目的のために、シグナル形成系の第１の成分は、第１の抗Ｆ１＋２抗体と会合しているか、または会合可能であるような性質の第１の粒状固相からなる。第１の粒状固相は、第１の抗Ｆ１＋２抗体と共有結合もしくはＸ／Ｙ結合対を介して連結していても、または反応中にＸ／Ｙ結合対を介してそれと連結してもよい。さらにまた、シグナル形成系の第２の成分は、第２の抗Ｆ１＋２抗体と（またはＦ１＋２と第１の抗体とからなる免疫複合体に対して特異性を有する抗体と）会合しているか、または会合可能であるような性質の第２の粒状固相からなる。第２の粒状固相は、第２の抗Ｆ１＋２抗体と（または免疫複合体特異的抗体と）共有結合もしくはＡ／Ｂ結合対を介して連結していても、または反応中にＡ／Ｂ結合対を介してそれと連結してもよい。粒子強化光散乱の原理に基づいたイムノアッセイは１９２０頃から公知である（総説については、Ｎｅｗｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９２；２９：２２～４２を参照されたい）。好ましいのは、０．１～０．５μｍの直径を有する、より好ましくは０．１５～０．３５μｍの直径を有するポリスチレン粒子の使用である。好ましいのは、アミン、カルボキシル、またはアルデヒド官能基を有するポリスチレン粒子の使用である。好ましいのはまた、コアシェル粒子の使用である。粒子の合成およびリガンドの共有結合は、例えば、Ｐｅｕｌａ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９５；６：７７９～７８５に記載されている。

【0024】

均一系ＰＦ４イムノアッセイの別の実施形態では、シグナル形成系は、少なくとも第１および第２の成分を含み、それらが互いに空間的近傍に導かれ、それによって互いに相互作用できる状態になると検出可能なシグナルが生成されるように相互作用する。成分間の相互作用は、特にエネルギー移動、すなわち、例えば、光または電子放射を通した、または短寿命の一重項酸素などの反応性化学分子を介する成分間のエネルギーの直接的な移動を意味すると理解されたい。エネルギー移動は、一方の成分から他方の成分へ移動するものであり得るが、異なる物質のカスケードを介してエネルギー移動が進行するものも可能である。例えば、成分は、エネルギー供与体およびエネルギー受容体を含む対であってもよく、例えば、光増感剤および化学発光剤（ＥＰ－Ａ２－０５１５１９４、ＬＯＣＩ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、または光増感剤およびフルオロフォア（ＷＯ９５／０６８７７）、または放射性ヨウ素－１２５およびフルオロフォア（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：８６７２～８６７６）、またはフルオロフォアおよび蛍光消光剤（ＵＳ３，９９６，３４５）であってもよい。特に好ましくは、シグナル形成系の第１の成分が化学発光剤でシグナル形成系の第２の成分が光増感剤であるか、またはその逆であり、測定されるのは反応混合物における化学発光である。

【0025】

互いに相互作用することができるシグナル形成系の第１の成分および／または第２の成分は、共有結合的にもしくは特異的相互作用を介して粒状固相に会合していても、またはその中に埋め込まれた状態であってもよい。粒状固相という用語は、非細胞の、懸濁可能な粒子、例えば、金属ゾル、シリカ粒子、磁性粒子、または特に好ましくはラテックス粒子を意味すると理解されたい。好ましいのは、０．０１～１０μｍの直径を有する粒子、特に好ましいのは、０．１～１μｍの直径を有する粒子である。

【0026】

互いに空間的近傍に導かれ、それによって互いに相互作用できるような状態になると検出可能なシグナルが生成されるように相互作用するシグナル形成系の第１の成分は、第１の抗Ｆ１＋２抗体と会合しているか、または会合可能であるような性質のものである。シグナル形成系の第１の成分は、第１の抗Ｆ１＋２抗体と直接的に会合していても、または直接的に会合可能であってもよい。好ましくは、シグナル形成系の第１の成分は、第１の抗Ｆ１＋２抗体と間接的に会合しているか、または間接的に会合可能である。この目的のために、シグナル形成系の第１の成分は粒状固相と会合しており、該粒状固相は、加えて第１の抗Ｆ１＋２抗体と共有結合的にもしくはＸ／Ｙ結合対を介して会合しているか、または加えて第１の抗Ｆ１＋２抗体とＸ／Ｙ結合対を介して会合可能である。

【0027】

互いに空間的近傍に導かれ、それによって互いに相互作用可能になると検出可能なシグナルが生成されるように相互作用するシグナル形成系の第２の成分は、第２の抗ＰＦ４抗体（または免疫複合体特異的抗体）と会合しているか、または会合可能であるような性質のものである。シグナル形成系の第２の成分は、第２の抗Ｆ１＋２抗体（または免疫複合体特異的抗体）と直接的に会合していても、または直接的に会合可能であってもよい。好ましくは、シグナル形成系の第２の成分は、第２の抗Ｆ１＋２抗体（または免疫複合体特異的抗体）と間接的に会合しているか、または間接的に会合可能である。この目的のために、シグナル形成系の第２の成分は粒状固相と会合しており、該粒状固相は、加えてリガンドと共有結合的にもしくはＡ／Ｂ結合対を介して会合しているか、または加えてリガンドとＡ／Ｂ結合対を介して会合可能である。

【0028】

「結合相手ＸおよびＹ」および「結合相手ＡおよびＢ」は、各場合において、互いに特異的に認識し、かつ互いに結合する２つの異なる分子である。特異的な認識および結合の例は、抗体－抗原相互作用、ポリヌクレオチド相互作用などである。

【0029】

適切なＸ／ＹおよびＡ／Ｂ結合対は、とりわけ抗原／抗体の組み合わせであり、結合相手ＸまたはＡは、抗ＰＦ４抗体の抗原エピトープである。抗原エピトープは、抗体の天然の配列エピトープまたは構造性エピトープであってもよい。抗原エピトープはまた、修飾された抗ＰＦ４抗体の異種の配列エピトープまたは構造性エピトープであってもよい。異種の配列エピトープまたは構造性エピトープの例は、ＦＬＡＧタグもしくはＨＩＳタグ、またはフルオレセインタグであり、これらは、とりわけペプチドまたはタンパク質の標識に使用される。さらに適切なＸ／ＹおよびＡ／Ｂ結合対は、相補的なポリヌクレオチドであるＸおよびＹ、ならびに相補的なポリヌクレオチドであるＡおよびＢである。特に好ましいＸ／ＹおよびＡ／Ｂ結合対は、ＦＬＡＧタグ／抗ＦＬＡＧタグ抗体、ＨＩＳタグ／抗ＨＩＳタグ抗体、フルオレセイン／抗フルオレセイン抗体、ビオチン／アビジン、およびビオチン／ストレプトアビジンである。

【0030】

記載の均一系イムノアッセイによって、反応混合物中の血小板を除去するための遠心分離工程を省くことが可能になることが見出された。これによって手順が単純化されることにより、一般的な分析器での本方法の自動実行が可能になる。本発明による方法の好ましい実施形態では、得られた反応混合物は、血小板の沈殿または除去のための遠心分離工程に供さない。

【0031】

反応混合物中のＦ１＋２の量を決定した後、このように決定されたＦ１＋２の量は、所定の基準値と比較される。適切な基準値は、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含んでいないことがわかっているドナーの体液サンプルを含む反応混合物において同じ方法を使用して決定される（または事前に決定された）Ｆ１＋２の量である。抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体または他の血液凝固障害を有していないことがわかっている健常なドナーの複数のサンプルにおける基準値を決定するために通常行われるのは、Ｆ１＋２の量を決定すること、次いでそれをＨＩＴを患っており、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を有しているドナーの複数のサンプルにおけるＦ１＋２の量と比較することである。このとき、基準値は、例えば、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を有するサンプルと有さないサンプルを区別することを可能にするカットオフであり得る。決定された反応混合物中のＦ１＋２の量が基準値を超えているならば、これによってサンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在を確定することが可能になる。対照的に、決定された反応混合物中のＦ１＋２の量が基準値に達しないならば、これによってサンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の非存在を確定することが可能になる。

【0032】

本発明は、ヘパリン起因性血小板減少症を診断または予測するための方法であって、患者の体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在が本発明による方法を使用して検出される方法をさらに提供する。

【0033】

本発明はさらに、本発明による方法を行うための試験キットを提供する。該試験キットは、少なくとも以下の構成要素：
ａ． 血小板を含む第１の試薬；
ｂ． ＰＦ４結合性非分枝多糖もしくはＰＦ４結合性ポリアニオンまたは非分枝多糖もしくはポリアニオンに結合したＰＦ４タンパク質からなる複合体を含む、第２の試薬；および
ｃ． 少なくとも１種の試薬が抗Ｆ１＋２特異的抗体を含む、Ｆ１＋２を検出するための１種またはそれ以上の試薬
を含む。

【0034】

血小板を含む試薬は、好ましくは、洗浄され、再懸濁されたヒト血小板の懸濁液である。血小板は、好ましくは、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含んでいないことがわかっている１人またはそれ以上の健常なドナーに由来する。適切な血小板含有試薬は、血小板濃縮血漿を得るために、例えば、好ましくはヒルジンも添加されたクエン酸全血サンプルを遠心分離することによって製造される。クエン酸溶液およびアピラーゼを血小板濃縮血漿に再度添加し、遠心分離を再度行い、次いで無細胞の上清を捨てる。最後に、ペレット化された血小板を緩衝懸濁溶液中に懸濁させる。適切な血小板含有試薬は、１リットル当たりに少なくとも３００×１０^９個の血小板を含む。

【0035】

第２の試薬は、以下：
・ 好ましくは、ヘパリン、未分画ヘパリン、分画ヘパリン、デキストラン硫酸、およびフコイダンからなる群からのＰＦ４結合性非分枝多糖；または
・ 好ましくは、ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルリン酸、ポリビニルホスホン酸、ポリスチレン硫酸、およびポリスチレンスルホン酸からなる群からのＰＦ４結合性ポリアニオン；または
・ 上述の非分枝多糖のうちの１つに結合したＰＦ４タンパク質からなる、もしくは上述のポリアニオンのうちの１つに結合したＰＦ４タンパク質からなる複合体
のうちの１つを含む。

【0036】

第１および第２の試薬は、体液サンプルとの反応混合物を得るためにあることが意図される。

【0037】

試験キットは、Ｆ１＋２を検出するための１種またはそれ以上の試薬も含み、ここで、少なくとも１種の試薬が抗Ｆ１＋２特異的抗体を含む。抗Ｆ１＋２特異的抗体を含む試薬は、固相に会合した抗体、例えば、ラテックス粒子に結合した、またはマイクロタイトレーションプレートのウェル中の抗体であってもよい。試験形式に応じて、試験キットは、抗Ｆ１＋２抗体に結合したＦ１＋２を定量的に検出するための追加の成分、例えば、検出可能なラベルで標識された第２の抗体を含む試薬を含む。

【0038】

好ましい試験キットは、第１の抗Ｆ１＋２特異的抗体を含む試薬と、第２の抗Ｆ１＋２抗体（またはＦ１＋２と第１の抗体とからなる免疫複合体に対して特異性を有する抗体）を含む別の試薬とを含む。第１および／または第２の抗Ｆ１＋２抗体は、固相および／またはシグナル形成系の第１／第２の成分と会合していてもよく、その成分は、それらが互いに空間的近傍に導かれる際に検出可能なシグナルが生成されるように相互作用する。

【0039】

本発明による試験キットの試薬は、液体で提供されても、または凍結乾燥形態で提供されてもよい。試験キットの試薬の一部または全部が凍結乾燥物の形態で存在する場合、試験キットは、凍結乾燥物を再構成するのに必要とされる溶媒、例えば、蒸留水または適当な緩衝液を加えて含んでもよい。

【0040】

以下の実施例は、本発明を例示する役割を果たすものであり、限定すると理解されるべきではない。

【実施例0041】

実施例１：抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を検出するための均一系イムノアッセイ
ここで使用されるＬＯＣＩ（登録商標）技術は、ラテックス粒子にカップリングされた化学発光化合物（Ｃｈｅｍｉｂｅａｄｓ）およびラテックス粒子にカップリングされた光増感剤（Ｓｅｎｓｉｂｅａｄｓ）が分析物に同時に結合することによって互いに空間的近傍に導かれ、その結果として光増感剤によって生じた一重項酸素が化学発光化合物を励起することが可能になることに基づく。

【0042】

ヒト血漿サンプル２μＬを、６人の健常なドナーからの洗浄したヒト血小板を含む懸濁液７．５μＬ（およそ３００×１０^９個の血小板／Ｌ）および０．４ＩＵ／ｍＬのヘパリンを含む緩衝液１０μＬと混合し、３７℃でインキュベートした。１０分後に、以下の成分：
・ Ｆ１＋２のネオエピトープに対する特異性を有する第１のビオチン化モノクローナル抗体を含む第１の試薬（「試薬ＢＡ」）５０μｌ；および次いで
・ 化学発光化合物（Ｃｈｅｍｉｂｅａｄｓ）と会合したラテックス粒子にカップリングした、第１の抗体とそれに結合したＦ１＋２ペプチドとからなる免疫複合体に対する特異性を有する第２のモノクローナル抗体を含む第２の試薬（「Ｃｈｅｍｉｂｅａｄｓ試薬」）５０μＬ；および
・ 光増感剤（Ｓｅｎｓｉｂｅａｄｓ）と会合したストレプトアビジン被覆ラテックス粒子を含む第３の試薬（「Ｓｅｎｓｉｂｅａｄｓ試薬」）１００μＬ
を反応混合物に添加した。

【0043】

約１０分後に、化学発光シグナルを測定した［ｋｃｏｕｎｔｓ］。

【0044】

１０人のＨＩＴ患者の血漿サンプルを、本発明による方法（以降「Ｆ１＋２生成試験」とも呼ぶ）を使用して測定した。該ＨＩＴ患者では、ＨＩＴが臨床基準（４Ｔスコア、幾つかの症例では血栓事象を有する）に基づいて診断されており、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在が２つの独立した市販のイムノアッセイ（ＨｅｍｏｓＩＬ（登録商標）ＡｃｕＳｔａｒ ＨＩＴ－Ａｂ（ＰＦ４－Ｈ）、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ａｎｄ Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＨＰＩＡ－ＩｇＧ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）を使用して確定されている。

【0045】

本発明による方法をさらに使用して、７人の健常なドナー（臨床ＨＩＴ基準を満たさず、かつ抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を有さないもの）の血漿サンプルおよび正常な血漿プール（健常なドナーの約２０の血漿からのもの、「ＦＮＰ」）を測定した。

【0046】

Ｆ１＋２生成試験の高陽性対照として、血漿サンプルの代わりに血小板活性化抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体（５０μｇ／ｍＬ）を含む抗体溶液を使用して、使用した血小板含有試薬での高レベルのＦ１＋２生成を決定した。一連のＦ１＋２標準物質によって、生成されたＦ１＋２の量をｐｍｏｌ／Ｌで定量化することができる。

【0047】

比較を目的として、記載のサンプルを、ゴールドスタンダードとみなされている、Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｄ．ら（１９８６） Ａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｈｅｐａｒｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．Ｂｌｏｏｄ ６７（１）：２７～３０に従った、［１４Ｃ］－セロトニン放出アッセイ（以降「ＳＲＡ」とも呼ぶ）も使用して測定した。

【0048】

表１に試験の結果を要約する。

【0049】

【表1】

【0050】

本発明による方法の結果がＳＲＡゴールドスタンダード試験の結果と非常によく相関することが明らかとなっている。ＨＩＴ患者のサンプルを含む反応混合物のすべてにおいて、健常なドナーと比較して有意に増加した濃度のＦ１＋２が検出可能である。抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含むサンプルを何も含まないものから区別するためのカットオフとして、Ｆ１＋２生成値≧５００ｐｍｏｌ／Ｌ Ｆ１＋２と定義することができる（ＳＲＡ試験カットオフ：≧２０％）。しかし、カットオフ値をより高い統計的精度で定義するためには、紛れもなくより多くの数のサンプル測定が必要とされる。

【0051】

さらにまた、血栓事象を有するＨＩＴ患者のサンプルを含む反応混合物では、血栓事象を有さないＨＩＴ患者のサンプルを含む反応混合物と比較して、増加したＦ１＋２の濃度（これによって患者の凝固促進状態が示される）が検出可能であることが明らかとなる。

【外国語明細書】