▶ アーチ バイオパートナーズ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024028553
(43)【公開日】2024-03-04
(54)【発明の名称】ＤＰＥＰ－１結合剤および使用の方法
(51)【国際特許分類】
C07K 7/08 20060101AFI20240226BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20240226BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20240226BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240226BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20240226BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240226BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240226BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240226BHJP
【ＦＩ】
C07K7/08 ZNA
C07K7/06
C07K14/00
C07K14/705
A61K38/10
A61P13/12
A61P35/00
A61P35/04
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024007364
(22)【出願日】2024-01-22
(62)【分割の表示】P 2021530885の分割
【原出願日】2019-12-02
(31)【優先権主張番号】62/773,733
(32)【優先日】2018-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】518049544
【氏名又は名称】アーチ バイオパートナーズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】スティーブン マーク ロビンズ
(72)【発明者】
【氏名】ドナ ロレイン センガー
(72)【発明者】
【氏名】ダニエル アブラハム ムルベ
(72)【発明者】
【氏名】サウラブ ロイ チョウドリー
(72)【発明者】
【氏名】ジェニファー ジョイ ラーン
(72)【発明者】
【氏名】アーサー ウィング ジィー ラウ
(72)【発明者】
【氏名】ジャスティン マクドナルド
(72)【発明者】
【氏名】リアン バーベス
(72)【発明者】
【氏名】ポール クベス
(57)【要約】
【課題】対象において炎症を低減させるため、白血球動員を遮断するため、腫瘍転移を阻害するため、敗血症を処置するためおよび急性腎臓傷害を予防／低減させるための、医薬組成物およびそれらの使用の方法を提供すること。
【解決手段】ＤＰＥＰ－１結合組成物（例えば、ペプチド）ならびにそれを含む医薬組成物が、本明細書で開示される。かかるＤＰＥＰ－１組成物を使用および作製する方法、ならびにＤＰＥＰ－１結合組成物についてスクリーニングするための方法もまた開示される。
【選択図】なし
【解決手段】ＤＰＥＰ－１結合組成物（例えば、ペプチド）ならびにそれを含む医薬組成物が、本明細書で開示される。かかるＤＰＥＰ－１組成物を使用および作製する方法、ならびにＤＰＥＰ－１結合組成物についてスクリーニングするための方法もまた開示される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１１月３０日出願の米国仮特許出願第６２／７７３，７３３号に基づく優先権を主張し、この仮特許出願はその全体が本明細書に援用される。
本出願は、２０１８年１１月３０日出願の米国仮特許出願第６２／７７３，７３３号に基づく優先権を主張し、この仮特許出願はその全体が本明細書に援用される。
【0002】
分野
ＤＰＥＰ－１結合組成物（例えば、ペプチド）およびそれを含む医薬組成物が、本明細書で開示される。かかるペプチドおよび医薬組成物を使用および製造するための方法、ならびにＤＰＥＰ－１結合組成物についてスクリーニングするための方法もまた開示される。
ＤＰＥＰ－１結合組成物（例えば、ペプチド）およびそれを含む医薬組成物が、本明細書で開示される。かかるペプチドおよび医薬組成物を使用および製造するための方法、ならびにＤＰＥＰ－１結合組成物についてスクリーニングするための方法もまた開示される。
【背景技術】
【0003】
炎症は、有害な刺激に対する宿主防御反応である。急性炎症は、発赤、熱、腫脹および疼痛によって特徴付けられる。炎症の主な目的は、刺激物を限局化し根絶すること、ならびに周囲の組織の修復を促進することである。ほとんどの場合には、炎症は、必要かつ有益なプロセスである。
【0004】
炎症応答には、３つの主要な段階が関与する：第１に、血液の流れを増加させる細動脈の拡張；第２に、微小血管の構造的変化および血流からの血漿タンパク質の漏れ；ならびに第３に、内皮を介した白血球血管外移動および傷害の部位における蓄積。白血球経内皮遊走（ＴＥＭ）は、炎症、傷害および免疫反応の部位へのそれらの動員における重要なステップである。炎症の部位への好中球の遊出は、細胞間接着を必要とすると考えられる。
【0005】
炎症は、急性または慢性であり得る。急性炎症を促す有害な刺激を解消できないと、慢性炎症がもたらされ得、一部の刺激は、急慢性（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｃｈｒｏｎｉｃ）炎症を促す可能性が高い。一部の例では、炎症は、二次的または慢性の損傷を生じる。腫瘍微小環境における炎症は、がん加速および腫瘍転移にも関与している（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ． ２００９ Ｏｃｔ １５；８（２０）：３２６７－７３、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３；８（１）：ｅ５４９５９）。炎症促進性分子の存在により、悪性がん細胞は内皮壁に接着できるようになり、転移をもたらす。炎症促進性サイトカインは、がん細胞の増殖および凝集を誘導し、他のがん細胞がより多くのサイトカインを分泌するように誘発して、ポジティブフィードバックループを生じる。急性および慢性炎症における接着分子の役割は、内皮への白血球接着をモジュレートまたは遮断することによって炎症を制御するための方法の開発に必要な研究領域である。
【0006】
抗炎症剤は、炎症応答の遮断剤、抑制剤またはモジュレーターとして機能する。炎症の組織特異的制御が、他の組織における応答を維持しつつ、１つの組織において炎症をモジュレートするために望ましい場合がある。抗炎症剤は、種々の急性および慢性状態を処置するために使用される。ほとんどの人は、これらの薬剤を摂取することに何の問題もないが、一部の人は、重篤であり得る副作用を発症する。一部の群では、これらの薬は、代替法がない場合にのみ、必要な最低用量および持続時間で、注意して処方される。
【0007】
パターン認識受容体による非自己分子パターンの認識は、自然免疫の基盤である。自然免疫系の研究は、炎症応答を活性化する感覚およびシグナル伝達のためのジヌクレオチド受容体の存在も明らかにしている（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。ジヌクレオチド受容体ＳＴＩＮＧは、Ｉ型ＩＦＮを誘導するために使用される（Ｉｓｈｉｋａｗａ ２００９）。これらの系は、哺乳動物および他の動物において広がっている。ジヌクレオチド受容体が存在する場合、類似の様式で機能するジペプチド受容体が存在する可能性が高い。炎症促進性ジペプチド受容体細胞シグナル伝達系は、炎症をモジュレートし、急性および慢性の炎症媒介性疾患を処置するための別の治療アプローチを提供する。
【0008】
天然タンパク質の配列のバリエーションは、中立変異（タンパク質の変更された構造も機能ももたらさない変異）、構造的変異（タンパク質の変更された構造をもたらすが、変更された機能を必ずしももたらさない変異）または機能的変異（タンパク質の機能喪失または機能獲得をもたらす変異）として特徴付けられ得る。かかるバリエーションは、集団内の差異を生じ得および／または疾患を生じ得、したがって、進化的解析、および疾患の根本原因の医学的解析のために有用な情報を提供する。さらに、構造および機能の両方に関して相同および類似の変異を識別することによって、より正確な進化的解析が可能になる。どの変異が中立、構造的または機能的であるかを理解することは、より正確な診断法を可能にし、より有効な処置の設計を助けるであろう。
特に、現行のアプローチの多くは、炎症のより極端な症例の一部を適切に処置できないので、最新の治療薬として、炎症を低減または遮断するためのさらなる治療的化合物が依然として必要とされている。したがって、炎症応答の遮断剤、抑制剤またはモジュレーターとして機能する新たな組成物が必要とされている。新規標的、およびこれらの標的を介して炎症をモジュレートする方法もまた、必要とされている。
特に、現行のアプローチの多くは、炎症のより極端な症例の一部を適切に処置できないので、最新の治療薬として、炎症を低減または遮断するためのさらなる治療的化合物が依然として必要とされている。したがって、炎症応答の遮断剤、抑制剤またはモジュレーターとして機能する新たな組成物が必要とされている。新規標的、およびこれらの標的を介して炎症をモジュレートする方法もまた、必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ． ２００９ Ｏｃｔ １５；８（２０）：３２６７－７３
【非特許文献2】Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３；８（１）：ｅ５４９５９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
要旨
ＤＰＥＰ－１結合組成物（例えば、ペプチド）ならびにそれを含む医薬組成物が、本明細書で開示される。かかるＤＰＥＰ－１組成物を使用および作製する方法、ならびにＤＰＥＰ－１結合組成物についてスクリーニングするための方法もまた開示される。
ＤＰＥＰ－１結合組成物（例えば、ペプチド）ならびにそれを含む医薬組成物が、本明細書で開示される。かかるＤＰＥＰ－１組成物を使用および作製する方法、ならびにＤＰＥＰ－１結合組成物についてスクリーニングするための方法もまた開示される。
【0011】
第１の態様では、有効量のＤＰＥＰ－１結合ペプチドを含む組成物であって、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドが、（ｉ）ＬＳＡＬＴを含むアミノ酸配列ならびに（ｉｉ）Ｎ末端および／またはＣ末端に、１つまたは複数のグリシン残基を含む、組成物が開示される。
【0012】
一実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端に、２つまたはそれよりも多くのグリシン残基を含む。
【0013】
一実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端に、３つまたはそれよりも多くのグリシン残基を含む。
【0014】
特定の実施形態では、（ｉ）のアミノ酸配列は、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１）を含む。
【0015】
特定の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、ＧＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号２）、ＧＧＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号３）、ＧＧＧＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号４）およびＧＧＧＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号４）からなる群から選択される。
【0016】
代替的な実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、ＬＳＡＬＴペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端から、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基が除去されている。
【0017】
特定の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、アミノ酸配列ＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号５）を含む。
【0018】
特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【0019】
第２の態様では、ＫＨＭＨＷＨＰＰＡＬＮＴ（配列番号６、「ネオゲニン模倣性ペプチド」）を含むアミノ酸配列を含むＤＰＥＰ－１結合ペプチドが、本明細書で開示される。一実施形態では、アミノ酸配列は、Ｎ末端またはＣ末端に、１つまたは複数の追加のアミノ酸残基をさらに含む。
【0020】
第３の態様では、ＩＰＫＸＰＸＸＸＰ（配列番号７）モチーフを含むアミノ酸配列を含むＤＰＥＰ－１結合阻害性ペプチドが、本明細書で開示される。
【0021】
一実施形態では、アミノ酸配列は、Ｎ末端またはＣ末端に、１つまたは複数の追加のアミノ酸残基をさらに含む。
【0022】
第４の態様では、ＨＩＰＫＳＰＩＱＩＰＩＩ（配列番号８）を含むアミノ酸配列を含むＤＰＥＰ－１結合阻害性ペプチドが、本明細書で開示される。
【0023】
一実施形態では、アミノ酸配列は、Ｎ末端またはＣ末端に、１つまたは複数の追加のアミノ酸残基をさらに含む。
【0024】
必要に応じて、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、１つまたは複数の改変を有し得る。一実施形態では、１つまたは複数のペプチド改変は、内部改変、Ｎ末端改変またはＣ末端改変からなる群から選択される。
【0025】
一実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、１つまたは複数のＤ－アミノ酸、改変されたアミノ酸、アミノ酸アナログまたはそれらの組合せを含む。
【0026】
一実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、β－アラニン、ノルバリン、ノルロイシン、４－アミノ酪酸、オルニチン（ｏｒｉｔｈｉｎｅ）、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２－アミノイソ酪酸、６－アミノヘキサン酸、ｔ－ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジンからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸アナログを含む。
【0027】
ある特定の実施形態では、ＤＰＥＰ－１ペプチドは、メチル化、アミド化、アセチル化、アセチル化、プレニル化、ＰＥＧ化またはそれらの組合せによって改変される。
【0028】
第５の態様では、炎症をｉｎ ｖｉｖｏで低減させるための方法であって、（ｉ）本明細書で開示される組成物を細胞に投与し、それによって、炎症を低減させるステップを含む方法が、開示される。
【0029】
一実施形態では、炎症は、ＩＬ－１２、ＩＰ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγまたはＩＬ－１αから選択される炎症マーカーのプロファイルによって特徴付けられる。特定の実施形態では、方法は、炎症マーカーのうち１つまたは複数のレベルにおける改変を生じる。
【0030】
第６の態様では、必要な対象において疾患または障害を処置するための方法であって、（ｉ）本明細書で開示される組成物を対象に投与し、それによって、疾患または障害を処置するステップを含む方法が、開示される。
【0031】
一実施形態では、疾患または障害は、白血球動員、炎症またはそれらの組合せと関連する。
【0032】
特定の実施形態では、疾患または障害は、急性腎臓傷害である。
【0033】
特定の実施形態では、疾患または障害は、敗血症である。
【0034】
特定の実施形態では、疾患または障害は、腫瘍転移である。
【0035】
一実施形態では、疾患または障害は、虚血－再灌流傷害関連障害である。特定の実施形態では、必要な対象は、臓器ドナーまたは臓器レシピエントである。
【0036】
一実施形態では、方法は、診断試験を実施することによって、処置を必要とする対象を識別するステップをさらに含む。
【0037】
第７の態様では、ＤＰＥＰ－１に結合する組成物（例えば、ペプチド）についてスクリーニングするための方法であって、（ａ）試験化合物（例えば、ペプチド）のライブラリーを、ＤＰＥＰ－１に結合するそれらの能力についてスクリーニングするステップ、および（ｂ）ＤＰＥＰ－１に対する選択的結合親和性を示す化合物を選択するステップを含む方法が、本明細書で開示される。
【0038】
一実施形態では、方法は、（ｃ）ＤＰＥＰ－１に対する選択的結合親和性を示す化合物を試験して、炎症低減活性を有する化合物をｉｎ ｖｉｖｏで識別するステップ、および（ｄ）炎症低減活性を示す化合物をｉｎ ｖｉｖｏで選択するステップをさらに含む。
【0039】
第８の実施形態では、本明細書で開示される組成物を含むキットが、本明細書で開示される。一実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【0040】
本発明のこれらおよび他の目的および特色は、本発明の以下の詳細な説明を添付の図面と併せて読んだ場合に、より完全に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1-1】図１Ａは、ヒト腎臓腎摘出術から単離および培養し、ＤＰＥＰ－１およびＺＯ－１（ＴＥＣ表面マーカー）で標識した腎尿細管上皮細胞（ＴＥＣ）の代表的な顕微鏡写真を提供する。図１Ｂは、ＤＰＥＰ－１抗体で染色し、免疫ペルオキシダーゼを使用して可視化したマウス腎臓組織の代表的な顕微鏡写真を提供する。矢印は、暗色の染色によって示される、ＤＰＥＰ－１について陽性の尿細管を示す。図１Ｃは、トランスフェクトされていないＣＯＳ－７細胞、ＤＰＥＰ－１を過剰発現するＣＯＳ－７細胞、ヒト腎臓組織およびマウス腎臓組織から調製した総タンパク質溶解物のＤＰＥＰ－１酵素活性を示すグラフを提供する。
【図1-2】同上。
【0042】
【0043】
【0044】
【図4-1】図４Ａは、示されるような、野生型ヒトＤＰＥＰ１または変異したヒトＤＰＥＰ１でトランスフェクトしたＣｏｓ１細胞への蛍光標識されたペプチド結合の代表的な顕微鏡写真を提供する。ＬＳＡＬＴペプチドは、Ｍｅｔａｂｌｏｋとも呼ばれる。ＧＦＥ－１は、ＤＰＥＰ１に結合し、したがって、陽性対照として作用することが公知の、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ．によって発見された陽性対照ペプチドである。陰性対照ペプチド（対照Ｐ）は、ＤＡＰＩ核対比染色の蛍光のみを示す。シラスタチンまたはペニシラミンの存在下または非存在下での野生型および変異体（Ｅ＞Ｄ、Ｈ＞Ｋ）ＤＰＥＰ１構築物の各々の酵素活性は、図４Ｂにグラフで示される。Ｃｏｓ１細胞におけるトランスフェクトされたタンパク質の発現を確認するためのウエスタンブロットの写真は、図４Ｃに示される。
【図4-2】同上。
【0045】
【図5-1】図５Ａ～Ｄは、ラット（図５Ａ）、ヒト（図５Ｂ）またはイヌＤＰＥＰ－１（図５Ｃ）遺伝子に対応する膜ジペプチダーゼ（ＤＰＥＰ－１）ｃＤＮＡで一過的にトランスフェクトされたＣｏｓ－１細胞への蛍光標識されたペプチド結合の代表的な顕微鏡写真を提供する。対照ペプチドは、ＤＡＰＩ核対比染色の蛍光のみを示す。トランスフェクトされたＣｏｓ１細胞におけるＤＰＥＰ１発現を確認するウエスタンブロットの写真は、図５Ｄに提供される。ＬＳＡＬＴペプチドが、移行可能なビオチンに連結され、細胞結合したＤＰＥＰ１と相互作用できるようになり、次いで、ＵＶ光による活性化によってビオチンをＤＰＥＰ１に移行させる、ビオチン移行法の概略図。次いで、ビオチン化されたＤＰＥＰ１は、ニュートラアビジンビーズを使用して親和性沈殿され得る。ビーズ上のタンパク質は、ＤＰＥＰ１についてのウエスタンブロットによって解析され、ＬＳＡＬＴ（およびＧＦＥ－１ではあるが、ＫＧＡＬ対照ペプチドではない）が、図５Ｅに提供されるように、ＤＰＥＰ１と相互作用することが実際にできたことが確認される。
【図5-2】同上。
【図5-3】同上。
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【図10】図１０Ａは、ヒト、ラットまたはマウスＤＰＥＰ１の酵素活性が、これらの遺伝子の各々でＣｏｓ１細胞をトランスフェクトした後に測定され得ることを実証している。Ｌ２０００は、Ｃｏｓ１細胞が、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ビヒクルのみでモックトランスフェクトされたことを示している。図１０Ｂは、ヒトまたはマウスＤＰＥＰ１の酵素活性が、シラスタチン（ＣＬ）またはペニシラミン（Ｐｅｎ）によって阻害され得ることを示している。図１０Ｃは、ＬＳＡＬＴおよびＧＦＥ－１が膜ジペプチダーゼ酵素活性を阻害しないことを示すグラフを提供する。Ｍｅｔａｂｌｏｋは、ＬＳＡＬＴペプチドである。ＧＦＥ－１は、対照として使用した別のＤＰＥＰ－１結合ペプチドである。
【0051】
【図11-1】図１１Ａは、生体顕微鏡によって測定した、腎臓への白血球動員に対するＬＰＳ投与の影響を実証している。図１１Ｂ、Ｃは、炎症用量の全身ＬＰＳ後の、腎臓への好中球動員に対するＬＳＡＬＴペプチドまたはシラスタチンの効果を実証している。シラスタチンは、ジペプチダーゼ－１阻害剤であり、対照として使用される。
【図11-2】同上。
【0052】
【0053】
【0054】
【0055】
【図14-1】図１４Ａは、ＬＳＡＬＴペプチドの存在下または非存在下での、マウスにおける、ＬＰＳによって誘導される炎症性メディエーターにおける低減を示すグラフを提供する。図１４Ｂは、マウスにおけるＬＰＳチャレンジの間のＬＳＡＬＴペプチドによって誘導されるＩＬ－１０における増加を示すグラフを提供する。
【図14-2】同上。
【0056】
【図15-1】図１５Ａ～Ｃは、グリシンスペーサーがＤＰＥＰ１へのＬＳＡＬＴの結合を増強することを示す表およびグラフを提供する。ヒトＤＰＥＰ１を安定に過剰発現するＨＥＫ細胞またはヒト尿細管上皮細胞（ｈＴＥＣ）を、種々の改変（グリシンリンカーおよび／またはアミド化）を有するビオチン化されたＬＳＡＬＴペプチド（５０μＭ）と共に、１時間インキュベートした。ペプチドを、二次ストレプトアビジン蛍光抗体を介して検出した。ペプチド結合を、フローサイトメトリーを介して評価および定量化した。ペプチド結合のパーセンテージを、陰性対照と比較した（ｎ＝３／群）。図１５Ｂは、図１５Ａ中のペプチド結合データのグラフ表示である。図１５Ｃは、グリシンスペーサーで改変されたＬＳＡＬＴが、内毒血症誘導性の腎臓炎症を阻害できることを実証するグラフを提供する。腎臓中の炎症を、尿量枯渇（ｖｏｌｕｍｅ ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＬｙｓＭ（ｇｆｐ／ｇｆｐ）マウス中へのＬＰＳ（Ｏ１１１：Ｂ４、５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射によって誘導した。マウスを、ＬＰＳ処置の５分前に、対照ペプチド（スクランブルＬＳＡＬＴ）またはトリ－グリシンＬＳＡＬＴ（Ｇ２）のいずれかであらかじめ処置した。腎臓を、ＬＰＳ処置の４時間後に、炎症について評価した。炎症を、単一の顕微鏡視野中の単球接着の手動計数によって定量化した（ｎ＝３～６視野／群；＊：ｐ＝０．０２）。
【図15-2】同上。
【0057】
【図16-1】図１６Ａ～Ｂは、ＬＳＡＬＴ中のアラニン置換が結合親和性に影響を与えることを示す。図１６Ａは、どのアミノ酸残基がＤＰＥＰ１への結合に影響を与えるかを決定するためにＬＳＡＬＴが各アミノ酸位置においてアラニン置換でどのように改変されたかの表を提供する。図１６Ｂは、ＤＰＥＰ１発現細胞への、アラニン置換で改変されたＬＳＡＬＴの結合を定量化する。ヒトＤＰＥＰ１を安定に過剰発現するＨＥＫ細胞を、ビオチン化された改変されたＬＳＡＬＴペプチド（５０μＭ）と共に１時間インキュベートした。ペプチド結合を、フローサイトメトリーを介して評価および定量化した。ペプチド結合のパーセンテージを、陰性対照と比較した。
【図16-2】同上。
【0058】
【図17-1】図１７Ａ～Ｃは、血液中の代謝されたＬＳＡＬＴがＤＰＥＰ１になおも結合できることを示す。図１７Ａは、ＬＳＡＬＴペプチドが全血中のより小さい断片へと、全血中で代謝されることを実証している。ＬＳＡＬＴペプチド（５０μｇ／ｍＬ）を、最大で１２０分までの種々の時点にわたりヒト全血（クエン酸塩またはＫ２ ＥＤＴＡ処置した）中でインキュベートした。血漿を各試料について分離し、リン酸を添加して、各時点においてペプチドを安定化した。試料を、ＬＣ／ＭＳを使用して、ＬＳＡＬＴおよびその代謝物について評価した。ＬＳＡＬＴ代謝物を、ＬＳＡＬＴおよびヒトプロテオームに対するＰＥＡＫＳ Ｘおよびデータベース検索を使用して識別した。図１７Ｂは、ＤＰＥＰ１発現細胞へのＬＳＡＬＴ断片の結合を定量化する。ＬＳＡＬＴ断片結合を、フローサイトメトリーを介して評価および定量化した。ペプチド結合のパーセンテージを、陰性対照と比較した。図１７Ｃは、代謝されたＬＳＡＬＴ断片が内毒血症誘導性の腎臓炎症を阻害できることを実証するグラフを提供する。腎臓中の炎症を、尿量枯渇ＬｙｓＭ（ｇｆｐ／ｇｆｐ）マウス中へのＬＰＳ（Ｏ１１１：Ｂ４、５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射によって誘導した。マウスを、ＬＰＳ処置の５分前に、対照ペプチド（スクランブルＬＳＡＬＴ）または種々のＬＳＡＬＴ断片（標識は図１７Ａに対応する）のいずれかであらかじめ処置した。腎臓を、ＬＰＳ処置の４時間後に、炎症について評価した。炎症を、単一の顕微鏡視野中の単球接着の手動計数によって定量化した（ｎ＝３～６視野／群；＊＊＊：ｐ＝０．００４）。
【図17-2】同上。
【図17-3】同上。
【0059】
【0060】
【図19-1】図１９Ａ～Ｃは、新規ＤＰＥＰ－１結合ペプチドを示す。ニッケルコーティングされたアガロースビーズに結合させた市販の組換えヒトＤＰＥＰ１（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ、Ｈｉｓタグ化）を使用して、ｈＤＰＥＰ１を、ＰｈＤ１２ファージディスプレイライブラリーを使用してバイオパニングした。図１９Ａは、ネオゲニン模倣性ペプチドを含むいくつかの候補ヒットを用いて配列決定した４８個のプラークを示す。図１９Ｂは、ＤＰＥＰ１結合について試験したファージヒットのイメージを提供する。ＤＰＥＰ１およびＤＰＥＰ２トランスフェクトされたＣｏｓ１細胞を使用して、ファージヒットを、結合特異性について戻しスクリーニングした。ＫＨＭＨＷＨＰＰＡＬＮＴは、ＤＰＥＰ１トランスフェクトされた細胞への最も明るい結合を示した。 図１９Ｃは、ネオゲニン模倣性ペプチドの阻害が好中球の接着を防止することを実証している。ネオゲニン模倣性ペプチドの機能的活性を、組換えｈＤＰＥＰ１への静的好中球接着アッセイを使用して試験し、Ｃｏｓ機能的活性を、組換えｈＤＰＥＰ１、Ｃｏｓ１トランスフェクトされた細胞およびＬＰＳ活性化された内皮細胞（ＨＬＭＶＥＣ）への静的好中球接着アッセイを使用して試験した（図１９Ｃ）。ネオゲニン模倣性ペプチドファージヒット配列の合成的に生成されたペプチド（ＮｅｏＨ）および正確なネオゲニン模倣性配列配列を有するペプチド（ＮｅｏＥｘ）の両方が、３つ全ての系において好中球接着を阻害することができた。さらに、抗ネオゲニン抗体もまた、内皮細胞への好中球接着を阻害することができた。
【図19-2】同上。
【図19-3】同上。
【0061】
【図20-1】図２０Ａ～Ｃは、ＬＳＡＬＴが結合する配列を識別する。図２０Ａは、バイオパニング後に配列決定したプラーク中の繰り返し出現するＩＰＫモチーフを示す。ＬＳＡＬＴペプチドを、アガロースビーズに固定し、ＰｈＤ１２ファージディスプレイライブラリーを使用してそれに対してバイオパニングした。モチーフＩＰＫｘＰｘｘｘＰは、２９個の配列決定したプラークのうち９個において見出された。図２０Ｂは、ヒトおよびマウスＤＰＥＰ１中のＩＰＫモチーフを示す。ペプチドアラインメント解析は、ＩＰＫモチーフが、ヒトおよびマウスのＤＰＥＰ１中にのみ存在し、ＤＰＥＰ２中にもＤＰＥＰ３中にも存在しないことを実証した。図２０Ｃは、ＩＰＫ阻害が好中球接着を防止することを実証するグラフを提供する。ＩＰＫファージヒットのうち１つ（ＨＩＰＫＳＰＩＱＩＰＩＩ）は、ＬＰＳ刺激されたヒト内皮細胞において好中球接着を阻害することができた。ＩＰＫペプチドは、ＤＰＥＰ１と相互作用する好中球リガンドに結合することによって、ＤＰＥＰ１媒介性白血球接着を妨害し得る。
【図20-2】同上。
【図20-3】同上。
【0062】
【図21-1】図２１Ａ～Ｃは、ＬＳＡＬＴが、ＤＰＥＰ１発現ＣＯＳ１単層への転移性がん細胞の結合をｉｎ ｖｉｔｒｏで減少させることを実証している。図２１Ａは、ヒト黒色腫細胞（７０Ｗ）がＤＰＥＰ１に特異的に結合することを実証している。ＣＯＳ－１細胞を、ビヒクル処置したか（対照）、またはＤＰＥＰ１、ＤＰＥＰ２もしくはＤＰＥＰ３でトランスフェクトした。ヒト黒色腫細胞を、トランスフェクトされた細胞と共に共培養し、定量化した。図２１Ｂ～Ｃは、ＬＳＡＬＴが、ＤＰＥＰ１へのマウスがん細胞の結合を阻害することを示している。ＣＯＳ－１細胞を、ビヒクルトランスフェクトしたか（対照）、またはＤＰＥＰ１トランスフェクトし、ＬＳＡＬＴ（５０μＭ）の非存在下または存在下で、マウス黒色腫細胞（Ｂ１６－Ｆ１０）またはマウス乳房がん細胞（Ｅ０７７１．ＬＭＢ）のいずれかと共に共培養した。トランスフェクトされたＣＯＳ－１細胞に結合したマウスがん細胞を、共培養後に定量化した。
【図21-2】同上。
【図21-3】同上。
【0063】
【図22-1】図２２Ａ～Ｂは、ＬＳＡＬＴが、活性化された肺内皮細胞への転移性がん細胞の結合を減少させることを示すグラフを提供する。ＬＳＡＬＴ（５０μＭ）は、活性化された（ＴＮＦαおよびＩＬ１β処置した）ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＬＭＶＥＣ）への、マウス黒色腫細胞（Ｂ１６－Ｆ１０）またはマウス肉腫細胞（Ｔａｏ－１）のいずれかの結合を減少させた。未処置のＨＬＭＶＥＣを対照として使用した。
【図22-2】同上。
【0064】
【図23-1】図２３Ａ～Ｉは、ＬＳＡＬＴが、転移性がん細胞を注射した動物の肝臓および肺において腫瘍負荷を低減させることを実証している。図２３Ａは、ＬＳＡＬＴが、転移性がん細胞を注射した動物の肝臓において腫瘍負荷を低減させることを実証するグラフを提供する。対照ペプチド（１ｍＭ）またはＬＳＡＬＴペプチド（１ｍＭ）の存在下での、４Ｔ１マウス乳房がん細胞を注射した動物における肝臓転移性病変の数を定量化した。図２３Ｂは、ヒト黒色腫細胞を注射した動物における腫瘍負荷の代表的な顕微鏡写真を提供する。腫瘍負荷を、対照ペプチド（１ｍＭ）またはＬＳＡＬＴペプチド（１ｍＭ）の存在下での、ルシフェラーゼ発現７０Ｗヒト黒色腫細胞を注射した動物の生物発光イメージングによって解析した。図２３Ｃは、図２３Ｂ中のイメージのグラフ表示データを提供する。図２３Ｄは、ヒト骨肉腫細胞を注射した動物における腫瘍負荷の代表的な顕微鏡写真を提供する。腫瘍負荷を、対照ペプチド（１ｍＭ）またはＬＳＡＬＴペプチド（１ｍＭ）の存在下での、ルシフェラーゼ発現１４３Ｂヒト骨肉腫細胞を注射した動物の生物発光イメージングによって解析した。図２３Ｅは、図２３Ｄ中のイメージのグラフ表示データを提供する。図２３Ｆは、対照ペプチド（１ｍＭ）またはＬＳＡＬＴペプチド（１ｍＭ）の存在下での、Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞を注射した動物からの肺試料の代表的なＨ＆Ｅイメージを提供する。図２３Ｇは、図２３ＦからのＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞を注射した動物の肺中に存在する転移性病変の定量化を示すグラフを提供する。図２３Ｈは、対照ペプチド（１ｍＭ）またはＬＳＡＬＴペプチド（１ｍＭ）の存在下での、Ｅ０７７１．ＬＭＢマウス乳房がん細胞を注射した動物からの肺試料の代表的なＨ＆Ｅイメージを提供する。図２３Ｉは、図２３ＨからのＥ０７７１．ＬＭＢマウス乳房がん細胞を注射した動物の肺中に存在する転移性病変面積の定量化を示すグラフを提供する。
【図23-2】同上。
【図23-3】同上。
【図23-4】同上。
【図23-5】同上。
【図23-6】同上。
【図23-7】同上。
【図23-8】同上。
【図23-9】同上。
【0065】
【図24】図２４Ａ～Ｃは、ヒト黒色腫細胞がヒトＤＰＥＰ１に結合することを実証している。図２４Ａは、ＤＰＥＰ１トランスフェクトされたＣＯＳ－１細胞へのヒト黒色腫細胞（７０Ｗ）の定量化を示すグラフを提供する。Ｃｏｓ－１細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、ヒトＤＰＥＰ１で一過的にトランスフェクトした。ＧＦＰ発現７０Ｗヒト黒色腫細胞を、ＤＰＥＰ１発現Ｃｏｓ－１細胞単層の上に４時間播種した。次いで、細胞を、洗浄および固定した。ＤＰＥＰ１発現Ｃｏｓ－１細胞単層に接着した７０Ｗ黒色腫細胞を、蛍光顕微鏡を使用して１０×の倍率下で計数した。示される値は、３つの独立した実験からのものである；アスタリスク（＊＊＊）は、モックトランスフェクトされた細胞と比較してＰ＜０．００１を示す。図２４Ｂは、比較のための陽性対照（ＤＰＥＰ１）でトランスフェクトされたＣＯＳ－１細胞におけるＤＰＥＰ１の発現を確認するイムノブロットのイメージを提供する。図２４Ｃは、トランスフェクトされたＣＯＳ－１細胞のＤＰＥＰ１酵素活性の定量化を示すグラフを提供する。ＤＰＥＰ１酵素活性に特異的な蛍光定量的アッセイを、以前に記載されたように実施した（Ｈｅｙｗｏｏｄ ａｎｄ Ｈｏｏｐｅｒ， １９９５に従って）。ＤＰＥＰ１活性は、ヒトＤＰＥＰ１タンパク質の酵素活性を確認し、シラスタチン（Ｃｉｌａ）およびペニシラミン（Ｌ－Ｐｅｎ）は、この活性を阻害した。
【発明を実施するための形態】
【0066】
詳細な説明
Ｉ．定義
用語が単数形で提供される場合、本発明者らは、その用語の複数形によって記載される本発明の態様もまた企図する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他を明確に示さない限り、複数形の言及を含み、例えば、「１つの（ａ）ペプチド」は、複数のペプチドを含む。したがって、例えば、「１つの（ａ）方法」に対する言及は、本明細書に記載されるおよび／または本開示を読んだ当業者に明らかとなる、１つもしくは複数の方法および／またはその型のステップを含む。
Ｉ．定義
用語が単数形で提供される場合、本発明者らは、その用語の複数形によって記載される本発明の態様もまた企図する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他を明確に示さない限り、複数形の言及を含み、例えば、「１つの（ａ）ペプチド」は、複数のペプチドを含む。したがって、例えば、「１つの（ａ）方法」に対する言及は、本明細書に記載されるおよび／または本開示を読んだ当業者に明らかとなる、１つもしくは複数の方法および／またはその型のステップを含む。
【0067】
用語「投与する」、「投与すること」または「投与された」は、生理学的系（例えば、対象またはｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏの細胞、組織および臓器）に薬剤または治療的処置を与える行為を意味する。
【0068】
用語「親和性」は、本明細書で使用される場合、ある分子の単一の結合部位とその結合パートナーとの間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。他に示さない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって示され得る。親和性は、当該分野で公知の一般的方法によって測定され得る。
【0069】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸、ならびに天然に存在しないまたは非標準的アミノ酸、例えば、アミノ酸アナログ、合成アミノ酸およびアミノ酸模倣物を指す。これらのアミノ酸は、Ｌ－もしくはＤ－（異性体）立体配置であり得、または両方の右旋性形態を含み得る。ペプチド中に取り込まれたアミノ酸は、「残基」と呼ばれる。アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される一般に公知の３文字記号または１文字記号のいずれかによって、本明細書で言及され得る。以下のアミノ酸定義が、本明細書を通じて使用される：アラニン：Ａｌａ（Ａ）アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）グルタミン：Ｇｌｎ（Ｏ）グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）リシン：Ｌｙｓ（Ｋ）メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【0070】
用語「結合剤」は、本明細書で使用される場合、受容体と複合体を形成するリガンド（例えば、ペプチド）を指す。リガンドは、選択的または非選択的であり得る。リガンドは、アゴニスト（部分または完全）、アンタゴニスト（即ち、アゴニストの作用を遮断する）、インバースアゴニスト（即ち、アゴニストの反対の作用を発揮する）またはアロステリックモジュレーターであり得る。アンタゴニストは、競合的（即ち、アゴニストと同じ部位に結合する）または非競合的アンタゴニスト（即ち、アゴニストと同じ部位に恒久的に結合する、またはアロステリック部位 － 活性部位以外の部位 － に結合する）であり得る。
【0071】
用語「診断された」、「診断（的）」または「診断された」は、病理的状態の存在または性質を識別することを意味する。診断方法は、観察およびアッセイを含み、それらの感度および特異度が異なる。診断的観察またはアッセイの「感度」は、試験陽性の疾患個体のパーセンテージ（「真陽性」のパーセント）である。観察またはアッセイによって検出されない疾患個体は、「偽陰性」である。疾患でなく、観察またはアッセイにおいて試験陰性の対象は、「真陰性」と呼ばれる。診断的観察またはアッセイの「特異度」は、１マイナス偽陽性率であり、「偽陽性」率は、試験陽性の、疾患を有さない者の割合として定義される。特定の診断方法は、状態の確定診断を提供しない場合があるが、方法が診断を助ける陽性の指標を提供するのであれば、それで十分である。
【0072】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な、治療（例えば、予防剤または治療剤）の量を指す。有効量は、１つまたは複数の投与で投与され得る。
【0073】
本明細書で使用される場合、用語「炎症性疾患」は、ａ．白血球の動員、接着または活性化、および好中球、単球、リンパ球またはマクロファージが関与する他の障害、ｂ．炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α、インターロイキン（ＩＬ）－ｌβ、ＩＬ－２、ＩＬ－６）の病理学的産生が関与する疾患、ｃ．炎症性サイトカインをコードする遺伝子の転写を促進する核因子の活性化が含まれるがこれらに限定されない疾患（本明細書に記載される化合物で処置可能または予防可能）を指す。これらの核転写因子の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：核因子－κＢ（ＮＦκＢ）、活性化タンパク質－１（ＡＰ－１）、活性化されたＴ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）。
【0074】
用語「虚血再灌流傷害」は、本明細書で使用される場合、組織への血液供給の制限（虚血）とその後の血液の再供給（再灌流）によって最初に引き起こされる損傷を指し、フリーラジカルの付随的な生成、炎症および細胞死が、臓器傷害および機能不全を生じる。移植シナリオでは、虚血再灌流傷害は、同種移植片機能に負の影響を与える。
【0075】
用語「単離された」は、本明細書で使用される場合、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合には、天然環境）から取り出された材料を指す。例えば、生きた動物中に存在する天然に存在するペプチドは、単離されていないが、天然の系において共存する材料の一部または全てから分離された同じポリヌクレオチドペプチドは、単離されている。
【0076】
用語「薬学的に許容される担体」は、特定の投与様式に適切であることが当業者に公知の任意のかかる担体を指す。例えば、用語「薬学的に許容される担体」には、薬学的に許容される物質のための媒体として使用され得る、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。さらに、活性材料はまた、所望の作用を損なわない他の活性材料と、または所望の作用を補うもしくは別の作用を有する材料と、混合され得る。
【0077】
用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書で使用される場合、非毒性であることが公知であり、医薬品文献において一般に使用される塩を指す。かかる塩を形成するために使用される典型的な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、次リン酸などが含まれる。有機酸、例えば、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸およびヒドロキシアルカンジオン酸（ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸に由来する塩もまた使用され得る。かかる薬学的に許容される塩には、酢酸塩、フェニル酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アクリル酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ｏ－アセトキシ安息香酸塩、ナフタレン－２－安息香酸塩、臭化物、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、ベータ－ヒドロキシ酪酸塩、塩化物、ケイ皮酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘプタン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、ピロ硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、スルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酒石酸塩（ｔａｒｔａｒａｔｅ）などが含まれる。
【0078】
用語「予防する」または等価物、例えば、「予防」もしくは「予防すること」は、未処置の対照試料と比較して、処置された試料における障害もしくは状態の発生を低減させること、あるいは未処置の対照試料と比較して、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の開始を遅延させることまたはその重症度を低減させることを指す。本明細書で使用される場合、虚血－再灌流傷害を予防することは、酸化的損傷を予防しまたはミトコンドリア膜透過性遷移を予防し、それによって、影響を受けた臓器への血液の流れの喪失および引き続く回復の有害な影響を予防することもしくは寛解させることを含む。予防することは、対象が、以後の人生でその状態を決して発症しないことを意味するわけではない －
発生の可能性が低減されるだけである。
発生の可能性が低減されるだけである。
【0079】
本明細書の疾患または状態の文脈において、用語「低減させること」、「低減させる」または「低減」は、疾患または状態の原因、症状または影響における減少を指す。したがって、開示された方法では、「低減させること」は、再灌流に起因する傷害の量における、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少、またはそれらの間の任意の値もしくは範囲を指し得る。
【0080】
用語「対象」もしくは「患者」またはその同義語は、本明細書で使用される場合、動物界の全てのメンバー、特に、ヒトを含む哺乳動物を含む。対象または患者は、適切には、ヒトである。
【0081】
用語「移植」は、細胞、組織または臓器がドナー対象からレシピエント対象に移行される、または同じ対象中の身体の１つの部分から別の部分に移行される、外科的手順を意味する。「ドナー対象」または「ドナー」は、輸血または臓器移植によって、血液、細胞、組織または臓器を別の対象に与える対象である。ドナー対象は、ヒトまたは別の哺乳動物である。「レシピエント対象」または「レシピエント」は、輸血または臓器移植によって、別の対象からの血液、細胞、組織または臓器を受ける対象である。
【0082】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、任意の状態または疾患の少なくとも１つの病理学および／または症状の進行、重症度および／または持続時間の予防、低減または寛解を指す。用語「処置」または「処置すること」は、本明細書で開示される化合物の任意の投与を指し、以下を含む：（ｉ）疾患もしくは疾患状態の病理学もしくは症候学を経験しているもしくは示している個体において、疾患もしくは疾患状態を阻害すること（即ち、病理学および／もしくは症候学のさらなる展開を止めること）または（ｉｉ）疾患もしくは疾患状態の病理学もしくは症候学を経験しているもしくは示している個体において、疾患を寛解させること（即ち、病理学および／もしくは症候学を逆転させること）。用語「制御すること」は、疾患または疾患状態の症状を予防すること、処置すること、根絶すること、寛解すること、またはその重症度を他の方法で低減させることを含む。
【0083】
がんに関して、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、１つまたは複数の治療（例えば、１つまたは複数の予防剤および／または治療剤）の投与から生じる、がん、特に固形腫瘍、またはその１つもしくは複数の症状の進行、重症度および／または持続時間の低減または寛解を指す。例示的な実施形態では、固形腫瘍の処置は、以下のうち１つまたは複数を指す：（ｉ）がん細胞の数を低減させること；（ｉｉ）腫瘍細胞アポトーシスを増加させること；（ｉｉｉ）腫瘍サイズを低減させること；（ｉｖ）腫瘍体積を低減させること；（ｖ）末梢臓器中へのがん細胞浸潤をある程度まで阻害すること、遅らせること、緩徐化すること、および好ましくは停止させること；（ｖｉ）腫瘍転移を阻害すること（例えば、ある程度まで緩徐化すること、および好ましくは停止させること）；（ｖｉｉ）腫瘍成長を阻害すること；（ｖｉｉｉ）腫瘍の発生および／もしくは再発を予防することもしくは遅延させること；（ｉｘ）がんの存在と関連するがんマーカーの低減；ならびに／または（ｉｘ）がんと関連する症状のうち１つもしくは複数をある程度まで軽減すること。「処置」は、処置を受けていない場合に期待される生存と比較して、生存を延長させることも意味し得る。標準的な方法、例えば、精製された酵素を用いたｉｎ
ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞に基づくアッセイ、動物モデルまたはヒト試験が、この効果の大きさを測定するために使用され得る。例えば、患者のがん腫瘍の免疫組織化学的解析は、本明細書で開示される組成物が患者に投与される場合に、腫瘍細胞アポトーシスにおける顕著な増加を示し得る。固形腫瘍として通常は現れるがんの型を指す場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波もしくは触診などの手順によって、腫瘍量に基づいて検出可能な腫瘍、および／または患者から得ることができる試料中の１つもしくは複数のがん特異的抗原の発現に起因して検出可能な腫瘍である。
ＩＩ．ＤＰＥＰ－１
ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞に基づくアッセイ、動物モデルまたはヒト試験が、この効果の大きさを測定するために使用され得る。例えば、患者のがん腫瘍の免疫組織化学的解析は、本明細書で開示される組成物が患者に投与される場合に、腫瘍細胞アポトーシスにおける顕著な増加を示し得る。固形腫瘍として通常は現れるがんの型を指す場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波もしくは触診などの手順によって、腫瘍量に基づいて検出可能な腫瘍、および／または患者から得ることができる試料中の１つもしくは複数のがん特異的抗原の発現に起因して検出可能な腫瘍である。
ＩＩ．ＤＰＥＰ－１
【0084】
腎ジペプチダーゼ、ミクロソームジペプチダーゼまたはデヒドロペプチダーゼ－１としても公知であり、現在ＥＣ３．４．１３．１９と分類されている（以前にはＥＣ３．４．１３．１１であった）ＤＰＥＰ－１は、原形質膜のグリコシルホスファチジルイノシトールアンカリングされた糖タンパク質である（参照により本明細書に組み込まれるＫｅｙｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｏｏｐｅｒ （Ｅｄ．） Ｚｉｎｃ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｌｏｎｄｏｎ ｐａｇｅｓ ２８５－３０９ （１９９６））。肺および腎臓刷子縁において主に発現されるこの亜鉛メタロプロテアーゼは、グルタチオンの腎代謝およびペプチジルロイコトリエンの肺代謝にｉｎ ｖｉｖｏで関与する。さらに、ＤＰＥＰ－１は、哺乳動物ベータ－ラクタマーゼの唯一の公知の例であり、グルタチオンおよびそのコンジュゲートならびにロイコトリエンＤ４の代謝にも関与する。ＤＰＥＰ－１は、ジスルフィド連結されたホモダイマーを形成し、モノマーの分子量は、起源の種に依存して約４８～５９ｋＤａの範囲である（参照により本明細書に組み込まれるＫｅｙｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５：１２５１１－１２５１７ （１９９６）；実施例ＩＶＢもまた参照のこと）。
【0085】
ジペプチダーゼ発現は、いくつかの組織で検出されているが、これは、肺および腎臓において主に発現される。肝臓、脾臓、小腸および脳からの総抽出物において、低レベルのＤＰＥＰ－１活性が報告されているが、他は、これらの臓器において検出可能な活性が見出されていない。マウスでは、４つの別個のＤＰＥＰ－１ ｍＲＮＡが存在し、それらは、いくつかの臓器において差次的に発現される（Ｈａｂｉｂ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１６２７３－１６２８０ （１９９６））。ブタＤＰＥＰ－１のＮ結合型グリコシル化の性質および程度における臓器特異的差異も報告されている（Ｈｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２４：１５１－１５７
（１９９７））。
（１９９７））。
【0086】
腎臓では、ＤＰＥＰ－１発現は、近位尿細管の刷子縁領域中の上皮細胞および尿細管周囲毛細血管の内皮細胞に制限される。肺では、ＤＰＥＰ－１発現は、誘導気道（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ ａｉｒｗａｙ）、肺胞管、毛細血管の内皮細胞および上皮細胞を含む多くの細胞型、ならびに肺胞および終末細気管支の基底膜において検出されている（Ｈａｂｉｂ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ， １９９６）；Ｉｎａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ ａｎｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ５０：８５－９２ （１９９４））。ＤＰＥＰ－１発現は、ヒト気管中の粘膜下微小血管の内皮細胞上でも観察されている（Ｙａｍａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｐ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１１：１０１－１０９ （１９９８））。ＤＰＥＰ－１活性のレベルは、肺において最も高い（Ｈｉｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６０：５２１－５２５ （１９８６）；Ｈａｂｉｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：４８５９－４８６３ （１９９８））。この発現パターンは、ＧＦＥ－１などの分子の強い肺ホーミングと相関する。
Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ５０：８５－９２ （１９９４））。ＤＰＥＰ－１発現は、ヒト気管中の粘膜下微小血管の内皮細胞上でも観察されている（Ｙａｍａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｐ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１１：１０１－１０９ （１９９８））。ＤＰＥＰ－１活性のレベルは、肺において最も高い（Ｈｉｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６０：５２１－５２５ （１９８６）；Ｈａｂｉｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：４８５９－４８６３ （１９９８））。この発現パターンは、ＧＦＥ－１などの分子の強い肺ホーミングと相関する。
【0087】
特定の理論に束縛されないが、ＤＰＥＰ－１受容体は、血管内皮、または他の実質細胞、例えば、腎臓尿細管上皮上で発現される白血球接着分子または腫瘍細胞接着分子として機能すると考えられている（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ． ２０１９， Ｃｅｌｌ
１７８， １２０５－１２２１）。接着分子は、動員プロセスに関与し、白血球および／または内皮細胞上で発現される表面結合した糖タンパク質分子である。白血球動員における重要なステップは、内皮の表面上での白血球の堅固な接着であり、これは、炎症した部位に対してその効果を発揮するために接着および活性化事象の配列を介して血管壁中に遊走するように、白血球を位置付ける。ＤＰＥＰ－１は、臓器傷害または感染の間に、ペプチド検出系としても機能し得る。１つのかかるペプチド検出系は、侵入してくる病原体の重要な分子シグネチャー、即ち、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）または内因性損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を検出し、それによって、自然免疫系を誘発する、いわゆるパターン認識受容体（ＰＲＲ）である（Ｊａｎｅｗａｙ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０ （２００２）， ｐｐ． １９７－２１６）。ＰＲＲの例は、（ｔｏｌｌ様受容体）ＴＬＲであり、これは、細菌またはウイルス産物、例えば、ＬＰＳ（ＴＬＲ４）またはペプチドグリカン（ＴＬＲ２）を検出する（Ｂｅｌｌ， Ｊ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２４ （２００３）， ｐｐ． ５２８－５３３）。
１７８， １２０５－１２２１）。接着分子は、動員プロセスに関与し、白血球および／または内皮細胞上で発現される表面結合した糖タンパク質分子である。白血球動員における重要なステップは、内皮の表面上での白血球の堅固な接着であり、これは、炎症した部位に対してその効果を発揮するために接着および活性化事象の配列を介して血管壁中に遊走するように、白血球を位置付ける。ＤＰＥＰ－１は、臓器傷害または感染の間に、ペプチド検出系としても機能し得る。１つのかかるペプチド検出系は、侵入してくる病原体の重要な分子シグネチャー、即ち、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）または内因性損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を検出し、それによって、自然免疫系を誘発する、いわゆるパターン認識受容体（ＰＲＲ）である（Ｊａｎｅｗａｙ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０ （２００２）， ｐｐ． １９７－２１６）。ＰＲＲの例は、（ｔｏｌｌ様受容体）ＴＬＲであり、これは、細菌またはウイルス産物、例えば、ＬＰＳ（ＴＬＲ４）またはペプチドグリカン（ＴＬＲ２）を検出する（Ｂｅｌｌ， Ｊ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２４ （２００３）， ｐｐ． ５２８－５３３）。
【0088】
ＴＬＲは、リガンド結合および自己調節に関与するそれらの細胞外ドメイン中のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を介して病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識する膜貫通受容体である（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．
１３， ８１６－８２５， ２００６）。ＴＬＲは、宿主防御応答の最初期に微生物構造を認識し、多くの免疫および炎症遺伝子の発現を誘導し、それらの産物は、侵入してくる病原体を排除するために必要な免疫機構を駆動するように調整される。ＴＬＲは、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の認識にも関与しており、腫瘍促進性炎症の調節因子および腫瘍生存シグナルの促進因子としてますます認識されるようになっている。かかる細胞経路の他の活性化因子は、病原体および損傷関連細胞炎症を処置するための有効な治療標的を提供し得る。
１３， ８１６－８２５， ２００６）。ＴＬＲは、宿主防御応答の最初期に微生物構造を認識し、多くの免疫および炎症遺伝子の発現を誘導し、それらの産物は、侵入してくる病原体を排除するために必要な免疫機構を駆動するように調整される。ＴＬＲは、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の認識にも関与しており、腫瘍促進性炎症の調節因子および腫瘍生存シグナルの促進因子としてますます認識されるようになっている。かかる細胞経路の他の活性化因子は、病原体および損傷関連細胞炎症を処置するための有効な治療標的を提供し得る。
【0089】
本明細書で使用される場合、用語「ジペプチダーゼ」および「膜ジペプチダーゼ」は、「ＤＰＥＰ－１」と同義であり、現在ＥＣ３．４．１３．１９と分類されている（以前にはＥＣ３．４．１３．１１であった）酵素を指し、腎もしくはミクロソームジペプチダーゼまたはデヒドロペプチダーゼ－１としても公知である。
【0090】
用語「選択的に阻害する」は、ＤＰＥＰ－１酵素活性に言及して本明細書で使用される場合、結合剤が、関連はするが異なる酵素、例えば、他のプロテアーゼと比較して、ＤＰＥＰ－１酵素に選択的な様式でＤＰＥＰ－１活性を減少させることを意味する。したがって、ＤＰＥＰ－１結合剤は、例えば、亜鉛メタロプロテアーゼの非特異的阻害剤とは別個である。したがって、ＤＰＥＰ－１結合剤は、例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性に対して影響をほとんどまたは全く有さずに、ＤＰＥＰ－１活性を選択的に減少させ得る。一実施形態では、結合剤は、ＤＰＥＰ－１への結合を防止する競合的阻害剤である。
【0091】
用語「選択的に結合する」は、ＤＰＥＰ－１結合剤に言及して本明細書で使用される場合、結合剤が、関連はするが異なる受容体と比較して、ＤＰＥＰ－１受容体に選択的な様式でＤＰＥＰ－１媒介性白血球動員を減少させることを意味する。ＤＰＥＰ－１結合剤は、ＤＰＥＰ－１媒介性白血球動員を減少させることも指し、ここで、ＤＰＥＰ－１は、その酵素活性とは無関係に、白血球または腫瘍細胞に対する接着分子として作用する。したがって、ＤＰＥＰ－１結合剤は、例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性に対して影響をほとんどまたは全く有さずに、ＤＰＥＰ－１媒介性白血球動員を選択的に減少させ得る。一実施形態では、結合剤は、ＤＰＥＰ－１への結合を防止する競合的または非競合的阻害剤である。
【0092】
一実施形態では、本明細書で開示されるＤＰＥＰ－１結合剤は、ＤＰＥＰ受容のアンタゴニストである、即ち、相互作用を破壊し、アゴニストまたはインバースアゴニストの機能を阻害するように、受容体に結合しそれを遮断することによって、生物学的応答を遮断するまたは弱める。特定の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合剤は、競合的アンタゴニストである、即ち、活性部位についてアゴニストと競合する。別の特定の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合剤は、非競合的アンタゴニストである、即ち、活性部位以外の部位で結合する。
【0093】
特異的結合という用語は、本明細書で使用される場合、低親和性および高親和性の両方の特異的結合を含む。特異的結合は、例えば、膜ジペプチダーゼに対して約１０－４Ｍ～約１０－７ＭのＫｄを有する低親和性ＤＰＥＰ－１結合分子によって示され得る。特異的結合は、高親和性ＤＰＥＰ－１結合分子、例えば、膜ジペプチダーゼに対して少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、少なくとも約１０－１０Ｍ、または少なくとも約１０－１１Ｍもしくは１０－１２Ｍあるいはそれよりも大きいＫｄを有するＤＰＥＰ－１結合分子によっても示され得る。式中、Ｘ１およびＸ２が各々、１～１０個の独立して選択されるアミノ酸である、ＬＳＡＬＴペプチドを含むＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、例えば、膜ジペプチダーゼに対して約２×１０－５Ｍ～１０－７ＭのＫｄ、例えば、約１０－６～１０－７ＭのＫｄを有し得る。肺または腎臓内皮に選択的に結合する低親和性および高親和性の両方のＤＰＥＰ－１結合分子は、本明細書に記載される方法において有用であり得る。
ＩＩＩ．ＤＰＥＰ－１結合組成物
ＩＩＩ．ＤＰＥＰ－１結合組成物
【0094】
ＤＰＥＰ－１に結合することまたはＤＰＥＰ－１を遮断することは、例えば、敗血症または急性腎臓傷害の間に、肺および腎臓における炎症媒介性疾患を低減させる有用性を有する。ＤＰＥＰ－１に結合することまたはＤＰＥＰ－１を遮断することは、腫瘍転移を低減させる有用性もまた有する。ペプチドが含まれるがこれに限定されない、ＤＰＥＰ－１に結合するまたはＤＰＥＰ－１を遮断する組成物が、本明細書で開示される。
Ａ．ＤＰＥＰ－１結合ペプチド
Ａ．ＤＰＥＰ－１結合ペプチド
【0095】
ＤＰＥＰ－１に結合するペプチドが、本明細書で開示される。これらの方法において使用されることが可能なこれらの結合ペプチドのバリアントおよび改変された実施形態もまた提供される。一実施形態では、ペプチドは、ＤＰＥＰ－１の活性をモジュレートし、より詳細には、ＤＰＥＰ－１の活性を、競合的または非競合的に阻害する。
【0096】
偏りなしのコンビナトリアルファージｉｎ ｖｉｖｏバイオパニングアプローチを使用して、炎症促進性刺激で処置された動物の肝臓および肺に局在化し、白血球動員を遮断する特異的ペプチドディスプレイファージが単離された。このファージおよびその対応するディスプレイされたペプチド（ＬＳＡＬＴまたはＭｅｔａｂｌｏｋと呼ばれるＮ－ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ）（配列番号１）は、腫瘍細胞系を注射した動物の肝臓または肺において、腫瘍負荷を劇的に低減させることもまた見出された。ＬＳＡＬＴは、ＤＰＥＰ－１に結合し、組織の炎症プロファイルを低減させることが可能であり、それによって、いくつかの治療的に有用な作用を提供する。ペプチドはまた、敗血症のマウスモデルにおいて、肝臓への好中球動員を低減させた。ＬＳＡＬＴペプチド（ＬＳＡＬＴまたはＭｅｔａｂｌｏｋと呼ばれる；配列番号１）、ならびにそのバリアントおよび改変されたバージョンは、米国特許第９，４６４，１１４号に記載されている。
【0097】
一部の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、プロテアーゼ耐性、血清安定性および／またはバイオアベイラビリティを増加させるために、１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、改変は、ＰＥＧ化、アセチル化、グリコシル化、ビオチン化、プレニル化、またはＤ－アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸による置換、ならびに／またはペプチドの環化から選択される。
【0098】
ある特定の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、１つまたは複数のＬ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸および／または非標準的アミノ酸を含む。
【0099】
種々の実施形態では、ＤＥＰ－１結合ペプチドは、Ｃ末端、Ｎ末端、またはＣ末端およびＮ末端の両方に、１つまたは複数のアミノ酸残基またはアナログをさらに含む。好ましくは、ペプチドの活性保有配列は、これらの追加のアミノ酸（複数可）の付加によって、感知できるほどには影響されない。
【0100】
別の実施形態では、ＤＥＰ－１結合ペプチドは、ペプチド配列のＮ末端に、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基をさらに含む。
【0101】
種々の実施形態では、ペプチドは、Ｘ－ペプチド、ＸＸ－ペプチド、ＸＸＸ－ペプチド、ＸＸＸＸ－ペプチドまたはＸＸＸＸＸ－ペプチドから選択され、式中、Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、またはＸは、本明細書に記載されかつ当業者に公知の、非慣習的なアミノ酸もしくはアミノ酸アナログである。
【0102】
別の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１）配列のＣ末端に、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基をさらに含み、ペプチド－Ｘ、ペプチド－ＸＸ、ペプチド－ＸＸＸ、ペプチド－ＸＸＸＸまたはペプチド－ＸＸＸＸＸから選択され、式中、Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、またはＸは、本明細書に記載されかつ当業者に公知の、非慣習的なアミノ酸もしくはアミノ酸アナログである。
【0103】
一実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基をさらに含み、Ｘ－ペプチド－Ｘ、Ｘ－ペプチド－ＸＸ、Ｘ－ペプチド－ＸＸＸ、Ｘ－ペプチド－ＸＸＸＸ、Ｘ－ペプチド－ＸＸＸＸＸ、ＸＸ－ペプチド－Ｘ、ＸＸ－ペプチド－ＸＸ、ＸＸ－ペプチド－ＸＸＸ、ＸＸ－ペプチド－ＸＸＸＸ、ＸＸ－ペプチド－ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸ－ペプチド－Ｘ、ＸＸＸ－ペプチド－ＸＸ、ＸＸＸ－ペプチド－ＸＸＸ、ＸＸＸ－ペプチド－ＸＸＸＸ、ＸＸＸ－ペプチド－ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸ－ペプチド－Ｘ、ＸＸＸＸ－ペプチド－ＸＸ、ＸＸＸＸ－ペプチド－ＸＸＸ、ＸＸＸＸ－ペプチド－ＸＸＸＸ、ＸＸＸＸ－ペプチド－ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＸ－ペプチド－Ｘ、ＸＸＸＸＸ－ペプチド－ＸＸ、ＸＸＸＸＸ－ペプチド－ＸＸＸ、ＸＸＸＸＸ－ペプチド－ＸＸＸＸまたはＸＸＸＸＸ－ペプチド－ＸＸＸＸＸから選択され、式中、Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、またはＸは、本明細書に記載されかつ当業者に公知の、非慣習的なアミノ酸もしくはアミノ酸アナログである。
【0104】
有効量のＤＰＥＰ－１結合ペプチドを含む組成物であって、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドが、ＬＳＡＬＴペプチドまたはその誘導体もしくは断片であり得る組成物が、本明細書で開示される。
【0105】
一実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、アミノ酸配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１）を含む。一実施形態では、ペプチドは、ペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端に、追加の１、２、３、４または５個のアミノ酸残基を含む。具体的な実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端に、追加の１、２、３、４または５個のアミノ酸残基を含む。一実施形態では、ペプチドは、ＬＳＡＬＴペプチド（配列番号１）のＮ末端に、追加のグリシン残基を含む。別の実施形態では、少なくとも１つのグリシン残基が、ＬＳＡＬＴペプチドのＮ末端にある。別の実施形態では、少なくとも２つのグリシン残基が、ＬＳＡＬＴペプチドのＮ末端にある。さらなる実施形態では、少なくとも３つのグリシン残基が、ＬＳＡＬＴペプチドのＮ末端にある。特定の実施形態では、ペプチドは、ＧＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号２）、ＧＧＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号３）、またはＧＧＧＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号４）から選択される。具体的な実施形態では、ペプチドは、ＧＧＧＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号４）である。
【0106】
さらなる実施形態では、ペプチドは、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１）を含み、ペプチドは、１つまたは複数のＤ－アミノ酸またはＬ－アミノ酸で置換されている。別の実施形態では、ペプチドは、改変されたアミノ酸、アミノ酸アナログまたはそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の改変を含む。
【0107】
他の実施形態では、本明細書で提供されるＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、ＬＳＡＬＴペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端から、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基が除去されている。これらのペプチドは、以下の配列のいずれかを有し得る：ＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号９）、ＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１０）、ＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１１）、ＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１２）、ＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫ（配列番号１３）および／またはＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１４）。
【0108】
特定の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、ＬＳＡＬＴペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端から、３個のアミノ酸残基が除去されている。特定の実施形態では、ペプチドは、ＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号５）である。
【0109】
有効量のＤＰＥＰ－１結合ペプチドを含む組成物であって、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドがネオゲニン模倣性ペプチドまたはその誘導体を含む組成物が、提供される。一実施形態では、ネオゲニン模倣性ペプチドは、配列番号６である。ネオゲニン模倣性ペプチドは、ネオゲニンタンパク質の一部分と類似している。
【0110】
ネオゲニンは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する多機能性膜貫通受容体である。ネオゲニンは、ネトリンによって惹起されるシグナルを伝達することができる。これらのネオゲニン－ネトリン相互作用は、組織形態形成、血管新生、筋芽細胞分化および最も最近では軸索ガイダンスに関与している。ネオゲニンは、神経分化、アポトーシスおよび反発的軸索ガイダンスに関与するグリコシルホスファチジルイノシトール連結されたタンパク質である反発的ガイダンス分子に対する受容体でもある。ネオゲニンのｉｎ ｖｉｖｏ機能、ならびに発生および恒常性の複数の局面におけるその役割を解明するために、多数の研究が開始されている（Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｋｅｙ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃａｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ３９， Ｉｓｓｕｅ ５， ２００７， Ｐａｇｅｓ ８７４－８７８）。さらなる実施形態では、ペプチドは、置換されたネオゲニン模倣性ペプチド（配列番号６）を含み、ネオゲニン模倣性ペプチドは、１つまたは複数のＤ－アミノ酸またはＬ－アミノ酸で置換されている。
【0111】
一実施形態では、ネオゲニン模倣性ペプチドは、アミノ酸配列ＫＨＭＨＷＨＰＰＡＬＮＴ（配列番号６）を含む。一実施形態では、ネオゲニン模倣性ペプチドは、ペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端に、追加の１、２、３、４または５個のアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、ペプチドは、ネオゲニン模倣性ペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端から、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基が除去されている。さらなる実施形態では、ペプチドは、置換されたネオゲニン模倣性ペプチド（配列番号６）を含み、ペプチドは、１つまたは複数のＤ－アミノ酸またはＬ－アミノ酸で置換されている。別の実施形態では、ペプチドは、改変されたアミノ酸、アミノ酸アナログまたはそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の改変を含む。
【0112】
特定の実施形態では、ネオゲニン模倣性ペプチド配列は、アミノ酸配列ＫＨＭＨＷＨＰＰＡＬＮＴ（配列番号６）から本質的になる。一実施形態では、ネオゲニン模倣性ペプチドは、ＫＨＭＨＷＨＰＰＡＬＮＴならびにペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端の追加の１、２、３、４または５個のアミノ酸残基から本質的になる。別の実施形態では、ペプチドは、ネオゲニン模倣性ペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端から、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基が除去されている。さらなる実施形態では、ネオゲニン模倣性ペプチドは、置換されたネオゲニン模倣性ペプチド（配列番号６）から本質的になり、ネオゲニン模倣性ペプチドは、１つまたは複数のＤ－アミノ酸またはＬ－アミノ酸で置換されている。別の実施形態では、ペプチドは、改変されたアミノ酸、アミノ酸アナログまたはそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の改変を含む。
【0113】
さらなる態様では、有効量のＤＰＥＰ－１結合阻害性ペプチドを含む組成物であって、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドがＩＰＫペプチドまたはその誘導体を含む組成物が、提供される。
【0114】
一実施形態では、ＩＰＫペプチド配列は、ＩＰＫＸＰＸＸＸＰ（配列番号７）であり得、式中、Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、またはＸは、本明細書に記載されかつ当業者に公知の、非慣習的なアミノ酸もしくはアミノ酸アナログである。具体的な実施形態では、ＩＰＫペプチド配列は、ＨＩＰＫＳＰＩＱＩＰＩＩ（配列番号８）であり得る。
【0115】
他の実施形態では、ＩＰＫペプチドは、ペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端に、追加の１、２、３、４または５個のアミノ酸残基を含み得る。別の実施形態では、ペプチドは、ＩＰＫペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端から、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基が除去されている。さらなる実施形態では、ペプチドは、置換されたＩＰＫペプチドを含み、ペプチドは、１つまたは複数のＤ－アミノ酸またはＬ－アミノ酸で置換されている。別の実施形態では、ペプチドは、改変されたアミノ酸、アミノ酸アナログまたはそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の改変を含む。
【0116】
ＬＳＡＬＴが結合する配列を識別するために、ＬＳＡＬＴペプチドに対するファージディスプレイバイオパニングを、本明細書で開示されるように実施した。モチーフＩＰＫＸＰＸＸＸＰを含む２つのペプチドを識別した。ＩＰＫファージヒットのうち１つ（ＨＩＰＫＳＰＩＱＩＰＩＩ）は、ＬＰＳ刺激されたヒト内皮細胞において好中球接着を阻害することができた（図２０）。ＩＰＫモチーフは、好中球リガンド相互作用のためのＤＰＥＰ－１上の結合部位を提示し得る。ＩＰＫペプチドは、ＤＰＥＰ１と相互作用する好中球リガンドに結合することによって、ＤＰＥＰ１媒介性白血球接着を妨害し得、したがって、本明細書で開示されるＩＰＫペプチドは、ＤＰＥＰ－１結合阻害性ペプチドとして記載される。一実施形態では、本明細書で開示されるＩＰＫペプチドは、ＤＰＥＰ－１への結合を防止する非競合的阻害剤である。
Ｂ．改変されたペプチドおよびペプチドアナログ
Ｂ．改変されたペプチドおよびペプチドアナログ
【0117】
種々の実施形態では、ペプチドは、ペプチド中のカルボキシ末端および／もしくはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸を含み、またはその活性に有害な影響を与えることなしにペプチドの循環半減期を変化させ得るＰＥＧ化、メチル化、アミド化、アセチル化、プレニル化および／もしくは他の化学基による置換によって改変され得る。非慣習的なまたは非天然アミノ酸の例には、シトルリン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、４－（Ｅ）－ブテニル－４（Ｒ）－メチル－Ｎ－メチルスレオニン（ＭｅＢｍｔ）、Ｎ－メチル－ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、アミノイソ酪酸、スタチン（ｓｔａｔｉｎｅ）およびＮ－メチル－アラニン（ＭｅＡｌａ）が含まれるがこれらに限定されない。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与し得る。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、合成または非天然アミノ酸（例えば、α，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸）である；一部の実施形態では、アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸である；ある特定の実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。
Ｃ．ＤＰＥＰ－１結合ペプチドの合理的設計および構造－機能解析
Ｃ．ＤＰＥＰ－１結合ペプチドの合理的設計および構造－機能解析
【0118】
異なる技術が、タンパク質構造についての異なる補完的な情報を与える。一次構造は、タンパク質からのアミノ酸配列の直接的決定によって、または対応する遺伝子もしくはｃＤＮＡのヌクレオチド配列から、生化学的方法によって得られる。大きいタンパク質または凝集体の四次構造は、電子顕微鏡によっても決定され得る。タンパク質内の原子の配置についての詳細な情報を必要とする二次および三次構造を得るために、ｘ線結晶解析が一般に使用される。ペプチドの構造および機能を評価するための他の構造的テクノロジーには、水素重水素交換質量分析、ｂｉｏ－ＮＭＲおよびｃｒｙｏ－ＥＭが含まれる。
【0119】
ｘ線結晶解析によってタンパク質の三次元構造を解析するための第１の要件は、ｘ線を強く回折する秩序立った結晶である。結晶学的方法は、個々の分子の構造がそこから読み出され得るパターンでｘ線がそこから回折されるように、多くの同一の分子の規則的な反復アレイ上に、ｘ線のビームを方向付ける。球状タンパク質分子の秩序立った結晶は大きく、不規則な表面を有する球形または楕円体の物体およびその結晶は、個々の分子間に形成される大きい穴またはチャネルを含む。結晶の体積の半分よりも多くを通常占めるこれらのチャネルは、無秩序な溶媒分子で満たされる。タンパク質分子は、いくつかの小さい領域のみにおいて、互いに接触している。これは、ｘ線結晶解析によって決定されたタンパク質の構造が、溶液中のタンパク質の構造と一般に同じである１つの理由である。
【0120】
ｘ線結晶解析は、標的生体分子に結合するそれらの能力について、標的生体分子の公知のリガンドではない化合物をスクリーニングするために使用され得る。方法は、標的生体分子の結晶を得るステップ；標的生体分子結晶を１つまたは複数の試験試料に曝露させるステップ；およびＸ線結晶回折パターンを得て、リガンド／受容体複合体が形成されているかどうかを決定するステップ、を含む。
【0121】
ＤＰＥＰ－１受容体は、１つもしくは複数の試験試料の存在下で生体分子を共結晶化すること、または１つもしくは複数の試験試料の溶液中に生体分子結晶を浸すことによって、試験ペプチドに曝露される。別の実施形態では、リガンド／受容体複合体からの構造的情報は、より緊密に結合する、より特異的に結合する、より良い生物活性を有する、またはより良い安全性プロファイルを有するリガンドを設計するために使用される。これらには、小分子または他の生物療法薬、例えば抗体が含まれ得る。
【0122】
本明細書に記載されるペプチドは、質量分析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびアミノ酸解析（ＡＡＡ）を使用して、完全に特徴付けられ得る。
【0123】
質量分析は、タンパク質の構造を決定する際に使用される、タンパク質のアミノ酸残基間の距離拘束を得るために使用される。
【0124】
いずれの特定の機構にも束縛されないが、三次構造を安定化するペプチド構造および任意の改変は、ＤＰＥＰ－１への結合を増強すると考えられる。
【0125】
一実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、アルファ－ヘリックスを形成する。
【0126】
種々の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、ラクタム架橋またはグリシンスペーサーを含む。かかる構造は、ペプチドを安定化し、ＤＰＥＰ－１への結合の堅牢性を改善するために使用される。
【0127】
種々の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドの外側に、疎水性を増加させる改変を含む。かかる改変は、ＤＰＥＰ－１への結合を増加させるために使用される。
【0128】
一実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、エクソン３上のＩＰＫモチーフにおいてＤＰＥＰ－１受容体に結合する。ＩＰＫモチーフは、ヒトおよびマウスの両方のＤＰＥＰ－１中に存在するが、ヒトおよびマウス由来のＤＰＥＰ－２にもＤＰＥＰ－３にも存在しない。
【0129】
一実施形態では、ＤＰＥＰ－１のＩＰＫモチーフにリガンドが結合するのを妨害するペプチドは、ＨＩＰＫＳＰＩＱＩＰＩＩである。
【0130】
他に定義しない限り、本明細書で使用される科学的および技術的な用語および術語体系は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学の方法などの手順は、当該分野で使用される一般的な方法である。かかる標準的な技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， ２００１などの参照マニュアル中に見出すことができる。
【0131】
ペプチドは、生物活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで惹起するのに有効であり得るが、それらのｉｎ ｖｉｖｏ有効性は、プロテアーゼの存在によって低減され得る。血清プロテアーゼは、特異的基質要求を有する。基質は、切断のためにＬ－アミノ酸およびペプチド結合の両方を有さなければならない。さらに、血清中のプロテアーゼ活性の最も突出した構成成分を占めるエキソペプチダーゼは、通常、ペプチドの最初のペプチド結合に対して作用し、遊離Ｎ末端を必要とする（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １０：１２６８－１２７３ （１９９３））。これを考慮すると、改変されたバージョンのペプチドを使用することが有利である場合が多い。改変されたペプチドは、ＬＳＡＬＴの所望の生物活性を付与するが、有利には、プロテアーゼおよび／またはエキソペプチダーゼによる切断に対して容易には感受性でない、元のＬ－アミノ酸ペプチドの構造的特徴を保持する。
【0132】
コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の、同じ型のＤ－アミノ酸による体系的置換（例えば、Ｌ－リシンの代わりにＤ－リシン）は、より安定なペプチドを生成するために使用され得る。したがって、本明細書で開示されるペプチド誘導体またはペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）は、フォワードまたはリバース順序のいずれかの、全てＬ、全てＤまたは混合Ｄ，Ｌペプチドであり得る。Ｎ末端またはＣ末端Ｄ－アミノ酸の存在は、ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増加させるが、それは、ペプチダーゼがＤ－アミノ酸を基質として利用できないからである（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １０：１２６８－１２７３ （１９９３））。リバース－Ｄペプチドは、Ｌ－アミノ酸を含むペプチドと比較して、リバース配列で配置されたＤ－アミノ酸を含むペプチドである。したがって、Ｌ－アミノ酸ペプチドのＣ末端残基は、Ｄ－アミノ酸ペプチドについてはＮ末端になる、などである。レトロインベルソＤ－アミノ酸ペプチドは、Ｌ－アミノ酸ペプチドと同じ二次コンフォメーションおよびしたがって類似の活性を保持するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの酵素的分解に対してより耐性が高く、したがって、元のペプチドよりも高い治療的有効性を有し得る（Ｂｒａｄｙ ａｎｄ Ｄｏｄｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８：６９２－６９３ （１９９４）； Ｊａｍｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６８：７４４－７４６ （１９９４））。同様に、リバース－Ｌペプチドは、親ペプチドのＣ末端がリバース－ＬペプチドのＮ末端の代わりになる、標準的な方法を使用して生成され得る。顕著な二次構造を有さないＬ－アミノ酸ペプチドのリバースＬ－ペプチド（例えば、短いペプチド）は、Ｌ－アミノ酸ペプチドの側鎖と同じスペーシングおよびコンフォメーションを保持し、したがって、元のＬ－アミノ酸ペプチドと類似の活性を有する場合が多いことが企図される。さらに、リバースペプチドは、Ｌ－アミノ酸およびＤ－アミノ酸の組合せを含み得る。アミノ酸間のスペーシングおよび側鎖のコンフォメーションは保持され得、元のＬ－アミノ酸ペプチドと類似の活性を生じる。
【0133】
一実施形態では、ペプチドは、改変されたペプチドがもはやペプチダーゼの基質でなくなるように、ペプチド末端に化学基を付加することによって、ペプチドのＮ末端またはＣ末端残基に対して作用するペプチダーゼに対する耐性を付与するように、化学的に改変される。一実施形態では、１つのかかる化学的改変は、いずれかの末端または両方の末端でのペプチドのグリコシル化である。他の実施形態では、血清安定性を増強する化学的改変には、１～２０炭素の低級アルキルからなるＮ末端アルキル基、例えば、アセチル基の付加、および／またはＣ末端アミドもしくは置換アミド基の付加が含まれるがこれらに限定されない。特に、本明細書で開示される組成物は、Ｎ末端アセチル基および／またはＣ末端アミド基を保有するペプチドからなる改変されたペプチドを含む。
【0134】
一実施形態では、ペプチド中の、ある特定の天然に存在するアミノ酸の非天然アミノ酸への置換は、タンパク質分解に対する耐性を付与する。かかる置換は、例えば、生物活性に影響を与えることなしに、Ｎ末端に対して作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する耐性を付与し得る。天然に存在しないアミノ酸の例には、α，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、Ｃ－α－メチルアミノ酸、β－アミノ酸およびβ－メチルアミノ酸が含まれる。本発明において有用なアミノ酸アナログには、β－アラニン、ノルバリン、ノルロイシン、４－アミノ酪酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２－アミノイソ酪酸、６－アミノヘキサン酸、ｔ－ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジンおよび他の非慣習的なアミノ酸が含まれ得るがこれらに限定されない。さらに、天然に存在しないアミノ酸を有するペプチドの合成は、当該分野で公知である。
【0135】
ペプチドアナログは、鋳型ペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬物として、医薬品産業において一般に使用される。非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」またはペプチド模倣薬と呼ばれる（Ｆａｕｃｈｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ５４：２８３－２８７ （１９８６）；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３０：１２２９－１２３９ （１９８７））。ペプチド模倣物は、治療的に有用なペプチドと構造的に関連しており、等価物を産生するためまたは増強された治療効果もしくは予防効果を生じるために使用され得る。一般に、ペプチド模倣薬は、パラダイムポリペプチド（即ち、生物活性または薬理学的活性を有するポリペプチド）、例えば、天然に存在する受容体結合ポリペプチドと構造的に類似しているが、当該分野で周知の方法によって、連結、例えば、－ＣＨ２ＮＨ－、－ＣＨ２Ｓ－、－ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－（シスおよびトランス）、－ＣＨ２ＳＯ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－、－ＣＯＣＨ２－などによって必要に応じて置き換えられた１つまたは複数のペプチド連結を有する（Ｓｐａｔｏｌａ， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｅｇａ Ｄａｔａ， １（３）：２６７ （１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ３８：１２４３－１２４９ （１９８６）；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ． １４：１７７－１８５
（１９７９）；およびＷｅｉｎｓｔｅｉｎ． Ｂ．， １９８３， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｄｓ， Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ，）。かかるペプチド模倣物は、より経済的な産生、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、効力、効率など）、低減された抗原性などを含む、天然に存在するポリペプチドを超える顕著な利点を有し得る。
Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３０：１２２９－１２３９ （１９８７））。ペプチド模倣物は、治療的に有用なペプチドと構造的に関連しており、等価物を産生するためまたは増強された治療効果もしくは予防効果を生じるために使用され得る。一般に、ペプチド模倣薬は、パラダイムポリペプチド（即ち、生物活性または薬理学的活性を有するポリペプチド）、例えば、天然に存在する受容体結合ポリペプチドと構造的に類似しているが、当該分野で周知の方法によって、連結、例えば、－ＣＨ２ＮＨ－、－ＣＨ２Ｓ－、－ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－（シスおよびトランス）、－ＣＨ２ＳＯ－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－、－ＣＯＣＨ２－などによって必要に応じて置き換えられた１つまたは複数のペプチド連結を有する（Ｓｐａｔｏｌａ， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｅｇａ Ｄａｔａ， １（３）：２６７ （１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ３８：１２４３－１２４９ （１９８６）；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ． １４：１７７－１８５
（１９７９）；およびＷｅｉｎｓｔｅｉｎ． Ｂ．， １９８３， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｄｓ， Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ，）。かかるペプチド模倣物は、より経済的な産生、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、効力、効率など）、低減された抗原性などを含む、天然に存在するポリペプチドを超える顕著な利点を有し得る。
【0136】
薬学的に許容される塩は、毒性副作用を伴わずに、親ペプチドの所望の生物活性を保持する。
【0137】
一実施形態では、プロテオミクスおよび他の構造生物学の方法は、ＬＳＡＬＴペプチド上の重要なアミノ酸残基を決定し、またはＤＰＥＰ１は、ＤＰＥＰ１と類似の阻害特性および結合特性を示す新規ペプチド配列、ペプチド模倣薬もしくは小分子を設計するために使用され得る。
【0138】
一実施形態では、ＬＳＡＬＴペプチドに結合する重要なＤＰＥＰ１エピトープを決定することは、ＤＰＥＰ１、白血球接着およびがん転移を標的化する治療的抗体を開発するためにも使用され得る。かかる方法の例には、ＬＳＡＬＴに結合したＤＰＥＰ１の結晶化およびＸ線回折による解析が含まれるがこれらに限定されない。別の実施形態では、ＤＰＥＰ１に結合したＬＳＡＬＴの光化学的架橋とその後のプロテアーゼ消化および質量分析（Ｎｇａｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９４）が、相互作用に関与する重要なＬＳＡＬＴアミノ酸およびＤＰＥＰ１ドメインを識別するために使用される。別の実施形態では、組換えＤＰＥＰ－１タンパク質が、宿主を免疫化し、ＤＰＥＰ１特異的抗体のライブラリーを生成するために、哺乳動物に注射される。種々の実施形態では、ｉｎ
ｓｉｌｉｃｏモデリングが、新規医薬組成物を開発するために実施される。
ＩＶ．医薬製剤および医薬
ｓｉｌｉｃｏモデリングが、新規医薬組成物を開発するために実施される。
ＩＶ．医薬製剤および医薬
【0139】
別の態様では、本明細書に記載される化合物または薬剤、ならびにそのバリアントおよび改変は、治療的使用のための医薬組成物として提供される。一実施形態では、医薬製剤は、表１に列挙される配列を含む単離されたペプチドを含む。別の実施形態では、医薬製剤は、ファージウイルス中に挿入物として含まれる単離されたペプチドを含み、ならびに／またはペプチド配列のＮ末端および／もしくはＣ末端に、１、２、３、４、５個の追加のアミノ酸残基をさらに含み得る。
【0140】
代表的な送達レジメンには、経口、非経口（皮下、筋肉内および静脈内注射を含む）、直腸、頬側（舌下を含む）、経皮、吸入、眼および鼻腔内が含まれる。一実施形態では、化合物の送達は、注射可能な制御放出製剤の皮下注射を必然的に伴う。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物は、皮下、鼻腔内および吸入投与のために有用である。
【0141】
正確な用量および組成物ならびに最も適切な送達レジメンの選択は、とりわけ、選択されたペプチドの薬理学的特性、処置されている状態の性質および重症度、ならびにレシピエントの肉体的状態および精神的鋭敏さによって影響されるであろう。さらに、投与経路は、差次的な量の吸収された材料を生じるであろう。異なる経路を介した化合物の投与についてのバイオアベイラビリティは、特に変わりやすく、１％未満から１００％近傍までの量が見られる。典型的には、静脈内、腹腔内または皮下注射以外の経路からのバイオアベイラビリティは、５０％またはそれ未満である。
【0142】
本発明の医薬組成物または製剤は、医薬組成物を調製するために、生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて製剤化され得る。担体および組成物は、無菌であり得る。製剤は、投与様式、例えば、静脈内または皮下投与に適するべきである。組成物を製剤化する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， （Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄｉｔｏｒ）（１９８９）を参照のこと）。
【0143】
適切な薬学的に許容される担体には、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えば、ラクトース、アミロースもしくはデンプン、糖、例えば、マンニトール、スクロースなど、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、ならびにそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。医薬調製物は、所望により、活性化合物と有害に反応しないまたはそれらの活性を妨害しない補助剤（例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色物質および／または芳香物質など）と混合され得る。好ましい実施形態では、静脈内投与に適切な水溶性担体が使用される。
【0144】
組成物または医薬は、所望により、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤も含み得る。組成物は、液体溶液、懸濁物、エマルション、持続放出製剤または粉末であり得る。組成物はまた、坐剤として、従来のバインダーおよび担体、例えば、トリグリセリドを用いて製剤化され得る。
【0145】
組成物または医薬は、ヒトへの投与に適応させた医薬組成物として、慣用的な手順に従って製剤化され得る。例えば、好ましい実施形態では、静脈内投与のための組成物は、典型的には、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要に応じて、組成物は、注射の部位における疼痛を和らげるために、可溶化剤および局所麻酔薬もまた含み得る。一般に、成分は、活性薬剤の量を示す密閉シールされているコンテナ、例えば、アンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）中に、単位投薬形態で、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末または水なし濃縮物として、別々にまたは一緒に混合されて供給される。組成物が注入によって投与される場合、組成物は、無菌の医薬品グレードの水、食塩水またはデキストロース／水を含む注入ボトルを用いて分配され得る。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るような、注射用無菌水または食塩水のアンプルが提供され得る。
【0146】
一部の実施形態では、医薬組成物は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス溶液、他の水性の生理学的平衡溶液、油、エステルおよびグリコールなどであるがこれらに限定されない液体担体を含む。
【0147】
本明細書に記載される化合物は、中性または塩形態として製剤化され得る。上述のように、薬学的に許容される塩には、遊離アミノ基と形成される塩、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩、および遊離カルボキシル基と形成される塩、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩が含まれる。
【0148】
本発明の医薬製剤は、周知の方法および医薬組成物に従って、賦形剤と混合され得る、賦形剤によって希釈され得るまたは担体内に封入され得るペプチドを含み、カプセル、サシェ、ペーパーまたは他のコンテナの形態であり得る。組成物は、非経口、静脈内、皮下または筋肉内投与を含む、ペプチド投与に適切な任意の経路によって投与され得る。典型的には、ペプチドは、０．５～２ｍｌまたはそれ未満の必要な用量を提供するのに十分な濃度で、無菌の注射可能な溶液中に溶解または懸濁される。非経口投与に適切な本発明の医薬組成物は、１つもしくは複数の薬学的に許容される無菌の等張の水性もしくは非水性の溶液、分散物、懸濁物もしくはエマルション、または使用の直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散物へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて、本発明の１つまたは複数の化合物を含み、抗酸化剤、緩衝剤、製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質または懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。
【0149】
注射可能なデポー形態は、生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド－ポリグリコリド中に、薬物のマイクロカプセル化されたマトリックスを形成することによって作製される。薬物のポリマーに対する比、および使用される特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。注射可能なデポー製剤は、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に薬物を捕捉することによっても調製される。注射可能な材料は、例えば、細菌保持フィルターを介した濾過によって、無菌化され得る。
【0150】
医薬組成物は、単位用量または多用量のシールされているコンテナ、例えば、アンプルおよびバイアル中で提示され得、使用の直前に、無菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵され得る。即時注射溶液および懸濁物は、上記した型の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
Ｖ．処置の方法
Ｖ．処置の方法
【0151】
処置の方法は、特に、炎症が組織または臓器に対する虚血／再灌流傷害によって引き起こされる疾患および状態を含む、炎症と関連する疾患および状態について企図される。臓器における虚血とその後の再灌流は、その臓器の組織中などに、構造的および機能的異常を生じる。好中球浸潤、出血、浮腫および壊死は全て、虚血／再灌流傷害後の組織において観察される。ＤＰＥＰ－１標的は、炎症によって媒介される疾患および状態を処置または予防するために使用される、本明細書に記載されるものなどのジペプチダーゼ阻害剤への機会を開く、以前には記載されていなかった炎症の経路を提示する。
【0152】
炎症と直接的に関連する一般的な疾患および医学的問題の非限定的なリストは、関節炎、腎不全、ループス、喘息、乾癬、膵炎、アレルギー、線維症、外科的合併症、貧血および線維筋痛症を含む。慢性炎症と関連する他の疾患には、慢性炎症によって引き起こされるがん；慢性炎症が冠状動脈アテローム性硬化症に寄与する心臓発作；慢性炎症が脳細胞を破壊するアルツハイマー病；慢性炎症が心臓の筋消耗を引き起こすうっ血性心不全；慢性炎症が血栓塞栓性事象を促進する脳卒中；および慢性炎症が心臓弁を損傷する大動脈弁狭窄症が含まれる。動脈硬化症、骨粗鬆症、パーキンソン病、感染（敗血症）、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、ならびに多発性硬化症。
【0153】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、敗血症誘導性の傷害、急性臓器傷害（例えば、低血圧の状況下での急性腎臓傷害）などであるがこれらに限定されない状態と関連する損傷から組織および臓器を保護するために有用である。
【0154】
他の実施形態では、本明細書に記載される方法は、敗血症誘導性の状態、例えば、急性呼吸促迫症候群、脳症、敗血症誘導性の肝不全、敗血症誘導性の腎不全または敗血症誘導性の心不全と関連する損傷から組織および臓器を保護するために有用である。
【0155】
他の実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、周術期手順、心不全、肝不全、脳卒中、心筋梗塞、ショック肝、脊髄傷害、脳傷害などであるがこれらに限定されない虚血－再灌流傷害と関連する損傷から組織および臓器を保護するために有用である。これらの組成物は、高リスク患者において虚血－再灌流傷害を予防または処置するためにも使用され得る。
【0156】
他の実施形態では、方法は、血管形成術もしくは血栓溶解治療の前、または手術、血管形成術もしくは血栓溶解治療後の虚血性臓器の移植もしくは再灌流の後にも有用である。
【0157】
外科的手順およびこれらの手順の間の虚血再灌流傷害のリスクがある臓器の他の例には、頸動脈手術、脳血管手術ならびに心臓および大動脈の手術の間の脳傷害；脳、脊髄、腸および腎臓の傷害；血栓塞栓除去または肺および心臓の手術の間の心肺バイパスの使用後の肺傷害；血行再建（冠状動脈バイパスグラフト手術）後の心臓傷害；腸間膜動脈に対する手術後の腸傷害；ならびに皮膚グラフトの摘出後の皮膚傷害が含まれるがこれらに限定されない。
【0158】
この方法が有用な追加の外科的手順には、移植のためのドナー臓器を摘出することが含まれる。他の実施形態では、方法は、ドナー調達、ｅｘ ｖｉｖｏ取り扱いおよび移植レシピエント中へのインプランテーションの間の、同種移植片臓器の保護のためにも有用である。本発明の組成物は、虚血が予期される外科的手順の前またはその間に移植されるドナー臓器を摘出する前、その間またはその後に、投与され得る。
【0159】
したがって、本発明は、対象において虚血再灌流傷害を予防、制限または処置するための方法であって、虚血性事象を受けたまたは虚血性事象が切迫しているまたは虚血性事象を有するリスクがある対象を識別するステップ、および治療有効量または予防有効量の本明細書に記載される組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【0160】
一実施形態では、ドナーから臓器を抽出するための方法であって、本明細書で開示されるＤＰＥＰ－１に結合する組成物を、臓器の抽出前にドナーに投与するステップを含む方法が開示される。必要に応じて、移植臓器のレシピエントのための方法であって、ＤＰＥＰ１に結合する組成物を、臓器インプランテーションの前に投与するステップを含む方法が開示される。方法は、１つまたは複数のマーカーが抽出前に、指定されたレベルを下回っているかどうかを決定するため、即ち、臓器が所定のマーカープロファイルを満たすかどうかを決定するために、１つまたは複数の炎症マーカーのレベルをモニタリングするステップをさらに含み得る。
【0161】
特定の実施形態では、臓器は、心臓、肝臓、腎臓、脳、腸（大腸または小腸）、膵臓、肺、胃、膀胱、脾臓、卵巣、精巣、骨格筋およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【0162】
特定の実施形態では、ドナーは、マージナルドナーである。一実施形態では、マージナルドナーは、複合生体ドナー、心停止ドナー（ＮＨＢＤ）または心機能低下ドナーからなる群から選択される。
【0163】
特定の実施形態では、複合生体ドナーは、例えば、約６０歳を上回る、約６５歳を上回るまたは約７０歳を上回る高齢のドナーである。
【0164】
別の特定の実施形態では、複合生体ドナーは、肥満、高血圧、糖尿病、腎結石症（腎臓結石）、伝染性の感染性疾患（例えば、ウイルス感染）、またはそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数のリスク因子を有する。
【0165】
一実施形態では、方法は、臓器を貯蔵するステップをさらに含む。必要に応じて、１つまたは複数の炎症マーカーのレベルが、臓器の貯蔵の間に１または複数回測定され得る。
【0166】
別の実施形態では、方法は、（ｉｖ）例えば、移植によって、レシピエントに臓器を提供するステップをさらに含む。必要に応じて、１つまたは複数の炎症マーカーのレベルが、臓器が提供された後、例えば、再灌流直後の期間の間に測定され得る。
【0167】
特定の実施形態では、１つまたは複数の炎症マーカーは、ＩＬ－１２、ＩＰ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγまたはＩＬ－１αからなる群から選択される。
【0168】
必要に応じて、１つまたは複数の追加の薬剤（例えば、抗酸化剤）が、臓器の抽出前にドナーに投与され得る。１つまたは複数の追加の薬剤（例えば、抗酸化剤）は、臓器のインプランテーション前にレシピエントに投与され得る。１つまたは複数の追加の薬剤は、ＤＰＥＰ－１に結合する組成物の投与の前に、それと同時期に、またはその後に、投与され得る。薬剤は、例えば、小分子、生物剤または治療的ガスであり得る。
【0169】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、改善されたグラフト機能、低減されたグラフト機能不全、改善されたグラフト生存（長期生存を含む）、低減されたグラフト劣化、臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）の発生率の低減などが含まれるがこれらに限定されない、１つまたは複数の有益な効果を生じ得る。
【0170】
一実施形態では、方法は、ＤＰＥＰ－１に結合する組成物が抽出またはインプランテーションの前に投与されていないグラフトの生存と比較して、グラフト生存における増加を生じる。グラフト生存は、例えば、移植の６ヶ月後、１年後または３年後に測定され得る。特定の実施形態では、グラフト生存は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％もしくは約２５％またはそれよりも大きく増加される。
【0171】
一実施形態では、臓器を保存する方法であって、貯蔵された臓器（即ち、移植を待っている抽出された臓器）を、本明細書で開示されるＤＰＥＰ－１に結合する組成物に曝露させるステップを含む方法が開示される。必要に応じて、方法は、それらが指定されたレベルを下回るかどうかを決定するために、炎症マーカーのレベルを１または複数回モニタリングするステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、臓器は、臓器移植溶液中に貯蔵される。ある特定の実施形態では、臓器は、約０℃と４℃との間の温度で貯蔵される。別の実施形態では、臓器は、約３７℃の温度で、即ち、非熱条件下で貯蔵される。ある特定の実施形態では、貯蔵された臓器は、臓器灌流システムに接続されるまたはそれと関連される。
【0172】
特定の実施形態では、本明細書で開示される臓器を保存する方法は、機能障害なしに、例えば、臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）における増加なしに、特定の臓器のための最大冷虚血時間における増加を可能にする。ある特定の実施形態では、増加は、約５％と約５０％との間、より詳細には、約５％と約２５％との間、あるいは約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％もしくは約３０％またはそれよりも大きい。
【0173】
別の実施形態では、臓器移植患者において虚血－再灌流関連傷害を予防する方法であって、臓器を患者に提供する前に、それと同時に、またはその後に、本明細書で開示されるＤＰＥＰ－１に結合する組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
【0174】
別の実施形態では、本明細書で開示されるＤＰＥＰ－１に結合する組成物を含む臓器摘出キットが開示される。必要に応じて、臓器摘出キットは、１つまたは複数の追加の薬剤を含み得る。
【0175】
いずれの特定の機構にも束縛されないが、本明細書で提供される組成物の保護効果は、ＤＰＥＰ－１標的における結合、ならびにＤＰＥＰ－１調節される白血球動員、炎症および腫瘍細胞接着における直接的低減を介して媒介される。炎症媒介性疾患および腫瘍転移に対する、本明細書に記載されるこれらの効果は、ＤＰＥＰ－１ジペプチダーゼ活性、または尿細管輸送を調節する際のその役割とは無関係に生じる。以前の研究は、細菌感染を処置するために、抗生物質化合物の半減期を延長させるためのＤＰＥＰ－１アンタゴニストの組合せを必要としていた。他の研究は、化学療法剤または他の腎毒性薬剤の腎尿細管取り込みを予防することによって臓器損傷を予防または処置するために、ＤＰＥＰ－１アンタゴニストシラスタチンを使用している（Ｈｕｍａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ， ８２：６５２－５５３ （２０１２）；Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ １３１（２）：９７４－９７９ （１９８５））。ＤＰＥＰ－１アンタゴニストを使用することによる、ＤＰＥＰ－１調節される炎症、炎症媒介性疾患または腫瘍転移の直接的処置は、以前には識別されていなかった。
【0176】
このように、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、毒性化合物、例えば、腎毒性化合物または化学療法剤によって直接的に誘導される組織損傷を処置または低減させるためには使用されない。他の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、ベータ－ラクタム抗生物質化合物と組み合わせては投与されない。他の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、カルバペネム抗生物質化合物と組み合わせては投与されない。
【0177】
本発明は、炎症を低減またはモジュレートするための方法であって、有効量の、ＤＰＥＰ－１に結合する組成物を投与して、炎症を低減またはモジュレートするステップを含む方法を提供する。
【0178】
一実施形態では、炎症は、ＩＬ－１２、ＩＰ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγまたはＩＬ－１αから選択される炎症マーカーのプロファイルによって特徴付けられる。
【0179】
一実施形態では、組成物は、ペプチド、ペプチド模倣性遮断抗体または小分子化合物を含む。
【0180】
一実施形態では、炎症は、胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍、慢性気管支炎、喘息、アレルギー、急性肺傷害、肺炎症、気道反応性亢進、血管炎、敗血症性ショック、炎症性皮膚障害、乾癬、アトピー性皮膚炎および湿疹からなる群から選択される炎症性障害と関連する。
【0181】
本発明は、対象の白血球動員を遮断するための方法であって、有効量の、ＤＰＥＰ－１に結合する組成物を投与して、白血球動員を遮断するステップを含む方法を提供する。
【0182】
一実施形態では、方法は、炎症における低減を必要とすることについての診断試験によって、処置を必要とする対象を識別するステップをさらに含む。処置の適応症には、（手術前に、または静脈内造影剤を投与する前に）急性腎臓傷害のリスクがある任意の患者における、または尿排出量の減少もしくは血清クレアチニンの増加を有する任意の患者における、例えば、全身感染もしくは低血圧を有する患者における、臨床的徴候および症状が含まれるがこれらに限定されない。
【0183】
本発明は、対象において腫瘍転移を低減または予防するための方法であって、有効量の、ＤＰＥＰ－１に結合する組成物を投与し、それによって、腫瘍転移を低減または予防するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、ＤＰＥＰ－１は、その酵素活性とは無関係に、白血球または腫瘍細胞に対する接着分子として作用し得、本明細書に記載される選択的ＤＰＥＰ－１結合剤によるＤＰＥＰ－１の結合は、腫瘍転移を低減または予防し得る。別の実施形態では、ＤＰＥＰ－１は、腫瘍転移を促進する炎症に寄与し、選択的ＤＰＥＰ－１結合剤によるＤＰＥＰ－１の結合は、腫瘍転移を低減または予防する。
【0184】
ある特定の実施形態では、腫瘍は、転移の潜在性があるまたは現在転移が可能であるがんを引き起こすことが公知の腫瘍から選択される。例えば、がんは、膵がん、腎臓がん、例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）、泌尿生殖器がん、例えば、膀胱、腎臓、骨盤および尿管における尿路上皮癌、黒色腫、前立腺癌、肺癌（非小細胞癌、小細胞癌、神経内分泌癌およびカルチノイド腫瘍）、乳房癌（乳管癌、小葉癌ならびに混合乳管および小葉癌）、甲状腺癌（甲状腺乳頭癌、濾胞性癌および髄様癌）、脳がん（髄膜腫、星細胞腫、神経膠芽腫、小脳腫瘍、髄芽腫）、卵巣癌（漿液性、粘液性および類内膜型）、子宮頸がん（扁平上皮癌ｉｎ ｓｉｔｕ、浸潤性扁平上皮癌および子宮頸管内腺癌）、子宮内膜癌（類内膜、漿液性および粘液性型）、原発性腹膜癌、中皮腫（胸膜および腹膜）、眼がん（網膜芽細胞腫）、筋肉（横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｓａｒｃｏｍａ）および平滑筋肉腫）、リンパ腫、食道がん（腺癌および扁平上皮癌）、胃がん（胃腺癌および消化管間質腫瘍）、肝臓がん（肝細胞癌および胆管がん）、小腸腫瘍（小腸間質腫瘍およびカルチノイド腫瘍）、結腸がん（結腸の腺癌、結腸高悪性度異形成および結腸カルチノイド腫瘍）、精巣がん、皮膚がん（黒色腫および扁平上皮癌）および副腎癌であり得る。
【0185】
一実施形態では、方法は、患者の腫瘍上のＤＰＥＰ－１結合分子の存在を決定することによって、腫瘍転移の低減または予防の必要を決定する診断試験を介して、処置を必要とする対象を識別するステップをさらに含む。
【0186】
本発明は、対象において敗血症の間の白血球動員および炎症を低減または予防するための方法であって、有効量の、ＤＰＥＰ－１に結合する組成物を投与し、それによって、敗血症の臓器合併症を低減または予防するステップを含む方法を提供する。
【0187】
一実施形態では、方法は、虚血－再灌流傷害の低減または予防の必要を決定する診断試験を介して、処置を必要とする対象を識別するステップをさらに含む。処置の適応症には、虚血－再灌流傷害の臨床的徴候および症状、または高リスクの虚血－再灌流傷害を伴う外科的手順を受けていることが含まれるがこれらに限定されない。
【0188】
本発明は、患者において虚血－再灌流傷害の症状を処置する方法であって、薬学的有効量の、ＤＰＥＰ－１に結合しそれを阻害する組成物を患者に投与するステップを含む方法を含む。
【0189】
一実施形態では、組成物は、虚血－再灌流傷害の症状が低減または寛解されるまで投与される。
【0190】
一実施形態では、単離されたペプチドまたはそのバリアントは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの間の投薬量で投与される。
【0191】
本発明は、対象において虚血－再灌流傷害関連障害を低減または予防するための方法であって、有効量の、ＤＰＥＰ－１に結合する組成物を投与し、それによって、虚血－再灌流傷害を低減または予防するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、方法は、虚血－再灌流傷害と関連する白血球動員および炎症を低減または予防する。
【0192】
一実施形態では、虚血－再灌流傷害関連障害は、臓器および組織における虚血性および虚血後事象と関連し、障害は、血栓性脳卒中；心筋梗塞；狭心症；塞栓性血管閉塞；末梢血行障害；内臓動脈閉塞；血栓または塞栓症による動脈閉塞、低い腸間膜流または敗血症後などの非閉塞性プロセスによる動脈閉塞；腸間膜動脈閉塞；腸間膜静脈閉塞；腸間膜微小循環に対する虚血－再灌流傷害；虚血性急性腎不全；大脳組織に対する虚血－再灌流傷害；腸重積症；血行動態ショック；組織機能不全；臓器不全（心不全、肝不全、腎不全などを含む）；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；血栓症；血小板凝集；ショック肝；脊髄傷害；周術期手順、心臓手術などの手順からなるリストから選択される脳傷害またはその後の状態；臓器手術；臓器移植；血管造影術；心肺および大脳蘇生からなる群から選択される。
【0193】
一実施形態では、虚血－再灌流傷害は、移植のためのドナー臓器を摘出することと関連する。
【0194】
一実施形態では、虚血－再灌流傷害は、ドナー調達、ｅｘ ｖｉｖｏ取り扱いまたは移植レシピエント中へのインプランテーションの間に、同種移植片臓器に対して生じる。
【0195】
種々の実施形態では、組成物は、（ｉ）移植されるドナー臓器の摘出の前、その間もしくはその後、または（ｉｉ）虚血が予期される外科的手順の前もしくはその間に、投与され得る。
【0196】
本発明は、対象において急性腎臓傷害を低減または予防するための方法であって、有効量の、ＤＰＥＰ－１に結合する組成物を投与し、それによって、急性腎臓傷害を低減または予防するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、方法は、急性腎臓傷害と関連する白血球動員および炎症を低減または予防する。
【0197】
一実施形態では、方法は、急性腎臓傷害の低減または予防の必要を決定する診断試験を介して、処置を必要とする対象を識別するステップを含む。
【0198】
一実施形態では、急性腎臓傷害は、敗血症の結果である。
【0199】
一実施形態では、急性腎臓傷害は、虚血再灌流の結果である。
【0200】
一実施形態では、急性腎臓傷害は、毒素誘導性の腎臓傷害である。
【0201】
一実施形態では、急性腎臓傷害は、造影剤誘導性の腎臓傷害である。
【0202】
ある特定の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の追加の治療剤と組み合わせて投与され得る。共投与には、別々の組成物での同時投与（同時発生的投与とも呼ばれる）、別々の組成物での異なる時間における投与、または両方の薬剤が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与および両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
【0203】
一実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、化学療法剤または抗増殖剤、抗ウイルス薬、抗生物質、抗ヒスタミン薬、皮膚軟化薬、全身光線療法、ソラレン光化学療法、レーザー治療、ホルモン補充治療、抗炎症剤、免疫調節剤または免疫抑制剤、神経栄養因子、心血管疾患を処置するための薬剤、糖尿病を処置するための薬剤、免疫不全障害を処置するための薬剤、および免疫チェックポイント阻害剤からなる群から選択される。
ＶＩ．投与経路
ＶＩ．投与経路
【0204】
本明細書に記載されるＤＰＥＰ－１に結合する組成物は、任意の適切な経路によって投与され得る。一部の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、非経口投与される。一部の実施形態では、非経口投与は、静脈内、皮内、吸入、経皮（外用）、眼内、筋肉内、皮下、筋肉内および／または経粘膜投与から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＤＰＥＰ－１結合ペプチドは、皮下投与される。本明細書で使用される場合、用語「皮下組織」は、皮膚のすぐ下の緩い不規則な結合組織の層として定義される。例えば、皮下投与は、大腿領域、腹部領域、臀部領域または肩甲骨領域が含まれるがこれらに限定されない領域に組成物を注射することによって実施され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＤＰＥＰ－１に結合する組成物は、静脈内投与される。他の実施形態では、本明細書に記載されるＤＰＥＰ－１に結合する組成物は、標的組織、例えば、心臓または筋肉（例えば、筋肉内）、腫瘍（腫瘍内）、神経系（例えば、脳への直接的注射；脳室内；くも膜下腔内）への直接的投与によって投与される。あるいは、本明細書に記載されるＤＰＥＰ－１に結合する組成物（または本明細書に記載されるＤＰＥＰ－１結合ペプチドを含む組成物もしくは医薬）は、吸入、非経口、皮内、経皮または経粘膜（例えば、経口もしくは経鼻）で投与され得る。１つよりも多くの経路が、所望に応じて、同時発生的に使用され得る。
【0205】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＤＰＥＰ－１に結合する組成物は、経口投与される。一部の実施形態では、本発明は、（ａ）ＤＰＥＰ－１結合ペプチド、（ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容されるｐＨ低下剤、（ｃ）ＤＰＥＰ－１結合ペプチドのバイオアベイラビリティを促進するのに有効な少なくとも１つの吸収増強因子、および（ｄ）保護的ビヒクルを含む、経口投与のための本明細書に記載されるＤＰＥＰ－１結合ペプチドの固体投薬形態を提供する。一部の実施形態では、固体投薬形態は、カプセルまたは錠剤である。
ＶＩＩ．投薬
ＶＩＩ．投薬
【0206】
有効量の、目的のＤＰＥＰ－１に結合する組成物が、処置において使用される。本発明に従って使用されるペプチドの投薬量は、ペプチドおよび処置されている状態に依存して変動する。選択される投薬量に影響を与える因子の中では、例えば、レシピエント患者の年齢、体重および臨床状態；ならびに治療を投与する臨床医または実務者の経験および判断である。他の因子には、投与経路、患者、患者の病歴、疾患プロセスの重症度、および特定のペプチドの効力が含まれる。用量は、患者に対して許容されない毒性を生じることなしに、処置される疾患の症状または徴候を寛解させるのに十分でなければならない。一般に、ペプチドの有効量は、症状の主観的救済または臨床医もしくは他の有資格の観察者によって留意される客観的に識別可能な改善のいずれかを提供する量である。
【0207】
種々の実施形態は、異なる投薬レジメンを含み得る。一部の実施形態では、ＤＰＥＰ－１結合組成物は、持続的注入を介して投与される。一部の実施形態では、持続的注入は、静脈内である。他の実施形態では、持続的注入は、皮下である。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、ＤＰＥＰ－１に結合する組成物は、２ヶ月に１回、月に１回、月に２回、３週間に１回、２週間に１回、週に１回、週に２回、週に３回、１日１回、１日２回、または別の臨床的に望ましい投薬スケジュールで投与される。単一の対象のための投薬レジメンは、固定された間隔である必要はないが、対象の必要に依存して経時的に変動され得る。
【0208】
一実施形態では、局所投薬量が、治療結果が達成されるまで、１日に少なくとも１回投与される。投薬量は、１日２回投与され得るが、より頻繁なまたはより頻度の低い投薬が、臨床医によって推奨され得る。治療結果が達成されると、ペプチドは、徐々に減らされ得るまたは中断され得る。時折、副作用が、治療の中断を正当化する。有効量の目的のペプチドが、処置において使用される。本発明に従って使用されるペプチドの投薬量は、化合物および処置されている状態に依存して変動する。選択される投薬量に影響を与える因子の中では、レシピエント患者の年齢、除脂肪体重、総体重、体表面積および臨床状態；ならびに治療を投与する臨床医または実務者の経験および判断である。他の因子には、投与経路、患者、患者の病歴、疾患プロセスの重症度、および特定の化合物の効力が含まれる。用量は、患者に対して許容されない毒性を生じることなしに、処置される疾患の症状または徴候を寛解させるのに十分でなければならない。
【0209】
医薬品として使用される場合、本発明のペプチドは、医薬組成物の形態で投与され、これらの医薬組成物は、本発明のさらなる実施形態を示す。これらのペプチドは、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内および鼻腔内を含む種々の経路によって、または気管内滴下もしくはエアロゾル吸入を介して、投与され得る。
【0210】
ＤＰＥＰ－１に結合する組成物は、炎症を低減させる際に、または組織、例えば肝臓の炎症プロファイルを改変する際に有用である。投与様式は、化合物の適用によって規定され、最適な用量を見出すための臨床試験の慣用的な方法によって決定され得る。
【0211】
一実施形態では、投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの間の活性ペプチド、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの間または約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの間である。
【0212】
他の実施形態では、投薬量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの間、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの間、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの間または約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの間である。
【0213】
他の実施形態では、投薬量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０．０ｍｇ／ｋｇの間である。
【0214】
他の実施形態では、投薬量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの間、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの間、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約７０ｍｇ／ｋｇの間、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの間、約５．０ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの間、約５．０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの間、約５．０ｍｇ／ｋｇ～約７０ｍｇ／ｋｇの間、約５．０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの間、約１０．０ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの間、約１０．０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの間、約１０．０ｍｇ／ｋｇ～約７０ｍｇ／ｋｇの間または約１０．０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの間である。
【0215】
別の実施形態では、投薬量は、約５０μＭと約５００μＭとの間である。
【0216】
しかし、実際に投与されるＤＰＥＰ－１結合組成物の量は、処置される状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度などを含む、適切な状況の観点から、医師によって決定されることが理解されよう。
【0217】
種々の実施形態では、本明細書に記載される組成物またはその塩は、１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重と約２０ｍｇ／ｋｇ体重との間、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重と約１０ｍｇ／ｋｇ体重との間、１日当たり約０．１μｇ／ｋｇ体重と約１０００μｇ／ｋｇ体重との間または１日当たり約０．１μｇ／ｋｇ体重と約１００μｇ／ｋｇ体重との間の量で投与される。投与経路は変動する。例えば、本明細書に記載されるペプチドまたはその塩は、１日当たり約０．１μｇ／ｋｇ体重と約１０００μｇ／ｋｇ体重の間または１日当たり約０．１μｇ／ｋｇ体重～約１００μｇ／ｋｇ体重の間の量で、皮下注射によって投与される。例として、５０ｋｇのヒト雌性対象について、活性成分の１日用量は、皮下注射によって、約５～約５０００μｇまたは約５～約５０００μｇである。投与経路、ペプチド効力、観察された薬物動態学的プロファイルおよび適用可能なバイオアベイラビリティ、ならびに活性薬剤および処置されている疾患に依存して、異なる用量が必要とされるであろう。投与が吸入によるものである代替の実施形態では、１日用量は、１日２回、１０００～約２０，０００μｇである。他の哺乳動物、例えば、ウマ、イヌおよびウシでは、より高い用量が必要とされ得る。この投薬量は、最も有効な結果を達成するために必要に応じて、単一の投与によって、複数の適用によって、または制御放出を介して、慣習的な医薬組成物で送達され得る。
ＶＩＩＩ．キット
ＶＩＩＩ．キット
【0218】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるＤＰＥＰ－１結合ペプチドまたは医薬組成物、ならびにその再構成（凍結乾燥されている場合）および／または使用のための使用説明書を含むキットまたは他の製造物品を、さらに提供する。キットまたは他の製造物品は、投与（例えば、皮下、吸入による）において有用なコンテナ、シリンジ、バイアルおよび任意の他の物品、デバイスまたは装置を含み得る。適切なコンテナには、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ（例えば、あらかじめ充填されたシリンジ）、アンプル、カートリッジ、リザーバーまたはｌｙｏ－ｊｅｃｔが含まれる。コンテナは、種々の材料、例えば、ガラスまたはプラスチックから形成され得る。一部の実施形態では、コンテナは、あらかじめ充填されたシリンジである。適切なあらかじめ充填されたシリンジには、ベイクドシリコーンコーティングを有するホウケイ酸ガラスシリンジ、シリコーンが噴霧されたホウケイ酸ガラスシリンジ、またはシリコーンなしのプラスチック樹脂シリンジが含まれるがこれらに限定されない。
【0219】
典型的には、コンテナは、製剤、ならびにコンテナ上のまたはコンテナと関連した、再構成および／または使用のための指示を示し得るラベルを保持し得る。例えば、ラベルは、製剤が上記の濃度に再構成されることを示し得る。ラベルは、製剤が、例えば皮下投与のために有用であるまたはそのために意図されることをさらに示し得る。一部の実施形態では、コンテナは、単一の用量の、ＤＰＥＰ－１結合ペプチドを含む安定な製剤を含み得る。種々の実施形態では、安定な製剤の単一の用量は、約１５ｍｌ、約１０ｍｌ、約５．０ｍｌ、約４．０ｍｌ、約３．５ｍｌ、約３．０ｍｌ、約２．５ｍｌ、約２．０ｍｌ、約１．５ｍｌ、約１．０ｍｌまたは約０．５ｍｌ未満の体積中に存在する。あるいは、製剤を保持するコンテナは、製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする、多使用バイアルであり得る。キットまたは他の製造物品は、適切な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ、食塩水、緩衝食塩水）を含む第２のコンテナをさらに含み得る。希釈剤および製剤の混合の際に、再構成された製剤中の最終タンパク質濃度は、一般に、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ）になるであろう。キットまたは他の製造物品は、使用のための使用説明書と共に、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび添付文書を含む、商業的およびユーザーの立場から望ましい他の材料をさらに含み得る。一部の実施形態では、キットまたは他の製造物品は、自己投与のための使用説明書を含み得る。
ＩＸ．スクリーニング方法
ＩＸ．スクリーニング方法
【0220】
ＤＰＥＰ－１に結合する組成物（例えば、ペプチド）についてスクリーニングするための方法が、本明細書で開示される。
【0221】
一実施形態では、方法は、ａ）試験ペプチドのライブラリーを、組織中のＤＰＥＰ－１に結合するそれらの能力についてスクリーニングするステップ；および（ｂ）選択的結合親和性を示すペプチドを識別するステップを含む。ある特定の実施形態では、識別されたペプチドは、１つまたは複数の追加の試験方法に供される。
【0222】
一実施形態では、スクリーニング方法は、（ａ）試験ペプチドのライブラリーを、組織中のＤＰＥＰ－１に結合するそれらの能力についてスクリーニングするステップ；（ｂ）選択的結合親和性を示す候補試験ペプチドを選択するステップ；（ｃ）炎症低減活性について候補ペプチドを試験するステップ、および（ｄ）それが炎症を減少させる場合、候補ペプチドを選択し、それによって、炎症を減少させるのに有効なペプチドを提供するステップを含む、患者の組織において炎症を減少させるのに有効なペプチドを識別するステップを含む。
【0223】
ライブラリー中の、標的ペプチドのうち１つに対する選択的結合親和性、例えば、結合親和性における、ランダム配列ペプチドを超える少なくとも１０～１００倍の増加を示すライブラリー化合物について、化合物は、以下に詳述される方法に従って、組織において炎症を低減させるその能力についてさらに試験される。次いで、組織において炎症を低減させることが示された試験化合物は、さらなる化合物試験および開発のためのリード化合物として識別される。
【0224】
一実施形態では、組織は、肺組織または肝臓組織である。
【0225】
一実施形態では、患者の脈管構造において白血球動員を遮断するのに有効なペプチドを識別するための方法が提供される。
【0226】
一実施形態では、本発明は、患者の組織において炎症を低減させるのに有効なペプチドを識別する方法であって、（ａ）試験ペプチドのライブラリーを、ＤＰＥＰ－１に結合するそれらの能力についてスクリーニングするステップ；（ｂ）選択的結合親和性を示すペプチドを選択するステップ；（ｃ）白血球動員阻害活性についてペプチドを試験するステップ、および（ｄ）それが組織において炎症を減少させる場合に、そのペプチドを選択するステップを含む方法を提供する。
【0227】
一実施形態では、組織は、肺組織または肝臓組織である。
【0228】
一実施形態では、方法は、（ｅ）固形腫瘍を保有する動物において白血球動員を遮断するその能力についてペプチドをさらに試験するステップ；および（ｆ）それがステップ（ｅ）において白血球動員を遮断する場合に、そのペプチドを選択するステップをさらに含む。
【0229】
一実施形態では、方法は、（ｅ）固形腫瘍を保有する動物において腫瘍転移を阻害するその能力についてペプチドをさらに試験するステップ；および（ｆ）それがステップ（ｅ）において腫瘍転移を阻害する場合に、そのペプチドを選択するステップをさらに含む。
【0230】
一実施形態では、方法は、（ｅ）肺または肝臓に転移することが公知の固形腫瘍を保有する動物中の肺および肝臓への腫瘍転移を阻害するその能力についてペプチドをさらに試験するステップ；および（ｆ）それがステップ（ｅ）において腫瘍転移を阻害する場合に、そのペプチドを選択するステップをさらに含む。
【0231】
一実施形態では、方法は、（ｅ）患者において敗血症を処置するその能力についてペプチドをさらに試験するステップ；および（ｆ）それがステップ（ｅ）において敗血症を処置する場合に、そのペプチドを選択するステップをさらに含む。
【0232】
一実施形態では、方法は、（ｅ）患者において細菌敗血症を処置するその能力についてペプチドをさらに試験するステップ；および（ｆ）それがステップ（ｅ）において敗血症を処置する場合に、そのペプチドを選択するステップをさらに含む。
【0233】
一実施形態では、方法は、（ｅ）患者において急性腎臓損傷を処置するその能力についてペプチドをさらに試験するステップ；および（ｆ）それがステップ（ｅ）において急性腎臓損傷を処置する場合に、そのペプチドを選択するステップをさらに含む。
【0234】
一実施形態では、方法中のステップ（ａ）は、試験ペプチドのライブラリーを、ＤＰＥＰ－１に結合するそれらの能力についてスクリーニングするステップを含む。
【0235】
一実施形態では、方法は、タンパク質マイクロアレイにおいてＬＳＡＬＴペプチドを使用することによって、補因子、共受容体、循環因子およびアクセサリータンパク質を含む、炎症に関与する他の二次標的を識別するステップをさらに含む。
【0236】
本明細書で言及される全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、参照により具体的かつ個々に組み込まれると示されるのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例0237】
（実施例１）
腎臓における腎ジペプチダーゼ（ＤＰＥＰ－１）の特徴付け
腎尿細管上皮細胞（ＴＥＣ）を、ヒト腎臓腎摘出術から単離および培養した。次いで、細胞を、ＤＰＥＰ－１およびＺＯ－１（ＴＥＣ表面マーカー）抗体で標識し、共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。イメージを、６０×の倍率で撮影した。代表的な顕微鏡写真は、図１Ａに示される。マウス腎臓組織を、ＤＰＥＰ－１抗体で染色し、免疫ペルオキシダーゼを使用して可視化した。矢印は、暗褐色の染色によって示される、ＤＰＥＰ－１について陽性の尿細管を示す。代表的な顕微鏡写真は、図１Ｂに示される。総タンパク質溶解物を、トランスフェクトされていないＣＯＳ－７細胞、ＤＰＥＰ－１を過剰発現するＣＯＳ－７細胞、ヒト腎臓組織およびマウス腎臓組織から調製した。次いで、溶解物を、ＤＰＥＰ－１のジペプチド基質であるグリシン－デヒドロ－フェニルアラニン（Ｇｌｙ－Ｄ－Ｐｈｅ）の分解の蛍光定量的検出を介して、ＤＰＥＰ－１酵素活性について試験した。これらの結果は、図１Ｃにグラフで示される。
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｖｏの内因性ＤＰＥＰ－１活性
腎臓における腎ジペプチダーゼ（ＤＰＥＰ－１）の特徴付け
腎尿細管上皮細胞（ＴＥＣ）を、ヒト腎臓腎摘出術から単離および培養した。次いで、細胞を、ＤＰＥＰ－１およびＺＯ－１（ＴＥＣ表面マーカー）抗体で標識し、共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。イメージを、６０×の倍率で撮影した。代表的な顕微鏡写真は、図１Ａに示される。マウス腎臓組織を、ＤＰＥＰ－１抗体で染色し、免疫ペルオキシダーゼを使用して可視化した。矢印は、暗褐色の染色によって示される、ＤＰＥＰ－１について陽性の尿細管を示す。代表的な顕微鏡写真は、図１Ｂに示される。総タンパク質溶解物を、トランスフェクトされていないＣＯＳ－７細胞、ＤＰＥＰ－１を過剰発現するＣＯＳ－７細胞、ヒト腎臓組織およびマウス腎臓組織から調製した。次いで、溶解物を、ＤＰＥＰ－１のジペプチド基質であるグリシン－デヒドロ－フェニルアラニン（Ｇｌｙ－Ｄ－Ｐｈｅ）の分解の蛍光定量的検出を介して、ＤＰＥＰ－１酵素活性について試験した。これらの結果は、図１Ｃにグラフで示される。
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｖｏの内因性ＤＰＥＰ－１活性
【0238】
臓器（肺、肝臓、脾臓および腎臓）を、８～１０週齢のＣ５７／ＢＬ６動物（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から摘出した。タンパク質を、組織ホモジナイザーを使用して、プロテアーゼ阻害剤カクテルの非存在下でＲＩＰＡ／オクチル－グルコシドを使用して、組織から単離した。各条件／臓器からの１０μｌのタンパク質溶解物を使用して、ＤＰＥＰ－１酵素活性アッセイを実施した。これらの結果は、図２にグラフで示される。
（実施例３）
ＤＰＥＰ－１の肺発現
（実施例３）
ＤＰＥＰ－１の肺発現
【0239】
臓器（肺および腎臓）を、８～１０週齢のＣ５７／ＢＬ６動物（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から摘出し、組織を、組織学のためにパラフィン包埋した。腎臓および肺切片を、ＤＰＥＰ－１発現を評価するためにＤＡＢ法を使用してＤＰＥＰ－１特異的抗体（暗色（Ａｂｃａｍ））で染色した。代表的な顕微鏡写真は、図３に示される。
（実施例４）
ＤＰＥＰ－１の触媒活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合に必要とされない
（実施例４）
ＤＰＥＰ－１の触媒活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合に必要とされない
【0240】
Ｃｏｓ－１細胞を、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を使用して、ヒトＤＰＥＰ－１遺伝子に対応する３μｇの野生型膜ジペプチダーゼ（ＤＰＥＰ－１）の触媒的に不活性な変異体（Ｅ＞Ｄ）または変異体対照（Ｈ＞Ｋ）のいずれかで、一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＤＰＥＰ－１発現細胞を、２４ウェルのコラーゲンコーティングされた（中和された）プレート上に再播種し、３７℃で２４時間成長させた。播種の２４時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞を、氷上で３０分間、ＰＢＳ中のＦＢＳ／ＮＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で遮断した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷上で３０分間、Ａｌｅｘａ－４８８（緑色）コンジュゲートされたＬＳＡＬＴ、ＧＦＥ－１、対照ペプチドまたはＤＰＥＰ－１抗体（１／１００）（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷上で４分間、ＤＡＰＩで染色した。細胞をＰＢＳで再度洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、免疫蛍光顕微鏡を実施して、結合を評価した。各実験条件の代表的な顕微鏡写真は、図４Ａに示される（ｎ＝３）。ヒトＤＰＥＰ－１トランスフェクトされた細胞からのタンパク質を、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で、オクチル－グルコシド／ＲＩＰＡを使用して４８時間後に単離した。膜ジペプチダーゼ活性アッセイおよびＤ－Ｐｈｅの蛍光定量的検出を、Ｈｅｙｗｏｏｄ ａｎｄ Ｈｏｏｐｅｒ （１９９５）によって元々確立された原理に従って、以前に記載されたとおりに正確に実施した。これらの結果は、図４Ｂにグラフで示される。示される値は、６つの独立した実験からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；アスタリスク（＊＊＊）は、ＤＰＥＰ－１トランスフェクトされた細胞と比較してＰ＜０．００１を示す（Ｎｅｕｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ事後テストを用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）（ｎ＝５）。トランスフェクトされた細胞からのタンパク質を、オクチル－グルコシド／ＲＩＰＡ溶解緩衝剤を使用して４８時間後に単離し、ウエスタンブロット解析を、ＤＰＥＰ－１抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して実施して、ＤＰＥＰ－１発現を評価した。ウエスタンブロット解析の写真は、図４Ｃに示される。
（実施例５）
ＬＳＡＬＴは、ＲＡＣＩＮＥおよびヒトＤＰＥＰ－１に結合する
（実施例５）
ＬＳＡＬＴは、ＲＡＣＩＮＥおよびヒトＤＰＥＰ－１に結合する
【0241】
Ｃｏｓ－１細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を使用して、ラット（図５Ａに示される）、ヒト（図５Ｂに示される）またはイヌ（図５Ｅに示される）ＤＰＥＰ－１遺伝子に対応する３または５μｇのいずれかの膜ジペプチダーゼ（ＤＰＥＰ－１）ｃＤＮＡで、一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＤＰＥＰ－１発現細胞を、２４ウェルプレート中の、コラーゲンコーティングされた（中和された）ウェル上に再播種し、３７℃で２４時間成長させた。播種の２４時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞を、氷上で３０分間、ＰＢＳ中のＦＢＳ／ＮＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で遮断した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷上で３０分間、Ａｌｅｘａ－４８８（緑色）コンジュゲートされたＬＳＡＬＴ、ＧＦＥ－１、対照ペプチドまたはＤＰＥＰ－１抗体（１／１００）（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。ＤＰＥＰ－１抗体インキュベートした細胞をＰＢＳで洗浄し、氷上で３０分間、蛍光コンジュゲートされた抗ウサギ二次抗体（ＰＢＳ中１／５００）と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷上で５分間、ＤＡＰＩで染色した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、免疫蛍光顕微鏡を実施して、結合を評価した。各実験条件の代表的な顕微鏡写真が示される（ｎ＝５）。ヒトＤＰＥＰ－１トランスフェクトされた細胞からのタンパク質を、オクチル－グルコシド／ＲＩＰＡ溶解緩衝剤を使用して４８時間後に単離し、ウエスタンブロット解析を、ＤＰＥＰ－１特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して実施して、ＤＰＥＰ－１発現を評価した。ウエスタンブロットの写真は、図５Ｄに提供される。Ｃｏｓ－１細胞を、３μｇの、ヒトＤＰＥＰ－１をコードするＤＰＥＰ－１遺伝子で、一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中で２時間血清飢餓させ、メチル－ベータ－シクロデキストリンで３０分間処置した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０ｍｇ／ｍｌのビオチン移行ペプチド（ＬＳＡＬＴ、ＧＦＥ－１または対照ペプチド（ＫＧＡＬ）］で１０分間処置した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ビオチン移行を、３６３ｎｍで１５分間のアリールアジド基のＵＶ活性化によって可能にした。残留流体を除去し、単層を、オクチル－グルコシド／ＲＩＰＡまたは８Ｍ尿素のいずれかで溶解させた。単離された上清を、５０μｌのニュートラアビジンアガロースビーズと共に４℃で２４時間回転させた。ビーズを、対応する緩衝剤で洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝剤中で煮沸し、ＤＰＥＰ－１特異的抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）を使用するウエスタンブロットによって解析した。この手順の概略図および得られたウエスタンブロットの写真は、図５Ｅに提供される。
（実施例６）
ＬＳＡＬＴペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＤＰＥＰ２およびＤＰＥＰ３に結合しない
（実施例６）
ＬＳＡＬＴペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＤＰＥＰ２およびＤＰＥＰ３に結合しない
【0242】
Ｃｏｓ－１細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を使用して、３μｇのヒトＤＰＥＰ－１、ＤＰＥＰ２またはＤＰＥＰ３遺伝子のいずれかで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＤＰＥＰ－１、ＤＰＥＰ２またはＤＰＥＰ３発現細胞を、２４ウェルプレート中のコラーゲンコーティングされた（中和された）ウェル上に再播種し、３７℃で２４時間成長させた。播種の２４時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞を、氷上で３０分間、ＰＢＳ中のＦＢＳ／ＮＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で遮断した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ－４８８（緑色）とコンジュゲートさせたＬＳＡＬＴまたはＧＦＥ－１と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷上で５分間、ＤＡＰＩで染色した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、免疫蛍光顕微鏡を実施して、結合を評価した。各実験条件についての代表的な顕微鏡写真は、図６Ａに示される（ｎ＝３）。ＤＰＥＰ－１、ＤＰＥＰ２およびＤＰＥＰ３トランスフェクトされた細胞からのタンパク質を、オクチル－グルコシド／ＲＩＰＡ溶解緩衝剤を使用して４８時間後に単離し、ウエスタンブロット解析を、特異的抗体；ＤＰＥＰ－１抗体（Ｓｉｇｍａ）、ＤＰＥＰ２（Ａｂｃａｍ）およびＤＰＥＰ３（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）を使用して実施して、ＤＰＥＰ－１、ＤＰＥＰ２およびＤＰＥＰ３タンパク質発現を評価した。ブロットを剥がし、抗β－アクチンで再プローブした。ウエスタンブロットの写真は、図６Ｂに示される。
（実施例７）
ＬＳＡＬＴは、ＬＰＳの存在下での肝類洞における好中球接着を阻害する：
（実施例７）
ＬＳＡＬＴは、ＬＰＳの存在下での肝類洞における好中球接着を阻害する：
【0243】
６～１０週齢のＬｙｓＭ（ｇｆｐ）マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇのリポポリサッカリドの注射（腹腔内）の５分後に、１ｍＭ用量のＬＳＡＬＴまたは１ＫＧＡＬ（対照）（静脈内）を注射した。３時間後、動物にケタミンおよびキシラジンを注射して、全身麻酔を提供した。次いで、蛍光コンジュゲートされたＦ４／８０およびＰＥＣＡＭ－１抗体を、頸静脈カニューレ挿入を介して投与し、生体内スピニングディスク共焦点顕微鏡を実施した。肝臓を１時間イメージングし、好中球の数を異なる時点で計数した。肝臓類洞中で３０秒以上静止していた好中球を、接着細胞として計数した。データは、３つの独立した実験の代表である。対応のない両側スチューデントｔ検定を実施して、ＬＰＳ処置群に対してＬＳＡＬＴ、ＧＦＥ－１または対照処置群を比較した（＊ｐ＜０．０５）。結果は、図７に示される。
（実施例８）
ＤＰＥＰ－１の発現は、ＣＯＳ－７細胞におけるＬＳＡＬＴおよびＧＦＥ－１の結合を増強した
（実施例８）
ＤＰＥＰ－１の発現は、ＣＯＳ－７細胞におけるＬＳＡＬＴおよびＧＦＥ－１の結合を増強した
【0244】
Ｃｏｓ－７細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を使用して、５μｇの腎ラット膜ジペプチダーゼ（ＤＰＥＰ－１）プラスミドで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞を、氷上で３０分間、Ａｌｅｘａ－４８８（緑色）とコンジュゲートさせたＬＳＡＬＴもしくはＧＦＥ－１、またはＡｌｅｘａ－４８８（緑色）とコンジュゲートさせた対照ペプチドと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、免疫蛍光顕微鏡を実施して、結合を評価した。各実験条件の代表的な顕微鏡写真が示される（ｎ＝２）。結果は、図８に示される。
（実施例９）
ＤＰＥＰ－１の発現は、ＣＯＳ－７細胞へのＬＳＡＬＴの結合を増強した
（実施例９）
ＤＰＥＰ－１の発現は、ＣＯＳ－７細胞へのＬＳＡＬＴの結合を増強した
【0245】
Ｃｏｓ－７細胞を、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を使用して、５μｇの腎ラット膜ジペプチダーゼ（ＤＰＥＰ－１）プラスミドで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、氷上で３０分間、Ａｌｅｘａ－４８８（緑色）にコンジュゲートさせたＬＳＡＬＴと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを実施して、結合を評価した。各実験条件についての単一パラメーターヒストグラムが示される（ｎ＝２）。結果は、図９に示される。
（実施例１０）
ＬＳＡＬＴは、膜ジペプチダーゼ（ＤＰＥＰ－１）酵素活性を阻害しない
（実施例１０）
ＬＳＡＬＴは、膜ジペプチダーゼ（ＤＰＥＰ－１）酵素活性を阻害しない
【0246】
Ｃｏｓ－１細胞を、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を使用して、３μｇのヒト膜ジペプチダーゼ（ＤＰＥＰ－１）プラスミドで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で、オクチルグルコシドを使用して単離した。膜ジペプチダーゼアッセイおよびＤ－Ｐｈｅの蛍光定量的検出を、Ｈｅｙｗｏｏｄ ａｎｄ Ｈｏｏｐｅｒによって以前に記載されたとおりに正確に実施した。簡潔に述べると、タンパク質を、ＬＳＡＬＴまたはＧＦＥ－１ペプチドの存在下または非存在下のいずれかで、膜ジペプチダーゼ基質Ｇｌｙ－Ｄ－Ｐｈｅと共に３７℃で３時間最初にインキュベートした。Ｄ－アミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼの存在下でのＤ－Ｐｈｅの６，６９－ジヒドロキシ－（１，１９－ビフェニル）－３，３９－二酢酸への変換から生成された蛍光シグナルを、蛍光プレートリーダーを使用して測定した。結果は、図１０Ａ～Ｃに示される。
（実施例１１）
敗血症の間の腎ジペプチダーゼの阻害は、炎症を低減させる
（実施例１１）
敗血症の間の腎ジペプチダーゼの阻害は、炎症を低減させる
【0247】
ＬｙｓＭ（ｇｆｐ）マウスを、５ｍｇ／ｋｇの用量でのリポポリサッカリド（ＬＰＳ、Ｏ１１１：Ｂ４）の静脈内注射を介した内毒血症に供した。腎臓を、３０分毎に最大で９０分まで、多光子顕微鏡を使用してイメージングした。ジペプチダーゼの阻害剤を静脈内で使用して、ＬＰＳ注射の１０分前にマウスをあらかじめ処置した。顕微鏡写真は、図１１Ａに示される。図１１Ｂは、種々の阻害剤を伴ったＬＰＳの前（ＮＴ）および後（９０分）の腎臓の顕微鏡写真イメージを提供する。接着好中球が、ＩＲＩ後に間質腔において見られた。好中球を、種々のＤＰＥＰ－１阻害剤を伴ったＬＰＳ注射後９０分間の時間経過にわたって定量化した。ｎ＝２～３／群、＊：ｐ＜０．０５。これらの結果は、図１１Ｃにグラフで示される。
（実施例１２）
腎虚血再灌流傷害の間のジペプチダーゼの阻害は、炎症を低減させる
（実施例１２）
腎虚血再灌流傷害の間のジペプチダーゼの阻害は、炎症を低減させる
【0248】
ＬｙｓＭ（ｇｆｐ）マウスを、血管クランプを介した３７℃で３０分間の一側性腎虚血および１２０分間の再灌流に供し、影響を受けた腎臓を、多光子顕微鏡を使用してイメージングした。代表的な顕微鏡写真は、図１２Ａに示される。ジペプチダーゼの阻害剤を使用して、虚血の１０分前にマウスをあらかじめ処置した。標識化抗体を、イメージング前に静脈内注射した。種々の阻害剤を伴ったＩＲＩの前（ＮＴ）および後（１２０分）の腎臓のイメージは、図１２Ｂに提供される。接着好中球が、ＩＲＩ後に間質腔において見られた。好中球を、１２０分間の時間経過にわたって定量化し、図１３Ａにグラフで示した（ｎ＝３／群、＊＊＊：ｐ＜０．０１）。好中球を、種々の阻害剤を伴ったＩＲＩの後（１２０分）に定量化し、図１３Ｂにグラフで示した（ｎ＝３～５／群、＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
（実施例１４）
ＤＰＥＰ－１結合による炎症性メディエーターの阻害
（実施例１４）
ＤＰＥＰ－１結合による炎症性メディエーターの阻害
【0249】
以下の実験を実施して、ＬＳＡＬＴペプチドによるＤＰＥＰ－１結合が、ＬＰＳに応答した特定の血清サイトカインのレベルに対して影響を有したかどうかを評価した。６～８週齢のＳＣＩＤマウスに、ＬＳＡＬＴペプチドまたは対照ペプチドの静脈内注射の５分前に、ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を与えた。ＬＰＳの注射の４時間後、血液を心穿刺によって収集し、血漿サイトカインレベルにおける変化を、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙを使用して評価した。棒グラフは、ＬＳＡＬＴペプチドおよび対照ペプチドの存在下または非存在下での、血漿中に放出された異なる炎症性メディエーターのレベルを示している（図１４Ａ）。ＬＳＡＬＴペプチドは、いくつかの異なる血清サイトカインのレベルを減弱させる。
【0250】
６～８週齢のＳＣＩＤマウスに、ＬＳＡＬＴペプチドまたは対照ペプチドの静脈内注射の５分前に、ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を与えた。ＬＰＳの注射の４時間後、血液を心穿刺によって収集し、血漿サイトカインレベルにおける変化を、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙを使用して評価した。棒グラフは、２つの独立した実験における、ＬＳＡＬＴペプチドまたは対照ペプチドでの、血漿中に放出された抗炎症性サイトカインＩＬ－１０のレベルを示している（図１４Ｈおよび図１４Ｉ）。ＬＳＡＬＴペプチドは、ＬＰＳに応答して、抗炎症性メディエーターＩＬ－１０の産生を増加させる。
（実施例１５）
７０Ｗヒト黒色腫細胞は、ＤＰＥＰ－１発現ＣＯＳ－１単層にｉｎ ｖｉｔｒｏで結合する
（実施例１５）
７０Ｗヒト黒色腫細胞は、ＤＰＥＰ－１発現ＣＯＳ－１単層にｉｎ ｖｉｔｒｏで結合する
【0251】
Ｃｏｓ－１細胞を、３μｇのヒトＤＰＥＰ－１ ｃＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１２または２４ウェルプレート上に、２４時間後に再播種した。４８時間後、安定なＧＦＰ－ルシフェラーゼを発現する７０Ｗ黒色腫細胞を、Ｐｕｃｋ’ｓ ＥＤＴＡを使用して収集し、１０×１０３細胞を、ＤＰＥＰ－１発現Ｃｏｓ－１単層の上に播種した。細胞を、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで２回激しく洗浄した。次いで、細胞を、パラホルムアルデヒド（４％）を使用して固定した。結合／接着した７０Ｗ黒色腫細胞の数を、倒立蛍光顕微鏡を使用して、１０の異なる視野にわたって１０×の倍率下で計数した（図２４Ａ）。対応のない両側スチューデントｔ検定を実施して比較した（図２４Ａ）。対応のない両側スチューデントｔ検定を実施して、モックトランスフェクトされた細胞の対照に対して、ＤＰＥＰ－１トランスフェクトされた細胞への７０Ｗ黒色腫細胞の結合を比較した。示される値は、３つの独立した実験からのものである；アスタリスク（＊＊＊）は、モックトランスフェクトされた細胞と比較してＰ＜０．００１を示す。
【0252】
ＤＰＥＰ－１トランスフェクトされた細胞からのタンパク質を、オクチル－グルコシド／ＲＩＰＡ溶解緩衝剤を使用して４８時間後に単離し、ＤＰＥＰ－１特異的抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）を使用してウエスタンブロット解析を実施して、ＤＰＥＰ－１発現を評価した（図２４Ｂ）。膜ジペプチダーゼ活性アッセイおよびＤ－Ｐｈｅの蛍光定量的検出を、Ｈｅｙｗｏｏｄ ａｎｄ Ｈｏｏｐｅｒ （１９９５）によって記載されたとおりに正確に実施した（図２４Ｃ）。
（実施例１６）
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への、ＬＳＡＬＴアラニン置換合成ペプチドの結合
（実施例１６）
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への、ＬＳＡＬＴアラニン置換合成ペプチドの結合
【0253】
公知の生理活性ペプチドの場合、好ましい治療的特性を有するペプチドリガンドの合理的設計が完成され得る。かかるアプローチでは、ペプチド配列を段階的に変化させ、ペプチドの生理活性または予測的な生物物理学的特性（例えば、溶液構造）に対する置換の影響を決定する。本明細書で以下、これらの技術を、「合理的設計」と集合的に呼ぶ。１つのかかる技術では、単一の残基を一度にアラニンで置き換える、一連のペプチドを作製する。この技術は、「アラニンウォーク」または「アラニンスキャン」と一般に呼ばれる。２つの残基（連続するまたは間隔をあけた）が置き換えられる場合、これは、「二重アラニンウォーク」と呼ばれる。得られたアミノ酸置換は、単独でまたは組み合わせて使用されて、好ましい治療的特性を有する新たなペプチド実体を生じ得る。
【0254】
ＨＥＫ２９細胞を、アッセイの２日前に、ＤＰＥＰ１またはＤＰＥＰ２でトランスフェクトし、１日前に、コラーゲンコーティングされたカバーガラス上にプレートした。次いで、ＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、各々５ｕＭのアラニン置換された試験ペプチドと共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで穏やかに２回洗浄し、ＰＢＳ中１／５０のＡｌｅｘａ ５６８－ストレプトアビジン（ｓｔｒａｐｔａｖａｄｉｎ）と共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで穏やかに２回洗浄し、ＤＡＰＩを添加し、ＤＡＫＯ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔマウント培地を用いてマウントし、蛍光顕微鏡下で結合について評価した。
表１：アラニンウォークの結合活性および配列
（実施例１７）
ＬＳＡＬＴペプチドの円二色性解析
表１：アラニンウォークの結合活性および配列
【表1】
（実施例１７）
ＬＳＡＬＴペプチドの円二色性解析
【0255】
タンパク質治療薬の物理的および化学的特性は、製造、開発および臨床的使用の容易さに影響する重要な因子である。ＬＳＡＬＴペプチドを、種々の生物物理学的方法を使用して、その溶解度、凝集状態および安定性に関して評価した。タンパク質の二次構造を、円二色性（ＣＤ）分光法によって決定した：水性緩衝剤中でのＬＳＡＬＴの遠ＵＶスペクトルは、α－ヘリックスコンフォメーションに特徴的な、２２２ｎｍにおける最小値を示す。
【0256】
ＣＤ（円二色性）解析を、ＬＳＡＬＴペプチドおよび種々のアナログに対して実施して、ペプチドがアルファ－ヘリックスを形成する傾向を実証した。
【表2-1】
【表2-2】
【0257】
特に、１、５、１０および１２位（これらの変異体は、免疫蛍光によって、ＤＰＥＰ－１への減少および増加した結合を示した）は全て、推定アルファ－ヘリックスＬＳＡＬＴと同じ面上にクラスタリングし、ヘリックスの一方の側上に、連続するクラスターを構成し、これらの残基がＤＰＥＰ－１と相互作用することの根拠を示す。
【0258】
円二色性分光法では、２２２ｎｍにおける楕円率値が、α－ヘリックス含量の尺度である。５０％トリフルオロエタノールは、疎水性溶媒であり、構造が誘導され得る場合にはα－ヘリックス構造を誘導する。試験した全てのペプチドが、α－ヘリックス構造を取るように誘導され得る。ペプチドは、穏和な条件（非変性）では、ランダムコイルである。緩衝剤条件は、水性リン酸、ｐＨ７．０であった。ネイティブペプチドは、遊離α－アミノ基を有し、この基をビオチンで遮断することは、誘導可能なα－ヘリックス構造のための明らかな利点である（ネイティブ 対 ビオチン－ネイティブの比較）。
【0259】
同様に、Ｃ末端アミド基を有することは、誘導可能なα－ヘリックス構造（ペプチドＡ１６／Ａ１７とＡ１８／Ａ１９との比較、ここで、％誘導可能なヘリックス構造は、約３２％ 対 ５１％である）にとって有利である。Ａ１ 対 Ａ２の比較は、Ｓｅｒ残基をＡｌａ残基で置換することが、予想されるように、誘導可能なα－ヘリックス構造を有意に増強することを示している（Ａｌａは、Ｓｅｒと比較して、強いヘリックス形成性残基である）（α－ヘリックス傾向スケールについては、Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １， ３１９－３２９ （１９９５））。
穏和な緩衝剤（１００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）
（実施例１８）
グリシンスペーサーは、ＤＰＥＰ１へのＬＳＡＬＴの結合を増強する
【表3】
穏和な緩衝剤（１００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）
（実施例１８）
グリシンスペーサーは、ＤＰＥＰ１へのＬＳＡＬＴの結合を増強する
【0260】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者のプロトコールに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を介して、ヒトＤＰＥＰ１を含むｐｃＤＮＡベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、ジェネティシン耐性を使用してポジティブ選択し、サブクローニングして、安定にトランスフェクトされたＤＰＥＰ１クローンを生成した。ヒト腎尿細管上皮細胞（ｈＴＥＣ）を、ヒト腎臓腎摘出術から単離および培養した。免疫細胞化学のために、細胞を、コラーゲンコーティングされたガラスカバーガラス上で培養し、４％パラホルムアルデヒドによって固定した。固定された細胞を、ＰＢＳ洗浄前に３７℃で１時間、種々の改変（グリシンリンカーおよび／またはアミド化）を有するビオチン化されたＬＳＡＬＴペプチド（５０μＭ）と共にインキュベートした。結合したビオチン化されたペプチドを、二次ストレプトアビジン蛍光コンジュゲート（３７℃で３０分間のインキュベーション）を介して検出し、ＰＢＳで洗浄した。図１５Ａは、グリシンリンカーおよびアミド化改変を有するＬＳＡＬＴの結合を、フローサイトメトリーを介して評価および定量化したことを示している。安定にトランスフェクトされたＤＰＥＰ１ ＨＥＫ細胞を再懸濁し、ＰＢＳ洗浄前に３７℃で１時間、ビオチン化されたペプチド（５０μＭ）と共にインキュベートした。結合したビオチン化されたペプチドを、二次ストレプトアビジン蛍光コンジュゲート（３７℃で３０分間のインキュベーション）を介して検出し、ＰＢＳで洗浄した。ペプチド結合を、フローサイトメーターを介して解析した。ペプチド結合のパーセンテージを、陰性対照と比較した（ｎ＝３／群）。図１５Ｃは、グリシン連結されたＬＳＡＬＴによる炎症の機能的阻害を、内毒血症誘導性の急性腎臓傷害のモデルにおいて試験したことを示している。ＬｙｓＭ（ｇｆｐ）マウスを、５ｍｇ／ｋｇの用量でのリポポリサッカリド（ＬＰＳ、Ｏ１１１：Ｂ４）の静脈内注射を介した内毒血症に供した。腎臓を、注射の４時間後に、多光子顕微鏡を使用してイメージングした。トリ－グリシン連結されたＬＳＡＬＴ（Ｇ２）を静脈内で使用して、ＬＰＳ注射の１０分前にマウスをあらかじめ処置した。炎症を、単一の顕微鏡視野中の単球接着の手動計数によって定量化した（ｎ＝３～６視野／群；＊：ｐ＝０．０２）。
（実施例１９）
ＬＳＡＬＴにおけるアラニン置換は、結合親和性に影響を与える。
（実施例１９）
ＬＳＡＬＴにおけるアラニン置換は、結合親和性に影響を与える。
【0261】
図１６Ａは、ＬＳＡＬＴを、各アミノ酸位置においてアラニン置換で改変して、どのアミノ酸残基がＤＰＥＰ１への結合に影響を与えるかを決定したことを示している。図１６Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者のプロトコールに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を介して、ヒトＤＰＥＰ１を含むｐｃＤＮＡベクターでトランスフェクトしたことを示している。トランスフェクトされた細胞を、ジェネティシン耐性を使用してポジティブ選択し、サブクローニングして、安定にトランスフェクトされたＤＰＥＰ１クローンを生成した。安定にトランスフェクトされたＤＰＥＰ１ ＨＥＫ細胞を再懸濁し、ＰＢＳ洗浄前に３７℃で１時間、ビオチン化されたペプチド（５０μＭ）と共にインキュベートした。結合したビオチン化されたペプチドを、二次ストレプトアビジン蛍光コンジュゲート（３７℃で３０分間のインキュベーション）を介して検出し、ＰＢＳで洗浄した。ペプチド結合を、フローサイトメーターを介して解析した。ペプチド結合のパーセンテージを、陰性対照と比較した。減少したペプチド結合は、ＬＳＡＬＴ－ＤＰＥＰ１結合相互作用にとって潜在的に重要なアミノ酸残基を示した。
（実施例２１）
血液中の代謝されたＬＳＡＬＴ断片は、ＤＰＥＰ１になおも結合できる。
（実施例２１）
血液中の代謝されたＬＳＡＬＴ断片は、ＤＰＥＰ１になおも結合できる。
【0262】
図１７Ａは、ＬＳＡＬＴペプチド（５０μｇ／ｍＬ）を、最大で１２０分までの種々の時点にわたりヒト全血（クエン酸塩またはＫ２ＥＤＴＡ処置した）中でインキュベートしたことを示している。血漿を各試料について分離し、リン酸を添加して、各時点においてペプチドを安定化した。試料を、ＬＣ／ＭＳを使用して、ＬＳＡＬＴおよびその代謝物について評価した。ＬＳＡＬＴ代謝物を、ＬＳＡＬＴおよびヒトプロテオームに対するＰＥＡＫＳ Ｘおよびデータベース検索を使用して識別した。図１７Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者のプロトコールに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を介して、ヒトＤＰＥＰ１を含むｐｃＤＮＡベクターでトランスフェクトしたことを示している。トランスフェクトされた細胞を、ジェネティシン耐性を使用してポジティブ選択し、サブクローニングして、安定にトランスフェクトされたＤＰＥＰ１クローンを生成した。安定にトランスフェクトされたＤＰＥＰ１ ＨＥＫ細胞を再懸濁し、ＰＢＳ洗浄前に３７℃で１時間、ビオチン化されたＬＳＡＬＴ断片ペプチド（５０μＭ）と共にインキュベートした。結合したビオチン化されたペプチドを、二次ストレプトアビジン蛍光コンジュゲート（３７℃で３０分間のインキュベーション）を介して検出し、ＰＢＳで洗浄した。ペプチド結合を、フローサイトメーターを介して解析した。ペプチド結合のパーセンテージを、陰性対照と比較した。図１７Ｃは、ＬＳＡＬＴ断片による炎症の機能的阻害（図１７Ａを参照）を、内毒血症誘導性の急性腎臓傷害のモデルにおいて試験したことを示している。ＬｙｓＭ（ｇｆｐ）マウスを、５ｍｇ／ｋｇの用量でのリポポリサッカリド（ＬＰＳ、Ｏ１１１：Ｂ４）の静脈内注射を介した内毒血症に供した。腎臓を、注射の４時間後に、多光子顕微鏡を使用してイメージングした。種々のＬＳＡＬＴ断片を静脈内で使用して、ＬＰＳ注射の１０分前にマウスをあらかじめ処置した。炎症を、単一の顕微鏡視野中の単球接着の手動計数によって定量化した（ＬＰＳ 対 断片Ｃ；ｎ＝３～６視野／群；＊＊＊：ｐ＝０．００４）。
【0263】
図１８Ａは、改変されたＬＳＡＬＴが、内毒血症誘導性の腎臓炎症を阻害できることを示している。腎臓中の炎症を、尿量枯渇ＬｙｓＭ（ｇｆｐ）マウス中へのＬＰＳ（Ｏ１１１：Ｂ４、５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射によって誘導した。腎臓を、注射の４時間後に、多光子顕微鏡を使用してイメージングした。マウスを、ＬＰＳ処置の１０分前に、レトロインベルソＬＳＡＬＴ（ＲＩ ＬＳＡＬＴ）であらかじめ処置した。腎臓を、ＬＰＳ処置の４時間後に、炎症について評価した。炎症を、単一の視野中の単球接着の手動計数によって定量化した（ｎ＝６～１０視野／群；＊＊：ｐ＝０．００３４）。
（実施例２２）
新規ＤＰＥＰ－１結合ペプチド
（実施例２２）
新規ＤＰＥＰ－１結合ペプチド
【0264】
図１９Ａでは、ヒト組換えＤＰＥＰ１（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ；ＤＰＥＰ１－７７Ｈ、アミノ６×Ｈｉｓタグ化）を、アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ ＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ Ｒｅｓｉｎ；８８２２１ － １５ｕＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂を１５ｕｇ ＤＰＥＰ１、３０ｕＬの総体積のＰＢＳと混合し、使用前に５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１時間遮断したもの）に連結させ、ファージディスプレイされたペプチド配列についてバイオパニングするために使用した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｐｈ．Ｄ．－１２ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ；Ｅ８１１０Ｓ）。Ｐｈ．Ｄ．－１２ライブラリーを、アガロースビーズに連結したＤＰＥＰ２（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ；ＤＰＥＰ２－８６１１Ｈ）に対して最初に３回サブトラクトし（１００ｕＬのＬｕｒｉａブロス中１０ｕＬのＤＰＥＰ－アガロース、および４．５×１０９ｐｆｕのＰｈ．Ｄ．－１２ライブラリー）、上清中に残存するファージを保持し、サブトラクションビーズに付着したファージを廃棄した。第２に、ライブラリーを、ＤＰＥＰ１－アガロースビーズに対して選択し、上清中に残存するファージを廃棄し、ＤＰＥＰ１－アガロースペレットに結合するファージを保持した。ペレットをＰＢＳ中で３回洗浄し、次いで、ファージ宿主細菌培養物（ＥＲ ２７３８）に移して、結合したファージを増幅し、これを次いで、製造業者のプロトコールに従って沈殿させた。次いで、回収したファージを使用して、サブトラクションおよび選択のステップを反復した。選択された最終ライブラリーを、細菌菌叢上にプレートして、個々の青色のプラークの選択を可能にした；各プラークは、個々のファージ粒子からのクローン性増幅から形成され、したがって、単一の独自のディスプレイされたペプチドを含む。各プラークを、液体細菌宿主培養物中で別々に増幅した。各クローン性培養物からのＤＮＡを、Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－ｔｅｋ Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｍ１３ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して回収し、ディスプレイされたペプチドに対応する挿入物を含む領域の配列決定に送った。ＤＮＡ挿入物を、予想されるタンパク質に翻訳し、選別して、反復配列の数を評価した。特異的に見えるものを、ＮＩＨ
ＢＬＡＳＴデータベース上で検索して、可能なマッチする同一性を見出したところ、表面タンパク質が優先的に選択された。
ＢＬＡＳＴデータベース上で検索して、可能なマッチする同一性を見出したところ、表面タンパク質が優先的に選択された。
【0265】
図１９Ｂでは、Ｃｏｓ１細胞を、コラーゲンコーティングされた（ＰｕｒｅＣｏｌ；ウシの腱由来のＩ型コラーゲン）カバーガラス上にプレートする２４時間前に、ヒトＤＰＥＰ１またはＤＰＥＰ２に対応するプラスミドで一過的にトランスフェクトした（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）。１日後、細胞を、１０８ｐｆｕの試験ファージと共にインキュベートし、これを次いで、抗ウサギＡｌｅｘａ ５６８二次と共に抗Ｍ１３ウサギ血清（社内）によって検出した。固定し、ＤＡＰＩを用いて対比染色した後、カバーガラスを蛍光イメージングした。ネオゲニンに対応すると暫定的に識別されたファージペプチドは、最良の結合を有したので、その対応するペプチド挿入物を、合成的に作製した。
【0266】
図１９Ｃは、ネオゲニン模倣性ペプチドの阻害が好中球接着ＤＰＥＰ１を防止することを実証している。上のパネルでは、９６ウェルのニッケルコーティングされたプレートを、何でもコーティングせずまたはｈｉｓタグ化組換えヒトＤＰＥＰ１（ＰＢＳ中９ｐｍｏｌ／ウェル、室温で１時間インキュベートした）でコーティングし、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０で３回洗浄し、細胞培養培地（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．カタログ番号１１１－５００）を用いて室温で１時間遮断した。新たに単離したヒト好中球を、０．４５ｕＭの示されたペプチドと共に、５×１０４／ｍＬ、１００ｕＬ体積でウェルに添加した。３７℃で３０分間の後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドで固定した。２つの視野を、４×の倍率で撮影し、計数された全ての細胞を、三連で実施した各ウェルについて記録した。中央のパネルでは、Ｃｏｓ１細胞を、２日前に、空のベクター（モック）または野生型ヒトＤＰＥＰ１をコードするベクターでトランスフェクトした。１日前に、トランスフェクトされた細胞を、２４ウェルプレート中に、ほぼコンフルエンシーでプレートした。実験当日に、新たに単離したヒト好中球を、１００ｕＭの示されたペプチドと共に、１×１０５／ｍＬ、０．５ｍＬ体積でウェルに添加した。３７℃で３０分間の後、ウェルを、培養培地で３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドで固定した。５つの視野を、２０×の倍率で撮影し、三連で実施した各ウェルについて平均した。下のパネルでは、２日前に、２４ウェルプレートを、Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．カタログ番号１２３－５００）でコーティングした。１日前に、Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ（ＨＬＭＶＥＣ、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．カタログ番号５４０－０５ａ）を、ほぼコンフルエンシーでプレートした。実験当日に、ＨＬＭＶＥＣを４時間、何でも刺激せず、または１ｕｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した。新たに単離したヒト好中球を、１００ｕＭの示されたペプチドと共に、または１３ｕｇ／ｍＬのネオゲニン遮断抗体（ＲｎＤカタログ番号ＡＦ１０７９）と共に、１×１０５／ｍＬ、０．５ｍＬ体積でウェルに添加した。３７℃で３０分間の後、ウェルを、培養培地で３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドで固定した。５つの視野を、２０×の倍率で撮影し、三連で実施した各ウェルについて平均した。グラフにした各ドットは、３つの技術的複製の平均と等しい。
（実施例２３）
ＬＳＡＬＴに結合する配列の識別
（実施例２３）
ＬＳＡＬＴに結合する配列の識別
【0267】
図２０Ａは、ＬＳＡＬＴペプチドに対するファージディスプレイバイオパニングからのペプチド配列を示している。合成ＬＳＡＬＴペプチドを、製造業者の使用説明書に従って、ＮＨＳ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号２６１９６）に共有結合させた。５０ｕＬのＬＳＡＬＴ－Ａｇａｒｏｓｅを、２．２５×１０１０ｐｆｕのＰｈ．Ｄ．－１２ファージライブラリーと共に１ｍＬのＰＢＳに添加し、ローテーター上で４℃で１時間インキュベートした。アガロースビーズをＰＢＳで３回洗浄し、結合したファージを、細菌宿主との一晩培養によって回収し、ＬＳＡＬＴ－Ａｇａｒｏｓｅに対するさらに２回のラウンドの選択に供した。選択された最終ライブラリーを、細菌菌叢上にプレートして、個々の青色のプラークの選択を可能にした；各プラークは、個々のファージ粒子からのクローン性増幅から形成され、したがって、単一の独自のディスプレイされたペプチドを含む。各プラークを、液体細菌宿主培養物中で別々に増幅した。各クローン性培養物からのＤＮＡを、Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－ｔｅｋ Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｍ１３
ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して回収し、ディスプレイされたペプチドに対応する挿入物を含む領域の配列決定に送った。ＤＮＡ挿入物を、予想されるタンパク質に翻訳し、選別して、反復配列の数を評価した。モチーフＩＰＫＸＰＸＸＸＰを含む２つのペプチドを識別した。ＩＰＫファージヒットのうち１つ（ＨＩＰＫＳＰＩＱＩＰＩＩ）は、ＬＰＳ刺激されたヒト内皮細胞において好中球接着を阻害することができた（図２０Ｃ）。ＩＰＫモチーフは、ＤＰＥＰ１と相互作用する好中球側受容体を提示し得る。
ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して回収し、ディスプレイされたペプチドに対応する挿入物を含む領域の配列決定に送った。ＤＮＡ挿入物を、予想されるタンパク質に翻訳し、選別して、反復配列の数を評価した。モチーフＩＰＫＸＰＸＸＸＰを含む２つのペプチドを識別した。ＩＰＫファージヒットのうち１つ（ＨＩＰＫＳＰＩＱＩＰＩＩ）は、ＬＰＳ刺激されたヒト内皮細胞において好中球接着を阻害することができた（図２０Ｃ）。ＩＰＫモチーフは、ＤＰＥＰ１と相互作用する好中球側受容体を提示し得る。
【0268】
図２０Ｂは、ＮＩＨデータベースから得たヒトＤＰＥＰ１、ＤＰＥＰ２およびＤＰＥＰ３のタンパク質配列のアラインメント比較を示している。コードするエクソンが示され、ＩＰＫ配列は、ＤＰＥＰ１のエクソン２のみにおいて見出された。ＩＰＫがＬＳＡＬＴペプチドに対するファージバイオパニングにおいて見出されたことを考慮すると、これは、ＬＳＡＬＴが、ＤＰＥＰ１のエクソン２に少なくとも優先的に結合することを示唆している。
【0269】
図２０Ｃは、ＩＰＫペプチドが、ＬＰＳ活性化された内皮細胞への好中球接着を阻害することを示している。実験の２日前に、２４ウェルプレートを、Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．カタログ番号１２３－５００）でコーティングした。１日前に、Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ（ＨＬＭＶＥＣ、Ｃｅｌｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．カタログ番号５４０－０５ａ）を、ほぼコンフルエンシーでプレートした。実験当日に、ＨＬＭＶＥＣを４時間、何でも刺激せず、または１ｕｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した。新たに単離したヒト好中球を、１００ｕＭの示されたペプチドと共に、１×１０５／ｍＬ、０．５ｍＬ体積でウェルに添加した。３７℃で３０分間の後、ウェルを、培養培地で３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドで固定した。５つの視野を、２０×の倍率で撮影し、三連で実施した各ウェルについて平均した。グラフにした各ドットは、３つの技術的複製の平均と等しい。
（実施例２４）
転移性がん細胞は、ＤＰＥＰ１発現ＣＯＳ１単層にｉｎ ｖｉｔｒｏで結合する
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．カタログ番号５４０－０５ａ）を、ほぼコンフルエンシーでプレートした。実験当日に、ＨＬＭＶＥＣを４時間、何でも刺激せず、または１ｕｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した。新たに単離したヒト好中球を、１００ｕＭの示されたペプチドと共に、１×１０５／ｍＬ、０．５ｍＬ体積でウェルに添加した。３７℃で３０分間の後、ウェルを、培養培地で３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドで固定した。５つの視野を、２０×の倍率で撮影し、三連で実施した各ウェルについて平均した。グラフにした各ドットは、３つの技術的複製の平均と等しい。
（実施例２４）
転移性がん細胞は、ＤＰＥＰ１発現ＣＯＳ１単層にｉｎ ｖｉｔｒｏで結合する
【0270】
ＬＳＡＬＴは、ＤＰＥＰ１発現ＣＯＳ１単層への転移性がん細胞の結合をｉｎ ｖｉｔｒｏで減少させる。図２１Ａは、ＣＯＳ１（対照）、ＤＰＥＰ１、ＤＰＥＰ２またはＤＰＥＰ３トランスフェクトされたＣＯＳ１細胞に結合するヒト黒色腫７０Ｗの定量化を示している。図２１Ｂ～Ｃは、ＬＳＡＬＴ（５０μＭ）の非存在下または存在下での、ＣＯＳ１（対照）またはＤＰＥＰ１ ＣＯＳ１に結合するマウス黒色腫Ｂ１６－Ｆ１０（Ｂ）またはマウス乳房がんＥ０７７１．ＬＭＢ（Ｃ）細胞の定量化を示している。
（実施例２５）
ＬＳＡＬＴは、活性化された肺内皮細胞への転移性がん細胞の結合を減少させる
（実施例２５）
ＬＳＡＬＴは、活性化された肺内皮細胞への転移性がん細胞の結合を減少させる
【0271】
ＬＳＡＬＴは、ＴＮＦαおよびＩＬ１βによって活性化されたヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＬＭＶＥＣ）への転移性がん細胞の結合を減少させる。図２２Ａは、ＬＳＡＬＴまたはスクランブルしたペプチドの存在下および非存在下での、ＨＬＭＶＥＣへのＢ１６－Ｆ１０細胞（マウス黒色腫）結合を示している。図２２Ｂは、ＬＳＡＬＴまたはスクランブルしたペプチド（５０μＭ）の存在下および非存在下での、ＨＬＭＶＥＣへのＴａｏ－１細胞（マウス肉腫）結合を示している。
（実施例２６）
ＬＳＡＬＴは、転移性がん細胞を注射した動物の肝臓および肺において腫瘍負荷を低減させる。
（実施例２６）
ＬＳＡＬＴは、転移性がん細胞を注射した動物の肝臓および肺において腫瘍負荷を低減させる。
【0272】
マウスにおける転移モデルを、Ｍｏｈａｎｔｙ ｅｔ ａｌ．に記載されるように実施した。図２３Ａは、対照またはＬＳＡＬＴペプチド（１ｍＭ）の存在下での、４Ｔ１マウス乳房がん細胞を注射した動物における肝臓転移性病変の数を示している。図２３Ｂは、対照またはＬＳＡＬＴペプチドの存在下での、ルシフェラーゼ発現７０Ｗヒト黒色腫細胞を注射した動物の生物発光イメージングを示している。図２３Ｃは、７０Ｗ処置した動物におけるルシフェラーゼ活性の定量化を示している。図２３Ｄは、対照またはＬＳＡＬＴペプチド（１ｍＭ）の存在下での、ルシフェラーゼ発現１４３Ｂヒト骨肉腫細胞を注射した動物の生物発光イメージングを示している。図２３Ｅは、１４３Ｂ処置した動物におけるルシフェラーゼ活性の定量化を示している。図２３Ｆは、対照またはＬＳＡＬＴペプチド（１ｍＭ）の存在下での、Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞を注射した動物からの肺試料の代表的なＨ＆Ｅイメージを示している。図２３Ｇは、図２３Ｆ中の動物の肺中に存在する転移性病変の定量化を示している。図２３Ｈは、対照またはＬＳＡＬＴペプチド（１ｍＭ）の存在下での、Ｅ０７７１．ＬＭＢマウス乳房がん細胞を注射した動物からの肺試料の代表的なＨ＆Ｅイメージを示している。図２３Ｉは、図２３Ｈ中の動物の肺中の腫瘍面積の定量化を示している。
【0273】
種々の変化および改変が、本発明から逸脱することなしにどのようになされ得るかは、理解されるであろう。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
（ａ）ＬＳＡＬＴを含むアミノ酸配列および（ｂ）Ｎ末端に、少なくとも１つの追加のグリシン残基を含む単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目２)
（ａ）の前記アミノ酸配列が、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１）である、項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目３)
配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される、項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目４)
ＰＥＧ化、アセチル化、グリコシル化、ビオチン化、プレニル化または環化によって改変されている、項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目５)
Ｄ－アミノ酸、改変されたアミノ酸、アミノ酸アナログまたはそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目６)
改変されたアミノ酸が、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または他の化学基による置換からなる群から選択される改変を含む、項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目７)
項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチドおよび少なくとも１つの医薬担体を含む医薬組成物。
(項目８)
必要なヒト対象において障害を処置または予防する方法であって、有効量の項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチドを前記対象に投与するステップを含む、方法。(項目９)
前記障害が、急性腎臓傷害、敗血症および腫瘍転移からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
(項目１０)
前記障害が、炎症および虚血－再灌流傷害からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
(項目１１)
前記虚血－再灌流傷害が、移植のためのドナー臓器を摘出することと関連する、項目１０に記載の方法。
(項目１２)
配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含む単離されたペプチド。
(項目１３)
前記配列が、配列番号５または＾から選択され、前記ペプチドが、ＤＰＥＰ－１に結合する、項目１２に記載の単離されたペプチド。
(項目１４)
前記配列が、配列番号７または配列番号８から選択され、前記ペプチドが、ＤＰＥＰ－１への結合を阻害する、項目１２に記載の単離されたペプチド。
(項目１５)
Ｎ末端に、少なくとも１、２、３、４または５個のアミノ酸残基をさらに含む、項目１２に記載の単離されたペプチド。
(項目１６)
Ｄ－アミノ酸、改変されたアミノ酸、アミノ酸アナログまたはそれらの組合せからなる
群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、項目１２に記載の単離されたペプチド。
(項目１７)
改変されたアミノ酸が、メチル化、アミド化、アセチル化からなる群から選択される改変を含む、項目１５に記載の単離されたペプチド。
(項目１８)
項目１２に記載の単離されたペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
(項目１９)
必要な対象において疾患または障害を処置する方法であって、有効量の項目１２に記載の単離されたペプチドを前記対象に投与するステップを含む、方法。
(項目２０)
前記疾患または障害が、急性腎臓傷害、敗血症および腫瘍転移からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
(項目２１)
前記障害が、炎症および虚血－再灌流傷害からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
(項目２２)
前記虚血－再灌流傷害が、移植のためのドナー臓器を摘出することと関連する、項目２１に記載の方法。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
（ａ）ＬＳＡＬＴを含むアミノ酸配列および（ｂ）Ｎ末端に、少なくとも１つの追加のグリシン残基を含む単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目２)
（ａ）の前記アミノ酸配列が、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１）である、項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目３)
配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される、項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目４)
ＰＥＧ化、アセチル化、グリコシル化、ビオチン化、プレニル化または環化によって改変されている、項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目５)
Ｄ－アミノ酸、改変されたアミノ酸、アミノ酸アナログまたはそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目６)
改変されたアミノ酸が、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または他の化学基による置換からなる群から選択される改変を含む、項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチド。
(項目７)
項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチドおよび少なくとも１つの医薬担体を含む医薬組成物。
(項目８)
必要なヒト対象において障害を処置または予防する方法であって、有効量の項目１に記載の単離されたＤＰＥＰ－１結合ペプチドを前記対象に投与するステップを含む、方法。(項目９)
前記障害が、急性腎臓傷害、敗血症および腫瘍転移からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
(項目１０)
前記障害が、炎症および虚血－再灌流傷害からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
(項目１１)
前記虚血－再灌流傷害が、移植のためのドナー臓器を摘出することと関連する、項目１０に記載の方法。
(項目１２)
配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含む単離されたペプチド。
(項目１３)
前記配列が、配列番号５または＾から選択され、前記ペプチドが、ＤＰＥＰ－１に結合する、項目１２に記載の単離されたペプチド。
(項目１４)
前記配列が、配列番号７または配列番号８から選択され、前記ペプチドが、ＤＰＥＰ－１への結合を阻害する、項目１２に記載の単離されたペプチド。
(項目１５)
Ｎ末端に、少なくとも１、２、３、４または５個のアミノ酸残基をさらに含む、項目１２に記載の単離されたペプチド。
(項目１６)
Ｄ－アミノ酸、改変されたアミノ酸、アミノ酸アナログまたはそれらの組合せからなる
群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、項目１２に記載の単離されたペプチド。
(項目１７)
改変されたアミノ酸が、メチル化、アミド化、アセチル化からなる群から選択される改変を含む、項目１５に記載の単離されたペプチド。
(項目１８)
項目１２に記載の単離されたペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
(項目１９)
必要な対象において疾患または障害を処置する方法であって、有効量の項目１２に記載の単離されたペプチドを前記対象に投与するステップを含む、方法。
(項目２０)
前記疾患または障害が、急性腎臓傷害、敗血症および腫瘍転移からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
(項目２１)
前記障害が、炎症および虚血－再灌流傷害からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
(項目２２)
前記虚血－再灌流傷害が、移植のためのドナー臓器を摘出することと関連する、項目２１に記載の方法。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【図16-1】
【図16-2】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図19-3】
【図20-1】
【図20-2】
【図20-3】
【図21-1】
【図21-2】
【図21-3】
【図22-1】
【図22-2】
【図23-1】
【図23-2】
【図23-3】
【図23-4】
【図23-5】
【図23-6】
【図23-7】
【図23-8】
【図23-9】
【図24】
【外国語明細書】