特開 2024-28651 原発性線毛機能不全症の治療のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024028651

(43)【公開日】2024-03-04

(54)【発明の名称】原発性線毛機能不全症の治療のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20240226BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 15/88 20060101ALN20240226BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240226BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61P11/00

A61P11/02

A61P27/16

A61P29/00

A61P15/00

A61K31/7105

C12N15/88 Z ZNA

C12N15/12

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024010105

(22)【出願日】2024-01-26

(62)【分割の表示】P 2021539435の分割

【原出願日】2020-01-07

(31)【優先権主張番号】62/789,414

(32)【優先日】2019-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】517316797

【氏名又は名称】トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アヌシャ ディアス

(72)【発明者】

【氏名】ダーシャン パレク

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー エス． ドゥビンス

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン コバー

(72)【発明者】

【氏名】シュリラング カーブ

(72)【発明者】

【氏名】ザルナ パテル

(72)【発明者】

【氏名】サラ ジェイ． ドゥナジ

(72)【発明者】

【氏名】フランク デローサ

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ハートレイン

(57)【要約】

【課題】原発性線毛機能不全症の治療のための組成物および方法の提供。
【解決手段】本発明は、特に、ｍＲＮＡ療法に基づいて原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）を治療するための方法および組成物を提供する。ＰＣＤの治療に使用される組成物は、ダイニン軸糸重鎖５（ＤＮＡＨ５）コード配列を含むｍＲＮＡを含み、ＰＣＤの少なくとも一つの症状もしくは特徴が、強度、重篤度、または頻度において低下する、または発症が遅延するような有効用量および投与間隔で投与される。最適化されたＤＮＡＨ５コード配列を有するｍＲＮＡが提供され、ｍＲＮＡのヌクレオチドを改変することなく投与して、インビボでの持続的な機能を達成することができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／７８９，４１４号に対するその利益および優先権を主張するものであり、該仮特許出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

配列表の参照による組み込み
２０２０年１月６日に作成され、サイズが５０４ＫＢである「ＭＲＴ－２０６０ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のテクストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）は、気道、生殖器系、ならびに他の器官および組織の内層に見られる、異常な繊毛および鞭毛を特徴とする自己劣性障害である。ＰＣＤは、約１６，０００人中１人に生じる。症状は、早ければ出生時から呼吸障害が現れ、罹患者は、幼児期から頻繁に呼吸器感染症を発症する。ＰＣＤ患者は、年間を通して鼻づまりと慢性的な咳も見られる。慢性呼吸器感染症は、気管支と呼ばれる通路を損傷させる気管支拡張症と呼ばれる状態をもたらし、生命を脅かす呼吸障害を引き起こす可能性がある。ＰＣＤ患者の中には、不妊症、再発性耳感染症、胸部と腹部の臓器の異常配置を有する人もいる。

【0004】

ＤＮＡＨ１またはＤＮＡＨ５遺伝子の変異は、原発性線毛機能不全症の全症例の約三分の一を占める。ＤＮＡＨ５遺伝子は、繊毛の内部構造を形成するダイニン軸糸重鎖５をコードする。ダイニン軸糸重鎖５の欠損または異常により、繊毛の欠陥は、肺から流体、細菌、および粒子を排除するために必要な力および動きを生み出すことができない。繊毛の動きはまた、胚の発生時に左右の軸を確立し、精子細胞をメスの卵細胞に向かって前進させるのに役立つ。

【0005】

現在、ＰＣＤに対する治療法はない。現行の標準治療には、粘液の排出を高めるための積極的な措置、および気道の細菌感染に対する抗生物質療法が含まれる。呼吸器感染症および他の二次的合併症を防ぐために、定期的な免疫付与が行われる。一部の患者については、肺葉切除、肺移植、および副鼻腔手術が考慮される。遺伝子治療は、ＰＣＤの新しいより効果的な治療の緊急の必要性に応えるために研究されてきた。しかしながら、ＤＮＡＨ５のサイズが大きいため、従来の遺伝子治療法は依然として困難である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、特に、原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）の治療に使用するための方法および組成物を提供する。本発明は、部分的には、およそ１４ｋｂの長さのＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡがリポソームに首尾よく封入され、インビボで標的組織に効果的に送達され得るという驚くべき発見に基づく。

【0007】

一部の態様では、本発明は、タンパク質またはペプチドをコードする１０ｋｂ以上のｍＲＮＡを、送達を必要とする対象に投与することを含む、インビボでタンパク質またはペプチドをコードする１０ｋｂ以上のｍＲＮＡの送達方法を提供する。一部の実施形態では、１０ｋｂ以上のｍＲＮＡはリポソーム内に封入される。一部の実施形態では、１０ｋｂ以上のｍＲＮＡは、１１ｋｂ以上の長さである。一部の実施形態では、１０ｋｂ以上のｍＲＮＡは、１２ｋｂ以上の長さである。一部の実施形態では、１０ｋｂ以上のｍＲＮＡは、１３ｋｂ以上の長さである。一部の実施形態では、１０ｋｂ以上のｍＲＮＡは、１４ｋｂ以上の長さである。

【0008】

一部の態様では、本発明は、ヒトＤＮＡＨ５タンパク質をコードするｍＲＮＡを、送達を必要とする対象に投与することを含む、インビボでのヒト軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）の送達方法を提供する。一部の実施形態では、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡはリポソーム内に封入される。

【0009】

一部の態様では、本発明は、治療を必要とする対象に対し、ヒト軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）をコードするｍＲＮＡを、ＰＣＤの少なくとも一つの症状または特徴が、強度、重篤度または頻度において低下する、またはその発生が遅延するような有効用量および投与間隔で投与することを含む、原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）を治療する方法を提供する。

【0010】

一部の実施形態では、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡはリポソーム内に封入される。

【0011】

一部の実施形態では、リポソームは、一種または複数のカチオン性脂質、一種または複数の非カチオン性脂質、および一種または複数のＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0012】

一部の実施形態では、一種または複数のカチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＯＦ－０２、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾールベース）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＤＬｉｎＳＳＤＭＡ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２４）、ｃｃＢｅｎｅ、ＭＬ７ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0013】

一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＩＣＥである。

【0014】

一部の実施形態では、一種または複数の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））またはそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＥである。

【0015】

一部の実施形態では、一種または複数のＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ６－Ｃ２０長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。

【0016】

一部の実施形態では、カチオン性脂質は、モル比でリポソームの約３０～６０％を構成する。

【0017】

一部の実施形態では、カチオン性脂質は、モル比でリポソームの約３０％、４０％、５０％、または６０％を構成する。

【0018】

一部の実施形態では、リポソームはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。

【0019】

一部の実施形態では、リポソームは約８０ｎｍ～２００ｎｍのサイズを有し、任意に、リポソームは約１００ｎｍまたは１００ｎｍ未満のサイズを有する。

【0020】

一部の実施形態では、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡはコドン最適化されている。

【0021】

一部の実施形態では、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡは、一個または複数の修飾ヌクレオチドを含む。

【0022】

一部の実施形態では、当該一個または複数の修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン、Ｎ－１－メチル－シュードウリジン、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および／または２－チオシチジンから選択される。

【0023】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されていない。

【0024】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２または配列番号３に記載の配列を有する、５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む。

【0025】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４または配列番号５に記載の配列を有する、３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。

【0026】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６～配列番号３１のうちのいずれか一つに対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６～配列番号３１のうちのいずれか一つに対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６～配列番号３１のうちのいずれか一つに対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６～配列番号３１のうちのいずれか一つに対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６～配列番号３１のうちのいずれか一つに対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６～配列番号３１に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６～配列番号３１に記載のコード配列を含む。

【0027】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６に記載のコード配列を含む。

【0028】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７に記載のコード配列を含む。

【0029】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８に記載のコード配列を含む。

【0030】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に記載のコード配列を含む。

【0031】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１０に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１０に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１０に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１０に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１０に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１０に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１０に記載のコード配列を含む。

【0032】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１に記載のコード配列を含む。

【0033】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１２に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１２に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１２に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１２に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１２に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１２に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１２に記載のコード配列を含む。

【0034】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１３に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１３に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１３に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１３に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１３に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１３に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１３に記載のコード配列を含む。

【0035】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１４に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１４に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１４に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１４に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１４に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１４に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１４に記載のコード配列を含む。

【0036】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１５に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１５に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１５に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１５に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１５に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１５に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１５に記載のコード配列を含む。

【0037】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１６に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１６に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１６に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１６に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１６に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１６に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１６に記載のコード配列を含む。

【0038】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１７に記載のコード配列を含む。

【0039】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１８に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１８に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１８に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１８に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１８に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１８に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１８に記載のコード配列を含む。

【0040】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１９に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１９に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１９に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１９に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１９に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１９に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１９に記載のコード配列を含む。

【0041】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２０に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２０に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２０に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２０に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２０に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２０に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２０に記載のコード配列を含む。

【0042】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２１に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２１に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２１に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２１に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２１に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２１に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２１に記載のコード配列を含む。

【0043】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２２に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２２に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２２に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２２に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２２に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２２に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２２に記載のコード配列を含む。

【0044】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２３に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２３に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２３に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２３に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２３に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２３に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２３に記載のコード配列を含む。

【0045】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２４に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２４に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２４に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２４に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２４に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２４に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２４に記載のコード配列を含む。

【0046】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５に記載のコード配列を含む。

【0047】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２６に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２６に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２６に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２６に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２６に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２６に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２６に記載のコード配列を含む。

【0048】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２７に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２７に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２７に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２７に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２７に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２７に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２７に記載のコード配列を含む。

【0049】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２８に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２８に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２８に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２８に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２８に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２８に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２８に記載のコード配列を含む。

【0050】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２９に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２９に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２９に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２９に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２９に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２９に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２９に記載のコード配列を含む。

【0051】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３０に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３０に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３０に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３０に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３０に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３０に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３０に記載のコード配列を含む。

【0052】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３１に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３１に対し、少なくとも７０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３１に対し、少なくとも８０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３１に対し、少なくとも９０％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３１に対し、少なくとも９５％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３１に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３１に記載のコード配列を含む。

【0053】

一部の実施形態では、対象へのｍＲＮＡの投与は、気管内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、または皮下送達によって行われる。

【0054】

一部の実施形態では、対象へのｍＲＮＡの投与は、気管内送達によって行われる。

【0055】

一部の実施形態では、対象へのｍＲＮＡの投与は、鼻腔内送達によって行われる。

【0056】

一部の実施形態では、対象へのｍＲＮＡの投与は、エアロゾル送達によって行われる。

【0057】

一部の実施形態では、対象へのｍＲＮＡの投与は、噴霧送達によって行われる。

【0058】

一部の実施形態では、対象へのｍＲＮＡの投与は、乾燥粉末吸入によって行われる。

【0059】

一部の実施形態では、組成物は、週に一回投与される。

【0060】

一部の実施形態では、組成物は、二週間に一回投与される。

【0061】

一部の実施形態では、組成物は、月に二回投与される。

【0062】

一部の実施形態では、組成物は、月に一回投与される。

【0063】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡの投与は、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、脳、胃、腸、卵巣、および精巣から選択される一つまたは複数の内臓において検出可能なＤＮＡＨ５タンパク質発現をもたらす。

【0064】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡの投与は、肺内で検出可能なＤＮＡＨ５タンパク質発現をもたらす。

【0065】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡの投与は、肺上皮内で検出可能なＤＮＡＨ５タンパク質発現をもたらす。

【0066】

一部の態様では、本発明は、原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）の治療に使用するための組成物を提供し、組成物は、リポソームに封入されたヒト軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）をコードするｍＲＮＡを含み、リポソームは、一つまたは複数のカチオン性脂質、一つまたは複数の非カチオン性脂質、および一つまたは複数のＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0067】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６～配列番号３１のうちのいずれか一つに対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一のＤＮＡＨ５コード配列を含む。

【0068】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６に対し、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７に対し、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のコード配列を含む。

【0069】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６に記載のコード配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７に記載のコード配列を含む。

【0070】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２または配列番号３に記載される配列を有する５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と、配列番号４または配列番号５に記載される配列を有する３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）とを有する。

【0071】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、一つまたは複数の修飾ヌクレオチドを有する。

【0072】

一部の実施形態では、一つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン、Ｎ－１－メチル－シュードウリジン、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および／または２－チオシチジンから選択される。

【0073】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されていない。

【0074】

一部の実施形態では、リポソームは、直径１００ｎｍ以下である。

【0075】

一部の実施形態では、本発明は、上述の組成物および好適な賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。

【0076】

一部の態様では、本発明は、タンパク質またはペプチドをインビボでコードするｍＲＮＡの送達方法であって、タンパク質またはペプチドをコードし、配列番号２に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一で、配列番号３ではない配列を有する５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を有するｍＲＮＡの送達を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２に対し、少なくとも７０％同一で、配列番号３ではない配列を有する、５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２に対し、少なくとも７５％同一で、配列番号３ではない配列を有する、５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２に対し、少なくとも８０％同一で、配列番号３ではない配列を有する、５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２に対し、少なくとも８５％同一で、配列番号３ではない配列を有する、５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２に対し、少なくとも９０％同一で、配列番号３ではない配列を有する、５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２に対し、少なくとも９５％同一で、配列番号３ではない配列を有する、５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２に対し、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一で、配列番号３ではない、５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２に記載の５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む。本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すが、単に例示のために与えられるものであり、制限するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者には明らかになるであろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒトＤＮＡＨ５タンパク質をコードするｍＲＮＡを、送達を必要とする対象に投与することを含む、インビボでのヒト軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）の送達方法。
（項目２）
治療を必要とする対象に対し、ヒト軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）をコードするｍＲＮＡを、ＰＣＤの少なくとも一つの症状または特徴が、強度、重篤度または頻度において低下する、またはその発生が遅延するような有効用量および投与間隔で投与することを含む、原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）を治療する方法。
（項目３）
前記ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡがリポソームに封入されている、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記リポソームは、一種または複数のカチオン性脂質、一種または複数の非カチオン性脂質、および一種または複数のＰＥＧ修飾脂質を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記一種または複数のカチオン性脂質が、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＯＦ－０２、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾールベース）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＤＬｉｎＳＳＤＭＡ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２４）、ｃｃＢｅｎｅ、ＭＬ７およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記カチオン性脂質がＩＣＥである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記一種または複数の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））、またはそれらの組み合わせから選択される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記一種または複数のＰＥＧ修飾脂質が、Ｃ_６－Ｃ_２０長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した長さ最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目４～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記カチオン性脂質が、モル比で前記リポソームの約３０～６０％を構成する、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記カチオン性脂質が、モル比で前記リポソームの約３０％、４０％、５０％、または６０％を構成する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記リポソームが、ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記リポソームが約８０ｎｍ～２００ｎｍの直径を有し、任意選択的に、前記リポソームが約１００ｎｍまたは１００ｎｍ未満の直径を有する、項目３～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡが、コドン最適化されている、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡが一つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記一個または複数の修飾ヌクレオチドが、シュードウリジン、Ｎ－１－メチル－シュードウリジン、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および／または２－チオシチジンから選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ｍＲＮＡは修飾されない、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記ｍＲＮＡは、配列番号２または３に記載の配列を有する、５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記ｍＲＮＡは、配列番号４または５に記載の配列を有する、３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記ｍＲＮＡが、配列番号６～配列番号３１のうちのいずれか一つに対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるコード配列を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ｍＲＮＡが、配列番号６～配列番号３１に対し、少なくとも７０％同一であるコード配列を含む、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記ｍＲＮＡが、配列番号６～配列番号３１に対し、少なくとも８０％同一であるコード配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記ｍＲＮＡが、配列番号６～配列番号３１に対し、少なくとも９０％同一であるコード配列を含む、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記ｍＲＮＡが、配列番号６～配列番号３１に対し、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるコード配列を含む、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記ｍＲＮＡが、配列番号６～配列番号３１に記載のコード配列を含む、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記対象への前記ｍＲＮＡの投与が、気管内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、または皮下送達によって行われる、項目１～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記対象への前記ｍＲＮＡの投与が、気管内送達によって行われる、項目１～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記対象への前記ｍＲＮＡの投与が、鼻腔内送達によって行われる、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記組成物は一日に一回投与される、項目１～２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記組成物は週に一回投与される、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記組成物は二週間に一回投与される、項目１～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記組成物は一か月に二回投与される、項目１～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記組成物は一か月に一回投与される、項目１～３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記ｍＲＮＡの投与が、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、脳、胃、腸、卵巣、および精巣から選択される一つまたは複数の内臓において検出可能なＤＮＡＨ５タンパク質発現をもたらす、項目１～３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記ｍＲＮＡの投与が、肺内で検出可能なＤＮＡＨ５タンパク質発現をもたらす、項目１～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記ｍＲＮＡの投与が、肺上皮内で検出可能なＤＮＡＨ５タンパク質発現をもたらす、項目１～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）の治療に使用するための組成物であって、前記組成物が、リポソームに封入されたヒト軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）をコードするｍＲＮＡを含み、前記リポソームが、一つまたは複数のカチオン性脂質、一つまたは複数の非カチオン性脂質、および一つまたは複数のＰＥＧ修飾脂質を含む、組成物。
（項目３７）
前記ｍＲＮＡが、配列番号６～配列番号３１のうちのいずれか一つに対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるコード配列を含む、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
前記ｍＲＮＡが、配列番号６～配列番号３１に対し、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一であるコード配列を含む、項目３６または３７に記載の組成物。
（項目３９）
前記ｍＲＮＡが、配列番号６～配列番号３１に記載のコード配列を含む、項目３６～３８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４０）
前記ｍＲＮＡが、配列番号２に記載される配列を有する５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、および配列番号４または配列番号５に記載される配列を有する３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を有する、項目３６～３９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４１）
前記ｍＲＮＡが、一個または複数の修飾ヌクレオチドを有する、項目３６～３９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４２）
前記修飾された一個または複数のヌクレオチドが、シュードウリジン、Ｎ－１－メチル－シュードウリジン、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および／または２－チオシチジンから選択される、項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
前記ｍＲＮＡが修飾されていない、項目３６～４２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４４）
前記リポソームが直径１００ｎｍ以下である、項目３６～４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４５）
一種または複数のカチオン性脂質が、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＯＦ－０２、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾールベース）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＤＬｉｎＳＳＤＭＡ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２４）、ｃｃＢｅｎｅ、ＭＬ７およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目３６～４４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４６）
前記カチオン性脂質がＩＣＥである、項目３６～４５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４７）
前記一種または複数の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））、またはそれらの組み合わせから選択される、項目３６～４６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４８）
前記非カチオン性脂質がＤＯＰＥである、項目３６～４７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４９）
前記一種または複数のＰＥＧ修飾脂質が、Ｃ_６－Ｃ_２０長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した長さ最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目３６～４８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５０）
項目３６～４９のいずれか一項に記載の組成物および好適な賦形剤を含む、医薬組成物。

【0077】

図面は、単に例示を目的とするものであり、制限するためのものではない。

【図面の簡単な説明】

【0078】

【図1A】図１Ａは、ｍＲＮＡ投与後２４時間の定量ＰＣＲ分析（ｑＰＣＲ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のためのマウスの気管および肺の様々な部分の解剖および使用を示す概略図である。

【図1B】図１Ｂ（左）および（右）は、図に示されるように、呼吸系の異なる領域におけるｈＤＮＡ５ ｍＲＮＡのｑＰＣＲデータを示すグラフである。図１Ｂ（左）は、ＭＲＴ－１ ｈＤＮＡ５ ｍＲＮＡを投与された第１群のマウスのデータを示す。図１Ｂ（右）は、ＭＲＴ－１ ｈＤＮＡ５－ＧＦＰ ｍＲＮＡを投与された第２群のマウスのデータを示す。

【0079】

【図2A】図２Ａおよび図２Ｂは、呼吸気道におけるｈＤＮＡタンパク質発現に関するＩＨＣ分析の結果を示す一連の顕微鏡写真を示す。図２Ａは、生理食塩水で処置された対照と比較した、ＭＲＴ－１ ｈＤＮＡ５ ｍＲＮＡで処置されたマウスにおけるｈＤＮＡ－５ タンパク質染色の代表的なＩＨＣデータを示し（第１群、左）、生理食塩水で処置された対照と比較した、ＭＲＴ－１ ｈＤＮＡ５－ＧＦＰ ｍＲＮＡで処置されたマウスにおけるＧＦＰタンパク質染色のＩＨＣデータを示す（第２群、右）。

【図2B】図２Ｂは、第１群（上部パネル）および第２群（下部パネル）のマウスの気道の上皮組織における、それぞれのｈＤＮＡ５ ｍＲＮＡ由来タンパク質の詳細な局在化を示す。

【発明を実施するための形態】

【0080】

定義
本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語が以下で最初に定義される。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して記載される。本発明の背景を説明し、かつその実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物および他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0081】

アルキル：本明細書において使用される場合、「アルキル」とは、１～１５個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基のラジカルを指す（「Ｃ１－１５アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１～３個の炭素原子を有する（「Ｃ１－３アルキル」）。Ｃ１－３アルキル基の例としては、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、ｎ－プロピル（Ｃ３）、およびイソプロピル（Ｃ３）が挙げられる。一部の実施形態では、アルキル基は、８～１２個の炭素原子を有する（「Ｃ８－１２アルキル」）。Ｃ８－１２アルキル基の例としては、限定されないが、ｎ－オクチル（Ｃ８）、ｎ－ノニル（Ｃ９）、ｎ－デシル（Ｃ１０）、ｎ－ウンデシル（Ｃ１１）、ｎ－ドデシル（Ｃ１２）などが挙げられる。接頭辞の「ｎ－」（直鎖状）とは、非分枝状アルキル基を指す。たとえば、ｎ－Ｃ８アルキルとは、（ＣＨ２）７ＣＨ３を指し、ｎ－Ｃ１０アルキルとは、（ＣＨ２）９ＣＨ３を指すなどである。

【0082】

アミノ酸：本明細書で使用される際に、「アミノ酸」という用語は、その最も広い意味で、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然に生じるアミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり、一部の実施形態では、アミノ酸はＤ－アミノ酸であり、一部の実施形態では、アミノ酸はＬ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に生じたペプチドに通常見られる２０個の標準Ｌ－アミノ酸のうちのいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、合成的に調製されるか天然源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミド等）、および／または置換を含むが、これらに限定されない化学修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチド中のカルボキシ末端アミノ酸および／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および／またはそれらの活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変化させることができる他の化学基との置換によって修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与し得る。アミノ酸は、一つまたは複数の翻訳後修飾、例えば、一つまたは複数の化学物質（例えば、メチル基、塩酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分等）との会合を含み得る。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸および／またはペプチドのアミノ酸残基を指し得る。この用語が遊離アミノ酸を指すか、ペプチドの残基を指すかは、それが使用される文脈から明らかになる。

【0083】

動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」とは、任意の発育段階のヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」とは、任意の発育段階の非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、魚、昆虫、および／または寄生虫が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであり得る。

【0084】

およそまたは約：本明細書で使用される場合、目的とする一つまたは複数の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、提示される参照値と同様の値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別途提示されない限り、または文脈から明らかではない限り（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、提示される参照値のいずれか（それよりも大きいまたは小さい）の方向で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に収まる値の範囲を指す。典型的には、用語「およそ」または「約」は、記載された参照値の１０％以内、またはより典型的には１％以内の値の範囲を指す。

【0085】

生物学的に活性：本明細書で使用される「生物学的に活性である」という句は、生物系において、特に生命体において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生命体に投与された時に、その生命体に対して生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると考えられる。

【0086】

コドン最適化：本明細書で使用される場合、この用語は、天然に存在する核酸配列（野生型」配列とも呼ぶ）中に存在する一つまたは複数のヌクレオチドが、代替ヌクレオチドで置換され、天然に存在する核酸配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更することなく、タンパク質発現を最適化した核酸を表す。例えば、コドンＡＡＡは、コードされたアミノ酸（リシン）の同一性を変化させることなく、ＡＡＧとなるように改変されてもよい。一部の実施形態では、本発明の核酸は、核酸によってコードされるタンパク質のタンパク質発現を増加させるようにコドン最適化される。本出願の目的のために、核酸塩基のチミジン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、ｍＲＮＡ配列のナレーションにおいて互換的に使用される。

【0087】

送達：本明細書で使用される際に、「送達」という用語は、局所送達および全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そしてその標的組織内で保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも称される）、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そして患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、そして全身に分布され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも称される）を包含する。

【0088】

投与間隔：本明細書で使用される場合、疾患の治療方法の文脈における投与間隔とは、少なくとも投与間隔の期間中、疾患に関連する一つまたは複数の症状が低減されるように、または疾患に関連する一つまたは複数のバイオマーカーが低減されるように、例えばｍＲＮＡ組成物などの治療用組成物を、それを必要とする対象（哺乳動物）に、ｍＲＮＡの有効用量で投与する頻度のことである。投与頻度および投与間隔は、本開示において互換的に使用され得る。

【0089】

発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳、複数のポリペプチドのインタクトなタンパク質（例えば、酵素）への集合、および／またはポリペプチドもしくは完全に集合したタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾を指す。本出願では、「発現」および「産生」という用語、ならびに文法的同義語は、互換的に使用される。

【0090】

有効用量：本明細書で使用される場合、有効用量とは、医薬組成物中のｍＲＮＡの用量であり、それを必要とする対象に投与した時、本発明の方法によれば、それによって哺乳動物対象は、例えば、疾患に関連する症状が低減するなど、対象に期待される結果をもたらすのに有効である。

【0091】

機能性：本明細書で使用される場合、「機能性」生体分子は、それが特徴付けられる特性および／または活性を呈する形態での生体分子である。

【0092】

半減期：本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、核酸またはタンパク質濃度または活性等の量が、ある期間の最初に測定されたその値の半分に下がるのに必要な時間である。

【0093】

改善する、増加させる、または減少させる：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加させる」、もしくは「減少させる」、または文法的同義語は、ベースライン測定、例えば、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体における測定、または本明細書に記載の治療の不在下での対照対象（または複数の対照対象）における測定と比較した値を示す。「対照対象」とは、治療されている対象と同じ疾患形態に罹患しており、治療されている対象とほぼ同じ年齢の対象である。

【0094】

インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工環境下で、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養下等で生じる事象を指す。

【0095】

インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物等の多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースの系との関連で、この用語は、（例えば、インビトロ系とは対照的に）生きている細胞内で生じる事象を指すために使用され得る。

【0096】

単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（１）（自然界および／または実験的環境かにかかわらず）最初に産生されたときに会合していた成分のうちの少なくともいくつかから分離しており、かつ／または（２）人工的に産生、調製、および／または製造された物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、それらが最初に会合していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離され得る。一部の実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質および／または実体の純度パーセントの計算は、賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水等）を含むべきではない。

【0097】

局所分布または局所送達：本明細書において使用される場合、「局所分布」、「局所送達」という用語、または文法的等価物は、組織特異的な送達または分布を指す。典型的には、局所分布または局所送達は、細胞内で翻訳および発現される、または分泌が限定的で、患者の循環系へ入ることを回避する、ｍＲＮＡにコードされるタンパク質（たとえば酵素）を必要とする。

【0098】

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも一つのポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドを指す。ｍＲＮＡは、一つまたは複数のコード領域および非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、天然の供給源から精製されてもよく、組換え発現系を使用して作製されてもよく、および任意で精製されてもよく、インビトロで転写されてもよく、化学的に合成されてもよい。ｍＲＮＡ配列は、別途指示されない限り、５’から３’の方向に提示される。典型的には、本発明のｍＲＮＡは、修飾を有さないアデノシン、グアノシン、シチジン、およびウリジンヌクレオチドから合成される。かかるｍＲＮＡは、本明細書において、非修飾ヌクレオチドを有するｍＲＮＡ、または略して「非修飾ｍＲＮＡ」と呼称される。典型的には、これは、本発明のｍＲＮＡが、以下のヌクレオシド類似体：２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジンのいずれも含まないことを意味する。請求項に記載の発明を実施するのに適したｍＲＮＡは、一般に、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、インターカレート塩基、修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）を含む、ヌクレオシドを含まない。

【0099】

核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、その最も広範な意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る化合物および／または物質である。一部の実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。

【0100】

患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、例えば、実験、診断、予防、美容、および／または治療目的のために、提供される組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒト等の哺乳動物）が含まれる。一部の実施形態では、患者は、ヒトである。ヒトには、出生前形態および出生後形態が含まれる。

【0101】

医薬的に許容される：本明細書で使用される際に、用語「医薬的に許容される」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、炎症刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的なベネフィット／リスクの比率に相応で、ヒトおよび動物の組織に接触させて使用することに適した物質を指す。

【0102】

薬学的に許容可能な塩：薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、薬学的に許容可能な塩についてＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１－１９で詳述している。本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩には、好適な無機酸および有機酸ならびに無機塩基および有機塩基に由来するものが含まれる。薬学的に許容可能な非毒性酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸等の無機酸と形成されるか、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸等の有機酸と形成されるか、またはイオン交換等の当該技術分野で使用されている他の方法を使用して形成されたアミノ基の塩である。他の薬学的に許容可能な塩として、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基に由来する塩には、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、およびＮ＋（Ｃ１－４アルキル）４塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等が挙げられる。さらなる薬学的に許容可能な塩には、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩、およびアリールスルホン酸塩等の対イオンを使用して形成された非毒性アンモニウムカチオン、四級アンモニウムカチオン、およびアミンカチオンが挙げられる。さらなる薬学的に許容可能な塩には、適切な求電子剤、例えば、ハロゲン化アルキルを使用して四級化アルキル化アミノ塩を形成する、アミンの四級化から形成された塩が挙げられる。

【0103】

全身分布または送達：本明細書で使用される場合、「全身分布」、「全身送達」という用語、または文法的同義語は、全身または全生物に影響を及ぼす送達または分布機構またはアプローチを指す。典型的には、全身分布または全身送達は、身体の循環系、例えば、血流を介して成し遂げられる。「局所分布または送達」の定義と比較される。

【0104】

対象：本明細書で使用される際に、用語「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトには、出生前形態および出生後形態が含まれる。多くの実施形態では、対象は、ヒトである。対象は、患者であり得る。疾患の診断または治療のために医療提供者に受診するヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書では「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患または障害に罹患している場合があるか、またはそれに罹り易いが、疾患または障害の症状を呈する場合も呈さない場合もある。

【0105】

実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的とする特徴または特性の全てまたはほぼ全ての範囲または程度を呈する質的状態を指す。生物学技術分野の当業者であれば、生物学的および化学的現象が、完了すること、および／または完了に至ること、または絶対的結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解する。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捕捉するために本明細書で使用される。

【0106】

標的組織：本明細書で使用される場合、「標的組織」という用語は、治療される疾患に罹患している任意の組織を指す。一部の実施形態では、標的組織には、疾患に関連する病態、症状、または特徴を呈する組織が含まれる。

【0107】

治療有効量：本明細書で使用される場合、治療薬の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、および／または状態に罹患しているか、またはそれに罹り易い対象に投与されたときに、疾患、障害、および／または状態の症状を治療する、診断する、予防する、および／またはその発症を遅延させるのに十分な量を意味する。当業者であれば、治療有効量が、典型的には、少なくとも一つの単位用量を含む投薬レジメンにより投与されることを理解する。

【0108】

治療すること：本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態の一つまたは複数の症状または特徴を部分的にまたは完全に緩和する、改善する、軽減する、抑制する、予防、その発症を遅延させる、その重症度を低下させる、および／またはその発生率を低下させるために使用される任意の方法を指す。治療は、疾患の兆候を呈していない対象および／または疾患の初期の兆候のみを呈している対象に、その疾患に関連する病態を発症させるリスクを減少させる目的のために投与され得る。

【0109】

本発明の様々な態様が、以下のセクションで詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、別段の記述がない限り、「および／または」を意味する。

【0110】

原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）
原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）は、気道、生殖器系、ならびに他の器官および組織の内層に見られる、異常な繊毛および鞭毛を特徴とする常染色体劣性障害である。繊毛の内部構造を形成するダイニン軸糸重鎖５タンパク質をコードする、ＤＮＡＨ５遺伝子における変異は、ＰＣＤを引き起こす。ＰＣＤ患者では、ＤＮＡＨ５遺伝子の８０種類以上の変異が特定されている。

【0111】

ＤＮＡＨ５遺伝子の変異は、繊毛の適切な機能に必要なダイニン軸糸重鎖５の欠如または異常をもたらす。ダイニン軸糸重鎖５の正常なバージョンなしでは、繊毛の欠陥は、肺から流体、細菌、および粒子を排除し、胚の発生時に左右の軸を確立し、精子細胞を前進させるのに必要な力および動きを生み出すことができない。ＰＣＤは、慢性呼吸器感染症、気管支拡張症、年間を通しての鼻づまり、胸部および腹部の臓器の異常配置、ならびに不妊症を引き起こす可能性がある。

【0112】

本開示のポリリボヌクレオチドは、例えば、原発性線毛機能不全症、またはその機能が繊毛の維持および機能に関連する遺伝子の欠陥または機能不全に関連する他の任意の状態を有するか、または有するリスクのある対象を、治療するために使用することができる。原発性線毛機能不全症と関連している遺伝子の非限定的な例には、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）、コイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）、サイクリンＯ（ＣＣＮＯ）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）、ダイニン軸糸重鎖１１（ＤＮＡＨｌ ｌ）、ダイニン軸糸重鎖５（ＤＮＡＨ５）、ダイニン軸糸重鎖６（ＤＮＡＨ６）、ダイニン軸糸重鎖８（ＤＮＡＨ８）、ダイニン軸糸中間鎖２（ＤＮＡＩ２）、ダイニン軸糸軽鎖１（ＤＮＡＬｌ）、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）、ディスレクシア感受性１候補１（ＤＹＸ１Ｃ１）、成長停止特異的８（ＧＡＳ８）、軸糸中央対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）、ロイシンリッチリピート含有６（ＬＲＲＣ６）、ＭＥ／Ｍ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）、口腔顔面デジタル症候群１（ＯＦＤ１）、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＰＧＲ）、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ１）、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ４Ａ）、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ９）、精子関連抗原ｌ（ＳＰＡＧｌ）、およびジンクフィンガーＭＹ Ｄタイプ含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）が含まれる。

【0113】

ダイニン軸糸重鎖５（ＤＮＡＨ５）遺伝子およびタンパク質配列
一部の実施形態では、本発明は、ＰＣＤの治療を目的とした、コードするｍＲＮＡを対象に送達するための方法および組成物を提供する。適切なＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡは、天然型ＤＮＡＨ５タンパク質の活性の代わりに機能することができ、および／またはＰＣＤと関連した一つまたは複数の症状の強度、重篤度、および／または頻度を低下させることができるＤＮＡＨ５タンパク質のいずれか全長、断片、または一部をコードする。

【0114】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、ヒトＤＮＡＨ５タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列である。天然型ヒトＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡコード配列、およびその対応するアミノ酸配列を表１に示す：

【0115】

天然型ヒトＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡコード配列、およびその対応するアミノ酸配列を表１に示す：

【表1-1】

【表1-2】

【0116】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、野生型のヒトＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの配列である。一部の実施形態では、適切な治療候補ｍＲＮＡは、配列番号１として表１に示されるＤＮＡＨ５アミノ酸配列、または配列番号１に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列をコードすることができるコドン最適化ｈＤＮＡＨ５配列である。一部の実施形態では、本発明によるｍＲＮＡは、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有するＤＮＡＨ５タンパク質をコードする。

【0117】

コドン最適化
増加する研究によると、ｍＲＮＡはアミノ酸コードと重複する多数の層の情報を含んでいる。従来、コドン最適化は、タンパク質発現の律速であると考えられていた希少なコドンを除去するために使用されてきた。急速に成長する細菌および酵母はどちらも、高度に発現する遺伝子で強いコドンバイアスを呈するが、高等真核生物は、はるかに少ないコドンバイアスを呈し、律速となり得るコドンを識別することをより困難にする。加えて、コドンバイアス自体は必ずしも高い発現をもたらすとは限らず、他の特徴を必要とすることが見出されている。

【0118】

例えば、希少なコドンは、翻訳の速度を遅くし、正しいタンパク質の折り畳みに必要となる可能性のある、一時停止部位を形成することに関与している。したがって、コドン使用における変化は、伸長の時間パターンを微調整するメカニズムを提供し、その結果、タンパク質がその正しい確認を行うのに利用可能な時間を増加させることができる。コドン最適化は、この微調整メカニズムに干渉し、結果として、効率の低いタンパク質翻訳または誤って折り畳まれたタンパク質の量の増加をもたらす可能性がある。同様に、コドン最適化は、同族およびウォブルｔＲＮＡ使用の通常のパターンを乱し、それによってタンパク質構造および機能に影響を与える場合がある。その理由は、ウォブルに依存した伸長の減速も同様に、正しいタンパク質の折り畳みを達成するためのメカニズムとして選択されている可能性があるからである。

【0119】

これらの障害にもかかわらず、発明者らは、野生型遺伝子のコード配列に比べて、ＤＮＡＨ５タンパク質の発現を少なくとも三倍改善する、コドン最適化ｈＤＮＡＨ５配列に到達した。発現の増加は、哺乳動物細胞の細胞培養に限定されないが、マウスモデルにおいてインビボで観察された。コドン最適化ＤＮＡＨ５コード配列の発現における改善が観察されると、ｍＲＮＡの調製のために修飾ヌクレオチドの使用を必要とせず、用量の削減および／または投与間隔の延長による治療が可能になるため、ＰＣＤに罹患している患者のためのｍＲＮＡ補充療法が改善され、より費用効果の高いものになることが期待される。

【0120】

コドン最適化ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡ配列の例
以下の配列は、選択された、例示的なコドン最適化ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡ配列を列挙する。

【0121】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号６において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0122】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号７において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0123】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号８において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0124】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号９において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0125】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号１０において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0126】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号１１において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0127】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号１２において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0128】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号１３において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0129】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号１４において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0130】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号１５において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0131】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号１６において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0132】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号１７において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0133】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号１８において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0134】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号１９において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0135】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号２０において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0136】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号２１において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0137】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号２２において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0138】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号２３において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0139】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号２４において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0140】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号２５において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0141】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号２６において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0142】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号２７において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0143】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号２８において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0144】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号２９において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0145】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号３０において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0146】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号３１において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。

【0147】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、ヒトＤＮＡＨ５タンパク質のホモログまたは類似体のｍＲＮＡ配列であってもよい。たとえばヒトＤＮＡＨ５タンパク質のホモログまたは類似体は、実質的にＤＮＡＨ５タンパク質の活性を保持しながら、野生型または天然型のヒトＤＮＡＨ５タンパク質と比較して一つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む修飾ヒトＤＮＡＨ５タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号１に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＤＮＡＨ５タンパク質と実質的に同一であるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号１に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列をコードする。典型的には、本発明によるｍＲＮＡは、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有するＤＮＡＨ５タンパク質をコードする。

【0148】

一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＤＮＡＨ５タンパク質の断片または一部をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＤＮＡＨ５タンパク質の断片または一部をコードし、この場合において当該タンパク質の断片または一部は、野生型タンパク質と類似したＤＮＡＨ５活性をいまだ維持している。

【0149】

一部の実施形態では、好適なｍＲＮＡは、別のタンパク質に融合したＤＮＡＨ５タンパク質（例えばＮ末端またはＣ末端融合物）の全長、断片、または一部を含む融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＤＮＡＨ５タンパク質の全長、断片、または一部をコードするｍＲＮＡに融合したタンパク質は、シグナル配列または細胞標的化配列をコードする。

【0150】

一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、または配列番号３１に対し少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一のヌクレオチド配列を含む。より一般的には、本発明によるｍＲＮＡは、配列番号６に対し少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。本発明によるｍＲＮＡは、配列番号７に対し少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を含む。

【0151】

本発明によるメッセンジャーＲＮＡは、様々な公知の方法のうちのいずれかに従って合成され得る。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成され得る。簡潔には、ＩＶＴは、典型的には、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、および適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）を含む線状または環状ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて行われる。正確な条件は、特定の用途により異なる。

【0152】

一部の実施形態では、本発明によるｍＲＮＡの調製のために、ＤＮＡ鋳型がインビトロで転写される。好適なＤＮＡ鋳型は、典型的には、インビトロ転写のためのプロモーター、例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６プロモーター、続いて、所望のｍＲＮＡの所望のヌクレオチド配列および終結シグナルを有する。

【0153】

典型的には、本発明によるｍＲＮＡは、非修飾ｍＲＮＡとして合成される。したがって、本発明のｍＲＮＡは、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））を含む天然に生じるヌクレオチドから合成される。

【0154】

典型的には、ｍＲＮＡ合成は、Ｎ末端（５’）上への「キャップ」の付加、およびＣ末端（３’）上への「テール」の付加を含む。キャップの存在は、大半の真核細胞で見られるヌクレアーゼへの耐性を提供するのに重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。

【0155】

したがって一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（たとえば、ＤＮＡＨ５をコードするｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には、以下のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの一つを除去して二つの末端リン酸を残し、その後、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’５’５三リン酸結合をもたらし、その後、グアニンの７－窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例には、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、およびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。

【0156】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（たとえば、ＤＮＡＨ５をコードするｍＲＮＡ）は、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端上のポリ－Ａテールは、典型的には、約１０～８００個のアデノシンヌクレオチド（例えば、約３００～５００個のアデノシンヌクレオチド、約３００～８００個のアデノシンヌクレオチド、約１０～５００個のアデノシンヌクレオチド、約１０～３００個のアデノシンヌクレオチド、約１０～２００個のアデノシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンヌクレオチド）を含む。典型的には、本発明によるｍＲＮＡ中のポリＡテールは、約３００～約８００アデノシンヌクレオチド長である。より一般的には、ポリＡテールは、約３００アデノシンヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）テール構造は、少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％のアデノシンを含む。

【0157】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端上の好適なポリ－Ｃテールは、典型的には、約１０～２００個のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～１５０個のシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のシトシンヌクレオチド、約２０～６０個のシトシンヌクレオチド、または約１０～４０個のシトシンヌクレオチド）を含む。ポリ－Ｃテールは、ポリ－Ａテールに付加され得るか、またはポリ－Ａテールの代わりになり得る。

【0158】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ヌクレオチド配列を含み、５’キャップ構造とコード配列の間に位置付けられた５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、および／またはヌクレオチド配列を含み、コード配列とポリ（Ａ）テール構造の間に位置付けられた３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）をさらに含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす要素、例えば、鉄応答性要素を一つまたは複数含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、約５０～５００ヌクレオチド長であり得る。

【0159】

一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞におけるｍＲＮＡの位置安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの一つまたは複数の結合部位のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、５０～５００ヌクレオチド長またはそれ以上であり得る。

【0160】

修飾ｍＲＮＡ
本発明によるｍＲＮＡは、典型的には、非修飾ｍＲＮＡとして合成される。一部の実施形態では、本発明のコドン最適化ＤＮＡＨ５コード配列をコードするｍＲＮＡを、一つまたは複数の修飾ヌクレオチドで合成することが有利であり得る。典型的には、ｍＲＮＡは、特に、裸のｍＲＮＡとして、または複合体形態で対象に投与される場合に、それらの安定性を高めるか、または免疫原性特性を低下させるように修飾される。したがって、本発明のコドン最適化ＤＮＡＨ５コード配列をコードするｍＲＮＡを提供することは、相乗効果を有し得、その結果、未修飾ｍＲＮＡで観察されたものを超える持続的なインビボ機能をもたらす。

【0161】

ｍＲＮＡの修飾は、たとえばＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。本発明による修飾ｍＲＮＡは、従って、例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））を含むが、これらに限定されない天然に存在するヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成され得、かつプリンおよびピリミジンの修飾ヌクレオチド類似体または誘導体、例えば、１－メチル－アデニン、２－メチル－アデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、プソイドウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－プソイドウラシル、クエオシン、ベータ－Ｄ－マンノシル－クエオシン、ワイブトキソシン、およびホスホロアミダイト、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシン、およびイノシン等として合成され得る。こうした類似体の調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、および同第５，７００，６４２号から当業者に公知であり、これらの開示は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

【0162】

一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、ＲＮＡ骨格修飾を含み得る。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩が化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾には、典型的には、メチルホスホネート、メチルホスホロアミダイト、ホスホロアミダイト、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’－Ｏ－（１－チオホスフェート））、ボラノホスフェート、正荷電グアニジウム基等からなる群からの修飾が含まれるが、これらに限定されず、これは、ホスホジエステル結合を他のアニオン性基、カチオン性基、または中性基で置き換えることを意味する。

【0163】

一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、糖修飾を含み得る。典型的な糖修飾は、ヌクレオチドの糖の化学修飾であり、糖修飾として、以下に限定されないが、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミン－オリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン５’－三リン酸、２’－メチルウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびこれらの異性体（２’－アラシチジン５’－三リン酸、２’－アラウリジン５’－三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）からなる群から選択される糖修飾が挙げられる。

【0164】

一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、ヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含み得る。塩基修飾を含む修飾ヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも呼ばれる。かかる塩基修飾ヌクレオチドの例には、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド５’－三リン酸、２－アミノアデノシン５’－三リン酸、２－チオシチジン５’－三リン酸、２－チオウリジン５’－三リン酸、４－チオウリジン５’－三リン酸、５－アミノアリルシチジン５’－三リン酸、５－アミノアリルウリジン５’－三リン酸、５－ブロモシチジン５’－三リン酸、５－ブロモウリジン５’－三リン酸、５－ヨードシチジン５’－三リン酸、５－ヨードウリジン５’－三リン酸、５－メチルシチジン５’－三リン酸、５－メチルウリジン５’－三リン酸、６－アザシチジン５’－三リン酸、６－アザウリジン５’－三リン酸、６－クロロプリンリボシド５’－三リン酸、７－デアザアデノシン５’－三リン酸、７－デアザグアノシン５’－三リン酸、８－アザアデノシン５’－三リン酸、８－アジドアデノシン５’－三リン酸、ベンゾイミダゾールリボシド５’－三リン酸、Ｎ１－メチルアデノシン５’－三リン酸、Ｎ１－メチルグアノシン５’－三リン酸、Ｎ６－メチルアデノシン５’－三リン酸、Ｏ６－メチルグアノシン５’－三リン酸、プソイドウリジン５’－三リン酸、ピューロマイシン５’－三リン酸、またはキサントシン５’－三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。

【0165】

キャップ構造
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には、以下のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの一つを除去して二つの末端リン酸を残し、その後、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’５’５三リン酸結合をもたらし、その後、グアニンの７－窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例には、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、およびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。

【0166】

天然に存在するキャップ構造は、三リン酸架橋により第一の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、結果としてｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（ここで、Ｎは任意のヌクレオシドである）のジヌクレオチドキャップをもたらす７－メチルグアノシンを含む。インビボでは、キャップは酵素的に付加される。キャップが核に付加され、酵素であるグアニリルトランスフェラーゼによって触媒される。キャップのＲＮＡの５’末端への付加は、転写開始直後に起こる。末端ヌクレオシドは、典型的にはグアノシンであり、全ての他のヌクレオチドに対して逆配向、すなわちＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐである。

【0167】

インビトロ転写によって産生されるｍＲＮＡの一般的なキャップは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり、それらの５’末端にキャップ構造を有するＲＮＡを得るためにＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ転写時にジヌクレオチドキャップとして使用されている。キャップされたｍＲＮＡの一般的なインビトロ合成方法では、転写の開始因子として、形態がｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）である予め形成されたジヌクレオチドが用いられている。

【0168】

これまで、インビトロ翻訳実験で使用される合成ジヌクレオチドキャップの通常の形態は、反逆方向キャップ類似体（「ＡＲＣＡ」）または修飾ＡＲＣＡであり、これは、一般に、２’または３’ＯＨ基が－ＯＣＨ３で置き換えられている修飾されたキャップ類似体である。

【0169】

追加のキャップ類似体には、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣからなる群から選択される化学的構造、非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称性キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、または反逆方向キャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ、ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、およびそれらの四リン酸誘導体）（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ‘ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ’ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，ＲＮＡ，９：１１０８－１１２２（２００３）を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。

【0170】

一部の実施形態では、好適なキャップは、三リン酸架橋により第１の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、結果としてｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（ここで、Ｎは任意のヌクレオシドである）をもたらす７－メチルグアニル酸（「ｍ７Ｇ」）である。本発明の実施形態で利用されるｍ７Ｇキャップの好ましい実施形態は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。

【0171】

一部の実施形態では、キャップは、キャップ０構造である。キャップ０構造は、塩基１および２に結合したリボース２’－Ｏ－メチル残基を欠く。一部の実施形態では、キャップは、キャップ１構造である。キャップ１構造は、塩基２に２’－Ｏ－メチル残基を有する。一部の実施形態では、キャップは、キャップ２構造である。キャップ２構造は、塩基２および塩基３の両方に結合した２’－Ｏ－メチル残基を有する。

【0172】

様々なｍ７Ｇキャップ類似体は当該技術分野で公知であり、それらの多くが商業的に入手可能である。これらには、上述のｍ７ＧｐｐｐＧ、ならびにＡＲＣＡ ３’－ＯＣＨ３キャップ類似体および２’－ＯＣＨ３キャップ類似体（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８－１１２２（２００３））が含まれる。本発明の実施形態で使用するための追加のキャップ類似体には、Ｎ７－ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９－１４８７（２００４）に記載のもの）、ホスホロチオエートキャップ類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ－Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，１３：１７４５－１７５５（２００７）に記載のもの）、および参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０９３，３６７号および同第８，３０４，５２９号に記載のキャップ類似体（ビオチン化キャップ類似体を含む）が含まれる。

【0173】

テール構造
典型的には、「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。ポリＡテールは、天然メッセンジャーおよび合成センスＲＮＡを安定させると考えられている。したがって、特定の実施形態では、長いポリＡテールがｍＲＮＡ分子に付加されて、結果としてＲＮＡをより安定したものにすることができる。ポリＡテールは、当該技術分野で認識されている様々な技法を使用して付加され得る。例えば、長いポリＡテールは、ポリＡポリメラーゼを使用して合成またはインビトロ転写ＲＮＡに付加され得る（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２－１２５６）。転写ベクターも長いポリＡテールをコードすることができる。加えて、ポリＡテールは、ＰＣＲ産物から直接転写によって付加され得る。ポリＡは、ＲＮＡリガーゼを用いてセンスＲＮＡの３’末端にライゲーションされる場合もある（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９９１ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと）。

【0174】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。典型的には、ポリＡテールの長さは少なくとも約１０、５０、１００、２００、３００、４００、または５００のヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの３’末端のポリＡテールは、典型的には、約１０～８００個のアデノシンヌクレオチド（例えば、約３００～５００個のアデノシンヌクレオチド、約３００～８００個のアデノシンヌクレオチド、約１０～２００個のアデノシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンヌクレオチド）を含む。典型的には、本発明によるｍＲＮＡ中のポリＡテールは、約３００～約８００アデノシンヌクレオチド長である。より一般的には、ポリＡテールは、約３００アデノシンヌクレオチド長である。

【0175】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端上の好適なポリ－Ｃテールは、典型的には、約１０～２００個のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～１５０個のシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のシトシンヌクレオチド、約２０～６０個のシトシンヌクレオチド、または約１０～４０個のシトシンヌクレオチド）を含む。ポリ－Ｃテールは、ポリ－Ａテールに付加され得るか、またはポリ－Ａテールの代わりになり得る。

【0176】

一部の実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールの長さが調整されて、本発明の修飾センスｍＲＮＡ分子の安定性、ひいてはタンパク質の転写を制御する。例えば、ポリＡテールの長さがセンスｍＲＮＡ分子の半減期に影響を及ぼし得るため、ポリＡテールの長さが調整されて、ｍＲＮＡのヌクレアーゼに対する耐性レベルを修正し、それにより、標的細胞でのポリヌクレオチド発現および／またはポリペプチド産生の時間経過を制御することができる。

【0177】

５’および３’非翻訳領域
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域およびは３’非翻訳領域のどちらも含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす要素、例えば、鉄応答性要素を一つまたは複数含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、約５０～５００ヌクレオチド長であり得る。

【0178】

一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞におけるｍＲＮＡの位置安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの一つまたは複数の結合部位のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、５０～５００ヌクレオチド長またはそれ以上であり得る。

【0179】

例示的な３’および５’非翻訳領域配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させるために、安定しているｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸サイクル酵素）から得られ得る。例えば、５’ＵＴＲは、ヌクレアーゼ耐性を改善するおよび／またはポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列またはその断片を含み得る。ポリヌクレオチドをさらに安定させるために、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列またはその断片のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非翻訳領域への包含も企図される。概して、これらの修飾は、ポリヌクレオチドの安定性および／または薬物動態特性（例えば、半減期）を、それらの修飾されていない対応物と比較して改善し、例えば、かかるポリヌクレオチドのインビボヌクレアーゼ消化に対する耐性を改善するために行われる修飾を含む。

【0180】

特定の実施形態では、コドン最適化ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡは、ＸおよびＹとしてそれぞれ表される５’および３’非翻訳領域に隣接したコドン最適化コード領域を有するコード領域を含む（下記参照）
Ｘ－コード領域－Ｙ
式中、コード領域配列は、配列番号６、もしくは配列番号６に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、または配列番号７、もしくは配列番号７に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号８、もしくは配列番号８に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号９、もしくは配列番号９に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号１０、もしくは配列番号１０に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号１１、もしくは配列番号１１に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号１２、もしくは配列番号１２に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号１３、もしくは配列番号１３に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号１４、もしくは配列番号１４に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号１５、もしくは配列番号１５に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号１６、もしくは配列番号１６に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号１７、もしくは配列番号１７に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号１８、もしくは配列番号１８に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号１９、もしくは配列番号１９に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号２０、もしくは配列番号２０に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号２１、もしくは配列番号２１に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号２２、もしくは配列番号２２に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号２３、もしくは配列番号２３に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号２４、もしくは配列番号２４に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号２５、もしくは配列番号２５に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号２６、もしくは配列番号２６に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号２７、もしくは配列番号２７に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号２８、もしくは配列番号２８に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号２９、もしくは配列番号２９に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号３０、もしくは配列番号３０に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、配列番号３１、もしくは配列番号３１に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列であり、
Ｘ（５’ＵＴＲ配列）は、
ＡＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ［配列番号２］もしくは配列番号２に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、
または
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ［配列番号３］もしくは配列番号３に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列であり、Ｙ（３’ＵＴＲ配列）は、
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ［配列番号４］もしくは配列番号４に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列、またはＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ［配列番号５］もしくは配列番号５に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列である。
インビトロ転写
本発明の特定の実施形態では、コドン最適化ヒトダイニン軸糸重鎖５メッセンジャーＲＮＡ（ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡ）は、当該遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写により合成された。その後、５’キャップ構造（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ” Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５，８６，１２３９－１２４９）と、およそ１００、２００、２５０、３００、４００、５００、または８００ヌクレオチド長の３’ポリ（Ａ）テールの付加が行われ、ゲル電気泳動により測定された。

【0181】

送達ビヒクル
本発明によると、本明細書に記載されるＤＮＡＨ５タンパク質（たとえば、ＤＮＡＨ５タンパク質の全長、断片、または一部）をコードするｍＲＮＡは、裸のＲＮＡ（パッケージされていない）として送達されてもよく、または送達ビヒクルを介して送達されてもよい。本明細書で使用される場合、「送達ビヒクル」、「移入ビヒクル」、「ナノ粒子」という用語、または文法的同義語は、互換的に使用される。

【0182】

一部の実施形態では、ＤＮＡＨ５タンパク質をコードするｍＲＮＡは、単一の送達ビヒクルを介して送達されてもよい。一部の実施形態では、ＤＮＡＨ５タンパク質をコードするｍＲＮＡは、各々異なる組成の一つまたは複数の送達ビヒクルを介して送達されてもよい。様々な実施形態によると、好適な送達ビヒクルとして、以下に限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質ナノ粒子、およびリポソームなどのポリマー系担体、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然および合成由来のエキソソーム、天然層状体、合成層状体、および半合成層状体、ナノ粒子、カルシウムリン－ケイ酸塩ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、微結晶微粒子、半導体ナノ粒子、ポリ（Ｄ－アルギニン）、ゾルゲル、ナノデンドリマー、デンプンベース送達系、ミセル、エマルジョン、ニオソーム、多ドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル酸ポリマー、動的多抱合体）、乾燥粉末製剤、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ならびに他の指向性タグが挙げられる。

【0183】

ポリマー
一部の実施形態では、好適な送達ビヒクルは、担体としてポリマーを使用して、単独でまたは本明細書に記載される様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて製剤化される。したがって、一部の実施形態では、本明細書で使用されるリポソーム送達ビヒクルは、ナノ粒子を含むポリマーも包含する。好適なポリマーとして、例えば、ポリアクリレート類、ポリアルキシアノアクリレート類、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー類、ポリカプロラクトン類、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン類、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられ得る。ＰＥＩを含む場合、ＰＥＩは１０～４０ｋＤａの範囲の分子量を持つ分枝状ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａの分枝状ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ ＃４０８７２７）であり得る。

【0184】

リポソーム：
一部の実施形態では、好適な送達ビヒクルは、リポソームである。本明細書で使用される場合、リポソームは、通常、一つまたは複数の二重層の膜によって外部媒体から隔離された内部水空間を有する微細小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は、典型的には、空間的に分離された親水性ドメインおよび疎水性ドメインを含む合成起源または天然起源の脂質等の両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７－３２１，１９９８）。リポソームの二重層膜は、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤（例えば、ポリメロソーム、ニオソーム等）によって形成される場合もある。本発明との関連で、リポソームは、典型的には、所望のｍＲＮＡを標的細胞または組織に輸送する役割を果たす。本発明による典型的なリポソームは、一種または複数のカチオン性脂質、一種または複数の非カチオン性脂質、一種または複数のコレステロール系脂質、および一種または複数のＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0185】

カチオン性脂質
本明細書で使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種のいずれかを指す。

【0186】

いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物および方法で使用するための好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１０／１４４７４０に記載されるカチオン性脂質が含まれる。

【0187】

特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、以下の化合物構造を有する、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４－（ジメチルアミノ）ブタン酸塩：

【化1】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0188】

本発明の組成物および方法で使用するためのその他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１３／１４９１４０に記載されるイオン化可能なカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のうちの一種のカチオン性脂質：

【化2】

またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立して水素、任意で置換される、可変飽和または不飽和Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、および任意で置換される、可変飽和または不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アシルからなる群から選択され、式中、Ｌ_１およびＬ_２は、それぞれ独立して水素、任意で置換されるＣ_１－Ｃ_３０アルキル、任意で置換される可変不飽和Ｃ_１－Ｃ_３０アルケニル、および任意で置換されるＣ_１－Ｃ_３０アルキニルからなる群から選択され、式中、ｍおよびｏはそれぞれ独立して、ゼロおよび任意の正の整数（例えば、ｍは３）からなる群から選択され、および式中、ｎはゼロまたは任意の正の整数（例えば、ｎは１）である。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（「ＨＧＴ５０００」）：

【化3】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ、１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－ｌ－アミン（「ＨＧＴ５００１」）：

【化4】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質および（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００２」）：

【化5】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0189】

本発明の組成物および方法で使用するためのその他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１０／０５３５７２に、アミノアルコールリピドイドとして記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化6】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0190】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１６／１１８７２５に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化7】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0191】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１６／１１８７２４に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化8】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0192】

本発明の組成物および方法において使用するための他の好適なカチオン性脂質は、１４，２５－ジトリデシル１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタンの式を有するカチオン性脂質、およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0193】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１３／０６３４６８およびＷＯ２０１６／２０５６９１に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：

【化9】

またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、Ｒ^Ｌの各々の事例は、独立して、任意で置換されるＣ_６－Ｃ_４０アルケニルである。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化10】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化11】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化12】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化13】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0194】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１５／１８４２５６に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：

【化14】

またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、各Ｘは独立してＯまたはＳであり；各Ｙは独立してＯまたはＳであり；各ｍは独立して０～２０であり；各ｎは独立して１～６であり；各Ｒ_Ａは独立して水素、任意で置換されるＣ１－５０アルキル、任意で置換されるＣ２－５０アルケニル、任意で置換されるＣ２－５０アルキニル、任意で置換されるＣ３－１０カルボシクリル、任意で置換される３～１４員のヘテロシクリル、任意で置換されるＣ６－１４アリール、任意で置換される５～１４員のヘテロアリールまたはハロゲンであり、各Ｒ_Ｂは独立して水素、任意で置換されるＣ１－５０アルキル、任意で置換されるＣ２－５０アルケニル、任意で置換されるＣ２－５０アルキニル、任意で置換されるＣ３－１０カルボシクリル、任意で置換される３～１４員のヘテロシクリル、任意で置換されるＣ６－１４アリール、任意で置換される５～１４員のヘテロアリールまたはハロゲンである。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ターゲット２３」：

【化15】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0195】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１６／００４２０２に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化16】

またはその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化17】

またはその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化18】

またはその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0196】

本発明の組成物および方法で使用するためのその他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照により組み込まれる、Ｊ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ，Ｃｅｌｌ
２０１０，１４１，２１０－２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化19】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0197】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１５／１９９９５２に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化20】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化21】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化22】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化23】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化24】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化25】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化26】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化27】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化28】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化29】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化30】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化31】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化32】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0198】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１７／００４１４３に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化33】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化34】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化35】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化36】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化37】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化38】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化39】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化40】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化41】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化42】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化43】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化44】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化45】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化46】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化47】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化48】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化49】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0199】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１７／０７５５３１に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：

【化50】

またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、Ｌ^１またはＬ^２のうちの一つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり；もう一つのＬ^１またはＬ^２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；Ｇ^１およびＧ^２は、それぞれ独立して非置換Ｃ_１－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニレンであり；Ｇ^３はＣ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルケニレンであり；Ｒ^ａはＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立してＣ_６－Ｃ_２４アルキルまたはＣ_６－Ｃ_２４アルケニルであり；Ｒ^３はＨ、ＯＲ^５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＲ^５ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^４であり、Ｒ^４はＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；Ｒ^５はＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり；ｘは０、１または２である。

【0200】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１７／１１７５２８に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化51】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化52】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化53】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0201】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１７／０４９２４５に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の式のうちの一つの化合物：

【化54】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。これら四つの式のうちのいずれか一つについて、Ｒ_４は、－（ＣＨ_２）_ｎＱおよび－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲから独立して選択され、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され、ｎは１、２または３である。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化55】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化56】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化57】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化58】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0202】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、それぞれ本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１７／１７３０５４およびＷＯ２０１５／０９５３４０に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化59】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化60】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化61】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：

【化62】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0203】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１２／１７０８８９に記載される切断可能なカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：

【化63】

を含み、式中、Ｒ_１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意で置換されるアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）およびピリジルからなる群から選択され、式中、Ｒ_２は、以下の二つの式のうちの一つからなる群から選択され：

【化64】

式中、Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立して、任意で置換される可変飽和または不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アルキルおよび任意で置換される可変飽和または不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アシルからなる群から選択され、式中、ｎは、０または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）である。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００１」：

【化65】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００２」：

【化66】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００３」：

【化67】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００４」：

【化68】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００５」：

【化69】

およびその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0204】

本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、２０１８年５月１６日に出願された米国仮出願第６２／６７２，１９４号に記載される切断可能カチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、一般式のうちのいずれか、または米国仮出願第６２／６７２，１９４号に記載される構造（１ａ）～（２１ａ）および（１ｂ）～（２１ｂ）および（２２）～（２３７）のうちのいずれかであるカチオン性脂質を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、式（Ｉ’）による構造を有するカチオン性脂質を含み：

【化70】

式中、
Ｒ^Ｘが独立して、－Ｈ、－Ｌ^１－Ｒ^１、または－Ｌ^５Ａ－Ｌ^５Ｂ－Ｂ’であり、
Ｌ^１、Ｌ^２、およびＬ^３が各々独立して、共有結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^Ｌ－であり、
Ｌ^４ＡおよびＬ^５Ａが各々独立して、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^Ｌ－であり、
Ｌ^４ＢおよびＬ^５Ｂが各々独立して、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキレン、Ｃ_２－Ｃ_２０アルケニレン、またはＣ_２－Ｃ_２０アルキニレンであり、
各ＢおよびＢ’は、ＮＲ^４Ｒ^５または５～１０員の窒素含有ヘテロアリールであり、
Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が各々独立して、Ｃ_６－Ｃ_３０アルキル、Ｃ_６－Ｃ_３０アルケニル、またはＣ_６－Ｃ_３０アルキニルであり、
各Ｒ^４およびＲ^５は独立して、水素、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_２－Ｃ_１０アルケニル、またはＣ_２－Ｃ_１０アルキニルであり、
各Ｒ^Ｌが独立して、水素、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_２－Ｃ_２０アルケニル、またはＣ_２－Ｃ_２０アルキニルである、カチオン性脂質を提供する。
特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する６２／６７２，１９４の化合物（１３９）であるカチオン性脂質を含む。

【化71】

【0205】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む。（参照により本明細書に援用される、（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。本発明の組成物および方法のために好適な他のカチオン性脂質は、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）（「ＤＯＧＳ」）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）を含む。

【0206】

本発明の組成物および方法に好適な追加の例示的なカチオン性脂質はまた、ｌ，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＳＤＭＡ」）；１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＯＤＭＡ」）、１，２－ジリノレイロキシオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｉｎＤＭＡ」）、ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｅｎＤＭＡ」）、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ－（ｌ，２－ジミリチルチルオキシプロップ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－ｌ－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣＬｉｎＤＭＡ」）；２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチｌ－ｌ－（シス，シス－９’，ｌ－２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（「ＤＭＯＢＡ」）；１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」）；２，３－ジリノレオイロイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（「ＤＬｉｎＤＡＰ」）、ｌ，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」）；ｌ，２－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ」）；２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ」）；（２Ｒ）－２－（（８－［（３ベータ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）；（２Ｓ）－２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ、ｆｓｌ－ジメチ３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」）、および２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ ２－ジエン－１－イル）－ｌ，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ」）を含む（本明細書に参照によって援用される国際公開第２０１０／０４２８７７号参照；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２－１７６（２０１０））。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３－１００７（２００５）；国際特許公開第２００５／１２１３４８号）。一部の実施形態では、カチオン性脂質のうちの一つまたは複数は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジニウム部分のうちの少なくとも一つを含む。

【0207】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に好適な一種または複数のカチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＸＴＣ」）；（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（「ＡＬＮＹ－１００」）および／または４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザヘキサデカン－１，１６－ジアミド（「ＮＣ９８－５」）を含む。

【0208】

一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の重量で測定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する一種または複数のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子のモル％で測定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する一種または複数のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の重量で測定して、約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する一種または複数のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子のモル％で測定して、約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する一種または複数のカチオン性脂質を含む

【0209】

一部の実施形態では、ステロール系カチオン性脂質が、本明細書に記載のカチオン性脂質の代わりに、または本明細書に記載のカチオン性脂質に加えて使用されてもよい。好適なステロール系カチオン性脂質は、ジアルキルアミノ含有ステロール系カチオン性脂質、イミダゾール含有ステロール系カチオン性脂質、およびグアニジニウム含有ステロール系カチオン性脂質である。例えば、特定の実施形態は、下記の構造（Ｉ）によって示されるように、イミダゾール、例えば、イミダゾールコレステロールエステル、または「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル ３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエートを含む一種または複数のステロール系カチオン性脂質をふくむ組成物を対象とする。特定の実施形態では、機能的なタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の送達のための脂質ナノ粒子は、以下の構造によって示されるように、イミダゾール系カチオン性脂質、例えば、イミダゾールコレステロールエステル、または「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル ３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエートの一つまたは複数を含んでもよい。

【化72】

【0210】

一部の実施形態では、リポソーム中のカチオン性脂質の割合は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、リポソームの約３０～５０重量％（例えば、約３０～４５重量％、約３０～４０重量％、約３５～５０重量％、約３５～４５重量％、または約３５～４０重量％）を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ＩＣＥ脂質）は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％を構成する。

【0211】

非カチオン性／ヘルパー脂質
一部の実施形態では、提供されたリポソームは、一つまたは複数の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含む。本明細書で使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、任意の中性脂質、双性イオン性脂質、またはアニオン性脂質を意味する。本明細書で使用される場合、語句「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたＨで正味の負電荷を保有する多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、以下に限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられる。

【0212】

一部の実施形態では、こうした非カチオン性脂質は、単独で使用され得るが、好ましくは他の賦形剤、例えば、カチオン性脂質と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、リポソームに存在する総脂質の約５％～約９０％、または約１０％～約７０％のモル比を含み得る。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、組成物が製剤化および／または投与される条件下で正味の電荷を保有しない脂質である。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質の割合は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であり得る。

【0213】

コレステロール系脂質
一部の実施形態では、提供されるリポソームは、一つまたは複数のコレステロール系脂質を含む。例として、好適なコレステロール系カチオン性脂質として、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、ｌ，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ ｅｔ
ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、リポソームに存在する総脂質の約２％～約３０％、または約５％～約２０％のモル割合を含み得る。一部の実施形態では、リポソーム中のコレステロール系脂質の割合は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であり得る。

【0214】

ＰＥＧ化脂質
一部の実施形態では、提供されるリポソームは一つまたは複数のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質と、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－ｌ－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含めた誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの誘導体化脂質とを、カチオン性脂質のうちの一つまたは複数と共に、一部の実施形態ではリポソームを含む他の脂質と共に、組み合わせて使用することも、本発明により企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６－Ｃ２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大２ｋＤａ、最大３ｋＤａ、最大４ｋＤａ、または５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ－２Ｋである。かかる成分の付加は、複合体の凝集を阻止することができ、循環寿命を増加させ、かつ脂質－核酸組成物の標的細胞への送達を増加させるための手段を提供することもできる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５－２３７）か、またはこれらの成分は、インビボで製剤から迅速に交換するように選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと）。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ－２Ｋである。一部の実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。

【0215】

一部の実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化された脂質は、リポソームに存在する総脂質の約０％～約１５％、約０．５％～約１５％、約１％～約１５％、約４％～約１０％、または約２％のモル割合を含み得る。ＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の合計脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を構成し得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の合計脂質の約３０～５０％（例えば、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。

【0216】

様々な実施形態によれば、リポソームを含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにかかる脂質の互いに対する相対モル割合の選択は、選択される脂質の特徴、対象とする標的細胞の性質、送達されるｍＲＮＡの特徴に基づく。さらなる考慮すべき事項には、例えば、選択される脂質のアルキル鎖の飽和度、ならびにサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、および毒性が含まれる。したがって、モル比は、適宜に調整され得る。

【0217】

リポソーム製剤
本発明に好適なリポソームは、本明細書に記載のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール脂質、ＰＥＧ化脂質、および／またはポリマーのいずれかのうちの一つまたは複数を様々な割合で含み得る。典型的には、本発明によるリポソームは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール脂質、およびＰＥＧ化脂質を含む。非限定的な例として、好適なリポソーム製剤は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋから選択される組み合わせを含み得る。脂質の追加的な組み合わせは、当該技術分野、例えば、米国特許第６２／４２０，４２１号（２０１６年１１月１０日出願）、米国特許第６２／４２１，０２１号（２０１６年１１月１１日出願）、米国特許第６２／４６４，３２７号（２０１７年２月２７日出願）、および“Ｎｏｖｅｌ ＩＣＥ－ｂａｓｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍＲＮＡ”と題され、２０１７年１１月１０日に出願されたＰＣＴ出願に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に含まれている。

【0218】

様々な実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）は、モル比でリポソームの約３０～６０％（例えば、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）の割合は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％以上である。

【0219】

一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれ約３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれおよそ４０：３０：２０：１０である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれおよそ４０：３０：２５：５である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれおよそ４０：３２：２５：３である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、およそ５０：２５：２０：５である。

【0220】

リポソームの形成
本発明の組成物で使用するためのリポソーム移入ビヒクルは、当該技術分野において現在公知である様々な技術により調製することができる。提供される組成物で使用するためのリポソームは、当該技術分野において現在公知である様々な技術により調製することができる。例えば、多重層ベシクル（ＭＬＶ）は、適切な溶媒に脂質を溶解することにより、選択された脂質を好適な容器または器の内壁に堆積させ、次いで、溶媒を蒸発させて器の内側に薄膜を残すか、または噴霧乾燥させることなどによる、従来技術に従って調製され得る。続いて、水相を渦動運動させながら器に添加し、その結果として、ＭＬＶを形成することができる。次に、単層ベシクル（ＵＬＶ）を、多重層ベシクルのホモジナイゼーション、超音波処理、または押出により形成することができる。加えて、単層ベシクルを、界面活性剤除去技術により形成することができる。

【0221】

特定の実施形態では、提供される組成物はリポソームを含み、この場合においてｍＲＮＡはリポソームの両表面上で会合し、および同リポソーム内に封入される。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームは、静電相互作用によりｍＲＮＡと会合し得る。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームは、静電相互作用によりｍＲＮＡと会合し得る。

【0222】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、リポソームに封入されたｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、一種または複数のｍＲＮＡ種が、同一のリポソームに封入され得る。一部の実施形態では、一種または複数のｍＲＮＡ種が、異なるリポソームに封入され得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは一つまたは複数のリポソームに封入される。当該リポソームは、その脂質組成、脂質成分のモル比、大きさ、電荷（ゼータ電位）、標的化リガンド、および／またはそれらの組み合わせにおいて異なる。一部の実施形態では、一つまたは複数のリポソームは、カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および／またはこれらの組み合わせの異なる組成物を有し得る。一部の実施形態では、一つまたは複数のリポソームは、リポソームを作製するために使用されるカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、およびＰＥＧ修飾脂質の異なるモル割合を有し得る。

【0223】

所望のｍＲＮＡをリポソーム内に組み込むプロセスは、「装填」と称されることが多い。例示的な方法は、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５－２５８，１９９２に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。典型的な実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、ＷＯ２０１８／０８９８０１に記載される方法を使用してリポソームに封入される（その教示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。簡潔に述べると、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを封入するリポソームが形成されるように、予め形成されたリポソームを含む溶液をｍＲＮＡと混合することによって封入される。

【0224】

典型的には、リポソームに組み込まれた核酸は、リポソームの二層膜内のリポソームの内部空間に完全に位置付けられるが、上述のように、ｍＲＮＡの一部（例えば、リポソーム組成物中の総ｍＲＮＡの１０％以下）もリポソーム膜の外表面と関連している可能性がある。リポソームへの核酸の組み込みは、本明細書では「封入」とも呼称される。典型的には、ｍＲＮＡを、リポソームに組み込む目的は、核酸を分解する酵素もしくは化学物質、および／または核酸の急速排出をもたらす系もしくは受容体を含み得る環境から核酸を保護することである。したがって、一部の実施形態では、好適な送達ビヒクルは、その中に含まれるｍＲＮＡの安定性を強化することができ、および／または標的細胞もしくは標的組織へのｍＲＮＡの送達を促進する。

【0225】

リポソームの大きさ
本発明による好適なリポソームは、様々な大きさに作製することができる。一部の実施形態では、提供されるリポソームは、従来から知られているｍＲＮＡ封入リポソームよりも小さく作製され得る。一部の実施形態では、リポソームの大きさが減少すると、ｍＲＮＡの送達効率が高くなる。適切なリポソームの大きさは、標的細胞または標的組織の部位を考慮し、また作製されるリポソームの用途をある程度考慮して選択することができる。

【0226】

一部の実施形態では、適切な大きさのリポソームを選択して、ｍＲＮＡによりコードされる抗体の全身分布を促進する。一部の実施形態では、特定の細胞または組織へのｍＲＮＡのトランスフェクションを限定することが望ましい場合がある。例えば、肝細胞を標的とするには、リポソームは、その寸法が肝臓の肝類洞を覆う内皮層の開窓よりも小さくなるように寸法決定されてもよく、こうした場合、リポソームは、その内皮開窓を容易に貫通して、標的肝細胞に達することができようになる。

【0227】

代替的または追加的に、リポソームは、リポソームの寸法が特定の細胞もしくは組織内への分布を制限するか、または意図的に分布しないようにするのに十分な直径であるように寸法決定されてもよい。例えば、リポソームは、その寸法が肝類洞を覆う内皮層の開窓より大きくなるように寸法決定されてもよく、それによって、リポソームの肝細胞への分布を制限する。

【0228】

一部の実施形態では、リポソームの大きさは、リポソーム粒子の最大直径の長さによって決定される。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約２５０ｎｍ以下（例えば、約２２５ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、または５０ｎｍ以下）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０～２５０ｎｍの範囲（例えば、約１０～２２５ｎｍ、１０～２００ｎｍ、１０～１７５ｎｍ、１０～１５０ｎｍ、１０～１２５ｎｍ、１０～１００ｎｍ、１０～７５ｎｍ、または１０～５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１００～２５０ｎｍの範囲（例えば、約１００～２２５ｎｍ、１００～２００ｎｍ、１００～１７５ｎｍ、１００～１５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。８０～２００ｎｍのサイズのリポソームは、いくつかの用途に特に適している。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０～１００ｎｍの範囲（例えば、約１０～９０ｎｍ、１０～８０ｎｍ、１０～７０ｎｍ、１０～６０ｎｍ、または１０～５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。特定の実施形態では、好適なリポソームは、約１００ｎｍ未満の大きさを有する。

【0229】

リポソーム集団の寸法決定に対して、当該技術分野において公知の様々な別の方法を利用することができる。こうした寸法決定方法の一つは、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。バス超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音波処理によって、直径が約０．０５マイクロメートル未満の小さいＵＬＶまでサイズ漸減する。ホモジナイゼーションは別の方法であり、大きいリポソームをより小さいものに断片化するのに剪断エネルギーを利用する。典型的なホモジナイゼーション手順において、ＭＬＶは、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約０．１～０．５マイクロメートルの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを用いて再循環される。リポソームの大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１－１５０（１９８１）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載された準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって算出され得る。平均リポソーム直径を、形成されたリポソームを超音波処理することによって低減させることができる。断続的な超音波処理サイクルをＱＥＬＳ評価と交互に行って、効率的なリポソーム合成を導くことができる。

【0230】

ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの送達および発現のためのリポソーム製剤
本セクションは、インビボでのＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの効果的な送達および発現のためのリポソーム製剤の例を提供する。

【0231】

脂質材料
本明細書に記載される製剤は、ＤＮＡＨ５タンパク質をコードするｍＲＮＡを封入するよう設計された、一種または複数のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（たとえば非カチオン性脂質および／またはコレステロール系脂質）、およびＰＥＧ化脂質を活用する、様々な比率の多成分脂質混合物を含む。カチオン性脂質としては、（限定ではないが）ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２－ジオレイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ” Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６－２８７）、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２－１７６）、Ｃ１２－２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ” ＰＮＡＳ ２０１０，１０７，１８６４－１８６９）、ｃＫＫ－Ｅ１２（３，６－ビス（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ＯＦ－０２、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジニウム系などが挙げられる。ヘルパー脂質としては（限定ではないが）、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））、コレステロールなどが挙げられる。ＰＥＧ化脂質は、Ｃ６－Ｃ２０の長さのアルキル鎖を有する脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖が挙げられる（限定ではない）。

【0232】

製剤プロトコールの例
Ａ．ｃＫＫ－Ｅ１２
ｃＫＫ－Ｅ１２の５０ｍｇ／ｍＬ エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ クエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得た。得られたリポソーム懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析して、濃縮し、２～８℃で保存した。ＤＮＡＨ５封入ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定した。

【0233】

Ｂ．Ｃ１２－２００
ｃ１２－２００の５０ｍｇ／ｍＬ エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＤＮＡＨ５ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ クエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたリポソーム懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析して、濃縮し、２～８℃で保存する。ＤＮＡＨ５封入ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。

【0234】

Ｃ．ＨＧＴ４００３
ＨＧＴ４００３の５０ｍｇ／ｍＬ エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ クエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたリポソーム懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析して、濃縮し、２～８℃で保存する。ＤＮＡＨ５封入ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。

【0235】

Ｄ．ＩＣＥ
ＩＣＥの５０ｍｇ／ｍＬ エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ クエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたリポソーム懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析して、濃縮し、２～８℃で保存する。ＤＮＡＨ５封入ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。

【0236】

Ｅ．ＨＧＴ５００１
ＨＧＴ５００１の５０ｍｇ／ｍＬ エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ クエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたリポソーム懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析して、濃縮し、２～８℃で保存する。ＤＮＡＨ５封入ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。

【0237】

Ｆ．ＨＧＴ５０００
ＨＧＴ５０００の５０ｍｇ／ｍＬ エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＤＮＡＨ５Ｔ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ クエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたリポソーム懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析して、濃縮し、２～８℃で保存する。ＤＮＡＨ５封入ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。

【0238】

Ｇ．ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ
ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡの５０ｍｇ／ｍＬ エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ クエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたリポソーム懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析して、濃縮し、２～８℃で保存する。ＤＮＡＨ５封入ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。

【0239】

Ｈ．ＤＯＤＡＰ
ＤＯＤＡＰの５０ｍｇ／ｍＬ エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ クエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたリポソーム懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析して、濃縮し、２～８℃で保存する。ＤＮＡＨ５封入ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。

【0240】

Ｉ．ＤＯＤＭＡ
ＤＯＤＭＡの５０ｍｇ／ｍＬ エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ クエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたリポソーム懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析して、濃縮し、２～８℃で保存する。ＤＮＡＨ５封入ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。

【0241】

臨床的または治療的な候補ｍＲＮＡ製剤は、５’－キャップおよび３’－ポリＡテールを有する例示的なコドン最適化ｍＲＮＡ配列から選択され、これは上述の適切な脂質の組み合わせで製剤化される。臨床的に意義のあるｍＲＮＡ候補は、インビボ組織による効率的な送達および取り込み、高レベルの発現、および持続的なタンパク質産生によって特徴付けられ、治療剤が投与される対象において、薬理学的に活性な成分またはリポソーム中の脂質、または製剤中で使用される任意の賦形剤のいずれかによって引き起こされる、検出可能な有害作用がない。概して、低用量投与による高効率は、関連する候補治療薬の選択プロセスにとって好ましい。

【0242】

医薬組成物
本発明は、原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）の治療に使用するための組成物を提供する。本発明の組成物は、原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）の治療のための医薬品の製造における使用のためのものである。

【0243】

インビボでのｍＲＮＡの発現を促進するために、リポソームなどの送達ビヒクルは、一つまたは複数の追加の核酸、担体、標的化リガンドもしくは安定化試薬と組み合わせて製剤化されてもよく、または好適な賦形剤と混合されている薬理組成物中で製剤化されてもよい。薬物の製剤化および投与の技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎで知ることができる。

【0244】

提供されるリポソーム封入ｍＲＮＡ、またはリポソーム結合ｍＲＮＡ、およびそれを含む組成物は、対象の臨床状態、投与の部位および投与方法、投与スケジュール、対象の年齢、性別、体重、ならびに当該技術分野の臨床医に関連する他の要因を考慮して、現在の医療行為に従い投与および投薬され得る。本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、主として、本発明の医薬組成物に含まれる治療薬の総量に基づいて決定される。一般に、治療有効量は、対象である哺乳動物に対して意義のある利益を得る（例えば、ＰＣＤを治療、調節、治癒、防止、および／または改善する）のに十分な量である。例えば、治療有効量は、所望の治療的および／または予防的効果を得るのに十分な量であり得る。通常、その必要のある対象に投与される治療剤（例えば、ＤＮＡＨ５タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の量は、当該対象の特徴に依存するであろう。このような特徴には、対象の状態、疾患重篤度、全般的健康、年齢、性別および体重が含まれる。当業者は、これらおよび他の関連因子に応じて適切な投薬量を容易に決定することができるであろう。さらに、最適な投薬量範囲を同定するために、客観的および主観的アッセイの両方を任意に用いることができる。

【0245】

一部の実施形態では、ダイニン軸糸重鎖５タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む医薬組成物の有効治療用量は、投与間隔の期間の間、または治療前の状態と比較して哺乳動物におけるＰＣＤに関連する少なくとも一つの症状またはバイオマーカーのレベルをより長く減少させるのに十分な投与間隔で哺乳動物に投与される。

【0246】

一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。ヒトに適用可能な適切な治療用量は、動物試験に基づいて導出され得る。動物で実施された試験からヒト等価用量を導出するための基本的なガイドラインは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）ウェブサイト ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｄｒｕｇｓ／ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／ｕｃｍ０７８９３２．ｐｄｆより“Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．”と題されたものが入手できる。相対成長率のガイドラインに基づくと、例えばマウスで０．６ｍｇ／ｋｇの好適な用量は、０．００４８ｍｇ／ｋｇのヒト等価用量に相当する。したがって、導出されたヒト等価用量を考慮すると、予測されるヒト治療用量は、他の動物での試験に基づいて導出され得る。

【0247】

一部の実施形態では、投与間隔は、１５日以上に一回、または２０日以上に一回、または２１日以上に一回、または２２日以上に一回、または２３日以上に一回、または２４日以上に一回、または２５日以上に一回、２６日以上に一回、または２７日以上に一回、または２８日以上に一回、または２９日以上に一回、または３０日以上に一回、または３１日以上に一回である。一部の実施形態では、投与間隔は、４０日、４５日、または５０日、または６０日、またはその間の任意の日数に一回である。一部の実施形態では、投与間隔は、８０日、９０日、または１２０日、または１５０日、またはその間の任意の日数に一回である。

【0248】

一部の実施形態では、治療的低用量は、２週間以上に一回の投与間隔で投与され、これは、治療前の状態と比較して、哺乳動物のＰＣＤに関連する少なくとも一つの症状またはバイオマーカーのレベルを減少させるのに十分である。一部の実施形態では、治療的低用量は、３週間以上に一回の投与間隔で投与され、これは、治療前の状態と比較して、哺乳動物のＰＣＤに関連する少なくとも一つの症状またはバイオマーカーのレベルを減少させるのに十分である。一部の実施形態では、投与間隔は、４週間以上に一回である。一部の実施形態では、投与間隔は、５週間以上に一回である。一部の実施形態では、投与間隔は、６週間以上に一回である。一部の実施形態では、投与間隔は、８週間以上に一回である。一部の実施形態では、投与間隔は、１２週間、または１５週間、または１８週間以上に一回である。

【0249】

一部の実施形態では、投与間隔は一か月に一回である。一部の実施形態では、投与間隔は二か月毎に一回である。一部の実施形態では、投与間隔は、三か月に一回、または四か月に一回、または五か月に一回、または六か月に一回、またはその間のどこかに一回である。

【0250】

一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料におけるダイニン軸糸重鎖５ ｍＲＮＡの発現レベルが、治療前のベースライン発現レベルと比較して増加する。典型的には、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、および組織試料（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が含まれる。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの発現レベルが、治療直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの発現レベルが、治療をしていない対象のＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの発現レベルと比較して増加する

【0251】

本発明によると、提供される組成物の治療有効用量は、定期的に投与された場合、治療前のベースラインのＤＮＡＨ５タンパク質発現レベルまたは活性レベルと比較して、対象におけるＤＮＡＨ５タンパク質発現レベルまたは活性レベルの増加をもたらす。典型的には、ＤＮＡＨ５タンパク質発現レベルまたは活性レベルは、たとえば血液、血漿もしくは血清、尿、または固形組織抽出物などの対象から取得された生体試料において測定される。一部の実施形態では、本発明の組成物の投与は、肝臓で検出可能なＤＮＡＨ５発現をもたらす。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、生体試料（たとえば血漿／血清または尿）中のＤＮＡＨ５タンパク質発現レベルまたは活性レベルは、治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、生体試料（たとえば血漿／血清または尿）中のＤＮＡＨ５タンパク質発現レベルまたは活性レベルは、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、または少なくとも１５日間の治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。

【0252】

一部の実施形態では、治療用量は、症状や、当業者によって疾患の進行、退行、または改善の適切な基準として選択される、バイオマーカーなどの他の指標を、少なくともいくらか安定化、改善、または排除するのに十分である。

【0253】

好適な投与経路には、例えば、経口投与、直腸投与、膣投与、経粘膜投与、気管内投与もしくは吸入投与を含む肺投与、または腸投与、皮内注射、経皮（局所）注射、筋肉内注射、皮下注射、髄内注射を含む非経口送達、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、もしくは鼻腔内が含まれる。

【0254】

一部の実施形態では、ダイニン軸糸重鎖タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む治療有効用量は、筋肉内投与によって対象に投与される。

【0255】

一部の実施形態では、ダイニン軸糸重鎖タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む治療有効用量は、皮下投与によって対象に投与される。

【0256】

特定の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋、および心筋からなる群から選択される筋肉に行われる。一部の実施形態では、投与の結果、ｍＲＮＡが筋細胞に送達される。一部の実施形態では、投与の結果、ｍＲＮＡが肝細胞（すなわち肝臓細胞）に送達される。特定の実施形態では、筋肉内投与の結果、ｍＲＮＡが筋細胞に送達される。

【0257】

最も一般的には、ダイニン軸糸重鎖タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む治療有効用量は、静脈内投与によって対象に投与される。

【0258】

あるいはまたは加えて、本発明のリポソーム封入ｍＲＮＡおよび組成物は、全身的にではなく局所的に、例えば、好ましくは徐放性製剤中で、医薬組成物を標的組織内へ直接注射することによって投与され得る。局所送達は、標的とされる組織に応じて様々な方式で達成され得る。例えば、本発明の組成物を含むエアロゾルが吸引され得（鼻送達、気管送達、または気管支送達の場合）、本発明の組成物が、例えば、損傷、疾患兆候、または疼痛の部位に注射され得、組成物が、経口、気管、または食道用のトローチ剤で提供され得るか、胃もしくは腸への投与用に液体、錠剤、もしくはカプセル形態で供給され得るか、直腸もしくは膣用に坐剤形態で供給され得るか、またはクリーム、液滴、もしくはさらには注射を使用することにより眼にも送達され得る。治療用の分子またはリガンドと複合体を形成した提供される組成物を含む製剤は、例えば、組成物を移植部位から周囲細胞に拡散させることができるポリマーまたは他の構造もしくは物質と合わせて、外科的に投与することもできる。あるいは、これらは、ポリマーまたは支持体を使用することなく外科的に適用され得る。

【0259】

特定の実施形態では、ｍＲＮＡをコードするＤＮＡＨ５は静脈内投与され、静脈内投与は、肝細胞へのｍＲＮＡの送達と関連する。

【0260】

一部の実施形態では、ダイニン軸糸重鎖タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む治療有効用量は、哺乳動物の肝臓への適切な送達のために投与される。一部の実施形態では、ダイニン軸糸重鎖タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む治療有効用量は、投与された哺乳動物の肝細胞における適切な発現のために投与される。

【0261】

本発明の提供される方法は、本明細書に記載される治療剤（例えば、ＤＮＡＨ５タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の治療有効量の単回投与ならびに複数回投与を企図する。治療剤は、対象の状態（例えば、ＰＣＤ）の性質、重症度、および程度によって規則的な間隔で投与され得る。一部の実施形態では、本発明の治療剤（例えば、ＤＮＡＨ５タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の治療有効量を、規則的な間隔で（例えば、年に一回、六か月に一回、五か月に一回、三か月に一回、隔月（二か月に一回）、毎月（毎月一回）、隔週（二週間に一回）、月二回、３０日に一回、２８日に一回、１４日に一回、１０日に一回、７日に一回、毎週、週二回、毎日、または連続して）、周期的に髄腔内に投与してもよい。

【0262】

一部の実施形態では、提供されるリポソームおよび／または組成物は、その中に含まれるｍＲＮＡの徐放に適するように製剤化される。こうした徐放性組成物は、投薬間隔を延長させて対象に適宜投与することができる。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、一日二回、毎日、または一日おきに対象に投与される。一部の実施形態では、本発明の組成物は、週二回、週一回、７日に一回、１０日に一回、１４日に一回、２８日に一回、３０日に一回、二週間に一回、三週間に一回、四週間に一回、一か月に一回、一か月に二回、六週間に一回、八週間に一回、隔月に一回、三か月に一回、四か月に一回、六か月に一回、八か月に一回、九か月に一回、または毎年、対象に投与される。

【0263】

好ましい実施形態では、本発明の組成物は、週に一回、二週間に一回、または月に一回、対象に投与される。より好ましい実施形態では、本発明の組成物は、二週間に一回、または毎月一回、対象に投与される。最も好ましい実施形態では、本発明の組成物は、毎月一回、対象に投与される。

【0264】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、追加的療法と同時に投与される。

【0265】

長期間にわたるｍＲＮＡの送達または放出のいずれかを行うために、デポ投与（例えば、筋肉内、皮下、硝子体内）用に製剤化される組成物およびリポソームも企図される。好ましくは、採用される徐放手段は、安定性を強化するためにｍＲＮＡに施される修飾と組み合わされる。

【0266】

治療有効量は、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンで一般的に投与される。任意の特定の治療用タンパク質について、治療有効（および／または有効な投与レジメン内の適切な単位投与量）は、例えば、投与経路に応じて、他の医薬品と組み合わせて変化し得る。また、任意の特定の患者に固有の治療有効量（および／または単位用量）は、治療される障害および障害の重篤度；採用される特定の医薬作用剤の活性；採用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食事；投与時間、投与経路、および／または採用される特定のタンパク質の排出または代謝速度；治療期間；ならびに医療分野において周知の類似要因を含む様々な要因に依存し得る。本発明によると、提供される組成物の治療有効用量は、定期的に投与された場合、ＰＣＤの少なくとも一つの症状または特徴が、強度、重篤度または頻度において低下する、または発症が遅延する。

【0267】

また、本明細書に開示されるリポソームのうちの一つまたは複数を含む凍結乾燥された医薬組成物と、例えば、２０１２年６月８日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／４１６６３に開示されるような、かかる組成物を使用するための関連方法も、本明細書において企図される。当該出願の教示内容はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本発明による凍結乾燥された医薬組成物は、投与前に戻されるか、またはインビボで戻され得る。例えば、凍結乾燥された医薬組成物は、適切な剤形（例えば、ディスク、ロッド、または膜などの皮内剤形）に製剤化され、剤形が個体の体液によってインビボで経時的に再水和されるように投与され得る。

【0268】

一部の実施形態では、医薬組成物は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、およびコレステロールを含む凍結乾燥リポソーム送達ビヒクルを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、再構成時に５００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１２０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍまたはそれより小さい数字未満のＤｖ５０を有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、再構成時に７５０ｎｍ、７００ｎｍ、５００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍまたはそれより小さい数字未満のＤｖ９０を有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、再構成時に、１、０．９５、０．９、０．８、０．７５、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２５、０．２、０．１、０．０５またはそれより少ない数字未満の多分散指数値を有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、再構成時に５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍまたは未満の平均粒子径を有する。

【0269】

一部の実施形態では、凍結乾燥医薬組成物は、スクロース、トレハロース、デキストラン、またはイヌリンなどの一つまたは複数のリオプロテクタントをさらに含む。典型的には、リオプロテクタントはスクロースである。一部の実施形態では、医薬組成物は、４℃での保存時に少なくとも１か月もしくは少なくとも６か月の間、または２５℃での保存時に少なくとも６か月の間、安定である。一部の実施形態では、再構成された凍結乾燥医薬組成物のｍＲＮＡの生物活性は、組成物の凍結乾燥前に観察された生物活性の７５％を超える。

【0270】

提供されるリポソームおよび組成物は、任意の所望の組織に投与され得る。一部の実施形態では、提供されるリポソームまたは組成物によって送達されるＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡは、リポソームおよび／または組成物が投与された組織で発現される。一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡは、リポソームおよび／または組成物が投与された組織とは異なる組織で発現される。送達されるｍＲＮＡが送達および／または発現され得る組織の例には、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、および／または脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。

【0271】

様々な実施形態によると、送達されるｍＲＮＡの発現の時期を、特定の医学的要求に合うように調整することができる。一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供されるリポソームおよび／または組成物の投与の１時間、２時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、または１か月後に検出可能である。

【0272】

一部の実施形態では、提供される組成物の治療有効用量は、定期的に投与された場合、治療前のベースラインのメチルマロン酸値と比較して、対象におけるメチルマロン酸値の低下をもたらす。

【0273】

一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象の肝臓細胞（たとえば肝細胞）におけるＤＮＡＨ５タンパク質のレベルが、治療前のベースラインのレベルと比較して増加する。典型的には、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、肝臓細胞におけるＤＮＡＨ５タンパク質のレベルが、治療直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、肝臓細胞におけるＤＮＡＨ５タンパク質のレベルが、治療をしていない対象の肝臓細胞におけるＤＮＡＨ５タンパク質のレベルと比較して増加する。

【0274】

一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象の血漿または血清におけるＤＮＡＨ５タンパク質のレベルが、治療前のベースラインのレベルと比較して増加する。典型的には、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、血漿または血清におけるＤＮＡＨ５タンパク質のレベルが、治療直前のベースラインのレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、血漿または血清におけるＤＮＡＨ５タンパク質のレベルが、治療をしていない対象の血漿または血清におけるＤＮＡＨ５タンパク質のレベルと比較して増加する。

【0275】

一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料におけるＤＮＡＨ５酵素活性が、治療前のベースラインのレベルと比較して増加する。典型的には、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、および組織試料（例えば、肝臓）が含まれる。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、ＤＮＡＨ５酵素活性が、治療直前のベースラインのレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、ＤＮＡＨ５酵素活性が、治療をしていない対象のＤＮＡＨ５酵素活性と比較して増加する。

【0276】

一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、成体である。一部の実施形態では、哺乳動物は、青年期である。一部の実施形態では、哺乳動物は幼児または若年哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は霊長類である。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は６歳～８０歳である。

【実施例0277】

本発明のある特定の化合物、組成物、および方法が、ある特定の実施形態に従って具体的に説明されているが、以下の実施例は、本発明の化合物を例証する役割のみを果たし、それを限定するようには意図されていない。

【0278】

実施例１．ＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの送達および発現のためのリポソーム製剤の例
本実施例は、インビボでのｈＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの効果的な送達および発現のためのリポソーム製剤の例を提供する。

【0279】

脂質材料
以下の実施例に記載される製剤は、特に記載しない限り、ヒトダイニン軸糸重鎖５（ｈＤＮＡＨ５）ｍＲＮＡを封入するように設計された、一種または複数のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）、およびＰＥＧ化脂質を用いた様々な比の多成分脂質混合物を含む。別段の指定がない限り、以下の実施例で使用される多成分脂質混合物は、イミダゾールコレステロールエステル（「ＩＣＥ」）カチオン性脂質、ＤＯＰＥなどの非カチオン性脂質、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２ＫなどのＰＥＧ化脂質のエタノール溶液であった。
メッセンジャーＲＮＡ材料

【0280】

コドン最適化ｈＤＮＡＨ５メッセンジャーＲＮＡを、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写により合成した。インビトロ転写後、５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ” Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５，８６，１２３９－１２４９）および３’ ポリ（Ａ）テールを付加した。ポリ（Ａ）テールは、平均で約１３５ヌクレオチド長であった。各ｍＲＮＡ産物中に存在する５’および３’の非翻訳領域はそれぞれＸおよびＹと表されており、述べられるように定義される（下記参照）。
コドン最適化 ｈＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡ：
Ｘ－コード領域－Ｙ
５’および３’のＵＴＲ配列
Ｘ（５’ＵＴＲ配列）＝
ＡＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ［配列番号：２］
または
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ［配列番号：３］
Ｙ（３’ＵＴＲ配列）＝
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ［配列番号：４］
または
ＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ［配列番号：５］

【0281】

コード領域
ＭＲＴ－１コドン最適化ｈＤＮＡＨ５メッセンジャーＲＮＡコード領域は、配列番号６または配列番号７の配列を含む。ＭＲＴ－１コドン最適化ｈＤＮＡ５の３’－ＧＦＰタグ付きバージョン、ＭＲＴ－ｈＤＮＡ５－ＧＦＰも同様に、当技術分野で周知の分子クローニング技術を使用して調製した。

【0282】

製剤プロトコール
ｈＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡを、２０１８年５月１７日公開のＷＯ２０１８／０８９７９０（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、およそ１０のＮ／Ｐ比で多成分リポソーム内に封入した。

【0283】

実施例２．インビボでのｈＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡの肺への投与および送達、ならびにｈＤＮＡＨ５タンパク質の発現
本実施例は、ｈＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡ担持リポソームナノ粒子を投与する例示的方法、およびインビボで肺上皮に送達されたｍＲＮＡ、およびその後に発現したｈＤＮＡＨ５タンパク質を分析する方法を示す。

【0284】

本実施例の試験は、およそ１０～１２週齢のオスの１２９Ｓ１／ＳｖｉｍＪマウスを使用して行われた。三つの群のマウス（各ｎ＝５）を、Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ（登録商標）（５０μＬ／動物）の試験物質（第１群および第２群）、または対照を介して単回気管内エアロゾル投与により曝露した。第１群の試験物質は、実施例１に記載されるように調製された１０μｇ／動物のＭＲＴ－１ ｈＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡであった。第２群の試験物質は、実施例１に記載されるように調製された１０μｇ／動物（別段の指定がない限り）のｈＤＮＡＨ５－ＧＦＰ ｍＲＮＡ（すなわちＭＲＴ１ ｈＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡの両方を含む配列）であった。対照は、試験物質と同じ量で投与された生理食塩水、または同じ送達ビヒクル中の無関係なｍＲＮＡのいずれかを含んだ。マウスを、投与後２４時間（±５％）で安楽死させた。

【0285】

分析のための血漿の分離
すべての動物を、ノーズコーンを介してイソフルレン過剰摂取により安楽死させ、その後、開胸および最終採血を行った。全血（最大取得可能量）を、安楽死させた動物の心臓穿刺を介して収集し、廃棄した。次いで、動物を生理食塩水で灌流した。

【0286】

分析のための器官組織の単離
灌流後、各マウスの肝臓および気道全体（気管から肺）を採取した。気管の上部から肺までの気道全体を一つにまとめて切開し、さらに矢状に切断して、気道全体の左右の切片が得られた。図１Ａは、肺の切開スキームを示す。気道全体の左側の切片は、その後の免疫組織化学的および組織学的分析のために緩衝液に固定された。気道全体の右側の切片を急速凍結し、気管（１）、上葉（２）、中葉（３）、下葉（４）、および大静脈後葉（ｐｏｓｔ－ｃａｖａｌ ｌｏｂｅ）（５）のその後のｑＰＣＲ解析のために－７０℃で保存した。肝臓はまた、急速凍結され、－７０℃で保存された。

【0287】

ｑＰＣＲアッセイ
マウスの気管および各肺葉を、トリゾールの存在下で均質化して完全に溶解させた後、シリカ膜ベースのスピンカラムを使用してＲＮＡを抽出した。コドン最適化ｈＤＮＡＨ５
ｍＲＮＡレベルは、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して決定される。第一に、精製されたＲＮＡは、ランダムプライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写（ＲＴ）される。次いで、ＰＣＲ反応は、配列特異的プライマーを使用して実行され、ｔａｑｍａｎフルオロフォアプローブ（ｑＰＣＲ）を使用してリアルタイムで定量化される。ｑＰＣＲアッセイで参照として実行される精製されたインビトロ転写ｈＤＮＡＨ５を使用して、標準曲線を生成し、分析した組織のミリグラム当たりのｈＤＮＡＨ５コピー数を計算する。ｑＰＣＲ解析の結果を、図１Ｂに示す。

【0288】

免疫組織化学（ＩＨＣ）分析－ＤＮＡＨ５またはＧＦＰ
気管および肺のｈＤＮＡＨ５およびＧＦＰタンパク質は、ＩＨＣ染色によって特徴づけられた。簡潔に述べると、採取された組織をホルマリンに固定し、パラフィンブロックに包埋した。組織の長さに沿った切片（５ミクロン厚）を、染色のためにガラススライド上に取り付けた。抗原回収は、ＥＤＴＡベースの緩衝液を使用して行い、続いて過酸化水素およびヤギ血清でブロッキングした。ｈＤＮＡＨ５（Ａｂ１２２３９０）およびＧＦＰ（Ａｂ２９０）に対する一次抗体を、それぞれの試料と共に４℃で一晩インキュベートした。結合した一次抗体の検出には、酵素結合二次抗体を使用した。染色されたスライドの画像を２０Ｘ倍率で捕捉した。ＩＨＣ解析の結果を、図２に示す。

【0289】

結果
本実施例は、１０ｋｂ超の治療的ｍＲＮＡのインビボ投与、送達および発現の成功を示す。特に、本実施例では、１４ｋｂのｍＲＮＡであるｈＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡを封入し、噴霧により投与し、インビボで肺に送達することに成功した。図１Ｂは、第１群および第２群の各マウスについて、気管（１）、上葉（２）、中葉（３）、下葉（４）、および大静脈後葉（ｐｏｓｔ－ｃａｖａｌ ｌｏｂｅ）（５）の各々の細胞における、ｈＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡ沈着の成功を示すｑＰＣＲデータを提供する。図２Ａは、第１群および第２群の各々におけるマウスのｈＤＮＡＨ５ ｍＲＮＡ肺組織から発現されたｈＤＮＡＨ５タンパク質に対する陽性染色を示す、例示的なＩＨＣ画像を提供する。さらに、図２Ｂは、第１群および第２群のマウスの、気管の組織ならびに肺全体の組織における、ｈＤＮＡＨ５タンパク質に対する陽性染色を伴うＩＨＣ画像を、上から下（図２Ｂの左から右）に示す。

【0290】

例示的な配列
例示的なコドン最適化ｍＲＮＡ配列は、配列番号６～３１に示される。配列開示の目的のために、ＵおよびＴは互換的に使用される。

【0291】

均等物
当業者は、日常的な実験作業を越えない手法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認できるものとなる。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されず、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【配列表】

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【外国語明細書】