特開 2024-2868 キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024002868

(43)【公開日】2024-01-11

(54)【発明の名称】キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/36 20060101AFI20231228BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231228BHJP

【ＦＩ】

A61K47/36

A61K9/51

A61K48/00

A61K45/00

A61P35/00

【審査請求】有

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022162857

(22)【出願日】2022-10-10

(31)【優先権主張番号】202210731610.3

(32)【優先日】2022-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】515223167

【氏名又は名称】中国海洋大学

(74)【代理人】

【識別番号】100178434

【弁理士】

【氏名又は名称】李 じゅん

(72)【発明者】

【氏名】常 菁

(72)【発明者】

【氏名】韓 宝芹

(72)【発明者】

【氏名】孫 楽

(72)【発明者】

【氏名】谷 志洋

(72)【発明者】

【氏名】王 立▲とう▼

(72)【発明者】

【氏名】郭 麗々

(72)【発明者】

【氏名】李 文雅

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4C076AA65

4C076AA95

4C076EE37

4C076GG06

4C076GG07

4C084AA13

4C084AA17

4C084MA44

4C084NA13

4C084ZB261

4C084ZB262

(57)【要約】      （修正有）

【課題】分散性が良く、安定性が高く、良好な生物学的安全性を有する多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア及びその製造方法を提供する。
【解決手段】キトサンを主体とし、キトサンのアミノ基はそれぞれビタミンＥコハク酸エステル、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ヒスチジンと結合される、ことを特徴とする自己組織化ナノキャリアである。該自己組織化ナノキャリアは、好ましくは、球状又は楕円球状であり、平均粒径は１４７．６±４０．４ｎｍで、ＰＤＩ＝０．３８±０．０２９であり、その中、ビタミンＥコハク酸エステルの置換度は４．１３％で、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルの置換度は２２．６％で、ヒスチジンの置換度は１７．３９％である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリアであって、
前記ナノキャリアはキトサンを主体とし、キトサンのアミノ基はそれぞれビタミンＥコハク酸エステル（ＶＥＳ）、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）と結合される、
ことを特徴とするキトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア。

【請求項2】

前記ナノキャリアは球状又は楕円球状であり、平均粒径は１４７．６±４０．４ｎｍで、ＰＤＩ＝０．３８±０．０２９であり、その中、ビタミンＥコハク酸エステルの置換度は４．１３％で、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルの置換度は２２．６％で、ヒスチジンの置換度は１７．３９％である、
ことを特徴とする請求項１に記載の多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア。

【請求項3】

前記ナノキャリアの表面ゼータ電位は＋３２．８±７．３ｍＶである、
ことを特徴とする請求項１に記載の多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア。

【請求項4】

前記ナノキャリアは、形態が球状又は楕円球状であり、粒径サイズが比較的に均一であり、分散性がよく、ナノ粒子の間には比較的に強い静電作用があり、良好な生物学的安全性を有する、
ことを特徴とする請求項１に記載の多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア。

【請求項5】

請求項１に記載の多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリアの製造方法であって、
（１）キトサンを希酸溶液に溶解するステップと、
（２）ＶＥＳ溶液を製造し、活性化剤を添加するステップと、
（３）ステップ（１）で得られたキトサン液をステップ（２）ＶＥＳ溶液に滴下し、反応させるステップと、
（４）ステップ（３）で反応の完了した混合液に対してエタノール沈殿、透析及び凍結乾燥を行って、スポンジ状のビタミンＥコハク酸エステル－キトサン（ＶＣ）を得るステップと、
（５）ステップ（４）で得られたＶＣを酸性溶液に溶解し、次に、ｍＰＥＧ溶液を製造して活性化し、続いて、ＶＣ溶液をｍＰＥＧ溶液に滴下して反応させるステップと、
（６）ステップ（５）の反応が完了した後、透析及び凍結乾燥を行って、ビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＶＣＰ）を得るステップと、
（７）ステップ（６）で得られたＶＣＰを酸性溶液に溶解し、次に、Ｈｉｓ溶液を製造して活性化し、続いて、ＶＣＰ溶液をＨｉｓ溶液に滴下して反応させるステップと、
（８）ステップ（７）の反応が完了した後、透析及び凍結乾燥を行って、最終の生成物であるビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル－ヒスチジン（ＶＣＰＨ）を得るステップとを含む、
ことを特徴とする多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリアの製造方法。

【請求項6】

方法であって、この方法において請求項１に記載のキトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリアを薬物又は遺伝子のキャリアとして使用することを特徴とする方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）が改質されたナノ材料に関する。具体的には、キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア及びその製造方法に関し、海洋生物材料を製造する技術分野に属する。

【背景技術】

【0002】

キトサンは、Ｄ－グルコサミンとＮ－アセチルグルコサミンユニットにより構成される。キトサンの脱アセチル化度が約５０％に達すると、酸性水溶液に溶解し、キトサンが酸性環境において溶解すると、アミノ基が陽イオンに変化し、キトサンが唯一の陽イオン海洋多糖になる。キトサンは無毒で副作用がなく、良好な保湿や吸着性を持つ。しかしながら、水やほとんどの有機溶媒に溶解しないデメリットを持つため、さまざまな分野における応用が限られている。キトサンのより大きな役割を果たすために、キトサンの活性を有する官能基に対して化学修飾を行うことにより、キトサンの誘導体を得ることができる。化学改質は、キトサンの独自の特性を保留することができるだけではなく、キトサンの物理的及び化学的特性を改善して、キトサン誘導体の応用の範囲を拡大することができる。

【0003】

キトサンを薬物／遺伝子キャリアとして使用することは、現在の研究の焦点であり、幅広い応用の見込みがある。

【発明の概要】

【0004】

本発明の目的は、キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリアを提供することである。本発明の他の目的は、このナノキャリアの製造方法を提供することであり、また、このナノキャリアが腫瘍の薬物／遺伝子共同治療における応用について研究する。

【0005】

上記の目的を達成するために、本発明が採用する具体的な技術的な解決手段は次の通りである。

【0006】

キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア（ＶＣＰＨ）であって、前記ナノキャリアはキトサンを主体とし、キトサンのアミノ基はそれぞれビタミンＥコハク酸エステル（ＶＥＳ）、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）と結合される。

【0007】

さらに、前記ＶＣＰＨは球状又は楕円球状であり、平均粒径は１４７．６±４０．４ｎｍで、ＰＤＩ＝０．３８±０．０２９であり、その中、ＶＥＳの置換度は４．１３％で、ｍＰＥＧの置換度は２２．６％で、Ｈｉｓの置換度は１７．３９％である。

【0008】

さらに、前記ＶＣＰＨの表面ゼータ電位は＋３２．８±７．３ｍＶである。

【0009】

前記ＶＣＰＨは、形態が球状又は楕円球状であり、粒径サイズは比較的に均一であり、分散性は良好であり、ナノ粒子の間には比較的に強い静電相互作用があり、ナノミセルの安定性を維持することに有利であり、良好な生物学的安全性を有する。

【0010】

上記ナノキャリアの製造方法は、
（１）キトサンを希酸溶液に溶解するステップと、
（２）ＶＥＳ溶液を製造し、活性化剤を添加するステップと、
（３）ステップ（１）で得られたキトサン液をステップ（２）ＶＥＳ溶液に滴下し、反応させるステップと、
（４）ステップ（３）で反応完了した混合液をエタノール沈殿、透析及び凍結乾燥を行って、スポンジ状のビタミンＥコハク酸エステル－キトサン（ＶＣ）を得るステップと、
（５）ステップ（４）で得られたＶＣを酸性溶液に溶解し、ｍＰＥＧ溶液を製造して活性化し、続いて、ＶＣ溶液をｍＰＥＧ溶液に滴下して反応させるステップと、
（６）ステップ（５）の反応が完了した後、透析及び凍結乾燥を行って、生成物であるビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＶＣＰ）（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ－Ｃｈｉｔｏｓａｎ－Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ Ｅｔｈｅｒ）を得るステップと、
（７）前記ＶＣＰを酸性溶液に溶解し、Ｈｉｓ溶液を製造して活性化してから、ＶＣＰ溶液をＨｉｓ溶液に滴下して反応させるステップと、
（８）ステップ（７）の反応が完了した後、透析及び凍結乾燥を行って、最終の生成物であるビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル－ヒスチジン（ＶＣＰＨ）を得るステップとを含む。

【0011】

また、本発明は、前記ＶＣＰＨの共担持疎水性薬物と負に帯電する電子遺伝子キャリアの製造における応用を提供する。

【0012】

さらに、疎水性薬物をジメチルスルホキシドに分散させ、前記ＶＣＰＨを水に溶解し、両者を均一に混合し、透析処理を行い、次に、封入されなかった疎水性薬物を除去し、凍結乾燥を行う。

【0013】

さらに、負電荷電子遺伝子を水に溶解し、疎水性薬物が封入されたナノ粒子溶液を遺伝子水溶液に滴下し、両者を均一に混合し、静置する。

【0014】

さらに、前記疎水性薬物は疎水性ドキソルビシンであり、負電荷電子遺伝子はすでに構築されたｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ ＳＴＡＴ３－ｓｈＲＮＡ（ｐＤＮＡ）である。

【0015】

ＶＣＰＨを基にして製造されたＤＯＸ／ＶＣＰＨの封入率は８４．２１％であり、薬物担持量は最高３１．５８％であり、表面ゼータ電位は＋２８．１±１．３ｍＶである。また、前記ＤＯＸ／ＶＣＰＨナノ粒子はπ－π共役作用を有し、一定のｐＨ感度を持つ。

【0016】

ＶＣＰＨを基にして製造されたＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの平均粒径は２６７．９±８．９ｎｍで、ＰＤＩ＝０．２１９±０．００７であり、表面ゼータ（Ｚｅｔａ）電位は＋１５．１±０．２１ｍＶである。その形態は球状又は楕円球状であり、分散は均一で安定である。体内及び体外機能実験で良好な抗腫瘍効果を示しており、体外腫瘍抑制率は６２．４０％で、体内腫瘍抑制率は４０．１２％である。

【0017】

本発明のメリット及び技術的な効果は以下の通りである。
本発明により製造されたＶＣＰＨは、分散性が良く、安定性が高く、良好な生物学的安全性を有する。製造された薬物担持ナノ粒子は、安定性が強く、封入率及び薬物担持量が高い。ＶＣＰＨが薬物キャリアとして効果的に使用できることを実際に検証した。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ＣＳ、ＶＣ、ＶＣＰ及びＶＣＰＨの赤外線スペクトル画像である。

【図2】ＶＣＰＨの^１ＨＮＲＭ図である。

【図3】ＶＣＰＨナノ粒子の粒径分布図である。

【図4】ＶＣＰＨナノ粒子の表面ゼータ電位図である。

【図5】ＶＣＰＨナノ粒子の走査型電子顕微鏡像である。

【図6】異なる濃度のＶＣＰＨナノ粒子でＬ９２９細胞を処理時、２４時間及び４８時間における増殖状態の観察図である。

【図7】異なる濃度のＶＣＰＨナノ粒子で処理後、Ｌ９２９細胞の相対増殖率の結果図である。

【図8】ＤＯＸ／ＶＣＰＨの粒径分布図である。

【図9】ＤＯＸ／ＶＣＰＨの表面ゼータ電位図である。

【図10】ＤＯＸ／ＶＣＰＨの走査型電子顕微鏡像である。

【図11】ＤＯＸ・ＨＣｌ及びＤＯＸ／ＶＣＰＨのＵＶ吸収スペクトル画像である。

【図12】ＤＯＸ／ＶＣＰＨのｐＨ＝５．７及びｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液における放出曲線である。

【図13】ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの粒径分布図である。

【図14】ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの表面ゼータ電位図である。

【図15】ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡナノ粒子の走査型電子顕微鏡像である。

【図16】ＤＯＸ・ＨＣｌ、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ及びＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡのＩＣ_５０結果図である。

【図17】異なるナノ粒子でＡ５４９細胞トランスフェクション後の細胞の相対抑制率の結果図である。

【図18】異なるナノコンポジット粒子でＡ５４９細胞トランスフェクション後のレーザー共焦点走査型顕微鏡の観察図である。

【図19】異なるナノコンポジット粒子でＡ５４９細胞トランスフェクション後のＧＦＰ陽性率をフローサイトメトリーで検出した結果図である。

【図20】異なるナノ粒子群におけるヌードマウスの相対体重の変化図である（生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５）。

【図21】異なるナノ粒子群におけるヌードマウスの相対腫瘍直径の変化図である。（生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。

【図22】異なる群におけるヌードマウスの主要臓器の臓器指数である。（生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５）。

【図23】異なる群におけるヌードマウスの腫瘍切除後の固形腫瘍図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、具体的な実施例を基づき、添付の図面と結合して、本発明を更に解釈及び説明する。

【実施例0020】

０．２４ｇのキトサンを秤量し、６０ｍＬの０．５％酢酸溶液に溶解し、１．５９ｇのＶＥＳを４０ｍＬのＤＭＦに溶解し、三口フラスコに入れる。次に、１．１５ｇのＥＤＣと０．６８ｇのＮＨＳを秤量し、上記の溶液に添加し、２時間磁気撹拌し、キトサン溶液を定圧滴定漏斗により三口フラスコに滴下し、室温で４８時間撹拌する。反応後の混合液を５倍体積の無水エタノールに注ぎ入れて沈殿させ、８時間撹拌した後、１２０００ｒｐｍで室温で２０分間遠心分離する。次に、無水エタノールで４～５回洗浄して沈殿させ、２００ｍＬの蒸留水で溶解して沈殿させ、透析バッグ（阻止率８０００－１４０００ｋ）に入れ、３日間透析し、凍結乾燥を行って、スポンジ状のビタミンＥコハク酸エステル－キトサン（ＶＣ）を得る。

【0021】

０．２４ｇのＶＣを秤量し、６０ｍＬの０．５％酢酸溶液に溶解し、後で使用する。０．２ｇのポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）を秤量し、６０ｍＬの０．５％酢酸溶液に溶解し、０．５７ｇのＥＤＣと０．３４ｇのＮＨＳを添加し、２時間磁気攪拌した後、上記ＶＣ溶液をゆっくりと混合液に滴下し、室温で３６時間機械撹拌する。反応が完了した後、混合液を透析バッグ（阻止率３５００ｋ）に入れ、３日間透析し、凍結乾燥の方法によりビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＶＣＰ）を得る。

【0022】

０．４ｇのＶＣＰを秤量し、８０ｍＬの０．５％酢酸溶液に溶解し、後で使用する。０．１９３ｇのヒスチジン（Ｈｉｓ）を秤量し、脱イオン水に溶解し、０．２８６ｇのＥＤＣと０．４７６ｇのＮＨＳを添加し、２時間磁気攪拌した後、上記ＶＣＰ溶液をゆっくりと混合液に滴下し、室温で２４時間機械撹拌する。反応が完了した後、混合液を透析バッグ（阻止率８０００～１４０００ｋ）に入れ、３日間透析し、凍結乾燥を行って、最終生成物であるビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル－ヒスチジン（ＶＣＰＨ）を得る。

【0023】

赤外線分光スペクトルとＮＭＲ（核磁気共鳴）水素スペクトル特性付けを採用して合成された最終生成物であるＶＣＰＨの結果を図１と図２に示す。赤外線及びＮＭＲの結果を組み合わせると、ビタミンＥコハク酸エステル、ｍＰＥＧ及びＨｉｓがキトサンへのグラフトに成功したことを判断できる。レーザー粒径電位アナライザーを採用してＶＣＰＨナノ粒子の粒径、表面ゼータ電位及び多分散指数（ＰＤＩ）を測定し、その結果を図３及び図４に示す。ＶＣＰＨナノ粒子の平均粒径は１４７．６±４０．４ｎｍで、ＰＤＩ＝０．３８±０．０２９で、表面ゼータ電位は＋３２．８±７．３ｍＶである。

【0024】

上記の結果は、ＶＣＰＨナノ粒子の粒径サイズが分散して均一であり、ナノ粒子の間に比較的に強い静電相互作用があり、ナノミセルの安定性を維持するために有利であることを示す。走査型電子顕微鏡でＶＣＰＨナノ粒子の形態を観察し、その結果を図５に示す。この図から、ＶＣＰＨナノ粒子は球状又は楕円球状であり、粒径サイズは約１００～２００ｎｍであり、均一に分散され、明らかな凝集現象がないことが観察できる。

【実施例0025】

Ｌ９２９細胞が対数増殖期にある時、パンクレアチンを添加して消化した後、培地で消化を停止し、遠心分離し、細胞ペレットを収集し、細胞を再懸濁した後、細胞懸濁液の濃度を２×１０^４個／ｍＬに調整し、１ウェルあたり２００μＬで９６ウェルプレートに播種する。２４時間培養した後、ウェルプレート内の古い培地を吸引して廃棄し、２００μＬの異なる濃度のＶＣＰＨ溶液を含む培地を添加し、濃度勾配を１０、５０、１００及び２００μｇ／ｍＬに設定し、通常の培地で培養された細胞播種ウェル及び通常の培地のみを含むが細胞が播種されていないウェルをそれぞれ対照群及びブランク対照群として設定し、各群に６セットの重複ウェルを設定する。穏やかに混ぜた後、ウェルプレートを２４時間及び４８時間インキュベートした後、それぞれ異なる時点で取り出し、倒立顕微鏡下で細胞の形態を観察し、写真を撮る。次に、各ウェルに２０μＬの製造されたＭＴＴ溶液を添加し、３７℃のインキュベーターで４時間インキュベートし、上清液を吸引して廃棄し、１５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、マイクロプレートリーダーで３７°Ｃで１０分間振とうしながらインキュベートした後、４９２ｎｍの波長で各ウェルの吸光度値（ＯＤ値）を測定する。次の公式に従って、細胞の相対増殖率（ＲＧＲ）は算出する。

【0026】

細胞の相対増殖率（ＲＧＲ％）＝（実験群の平均吸光度値－ブランク群の平均吸光度値）／（対照群の平均吸光度値－ブランク群の平均吸光度値）×１００％

【0027】

細胞毒性の評価基準は表１の通りである。

【表1】

表１は細胞毒性の評価表である。
備考：グレード０又は１は適格と見なされ、グレード２は細胞の形態と組み合わせて評価する必要があり、グレード３～５は不適格と見なされる。

【0028】

図６は、異なる濃度のＶＣＰＨナノ粒子とＬ９２９細胞を２４時間及び４８時間共培養した細胞の形態図である。この図から、Ｌ９２９細胞は２４時間及び４８時間の培養後にいずれも正常に成長及び増殖でき、細胞の形態が良好で、正常な紡錘形又は扁平状の細胞の形態を呈し、対照群の細胞と比較して細胞数に明らかな差はなく、細胞の変形、収縮、又は細胞間のお互いの分離等の明らかなアポトーシスが見られないことがわかる。

【0029】

図７は、異なる濃度のＶＣＰＨナノ粒子がＬ９２９細胞に対する細胞の相対増殖率をＭＴＴ法（ＭＴＴアッセイプロトコル）で検出した図である。この図から、ＶＣＰＨとＬ９２９を２４時間共培養したか又は４８時間共培養したかにかかわらず、その細胞の相対増殖率はいずれも８０％を超えていることがわかる。細胞毒性の評価によると、各ナノ粒子群の細胞毒性はグレード０又は１であることがわかる。これは、ＶＣＰＨナノ粒子は細胞毒性がなく、良好な細胞適合性を持つことを示す。