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特開2024-28724細胞の脱サービス化状態の分子マーカーの検出およびその調節方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024028724
(43)【公開日】2024-03-05
(54)【発明の名称】細胞の脱サービス化状態の分子マーカーの検出およびその調節方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240227BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240227BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20240227BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240227BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240227BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12Q1/6876 Z ZNA
C12Q1/6813 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6851 Z
【審査請求】有
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023197126
(22)【出願日】2023-11-21
(62)【分割の表示】P 2021562082の分割
【原出願日】2020-04-17
(31)【優先権主張番号】201910314706.8
(32)【優先日】2019-04-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】521119197
【氏名又は名称】ナンジン・ユニバーシティ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１６３ Ｘｉａｎｌｉｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｑｉｘｉａ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｎａｎｊｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１００２３， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チャン，チェンユ
(72)【発明者】
【氏名】ジョウ，ゼン
(72)【発明者】
【氏名】フー，シウティン
(72)【発明者】
【氏名】リ，ジン
(72)【発明者】
【氏名】ジョウ，シンヤン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】細胞のサービス化状態を検出するための核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）またはその検出試薬の用途を提供する。
【解決手段】核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）の検出試薬の使用であって、分化細胞のサービス化状態を検出するための試薬又はキットの調製に用いられ、ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、及び、ＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される、前記使用である。
【選択図】なし
【解決手段】核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）の検出試薬の使用であって、分化細胞のサービス化状態を検出するための試薬又はキットの調製に用いられ、ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、及び、ＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される、前記使用である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）またはその検出試薬の使用であって、
細胞のサービス化状態を検出するための試薬またはキットの調製に用いられることを特徴とする、前記使用。
細胞のサービス化状態を検出するための試薬またはキットの調製に用いられることを特徴とする、前記使用。
【請求項2】
前記サービス化状態は、インサービス化状態、脱サービス化状態、またはその変換を含むことを特徴とする、
請求項１に記載の使用。
請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記ｓｎｏＲＮＡは、哺乳動物、齧歯動物、霊長類動物に由来することを特徴とする、
請求項１に記載の使用。
請求項１に記載の使用。
【請求項4】
前記ｓｎｏＲＮＡは、臓器、組織、細胞特異的なｓｎｏＲＮＡであることを特徴とする、
請求項１に記載の使用。
請求項１に記載の使用。
【請求項5】
前記臓器は、関節、靭帯、舌、唾液腺、耳下腺、下顎腺、舌下腺、咽頭、食道、胃、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、肝臓、胆嚢、腸間膜、膵臓、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜、腎臓、尿管、膀胱、尿道、卵巣、卵管、子宮、膣、胎盤、精巣、精巣上体、精管、精嚢、前立腺、尿道球腺、陰茎、陰嚢、脳下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎腺、膵臓腺、心臓、動脈、静脈、毛細血管、リンパ管、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、腸関連リンパ組織、扁桃腺、脳、間脳、脳幹、中脳、橋（ｐｏｎｓ）、延髄、小脳、脊髄、脳室、脈絡叢、脳神経、脊髄神経、神経節、腸管神経系、角膜、虹彩、毛様体、水晶体、網膜、耳たぶ、鼓膜、耳小骨、蝸牛、耳前庭、三半規管、舌、皮膚からなる群から選択されることを特徴とする、
請求項１に記載の使用。
請求項１に記載の使用。
【請求項6】
前記組織は、上皮組織、結合組織、神経組織および筋肉組織からなる群から選択されることを特徴とする、
請求項１に記載の使用。
請求項１に記載の使用。
【請求項7】
前記細胞は、外分泌上皮細胞、バリア細胞、およびホルモン分泌細胞を含む、内胚葉に由来する細胞を含むことを特徴とする、
請求項１に記載の使用。
請求項１に記載の使用。
【請求項8】
前記ｓｎｏＲＮＡは、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択されることを特徴とする、
請求項１に記載の使用。
請求項１に記載の使用。
【請求項9】
サービス化状態の分子マーカーを決定する方法であって、
（１）第１のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第１のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第１のデータセットを得る段階、
（２）第２のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第２のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第２のデータセットを得る段階、および
（３）第１のデータセットと第２のデータセットとを比較して、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態における固有のｓｎｏＲＮＡの種類および量の情報を決定することにより、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態における固有の分子マーカーを区別する段階
を含むことを特徴とする、前記サービス化状態の分子マーカーを決定する方法。
（１）第１のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第１のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第１のデータセットを得る段階、
（２）第２のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第２のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第２のデータセットを得る段階、および
（３）第１のデータセットと第２のデータセットとを比較して、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態における固有のｓｎｏＲＮＡの種類および量の情報を決定することにより、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態における固有の分子マーカーを区別する段階
を含むことを特徴とする、前記サービス化状態の分子マーカーを決定する方法。
【請求項10】
ｓｎｏＲＮＡまたはその促進剤またはその拮抗剤の使用であって、
細胞組織または臓器のサービス化状態を調節するための薬物または製剤の調製に用いられることを特徴とする、前記使用。
細胞組織または臓器のサービス化状態を調節するための薬物または製剤の調製に用いられることを特徴とする、前記使用。
【請求項11】
前記ｓｎｏＲＮＡは、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択されることを特徴とする、
請求項１０に記載の使用。
請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、具体的には、ヒトおよび動物の組織および細胞における細胞の脱サービス化状態を区別するために使用される核小体低分子リボ核酸分子の分離、定性および定量分析に関し、同時に細胞の脱サービス化状態を変更するためのヒトおよび動物の組織および細胞における核小体低分子リボ核酸を調節する応用方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）は、中程度の長さの非コード化低分子ＲＮＡのクラスであり、それらの長さは、６０～３００ｎｔの範囲であり、核小体リボヌクレオタンパク質と結合してｓｎｏＲＮＰ複合体を形成することができる。脊椎動物において、核小体低分子ＲＮＡをコードする遺伝子は、主にタンパク質コード遺伝子またはタンパク質非コード遺伝子のイントロン領域に存在し、さらなる転写後プロセシングを受けて成熟した核小体低分子ＲＮＡを形成する。ヒト細胞において、ＲＮＡの転写後修飾、ｍＲＮＡの安定性および翻訳の制御は、遺伝子発現調節の重要な構成要素である。ｓｎｏＲＮＡとそれらとが生成するＲＮＡの機能的な短いフラグメントは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）の修飾を指示し、それらの相補的な前駆体ｍＲＮＡのスプライシングおよびｍＲＮＡの翻訳と安定性との制御に影響を与えるプロセスで重要な役割を果たす。外的要因および細胞内のシグナルカスケード反応は、ｓｎｏＲＮＡの発現レベルの変化を引き起こすことができて、細胞レベルの生理学的変化、臓器機能障害および様々な疾患を引き起こす。ｓｎｏＲＮＡの検出および調節により、細胞のサービス化と脱サービス化との状態を効果的に決定および変更することができる。
【0003】
細胞の異なるサービス化状態に関する研究が始まったばかりであるため、現在、細胞のサービス化状態および脱サービス化状態を具体的かつ効果的に定義できる効果的な分子マーカーはない。
従って、当技術分野で効果的なｓｎｏＲＮＡの検出および調節方法を構築することが急務である。
従って、当技術分野で効果的なｓｎｏＲＮＡの検出および調節方法を構築することが急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
現在、医学的臨床過程において、説明がない多くの生理学的現象があり、例えば、肝炎の患者は過度に疲労することはできず、腎臓腫瘍の患者は小さな腫瘍病巣にもかかわらず腎不全で死亡し、遷延性意識障害は、正常な反射を示さないが生理学的状態は正常である等の一連の現象である。細胞の脱サービス化状態に関する研究は、これらの問題をよりよく説明するのにさらに役立つことができる。この一連の研究の前提は、このような状態を識別できるマーカーを見つけることである。
【0005】
本発明者らは、研究対象として核小体低分子リボ核酸を選択し、細胞内の核小体低分子リボ核酸の発現変化を検出することによってこの現象を区別することを期待し、同時に細胞内の核小体低分子リボ核酸の発現を調節して細胞を脱サービス化状態からサービス化状態に変更することにより、臨床上で治療的役割を果たすことができることをさらに期待する。
【0006】
本発明の目的は、まず、細胞の脱サービス化状態の検出マーカーを提供することであり、前記マーカーは、動物および植物細胞において以下の検出可能なｓｎｏＲＮＡのいずれか一つまたは複数、好ましくは、任意の二つまたは複数を含み、ｓｎｏＲＮＡ配列は、ｈｔｔｐ：／／ｓｎｏｏｐｙ．ｍｅｄ．ｍｉｙａｚａｋｉ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／を参照する。
【0007】
本発明の別の目的は、細胞の状態をさらに評価することができる、上記細胞の脱サービス化状態を検出するためのｓｎｏＲＮＡマーカー検出方法を提供することである。
【0008】
本発明の別の目的は、細胞のサービス化状態と脱サービス化状態との間で変換するようにｓｎｏＲＮＡを調節することによって、生物体内ｓｎｏＲＮＡを調節するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の第１の態様は、細胞のサービス化状態を検出するための試薬またはキットの調製に使用される、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）またはその検出試薬の用途を提供する。
別の好ましい例において、前記サービス化状態は、インサービス化状態、脱サービス化状態、またはその変換を含む。
別の好ましい例において、前記サービス化状態は、インサービス化状態、脱サービス化状態、またはその変換を含む。
【0010】
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、哺乳動物、齧歯動物、および霊長類動物に由来する。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、ヒト、およびマウスに由来する。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、臓器、組織、および細胞特異的なｓｎｏＲＮＡである。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、ヒト、およびマウスに由来する。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、臓器、組織、および細胞特異的なｓｎｏＲＮＡである。
【0011】
別の好ましい例において、前記臓器は、関節、靭帯、舌、唾液腺、耳下腺、下顎腺、舌下腺、咽頭、食道、胃、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、肝臓、胆嚢、腸間膜、膵臓、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜、腎臓、尿管、膀胱、尿道、卵巣、ファロピウス管、子宮、膣、胎盤、精巣、精巣上体、精管、精嚢腺、前立腺、尿道球腺、陰茎、陰嚢、脳下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎腺、膵臓腺、心臓、動脈、静脈、毛細血管、リンパ管、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、腸関連リンパ組織、扁桃腺、脳、間脳、脳幹、中脳、橋（ｐｏｎｓ）、延髄髄質、小脳、脊髄、脳室、脈絡叢、脳神経、脊髄神経、神経節、腸管神経系、角膜、虹彩、毛様体、水晶体、網膜、耳たぶ、鼓膜、耳小骨、蝸牛、耳前庭、半円形管、舌、皮膚等からなる群から選択される。
【0012】
別の好ましい例において、前記組織は、上皮組織（単層上皮組織、単層円柱上皮組織、偽層状繊毛上皮組織、層状立方上皮組織）、結合組織（脂肪組織、緩い結合組織、線維性結合組織、硝子性軟骨組織、弾性軟骨組織、線維軟骨組織、骨組織、血液組織）、神経組織および筋肉組織（心筋、骨格筋、平滑筋）からなる群から選択される。
【0013】
別の好ましい例において、前記細胞は、外分泌上皮細胞、バリア細胞、およびホルモン分泌細胞を含む、内胚葉に由来する細胞を含む。外分泌上皮細胞は、十二指腸のホルナー細胞、呼吸管および消化管のゴブレット細胞、胃部の小窩細胞、主細胞、壁側細胞、膵臓腺房細胞、小腸のパネス細胞、肺ＩＩ型肺胞細胞、肺の棒状細胞を含む。バリア細胞は、Ｉ型肺細胞、胆嚢上皮細胞、肺胞心臓細胞、挿入管細胞，腸刷子縁細胞を含む。ホルモン分泌細胞には、腸内分泌細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、膵島細胞の４種類がある。腸内分泌細胞は、Ｋ細胞、Ｌ細胞、Ｉ細胞、Ｇ細胞、エンテロクロマフィン細胞、エンテロクロマフィン様細胞、Ｎ細胞、Ｓ細胞、Ｄ細胞、Ｍｏ細胞を含み、甲状腺細胞は、甲状腺上皮細胞、および濾胞傍細胞を含み、副甲状腺細胞は、主な副甲状腺細胞、および好酸球を含み、膵島細胞は、Ａｌｐｈａ細胞、Ｂｅｔａ細胞、Ｄｅｌｔａ細胞、Ｅｐｓｉｌｏｎ細胞、およびｐｐ細胞を含む。外胚葉に由来する細胞には、主に外分泌上皮細胞、ホルモン分泌細胞、上皮細胞、および神経系細胞等がある。ここで、外分泌細胞は、唾液腺粘液細胞、唾液腺血漿細胞、舌フェンガイボーン腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳ワックス腺細胞、外分泌汗腺暗細胞、外分泌汗腺明細胞、アポクリン汗腺細胞、まぶたモクスリー腺細胞、脂肪腺細胞、および十二指腸のホルナー細胞を含む。ホルモン分泌細胞は、下垂体の前葉および中葉のコルチコトロピン細胞、ゴナドトロピン細胞、プロラクチン細胞、メラノサイト、成長ホルモン細胞、甲状腺刺激細胞、および大細胞神経分泌細胞、小細胞神経分泌細胞、クロマフィン細胞を含む。上皮細胞は、ケラチノサイト、表皮基底細胞、メラノサイト、髄質毛細胞、皮質毛軸細胞、表皮毛軸細胞、Ｈｕｘｌｅｙ層毛根鞘細胞、外根鞘毛細胞、表面上皮細胞、基底細胞、挿入管細胞、線条管細胞、乳管細胞、およびエナメル芽細胞を含む。神経系の細胞は、センサー細胞、自律神経細胞、感覚器官および末梢ニューロン支持細胞、中枢神経系ニューロンおよびグリア細胞、ならびに水晶体細胞の五つのカテゴリーに分けられる。センサー細胞は、皮質聴覚内有毛細胞、皮質聴覚外有毛細胞、臭覚上皮基底細胞、寒冷感受性一次感覚ニューロン、熱感受性一次感覚ニューロン、表皮メルケル（Ｍｅｒｋｅｌ）細胞、臭覚受容体ニューロン、痛み感受性一次感覚ニューロン、固有受容性一次感覚ニューロン、触覚感受性一次感覚ニューロン、頸動脈体性化学受容体細胞、耳前庭系の外有毛細胞、耳前庭系の内有毛細胞、味蕾の味覚受容細胞、および網膜視細胞を含み、網膜視細胞は、視細胞桿体細胞、視細胞用の青色感受性錐体細胞、視細胞用の緑色感受性錐体細胞、および視細胞用の赤色感受性錐体細胞に細分されることができる。自律神経細胞は、コリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、およびポリペプチド神経細胞を含む。感覚器官および末梢ニューロン支持細胞は、皮質内柱細胞、皮質外柱細胞、皮質内指細胞、皮質外指細胞、皮質境界細胞、皮質ヘンセン（Ｈｅｎｓｅｎ）細胞、前庭支持細胞、味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、衛星グリア細胞、および腸溶グリア細胞を含む。中枢神経系ニューロンおよびグリア細胞は、ニューロン細胞、星状細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、および下垂体細胞を含み、ここで、ニューロン細胞は、介在ニューロンおよび主細胞に分けられることができ、介在ニューロンは、バスケット細胞、ホイール細胞、星状細胞、ゴルジ細胞、顆粒細胞、ルガロ細胞（Ｌｕｇａｒｏ）、単極ブラシ細胞、マルティノッティ（Ｍａｒｔｉｎｏｔｔｉ）細胞、シャンデリア細胞、カハール・レツイウス（Ｃａｊａｌ-Ｒｅｔｚｉｕｓ）細胞、ダブルブーケ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｂｏｕｑｕｅｔ）細胞、グリア細胞、網膜レベル細胞、アマクリン細胞、脊髄介在ニューロン、およびランショック細胞を含み、主細胞は、紡錘ニューロン、フォークニューロン、錐体細胞、星状細胞、境界細胞、毛深い細胞、プルキンエ細胞、および中型とげニューロンを含み、錐体細胞は、位置細胞、測位細胞、速度細胞、方向認識細胞、および巨大錐体細胞を含む。水晶体細胞は、水晶体上皮細胞およびクリスタリンを含む水晶体線維細胞を含む。中胚葉に由来する細胞は、主に代謝および貯蔵細胞、分泌細胞、バリア細胞、細胞外マトリックス細胞、収縮細胞、血液および免疫系細胞、生殖細胞、栄養膜細胞、ならびに間葉組織細胞の九つタイプを含む。代謝および貯蔵細胞は、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞および肝臓脂肪細胞を含む。分泌細胞は、ミネラルコルチコイドを生成する副腎皮質球状態細胞、グルココルチコイドを生成する副腎皮質束状態細胞、アンドロゲンの３種類の副腎皮質細胞および卵巣濾胞内膜細胞を生成する副腎皮質網状態細胞、顆粒状ルテイン細胞、黄体細胞、精巣間質細胞、精嚢腺細胞、前立腺細胞、球腺細胞、大前庭腺細胞、尿道または尿道周囲腺細胞、子宮内膜細胞、傍糸球体細胞、腎高密度プラーク細胞、腎極性周囲細胞、および腎メサンギウム細胞を含む。バリア細胞は、足細胞、近位尿細管刷子縁細胞、ヘンリーリングセグメント細胞、遠位尿細管細胞、腎集合管細胞の主細胞と挿入細胞、および移行上皮細胞を含む泌尿器系、管細胞、排出管細胞、精巣上体主細胞、および精巣上体基底細胞を含む生殖器系、ならびに循環器系の内皮細胞の三つのタイプに分けられることができる。細胞外マトリックス細胞は、耳前庭半円形管上皮細胞、皮質歯間上皮細胞、緩い結合組織線維芽細胞、角膜線維芽細胞、腱線維芽細胞、骨髄網状線維芽細胞、他の非上皮線維芽細胞、例えば、肝星細胞、椎間板髄核細胞、硝子性軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、眼硝子体明細胞、耳介外リンパ腔星状細胞、膵臓星状細胞等のペリサイトを含む。収縮細胞は、赤い骨格筋細胞、白い骨格筋細胞、中間骨格筋細胞、筋紡錘核ポケット細胞、筋紡錘核鎖細胞、筋衛星細胞の６種類の骨格筋細胞、心筋細胞、副鼻腔結節細胞、プルキニエ線維細胞の３種類の心筋細胞、および平滑筋細胞、虹彩筋上皮細胞、外分泌腺筋上皮細胞を含む。血液と免疫系の細胞は、赤血球、巨核球、血小板、単球、結合組織のマクロファージ、表皮のランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア、好中球、好酸球細胞、好塩基球細胞、ハイブリドーマ細胞、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、天然キラーＴ細胞、Ｂ細胞、天然キラー細胞、網状細胞、および血液と免疫系の幹細胞と前駆細胞を含む。生殖細胞は、卵原細胞／卵母細胞、精子細胞、精原細胞、精母細胞、および精子を含む。栄養膜細胞は、卵巣の顆粒細胞、精巣の支持細胞、および上皮網状細胞を含む。間質組織細胞は、間質組織腎臓細胞を含む。
【0014】
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、表１に示される一つまたは複数、またはそれらの組み合わせである。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される。
【0015】
本発明の第２の態様は、
（１）第１のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第１のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第１のデータセットを得る段階と、
（２）第２のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第２のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第２のデータセットを得る段階と、および
（３）第１のデータセットと第２のデータセットとを比較して、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態とにおける固有のｓｎｏＲＮＡの種類および量情報を決定することにより、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態とにおける固有の分子マーカーを区別する段階とを含む、サービス化状態の分子マーカーを決定する方法を提供する。
（１）第１のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第１のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第１のデータセットを得る段階と、
（２）第２のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第２のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第２のデータセットを得る段階と、および
（３）第１のデータセットと第２のデータセットとを比較して、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態とにおける固有のｓｎｏＲＮＡの種類および量情報を決定することにより、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態とにおける固有の分子マーカーを区別する段階とを含む、サービス化状態の分子マーカーを決定する方法を提供する。
【0016】
別の好ましい例において、前記第１のサービス化状態は、インサービス化状態である。
別の好ましい例において、前記第２のサービス化状態は、脱サービス化状態である。
別の好ましい例において、前記第２のサービス化状態は、脱サービス化状態である。
【0017】
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、哺乳動物、齧歯動物、および霊長類動物に由来する。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、ヒト、およびマウスに由来する。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、臓器、組織、および細胞特異的なｓｎｏＲＮＡである。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、ヒト、およびマウスに由来する。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、臓器、組織、および細胞特異的なｓｎｏＲＮＡである。
【0018】
別の好ましい例において、前記臓器は、関節、靭帯、舌、唾液腺、耳下腺、下顎腺、舌下腺、咽頭、食道、胃、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、肝臓、胆嚢、腸間膜、膵臓、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜、腎臓、尿管、膀胱、尿道、卵巣、ファロピウス管、子宮、膣、胎盤、精巣、精巣上体、精管、精嚢腺、前立腺、尿道球腺、陰茎、陰嚢、脳下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎腺、膵臓腺、心臓、動脈、静脈、毛細血管、リンパ管、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、腸関連リンパ組織、扁桃腺、脳、間脳、脳幹、中脳、橋（ｐｏｎｓ）、延髄髄質、小脳、脊髄、脳室、脈絡叢、脳神経、脊髄神経、神経節、腸管神経系、角膜、虹彩、毛様体、水晶体、網膜、耳たぶ、鼓膜、耳小骨、蝸牛、耳前庭、半円形管、舌、皮膚等を含む。
【0019】
別の好ましい例において、前記組織は、上皮組織（単層上皮組織、単層円柱上皮組織、偽層状繊毛上皮組織、層状立方上皮組織）、結合組織（脂肪組織、緩い結合組織、線維結合組織、硝子性軟骨組織、弾性軟骨組織、線維軟骨組織、骨組織、血液組織）、神経組織和筋肉組織（心筋、骨格筋、平滑筋）を含む。
【0020】
別の好ましい例において、前記細胞は、外分泌上皮細胞、バリア細胞、およびホルモン分泌細胞を含む、内胚葉に由来する細胞を含む。外分泌上皮細胞は、十二指腸のホルナー細胞、呼吸管、消化管のゴブレット細胞、胃部の小窩細胞、主細胞、壁側細胞、膵臓腺房細胞、小腸のパネス細胞、肺ＩＩ型肺胞細胞、肺の棒状細胞を含む。バリア細胞は、Ｉ型肺細胞、胆嚢上皮細胞、肺胞心臓細胞、挿入管細胞、腸刷子縁細胞を含む。ホルモン分泌細胞には、腸内分泌細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、および膵島細胞の４種類がある。腸内分泌細胞は、Ｋ細胞、Ｌ細胞、Ｉ細胞、Ｇ細胞、エンテロクロマフィン細胞、エンテロクロマフィン様細胞、Ｎ細胞、Ｓ細胞、Ｄ細胞、Ｍｏ細胞を含み、甲状腺細胞は、甲状腺上皮細胞、および濾胞傍細胞を含み、副甲状腺細胞は、主な副甲状腺細胞、および好酸球を含み、膵島細胞は、Ａｌｐｈａ細胞、Ｂｅｔａ細胞、Ｄｅｌｔａ細胞、Ｅｐｓｉｌｏｎ細胞、およびｐｐ細胞を含む。外胚葉に由来する細胞には、主に外分泌上皮細胞、ホルモン分泌細胞、上皮細胞、および神経系細胞等がある。ここで、外分泌細胞は、唾液腺粘液細胞、唾液腺血漿細胞、舌フェンガイボーン腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳ワックス腺細胞、外分泌汗腺暗細胞、外分泌汗腺明細胞、アポクリン汗腺細胞、まぶたモクスリー腺細胞、脂肪腺細胞、および十二指腸のホルナー細胞を含む。ホルモン分泌細胞は、下垂体の前葉および中葉のコルチコトロピン細胞、ゴナドトロピン細胞、プロラクチン細胞、メラノサイト、成長ホルモン細胞、甲状腺刺激細胞、および大細胞神経分泌細胞、小細胞神経分泌細胞、クロマフィン細胞を含む。上皮細胞は、ケラチノサイト、表皮基底細胞、メラノサイト、髄質毛細胞、皮質毛軸細胞、表皮毛軸細胞、Ｈｕｘｌｅｙ層毛根鞘細胞、外根鞘毛細胞、表面上皮細胞、基底細胞、挿入管細胞、線条管細胞、乳管細胞、およびエナメル芽細胞を含む。神経系の細胞は、センサー細胞、自律神経細胞、感覚器官および末梢ニューロン支持細胞、中枢神経系ニューロンおよびグリア細胞、ならびに水晶体細胞の五つのカテゴリーに分けられる。センサー細胞は、皮質聴覚内有毛細胞、皮質聴覚外有毛細胞、臭覚上皮基底細胞、寒冷感受性一次感覚ニューロン、熱感受性一次感覚ニューロン、表皮メルケル細胞、臭覚受容体ニューロン、痛み感受性一次感覚ニューロン、固有受容性一次感覚ニューロン、触覚感受性一次感覚ニューロン、頸動脈体性化学受容体細胞、耳前庭系の外有毛細胞、耳前庭系の内有毛細胞、味蕾の味覚受容細胞、および網膜視細胞を含み、網膜視細胞は、視細胞桿体細胞、視細胞用の青色感受性錐体細胞、視細胞用の緑色感受性錐体細胞、および視細胞用の赤色感受性錐体細胞に細分されることができる。自律神経細胞は、コリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、およびポリペプチド神経細胞を含む。感覚器官および末梢ニューロン支持細胞は、皮質内柱細胞、皮質外柱細胞、皮質内指細胞、皮質外指細胞、皮質境界細胞、皮質ヘンセン細胞、前庭支持細胞、味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、衛星グリア細胞、および腸溶グリア細胞を含む。中枢神経系ニューロンおよびグリア細胞は、ニューロン細胞、星状細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、および下垂体細胞を含み、ここで、ニューロン細胞は、介在ニューロンおよび主細胞に分けられることができ、介在ニューロンは、バスケット細胞、ホイール細胞、星状細胞、ゴルジ細胞、顆粒細胞、ルガロ細胞、単極ブラシ細胞、マルティノッティ細胞、シャンデリア細胞、カハール・レツイウス細胞、ダブルブーケ細胞、グリア細胞、網膜レベル細胞、アマクリン細胞、脊髄介在ニューロン、およびランショック細胞を含み、主細胞は、紡錘ニューロン、フォークニューロン、錐体細胞、星状細胞、境界細胞、毛深い細胞、プルキンエ細胞、および中型とげニューロンを含み、錐体細胞は、位置細胞、測位細胞、速度細胞、方向認識細胞、および巨大錐体細胞を含む。水晶体細胞は、水晶体上皮細胞およびクリスタリンを含む水晶体線維細胞を含む。中胚葉に由来する細胞は、主に代謝および貯蔵細胞、分泌細胞、バリア細胞、細胞外マトリックス細胞、収縮細胞、血液および免疫系細胞、生殖細胞、栄養膜細胞、ならびに間葉組織細胞の九つタイプを含む。代謝および貯蔵細胞は、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞および肝臓脂肪細胞を含む。分泌細胞は、ミネラルコルチコイドを生成する副腎皮質球状態細胞、グルココルチコイドを生成する副腎皮質束状態細胞、アンドロゲンの３種類の副腎皮質細胞および卵巣濾胞内膜細胞を生成する副腎皮質網状態細胞、顆粒状ルテイン細胞、黄体細胞、精巣間質細胞、精嚢腺細胞、前立腺細胞、球腺細胞、大前庭腺細胞、尿道または尿道周囲腺細胞、子宮内膜細胞、傍糸球体細胞、腎高密度プラーク細胞、腎極性周囲細胞、および腎メサンギウム細胞を含む。バリア細胞は、足細胞、近位尿細管刷子縁細胞、ヘンリーリングセグメント細胞、遠位尿細管細胞、腎集合管細胞の主細胞と挿入細胞、および移行上皮細胞を含む泌尿器系、管細胞、排出管細胞、精巣上体主細胞、および精巣上体基底細胞を含む生殖器系、ならびに循環器系の内皮細胞の三つのタイプに分けられることができる。細胞外マトリックス細胞は、耳前庭半円形管上皮細胞、皮質歯間上皮細胞、緩い結合組織線維芽細胞、角膜線維芽細胞、腱線維芽細胞、骨髄網状線維芽細胞、他の非上皮線維芽細胞、例えば、肝星細胞、椎間板髄核細胞、硝子性軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、眼硝子体明細胞、耳介外リンパ腔星状細胞、膵臓星状細胞等のペリサイト。収縮細胞は、赤い骨格筋細胞、白い骨格筋細胞、中間骨格筋細胞、筋紡錘核ポケット細胞、筋紡錘核鎖細胞、筋衛星細胞の６種類の骨格筋細胞、心筋細胞、副鼻腔結節細胞、プルキニエ線維細胞の３種類の心筋細胞、および平滑筋細胞、虹彩筋上皮細胞、外分泌腺筋上皮細胞を含む。血液と免疫系の細胞は、赤血球、巨核球、血小板、単球、結合組織のマクロファージ、表皮のランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア、好中球、好酸球細胞、好塩基球細胞、ハイブリドーマ細胞、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、天然キラーＴ細胞、Ｂ細胞、天然キラー細胞、網状細胞、および血液と免疫系の幹細胞と前駆細胞を含む。生殖細胞は、卵原細胞／卵母細胞、精子細胞、精原細胞、精母細胞、および精子を含む。栄養膜細胞は、卵巣の顆粒細胞、精巣の支持細胞、および上皮網状細胞を含む。間質組織細胞は、間質組織腎臓細胞等を含む。
【0021】
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記方法は、非診断的かつ非治療的である。
別の好ましい例において、前記方法は、非診断的かつ非治療的である。
【0022】
本発明の第３の態様は、細胞組織または臓器のサービス化状態を調節するための薬物または製剤の調製に使用される、ｓｎｏＲＮＡまたはその促進剤またはその拮抗剤の用途を提供する。
別の好ましい例において、前記サービス化状態は、インサービス化状態、脱サービス化状態、またはその変換を含む。
別の好ましい例において、前記サービス化状態は、インサービス化状態、脱サービス化状態、またはその変換を含む。
【0023】
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、表１に示される一つまたは複数、またはそれらの組み合わせである。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ｓｎｏＲＮＡは、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される。
【発明の効果】
【0024】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】正常なマウスの様々な組織で検出されたいくつかのｓｎｏＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。
【図2】正常なマウスの様々な組織で検出されたいくつかのｓｎｏＲＮＡのリアルタイム（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ結果である。
【図3】インビトロでの脂肪細胞培養後様々な時点でのレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）遺伝子の発現変化を示す。
【図4】ハイスループットシーケンシングによって検出された様々な状態の脂肪細胞のｓｎｏＲＮＡの発現プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
本発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究の結果、サービス化状態および脱サービス化状態下での様々な組織および細胞におけるｓｎｏＲＮＡの特異的変化を研究することにより、細胞状態を診断するために使用される分子マーカーである、二つの細胞状態においてより高度な差次的発現を有するタイプのｓｎｏＲＮＡが得られることを初めて発見した。同時に、ｓｎｏＲＮＡ発現量を調節した後の細胞状態の変化を研究し、生物学的実験および臨床応用のために細胞のサービス化状態および脱サービス化状態を変換する方法を提供する。これに基づいて、本発明を完了した。
【0027】
細胞サービス化状態
インサービス：ｅｎｍｕｎｔｅ（動詞）、ｅｎｍｕｎｔｉｎｇ（動名詞）、ｅｎｍｕｎｔｉｏｎ（名詞）、ｅｎｍｕｎｔｉｖｅ（形容詞）、ｅｎｍｕｎｔｉｖｅｌｙ（副詞）
脱サービス：ｄｅｍｕｎｔｅ（動詞）、ｄｅｍｕｎｔｉｎｇ（動名詞）、ｄｅｍｕｎｔｉｏｎ（名詞）、ｄｅｍｕｎｔｉｖｅ（形容詞）、ｄｅｍｕｎｔｉｖｅｌｙ（副詞）
インサービス：ｅｎｍｕｎｔｅ（動詞）、ｅｎｍｕｎｔｉｎｇ（動名詞）、ｅｎｍｕｎｔｉｏｎ（名詞）、ｅｎｍｕｎｔｉｖｅ（形容詞）、ｅｎｍｕｎｔｉｖｅｌｙ（副詞）
脱サービス：ｄｅｍｕｎｔｅ（動詞）、ｄｅｍｕｎｔｉｎｇ（動名詞）、ｄｅｍｕｎｔｉｏｎ（名詞）、ｄｅｍｕｎｔｉｖｅ（形容詞）、ｄｅｍｕｎｔｉｖｅｌｙ（副詞）
【0028】
古典的な細胞生物学の概念において、特定の機能を有するすべての成熟細胞は、分化細胞と呼ばれるが、分化細胞が恒常性や内部環境を調節する特定の機能を欠いている場合、それらは単に「脱分化」と呼ばれ、前駆体細胞等の真の未分化細胞と区別がなく、特定の分子マーカーもない。
【0029】
本発明は、分化細胞に二つの状態があることを発見し、一つは、インサービス化状態（ｅｎｍｕｎｔｉｎｇ、恒常性を調節するサービス化機能を有する）であり、もう一つは、脱サービス化状態（ｄｅｍｕｎｔｉｎｇ、恒常性を調節するサービス化機能を有さない）である。この二つの状態は、どちらも分化状態であるため、細胞の生存と代謝（関連する遺伝子発現およびタンパク質合成）は、同じであり、サービス化機能があるかどうかの違いがある。ｄｅｍｕｎｔｉｎｇ細胞と前駆体細胞との違いは、生存と代謝との状態が異なるが（前駆体細胞はまだ分化していない）、特定のサービス機能の欠如の状態は同じであるということである。
【0030】
組織特異的ＳｎｏＲＮＡの増加は、ｄｅｍｕｎｔｉｎｇ細胞を同定するための生物マーカーであり、ＳｎｏＲＮＡを増やすと、細胞のｅｎｍｕｎｔｉｎｇ状態がｄｅｍｕｎｔｉｎｇ状態に変換することができ、ＳｎｏＲＮＡ減少させると、細胞のｄｅｍｕｎｔｉｎｇ状態をｅｎｍｕｎｔｉｎｇ状態に変換する。すべての組織細胞は、すべてこれら二つの状態で同時に存在する。ほとんどの病理条件下で、ｄｅｍｕｎｔｉｎｇ細胞の割合が増加して、臓器不全につながる。病理学的に増加したｄｅｍｕｎｔｉｎｇ細胞を減らすことは、脳死患者の覚醒、麻痺患者の機能神経の成長、嚢内の活性化された機能ニューロンの割合の増加等、すべての組織病理学的障害に治療効果をもたらす。
【0031】
本発明の主な利点は、次のとおりである。
１）本発明は、脱サービス化状態細胞と未分化細胞とを区別する分化細胞の二つの状態（インサービス化状態および脱サービス化状態）を発見し、これらの二つの状態を研究することにより、元の生物学的および医学的研究における多くの説明できない現象を説明することができる。
２）効果的なｓｎｏＲＮＡの検出法を構築することにより、本発明は、細胞のインサービス化状態および脱サービス化状態を迅速かつ簡単に同定することができ、細胞機能、状態、トランスクリプトームおよびプロテオームの変化を複雑に研究することで、これらの二つの細胞状態を同定する必要がなくなる。
３）効果的なｓｎｏＲＮＡの調節法を構築することにより、本発明は、細胞のインサービス化状態および脱サービス化状態を効果的に変換することができ、生物学的研究および臨床応用において大きな応用の見通しを有する。
４）本発明は、生物におけるｓｎｏＲＮＡの重要な調節機能をさらに発見し、生物学的理論研究および応用研究の新しい方向性を提供する。
１）本発明は、脱サービス化状態細胞と未分化細胞とを区別する分化細胞の二つの状態（インサービス化状態および脱サービス化状態）を発見し、これらの二つの状態を研究することにより、元の生物学的および医学的研究における多くの説明できない現象を説明することができる。
２）効果的なｓｎｏＲＮＡの検出法を構築することにより、本発明は、細胞のインサービス化状態および脱サービス化状態を迅速かつ簡単に同定することができ、細胞機能、状態、トランスクリプトームおよびプロテオームの変化を複雑に研究することで、これらの二つの細胞状態を同定する必要がなくなる。
３）効果的なｓｎｏＲＮＡの調節法を構築することにより、本発明は、細胞のインサービス化状態および脱サービス化状態を効果的に変換することができ、生物学的研究および臨床応用において大きな応用の見通しを有する。
４）本発明は、生物におけるｓｎｏＲＮＡの重要な調節機能をさらに発見し、生物学的理論研究および応用研究の新しい方向性を提供する。
【0032】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量パーセンテージおよび重量部数で計算される。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量パーセンテージおよび重量部数で計算される。
【0033】
一般的な方法
細胞の脱サービス化状態のｓｎｏＲＮＡマーカーを検出するための検出法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム蛍光定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ハイスループットシーケンシング技術またはバイオチップ法から選択される。
細胞の脱サービス化状態のｓｎｏＲＮＡマーカーを検出するための検出法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム蛍光定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ハイスループットシーケンシング技術またはバイオチップ法から選択される。
【0034】
ＲＴ－ＰＣＲ法は、好ましい方法であり、
１）被験細胞サンプルのトータルＲＮＡを抽出し（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して抽出する）、ＲＮＡ逆転写反応によりｃＤＮＡサンプルを取得し、または被験細胞サンプルのライセートを緩衝液として使用して、逆転写反応を実行してｃＤＮＡサンプルを調製する段階と、
２）ｓｎｏＲＮＡを使用してプライマーを設計して、ＰＣＲ反応を実行する段階と、
３）ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動を行う段階と、および
４）ＥＢ染色後の紫外線下での結果を観察する段階とを含む。
１）被験細胞サンプルのトータルＲＮＡを抽出し（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して抽出する）、ＲＮＡ逆転写反応によりｃＤＮＡサンプルを取得し、または被験細胞サンプルのライセートを緩衝液として使用して、逆転写反応を実行してｃＤＮＡサンプルを調製する段階と、
２）ｓｎｏＲＮＡを使用してプライマーを設計して、ＰＣＲ反応を実行する段階と、
３）ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動を行う段階と、および
４）ＥＢ染色後の紫外線下での結果を観察する段階とを含む。
【0035】
リアルタイムＰＣＲ法は、別の好ましい方法であり、
１）被験細胞サンプルのトータルＲＮＡを抽出し（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して抽出する）、ＲＮＡ逆転写反応によりｃＤＮＡサンプルを取得し、または被験細胞サンプルのライセートを緩衝液として使用して、逆転写反応を実行してｃＤＮＡサンプルを調製する段階と、
２）ｓｎｏＲＮＡを使用して、プライマーおよび蛍光染料を設計して、ＰＣＲ反応を実行する（ｓｎｏＲＮＡのＰＣＲプライマーについては表を参照する）段階と、および
３）正常な状態の細胞サンプルと比較して、被験細胞サンプル中のｓｎｏＲＮＡの量の変化を検出して比較する段階とを含む。
１）被験細胞サンプルのトータルＲＮＡを抽出し（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して抽出する）、ＲＮＡ逆転写反応によりｃＤＮＡサンプルを取得し、または被験細胞サンプルのライセートを緩衝液として使用して、逆転写反応を実行してｃＤＮＡサンプルを調製する段階と、
２）ｓｎｏＲＮＡを使用して、プライマーおよび蛍光染料を設計して、ＰＣＲ反応を実行する（ｓｎｏＲＮＡのＰＣＲプライマーについては表を参照する）段階と、および
３）正常な状態の細胞サンプルと比較して、被験細胞サンプル中のｓｎｏＲＮＡの量の変化を検出して比較する段階とを含む。
【0036】
ノーザンブロッティング法は、
１）被験細胞サンプルのトータルＲＮＡを抽出する（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して抽出する）段階と、
２）変形ＰＡＧＥ電気泳動および膜転写実験を行う段階と、
３）同位元素標識またはジゴキシゲニン標識核酸プローブを調製する段階と、
４）膜ハイブリダイゼーション反応を実行する段階と、および
５）同位元素シグナルまたはジゴキシゲニンシグナルを検出する段階とを含む。
１）被験細胞サンプルのトータルＲＮＡを抽出する（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して抽出する）段階と、
２）変形ＰＡＧＥ電気泳動および膜転写実験を行う段階と、
３）同位元素標識またはジゴキシゲニン標識核酸プローブを調製する段階と、
４）膜ハイブリダイゼーション反応を実行する段階と、および
５）同位元素シグナルまたはジゴキシゲニンシグナルを検出する段階とを含む。
【0037】
ハイスループットシーケンシング法は、
１）被験細胞サンプルのトータルＲＮＡを抽出する（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して抽出する）段階と、
２）変形ＰＡＧＥ電気泳動を実行して、５０ｎｔ以下のＲＮＡ分子を回収する段階と、
３）アダプタープライマーをＲＮＡ分子の３’末端および５’末端に酵素結合する段階と、
４）ＲＴ－ＰＣＲ反応およびシーケンシングを実行する段階と、および
５）データを分析および処理する段階とを含む。
１）被験細胞サンプルのトータルＲＮＡを抽出する（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して抽出する）段階と、
２）変形ＰＡＧＥ電気泳動を実行して、５０ｎｔ以下のＲＮＡ分子を回収する段階と、
３）アダプタープライマーをＲＮＡ分子の３’末端および５’末端に酵素結合する段階と、
４）ＲＴ－ＰＣＲ反応およびシーケンシングを実行する段階と、および
５）データを分析および処理する段階とを含む。
【0038】
バイオチップ法は、
１）ヒトの７００種類以上のｓｎｏＲＮＡライブラリーをすべて配列し、かつバイオチップを調製する段階と、
２）被験細胞サンプルのトータルＲＮＡを抽出する（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して抽出する）段階と、
３）カラム分離により小さなリボ核酸を分離する段階と、
４）Ｔ４ＲＮＡリガーゼを使用して、マイクロリボ核酸の蛍光標識を実行する段階と、および
５）バイオチップとのハイブリダイゼーション反応を実行する段階とを含む。
１）ヒトの７００種類以上のｓｎｏＲＮＡライブラリーをすべて配列し、かつバイオチップを調製する段階と、
２）被験細胞サンプルのトータルＲＮＡを抽出する（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して抽出する）段階と、
３）カラム分離により小さなリボ核酸を分離する段階と、
４）Ｔ４ＲＮＡリガーゼを使用して、マイクロリボ核酸の蛍光標識を実行する段階と、および
５）バイオチップとのハイブリダイゼーション反応を実行する段階とを含む。
【0039】
調節方法は、干渉ＲＮＡ調節法およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９調節法から選択される。
【0040】
干渉ＲＮＡ調節方法は、好ましい方法であり、
１）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ配列）および干渉ＲＮＡを発現できるｓｈＲＮＡ配列を設計する（ｓｉＲＮＡ配列およびｓｈＲＮＡ配列についてはｅｘｃｅｌを参照する）段階と、
２）干渉ＲＮＡまたは対応する干渉ＲＮＡを発現できるｓｈＲＮＡのプラスミド／ウイルスを調製する段階と、
３）トランスフェクション法を使用して、干渉ＲＮＡまたは干渉ＲＮＡを発現するプラスミドを細胞に移すか、またはウイルス感染法を使用して細胞を感染させる段階と、および
４）細胞を収集して、細胞状態を検出する段階とを含む。
１）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ配列）および干渉ＲＮＡを発現できるｓｈＲＮＡ配列を設計する（ｓｉＲＮＡ配列およびｓｈＲＮＡ配列についてはｅｘｃｅｌを参照する）段階と、
２）干渉ＲＮＡまたは対応する干渉ＲＮＡを発現できるｓｈＲＮＡのプラスミド／ウイルスを調製する段階と、
３）トランスフェクション法を使用して、干渉ＲＮＡまたは干渉ＲＮＡを発現するプラスミドを細胞に移すか、またはウイルス感染法を使用して細胞を感染させる段階と、および
４）細胞を収集して、細胞状態を検出する段階とを含む。
【0041】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９調節法は、別の好ましい方法であり、
１）ｓｇＲＮＡを設計する段階と、
２）ｓｇＲＮＡプラスミドベクターを構築する同時にｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを発現するａａｖウイルスを構築する段階と、
３）トランスフェクション法をを使用して、ｓｇＲＮＡプラスミドおよびＣａｓ９プラスミドを標的細胞にトランスフェクトするか、または構築されたａａｖウイルスを細胞と一緒にインキュベートする段階と、および
４）細胞を収集して、細胞状態を検出する段階とを含む。
１）ｓｇＲＮＡを設計する段階と、
２）ｓｇＲＮＡプラスミドベクターを構築する同時にｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを発現するａａｖウイルスを構築する段階と、
３）トランスフェクション法をを使用して、ｓｇＲＮＡプラスミドおよびＣａｓ９プラスミドを標的細胞にトランスフェクトするか、または構築されたａａｖウイルスを細胞と一緒にインキュベートする段階と、および
４）細胞を収集して、細胞状態を検出する段階とを含む。
【0042】
実施例１．細胞内のｓｎｏＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ実験
様々な細胞サービス化状態下でのｓｎｏＲＮＡの特異的変化を検出するために、ＲＴ－ＰＣＲ技術を使用してヒトおよび動物細胞中のｓｎｏＲＮＡ含有量を検出し、具体的な段階は次のとおりである。
様々な細胞サービス化状態下でのｓｎｏＲＮＡの特異的変化を検出するために、ＲＴ－ＰＣＲ技術を使用してヒトおよび動物細胞中のｓｎｏＲＮＡ含有量を検出し、具体的な段階は次のとおりである。
【0043】
（１）ヒトまたは他の動物の細胞を収集する。
（２）ｃＤＮＡサンプルを調製する。ＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して細胞のトータルＲＮＡを抽出した後、ＲＮＡ逆転写反応によってｃＤＮＡを取得する。逆転写された反応システムは、２μｌの５×ＡＭＶバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）、０．５μｌのＲＮＡａｓｅ阻害剤（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、０．５μｌのＡＭＶ酵素、１μｌの遺伝子特異的逆プライマー、１μｇのトータルＲＮＡおよびトータル体積が１０μｌになるまで加えるＲＮＡａｓｅフリー（ｆｒｅｅ）水を含む。反応段階は、１６℃で１５分間インキュベートし、４２℃で１時間反応し、８５℃で５分間インキュベートする。
（２）ｃＤＮＡサンプルを調製する。ＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して細胞のトータルＲＮＡを抽出した後、ＲＮＡ逆転写反応によってｃＤＮＡを取得する。逆転写された反応システムは、２μｌの５×ＡＭＶバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）、０．５μｌのＲＮＡａｓｅ阻害剤（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、０．５μｌのＡＭＶ酵素、１μｌの遺伝子特異的逆プライマー、１μｇのトータルＲＮＡおよびトータル体積が１０μｌになるまで加えるＲＮＡａｓｅフリー（ｆｒｅｅ）水を含む。反応段階は、１６℃で１５分間インキュベートし、４２℃で１時間反応し、８５℃で５分間インキュベートする。
【0044】
（３）ＰＣＲ電気泳動および観察する。前記段階で得られた１μｌのｃＤＮＡを取り、０．３μｌのＴａｑ酵素、０．４μｌのｄＮＴＰ混合物、１．２μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ２、２μｌの１０×ＰＣＲバッファー、０．５μｌの特異的フォワードプライマー、０．５μｌの特異的リバースプライマーおよび１４．１μｌの水を加え、２０μｌのシステムでＰＣＲを実行する。ＰＣＲの反応条件は、９５℃、５分間で１サイクル→９５℃、１５秒、６０℃、１分間で４０サイクルを行う。１０μｌのＰＣＲ生成物を取り３％のアガロースゲル電気泳動を実行し、ＥＢ染色後に紫外線下で観察する。
【0045】
結果は図１に示されるように、正常マウスの複数の組織を研究対象とし、トータルＲＮＡを抽出して、ＲＴ－ＰＣＲを行う。本発明者らは、マウスの９００を超えるすべてのｓｎｏＲＮＡを選択してＰＣＲ反応を実行し、図１は、そのうちの四つのｓｎｏＲＮＡ（ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５和ＳＮＯＲＤ１１６）を示す。結果から、これらの四つのｓｎｏＲＮＡは、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳および筋肉で検出できることが分かる。
【0046】
実施例２．細胞内のｓｎｏＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ実験
様々な細胞サービス化状態下でのｓｎｏＲＮＡの特異的変化を検出するために、リアルタイムＰＣＲ技術を使用してヒトおよび動物細胞中のｓｎｏＲＮＡ含有量を検出する。リアルタイムＰＣＲの実験原理および実験段階は、ＲＴ－ＰＣＲと同じであるが、唯一の違いは、ＰＣＲ中に蛍光染料Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎを加えることである。機器は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７３００蛍光定量ＰＣＲ装置を使用し、反応条件は、９５℃、５分間で１サイクル→９５℃、１５秒、６０℃、１分間で４０サイクルを行う。データ処理方法は、ΔΔＣＴ法であり、ＣＴは、反応が閾値に達した際のサイクル数として設定し、標準的な内部参照に対する各ｓｎｏＲＮＡの発現量は、方程式２－ΔＣＴで表すことができ、ここで、ΔＣＴ＝ＣＴサンプル－ＣＴ内部参照である。
様々な細胞サービス化状態下でのｓｎｏＲＮＡの特異的変化を検出するために、リアルタイムＰＣＲ技術を使用してヒトおよび動物細胞中のｓｎｏＲＮＡ含有量を検出する。リアルタイムＰＣＲの実験原理および実験段階は、ＲＴ－ＰＣＲと同じであるが、唯一の違いは、ＰＣＲ中に蛍光染料Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎを加えることである。機器は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７３００蛍光定量ＰＣＲ装置を使用し、反応条件は、９５℃、５分間で１サイクル→９５℃、１５秒、６０℃、１分間で４０サイクルを行う。データ処理方法は、ΔΔＣＴ法であり、ＣＴは、反応が閾値に達した際のサイクル数として設定し、標準的な内部参照に対する各ｓｎｏＲＮＡの発現量は、方程式２－ΔＣＴで表すことができ、ここで、ΔＣＴ＝ＣＴサンプル－ＣＴ内部参照である。
【0047】
結果は、図２に示される。本発明者らは、リアルタイムＰＣＲを使用して、それぞれマウスの様々な組織におけるすべてのｓｎｏＲＮＡの発現量を検出する。図２は、それぞれ心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳および筋肉におけるＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５およびＳＮＯＲＤ１１６の発現量のみを示す。実験では、Ｕ６を内部参照として使用する。検出結果から、ＳＮＯＲＡ４１は、肝臓で高発現され、ＳＮＯＲＤ８５は、肺、脾臓、筋肉および腎臓で高発現され、ＳＮＯＲＤ１１５およびＳＮＯＲＤ１１６は、脳組織で特異的に高発現されることが分かる。図２から、様々な組織には組織特異的に発現するｓｎｏＲＮＡが存在し、これらのｓｎｏＲＮＡの発現の違いは、体内の様々な組織によって実行される機能の違いに関連している可能性がある。
【0048】
実施例３．インビトロでの異なる培養時間後の脂肪組織のｓｎｏＲＮＡ含有量を検出するためのハイスループットシーケンシング実験
ｓｎｏＲＮＡが異なる細胞状態下で差次的に発現しているかどうかを検出するためである。本発明者らは、ハイスループットシーケンシング法を使用して、インビトロでの培養後の異なる時点で脂肪細胞のｓｎｏＲＮＡ発現プロファイルを検出する。具体的な実験段階は、次のとおりである。
ｓｎｏＲＮＡが異なる細胞状態下で差次的に発現しているかどうかを検出するためである。本発明者らは、ハイスループットシーケンシング法を使用して、インビトロでの培養後の異なる時点で脂肪細胞のｓｎｏＲＮＡ発現プロファイルを検出する。具体的な実験段階は、次のとおりである。
【0049】
（１）様々な状態下のマウスの白色脂肪組織を収集する。小片にした後、それぞれ０時間、３時間、６時間、９時間、１２時間および２４時間で脂肪細胞を収集し、トータルＲＮＡおよびトータルタンパク質を抽出する。
【0050】
（２）低分子ＲＮＡを分離してライブラリーを構築する。トータルＲＮＡをＰＡＧＥ電気泳動を使用してゲルに切断し、１８～３０ｎｔのＲＮＡを分離する。５－アデニル化された（ａｄｅｎｙｌａｔｅｄ）、３－ブロックされた（ｂｌｏｃｋｅｄ）一本鎖ＤＮＡリンカーを使用して、ｃＲＮＡの３’末端に接続する。消化酵素を加えて、３’リンカーを除去する。５’リンカーは、前記の段階の生成物である５’末端に接続される。ＲＴプライマーを用いて逆転写および伸長を実行して、一本鎖ｃＤＮＡを合成する。高感度ポリメラーゼを使用して、ｃＤＮＡを増幅し、同時に３’リンカーと５’リンカーとに接続されるｃＤＮＡを濃縮し、ライブラリーの収量を増幅する。ＰＡＧＥ電気泳動を使用して、１００～１２０ｂｐの範囲のＰＣＲ生成物を分離し、プライマーダイマー等の副生成物を効果的に除去する。構築されたライブラリーに対して品質検出を実行し、品質検出によって合格されたライブラリーをコンピューターでシーケンシングする。
【0051】
（３）イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）Ｈｉｓｅｑ２５００を使用して、構築されたｃＤＮＡライブラリーをシーケンシングする。
（４）シーケンシングデータの生成および後続的分析。生成されたシーケンシングイメージファイルをＣＡＳＡＶＡを使用して配列ファイルに変換した後、それぞれシーケンシング品質の低いタグ（ｔａｇ）、５’リンカー汚染のあるタグ、３’リンカー配列のないタグ、フラグメントの挿入されないタグ、ｐｏｌｙＡを含むタグおよび１８ｎｔ未満のタグを除去する。残りの配列は、ボウタイ（ｂｏｗｔｉｅ）を使用して、それぞれ既知のｓｎｏＲＮＡと比較して、注釈をつける。すべてのサンプルデータを要約して、様々な状態下での脂肪細胞のｓｎｏＲＮＡ発現プロファイルデータを取得する。
（４）シーケンシングデータの生成および後続的分析。生成されたシーケンシングイメージファイルをＣＡＳＡＶＡを使用して配列ファイルに変換した後、それぞれシーケンシング品質の低いタグ（ｔａｇ）、５’リンカー汚染のあるタグ、３’リンカー配列のないタグ、フラグメントの挿入されないタグ、ｐｏｌｙＡを含むタグおよび１８ｎｔ未満のタグを除去する。残りの配列は、ボウタイ（ｂｏｗｔｉｅ）を使用して、それぞれ既知のｓｎｏＲＮＡと比較して、注釈をつける。すべてのサンプルデータを要約して、様々な状態下での脂肪細胞のｓｎｏＲＮＡ発現プロファイルデータを取得する。
【0052】
（５）それぞれリアルタイムＰＣＲ法およびウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）法を使用して、段階（１）の各時点で脂肪細胞レプチンのｍＲＮＡおよびタンパク質含有量を検出する。
【0053】
結果は図３に示されるように、本発明者らは、異なる時点での脂肪細胞におけるレプチン等の脂肪細胞の固有のサービス化遺伝子の発現含有量を検出する。図２は、レプチン遺伝子の発現含有量の変化のみを示す。結果は、インビトロでの培養時間が増加するにつれて、レプチン遺伝子のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方が、すべて発現されなくなるまで減少されたことを示す。脂肪細胞が単離された後、インサービス化状態から脱サービス化状態に変換することを示す。
【0054】
図４に示されるように、異なる時点での脂肪組織ｓｎｏＲＮＡの発現プロファイルを分析することにより、本発明者らは、ＳＮＯＲＤ１４ｃ／ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４およびＳＮＯＲＤ８２等のｓｎｏＲＮＡの発現量が時間の変化とともに変化することを見出した。これらの九つのｓｎｏＲＮＡは、インビトロで３時間培養後に増加し始め、９時間で発現量は、最高点に上昇し、２４時間後に低下する。上記のデータは、インビトロで脂肪細胞を培養した後、外部条件が変化するにつれて、徐々脱サービス化状態に変換する同時に、ｓｎｏＲＮＡの発現量も増加することを示す。上記結果は、上記いくつかのｓｎｏＲＮＡが脂肪細胞の脱サービス化状態の分子マーカーとして使用できることを示唆する。
【表1】
【0055】
実施例４．プラスミドを使用して発現したｓｉＲＮＡのマウス脳におけるＳＮＯＲＤ１１５発現の阻害
本発明者らは、制限エンドヌクレアーゼを使用して対照プラスミドを処理し、線形ベクターを回収した後、Ｔ４リガーゼを使用してＲＶＧ－ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｈＲＮＡの組み合わせのフラグメントをベクターと接続し、得られた接続生成物を変換実験を実行して抗性プレートにコーティングし、翌日、単一のクローンを選択し、シーケンシングしてプラスミド配列の正確さをシーケンスする。
本発明者らは、制限エンドヌクレアーゼを使用して対照プラスミドを処理し、線形ベクターを回収した後、Ｔ４リガーゼを使用してＲＶＧ－ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｈＲＮＡの組み合わせのフラグメントをベクターと接続し、得られた接続生成物を変換実験を実行して抗性プレートにコーティングし、翌日、単一のクローンを選択し、シーケンシングしてプラスミド配列の正確さをシーケンスする。
【0056】
対照プラスミドおよびＳＮＯＲＤ１１５ ｓｉＲＮＡ／ＲＶＧプラスミドを正常マウスの尾静脈に１０ｍｇ／ｋｇの用量で注射し、１２時間後、マウスを犠牲にし、マウスの肝臓組織および脳組織を取り、それぞれインサイチュハイブリダイゼーション実験を実行する。このグループの実験において、組織切片におけるｓｉＲＮＡの分布状況を指示する検出プローブとして、ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｉＲＮＡ配列に完全に相補的な配列に緑色蛍光修飾を加える。結果から、マウスの肝臓組織には多数のｓｉＲＮＡが分布されており、脳組織でも少量のｓｉＲＮＡが検出され、ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｉＲＮＡ／ＲＶＧプラスミドが脳を標的とする効果があることが証明されることを示す。
【0057】
これらの分布されたｓｉＲＮＡがインビボでＳＮＯＲＤ１１５の発現状況を効果的に阻害できるかどうかを証明するために、本発明者らは、対照プラスミドおよびＳＮＯＲＤ１１５ ｓｉＲＮＡ／ＲＶＧプラスミドをマウスの尾静脈に１０ｍｇ／ｋｇの用量で注射し、２日ごとに１回、合計７回注射し、最後の注射の２４時間後にマウスを犠牲にし、マウスの脳組織を採取してリアルタイムＰＣＲ実験を実行する。結果は、プラスミド分子がインビボで脳組織におけるＳＮＯＲＤ１１５の発現レベルを効果的に低下させることができることを示す。
【0058】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-12-20
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）の検出試薬の使用であって、
分化細胞のサービス化状態を検出するための試薬またはキットの調製に用いられ、ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される、前記使用。
分化細胞のサービス化状態を検出するための試薬またはキットの調製に用いられ、ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される、前記使用。
【請求項2】
サービス化状態が、インサービス化状態、脱サービス化状態、またはその変換を含む、
請求項１に記載の使用。
請求項１に記載の使用。
【請求項3】
ｓｎｏＲＮＡが、哺乳動物、齧歯動物、および／または霊長類動物に由来する、
請求項１または２に記載の使用。
請求項１または２に記載の使用。
【請求項4】
ｓｎｏＲＮＡが、臓器、組織、および／または細胞特異的なｓｎｏＲＮＡである、
請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項5】
臓器が、関節、靭帯、舌、唾液腺、耳下腺、下顎腺、舌下腺、咽頭、食道、胃、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、肝臓、胆嚢、腸間膜、膵臓、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜、腎臓、尿管、膀胱、尿道、卵巣、卵管、子宮、膣、胎盤、精巣、精巣上体、精管、精嚢、前立腺、尿道球腺、陰茎、陰嚢、脳下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎腺、膵臓腺、心臓、動脈、静脈、毛細血管、リンパ管、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、腸関連リンパ組織、扁桃腺、脳、間脳、脳幹、中脳、橋（ｐｏｎｓ）、延髄、小脳、脊髄、脳室、脈絡叢、脳神経、脊髄神経、神経節、腸管神経系、角膜、虹彩、毛様体、水晶体、網膜、耳たぶ、鼓膜、耳小骨、蝸牛、耳前庭、三半規管、舌、皮膚からなる群から選択される、
請求項４に記載の使用。
請求項４に記載の使用。
【請求項6】
組織が、結合組織であって、前記結合組織が脂肪組織である、
請求項４に記載の使用。
請求項４に記載の使用。
【請求項7】
細胞が、外分泌上皮細胞、バリア細胞、およびホルモン分泌細胞を含む、内胚葉に由来する細胞を含む、
請求項１～６のいずれか一項に記載の使用。
請求項１～６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項8】
分化細胞のサービス化状態の分子マーカーを決定する方法であって、
（１）第１のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第１のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第１のデータセットを得る段階、
（２）第２のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第２のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第２のデータセットを得る段階、および
（３）第１のデータセットと第２のデータセットとを比較して、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態における固有のｓｎｏＲＮＡの種類および量の情報を決定することにより、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態における固有の分子マーカーを区別する段階
を含み、ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される、前記サービス化状態の分子マーカーを決定する方法。
（１）第１のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第１のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第１のデータセットを得る段階、
（２）第２のサービス化状態下の細胞を提供し、前記第２のサービス化状態下のｓｎｏＲＮＡの種類および量を検出することにより、第２のデータセットを得る段階、および
（３）第１のデータセットと第２のデータセットとを比較して、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態における固有のｓｎｏＲＮＡの種類および量の情報を決定することにより、第１のサービス化状態と第２のサービス化状態における固有の分子マーカーを区別する段階
を含み、ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される、前記サービス化状態の分子マーカーを決定する方法。
【請求項9】
ｓｎｏＲＮＡまたはその促進剤またはその拮抗剤の使用であって、
分化細胞のサービス化状態を調節するための薬物または製剤の調製に用いられ、ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される、前記使用。
分化細胞のサービス化状態を調節するための薬物または製剤の調製に用いられ、ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ４１、ＳＮＯＲＤ８５、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１４ｃ、ＳＮＯＲＤ１４ｄ、ＳＮＯＲＤ５５、ＳＮＯＲＤ１５ｂ、ＳＮＯＲＤ２３、ＳＮＯＲＤ９６ａ、ＳＮＯＲＤ１２３、ＳＮＯＲＤ３４、およびＳＮＯＲＤ８２からなる群から選択される、前記使用。
【外国語明細書】