特開2024-28756インターロイキン－１２とフィブロネクチンのエクストラドメインＢに結合する抗体とを含む組換えタンパク質を含む組成物の投与単位およびレジメン、使用、方法または製剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024028756
(43)【公開日】2024-03-05
(54)【発明の名称】インターロイキン－１２とフィブロネクチンのエクストラドメインＢに結合する抗体とを含む組換えタンパク質を含む組成物の投与単位およびレジメン、使用、方法または製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/20 20060101AFI20240227BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240227BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240227BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240227BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240227BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20240227BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20240227BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20240227BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20240227BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240227BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240227BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240227BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20240227BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240227BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240227BHJP
【ＦＩ】
A61K38/20 ZNA
A61P35/00
A61K39/395 T
A61K47/26
A61K47/18
A61K47/10
A61K47/12
A61K47/02
A61K47/22
A61K47/64
A61P43/00 121
A61P35/04
C07K16/24
C07K16/18
C07K19/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023199561
(22)【出願日】2023-11-27
(62)【分割の表示】P 2022561419の分割
【原出願日】2021-04-13
(31)【優先権主張番号】20169469.2
(32)【優先日】2020-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】518360689
【氏名又は名称】フィロジェン ソチエタ ペル アツィオーニ
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】バッチ カミッラ
(72)【発明者】
【氏名】ヘンメル テレーザ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】インターロイキン１２（ＩＬ－１２）とフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体とを含む免疫サイトカインの適切な用量または投与レジメンを提供する。
【解決手段】ＩＬ－１２と、ＥＤ－Ｂに結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質を含む医薬製剤であって、
・ヒスチジン、スクロース、およびｐＨ８．０±０．３に調整されたＥＤＴＡ、
・クエン酸、クエン酸ナトリウム、スクロース、グリセロール、およびｐＨ６．０±０．３に調整されたＥＤＴＡ、または
・Ｈｅｐｅｓ、ＮａＣｌ、マンニトール、グリセロール、ｐＨ７．０±０．３に調整されたＥＤＴＡを含む医薬製剤とする。
ＩＬ－１２と、ＥＤ－Ｂに結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質を、ヒト患者の体重に対して０．１μｇ／ｋｇ以上含む、投与単位またはレジメンを提供する。
【選択図】なし
【解決手段】ＩＬ－１２と、ＥＤ－Ｂに結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質を含む医薬製剤であって、
・ヒスチジン、スクロース、およびｐＨ８．０±０．３に調整されたＥＤＴＡ、
・クエン酸、クエン酸ナトリウム、スクロース、グリセロール、およびｐＨ６．０±０．３に調整されたＥＤＴＡ、または
・Ｈｅｐｅｓ、ＮａＣｌ、マンニトール、グリセロール、ｐＨ７．０±０．３に調整されたＥＤＴＡを含む医薬製剤とする。
ＩＬ－１２と、ＥＤ－Ｂに結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質を、ヒト患者の体重に対して０．１μｇ／ｋｇ以上含む、投与単位またはレジメンを提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質を含む医薬製剤であって、
・ ヒスチジン、スクロース、およびｐＨ８．０±０．３に調整されたＥＤＴＡ、
・ クエン酸、クエン酸ナトリウム、スクロース、グリセロール、およびｐＨ６．０ ±０．３に調整されたＥＤＴＡ、または
・ Ｈｅｐｅｓ、ＮａＣｌ、マンニトール、グリセロール、ｐＨ７．０±０．３に調 整されたＥＤＴＡ
を含む医薬製剤。
・ ヒスチジン、スクロース、およびｐＨ８．０±０．３に調整されたＥＤＴＡ、
・ クエン酸、クエン酸ナトリウム、スクロース、グリセロール、およびｐＨ６．０ ±０．３に調整されたＥＤＴＡ、または
・ Ｈｅｐｅｓ、ＮａＣｌ、マンニトール、グリセロール、ｐＨ７．０±０．３に調 整されたＥＤＴＡ
を含む医薬製剤。
【請求項2】
（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質を、ヒト患者の体重に対して０．１μｇ／ｋｇ以上含む、投与単位またはレジメン。
【請求項3】
（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質の、ヒト患者の体重に対して１００μｇ／ｋｇ以下含む、投与単位またはレジメン。
【請求項4】
（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質の、ヒト患者の体重に対して、０．５μｇ／ｋｇ以上４μｇ／ｋｇ未満の間で含む、投与単位またはレジメン。
【請求項5】
組換えタンパク質が請求項２～４のいずれか１項に記載の投与単位またはレジメンに従って投与される、がんと診断されているか、またはがんに罹患している患者の治療に使用するための、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質。
【請求項6】
がんの診断を受けているか、またはがんに罹患しているヒト患者の治療のための、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質の（医薬品の製造における）使用であって、タンパク質が、患者に対して請求項２～４のいずれか１項に記載の投与単位またはレジメンで投与するためのものである使用。
【請求項7】
がんと診断されているか、またはがんに罹患している患者を治療する方法であって、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質を、請求項２～４のいずれか１項に記載の投与単位またはレジメンによる用量で、患者に投与することを含む、方法。
【請求項8】
用量が患者に対して毎日、半週、毎週、隔週、３週ごと、毎月または隔月に投与される、請求項５の使用のための組換えタンパク質、請求項６の使用または請求項７の方法。
【請求項9】
進行性／転移性免疫療法反応性固形がんまたはリンパ腫から選択される、がんと診断されているか、またはがんに罹患している患者の治療に用いるための、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）と結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む、組換えタンパク質。
【請求項10】
進行性／転移性免疫療法反応性固形がんまたはリンパ腫と診断されているか、またはがんに罹患している患者を治療する方法であって、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢに結合する抗体、またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体を含む組み換えタンパク質を治療上十分な量で患者に投与することを含む、方法。
【請求項11】
がん腫またはリンパ腫が、以下からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５、８または９に記載の組換えタンパク質の使用、請求項６に記載の使用、または請求項７もしくは１０に記載の方法。
ａ） 悪性黒色腫
ｂ） 非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）
ｃ） 腎細胞がん
ｄ） 尿路上皮がん
ｅ） 頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）
ｆ） 高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機構 欠損（ｄＭＭＲ）の転移性大腸がん
ｇ） 肝細胞がん
ｈ） 胃がん
ｉ） 皮膚扁平上皮がん
ｊ） 子宮頸がん、および／または
ｋ） びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）。
ａ） 悪性黒色腫
ｂ） 非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）
ｃ） 腎細胞がん
ｄ） 尿路上皮がん
ｅ） 頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）
ｆ） 高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機構 欠損（ｄＭＭＲ）の転移性大腸がん
ｇ） 肝細胞がん
ｈ） 胃がん
ｉ） 皮膚扁平上皮がん
ｊ） 子宮頸がん、および／または
ｋ） びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）。
【請求項12】
がん腫またはリンパ腫が、以下の少なくとも１つを特徴とする、請求項５、８、９または１１に記載の組換えタンパク質の使用、請求項６または１１に記載の使用、または請求項７または１０～１１に記載の方法。
ａ） 免疫チェックポイント阻害療法が進行していた、
ｂ） 東部協力腫瘍学グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス≦２、および ／または
ｃ） 固形がんに関するＲＥＣＩＳＴ（ｖ．１．１）または悪性リンパ腫に関するＬ ＵＧＡＮＯ基準で定義された、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ＭＲＩまたは ＰＥＴ／ＣＴのいずれかによる少なくとも１つの一次元的に測定可能な病変。
ａ） 免疫チェックポイント阻害療法が進行していた、
ｂ） 東部協力腫瘍学グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス≦２、および ／または
ｃ） 固形がんに関するＲＥＣＩＳＴ（ｖ．１．１）または悪性リンパ腫に関するＬ ＵＧＡＮＯ基準で定義された、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ＭＲＩまたは ＰＥＴ／ＣＴのいずれかによる少なくとも１つの一次元的に測定可能な病変。
【請求項13】
患者が以下の少なくとも１つを特徴とする、請求項５、８、９または１１～１２に記載の組換えタンパク質の使用、請求項６または１１～１２に記載の使用、または請求項７または１０～１２に記載の方法。
ａ） 直前の治療として免疫チェックポイント阻害療法に基づくレジメンを受けてい たか、
ｂ） 臨床的利点（ＣＲ／ＰＲ／ＳＤ）を有していたことがあり、免疫チェックポイ ント遮断療法中に、転移性疾患を記録した最初の画像診断から３ヶ月以上無増 悪で、免疫チェックポイント遮断療法後のレントゲン写真により疾患進行（ｒ ａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）である か、
ｃ） ＤＬＣＢＬと診断されたとき、またはＤＬＣＢＬに罹患したときに、２種類以 上の先行する全身療法を受けたことがあるか；および／また
ｄ） ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶの検査が陰性である。
ａ） 直前の治療として免疫チェックポイント阻害療法に基づくレジメンを受けてい たか、
ｂ） 臨床的利点（ＣＲ／ＰＲ／ＳＤ）を有していたことがあり、免疫チェックポイ ント遮断療法中に、転移性疾患を記録した最初の画像診断から３ヶ月以上無増 悪で、免疫チェックポイント遮断療法後のレントゲン写真により疾患進行（ｒ ａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）である か、
ｃ） ＤＬＣＢＬと診断されたとき、またはＤＬＣＢＬに罹患したときに、２種類以 上の先行する全身療法を受けたことがあるか；および／また
ｄ） ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶの検査が陰性である。
【請求項14】
組換えタンパク質に含まれる抗体が、少なくとも１つの単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体フラグメント、場合により単鎖ダイアボディを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の投与単位、使用のための組換えタンパク質、方法または製剤。
【請求項15】
組換えタンパク質に含まれるＩＬ－１２が、リンカーで連結されたｐ４０サブユニットとｐ３５サブユニットを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の投与単位、使用のための組換えタンパク質、方法または製剤。
【請求項16】
以下の少なくとも１つを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の投与単位、使用のための組換えタンパク質、方法または製剤。
・ ｐ４０サブユニットおよびｐ３５サブユニットが、それぞれ配列番号１または配 列番号３に記載のアミノ酸配列を含むか、
・ 組換えタンパク質に含まれる抗体が、ＶＬドメインとして配列番号５に記載のア ミノ酸配列、およびＶＨドメインとして配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む 抗ＥＤＢ抗体Ｌ１９であるか、
・ 抗体、ＩＬ－１２および／または両者を連結するリンカーの少なくとも１つが、 ＷＯ２０１９／１５４９８６に開示されているものであり、場合により、組換え タンパク質が、ＷＯ２０１９／１５４９８６に開示されているものであるか、お よび／または
・ 組換えタンパク質が、配列番号９に記載の配列を含むか、場合により配列番号９ に記載の配列からなる。
・ ｐ４０サブユニットおよびｐ３５サブユニットが、それぞれ配列番号１または配 列番号３に記載のアミノ酸配列を含むか、
・ 組換えタンパク質に含まれる抗体が、ＶＬドメインとして配列番号５に記載のア ミノ酸配列、およびＶＨドメインとして配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む 抗ＥＤＢ抗体Ｌ１９であるか、
・ 抗体、ＩＬ－１２および／または両者を連結するリンカーの少なくとも１つが、 ＷＯ２０１９／１５４９８６に開示されているものであり、場合により、組換え タンパク質が、ＷＯ２０１９／１５４９８６に開示されているものであるか、お よび／または
・ 組換えタンパク質が、配列番号９に記載の配列を含むか、場合により配列番号９ に記載の配列からなる。
【請求項17】
組換えタンパク質が以下を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の投与単位、使用のための組換えタンパク質、方法または製剤。
ａ） ｐ３５ドメインに第１のリンカーで連結されたｐ４０ドメイン、
ｂ） ＳＡＤリンカーによってｐ３５ドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＨドメ イン、
ｃ） 第３のリンカーによって第１のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第１のＬ１ ９ ＶＬドメイン、
ｄ） 第４のリンカーによって第１のＬ１９ ＶＬドメインに連結された第２のＬ１ ９ ＶＨドメイン；および／または
ｅ） 第５のリンカーによって第２のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第２のＬ１ ９ ＶＬドメイン。
ａ） ｐ３５ドメインに第１のリンカーで連結されたｐ４０ドメイン、
ｂ） ＳＡＤリンカーによってｐ３５ドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＨドメ イン、
ｃ） 第３のリンカーによって第１のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第１のＬ１ ９ ＶＬドメイン、
ｄ） 第４のリンカーによって第１のＬ１９ ＶＬドメインに連結された第２のＬ１ ９ ＶＨドメイン；および／または
ｅ） 第５のリンカーによって第２のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第２のＬ１ ９ ＶＬドメイン。
【請求項18】
投与が静脈内または皮下である、前記請求項のいずれか１項に記載の投与単位またはレジメン、使用のための組換えタンパク質、方法または製剤。
【請求項19】
請求項１に記載の製剤で提供される、前記の請求項のいずれか１項に記載の投与単位またはレジメン、使用のための組換えタンパク質。
【請求項20】
前記の請求項のいずれか１項に記載の投与単位またはレジメンまたは組換えタンパク質を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項21】
以下を含むキット。
ａ） 前記請求項のいずれか１項に記載の使用のための投与単位または組換えタンパ ク質、
ｂ） 投与単位または組換えタンパク質を投与するための装置、および、場合により
ｃ） キットの使用のための説明書。
ａ） 前記請求項のいずれか１項に記載の使用のための投与単位または組換えタンパ ク質、
ｂ） 投与単位または組換えタンパク質を投与するための装置、および、場合により
ｃ） キットの使用のための説明書。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質を含む組成物の投与単位およびレジメン、使用、方法または製剤に関する。
＜参照による援用＞
本出願で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願およびその他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願またはその他の文書が参照により援用されることが個別に示されている場合と同じ程度に、すべての目的のために参照により全体が援用される。本明細書に援用された１つ以上の文献の教示と本開示との間に矛盾がある場合、本明細書の教示が意図される。
＜参照による援用＞
本出願で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願およびその他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願またはその他の文書が参照により援用されることが個別に示されている場合と同じ程度に、すべての目的のために参照により全体が援用される。本明細書に援用された１つ以上の文献の教示と本開示との間に矛盾がある場合、本明細書の教示が意図される。
【背景技術】
【0002】
ＩＬ－１２は、ｐ３５およびｐ４０という２つのジスルフィド結合サブユニットを含むヘテロ二量体サイトカインである。ＩＬ－１２はＴ細胞やナチュラルキラー細胞からのＩＦＮγの産生を刺激し、またＴｈ１ヘルパー細胞の分化を誘導する。ＩＬ－１２は、自然免疫および細胞性免疫の重要なメディエーターであり、抗がんおよび抗転移活性の可能性がある。
【0003】
しかし、他の多くのサイトカインと同様に、ＩＬ－１２の投与は、１日１μｇ／ｋｇという低用量でも、重度の毒性と関連しており(Car et al., 1999)、１日１μｇ／ｋｇという低用量でも、抗がん剤としての開発を妨げている。
【0004】
多くのサイトカインは、がんや免疫疾患の前臨床動物モデルで有益な効果を示し、治療薬として有望視されている。しかし、有望な結果が得られているにもかかわらず、医薬品として承認されているサイトカインはわずかである（例：インターロイキン２（ＩＬ２、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、Ｂｅｒｏｍｕｎ（登録商標））、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα、Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ（登録商標）およびＩｎｔｒｏｎ Ａ（登録商標））。（Ｇｕｔｂｒｏｄｔ ａｎｄ Ｎｅｒｉ，２０１２）．現在、がん領域では、転移性腎細胞がん、悪性黒色腫、有毛細胞白血病、慢性骨髄性リンパ腫、肉腫、多発性骨髄腫などに、単剤あるいは化学療法との併用で適応がある。さらに、ある種のサイトカインは、臨床においてウイルスや細菌感染の治療に使用され、慢性炎症性疾患に苦しむ患者に投与されている。残念ながら、低用量でかなりの毒性が見られるため、治療効果のあるレジメンにエスカレートすることができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
ヒトに投与する免疫サイトカインの適切な用量や投与レジメンを見つけるのは、とても難しいことである。当業者は、作用機序が全く異なること、毒性の問題が加わることから、例えば抗体のような他のバイオ医薬品で行われた経験を信頼することはできない。したがって、本発明の一つの目的は、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体とを含む免疫サイトカインの適切な用量または投与レジメンを見出すことである。
【0006】
抗体などの治療用組換えタンパク質の製剤化は、臨床応用に必要な保存性や投与経路の様々な要求に対応するために、独自の医薬品添加物を用いた複雑な最適化プロセスである。
【0007】
免疫サイトカインは、抗体を中心としたタンパク質の結合分子とサイトカインを含む組換えタンパク質である。そのため、免疫サイトカインは抗体とは化学的・物理的な性質が大きく異なる。例えば、ドメイン構造、分子量、あるいは鎖間および鎖内のジスルフィド橋の数などがこれに該当する。その結果、免疫サイトカインの溶解性、凝集挙動、薬理作用は、抗体で知られているものと大きく異なる可能性がある。したがって、抗体から学んだことは、免疫サイトカインにそのまま転用することはできない。
【0008】
このように、ヒトに投与する免疫サイトカインの製剤を見つけることは、一筋縄ではいかないことがわかる。それゆえ、本発明の他の一つの目的は、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体とを含む免疫サイトカイン用製剤を見出すことである。
【0009】
ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９という用語は、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質を指し、これは、本明細書に説明するように単鎖ダイアボディ形態（「タンデムダイアボディ」ともいう）で提供されるものである。組換えタンパク質は、配列番号９に記載のアミノ酸を含む。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９の製剤研究。濃縮ステップ前後の異なる製剤化サンプルのＳＥＣ分析。
【0011】
【図2】ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９の製剤研究。濃縮ステップ前後の異なる製剤化サンプルのＳＥＣ分析。
【図3】ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９の模式図。この分子は、免疫調節ペイロードＩＬ１２の２つのサブユニットからなる一本鎖ポリペプチドとヒト血管標的抗体が融合した単鎖ダイアボディからなる。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、特に、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質を含む組成物の投与単位、使用、方法または製剤を提供するものである。
【0013】
本発明およびその特徴の一般的な利点を以下に詳細に説明する。
【0014】
本発明の一態様によれば、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体、またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質の、ヒト患者の体重に対して、０．１μｇ／ｋｇ以上（≧０．１μｇ／ｋｇ）を含む、投与単位が提供される。
【0015】
Rudmanet al.(2011)では、ＡＳ１４０９が開示され、これは、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）に結合されたＩｇＧフォーマットのヒト化抗体ＢＣ１を含む融合タンパク質である。フィブロネクチンのＥＤ－Ｂ変異体を標的とする抗体を用いて、腫瘍に関連する血管系にＩＬ－１２を送達するように設計されている。ＡＳ１４０９の週１回点滴投与の第１相試験は、腎臓がんおよび悪性黒色腫患者を対象に実施した。安全性、有効性、ＩＬ－１２を介した免疫反応のマーカー、および薬物動態を評価した。１５μｇ／ｋｇと２５μｇ／ｋｇの投与量を検討した。試験では、このアプローチの安全性が実証され、提案された作用機序に対する薬力学的な裏付けが得られた。転移性黒色腫に対する有効性のエビデンスとともに、第ＩＩ相試験へ移行する根拠となる実験であると規定された。しかし、第２相臨床試験は開始されなかった。
【0016】
一般に、免疫サイトカインは、１つのサイトカインが２つ以上の免疫細胞を刺激することができ、免疫系に増強効果を持つため、安全かつ効率的な投与量の決定は、例えば、不活性化すべきリガンドやブロックすべき受容体など、所与の標的の量が分かっていて、抗体と標的との間の明確な確率的関係が計算できる抗体療法よりもはるかに困難である。
【0017】
Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）は転移性固形腫瘍を対象とした腫瘍標的サイトカイン（ＮＨＳ－ＩＬ１２）のファーストインヒューマン第Ｉ相試験を開示する。ＮＨＳ－ＩＬ１２免疫サイトカインは、２つのＩＬ－１２ヘテロダイマーが、それぞれ抗ヒストン抗体ＮＨＳ７６のＨ鎖の１つと融合したものである。最大耐容用量（ＭＴＤ）は１６．８μｇ／ｋｇと決定された。ＮＨＳ７６はヒストンを介して一本鎖および二本鎖のＤＮＡに親和性を持つため、ＮＨＳ－ＩＬ１２は腫瘍壊死でＤＮＡが露出した部位への送達を標的としている。
【0018】
ＮＨＳ抗体の標的であるヒストンが、細胞外の標的であるＥＤＢと比較して、細胞内の標的であること、ヒストンの腫瘍組織における存在量がＥＤＢと異なることなどから、少なくともこの研究からの教示は、本発明のＩＬ１２－抗ＥＤＢ組換えタンパク質に転用することができない。
【0019】
Ｐｕｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１９）において、新規融合タンパク質（Ｌ１９－ｍＩＬ１２と称する）のクローニングと特性付けが開示されている。この融合タンパク質は、マウスのインターロイキン１２を単鎖の形態で、抗ＥＤＢ抗体Ｌ１９を単鎖ダイアボディ（「タンデムダイアボディ」とも呼ばれる）形態で順次融合させたものである。著者らは、マウスにおいて、Ｌ１９－ｍＩＬ１２は体表面スケーリングファクターを考慮したヒトの用量２ｍｇに相当する１２μｇの用量で非常によく耐性を示したと報告している－この用量は、Ｒｕｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．およびＳｔｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．によって報告されてきたものよりはるかに高いものである。
【0020】
本発明の別の態様によれば、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質の、ヒト患者の体重に対して、１００μｇ／ｋｇ以下（≦100μg/kg）を含む投与単位またはレジメンが、提供される。
【0021】
いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧０．１μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧０．２５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対して≧０．５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対して≧１μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧３μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧４μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧６μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧７μｇ ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧８μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧９μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１０μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１１μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１２μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１３μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１４μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１６μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１７μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１８μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１９μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２０μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２１μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２２μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２３μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２４μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２６μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２７μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２８μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２９μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧３０μｇ／ｋｇを含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦９５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦９０μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦８５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦８０μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦７５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦７０μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦６５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦６０μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦５５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦５０μｇ ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦４５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦４０μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦３５μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦３２μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦３０μｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≦２５μｇ／ｋｇを含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２と≦２０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧３と≦２５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧４と≦３０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧５と≦３５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧６と≦４０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧７と≦４５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧８と≦５０μｇ ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧９と≦５５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１０と≦６０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１１と≦６５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１２と≦７０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１３と≦７５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１４と≦８０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１５と≦８５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１６と≦９０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１７と≦９５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１８と≦１００μｇ／ｋｇとの間を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２と≦３０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧４と≦３５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧６と≦４０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧８と≦４５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１０と≦５０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する、≧１２と≦５５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１４と≦６０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１６と≦６５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１８と≦７０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２０と≦７５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２２と≦８０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２４と≦８５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２６と≦９０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２８と≦９５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧３０と≦１００μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧３２と≦１０５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧３４と≦１１０μｇ／ｋｇとの間を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２と≦３０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧６と≦３５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１０と≦４０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１４と≦４５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧１８と≦５０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２２と≦５５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧２６と≦６０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧３０と≦６５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧３４と≦７０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧３８と≦７５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧４２と≦８０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧４６と≦８５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧５０と≦９０μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧５４と≦９５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧５８と≦１００μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧６２と≦１０５μｇ／ｋｇとの間を含む。いくつかの実施形態では、投与単位またはレジメンは、組換えタンパク質のヒト患者の体重に対する≧６６と≦１１０μｇ／ｋｇとの間を含む。
【0026】
本発明の一態様によれば、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、および（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体、またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体を含み、がんと診断されている患者、またはがんに苦しむ患者の治療において使用する組換えタンパク質であって、組換えタンパク質が上記の説明による用量で投与される、組換えタンパク質が提供される。
【0027】
本発明の一態様によれば、患者を治療する方法が提供され、患者は、がんと診断されているか、またはがんに罹患しており、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメント若しくは誘導体とを含む組換えタンパク質を含む組成物を、上記の説明による投与単位に応じた量で、患者に投与することを含む。
【0028】
治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する実施形態によれば、用量は、毎日患者に投与される。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する実施形態によれば、用量は、半週ごとに患者に投与される。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する実施形態によれば、用量は、患者に毎週投与される。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する実施形態によれば、用量は、患者に、隔週で投与される。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する実施形態によれば、用量は、３週間ごとに患者に投与される。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する実施形態によれば、用量は、患者に毎月投与される。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する実施形態によれば、用量は、２ヶ月に１回患者に投与される。
【0029】
（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質の以下の投与レジメンは、ヒト患者の体重に対して、良好な有効性と副作用低減の妥協点を提供するものである。
【0030】
【0031】
したがって、いくつかの実施形態において、（ｉ）インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメント若しくは誘導体とを含む組換えタンパク質の、ヒト患者の体重に対する≧０．５μｇ／ｋｇと＜４μｇ／ｋｇとの間を含む投与単位またはレジメンが提供される。
【0032】
次の表は、体重（ｋｇ）が異なる患者に対する各投与ごとの総投与量をμｇ単位で示したもので、投与単位／投与レジメンの違いによるものである（μｇ／ｋｇ－１）。
【0033】
本発明の一態様によれば、がんと診断されているか、またはがんに罹患している患者の治療のための（使用における）、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む、組換えタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、がんは、進行性／転移性免疫療法反応性固形がんまたはリンパ腫である。
【0034】
本発明の一態様によれば、患者を治療する方法が提供され、患者は、進行性／転移性免疫療法反応性固形がんまたはリンパ腫と診断されているか、またはそれに罹患しており、本方法は、治療上十分な量の、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメント若しくは誘導体とを含む組換えタンパク質を含む組成物を患者に投与することを含む。
【0035】
治療方法または使用のための組換えタンパク質に関するいくつかの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、悪性黒色腫である。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関するいくつかの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関するいくつかの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、腎細胞がんである。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関するいくつかの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、尿路上皮がんである。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関するいくつかの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）である。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関するいくつかの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）転移性大腸がんである。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関するいくつかの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、肝細胞がんである。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関するいくつかの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、胃がんである。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関するいくつかの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、皮膚の扁平上皮がんである。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関するいくつかの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、子宮頸がんである。治療方法または使用のための組換えタンパク質に関するいくつかの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。
【0036】
本開示の一部として、上記の条件は、組み合わせることもできる。
【0037】
治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する１つの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫には、免疫チェックポイント遮断療法が進行している。
【0038】
治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する１つの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、東部協力腫瘍学グループ（Ｅａｓｔｅｒｎ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｇｒｏｕｐ：ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス≦２である。
【0039】
治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する１つの実施形態によれば、がん腫またはリンパ腫は、固形腫瘍に関するＲＥＣＩＳＴ（ｖ．１．１）または悪性リンパ腫に関するＬＵＧＡＮＯ基準で定義された、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ＭＲＩまたはＰＥＴ／ＣＴのいずれかによる少なくとも１つの一次元的に測定可能な病変である。
【0040】
本開示の一部として、上記の条件は、組み合わせることもできる。
【0041】
治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する１つの実施形態によれば、患者は、直前の治療として免疫チェックポイント遮断療法に基づくレジメンを受けたことがある。
治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する１つの実施形態によれば、患者は、臨床的利点（ＣＲ／ＰＲ／ＳＤ）を有していたことがあり、免疫チェックポイント遮断療法中に、転移性疾患を記録した最初の画像診断から３ヶ月以上無増悪で、免疫チェックポイント遮断療法後のレントゲン写真により疾患進行（ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）と定義される
治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する１つの実施形態によれば、患者は、臨床的利点（ＣＲ／ＰＲ／ＳＤ）を有していたことがあり、免疫チェックポイント遮断療法中に、転移性疾患を記録した最初の画像診断から３ヶ月以上無増悪で、免疫チェックポイント遮断療法後のレントゲン写真により疾患進行（ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）と定義される
【0042】
治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する１つの実施形態によれば、患者は、ＤＬＣＢＬについて診断されたとき、またはＤＬＣＢＬに罹患したときに、２種類以上の先行する全身療法を受けたことがある。
【0043】
治療方法または使用のための組換えタンパク質に関する１つの実施形態によれば、患者は、ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶの検査が陰性である。
【0044】
本開示の一部として、上記の条件は、組み合わせることもできる。
【0045】
本明細書で使用するＣＲ／ＰＲ／ＳＤという用語は、ＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ Ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）基準により定義される奏効に関するものである。完全奏効（ＣＲ）＝標的病変のすべてが消失した場合、部分奏効（ＰＲ）＝標的病変のＬＤの合計が、投与前のＬＤの合計を基準として３０％以上減少した場合、疾患安定（ＳＤ）＝投与開始後のＬＤ合計が最小となる場合を基準として、ＰＲとなるほどの縮小でもＰＤとなるほどの増加でもない場合。
【0046】
本明細書で使用する「ＥＣＯＧパフォーマンスステータス」という用語は、東部協力腫瘍学グループ（Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）によって開発された、患者の介護能力、日常活動、身体能力（歩行、作業など）の機能レベルを表すスコアである。
【0047】
本明細書で使用する「免疫チェックポイント阻害療法」という用語は、免疫チェックポイント阻害剤として知られる薬剤を用いて、いくつかのタイプのがんに対処する療法に関するものである。具体的には、これらの薬は、体の免疫システムががん細胞を認識し、攻撃するのを助けることができる。免疫チェックポイント阻害剤には、特にＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ ３、ＴＩＭ３およびＯＸ４０に対する阻害剤またはアンタゴニストが含まれる。免疫チェックポイント阻害剤としては、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、セミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）などがよく知られている。
【0048】
用語「ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶの検査が陰性」とは、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスへの感染、またはそれらに対する抗体の存在が陰性であったことを意味する。
【0049】
本発明の一態様によれば、（ｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）と、（ｉｉ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する抗体またはその標的結合フラグメントもしくは誘導体とを含む組換えタンパク質を含む、医薬製剤が提供される。
【0050】
一実施形態では、製剤は、ヒスチジンを含むことができる。一実施形態では、製剤は、スクロースを含むことができる。一実施形態では、製剤は、ＥＤＴＡを含むことができる。一実施形態では、製剤は、ヒスチジンおよびスクロース、並びに場合によりＥＤＴＡを含むことができる。
【0051】
一実施形態では、製剤は、クエン酸を含むことができる。一実施形態では、製剤は、クエン酸ナトリウムを含むことができる。一実施形態では、製剤は、スクロースを含むことができる。一実施形態では、製剤は、グリセロールを含むことができる。一実施形態では、製剤は、ＥＤＴＡを含むことができる。一実施形態では、製剤は、クエン酸およびクエン酸ナトリウム、並びに場合によりスクロース、グリセロールおよびＥＤＴＡの少なくとも１つを含むことができる。
【0052】
一実施形態では、製剤は、ＨＥＰＥＳを含むことができる。一実施形態では、製剤は、ＮａＣｌを含むことができる。一実施形態では、製剤は、マンニトールを含むことができる。一実施形態では、製剤は、グリセロールを含むことができる。一実施形態では、製剤は、ＥＤＴＡを含むことができる。一実施形態では、製剤は、ＨＥＰＥＳおよびＮａＣｌ、ならびに場合によりマンニトール、グリセロールおよび、ＥＤＴＡのうちの少なくとも１つを含むことができる。
【0053】
一実施形態では、製剤は、８．０±０．３のｐＨを有するように調整された、ヒスチジン、スクロースおよびＥＤＴＡを含むことができる。別の実施形態では、製剤は、６．０±０．３のｐＨを有するように調整されたクエン酸、クエン酸ナトリウム、スクロース、グリセロール、ＥＤＴＡを含むことができる。一実施形態では、製剤は、７．０±０．３のｐＨを有するように調整されたＨｅｐｅｓ、ＮａＣｌ、マンニトール、グリセロール、ＥＤＴＡを含むことができる。
【0054】
これらの製剤は、ストレス条件下での安定性（凍結・解凍を数回繰り返してもタンパク質の損失が少なく、２～８℃では凝集体の形成が少ない）に関して高い要求を満たしている。
【0055】
ＡＳ１４０９（Ｒｕｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，上掲）は、ｐＨ６．０の水性バッファー中の１ｍｇ／ｍｌ溶液として供給された。０．９％塩化ナトリウムで１対１に希釈して患者に投与された。ＮＨＳ－ＩＬ１２（Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，上掲）については、製剤に関するデータは示されていない。Ｌ１９－ｍＩＬ１２（Ｐｕｃａｅｔ ａｌ．，上掲）をリン酸緩衝生理食塩水で希釈した。
【0056】
これらの製剤は、科学的な臨床試験には間違いなく使用できるが、保存性や凝集性などの問題が考慮されていないため、市場には適さないことは確かである。次の表は、６つの好ましい製剤を示したものである。
【0057】
本発明の出願人に譲渡された出願ＷＯ２０１８／０１１４０４Ａ１には、抗体Ｌ１９とサイトカインＴＮＦを含む免疫サイトカイン用製剤が開示されている。ＷＯ２０１８／０１１４０４Ａ１の２５～２７頁で開示されている実施例４では、特に以下の製剤を検討した。
【0058】
（ｉ）ｐＨ６、８、９に調製したヒスチジンバッファー。
・ Ｈｉｓｔ－１は、ｐＨ６．０の２０ｍＭ ヒスチジン、８．５％スクロース（ｗ／ ｖ）、１３０ｍＭ ＥＤＴＡを含む。
・ Ｈｉｓｔ－２は、ｐＨ８．０の２０ｍＭ ヒスチジン、８．５％スクロース（ｗ／ ｖ）、１３０ｍＭ ＥＤＴＡを含む。
・ Ｈｉｓｔ－３は、ｐＨ９．０の２０ｍＭ ヒスチジン、８．５％スクロース（ｗ／ ｖ）、１３０ｍＭ ＥＤＴＡを含む。
・ Ｈｉｓｔ－１は、ｐＨ６．０の２０ｍＭ ヒスチジン、８．５％スクロース（ｗ／ ｖ）、１３０ｍＭ ＥＤＴＡを含む。
・ Ｈｉｓｔ－２は、ｐＨ８．０の２０ｍＭ ヒスチジン、８．５％スクロース（ｗ／ ｖ）、１３０ｍＭ ＥＤＴＡを含む。
・ Ｈｉｓｔ－３は、ｐＨ９．０の２０ｍＭ ヒスチジン、８．５％スクロース（ｗ／ ｖ）、１３０ｍＭ ＥＤＴＡを含む。
【0059】
（ｉｉ） ｐＨ ６．６に調製したクエン酸バッファー
・ Ｃｉｔｒａｔｅ－１ は、５．６ｇ／Ｌ クエン酸ナトリウム、０．２１ｇ／Ｌ クエン酸、７０ｇ／Ｌ トレハロース二水和物、０．２ｇ／Ｌポリソルベート８０ 、１％ （ｗ／ｖ）グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．６を含む。
出願ＷＯ２０１８／０１１４０４Ａ１の２１～２３頁で開示されている実施例１では、特に以下の製剤を検討した。
・ Ｃｉｔｒａｔｅ－１ は、５．６ｇ／Ｌ クエン酸ナトリウム、０．２１ｇ／Ｌ クエン酸、７０ｇ／Ｌ トレハロース二水和物、０．２ｇ／Ｌポリソルベート８０ 、１％ （ｗ／ｖ）グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．６を含む。
出願ＷＯ２０１８／０１１４０４Ａ１の２１～２３頁で開示されている実施例１では、特に以下の製剤を検討した。
【0060】
（ｉｉｉ）ｐＨ７．５および８．０に調製したＨｅｐｅｓバッファー。
・ Ｈｅｐｅｓ－１は、３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７５ｍＭ マンニトール、１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）を含む
・ Ｈｅｐｅｓ－２は、３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７５ｍＭ マンニトール、１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）および ０．１％ポリ ソルベート２０ を含む
・ Ｈｅｐｅｓ－３ は、１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ 、７５ｍＭ マンニトールおよび１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）を含む
・ Ｈｅｐｅｓ－４は、１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７５ｍＭ マンニトール、１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）および０．００５％ポ リソルベート２０を含む
・ Ｈｅｐｅｓ－５は、１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７５ｍＭマンニトール、１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）、０．０１％ポリソルベ ート２０を含む
・ Ｈｅｐｅｓ－６は、１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７５ｍＭ マンニトール、１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）および０．０５％ポリ ソルベート２０を含む
・ Ｈｅｐｅｓ－１は、３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７５ｍＭ マンニトール、１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）を含む
・ Ｈｅｐｅｓ－２は、３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７５ｍＭ マンニトール、１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）および ０．１％ポリ ソルベート２０ を含む
・ Ｈｅｐｅｓ－３ は、１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ 、７５ｍＭ マンニトールおよび１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）を含む
・ Ｈｅｐｅｓ－４は、１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７５ｍＭ マンニトール、１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）および０．００５％ポ リソルベート２０を含む
・ Ｈｅｐｅｓ－５は、１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７５ｍＭマンニトール、１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）、０．０１％ポリソルベ ート２０を含む
・ Ｈｅｐｅｓ－６は、１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７５ｍＭ マンニトール、１．８％グリセロール（ｗ／ｖ）および０．０５％ポリ ソルベート２０を含む
【0061】
ヒスチジンバッファーについては、許容基準を満たさなかった。クエン酸バッファーでは、視覚的透明度とＡ２８０安定性の基準は満たしたが、純度の基準は満たさず、懸濁液中の粒子や３量体の凝集が示唆された。ヒスチジンバッファーとクエン酸バッファーは、粒子が懸濁しており、さらなる検討の対象とはならなかった。
【0062】
０．１％未満のポリソルベート２０を含むＨｅｐｅｓ製剤については、許容基準も満たさなかった。満たした場合のみ。０．１％以上のポリソルベート２０を含むＨｅｐｅｓ製剤は、許容基準を満たした。
【0063】
その上で、上記の表による製剤が、ＷＯ２０１８/０１１４０４Ａ１の実施例１および４で使用された製剤と高度に類似しているにもかかわらず、また、本発明の組換えタンパク質がＷＯ２０１８/０１１４０４Ａ１のＬ１９－ＴＮＦと構造的類似性を有するにもかかわらず、許容できる結果をもたらすことは、非常に驚くべきことである。
【0064】
本発明の投与単位、使用のための組換えタンパク質、治療方法または製剤の実施形態によれば、組換えタンパク質に含まれる抗体は、少なくとも１つの単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体フラグメント、場合により単鎖ダイアボディを含む。
【0065】
本明細書中で使用される用語「単鎖ダイアボディ」は、短いリンカー、好ましくは３から１０アミノ酸長、より好ましくは５アミノ酸長を有する２つの単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体（「ダイアボディ」としても知られる）が、より長いリンカー、好ましくは５から２０アミノ酸長、より好ましくは１５アミノ酸長によって互いに連結された構築物に関し、以下の式（Ｎ－＞Ｃ配向）：
Ｌ１９ＶＨ－リンカー－Ｌ１９ＶＬ－リンカー－Ｌ１９ＶＨ－リンカー－Ｌ１９ＶＬ
で記載される。
Ｌ１９ＶＨ－リンカー－Ｌ１９ＶＬ－リンカー－Ｌ１９ＶＨ－リンカー－Ｌ１９ＶＬ
で記載される。
【0066】
本発明の投与単位、使用のための組換えタンパク質、治療方法または製剤の実施形態によれば、組換えタンパク質に含まれるＩＬ－１２は、リンカーによって連結されたｐ４０サブユニットとｐ３５サブユニットとを含む。
【0067】
本発明の投与単位、使用のための組換えタンパク質、治療方法または製剤の実施形態によれば、ｐ４０サブユニットおよびｐ３５サブユニットは、それぞれ配列番号１または配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。
【0068】
本発明の投与単位、使用のための組換えタンパク質、治療方法または製剤の実施形態によれば、組換えタンパク質に含まれる抗体は、ＶＬドメインとして配列番号５に記載のアミノ酸配列、およびＶＨドメインとして配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む抗ＥＤＢ抗体Ｌ１９である。
【0069】
本発明の投与単位、使用のための組換えタンパク質、治療方法または製剤の実施形態によれば、抗体、ＩＬ－１２および／または両者を連結するリンカーの少なくとも１つは、ＷＯ２０１９／１５４９８６に開示されているものであり、場合により、組換えタンパク質は、ＷＯ２０１９／１５４９８６に開示されているものである。
【0070】
ＷＯ２０１９／１５４９８６には、本発明の対象となる組換えタンパク質の技術的および生理的特性が記載されている。ＷＯ２０１９／１５４９８６Ａ１の内容は、参照により本明細書に援用される。
【0071】
本発明の投与単位、使用のための組換えタンパク質、治療方法または製剤の実施形態によれば、組換えタンパク質は、以下を含む。
【0072】
・ ｐ３５ドメインに第１のリンカーで連結されたｐ４０ドメイン。
・ ＳＡＤリンカーによってｐ３５ドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＨドメイン 。
・ 第３のリンカーによって第１のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＬドメイン。
・ 第４のリンカーによって第１のＬ１９ ＶＬドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＨドメイン。
・ 第５のリンカーによって第２のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＬドメイン。
・ ＳＡＤリンカーによってｐ３５ドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＨドメイン 。
・ 第３のリンカーによって第１のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＬドメイン。
・ 第４のリンカーによって第１のＬ１９ ＶＬドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＨドメイン。
・ 第５のリンカーによって第２のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＬドメイン。
【0073】
本発明の投与単位、使用のための組換えタンパク質、治療方法または製剤の実施形態によれば、組換えタンパク質は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むか、場合により配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる。
【0074】
本発明の投与単位、使用のための組換えタンパク質、治療方法または製剤の実施形態によれば、投与は静脈内または皮下で行われる。
【0075】
本発明の実施形態によれば、使用のための投与単位または組換えタンパク質は、上記の説明による製剤で提供される。
【0076】
本発明の実施形態によれば、上記の説明による製剤は、上記の説明による投与単位または組換えタンパク質を含む。
【0077】
本発明の一態様によれば、以下のものを含む部品キットが提供される。
ａ） 上記の説明による使用のための投与量単位または組換えタンパク質、
ｂ） 投与単位または組換えタンパク質を投与するための装置、および、場合により
ｃ） キットの使用のための説明書。
ａ） 上記の説明による使用のための投与量単位または組換えタンパク質、
ｂ） 投与単位または組換えタンパク質を投与するための装置、および、場合により
ｃ） キットの使用のための説明書。
【実施例0078】
本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。
本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に示される。
本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に示される。
【0079】
実施例１カニクイザルを用いた毒性試験
ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９でＬ１９抗体の標的となるフィブロネクチンのエクストラドメインＢは、種を超えて非常によく保存されたドメインで、ヒトとサルでは１００％同じである。
ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９でＬ１９抗体の標的となるフィブロネクチンのエクストラドメインＢは、種を超えて非常によく保存されたドメインで、ヒトとサルでは１００％同じである。
【0080】
ヒトとサルのＩＬ１２の相同性は、ｐ４０が９８％、ｐ３５が９５％であり、ヒトＩＬ１２はヒトとサルの両方で活性を持つことが分かっている。ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９の活性は、ヒトとサルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でテストされた。ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９と組換えヒトＩＬ１２は、ヒトとサルの両方のＰＢＭＣに対するＩＦＮγ増加に関して同等の活性を有している。しかし、ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９も組換えＩＬ１２も、サルではヒトＰＢＭＣの１０倍も活性が低い。
【0081】
毒性試験では、サルにヒト等価用量（ＨＥＤ）１３、５１、２１３μｇ／ｋｇ／週でＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９を週８回静脈内投与した。試験された用量は、ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９に関連する観察結果が報告されていないことから、呼吸器系、中枢神経系、心臓系、腎臓系に対する安全性が確認された。
【0082】
実施例２：製剤開発
塩組成とｐＨの異なる複数のバッファーをスクリーニングし、製剤化を検討した。以下のバッファーを検討した。
１）Ｈｅｐｅｓバッファー
・ １Ａ．１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ マンニトール、１％ｗ／ｖ グリセロー ル、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０
・ １Ｂ．１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ マンニトール、１ ％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．０
２）ヒスチジンバッファー
・ ２Ａ．２０ｍＭ ヒスチジン、８，５％ ｗ／ｖ スクロース、５０ｍｇ／Ｌ Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ６．０
・ ２Ｂ．２０ｍＭ ヒスチジン、８，５％ ｗ／ｖ スクロース、５０ｍｇ／Ｌ Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ８．０
３）リン酸バッファー
・ ３Ａ．１５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、３０ｍＭ ＮａＣ ｌ、５０ｍＭ マンニトール、１％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ６．５
・ ３Ｂ．１５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、３０ｍＭ ＮａＣ ｌ、５０ｍＭ マンニトール、１％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ７．５
４）クエン酸バッファー
・ ４Ａ．１ｍＭ クエン酸、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、８％ ｗ／ｖ スクロ ース、１％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０
塩組成とｐＨの異なる複数のバッファーをスクリーニングし、製剤化を検討した。以下のバッファーを検討した。
１）Ｈｅｐｅｓバッファー
・ １Ａ．１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ マンニトール、１％ｗ／ｖ グリセロー ル、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０
・ １Ｂ．１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ マンニトール、１ ％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．０
２）ヒスチジンバッファー
・ ２Ａ．２０ｍＭ ヒスチジン、８，５％ ｗ／ｖ スクロース、５０ｍｇ／Ｌ Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ６．０
・ ２Ｂ．２０ｍＭ ヒスチジン、８，５％ ｗ／ｖ スクロース、５０ｍｇ／Ｌ Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ８．０
３）リン酸バッファー
・ ３Ａ．１５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、３０ｍＭ ＮａＣ ｌ、５０ｍＭ マンニトール、１％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ６．５
・ ３Ｂ．１５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、３０ｍＭ ＮａＣ ｌ、５０ｍＭ マンニトール、１％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ７．５
４）クエン酸バッファー
・ ４Ａ．１ｍＭ クエン酸、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、８％ ｗ／ｖ スクロ ース、１％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０
【0083】
この研究は、以下のような操作方法を適用して行われた。
【0084】
１） 製剤化は脱塩クロマトグラフィーによって行われる。
２） 製剤化製品は分析前に０．２２μｍのフィルターでろ過される。
３） 製剤化されたタンパク質の濃縮は、アミコンデバイス（１０ｋＤａカットオフ） を使用し、遠心分離することで行われる。
４） 製品は２ｍｇ／ｍｌで製剤化される。
２） 製剤化製品は分析前に０．２２μｍのフィルターでろ過される。
３） 製剤化されたタンパク質の濃縮は、アミコンデバイス（１０ｋＤａカットオフ） を使用し、遠心分離することで行われる。
４） 製品は２ｍｇ／ｍｌで製剤化される。
【0085】
製剤化製品を受け入れるために安定性試験を開始する前に、外観に関連する予備的な許容基準を以下のように評価した。
・ 溶液が濁っていたり、懸濁液中の粒子が見える場合⇒サンプルを拒絶する。
・ 溶液が透明で、懸濁液中に目に見える粒子がない場合⇒安定性試験を実施する。
・ 溶液が濁っていたり、懸濁液中の粒子が見える場合⇒サンプルを拒絶する。
・ 溶液が透明で、懸濁液中に目に見える粒子がない場合⇒安定性試験を実施する。
【0086】
安定性試験を表１にまとめた各サンプルについて行った。以下は定義である：
・ 最初のデータが規格外であっても、安定性試験のすべての時点を分析する必要がある。
・ Ａ280nmはサンプルを遠心分離した後に評価する。
・ Ａ280nm ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ 法を適用（参考：Ｐｈ．Ｅｕｒ． ｃｕｒｒ． ｅｄ．， ｐａｒａｇｒａｐｈ ２．５．３３）。
・ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラムを用いてＳＥＣ分析を行う。
・ 最初のデータが規格外であっても、安定性試験のすべての時点を分析する必要がある。
・ Ａ280nmはサンプルを遠心分離した後に評価する。
・ Ａ280nm ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ 法を適用（参考：Ｐｈ．Ｅｕｒ． ｃｕｒｒ． ｅｄ．， ｐａｒａｇｒａｐｈ ２．５．３３）。
・ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラムを用いてＳＥＣ分析を行う。
【0087】
表１ ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９の製剤研究。保存温度、時点、アッセイ、許容基準について詳述する。
【表1】
【0088】
製剤化試験を行うために使用した材料は、ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９の分取ＳＥＣによって得られた：ＴＧＥ手順（すなわちＴｒａｎｓｉｅｎｔ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって発現し、ＴＥＡ １００ｍＭ ｎａｔｉｖｅ ｐＨで溶出してＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂上で精製し、次にＷＯ２０１９１５４８９６に記載されているようにＰＢＳで脱塩したものである。
【0089】
記録された結果を表２にまとめた。
【0090】
表２ ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９の製剤研究。製剤化後および２ｍｇ／ｍｌまでの濃縮後にＳＥＣで評価した、ステップ収率（製剤化および濃縮ステップ）と単鎖ダイアボディ純度の概要である。
【表2】
【0091】
総収率（製剤＋濃縮工程）は８６．２％～９０．２％であり、検討した異なる製剤条件間で非常に同等なデータが記録された。製剤化工程後の単鎖ダイアボディ純度は９５．４９％から９６．１１％であった。入力サンプルの純度が９６．０６％であることを考慮すると、製剤化後の記録データは、バッファー交換によって凝集体の形成が誘発されなかったことを証明するものである。２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した後、ＳＥＣの結果、単鎖ダイアボディの割合は９３．１５％から９４．８９％で、濃縮手順そのものによる高ＭＷフォーム（３％未満）の増加がわずかであることが示された。
【0092】
図１および２に製剤化後と濃縮後のサンプルのＳＥＣプロファイルを示す。
【0093】
すべての製剤化および濃縮されたサンプルの視覚的外観は、目に見える粒子がなく透明であった。次に、ストレス条件（すなわち、－８０℃での凍結と常温での解凍を３サイクル繰り返す）および２～８℃保存温度におけるサンプルの安定性について調査した。
【0094】
表３は、各製剤化サンプルの安定性試験で記録された結果である。
【0095】
表３ ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９の製剤研究。各サンプルについて各時点で収集したＡ280nmとＳＥＣの結果。両方についてストレス条件後（すなわち、凍結／解凍の３サイクル繰り返し）および２－８℃保存後である。
【表3】
【0096】
ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９の安定性を、ストレス条件下（すなわち、－８０℃での凍結と常温での融解の３サイクル）および２－８℃での１４日間保存後の７つの製剤バッファーで検討した。すべてのサンプルで外観は非常に良好であった。
【0097】
ＳＥＣプロファイルと単鎖ダイアボディの割合は、すべてのサンプルでよく比較でき、ダイアボディの減少と凝集体（表３では「ＨＭＷフォーム」と報告）の増加という点では非常に小さな変動しか観察されなかった。
【0098】
外観とＳＥＣで記録された同等の結果に基づき、Ａ280nmの値を用いて異なる製剤を比較し、最適な条件を定義した。
【0099】
表４は、各サンプルについて記録した凍結融解３サイクル後のＡ280nm値の減少を示したものである。Ａ280nmの損失に基づいて、サンプルを最良から最悪に分類した。
【0100】
表４ ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９の製剤研究。ストレス条件下での安定性試験：凍結・解凍３サイクル後のＡ280nmの損失を評価し、この損失に基づいてサンプルを最良から最悪に分類する。
【表4】
【0101】
Ａ280nmで評価したタンパク質の損失は、バッファーのｐＨだけでなく、バッファーの賦形剤に大きく依存するようである。
詳細は以下である：
・ ヒスチジンバッファーの比較：ｐＨ８．０（２Ｂ）はｐＨ６．０（２Ａ）よりも優 れている。どちらのバッファーにも８．５％ ｗ／ｖスクロースが入っているが、 この場合、ｐＨが異なる。
・ ヒスチジンバッファーｐＨ８．０（２Ｂ）とクエン酸バッファーｐＨ６．０（４Ａ ）を比較すると、同じ安定性が記録されていた。どちらのバッファーにもスクロー スが含まれている（それぞれ８．５％ ｗ／ｖと８％ ｗ／ｖ）：スクロースは安 定性を保証するもので、ｐＨは関係ないようだ。
・ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＣｌバッファー（１Ｂ）とＮａＣｌを含まないＨｅｐｅｓバッフ ァー（１Ａ）を比較すると⇒ＮａＣｌの存在が安定性に寄与しているようである。
・ リン酸バッファー ｐＨ６．５（３Ａ）では、同じ組成のバッファー組成であるｐ Ｈ７．５（３Ｂ）よりも製品の安定性が向上している。
詳細は以下である：
・ ヒスチジンバッファーの比較：ｐＨ８．０（２Ｂ）はｐＨ６．０（２Ａ）よりも優 れている。どちらのバッファーにも８．５％ ｗ／ｖスクロースが入っているが、 この場合、ｐＨが異なる。
・ ヒスチジンバッファーｐＨ８．０（２Ｂ）とクエン酸バッファーｐＨ６．０（４Ａ ）を比較すると、同じ安定性が記録されていた。どちらのバッファーにもスクロー スが含まれている（それぞれ８．５％ ｗ／ｖと８％ ｗ／ｖ）：スクロースは安 定性を保証するもので、ｐＨは関係ないようだ。
・ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＣｌバッファー（１Ｂ）とＮａＣｌを含まないＨｅｐｅｓバッフ ァー（１Ａ）を比較すると⇒ＮａＣｌの存在が安定性に寄与しているようである。
・ リン酸バッファー ｐＨ６．５（３Ａ）では、同じ組成のバッファー組成であるｐ Ｈ７．５（３Ｂ）よりも製品の安定性が向上している。
【0102】
ストレス調査に基づき、以下のバッファーが良い候補として選ばれた。
・ ２Ｂ． ２０ｍＭ ヒスチジン、８．５％ ｗ／ｖ スクロース、５０ｍｇ／Ｌ Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ８．０
・ ４Ａ． １ｍＭ クエン酸、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、８％ ｗ／ｖ スクロ ース、１％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０
１Ｂ． １５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ マンニトール、１％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．０
・ ２Ｂ． ２０ｍＭ ヒスチジン、８．５％ ｗ／ｖ スクロース、５０ｍｇ／Ｌ Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ８．０
・ ４Ａ． １ｍＭ クエン酸、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、８％ ｗ／ｖ スクロ ース、１％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０
１Ｂ． １５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ マンニトール、１％ ｗ／ｖ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．０
【0103】
表５は、研究対象の各サンプルについて記録された、２～８℃で１４日間保存した後のＡ280nm値の損失を報告している。Ａ280nmの損失に基づいて、サンプルを最良から最悪に分類した。
詳細は以下である：
詳細は以下である：
【0104】
・ ヒスチジンバッファーｐＨ８．０（２Ｂ）＝ヒスチジンバッファーｐＨ６．０（２ Ａ）＝（非常に似ている）。クエン酸バッファーｐＨ６．０（４Ａ）：同じく２－ ８℃で、スクロースの存在が安定性を保証し、２％のタンパク質損失がこれらのケ ースで記録された最大値であった。しかし、上記のバッファーでは、単鎖ダイアボ ディ形態の減少が最も大きかった：２．４％．
・ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＣｌ バッファー（１Ｂ）＝ＮａＣｌを含まないＨｅｐｅｓバッ ファー（１Ａ）では、２．４－２．５％のタンパク質の損失が見られた。
・ リン酸バッファーｐＨ７．５（３Ｂ）では、リン酸バッファーｐＨ６．５（３Ａ） （同一組成）に比べて生成物の安定性が良好であった。それぞれ０．８％ ｖｓ． ２．９％のタンパク質の損失があった。
・ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＣｌ バッファー（１Ｂ）＝ＮａＣｌを含まないＨｅｐｅｓバッ ファー（１Ａ）では、２．４－２．５％のタンパク質の損失が見られた。
・ リン酸バッファーｐＨ７．５（３Ｂ）では、リン酸バッファーｐＨ６．５（３Ａ） （同一組成）に比べて生成物の安定性が良好であった。それぞれ０．８％ ｖｓ． ２．９％のタンパク質の損失があった。
【0105】
表５ ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９の製剤研究。２～８℃における安定性試験：１４日間保存後のＡ280nmの損失を評価し、この損失に基づいてサンプルを最良から最悪に分類する。
【表5】
【0106】
製剤研究中に記録された結果に基づき、好ましい製剤バッファーがバッファー２Ｂ（２０ｍＭ ヒスチジン，８．５％ ｗ／ｖ スクロース，５０ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０）であることがわかった。
【0107】
ストレス条件下での試験で最高の結果を示し（凍結・解凍の３サイクル目でタンパク質の損失が３．３％、ＳＥＣ分析でダイアボディの損失がない）、２－８℃での試験で良好な結果を示した（タンパク質の損失はわずか２．１％、凝集体形成を伴う単鎖ダイアボディフォームの損失は２．４％）。
【0108】
参考文献
その開示は、その全体が本明細書に参照により援用される。
Ｇｕｔｂｒｏｄｔ ａｎｄ Ｎｅｒｉ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１２， １（１）， ７０－８７
Ｒｕｄｍａｎ ＳＭ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ａｐｒｉｌ １； １７（７）：１９９８－２００５
Ｓｔｒａｕｓｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１９ Ｊａｎ １；２５（１）：９９－１０９． ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１８－１５１２． Ｅｐｕｂ ２０１８ Ａｕｇ ２１．
Ｐｕｃａ ｅｔ ａｌ （２０１９） Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０２０ Ｍａｙ １；１４６（９）：２５１８－２５３０．
Ｃａｒ ＢＤ ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．１９９９ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；２７（１）：５８－６３．
配列
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ ＳＴ ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。
その開示は、その全体が本明細書に参照により援用される。
Ｇｕｔｂｒｏｄｔ ａｎｄ Ｎｅｒｉ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１２， １（１）， ７０－８７
Ｒｕｄｍａｎ ＳＭ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ａｐｒｉｌ １； １７（７）：１９９８－２００５
Ｓｔｒａｕｓｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１９ Ｊａｎ １；２５（１）：９９－１０９． ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１８－１５１２． Ｅｐｕｂ ２０１８ Ａｕｇ ２１．
Ｐｕｃａ ｅｔ ａｌ （２０１９） Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０２０ Ｍａｙ １；１４６（９）：２５１８－２５３０．
Ｃａｒ ＢＤ ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．１９９９ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；２７（１）：５８－６３．
配列
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ ＳＴ ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。
【表6】
【0109】
SEQUENCE LISTING
<110> Philogen S.p.A.
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<130> PD43383
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<213> Homo sapiens
<400> 1
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50 55 60
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385 390 395 400
Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser
405 410 415
Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met
420 425 430
Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro
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Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu
450 455 460
Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser
465 470 475 480
Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile
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Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met
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Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Gly Ser Ala Asp Gly Gly Ser Ser Ala Gly
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Gly Ser Asp Ala Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
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Thr Phe Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
565 570 575
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr
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Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
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Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
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Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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995 1000 1005
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【配列表】
【外国語明細書】