特開 2024-28802 レンチウイルスパッケージングシステム、それにより製造されたレンチウイルス、及び、該レンチウイルスで形質導入された細胞、並びに、それを使用して宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024028802

(43)【公開日】2024-03-05

(54)【発明の名称】レンチウイルスパッケージングシステム、それにより製造されたレンチウイルス、及び、該レンチウイルスで形質導入された細胞、並びに、それを使用して宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20240227BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240227BHJP

【ＦＩ】

C12N15/867 Z ZNA

C12N7/01

C12N1/15

C12N1/19

C12N5/10

【審査請求】未請求

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023202860

(22)【出願日】2023-11-30

(62)【分割の表示】P 2021142315の分割

【原出願日】2021-09-01

(31)【優先権主張番号】110115343

(32)【優先日】2021-04-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW

(71)【出願人】

【識別番号】521311643

【氏名又は名称】沛爾生技醫藥股▲分▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100201329

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 真二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100167601

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 信之

(72)【発明者】

【氏名】林韋齊

(72)【発明者】

【氏名】周思▲ユ▼

(72)【発明者】

【氏名】楊曜誠

(72)【発明者】

【氏名】林建廷

(72)【発明者】

【氏名】林成龍

(57)【要約】      （修正有）

【課題】製造されたレンチウイルスが高いウイルス力価を有し、且つ、製造されたレンチウイルスを細胞の形質導入に使用する場合、形質導入率及び遺伝子デリバリー効率を向上させることができる、レンチウイルスパッケージングシステムを提供する。
【解決手段】ＴＡＲキメラ５’ＬＴＲのヌクレオチド配列を含むトランスファープラスミドと、ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含む少なくとも一つのパッケージングプラスミドと、エンベローププラスミドとを含む、レンチウイルスパッケージングシステムを提供する。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＡＲキメラ５’ ＬＴＲ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ－ｒｅｓｅｒｖｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ５’ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）のヌクレオチド配列を含むトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）プラスミドと、
ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＡＲ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含む少なくとも一つのパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）プラスミドと、
エンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）プラスミドと、を含み、
前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ｔａｔ遺伝子のヌクレオチド配列であり、前記ＴＡＲキメラ５’ ＬＴＲのヌクレオチド配列は、ＴＡＲのヌクレオチド配列を有し、前記ＴＡＲのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるヌクレオチド配列を含む、
レンチウイルスパッケージングシステム。

【請求項2】

前記少なくとも一つのパッケージングプラスミドは、第一パッケージングプラスミド及び第二パッケージングプラスミドであり、前記第一パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列のうちの二つを含み、前記第二パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列のうちの、前記第一パッケージングプラスミドに含まれる二つのヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。

【請求項3】

前記少なくとも一つのパッケージングプラスミドは、第一パッケージングプラスミド、第二パッケージングプラスミド、第三パッケージングプラスミド及び第四パッケージングプラスミドであり、前記第一パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第二パッケージングプラスミドは、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第三パッケージングプラスミドは、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第四パッケージングプラスミドは、ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。

【請求項4】

前記少なくとも一つのパッケージングプラスミドは、第一パッケージングプラスミド、第二パッケージングプラスミド及び第三パッケージングプラスミドであり、前記第一パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列のうちの二つを含み、前記第二パッケージングプラスミド及び前記第三パッケージングプラスミドはそれぞれ、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列のうちの、前記第一パッケージングプラスミドに含まれる二つのヌクレオチド配列以外のいずれか一つを含む、請求項１に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。

【請求項5】

前記第一パッケージングプラスミドは、前記ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及び前記ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第二パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第三パッケージングプラスミドは、前記ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。

【請求項6】

前記トランスファープラスミドと、第一パッケージングプラスミドと、第二パッケージングプラスミドと、第三パッケージングプラスミドと、エンベローププラスミドとの重量比が、３～１２：３～７：１～４：１～４：０．８～６である、請求項４又は５に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。

【請求項7】

前記ｔａｔ遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列を含む、請求項１に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。

【請求項8】

前記エンベローププラスミドは、水泡性口炎ウイルス糖タンパク質（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＶＳＶ－Ｇ）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、又はヒヒ内在性ウイルスエンベロープ（ｂａｂｏｏｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ）の遺伝子のヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステムにより調製された、
レンチウイルス。

【請求項10】

請求項９に記載のレンチウイルスで、分離された有核細胞に遺伝子を形質導入して得られる、
分離された細胞。

【請求項11】

前記有核細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、又は脂肪幹細胞である、請求項１０に記載の分離された細胞。

【請求項12】

請求項１～８のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステムを使用し、宿主細胞にトランスフェクションすることを含み、
前記宿主細胞が、ｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞である、
宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法。

【請求項13】

請求項１～８のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステムを使用し、宿主細胞にトランスフェクションすることを含む、
宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法。

【請求項14】

前記宿主細胞は哺乳類動物の細胞を含む、請求項１３に記載の宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法。

【請求項15】

前記哺乳類動物の細胞はヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）又は２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を含む、請求項１４に記載の宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、レンチウイルスパッケージングシステムに関するものであり、特に、ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含むプラスミドと、ＴＡＲキメラ ５’ ＬＴＲのヌクレオチド配列を含むプラスミドとを含む、レンチウイルスパッケージングシステムに関するものである。

【背景技術】

【0002】

レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）は、レトロウイルスの一種であり、トランスフェクションが困難な（ｈａｒｄ－ｔｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）細胞（例えば、初代Ｔ細胞）への標的遺伝子のデリバリーに広く用いられている。また、その他のレトロウイルスと異なり、レンチウイルスは、分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）及び非分裂（ｎｏｎ－ｄｉｖｉｄｉｎｇ）細胞に形質導入されることが可能である。且つ、ＶＳＶ－Ｇタンパク質と併用すると、ソースが異なる細胞に感染することができる。更に、レンチウイルスのＲＮＡゲノムの容量は約１０Ｋｂであるので、大きな遺伝子配列や複雑な遺伝子配列のデリバリーに用いられることが可能である。レンチウイルスはそれらの利点を有するので、臨床治療に広く適用されている。

【0003】

レンチウイルスの調製は、一般的に、標的遺伝子を含有するトランスファープラスミド、及び、レンチウイルスパッケージングに必要なウイルスの遺伝子を含有する他のプラスミドを共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、プラスミドのトランスフェクションの後、標的遺伝子の配列を含むレンチウイルスの顆粒が培地中に放出され、続いて、培地を回収し、更に、使用濃度となるように濃縮した後、－８０°Ｃで保存するものである。

【0004】

レンチウイルスパッケージングシステムは、過去数十年間において発展が進んでいる。一代目のレンチウイルスパッケージングシステムは、トランスファープラスミドと、エンベローププラスミドと、必要なＨＩＶ－１ウイルス遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ及びｒｅｖ）及び幾つかの従属遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ及びｎｅｆ）を含むプラスミドとの三つのプラスミドを含む。それらのうち、ウイルスのｇａｇ遺伝子は、多くのウイルスカプシドタンパク質をコードするものであり、ｐｏｌ遺伝子は、ウイルスのパッケージング及び感染に用いられる逆転写酵素、インテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）及びプロテアーゼをコードするものである。また、ウイルスのパッケージング又は標的細胞への感染にとって、前記四つの従属遺伝子は必要なものではないので、二代目のレンチウイルスパッケージングシステムには、前記四つの従属遺伝子が除去されている。また、一代目及び二代目のウイルスパッケージングシステムにおいて、トランスファープラスミドに標的遺伝子が含まれるウイルスゲノムの転写は、プロモーターとしての５’ ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）及びＴＡＴタンパク質により駆動されるものであり、該ＴＡＴタンパク質は、トランス活性化調節タンパク質（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）の一種であり、ＬＴＲにおけるＴＡＲ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）配列に結合することが可能である。

【0005】

一方、三代目のレンチウイルスパッケージングシステムでは、レンチウイルスの安全性をより一層向上させ、特に、レンチウイルスの複製能力の進展を避けるために、標的遺伝子の両端に位置する（ｆｌａｎｋ）ＬＴＲを修飾し、更にｒｅｖ遺伝子を第四のプラスミドに移動することにより、遺伝子組み換えの可能性をより一層低減する。また、修飾されたＬＴＲは、プロモーターの活性を有しなくなり、トランスファープラスミド上のウイルスゲノム配列の転写は、修飾された５’ ＬＴＲの前に加えられたラウス肉腫ウイルスプロモーター（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ＲＳＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）又はサイトメガロウイルスプロモーター（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）により駆動されるものとなる。この場合、ｔａｔ遺伝子は無用のものであることから、三代目のレンチウイルスパッケージングシステムにおいて除去されているので、遺伝子の減少によりレンチウイルスパッケージングシステムの感染効率が向上した。

【0006】

しかしながら、二代目のレンチウイルスパッケージングシステムと比べると、三代目のレンチウイルスパッケージングシステムは、安全性が向上した反面、レンチウイルスの収率が犠牲となっているので、ウイルスの製造効率を向上させることができるレンチウイルスパッケージングシステムは切実に求められている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｖ．ＮＡＲＲＹ ＫＩＭ、ＫＹＲＩＡＣＯＳ ＭＩＴＲＯＰＨＡＮＯＵＳ、ＳＵＳＡＮ Ｍ．ＫＩＮＧＳＭＡＮ、ＡＬＡＮ Ｊ．ＫＩＮＧＳＭＡＮ著、「Ｍｉｎｉｍａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ａ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １」、ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ、１９９８年１月発行、ｐ．８１１～８１６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

従来技術の欠点を克服するために、本発明は、安全性を損なうことなく、レンチウイルスパッケージングシステムによるレンチウイルスの収率を向上させることを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前記発明の目的を達成するために、本発明は、ＴＡＲキメラ ５’ ＬＴＲ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ－ｒｅｓｅｒｖｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ５’ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）のヌクレオチド配列を含むトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）プラスミドと、ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＡＲ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含む少なくとも一つのパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）プラスミドと、エンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）プラスミドとを含む、レンチウイルスパッケージングシステム（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を提供するものである。

【0010】

本発明は、三代目のレンチウイルスパッケージングシステムに、ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含むプラスミドを加えることにより、製造されたレンチウイルスの収率及びウイルス力価、特に、ウイルスの機能力価（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｉｔｅｒ）を向上させることができ、且つ、製造されたレンチウイルスの形質導入時の遺伝子のデリバリー効能を向上させることもできる。

【0011】

前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ｔａｔ遺伝子のヌクレオチド配列であることが好ましい。

【0012】

前記ｔａｔ遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるようなヌクレオチド配列を含むことが好ましい。それは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部であり、且つ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列はイントロンを含まないので、二代目のレンチウイルスパッケージングシステムにおいてよく使用されるｔａｔ遺伝子のヌクレオチド配列と異なり、小さいプラスミドのサイズを有することが可能である。

【0013】

前記ＴＡＲキメラ ５’ ＬＴＲのヌクレオチド配列におけるＴＡＲのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるようなヌクレオチド配列を含むことが好ましい。

【0014】

前記ＴＡＲキメラ ５’ ＬＴＲのヌクレオチド配列は、その５’ ＬＴＲのＵ３が破壊され、ＣＭＶ又はＲＳＶプロモーターにより駆動されるものとなることが好ましい。このことにより、ウイルスは複製し続けることができなくなるので、安全性は向上する。なお、このＴＡＲキメラ ５’ ＬＴＲのヌクレオチド配列は、三代目のレンチウイルスパッケージングシステムと同様である。また、本発明の一つの実施態様は、ＲＳＶプロモーターにより駆動されるものである。

【0015】

前記少なくとも一つのパッケージングプラスミドの数量は、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列の数量に等しいことが好ましい。例えば、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列の数量がそれぞれ一つであり、合計で四つである場合、プラスミドの数量も四つであり、即ち、前記少なくとも一つのパッケージングプラスミドは、第一パッケージングプラスミド、第二パッケージングプラスミド、第三パッケージングプラスミド及び第四パッケージングプラスミドであり、且つ、前記第一パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第二パッケージングプラスミドは、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第三パッケージングプラスミドは、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第四パッケージングプラスミドは、ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。前記各パッケージングプラスミドはそれぞれ、各配列の一つを有することが好ましい。

【0016】

前記少なくとも一つのパッケージングプラスミドは、第一パッケージングプラスミド及び第二パッケージングプラスミドであり、且つ、前記第一パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列のうちの一つを含み、前記第二パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列のうちの、前記第一パッケージングプラスミドに含まれる一つのヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。例えば、第一パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含み、第二パッケージングプラスミドは、前記ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。或いは、第一パッケージングプラスミドは、前記ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、第二パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。

【0017】

前記少なくとも一つのパッケージングプラスミドは、第一パッケージングプラスミド及び第二パッケージングプラスミドであり、且つ、前記第一パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列のうちの二つを含み、前記第二パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列のうちの、前記第一パッケージングプラスミドに含まれる二つのヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。また、第一パッケージングプラスミド及び第二パッケージングプラスミドに含まれるヌクレオチド配列はそれぞれ異なる。例えば、前記第一パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列及びｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第二パッケージングプラスミドは、前記ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。或いは、前記第一パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列及び前記ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第二パッケージングプラスミドは、前記ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。或いは、前記第一パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列及び前記ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第二パッケージングプラスミドは、前記ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列及びｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。

【0018】

前記少なくとも一つのパッケージングプラスミドは、第一パッケージングプラスミド、第二パッケージングプラスミド及び第三パッケージングプラスミドであり、且つ、前記第一パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列のうちの二つを含み、前記第二パッケージングプラスミド及び前記第三パッケージングプラスミドはそれぞれ、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列のうちの、前記第一パッケージングプラスミドに含まれる二つのヌクレオチド配列以外のいずれか一つを含むことが好ましい。また、第一パッケージングプラスミド、第二パッケージングプラスミド及び第三パッケージングプラスミドに含まれるヌクレオチド配列はそれぞれ異なる。一つの実施態様において、前記第一パッケージングプラスミドは、前記ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列及びｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第二パッケージングプラスミドは、前記ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記第三パッケージングプラスミドは、前記ｒｅｖ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。この実施態様によれば、同時トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時のプラスミド数量の増加によるレンチウイルスの収率の低下がないのみならず、製造されたレンチウイルスの収率は、プラスミド数量が少ない三代目のレンチウイルスパッケージングシステムにより製造されたレンチウイルスよりも高い。

【0019】

前記トランスファープラスミドと、第一パッケージングプラスミドと、第二パッケージングプラスミドと、第三パッケージングプラスミドと、エンベローププラスミドとの重量比は、３～１２：３～７：１～４：１～４：０．８～６であることが好ましく、前記トランスファープラスミドと、第一パッケージングプラスミドと、第二パッケージングプラスミドと、第三パッケージングプラスミドと、エンベローププラスミドとの重量比は、４～１１：４～７：１．５～３．５：１．５～３．５：０．９～４．５であることがより好ましい。この割合によれば、多量のレンチウイルスを製造することができる。前記トランスファープラスミドと、第一パッケージングプラスミドと、第二パッケージングプラスミドと、第三パッケージングプラスミドと、エンベローププラスミドとの重量比は、５：５：２：２：４であることがより好ましい。この割合によれば、多量のレンチウイルスを製造することができる。

【0020】

一つの実施例において、前記トランスファープラスミドと、第一パッケージングプラスミドと、第二パッケージングプラスミドと、第三パッケージングプラスミドと、エンベローププラスミドとの重量比は、９．５～１０．５：５．５～６．５：２．５～３．５：２．５～３．５：０．９～１．１である。この割合によれば、多量のレンチウイルスを製造することができる。前記トランスファープラスミドと、第一パッケージングプラスミドと、第二パッケージングプラスミドと、第三パッケージングプラスミドと、エンベローププラスミドとの重量比は、１０：６：３：３：１であることが更に好ましい。この割合によれば、多量のレンチウイルスを製造することができる。

【0021】

前記エンベローププラスミドは、水泡性口炎ウイルス糖タンパク質（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＶＳＶ－Ｇ）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、又はヒヒ内在性ウイルスエンベロープ（ｂａｂｏｏｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ）の遺伝子のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。これにより、エンベロープの形成、製造されたウイルスの感染力の向上、及び感染可能な細胞の種類の増加に寄与する。

【0022】

前記レンチウイルスパッケージングシステムは更に、ｖｐｕ遺伝子のヌクレオチド配列、ｎｅｆ遺伝子のヌクレオチド配列、ｖｉｆ遺伝子のヌクレオチド配列、ｖｐｒ遺伝子のヌクレオチド配列を含む、少なくとも一つ又は複数のプラスミドを含むことが好ましい。

【0023】

前記トランスファープラスミドは更に、デリバリーしようとする標的遺伝子を含むことが好ましい。

【0024】

前記デリバリーしようとする標的遺伝子は、抗ＣＤ１９受容体をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。前記抗ＣＤ１９受容体は、ＣＤ１９抗原に特異的に結合する受容体である。

【0025】

前記本発明は、抗ＣＤ１９受容体、例えば、Ｐｏｒｔｅｒ， Ｄａｖｉｄ Ｌ．， ｅｔ ａｌ．”Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ-ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．” Ｎ ｅｎｇｌ ｊ Ｍｅｄ ３６５（２０１１）：７２５－７３３における抗ＣＤ１９受容体－ＢＢｚのヌクレオチドを含み、ＢＢｚは即ち、共刺激（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）４－１ＢＢ及び細胞内領域（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）のＣＤ３ζであるので、更にがんの治療用のキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）細胞の調製に用いることができる。本発明の一つの実施態様において、抗ＣＤ１９受容体をコードするヌクレオチド配列としては、抗ＣＤ１９受容体－ＢＢｚをコードするヌクレオチド配列、即ち、抗ＣＤ１９受容体－ＢＢｚ（以下、ＣＤ１９－ＢＢｚと略称する）のヌクレオチド配列を使用する。

【0026】

本発明はまた、前記レンチウイルスパッケージングシステムにより調製されたレンチウイルスを提供するものである。前記製造されたレンチウイルスは、三代目のレンチウイルスパッケージングシステムと比べると、ウイルス顆粒中に更にＴＡＴタンパク質を有し、且つ、測定したところ、三代目のレンチウイルスパッケージングシステムと比べると、より高い形質導入効率を有する。

【0027】

本発明はまた、前記レンチウイルスで有核細胞に遺伝子を形質導入して得られる、分離された細胞を提供するものである。前記有核細胞は、分離されたＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、又は脂肪幹細胞を含むことが好ましい。それにより、前記分離された細胞を、更にがんの治療用のキメラ抗原受容体細胞の調製に使用することができる。即ち、本発明はまた、がんの治療薬物の調製に用いられる、前記分離された細胞の用途を提供するものである。本発明はまた、前記レンチウイルスパッケージングシステムを使用し、宿主細胞にトランスフェクションすることを含む、宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法を提供するものである。

【0028】

前記宿主細胞は哺乳類動物の細胞を含むことが好ましい。

【0029】

前記哺乳類動物の細胞は、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）又は２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を含むことが好ましく、該２９３Ｔ細胞は、ＨＥＫ ２９３に更にＳＶ４０ウイルスのＴ－抗原遺伝子を導入した細胞である。

【0030】

一つの実施態様において、前記宿主細胞は２９３Ｔ細胞である。

【0031】

一つの実施態様において、前記宿主細胞はｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞である。本発明のレンチウイルスパッケージングシステムは、ｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞でレンチウイルスを製造することにより、製造されたレンチウイルスのウイルス力価を確実に向上させることができる。

【発明の効果】

【0032】

本発明のレンチウイルスパッケージングシステムは、製造されたレンチウイルスのウイルス力価を向上させることができ、また、Ｔ細胞の形質導入に用いる場合、形質導入率及び遺伝子デリバリー効率を向上させることもできることから、「ウイルス力価が低すぎるため、形質導入の体積が増加し、形質導入効率が低下するので、Ｔ細胞の品質に影響を与える」という問題を避けることができる。且つ、ウイルス力価が高いことから、形質導入時に必要なレンチウイルスの体積は小さくなるので、製造されたレンチウイルスの遺伝子デリバリーへの応用（例えば、がんを治療するためのキメラ抗原受容体細胞（ＣＡＲ－Ｔ）の製造に使用する）のコストを低減することができる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】本発明に係るｙＴＡ－ＣＭＶ－ｔａｔ発現ベクターの模式図である。

【図2A】実施例１のレンチウイルスパッケージングシステムにおける、ＴＡＲキメラ５’－ＬＴＲを含むトランスファープラスミドの模式図である。

【図2B】実施例１のレンチウイルスパッケージングシステムにおけるプラスミド組成物の模式図である。

【図3】本発明のレンチウイルスパッケージングシステム及び三代目のレンチウイルスパッケージングシステムに係る、大規模及び小規模で製造されたレンチウイルスのウイルス力価の倍数の対比を示す図である。

【図4】調製例３においてウェスタンブロット法により測定された各細胞株のＰＫＲタンパク質の発現量を示す図である。

【図5】本発明のレンチウイルスパッケージングシステム及び三代目のレンチウイルスパッケージングシステムに係る、小規模でｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞で製造されたレンチウイルスのウイルス力価の倍数の対比を示す図である。

【図6A】二代目、三代目及び本発明のレンチウイルスパッケージングシステムにより製造されたレンチウイルスの形質導入率を示す図である。

【図6B】二代目、三代目及び本発明のレンチウイルスパッケージングシステムにより製造されたレンチウイルスの形質導入後のＴ細胞の平均蛍光強度を示す図である。

【図6C】本発明のレンチウイルスパッケージングシステム及び二代目のレンチウイルスパッケージングシステムに係る、製造されたレンチウイルスの形質導入率及び形質導入後のＴ細胞の平均蛍光強度の倍数の対比を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下、図面並びに本発明の調製例及び実験例を利用して、本発明において所望の発明の目的を達成するために採用される技術手段について更に説明する。

【0035】

調製例１：ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子を含むパッケージングプラスミドを構築する。

【0036】

まず、ｐＡｌｌ－Ｃａｓ９－Ｂ２Ｍ＿１－ＤＰプラスミドがＰｓｐＸＩ／ＡｇｅＩ酵素で切断された後の、ＣＭＶプロモーターを含むＤＮＡ断片を、ＸｍａＩ／ＳａｌＩ酵素で切断されて線状化されたｙＴＡ－ｅｍｐｔｙベクターに連結することにより、ｙＴＡ－ＣＭＶプラスミドを調製した。
また、この調製例に使用される、ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子である、イントロンを含まないｔａｔ遺伝子のヌクレオチド配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるもの）は、ｐＣＭＶｄｅｌｔａＲ８．９１プラスミド（中央研究院ＲＮＡｉ Ｃｏｒｅから購入したもの）を介して増幅した後、ＮｈｅＩ／ＢｓｒＧＩ酵素で切断され、ＮｈｅＩ／ＢｓｒＧＩ酵素で切断されて線状化されたｙＴＡ－ＣＭＶ プラスミドに挿入され、このことにより、図１で示されるような、３７４９の塩基対を有するｙＴＡ－ＣＭＶ－ｔａｔ発現プラスミドを得た。
前記ｐＡｌｌ－Ｃａｓ９－Ｂ２Ｍ＿１－ＤＰプラスミドは、ＢｓｍＢＩ酵素で切断された、中央研究院ＲＮＡｉ Ｃｏｒｅから購入した製品番号Ｃ６－８－６７のｐＡｌｌ－Ｃａｓ９．Ｐｐｕｒｏプラスミドに、Ｂ２Ｍ ｇＲＮＡ ＤＮＡ断片を導入して得られたｐＡｌｌ－Ｃａｓ９－Ｂ２Ｍプラスミドに対し、更に、ＰＣＲ増幅及びＳａｃＩＩ酵素切断の方式で、ａｎｔｉ－ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅを削除して得られたものである。
前記ｙＴＡ－ｅｍｐｔｙベクターは、ＰＣＲ方式で、ｐＡｌｌ－Ｃａｓ９．Ｐｐｕｒｏプラスミドから一部のＷＰＲＥ断片を増幅させ、また、ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ方式で、益生社から購入したｙＴＡベクター（Ｔ＆Ａ^ＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ，ＦＹＣ００１－２０Ｐ，ＹＥＡＳＴＥＲＮ ＢＩＯＴＥＣＨ）に導入してｙＴＡ－ＷＰＲＥ＿Ｐを得、更に、ＳａｃＩＩ酵素で切断されたｙＴＡ－ＷＰＲＥ＿Ｐプラスミドを使用し、二つのＳａｃＩＩ切断点間にある配列を除去して得られたものである。
前記ｙＴＡ－ｅｍｐｔｙベクターには、従来の発現ベクターの基本要素であるＡｍｐｒ、Ａｍｐｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒ及びｏｒｉを有する。

【0037】

調製例２：ＣＤ１９－ＢＢｚを含有するトランスファープラスミドを構築する。

【0038】

ＴＡＲキメラ５’ ＬＴＲのヌクレオチド配列を含み、且つＲＳＶプロモーターで駆動されるｐＬＡＳ５ｗ．Ｐｐｕｒｏプラスミド（中央研究院ＲＮＡｉ Ｃｏｒｅから購入したもの、商品番号Ｃ６－８－３９）に対し、ｈＰＧＫプロモーター及びＰＡＣ遺伝子を除去する（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔに依頼して行った）ことにより、ｐＬＡＳ５ｗプラスミドを得た。続いて、ＣＤ１９－ＢＢｚをコードしているヌクレオチド配列を、Ｌｅｎｔｉ－ＥＦ１ａ－ＣＤ１９ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓに依頼して製造したもの）から、ＢｓｔＢＩ及びＮｈｅＩ酵素で切断することにより、前記ｐＬＡＳ５ｗプラスミドに導入した。該ＴＡＲキメラ５’ ＬＴＲに含まれるＴＡＲのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される通りである。

【0039】

実験例１：レンチウイルスの調製

【0040】

２９３Ｔ細胞を、１．５ｘ１０^７の細胞数でＴ８７５培養瓶に接種し（大規模）、１ｘ１０^６の細胞数で１０ｃｍペトリ皿に接種した（小規模）後、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，１１９６５－０９２，Ｇｉｂｃｏ）培地を使用し、３７°Ｃ、５％二酸化炭素の雰囲気で三日培養した。その後、トランスフェクション試薬ＰｏｌｙＪｅｔ（ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、操作マニュアルの方式に従い、表１における二代目のレンチウイルスパッケージングシステム（比較例１）、三代目のレンチウイルスパッケージングシステム（比較例２）、及び本発明のレンチウイルスパッケージングシステム（実施例１及び実施例２を含む。この二つの実施例の差異は、各パッケージングプラスミドの割合の差異のみにある。）におけるプラスミド組成物を、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地において、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションすることにより、小規模（１０ｃｍペトリ皿）又は大規模（Ｔ８７５培養瓶）で、デリバリーしようとする標的遺伝子ＣＤ１９－ＢＢｚを有するレンチウイルスをそれぞれ調製した（本発明のレンチウイルスパッケージングシステムに係る実施例２では、小規模のみでレンチウイルスを調製した）。
そのうち、比較例１の二代目のレンチウイルスパッケージングシステム（中央研究院ＲＮＡｉ Ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙから購入したもの）及び比較例２の三代目のレンチウイルスパッケージングシステム（Ａｌｄｅｖｒｏｎから購入したもの）は従来技術である。翌日、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（５１９８５－０３４，Ｇｉｂｃｏ）で、元１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地を置き換え、２４時間後に、レンチウイルス顆粒を含む上層液を初めて回収し、また、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地を更に添加し、２４時間培養した後に、レンチウイルス顆粒を含む上層液を再び回収した。つまり、全ての回収プロセスを完成させた後に、全てのレンチウイルス顆粒を含む上層液を混合し、更にＬｅｎｔｉ－Ｘ濃縮試薬（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を利用して１００倍濃縮した。即ち、レンチウイルス顆粒を含む上層液の体積を元体積の１／１００に縮小することにより、１００倍濃縮レンチウイルスを得た。

【0041】

【表1】

【0042】

実験例１で調製したレンチウイルスに対し、ウイルス力価を測定し、具体的には、ウイルス力価に対する測定は、３倍配列希釈（３倍～６５６１倍）された実験例１のうちの各レンチウイルスサンプルを、Ｊｕｒｋａｔ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）した上で行った。まず、５０μＬのレンチウイルスサンプルを１００μＬのＸ－Ｖｉｖｏ１５培地に加入し、３倍配列希釈を行い、希釈６５６１倍となるまでこの希釈工程を繰り返すことにより、複数組の配列希釈されたレンチウイルスサンプルを得た。続いて、各組の配列希釈されたレンチウイルスサンプルから５０μＬを取って、９６ウェルプレート（Ｕ底）の、４×１０^４／１００μＬ／ウェルでＪｕｒｋａｔ細胞が培養されている、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０（１１８７５－０８５，Ｇｉｂｃｏ）培地に加入した（第０日）。
また、第２日に、各ウェルに、１００μＬの新鮮な、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地を加入する。更に、インキュベーターで２４時間再度培養した後、ｂｉｏｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）及びＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である抗体を使用してＣＤ１９－ＢＢｚを測定し、フローサイトメーターを利用して目標タンパク質の発現量を分析することにより、ウイルスの形質導入効力を測定した。且つ、以下の算式でウイルスの有効力価を計算した。
ウイルス力価（ＴＵ／ｍｌ）＝（％ＣＤ１９－ＢＢｚを発現した細胞／１００）×４×１０^４×２０×希釈倍数

【0043】

そのうち、希釈倍数が７２９倍である実施例２に係る本発明のレンチウイルスパッケージングシステムを使用してレンチウイルスサンプルを製造した場合、ＣＤ１９－ＢＢｚを発現した細胞の発現比率は１６．０９％であり、得られたウイルス力価は９．３８×１０^７形質導入単位（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｕｎｉｔ，ＴＵ）／ｍｌであり、また、希釈倍数としては、一つ目の発現百分比が２０％より低い希釈倍数を選択し、この希釈倍数のサンプルの数値で力価を計算した。
実施例２で調製したレンチウイルスサンプルのウイルス力価は、実施例１で調製したレンチウイルスサンプルよりも優れていた。また、図３で示されるように、実施例１に係る本発明のレンチウイルスパッケージングシステムを利用して生産したＣＤ１９－ＢＢｚレンチウイルスは、そのウイルスの力価が、大規模でも小規模でも、明らかに三代目のレンチウイルスパッケージングシステムを利用して生産したレンチウイルスの力価よりも優れていた。即ち、小規模の場合、おおよそ三代目のレンチウイルスパッケージングシステム（比較例２）で生産したレンチウイルスの力価の３．４８倍であり、大規模の場合、おおよそ三代目のレンチウイルスパッケージングシステム（比較例２）で生産したレンチウイルスの力価の４．１６倍より大きい。
更に、ウイルスの体積にウイルスの力価を乗ずることにより、ウイルスの収率を得た。また、各実施例、比較例の最終的に得られたウイルスの体積は同様であるので、収率又はウイルスの力価の増加の程度も同様である。即ち、小規模の場合、実施例１に係る本発明のレンチウイルスパッケージングシステムを利用して生産したＣＤ１９－ＢＢｚレンチウイルスの収率は、三代目のレンチウイルスパッケージングシステム（比較例２）による収率の３．４８倍であり、大規模の場合、実施例１に係る本発明のレンチウイルスパッケージングシステムを利用して生産したＣＤ１９－ＢＢｚレンチウイルスの収率は、三代目のレンチウイルスパッケージングシステム（比較例２）による収率の４．１６倍であり、明らかに三代目のレンチウイルスパッケージングシステム（比較例２）によるレンチウイルスの収率よりも優れていた。故に、本発明のレンチウイルスパッケージングシステムは、大規模の場合にも小規模の場合にも、ＴＡＴタンパク質を同時に発現したことから、明らかに三代目のレンチウイルスパッケージングシステム（比較例２）よりも優れていたので、確かにレンチウイルスの収率の向上に寄与する。

【0044】

調製例３：ｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞の調製

【0045】

二つの相補的プライマーをアニーリングして２４塩基対のＰＫＲガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）を調製し、ＢｓｍＢＩ酵素で切断されて線状化されたＣａｓ９－Ｔ２Ａ－ｅＧＦＰ－ＤＰプラスミドに連結することにより、Ｃａｓ９－ＰＫＲ－Ｔ２Ａ－ｅＧＦＰ－ＤＰプラスミドを得た後、ターゲットｐｋｒ遺伝子配列のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｋｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）：ＧＣＡＡＣＣＵＡＣＣＵＣＣＵＡＵＣＡＵＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）とプロテインキナーゼＲ ［Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｒ、ｐｋｒ、真核生物の翻訳開始因子２（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２－ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ ２；ｅＩＦ２ＡＫ２）とも称する］遺伝子との結合を利用し、Ｃａｓ ９遺伝子編集、ＤＮＡ二本鎖切断技術により、ｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞を調製した。
具体的には、リン酸カルシウム法を利用して、前記ｇＲＮＡを含有するＣａｓ９－ＰＫＲ－Ｔ２Ａ－ｅＧＦＰ－ＤＰプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、９６ウェルプレートにおいて、トランスフェクション後の２９３Ｔ細胞を０．５細胞／ウェルとなるまで希釈した後、ウェスタンブロット法で確認した。該ウェスタンブロット法では、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（ＲＩＰＡ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）で２９３Ｔ細胞を溶解し、細胞溶解液を回収した後、細胞溶解液の全タンパク質を分析し、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ＰＫＲポリクローナル抗体（ＧＴＸ１３２８２６、ＧｅｎｅＴｅｘ）を利用してＰＫＲタンパク質の発現を検出した。また、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを内部対照群とし、９６ウェルプレートにおける２９３Ｔ細胞株：＃１、＃４、＃１２、＃１７、＃２０、＃２３、＃２６の遺伝子編集の結果を選択して図４に示したところ、＃１２の２９３Ｔ細胞株のｐｋｒ遺伝子が成功にノックアウトされたことが分かったので、これを実験例２のレンチウイルスの調製に使用する。

【0046】

実験例２：ｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞によるレンチウイルスの調製

【0047】

実験例２の方法は実験例１と類似し、両者の差異は、「本実験例では、操作マニュアルに従い、トランスフェクション試薬ＰｏｌｙＪｅｔ（ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、三代目のレンチウイルスパッケージングシステム（比較例２）、及び実施例１に係る本発明のレンチウイルスパッケージングシステムのプラスミド組成物を、小規模（１０ｃｍペトリ皿）で、調製例３に係るウェスタンブロット法で実証された、ｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞（＃１２の２９３Ｔ細胞株）に同時トランスフェクションした」ことにある。
また、調製例２におけるウイルスの力価の測定工程の通り、三代目のレンチウイルスパッケージングシステム（比較例２）、及び実施例１に係る本発明のレンチウイルスパッケージングシステムのプラスミド組成物を利用し、ｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞を介して調製したレンチウイルスの力価を測定した結果、図５に示されるように、小規模で実施例１に係る本発明のレンチウイルスパッケージングシステムのプラスミド組成物を利用し、ｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞を介して調製したレンチウイルスの力価は、おおよそ三代目のレンチウイルスパッケージングシステム（比較例２）を利用し、ｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞を介して製造されたレンチウイルスの力価の２２．２倍である。故に、本発明のレンチウイルスパッケージングシステムを利用し、ｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔ細胞を介してレンチウイルスを調製することにより、確かに製造されたレンチウイルスの力価を顕著に向上させることができる。

【0048】

実験例３：感染能力の測定－初代Ｔ細胞の形質導入

【0049】

健康なドナーからの末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣ）に対しＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ）で処理し、また、ＣＤ３／ＣＤ２８増幅ビーズ（Ｅｘｐａｎｄｅｒ Ｂｅａｄｓ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で初代Ｔ細胞を精製して活化させた。翌日、実験例１における二代目、三代目及び実施例１に係る本発明のレンチウイルスパッケージングシステムを利用し、小規模で調製したレンチウイルスを、前記精製された初代Ｔ細胞に形質導入した（形質導入の第一日）。要するに、１ｍｌの、合計数量が１ｘ１０^６である初代Ｔ細胞及び実験例１で製造したレンチウイルス（ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）１、ＭＯＩ ３及びＭＯＩ ５に従う）を一緒に培養した。
また、レンチウイルスの形質導入の二日後に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去し、最後に、レンチウイルスの形質導入後の第六日に、フローサイトメーターを利用し、標的遺伝子－ＣＤ１９－ＢＢｚのＴ細胞における発現量を検出した。具体的には、１ｘ１０^５の初代Ｔ細胞を、１００μＬの染色液（染色液は、１％のＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）を含有するＰＢＳ溶液である）に懸濁させた後、第一抗体（Ｂｉｏｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２）を加入し、室温で２０分静置し、１ｍＬの染色液で初代Ｔ細胞を二回洗浄した後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰＥを含有する染色液（総体積１００μＬ）に、初代Ｔ細胞顆粒を再度懸濁させ、室温で２０分静置し、再度１ｍＬの染色液で初代Ｔ細胞を二回洗浄した後、最後に、初代Ｔ細胞を適量の染色液に懸濁させ、フローサイトメーター分析を行った。

【0050】

実験の結果について、図６Ａ－６Ｃに示す。図６Ａにおいて、実施例１に係る本発明のレンチウイルスパッケージングシステムにより生産したレンチウイルスを、ＭＯＩ １、ＭＯＩ ３及びＭＯＩ ５で形質導入したＴ細胞は、そのＣＤ１９－ＢＢｚ発現率はいずれも、二代目、三代目のレンチウイルスパッケージングシステムにより生産したレンチウイルスを形質導入したＴ細胞よりも高い。故に、二代目、三代目のレンチウイルスパッケージングシステムと比べると、本発明のレンチウイルスパッケージングシステムにより生産したレンチウイルスは、最適な形質導入率、形質導入効率及び遺伝子デリバリー効果を有する。
また、図６Ｂにおいて、実施例１に係る本発明のレンチウイルスパッケージングシステムにより生産したレンチウイルスをＭＯＩ １、ＭＯＩ ３及びＭＯＩ ５で形質導入したＴ細胞に対し、蛍光標識された抗体でＴ細胞ＣＤ１９－ＢＢｚの発現を検出したところ、各細胞の平均蛍光強度はいずれも、二代目、三代目のレンチウイルスパッケージングシステムにより生産したレンチウイルスを形質導入したＴ細胞よりも高い。
且つ、図６Ｃに示されるように、実施例１に係る本発明のレンチウイルスパッケージングシステムにより生産したレンチウイルスを形質導入したＴ細胞は、その形質導入率及び平均蛍光強度がいずれも、二代目のレンチウイルスパッケージングシステムよりも優れ、おおよそ二代目のレンチウイルスパッケージングシステムの１．２倍であり、該１．２倍は、本発明のレンチウイルスパッケージングシステムに係るＭＯＩ １、ＭＯＩ ３及びＭＯＩ ５と、二代目のレンチウイルスパッケージングシステムに係るＭＯＩ １、ＭＯＩ ３及びＭＯＩ ５とを対比して得られる増加倍数の平均値である。従って、本発明のレンチウイルスパッケージングシステムは、製造されたレンチウイルスの活性を向上させることができる。

【0051】

故に、本発明のレンチウイルスパッケージングシステムは、レンチウイルスの収率及び活性を顕著に向上させることができ、細胞の遺伝子組換え時に遺伝子のデリバリー効率を有効的に向上させることができる。また、細胞の遺伝子組換えのコストを低減することができ、且つ、ｐｋｒ遺伝子がノックアウトされた２９３Ｔにより生産されたレンチウイルスは、生産されたレンチウイルスの機能をより一層向上させることができる。

【0052】

前述したものは、単に本発明の好ましい実施例であり、本発明に対する形式上の制限は一切有しない。また、前文には、本発明の好ましい実施例が開示されているが、該実施例は、本発明を限定するためのものではなく、当業者であれば、本発明の技術方案の範囲を逸脱しない限り、上述した技術内容をやや変更、修飾することにより、同効の実施例とすることができる。つまり、本発明の技術方案を逸脱しない内容や、本発明の技術に基づいて前記実施例に対して実質的に行った簡単な変更、修飾はいずれも、本発明の技術方案の範囲内のものである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【配列表】

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