特開2024-28857ヒアルロン酸誘導体、及び、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024028857
(43)【公開日】2024-03-05
(54)【発明の名称】ヒアルロン酸誘導体、及び、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
(51)【国際特許分類】
C08B 37/08 20060101AFI20240227BHJP
A61K 31/728 20060101ALI20240227BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240227BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240227BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240227BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240227BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240227BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240227BHJP
【ＦＩ】
C08B37/08 Z
A61K31/728
A61P29/00
A61P19/02
A61P9/10 101
A61P9/10
A61P1/16
A61P9/00
A61P17/02
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023205738
(22)【出願日】2023-12-06
(62)【分割の表示】P 2019154678の分割
【原出願日】2019-08-27
(71)【出願人】
【識別番号】301023238
【氏名又は名称】国立研究開発法人物質・材料研究機構
(72)【発明者】
【氏名】西口 昭広
(57)【要約】 （修正有）
【課題】十分な抗炎症作用を奏する炎症性サイトカイン産生抑制剤の提供。
【解決手段】下記式１で表される繰り返し単位を有するヒアルロン酸誘導体又はその薬学的に許容される塩。
Ｒ１は式１－１の基又は分子量１００～１２００のポリエチレンイミンの任意の末端アミノ基を１つ除いた基。
【選択図】図１
【解決手段】下記式１で表される繰り返し単位を有するヒアルロン酸誘導体又はその薬学的に許容される塩。
Ｒ１は式１－１の基又は分子量１００～１２００のポリエチレンイミンの任意の末端アミノ基を１つ除いた基。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式１で表される繰り返し単位を有し、数平均分子量が６０万～１２０万であり、式１のＲ１に含まれるアミノ基の含有量が、０．１０～１．１０ｍｍｏｌ／ｇである、ヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩。
（式１中、Ｒ１は、式１－１で表される基か、又は、分子量１００～１２００のポリエチレンイミンの任意の末端アミノ基を１つ除いた基であり、＊は結合位置を表す。）
【化1】
（式１中、Ｒ１は、式１－１で表される基か、又は、分子量１００～１２００のポリエチレンイミンの任意の末端アミノ基を１つ除いた基であり、＊は結合位置を表す。）
【請求項2】
前記ポリエチレンイミンの分子量が２００～１０００である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩。
【請求項3】
Ｒ１に含まれるアミノ基の含有量が、０．４０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩。
【請求項4】
Ｒ１に含まれるアミノ基の含有量が、０．５０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、請求項１又は２記載のヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩。
【請求項5】
Ｒ１が、式１－１で表される基である、請求項１～４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩。
【請求項6】
Ｒ１が、前記ポリエチレンイミンの任意の末端アミノ基を１つ除いた基である、請求項１～４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法であって、
アルコールを含有する水溶液中で、カルボキシ基の活性化剤の存在下で、ヒアルロン酸又はその塩と、エチレンジアミン及びポリエチレンイミンからなる群から選択される少なくとも１種のアミンとをアミド化反応によって結合させることを含む、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
アルコールを含有する水溶液中で、カルボキシ基の活性化剤の存在下で、ヒアルロン酸又はその塩と、エチレンジアミン及びポリエチレンイミンからなる群から選択される少なくとも１種のアミンとをアミド化反応によって結合させることを含む、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒアルロン酸誘導体、及び、ヒアルロン酸誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
超高齢社会に突入した我が国において、急性、及び、慢性炎症疾患に対する治療法の開発がより一層望まれる。炎症反応は、感染等の外的因子に対する生体防御システムである一方で、関節炎、動脈硬化、褥瘡、及び、がん等の疾患との関連性が知られている。
【0003】
炎症を抑制する薬剤として、ステロイド、及び、非ステロイド系の薬剤、並びに、抗体医薬等が使用されるが、副腎不全、感染症、骨粗しょう症、及び、自己免疫疾患等の副作用が問題であり、また、薬剤の安定性、並びに、開発コスト、及び、製造コストに課題があった。
【0004】
そのため、より安全性が高く、かつ、抗炎症性を有する薬剤の研究が進められている。例えば、ステロイドを内包したハイドロゲル（非特許文献１）、抗炎症性を示す多糖類（非特許文献２）、及び、抗炎症効果を示す高分子量ヒアルロン酸（非特許文献３）等が提案されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｕｒｉ Ｓｏｉｂｅｒｍａｎ， Ｓｉｖａ Ｐ． Ｋａｍｂｈａｍｐａｔｉ， Ｔｏｎｙ Ｗｕ， Ｍａｎｏｊ Ｋ． Ｍｉｓｈｒａ， Ｙｕｍｉｎ Ｏｈ， Ｒｉｓｈｉ Ｓｈａｒｍａ， Ｊｉａｎｇｘｉａ Ｗａｎｇ， Ａｂｄｕｌ Ｅｌａｈ Ａｌ Ｔｏｗｅｒｋｉ， Ｓａｍｕｅｌ Ｙｉｕ， Ｗａｌｔｅｒ Ｊ． Ｓｔａｒｋ， Ｒａｎｇａｒａｍａｎｕｊａｍ Ｍ． Ｋａｎｎａｎ， Ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ－ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｇｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｒｎｅａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， １２５， ３８－５３ （２０１７）．
【非特許文献2】Ｈｏｎｇ Ｃｈｅｎ， Ｊｉａｎ Ｓｕｎ， Ｊｕｎ Ｌｉｕ， Ｙａｒｕｎ Ｇｏｕ， Ｘｉｎ Ｚｈａｎｇ， Ｘｉａｏｎａｎ Ｗｕ， Ｒｕｉ Ｓｕｎ， Ｓｉｘｕｅ Ｔａｎｇ， Ｊｕａｎ Ｋａｎ， Ｃｈｕｎｌｕ Ｑｉａｎ， Ｎｉａｎｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ｃｈａｎｇｈａｉ Ｊｉｎ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｌｋａｌｉ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｐｕｒｐｌｅ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， １３１， ４８４－４９４ （２０１９）
【非特許文献3】Ｊａｍｉｅ Ｅ． Ｒａｙａｈｉｎ， Ｊａｓｏｎ Ｓ． Ｂｕｈｒｍａｎ， Ｙｕ Ｚｈａｎｇ， Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｊ． Ｋｏｈ， Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ． Ｇｅｍｅｉｎｈａｒｔ， Ｈｉｇｈ ａｎｄ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． ＡＣＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １， ４８１～４９３ （２０１５）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
非特許文献１に記載されたステロイドを内包したハイドロゲルは、ステロイドの徐放速度を制御することが難しく、ステロイドに由来する副作用が問題である。
非特許文献２に記載されたような天然物より単離した多糖類は抗炎症性を示すものもあるが、その効果は弱く、また、大量生産することは困難である。
非特許文献３に記載された高分子量体のヒアルロン酸は低分子量体と比較して抗炎症性を示すが、その効果は微弱で、不十分である。
非特許文献２に記載されたような天然物より単離した多糖類は抗炎症性を示すものもあるが、その効果は弱く、また、大量生産することは困難である。
非特許文献３に記載された高分子量体のヒアルロン酸は低分子量体と比較して抗炎症性を示すが、その効果は微弱で、不十分である。
【0007】
そこで、本発明は、ステロイド化合物を含有しなくとも十分な抗炎症作用を奏する、言い換えれば、優れた安全性、及び、優れた抗炎症性を有する炎症性サイトカイン産生抑制材を提供することを課題とする。また、本発明は、ヒアルロン酸誘導体、及び、ヒアルロン酸誘導体の製造方法を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。
【0009】
[１] ヒアルロン酸誘導体と、後述する式Ａ１で表される化合物と、を含有するか、又は、式Ａ２で表される基を有する特定ヒアルロン酸誘導体を含有する、炎症性サイトカイン産生抑制材。
[２] 上記特定ヒアルロン酸誘導体が、後述する式１で表される繰り返し単位を有するヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩、エステル、若しくは、グルコシドである[１]に記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[３] 上記Ｒ２がアミノ基である、[２]に記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[４] 上記アミノ基の含有量が、０．１０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[３]に記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[５] 上記アミノ基の含有量が、０．４０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[３]に記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[６] 上記アミノ基の含有量が、０．５０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[３]に記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[７] 上記アミノ基の含有量が、１．１０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、[２]～[６]のいずれかに記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[８] マクロファージに作用して炎症性サイトカインの産生を抑制する、[１]～[７]のいずれかに記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[９] 水を含有するハイドロゲルである、[１]～[８]のいずれかに記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[１０] 後述する式１で表される繰り返し単位を有するヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩、エステル、若しくは、グルコシド。
[１１] 上記Ｒ２がアミノ基である、[１０]に記載のヒアルロン酸誘導体。
[１２] 上記アミノ基の含有量が、０．１０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[１１]に記載のヒアルロン酸誘導体。
[１３] 上記アミノ基の含有量が、０．４０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[１１]に記載のヒアルロン酸誘導体。
[１４] 上記アミノ基の含有量が、０．５０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[１１]に記載のヒアルロン酸誘導体。
[１５] 上記アミノ基の含有量が、１．１０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、[１１]～[１４]のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
[１６] アルコールを含有する水溶液中で、カルボキシ基の活性化剤の存在下で、ヒアルロン酸又はその塩と後述する式Ａ１で表される化合物とをアミド化反応によって結合させることを含む、[１１]～[１５]のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を製造するための、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
[２] 上記特定ヒアルロン酸誘導体が、後述する式１で表される繰り返し単位を有するヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩、エステル、若しくは、グルコシドである[１]に記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[３] 上記Ｒ２がアミノ基である、[２]に記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[４] 上記アミノ基の含有量が、０．１０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[３]に記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[５] 上記アミノ基の含有量が、０．４０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[３]に記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[６] 上記アミノ基の含有量が、０．５０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[３]に記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[７] 上記アミノ基の含有量が、１．１０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、[２]～[６]のいずれかに記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[８] マクロファージに作用して炎症性サイトカインの産生を抑制する、[１]～[７]のいずれかに記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[９] 水を含有するハイドロゲルである、[１]～[８]のいずれかに記載の炎症性サイトカイン産生抑制材。
[１０] 後述する式１で表される繰り返し単位を有するヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩、エステル、若しくは、グルコシド。
[１１] 上記Ｒ２がアミノ基である、[１０]に記載のヒアルロン酸誘導体。
[１２] 上記アミノ基の含有量が、０．１０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[１１]に記載のヒアルロン酸誘導体。
[１３] 上記アミノ基の含有量が、０．４０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[１１]に記載のヒアルロン酸誘導体。
[１４] 上記アミノ基の含有量が、０．５０ｍｍｏｌ／ｇ以上である、[１１]に記載のヒアルロン酸誘導体。
[１５] 上記アミノ基の含有量が、１．１０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、[１１]～[１４]のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
[１６] アルコールを含有する水溶液中で、カルボキシ基の活性化剤の存在下で、ヒアルロン酸又はその塩と後述する式Ａ１で表される化合物とをアミド化反応によって結合させることを含む、[１１]～[１５]のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を製造するための、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、優れた安全性、及び、優れた抗炎症性を有する炎症性サイトカイン産生抑制材が提供できる。また、本発明は、ヒアルロン酸誘導体、及び、ヒアルロン酸誘導体の製造方法も提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】エチレンジアミンを導入したヒアルロン酸誘導体の構造を１Ｈ核磁気共鳴分光法(１Ｈ ＮＭＲ)で測定した結果である。
【図2】エチレンジアミンを導入したヒアルロン酸誘導体の構造をフーリエ変換赤外分光法（ＦＴ－ＩＲ）で測定した結果である。
【図3】粘弾性測定装置を用いて、ヒアルロン酸誘導体水溶液の粘度を測定した結果である。
【図4】粘弾特性の測定結果である。
【図5】粘弾特性の測定結果である。
【図6】粘弾性測定装置を用いて、１０質量％のＨＡ３水溶液のひずみ変化に対するせん断弾性率の変化を測定した結果である。
【図7】ヒアルロン酸誘導体が細胞生存率及び細胞増殖に与える影響について、細胞数カウンティングキットを用いて測定した細胞生存率の結果である。
【図8】ヒアルロン酸誘導体が細胞生存率及び細胞増殖に与える影響について、細胞数カウンティングキットを用いて測定した播種細胞数に対する増殖度の結果である。
【図9】エチレンジアミンに代えてポリエチレンイミンを用いた場合の細胞生存率の測定結果である。
【図10】ヒアルロン酸誘導体の細胞の形態へ効果を調べるための位相差顕微鏡像である。
【図12】炎症性サイトカインの産生評価の結果である。
【図13】炎症性サイトカインの産生評価の結果である。
【図14】炎症性サイトカインの産生評価の結果である。
【図15】ヒアルロン酸誘導体作製条件が抗炎症性に与える影響の測定結果である。
【図16】ヒアルロン酸誘導体作製条件が抗炎症性に与える影響の測定結果である。
【図17】特定アミンとしてポリエチレンイミンを用いた場合の反応溶液中のポリエチレンイミンの含有量と炎症性サイトカイン産生抑制効果との関係を表す図である。
【図18】反応溶液中のＥＤＣの含有量と炎症性サイトカイン産生抑制効果との関係を表す図である。
【図19】ＥＤＡの代わりに、エタノールアミンを修飾して抗炎症効果を評価した結果である。
【図20】ポリエチレンイミン、及び、ポリエチレンイミン修飾ヒアルロン酸添加時の炎症性サイトカインの産生評価の結果である。
【図21】ポリエチレンイミン、及び、ポリエチレンイミン修飾ヒアルロン酸が細胞生存率に与える影響を調べた結果である。
【図22】ポリエチレンイミン修飾ヒアルロン酸、及び、ポリエチレンイミンとヒアルロン酸の混合物が細胞生存率に与える影響を調べた結果である。
【図23】ファゴサイトーシスの評価のための蛍光顕微鏡像（上段）及びその評価結果である。
【図24】ヒアルロン酸誘導体が細胞生存率及び細胞増殖に与える影響を表す図である。
【図25】架橋により作製したハイドロゲルの粘弾性測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【0013】
本明細書における基（原子群）の表記において、置換及び無置換を記していない表記は、本発明の効果を損ねない範囲で、置換基を有さないものと共に置換基を有するものをも包含するものである。例えば、「アルキル基」とは、置換基を有さないアルキル基（無置換アルキル基）のみならず、置換基を有するアルキル基（置換アルキル基）をも包含するものである。このことは、各化合物についても同義である。
また、本明細書において、「（メタ）アクリレート」はアクリレート及びメタクリレートの双方、又は、いずれかを表し、「（メタ）アクリル」はアクリル及びメタクリルの双方、又は、いずれかを表す。また、「（メタ）アクリロイル」はアクリロイル及びメタクリロイルの双方、又は、いずれかを表す。
また、本明細書において、「（メタ）アクリレート」はアクリレート及びメタクリレートの双方、又は、いずれかを表し、「（メタ）アクリル」はアクリル及びメタクリルの双方、又は、いずれかを表す。また、「（メタ）アクリロイル」はアクリロイル及びメタクリロイルの双方、又は、いずれかを表す。
【0014】
［炎症性サイトカイン産生抑制材］
本発明の実施形態に係る炎症性サイトカイン産生抑制材（以下、単に「本抑制材」ともいう。）は、有効成分として、ヒアルロン酸誘導体と、後述する式Ａ１で表される化合物（以下、「特定アミン」ともいう。）と、を含有する（特定混合物である）か、又は、後述する式Ａ２で表される基を有する特定ヒアルロン酸誘導体を含有する。本抑制材は、後述する実施例に記載したとおり、マクロファージに作用して炎症性サイトカインの産生を抑制する作用を有する。
また、本抑制材は、ヒアルロン酸誘導体、及び／又は、特定ヒアルロン酸誘導体を含有するため、ヒドロゲルを形成でき、投与が必要な部位にシリンジ等の器具を用いて注入することができる（インジェクタブルである）。
本発明の実施形態に係る炎症性サイトカイン産生抑制材（以下、単に「本抑制材」ともいう。）は、有効成分として、ヒアルロン酸誘導体と、後述する式Ａ１で表される化合物（以下、「特定アミン」ともいう。）と、を含有する（特定混合物である）か、又は、後述する式Ａ２で表される基を有する特定ヒアルロン酸誘導体を含有する。本抑制材は、後述する実施例に記載したとおり、マクロファージに作用して炎症性サイトカインの産生を抑制する作用を有する。
また、本抑制材は、ヒアルロン酸誘導体、及び／又は、特定ヒアルロン酸誘導体を含有するため、ヒドロゲルを形成でき、投与が必要な部位にシリンジ等の器具を用いて注入することができる（インジェクタブルである）。
【0015】
また、炎症性サイトカインの産生を抑制する作用に加えて、後述する実施例でも示すように、驚くべきことに、細胞に対する毒性もより低いという効果もあわせて有する。以下では、本抑制材が含有する各成分について詳述する。
【0016】
＜特定混合物＞
本抑制材の第１の実施形態は、ヒアルロン酸誘導体と、特定アミンとを含有する特定混合物である。以下では、特定混合物が含有するヒアルロン酸誘導体、及び、特定アミンについて詳述する。
本抑制材の第１の実施形態は、ヒアルロン酸誘導体と、特定アミンとを含有する特定混合物である。以下では、特定混合物が含有するヒアルロン酸誘導体、及び、特定アミンについて詳述する。
【0017】
（特定アミン）
上記特定混合物は、下記式Ａ１で表される特定アミンを含有する。特定混合物中における特定アミンの含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する炎症性サイトカイン産生抑制材が得られる点で、一般に、特定混合物の全質量に対して、１～５０質量％が好ましい。なお、特定混合物は、特定アミンの１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。特定混合物が、２種以上の特定アミンを含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
上記特定混合物は、下記式Ａ１で表される特定アミンを含有する。特定混合物中における特定アミンの含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する炎症性サイトカイン産生抑制材が得られる点で、一般に、特定混合物の全質量に対して、１～５０質量％が好ましい。なお、特定混合物は、特定アミンの１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。特定混合物が、２種以上の特定アミンを含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【化1】
【0018】
式Ａ１中、Ｌ１、Ｌ２、及び、Ｌ３はそれぞれ独立に、単結合、又は、２価の基を表し、Ｒ２はヒドロキシ基、メチル基、アミノ基、カルボキシ基、スルホン酸基、及び、メルカプト基からなる群より選択される少なくとも１種の特定置換基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、又は、上記特定置換基とは異なる１価の置換基を表し、Ｍ１は単結合、又は、ｐ＋ｑ＋１価の基を表し、Ｍ１が単結合の時ｐは１、ｑは０であり、Ｍ１がｐ＋ｑ＋１価の基の時、ｐは１以上の整数、ｑは０以上の整数を表し、複数あるＬ２、Ｒ２、Ｌ３、及び、Ｘは、それぞれ同一でも異なってもよい。
【0019】
Ｌ１、Ｌ２、及び、Ｌ３の２価の基としては特に制限されないが、－Ｏ－、－ＮＲ－（Ｒは水素原子、又は、後述する置換基Ｗを表す）、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－、ヘテロ原子を有していてもよい直鎖状、分岐鎖状、又は、環状の炭化水素基、及び、これらの組み合わせ等が挙げられる。
【0020】
炭化水素基としては、メチレン基、エチレン基、１，２－プロピレン基、１，３－プロピレン基、１，２－ブチレン基、１，３－ブチレン基、１，４－ブチレン基、１，５－ペンチレン基、１，６－ヘキシレン基、１，９－ノニレン基、及び、１，１２－ドデシレン基等の炭素原子数が１～２０個の２価の飽和炭化水素基；エテニレン基、プロペニレン基、３－ブテニレン基、２－ブテニレン基、２－ペンテニレン基、２－ヘキセニレン基、２－ノネニレン基、２－ドデセニレン基等のアルケニレン基、及び、エチニレン基等の炭素原子数が２～２０個の２価の不飽和炭化水素基；シクロプロピレン基、シクロブチレン基、シクロペンチレン基、シクロへキシレン基、シクロノニレン基、シクロドデシレン基、ノルボニレン基、及び、アダマンチレン基等の炭素原子数が３～２０個の２価の環状飽和炭化水素基；１，３－フェニレン基、１，４－フェニレン基、１，４－ナフチレン基、１，５－ナフチレン基、２，６－ナフチレン基、及び、ビフェニル－４，４’－ジイル基等の炭素原子数が６～２０個のアリーレン基等が挙げられ、２価の飽和炭化水素基が好ましく、置換基を有していてもよいアルキレン基がより好ましい。
なかでも、より優れた炎症性サイトカイン産生抑制効果を有する炎症性サイトカイン産生抑制材が得られる点で、２価の飽和炭化水素基の炭素数としては１０個以下が好ましく、８個以下がより好ましく、５個以下が更に好ましく、４個以下が特に好ましく、３個以下が最も好ましい。下限としては特に制限されないが、１個以上が好ましく、２個以上がより好ましい。
なかでも、より優れた炎症性サイトカイン産生抑制効果を有する炎症性サイトカイン産生抑制材が得られる点で、２価の飽和炭化水素基の炭素数としては１０個以下が好ましく、８個以下がより好ましく、５個以下が更に好ましく、４個以下が特に好ましく、３個以下が最も好ましい。下限としては特に制限されないが、１個以上が好ましく、２個以上がより好ましい。
【0021】
なお、上記各炭化水素基が有する水素原子の一部は、後述する置換基Ｗによって置換されていてもよい。
【0022】
ヘテロ原子としては、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、及び、リン原子等が挙げられる。
【0023】
Ｍ１の２価の基としては特に制限されないが、すでに説明したＬ１と同様の基が挙げられ、好適形態も同様である。
【0024】
Ｍ１の３価以上の基としては特に制限されないが例えば、以下の式（３ＢＲＣ）～（６ＢＲＣ）で表される基が挙げられる。なお、下記式中「＊」は結合位置を表す。
【0025】
【化2】
【0026】
式３ＢＲＣ中、Ｌ３は３価の基を表す。Ｔ３は単結合又は２価の基を表し、３個のＴ３は互いに同一でもよく異なってもよい。
Ｌ３としては、３価の炭化水素基（炭素数１～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、３価の複素環基（５員環～７員環の複素環基が好ましく、例えば、トリアジン環、及び、イソシアヌレート環等）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ３の具体例としては、グリセリン残基、トリメチロールプロパン残基、フロログルシノール残基、及びシクロヘキサントリオール残基等が挙げられる。
また、Ｌ３としては以下の式で表される基も挙げられる。
Ｌ３としては、３価の炭化水素基（炭素数１～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、３価の複素環基（５員環～７員環の複素環基が好ましく、例えば、トリアジン環、及び、イソシアヌレート環等）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ３の具体例としては、グリセリン残基、トリメチロールプロパン残基、フロログルシノール残基、及びシクロヘキサントリオール残基等が挙げられる。
また、Ｌ３としては以下の式で表される基も挙げられる。
【0027】
【化3】
【0028】
上記式中、Ｌｍ１～Ｌｍ３はそれぞれ独立に単結合、又は２価の基である。２価の基としては特に制限されないが、ヘテロ原子を有していてもよい飽和又は不飽和の、直鎖状、分岐鎖状、又は、環状の炭化水素基が挙げられる。また、＊は結合位置を表す。
【0029】
式４ＢＲＣ中、Ｌ４は４価の基を表す。Ｔ４は単結合又は２価の基を表し、４個のＴ４は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｌ４の好適形態としては、４価の炭化水素基（炭素数１～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、４価の複素環基（５～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ４の具体例としては、ペンタエリスリトール残基、及びジトリメチロールプロパン残基等が挙げられる。
なお、Ｌ４の好適形態としては、４価の炭化水素基（炭素数１～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、４価の複素環基（５～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ４の具体例としては、ペンタエリスリトール残基、及びジトリメチロールプロパン残基等が挙げられる。
【0030】
式５ＢＲＣ中、Ｌ５は５価の基を表す。Ｔ５は単結合又は２価の基を表し、５個のＴ５は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｌ５の好適形態としては、５価の炭化水素基（炭素数２～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、５価の複素環基（５～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ５の具体例としては、アラビニトール残基、フロログルシドール残基、及び、シクロヘキサンペンタオール残基等が挙げられる。
なお、Ｌ５の好適形態としては、５価の炭化水素基（炭素数２～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、５価の複素環基（５～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ５の具体例としては、アラビニトール残基、フロログルシドール残基、及び、シクロヘキサンペンタオール残基等が挙げられる。
【0031】
式６ＢＲＣ中、Ｌ６は６価の基を表す。Ｔ６は単結合又は２価の基を表し、６個のＴ６は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｌ６の好適形態としては、６価の炭化水素基（炭素数２～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、６価の複素環基（６～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ６の具体例としては、マンニトール残基、ソルビトール残基、ジペンタエリスリトール残基、ヘキサヒドロキシベンゼン、及び、ヘキサヒドロキシシクロヘキサン残基等が挙げられる。
なお、Ｌ６の好適形態としては、６価の炭化水素基（炭素数２～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、６価の複素環基（６～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ６の具体例としては、マンニトール残基、ソルビトール残基、ジペンタエリスリトール残基、ヘキサヒドロキシベンゼン、及び、ヘキサヒドロキシシクロヘキサン残基等が挙げられる。
【0032】
式３ＢＲＣ～式６ＢＲＣ中、Ｔ３～Ｔ６で表される２価の基の具体例及び好適形態は、すでに説明したＭ１の２価の基と同様であってよい。
また、Ｍ１が７価以上の基である場合には、式３ＢＲＣ～式６ＢＲＣで表した基を組み合わせた基を用いることができる。
また、Ｍ１が７価以上の基である場合には、式３ＢＲＣ～式６ＢＲＣで表した基を組み合わせた基を用いることができる。
【0033】
Ｒ２の特定置換基は、ヒドロキシ基、メチル基、アミノ基、カルボキシ基、スルホン酸基、及び、メルカプト基からなる群より選択される少なくとも１種であり、ヒドロキシ基、アミノ基、又は、メチル基が好ましく、アミノ基がより好ましい。
【0034】
Ｘの、特定置換基とは異なる１価の置換基としては特に制限されず、後述する置換基Ｗとして例示したものが挙げられる。
【0035】
より優れた本発明の効果を有する炎症性サイトカイン産生抑制材が得られる点で、Ａ１としては、以下のＡ１′で表される化合物がより好ましい。
【0036】
【化4】
【0037】
式Ａ１′中、Ｌ１２、及び、Ｌ２２はそれぞれ独立に単結合又は２価の基であり、２価の基としては、式２中のＬ１として説明した基が挙げられ、好適形態も同様である。
式Ａ１′中、ｐ′は１以上の整数であり、Ｍ１２は、単結合、又は、ｐ′＋１価の基である。Ｒ２２は特定置換基を表し、好適形態はすでに説明したＲ２と同様である。Ｍ１２としては、すでに説明したＭ１と同様の基が挙げられ、好適形態も同様である。
特定アミンとしては特に制限されないが、例えば、以下の式で表される化合物が使用できる。
式Ａ１′中、ｐ′は１以上の整数であり、Ｍ１２は、単結合、又は、ｐ′＋１価の基である。Ｒ２２は特定置換基を表し、好適形態はすでに説明したＲ２と同様である。Ｍ１２としては、すでに説明したＭ１と同様の基が挙げられ、好適形態も同様である。
特定アミンとしては特に制限されないが、例えば、以下の式で表される化合物が使用できる。
【0038】
【化5】
【0039】
【化6】
【0040】
また、特定アミンとしては、以下の化合物も使用できる。
【化7】
【化8】
【化9】
【0041】
また、特定アミンとしては、ポリエチレンイミンが好ましい。ポリエチレンイミンの分子量としては特に制限されないが、一般に、１００～１２００が好ましく、２００～１０００がより好ましい。
【0042】
（ヒアルロン酸誘導体）
上記特定混合物は、ヒアルロン酸誘導体を含有する。特定混合物中におけるヒアルロン酸誘導体の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する炎症性サイトカイン産生抑制材が得られる点で、一般に特定混合物の全質量に対して、０．０１～１０質量％が好ましい。なお、特定混合物は、ヒアルロン酸誘導体の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。組成物が、２種以上のヒアルロン酸誘導体を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
上記特定混合物は、ヒアルロン酸誘導体を含有する。特定混合物中におけるヒアルロン酸誘導体の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する炎症性サイトカイン産生抑制材が得られる点で、一般に特定混合物の全質量に対して、０．０１～１０質量％が好ましい。なお、特定混合物は、ヒアルロン酸誘導体の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。組成物が、２種以上のヒアルロン酸誘導体を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【0043】
本明細書において、ヒアルロン酸誘導体には、ヒアルロン酸、及び、その誘導体が含まれる。ヒアルロン酸等としては、ヒアルロン酸（ＨＡ）、又は、その塩を使用できる。ヒアルロン酸塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、及び、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）等が挙げられ、例えば、医薬品として繁用されているナトリウム塩をテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩などのテトラアルキルアンモニウム塩に変換して使用することができる。ＨＡ、又は、薬学的に許容される塩は、鶏冠及び豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法、生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができる。また、市販のものを購入して（例えば、電気化学工業株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社等から）使用することもできる。
ヒアルロン酸誘導体としては特に制限されないが、後述する特定ヒアルロン酸誘導体が好ましい。
ヒアルロン酸誘導体としては特に制限されないが、後述する特定ヒアルロン酸誘導体が好ましい。
【0044】
ＨＡの分子量としては特に制限されないが、数平均分子量として１０万～３００万が好ましく、６０万～１２０万がより好ましい。
【0045】
＜特定ヒアルロン酸誘導体＞
本発明の第２の実施形態に係る炎症性サイトカイン産生抑制材は、下記式Ａ２で表される基を有するヒアルロン酸誘導体を（有効成分として）含有する。
本発明の第２の実施形態に係る炎症性サイトカイン産生抑制材は、下記式Ａ２で表される基を有するヒアルロン酸誘導体を（有効成分として）含有する。
【0046】
【化10】
【0047】
式Ａ２中、Ｌ１、Ｌ２、及び、Ｌ３はそれぞれ独立に、単結合、又は、２価の基を表し、Ｒ２はヒドロキシ基、メチル基、アミノ基、カルボキシ基、スルホン酸基、及び、メルカプト基からなる群より選択される少なくとも１種の特定置換基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、又は、上記特定置換基とは異なる１価の置換基を表し、Ｍ１は単結合、又は、ｐ＋ｑ＋１価の基を表し、Ｍ１が単結合の時ｐは１、ｑは０であり、Ｍ１がｐ＋ｑ＋１価の基の時、ｐは１以上の整数、ｑは０以上の整数を表し、複数あるＬ２、Ｒ２、Ｌ３、及び、Ｘは、それぞれ同一でも異なってもよい。
なお、式Ａ２中のＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｒ２、Ｍ１、ｐ、及び、ｑとしては、式Ａ１における各記号と同義であり、好適形態も同様である。
なお、式Ａ２中のＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｒ２、Ｍ１、ｐ、及び、ｑとしては、式Ａ１における各記号と同義であり、好適形態も同様である。
【0048】
より優れた本発明の効果を有する点で、特定ヒアルロン酸誘導体は、以下のＡ２′で表される基を有することがより好ましい。
【0049】
【化11】
【0050】
式Ａ２′中、Ｌ１２、及び、Ｌ２２はそれぞれ独立に単結合又は２価の基であり、２価の基としては、式２中のＬ１として説明した基が挙げられ、好適形態も同様である。
式Ａ２′中、ｐ′は１以上の整数であり、Ｍ１２は、単結合、又は、ｐ′＋１価の基である。Ｒ２２は特定置換基を表し、好適形態はすでに説明したＲ２と同様である。Ｍ１２としては、すでに説明したＭ１と同様の基が挙げられ、好適形態も同様である。また、式Ａ２′中、＊は結合位置を表す。
式Ａ２′中、ｐ′は１以上の整数であり、Ｍ１２は、単結合、又は、ｐ′＋１価の基である。Ｒ２２は特定置換基を表し、好適形態はすでに説明したＲ２と同様である。Ｍ１２としては、すでに説明したＭ１と同様の基が挙げられ、好適形態も同様である。また、式Ａ２′中、＊は結合位置を表す。
【0051】
上記Ａ２で表される基としては特に制限されないが、以下の式で表される基が挙げられる。なお、式中＊は結合位置を表す。
【0052】
【化12】
【0053】
【化13】
【0054】
また、式Ａ２で表される基としては、ポリエチレンイミンの任意の末端アミノ基を１つ除いた基も好ましい。上記ポリエチレンイミンの分子量としては特に制限されないが、一般に、１００～１２００が好ましく、２００～１０００がより好ましい
【0055】
・特定ヒアルロン酸誘導体の好適形態
なかでも、より優れた本発明の効果を有する炎症性サイトカイン産生抑制材が得られる点で特定ヒアルロン酸誘導体は、下記式１で表される繰り返し単位を有するヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩、エステル、若しくは、グルコシドであることが好ましい。
なかでも、より優れた本発明の効果を有する炎症性サイトカイン産生抑制材が得られる点で特定ヒアルロン酸誘導体は、下記式１で表される繰り返し単位を有するヒアルロン酸誘導体、又は、その薬学的に許容される塩、エステル、若しくは、グルコシドであることが好ましい。
【0056】
【化14】
【0057】
式１中、Ｒ１はすでに説明したＡ２で表される基である。
特定ヒアルロン酸誘導体は、上記式１で表される二糖の繰り返し単位（以下、「単位」ともいう。）におけるＤ－グルクロン酸の６位の炭素に式Ａ２で表される基が導入された構造を有する。
特定ヒアルロン酸誘導体における式１で表される単位の含有量としては特に制限されないが、本ヒアルロン酸誘導体の全繰り返し単位を１００モル％としたとき、０．１～９９モル％が好ましく、１～９０モル％がより好ましい。
特定ヒアルロン酸誘導体は、上記式１で表される二糖の繰り返し単位（以下、「単位」ともいう。）におけるＤ－グルクロン酸の６位の炭素に式Ａ２で表される基が導入された構造を有する。
特定ヒアルロン酸誘導体における式１で表される単位の含有量としては特に制限されないが、本ヒアルロン酸誘導体の全繰り返し単位を１００モル％としたとき、０．１～９９モル％が好ましく、１～９０モル％がより好ましい。
【0058】
特定ヒアルロン酸誘導体の分子量としては特に制限されないが、典型的には、１０万～３００万が好ましく、６０万～１２０万がより好ましい。なお、本明細書においてヒアルロン酸誘導体の分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法によって測定した数平均分子量である。
【0059】
特定ヒアルロン酸誘導体における特定置換基の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する点で、０．１０ｍｍｏｌ／ｇ以上が好ましく、０．４０ｍｍｏｌ／ｇ以上がより好ましく、０．５０ｍｍｏｌ／ｇ以上が更に好ましい。上限としては特に制限されないが、一般に２．００ｍｍｏｌ／ｇ以下が好ましく、１．１０ｍｍｏｌ／ｇ以下がより好ましい。
特定置換基の含有量の測定方法としては、例えば、アミノ基であれば、２,４,６－トリニトロベンゼンスルホン酸を用いた比色試験により求めることができる。
特定置換基の含有量の測定方法としては、例えば、アミノ基であれば、２,４,６－トリニトロベンゼンスルホン酸を用いた比色試験により求めることができる。
【0060】
特定置換基がアミノ基である場合、特定ヒアルロン酸誘導体中におけるカルボキシ基の含有量としては特に制限されないが、一般に、０．１～１．２ｍｍｏｌが好ましく、０．１～０．７ｍｍｏｌ／ｇがより好ましく、０．１～０．５ｍｍｏｌ／ｇが更に好ましい。
なお、特定ヒアルロン酸誘導体中におけるカルボキシ基の量は、水酸化ナトリウム水溶液を用いた電位差測定による中和滴定により求めることができる。
なお、特定ヒアルロン酸誘導体中におけるカルボキシ基の量は、水酸化ナトリウム水溶液を用いた電位差測定による中和滴定により求めることができる。
【0061】
特定ヒアルロン酸誘導体は、式１で表される単位を有していれば、本発明の効果を奏する範囲内において、他の単位、及び、部分構造を有していてもよい。他の単位としては特に制限されないが、ヒアルロン酸（Ｎ－アセチルグルコサミンとＤ－グルクロン酸の二糖単位が連結した構造）、及び、式１で表される単位が分子間、及び／又は、分子内で架橋した構造が挙げられる。
【0062】
・製造方法
特定ヒアルロン酸誘導体の製造方法としては特に制限されないが、より簡便に特定ヒアルロン酸誘導体が製造できる点で、アルコールを含有する水溶液中で、カルボキシ基の活性化剤の存在下で、ヒアルロン酸又はその塩（以下「ヒアルロン酸等」ともいう。）と後述する式Ａ１で表される化合物（以下、「特定アミン」ともいう。）とをアミド化反応によって結合させることを含む、特定ヒアルロン酸誘導体の製造方法が好ましい。
上記製造方法は、言い換えれば、カルボキシ基の活性化剤と、式Ａ１で表される特定アミンと、ヒアルロン酸等と、アルコールと、水とを含有する反応溶液を調製して反応させ、ヒアルロン酸誘導体を得る、ヒアルロン酸誘導体の製造方法である。
以下では、上記反応溶液が含有する各成分について詳述する。
特定ヒアルロン酸誘導体の製造方法としては特に制限されないが、より簡便に特定ヒアルロン酸誘導体が製造できる点で、アルコールを含有する水溶液中で、カルボキシ基の活性化剤の存在下で、ヒアルロン酸又はその塩（以下「ヒアルロン酸等」ともいう。）と後述する式Ａ１で表される化合物（以下、「特定アミン」ともいう。）とをアミド化反応によって結合させることを含む、特定ヒアルロン酸誘導体の製造方法が好ましい。
上記製造方法は、言い換えれば、カルボキシ基の活性化剤と、式Ａ１で表される特定アミンと、ヒアルロン酸等と、アルコールと、水とを含有する反応溶液を調製して反応させ、ヒアルロン酸誘導体を得る、ヒアルロン酸誘導体の製造方法である。
以下では、上記反応溶液が含有する各成分について詳述する。
【0063】
反応溶液は式Ａ１で表される特定アミンを含有する。特定アミンはアミド化反応でヒアルロン酸とクロスカップリングして、ヒアルロン酸分子に特定置換基を有する基を導入する機能を有する。特定アミンとしては、特定混合物が含有する特定アミンとしてすでに説明したとおりであり、好適形態も同様である。
【0064】
反応溶液中における特定アミンの含有量としては特に制限されないが、一般に、反応溶液中におけるヒアルロン酸が有するＤ－グルクロン酸ユニットを１００モル％としたとき、１～１０００モル％が好ましく、１０～２００モル％が好ましい。なお、反応溶液は、特定アミンの１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。反応溶液が、２種以上の特定アミンを含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【0065】
（ヒアルロン酸等）
ヒアルロン酸等としては、ヒアルロン酸（ＨＡ）、又は、その塩を使用できる。ヒアルロン酸塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、及び、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）等が挙げられ、例えば、医薬品として繁用されているナトリウム塩をテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩などのテトラアルキルアンモニウム塩に変換して使用することができる。ＨＡ、又は、薬学的に許容される塩は、鶏冠及び豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法、生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができる。また、市販のものを購入して（例えば、電気化学工業株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社等から）使用することもできる。
ＨＡの分子量としては特に制限されないが、数平均分子量として１０万～３００万が好ましく、６０万～１２０万がより好ましい。
ヒアルロン酸等としては、ヒアルロン酸（ＨＡ）、又は、その塩を使用できる。ヒアルロン酸塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、及び、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）等が挙げられ、例えば、医薬品として繁用されているナトリウム塩をテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩などのテトラアルキルアンモニウム塩に変換して使用することができる。ＨＡ、又は、薬学的に許容される塩は、鶏冠及び豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法、生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができる。また、市販のものを購入して（例えば、電気化学工業株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社等から）使用することもできる。
ＨＡの分子量としては特に制限されないが、数平均分子量として１０万～３００万が好ましく、６０万～１２０万がより好ましい。
【0066】
反応溶液中におけるヒアルロン酸等の含有量としては特に制限されないが、より均一に反応が進行しやすい点で、反応溶液中の溶媒の含有量を１００質量部としたとき、０．０１～５０質量部が好ましい。
なお、反応溶液は、ヒアルロン酸等の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。反応溶液が、２種以上のヒアルロン酸等を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
なお、反応溶液は、ヒアルロン酸等の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。反応溶液が、２種以上のヒアルロン酸等を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【0067】
（カルボキシ基の活性化剤）
カルボキシ基の活性化剤としては特に制限されないが、カルボジイミド化合物を含有ことが好ましい。カルボジイミド化合物としては、例えば、ＥＤＣ（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＥＤＣと類似した構造を有する１－ａｌｋｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｓ、ＥＴＣ（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、及び、ＣＭＣ（１－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－３－（２－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）等が挙げられる。
カルボキシ基の活性化剤としては特に制限されないが、カルボジイミド化合物を含有ことが好ましい。カルボジイミド化合物としては、例えば、ＥＤＣ（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＥＤＣと類似した構造を有する１－ａｌｋｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｓ、ＥＴＣ（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、及び、ＣＭＣ（１－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－３－（２－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）等が挙げられる。
【0068】
反応溶液中におけるカルボキシ基の活性化剤の含有量としては特に制限されないが、より均一に反応が進みやすい点で、反応溶液中のヒアルロン酸等のＤ－グルクロン酸ユニットを１００モル％としたとき、１～１０００モル％が好ましく、１０～２００モル％が好ましい。なお、反応溶液は、カルボキシ基の活性化剤の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい反応溶液中が、２種以上のカルボキシ基の活性化剤を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【0069】
（アルコール）
一般に、ヒアルロン酸を分散させた水溶液中にアルコールを添加すると、ヒアルロン酸が凝集し、典型的には粒子状になることが知られており、アミド化反応の進行が不均一となりやすいと考えられてきた。そのため、アミド化反応をより均一に進行させる観点では、反応溶液中にアルコールを添加することはこれまで、検討されてこなかった。
一般に、ヒアルロン酸を分散させた水溶液中にアルコールを添加すると、ヒアルロン酸が凝集し、典型的には粒子状になることが知られており、アミド化反応の進行が不均一となりやすいと考えられてきた。そのため、アミド化反応をより均一に進行させる観点では、反応溶液中にアルコールを添加することはこれまで、検討されてこなかった。
【0070】
しかし、本発明者の鋭意の検討によって、上記アミノ化反応をアルコールを含有する水溶液中で進行させると、特定置換基の導入量を容易に制御できること、特に、特定置換基の導入量をより向上させることができる、言い換えれば反応効率をより向上させることができることを見出した。
上記の機序は必ずしも明らかではないが、反応溶液中にアルコールが存在すると、ヒアルロン酸等の分子間／分子内の水素結合がより阻害される結果、特定置換基が導入されやすくなったためと考えられる。
上記の機序は必ずしも明らかではないが、反応溶液中にアルコールが存在すると、ヒアルロン酸等の分子間／分子内の水素結合がより阻害される結果、特定置換基が導入されやすくなったためと考えられる。
【0071】
アルコールとしては特に制限されず、分子内にヒドロキシ基を１個有する１価のアルコール、及び、ヒドロキシ基を２項以上有する多価のアルコールのいずれも使用でき、また、これらの混合物も使用できる。
【0072】
また、アルコールの炭素数としては特に制限されないが、より均一な反応溶液が得られる点で、炭素数が１～１０個が好ましく、１～６個がより好ましく、１～４個が更に好ましい。
炭素数が１～４個のアルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、２－プロパノール、２－メトキシエタノール、２－エトキシエタノール、２－メトキシプロパノール、及び、２－メトキシ－２－プロパノール等の１価のアルコール（モノオール）；エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－プロパンジオール、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、２－メチル－１，２－プロパンジオール、１，４－ブチンジオール、及び、ジエチレングリコール等の２価のアルコール（ジオール）；グリセリン、１，２，４－ブタントリオール、及び、エリスリトール等のポリオールが挙げられる。
炭素数が１～４個のアルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、２－プロパノール、２－メトキシエタノール、２－エトキシエタノール、２－メトキシプロパノール、及び、２－メトキシ－２－プロパノール等の１価のアルコール（モノオール）；エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－プロパンジオール、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、２－メチル－１，２－プロパンジオール、１，４－ブチンジオール、及び、ジエチレングリコール等の２価のアルコール（ジオール）；グリセリン、１，２，４－ブタントリオール、及び、エリスリトール等のポリオールが挙げられる。
【0073】
なかでも、特定置換基をより効率よく導入できる点で、アルコールとしては、１価のアルコールが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、及び、２－プロパノールからなる群より選択される少なくとも１種がより好ましく、エタノール、プロパノール、及び、２－プロパノールからなる群より選択される少なくとも１種が更に好ましい。
【0074】
反応溶液中におけるアルコールの含有量としては特に制限されないが、特定置換基の導入率をより容易に制御しやすい点、一般に溶剤中における水の含有量を１００体積％としたとき、１０～２００体積％が好ましく、２０～１３０体積％がより好ましい。
反応溶液は、アルコールの１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。反応溶液が、２種以上のアルコールを含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
反応溶液は、アルコールの１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。反応溶液が、２種以上のアルコールを含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【0075】
（その他の成分）
反応溶液は上記以外の成分を含有してもよい。上記以外の成分としては、例えば、反応補助剤、及び、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
反応溶液は上記以外の成分を含有してもよい。上記以外の成分としては、例えば、反応補助剤、及び、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【0076】
反応補助剤は、活性エステルを形成可能な物質であることが好ましい。反応補助剤としては、例えば、ＮＨＳ（Ｎ－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、ＨＯＢｔ（１－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）、ＨＯＯＢｔ（３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－３－ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｏｘｏ－１，２，３－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｉｎｅ）、ＨＯＡｔ（１－ｈｙｄｒｏｘｙ－７－ａｚａｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）、及び、Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）等が挙げられる。反応補助剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【0077】
ｐＨ調整剤としては特に制限されないが、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、アンモニア、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＨＡＭ）、４－（２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、カルバモイルメチルイミノビス酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、コラミン塩酸、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、アセトアミドグリシン、トリシン、及び、グリシンアミド等が挙げられる。ｐＨ調整剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【0078】
反応溶液を調製する方法としては特に制限されず、上記の各成分を混合すればよい。なかでも特定置換基をより効率よく導入できる点で、ｐＨ調整剤と水とを含有する溶剤にヒアルロン酸等を溶解させ、次いでカルボキシ基の活性化剤と必要に応じて反の補助剤を添加して撹拌して溶解させ、最後にアルコールを添加する方法が好ましい。
【0079】
調製された反応溶液中でアミド化反応を行う際の温度としては特に制限されないが、２０～３０℃で２～６時間撹拌すればよい。
また、本製造方法は、反応後の反応溶液を精製する工程を更に有していてもよい。精製方法としては特に制限されないが、透析、及び／又は、凍結乾燥等が挙げられる。
また、本製造方法は、反応後の反応溶液を精製する工程を更に有していてもよい。精製方法としては特に制限されないが、透析、及び／又は、凍結乾燥等が挙げられる。
【0080】
＜用途＞
本抑制材は、実施例で示すとおり、マクロファージに作用して炎症性サイトカインの産生を抑制可能である。また、本ヒアルロン酸誘導体は、炎症抑制材としても使用できる。
実施例で示すとおり、本抑制材が水を含有する場合、ハイドロゲルが形成され、上記ハイドロゲルはチキソトロピー性を有し、シリンジ等で注入するのに適した特性を有している。上記ハイドロゲルを注入すると、患部の炎症が抑制され、治癒が促される。
本抑制材は、実施例で示すとおり、マクロファージに作用して炎症性サイトカインの産生を抑制可能である。また、本ヒアルロン酸誘導体は、炎症抑制材としても使用できる。
実施例で示すとおり、本抑制材が水を含有する場合、ハイドロゲルが形成され、上記ハイドロゲルはチキソトロピー性を有し、シリンジ等で注入するのに適した特性を有している。上記ハイドロゲルを注入すると、患部の炎症が抑制され、治癒が促される。
【0081】
対象となる炎症性疾患としては、特に制限されないが、関節炎、動脈硬化、心筋梗塞、脊髄損傷、肝炎、心膜炎、褥瘡、及び、皮膚や消化管粘膜における創傷治癒等が挙げられる。
また、再生医療分野において、細胞移植の際の細胞の足場材料としても使用することができる。本抑制材に移植細胞を内包して移植することで、ホストの免疫細胞の攻撃（免疫拒絶反応）から保護することができる。
また、美容分野において、スキンケア剤の添加剤として用いることで、過剰な炎症反応を抑制することができる。さらに、美容整形外科領域におけるヒアルロン酸注射の代替物として用いることで、炎症を抑えることができる。
また、再生医療分野において、細胞移植の際の細胞の足場材料としても使用することができる。本抑制材に移植細胞を内包して移植することで、ホストの免疫細胞の攻撃（免疫拒絶反応）から保護することができる。
また、美容分野において、スキンケア剤の添加剤として用いることで、過剰な炎症反応を抑制することができる。さらに、美容整形外科領域におけるヒアルロン酸注射の代替物として用いることで、炎症を抑えることができる。
【0082】
本抑制材は、本発明の効果を奏する範囲内においてその他の成分と混合して用いてもよい。その他の成分としては、希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、界面活性剤、脂質、及び、基材等が挙げられる。また、投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよいが、非経口的経路が好ましい。
【0083】
本抑制材は、スプレー、ドライパウダーインヘーラー、滴下、イオントフォレーシス、エレクトロポレーション、及び、ソノフォレーシス（超音波）等のデバイスを用いる経粘膜又は経皮投与方法や、マイクロカニューレ、マイクロニードル、無針注射、及び、研磨等による経粘膜又は経皮投与方法により投与できる。また、錠剤、タブレットによる経口投与、経膣投与、及び、直腸投与もできる。注射器を用いた投与も可能である。クリームや軟膏、シップ剤も可能である。
【0084】
［ハイドロゲル］
本発明の実施形態に係るハイドロゲル（以下、「本ハイドロゲル」ともいう。）は、本抑制材と水とを含有するハイドロゲルである。特に制限されないが、本ハイドロゲルは、常温常圧において、流動性の無いことが好ましい。
本ハイドロゲルは本抑制材と水とを含有し、水の含有量としては特に制限されず、用途に応じて適宜調整できる。一般に、水の含有量としては、ハイドロゲルの全質量の１～９９質量％が好ましく、８０～９９質量％がより好ましい。
本発明の実施形態に係るハイドロゲル（以下、「本ハイドロゲル」ともいう。）は、本抑制材と水とを含有するハイドロゲルである。特に制限されないが、本ハイドロゲルは、常温常圧において、流動性の無いことが好ましい。
本ハイドロゲルは本抑制材と水とを含有し、水の含有量としては特に制限されず、用途に応じて適宜調整できる。一般に、水の含有量としては、ハイドロゲルの全質量の１～９９質量％が好ましく、８０～９９質量％がより好ましい。
【0085】
本ハイドロゲルは、架橋剤を含有していてもよい。架橋剤としては特に制限されないが、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基、及び、イソシアネート基等を有する化合物（高分子化合物であってもよい）、粒子、並びに、ファイバー等を用いることでハイドロゲルを形成することもできる。架橋剤の添加によって力学強度を向上させることができる。
【0086】
架橋剤としては特に制限されないが、例えば、以下の式で表されるスルホン化セルロースを用いてもよい。
【化15】
【0087】
上記式中、ｋ、ｍ、及び、ｎは、各繰り返し単位のモル％を表し、特に制限されないが、ｋは２５～９５モル％が好ましく、４０～９０モル％がより好ましい。ｍは４～７０モル％が好ましく、７～６０モル％がより好ましい。ｎは１～７０モル％が好ましく、１０～３０モル％がより好ましい。
【0088】
上記スルホン化セルロースは、下記式に示すグルコース単位の３位と４位の間が開環されて、スルホン化された構造を含むセルロースである。
【0089】
【化16】
【0090】
上式は、水中等においてスルホン基（－ＳＯ３Ｈ）が解離された状態を示し、対カチオンはＮａ＋に限定されずプロトン、Ｋ＋等であってよい。
【0091】
スルホン化セルロースは、例えばＨｅｎｒｉｋｋｉ Ｌｉｉｍａｔａｉｎｅｎら，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（２０１３）２０：７４１-７４９に記載された下記式に示す経路で合成することができる。
先ず、原料セルロースを水に分散させ、分散液を得る。上記分散液に、セルロース中のグルコース単位の量（ｋ）を１００モル％としたときに５０～２００モル％の過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を添加し、遮光しながら、４０～６０℃で２～６時間撹拌することによって、アルデヒド化セルロースを生成する。
【化17】
先ず、原料セルロースを水に分散させ、分散液を得る。上記分散液に、セルロース中のグルコース単位の量（ｋ）を１００モル％としたときに５０～２００モル％の過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を添加し、遮光しながら、４０～６０℃で２～６時間撹拌することによって、アルデヒド化セルロースを生成する。
【0092】
次に減圧濾過によって未反応物を含む水溶液を除去し、超純水で洗浄する操作を数回繰り返した後に凍結乾燥することで、アルデヒド化セルロースの乾燥粉末を得る。上記式において、ｋの初期値を１００モル％としたときに、ｍは１～８０モル％、好ましくは１０～５０モル％である。
【0093】
アルデヒド基の量は、水酸化ナトリウム水溶液を用いた導電率測定による中和滴定により求めることができ、０．５～８ミリモル／ｇ、好ましくは１～７ミリモル／ｇ、より好ましくは１～５ミリモル／ｇである。
【0094】
原料セルロースとしては、例えば、針葉樹系パルプ、広葉樹系パルプ、綿系パルプ等の植物、動物等から得られたセルロース、これらを用いた紙、古紙等を用いることができる。
【0095】
次いで、アルデヒド化セルロースを超純水に分散させ、ピロ亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）を、アルデヒド基量を１００モル％として２０～２００モル％、好ましくは５０～１５０モル％で添加して、室温で１２～２４時間、攪拌しながら反応させる。生成物を遠心分離により回収し、超純水等で洗浄して未反応物を除去して精製した後、超音波ホモジナイザーによって１０～３０分間程度ホモジナイズすることによって、スルホン化セルロースのナノファイバー（「ｓＣＮＦ」と略す場合がある）を得ることができる。収率は、約８０～９０％である。
【0096】
ｓＣＮＦは生分解性である。本発明において「生分解性」は３７℃のｐ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、１日で１重量％以上分解したことにより確認した。この生分解性は、原料セルロースのグルコース単位の量（ｋ）の初期値を１００モル％としたとき、ｍ＋ｎ、即ち開環された単位が、少なくとも１モル％、好ましくは１０～５０モル％であることによるものと考えられる。また、ｓＣＮＦは開環単位を有することによって、Ｘ線回折測定による結晶化度が２０～７０％であり、９０％程度の結晶化度を有する原料セルロースに比べて低い。
【0097】
〔添加剤等〕
本ハイドロゲルは、その他の成分を含有していてもよく、デリバリーしたい各種薬剤、及び、タンパク質等を配合し、これらの局所デリバリー担体、又は、徐放性デリバリー担体として使用してもよい。
薬剤としては、例えば炎症薬、抗血栓薬、抗生物質、線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、及び、肝細胞増殖因子等の成長因子が挙げられる。
また、ワクチンとして、ウイルスや癌の抗原タンパク質を担持することで、ワクチンキャリアとして使用してもよい。
本ハイドロゲルは、その他の成分を含有していてもよく、デリバリーしたい各種薬剤、及び、タンパク質等を配合し、これらの局所デリバリー担体、又は、徐放性デリバリー担体として使用してもよい。
薬剤としては、例えば炎症薬、抗血栓薬、抗生物質、線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、及び、肝細胞増殖因子等の成長因子が挙げられる。
また、ワクチンとして、ウイルスや癌の抗原タンパク質を担持することで、ワクチンキャリアとして使用してもよい。
【0098】
［置換基Ｗ］
１価の置換基Ｗとしては特に制限されないが、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ノニル基、ドデシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基、及び、エイコシル基等の炭素数１～２０のアルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロノニル基、シクロドデシル基、ノルボルニル基、アダマンチル基等の炭素数３～２０のシクロアルキル基；
エテニル基、プロペニル基、３－ブテニル基、２－ブテニル基、２－ペンテニル基、２－ヘキセニル基、２－ノネニル基、及び、２－ドデセニル基等の炭素数２～２０のアルケニル基；
フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、２－メチルフェニル基、３－メチルフェニル基、４－メチルフェニル基、４－エチルフェニル基、４－プロピルフェニル基、４－イソプロピルフェニル基、４－ブチルフェニル基、４－ｔ－ブチルフェニル基、４－ヘキシルフェニル基、４－シクロヘキシルフェニル基、４－アダマンチルフェニル基、及び、４－フェニルフェニル基等の炭素数６～２０のアリール基；
フェニルメチル基、１－フェニレンエチル基、２－フェニルエチル基、１－フェニル－１－プロピル基、１－フェニル－２－プロピル基、２－フェニル－２－プロピル基、３－フェニル－１－プロピル基、４－フェニル－１－ブチル基、５－フェニル－１－ペンチル基、及び、６－フェニル－１－ヘキシル基等の炭素数７～２０のアラルキル基；
これら水素原子の少なくとも一部がハロゲン原子（フッ素、塩素、及び、臭素が好ましい）で置換された基；及び、
メトキシ基、エトキシ基、及び、プロポキシ基等のアルコキシ基；
メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボ二ル基、ｎ－ブトキシカルボニル基、及び、ｔ－ブトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基；等が挙げられる。
１価の置換基Ｗとしては特に制限されないが、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ノニル基、ドデシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基、及び、エイコシル基等の炭素数１～２０のアルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロノニル基、シクロドデシル基、ノルボルニル基、アダマンチル基等の炭素数３～２０のシクロアルキル基；
エテニル基、プロペニル基、３－ブテニル基、２－ブテニル基、２－ペンテニル基、２－ヘキセニル基、２－ノネニル基、及び、２－ドデセニル基等の炭素数２～２０のアルケニル基；
フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、２－メチルフェニル基、３－メチルフェニル基、４－メチルフェニル基、４－エチルフェニル基、４－プロピルフェニル基、４－イソプロピルフェニル基、４－ブチルフェニル基、４－ｔ－ブチルフェニル基、４－ヘキシルフェニル基、４－シクロヘキシルフェニル基、４－アダマンチルフェニル基、及び、４－フェニルフェニル基等の炭素数６～２０のアリール基；
フェニルメチル基、１－フェニレンエチル基、２－フェニルエチル基、１－フェニル－１－プロピル基、１－フェニル－２－プロピル基、２－フェニル－２－プロピル基、３－フェニル－１－プロピル基、４－フェニル－１－ブチル基、５－フェニル－１－ペンチル基、及び、６－フェニル－１－ヘキシル基等の炭素数７～２０のアラルキル基；
これら水素原子の少なくとも一部がハロゲン原子（フッ素、塩素、及び、臭素が好ましい）で置換された基；及び、
メトキシ基、エトキシ基、及び、プロポキシ基等のアルコキシ基；
メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボ二ル基、ｎ－ブトキシカルボニル基、及び、ｔ－ブトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基；等が挙げられる。
【0099】
また、置換基Ｗとしては、複素環基（ヘテロ環基）、シアノ基、ニトロ基、アリールオキシ基、シリルオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ基、アシル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アリール又はヘテロ環アゾ基、ホスフィノ基、ホスフィニル基、ホスフィニルオキシ基、ホスホノ基、シリル基、ヒドラジノ基、ウレイド基、ボロン酸基（－Ｂ（ＯＨ）２）、及び、ホスファト基（－ＯＰＯ（ＯＨ）２）等も挙げられる。
【実施例0100】
以下に実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。
また、以下の実施例で説明する図面中のグラフにおけるエラーバーは、いずれも標準偏差を意味する。
また、以下の実施例で説明する図面中のグラフにおけるエラーバーは、いずれも標準偏差を意味する。
【0101】
［ヒアルロン酸誘導体の調製］
表１に示すヒアルロン酸誘導体、ＨＡ１～６を合成した。未修飾ヒアルロン酸（反応前のヒアルロン酸）は、ＨＡ０とした。
まず、２５０ｍｇの鶏冠由来ヒアルロン酸（分子量６０～１２０万）を撹拌子で撹拌しながら５０ｍＬの２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液に溶解し、分散液を得た。次に、分散液にヒアルロン酸中のＤ－グルクロン酸単位の量（ｎ）を１００モル％としたときに１０～２００モル％のエチレンジアミン（ＥＤＡ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）と終濃度１０ ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を添加し、撹拌そた。そこに、緩衝液の２０％～１３０％（体積）のエタノールを添加し、２０～３０℃で２～６時間撹拌することによって、ヒアルロン酸誘導体を合成した。次に透析膜（分子量分画：３５００～１５０００Ｄａ）を用いた透析によって未反応物を除去し、凍結乾燥することで、ヒアルロン酸誘導体の乾燥粉末を得るた。アミノ基の量は、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸を用いた比色試験により求め、またカルボキシ基の定量は、電位差測定による中和滴定により求めた。
表１に示すヒアルロン酸誘導体、ＨＡ１～６を合成した。未修飾ヒアルロン酸（反応前のヒアルロン酸）は、ＨＡ０とした。
まず、２５０ｍｇの鶏冠由来ヒアルロン酸（分子量６０～１２０万）を撹拌子で撹拌しながら５０ｍＬの２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液に溶解し、分散液を得た。次に、分散液にヒアルロン酸中のＤ－グルクロン酸単位の量（ｎ）を１００モル％としたときに１０～２００モル％のエチレンジアミン（ＥＤＡ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）と終濃度１０ ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を添加し、撹拌そた。そこに、緩衝液の２０％～１３０％（体積）のエタノールを添加し、２０～３０℃で２～６時間撹拌することによって、ヒアルロン酸誘導体を合成した。次に透析膜（分子量分画：３５００～１５０００Ｄａ）を用いた透析によって未反応物を除去し、凍結乾燥することで、ヒアルロン酸誘導体の乾燥粉末を得るた。アミノ基の量は、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸を用いた比色試験により求め、またカルボキシ基の定量は、電位差測定による中和滴定により求めた。
【0102】
【表1】
【0103】
表１中、「ＨＡ（ｇ）」とあるのは、反応溶液中のヒアルロン酸の含有量（ｇ）であり、「Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅ（ｍｍｏｌ）」とあるのは、反応溶液中のエチレンジアミンの含有量（ｍｍｏｌ）であり、「ＥＤＣ（ｍｍｏｌ）」とあるのは、反応溶液中の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の含有量（ｍｍｏｌ）であり、「ＮＨＳ（ｍＭ）」とあるのは、反応溶液中のＮ－ヒドロキシスクシンイミドの含有量（ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、「ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｍＬ）」とあるのは、反応溶液中の２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液の含有量（ｍＬ）であり、「Ｅｔｈａｎｏｌ（ｍＬ）」とあるのは、反応溶液中のエタノールの含有量（ｍＬ）であり、「Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ」とあるのは、反応溶液の濁度を示しており、「Clear」とあるのは、目視で透明であると判断された状態にあったこと、「Turbid」とあるのは、目視で、濁った状態にあったことを示しており、「Ｒｅｄｓｉｄｕａｌ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ（ｍｍｏｌ／ｇ）」とあるのは、得られたヒアルロン酸誘導体について、定量された（第１級）アミノ基の量であり、「Ｒｅｄｓｉｄｕａｌ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｇｒｏｕｐ（ｍｍｏｌ／ｇ）」得られたヒアルロン酸誘導体について、定量されたヒドロキシ基の量である。
【0104】
また、エチレンジアミンに代えて、ポリエチレンイミン（日本触媒社製、商品名「エポミン」、平均分子量３００）を用いて、上記と同様にしてヒアルロン酸誘導体を得た。結果を表２に示した。
【0105】
【表2】
【0106】
表２中、「ＰＥＩ（ｍｍｏｌ）」とあるのは、反応溶液中のポリエチレンイミンの含有量（ｍｍｏｌ）であり、Ａｍｉｎｅ／ＣＯＯＨとあるのは、ポリエチレンイミンに含まれるアミノ基とヒアルロン酸に含まれるカルボキシ基の比であり、ＥＤＣ／ＣＯＯＨとあるのは、仕込んだＥＤＣのモル数とヒアルロン酸中に含まれるカルボキシ基のモル数の比であり、その他は表１と同義である。
【0107】
＜ヒアルロン酸誘導体の同定＞
ヒアルロン酸誘導体の構造を同定するため、１Ｈ核磁気共鳴分光（１Ｈ ＮＭＲ）法とフーリエ変換赤外分光（ＦＴ－ＩＲ）法による測定を実施した。図１には、ポリエチレンイミンを導入したヒアルロン酸誘導体（表２中の「ＰＨＥＩＡ１０」）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示した。なお、図１中、「ＨＡ」はヒアルロン酸、「ＰＥＩＨＡ」は「ＰＥＩＨＡ１０」のそれぞれのスペクトルを表す。
ヒアルロン酸誘導体の構造を同定するため、１Ｈ核磁気共鳴分光（１Ｈ ＮＭＲ）法とフーリエ変換赤外分光（ＦＴ－ＩＲ）法による測定を実施した。図１には、ポリエチレンイミンを導入したヒアルロン酸誘導体（表２中の「ＰＨＥＩＡ１０」）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示した。なお、図１中、「ＨＡ」はヒアルロン酸、「ＰＥＩＨＡ」は「ＰＥＩＨＡ１０」のそれぞれのスペクトルを表す。
【0108】
また、図２には、エチレンジアミンを導入したヒアルロン酸誘導体のＦＴ－ＩＲ）スペクトルを示した。図２中、「ＨＡ３」はエチレンジアミンを導入したヒアルロン酸誘導体のスペクトル、「ＨＡ０」はヒアルロン酸のスペクトルを示している。
【0109】
図１に記載されたとおり、ＰＥＩＨＡのスペクトルには、ポリエチレンイミンのメチレン部分のピークが検出された。また、図２に記載されたとおり、誘導体化によって１７２５ｃｍ－１付近のＣ＝Ｏ伸縮のピークが消失していることから、カルボキシ基がエチレンジアミンと反応しており、エチレンジアミンが導入されていることが確認できた。
【0110】
＜粘度測定＞
粘弾性測定装置（「Ｒｈｅｏｐｌｕｓ」、アントンパール社）を用いて、ヒアルロン酸誘導体水溶液の粘度を測定した。１質量％のＨＡ３の水溶液（超純水、ｐＨ＝７）１００μＬを粘弾性測定装置（レオメーター）のステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。測定中、ステージの温度は２５℃とした。結果を図３に示した。
粘弾性測定装置（「Ｒｈｅｏｐｌｕｓ」、アントンパール社）を用いて、ヒアルロン酸誘導体水溶液の粘度を測定した。１質量％のＨＡ３の水溶液（超純水、ｐＨ＝７）１００μＬを粘弾性測定装置（レオメーター）のステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。測定中、ステージの温度は２５℃とした。結果を図３に示した。
【0111】
図３に示した結果から、せん断速度を変化させ、粘度を測定したところ、せん断速度の増加に伴った粘度の低下が見られたことから、ヒアルロン酸誘導体はシェアシニング特性を有していることが分かった。
また、未修飾ヒアルロン酸であるＨＡ０の粘度と比較して、ＨＡ１及びＨＡ２は粘度が上昇していた。これはヒアルロン酸の架橋によって高分子量化したためであると考えられる。一方で、ＨＡ３においては、粘度が低下しており、これはエチレンジアミンの導入に伴った分子内及び分子間での水素結合の低下によるものだと考えられる。
また、未修飾ヒアルロン酸であるＨＡ０の粘度と比較して、ＨＡ１及びＨＡ２は粘度が上昇していた。これはヒアルロン酸の架橋によって高分子量化したためであると考えられる。一方で、ＨＡ３においては、粘度が低下しており、これはエチレンジアミンの導入に伴った分子内及び分子間での水素結合の低下によるものだと考えられる。
【0112】
＜粘弾特性＞
ヒアルロン酸は高濃度で水に溶解すると高粘性液体となる。ＨＡ３を５、７．５、１０質量％で超純水に溶解し、１００μＬをレオメーターのステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。測定中、ステージの温度は２５℃とした。結果を図４及び図５に示した。
ヒアルロン酸は高濃度で水に溶解すると高粘性液体となる。ＨＡ３を５、７．５、１０質量％で超純水に溶解し、１００μＬをレオメーターのステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。測定中、ステージの温度は２５℃とした。結果を図４及び図５に示した。
【0113】
直径１０ｍｍの円盤状の治具で固定し、ひずみを変化させたところ、０．１％～１００％のひずみの範囲においては、線形の粘弾特性を示した（図４）。また、濃度依存的にせん断弾性率は増加し、７．５重量％以上で貯蔵弾性率（Ｇ′）が損失弾性率（Ｇ″）を上回っており、高濃度領域ではゲル化していることが示された。一方で、周波数依存性を評価したところ、低周波数領域ではＧ″がＧ′を上回っており、粘性体であり、硝子体などのような粘弾特性を示した（図５）。
【0114】
＜チキソトロピー性＞
チキソトロピー性とは、せん断に対して粘度が低下し、負荷を止めると再び粘度が回復する性質のことであり、シリンジ等を用いたインジェクタブル材料に非常に適した性質である。
粘弾性測定装置を用いて、１０質量％のＨＡ３水溶液（超純水、ｐＨ＝７）のひずみ変化に対するせん断弾性率の変化を測定した。測定中、ステージの温度は２５℃、測定時の周波数は１Ｈｚで実験を行った。直径１０ｍｍの円盤状の治具で固定しひずみを２分毎に１％、３００％と変化させたときの弾性率を測定した。結果を図６に示した。
チキソトロピー性とは、せん断に対して粘度が低下し、負荷を止めると再び粘度が回復する性質のことであり、シリンジ等を用いたインジェクタブル材料に非常に適した性質である。
粘弾性測定装置を用いて、１０質量％のＨＡ３水溶液（超純水、ｐＨ＝７）のひずみ変化に対するせん断弾性率の変化を測定した。測定中、ステージの温度は２５℃、測定時の周波数は１Ｈｚで実験を行った。直径１０ｍｍの円盤状の治具で固定しひずみを２分毎に１％、３００％と変化させたときの弾性率を測定した。結果を図６に示した。
【0115】
図６に示したように、１％から３００％へとひずみを増加させるとＧ′が大きく低下し、再び１％にひずみを戻すと、Ｇ′が回復することが分かった（図６）。この操作を複数回繰り返しても、Ｇ′はもとの値へと回復した。この結果より、ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルは、チキソトロピー性を有していることが明らかとなった。
【0116】
＜ヒアルロン酸誘導体が細胞生存率及び細胞増殖に与える影響＞
ヒアルロン酸誘導体の細胞毒性と細胞増殖への影響について、マウスマクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４．７）を用いて評価した。ＲＡＷ２６４．７細胞はＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリンストレプトマイシン）を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。１×１０４個のＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。ＨＡ０、及び、ＨＡ３を細胞培養培地に０．３～５ｍｇ／ｍＬで溶解し、各ウェルに１００μＬずつ添加し、細胞生存率評価では３時間、細胞増殖試験では２４時間培養した。
また、コントロールとして、培地のみを加えたサンプル（コントロール）と炎症を惹起する細菌由来の毒素であるリポ多糖（ＬＰＳ）を１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。
ヒアルロン酸誘導体の細胞毒性と細胞増殖への影響について、マウスマクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４．７）を用いて評価した。ＲＡＷ２６４．７細胞はＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリンストレプトマイシン）を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。１×１０４個のＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。ＨＡ０、及び、ＨＡ３を細胞培養培地に０．３～５ｍｇ／ｍＬで溶解し、各ウェルに１００μＬずつ添加し、細胞生存率評価では３時間、細胞増殖試験では２４時間培養した。
また、コントロールとして、培地のみを加えたサンプル（コントロール）と炎症を惹起する細菌由来の毒素であるリポ多糖（ＬＰＳ）を１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。
【0117】
【0118】
その結果、最も高濃度である５ｍｇ／ｍＬにおいても細胞生存率は高く、高い細胞適合性が示された（図７）。また、細胞増殖に関しては、高濃度領域においては、若干の増殖率の低下が見られた。
【0119】
また、図８には、エチレンジアミンに代えてポリエチレンイミンを用いた場合の細胞生存率の測定結果を示した。ポリエチレンイミンを用いた場合も、エチレンジアミンを用いた場合と同様、細胞生存率は低下しなかった。なお、図８中、ＰＥＩＨＡは「ＰＥＩＨＡ１０」を意味する。
【0120】
＜細胞の形態への効果＞
１×１０４個のＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。培地で５ｍｇ／ｍＬに調製したＨＡ０及びＨＡ３に、ＬＰＳを添加し１００ｎｇ／ｍＬとした。
この溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。コントロールとして、培地のみを加えたサンプル（コントロール）とＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。
培養後の細胞の形態を位相差顕微鏡を用いて観察したところ、元々丸い形態であるＲＡＷ２６４．７細胞が、ＬＰＳ刺激によって伸展している様子が観察された（図１０）。ＨＡ０とＬＰＳとを同時に添加したサンプルにおいては、細胞の形態に変化はなかった一方で、ＨＡ３を用いたサンプルにおいては、細胞の形態が丸く、コントロールに近い形態であった。このことから、ＨＡ３は炎症状態を緩和し、未刺激の状態へと近づける効果があることが分かった。
図１１には、同様のサンプルの蛍光顕微鏡像から算出した接着面積を示した。図１１の結果から、ＬＰＳ＋ＨＡ３は、ＬＰＳのみ、及び、ＬＰＳ＋ＨＡ０と比較して接着面積がより狭く、ＬＰＳ刺激による伸展がより抑制されていることがわかった。
１×１０４個のＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。培地で５ｍｇ／ｍＬに調製したＨＡ０及びＨＡ３に、ＬＰＳを添加し１００ｎｇ／ｍＬとした。
この溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。コントロールとして、培地のみを加えたサンプル（コントロール）とＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。
培養後の細胞の形態を位相差顕微鏡を用いて観察したところ、元々丸い形態であるＲＡＷ２６４．７細胞が、ＬＰＳ刺激によって伸展している様子が観察された（図１０）。ＨＡ０とＬＰＳとを同時に添加したサンプルにおいては、細胞の形態に変化はなかった一方で、ＨＡ３を用いたサンプルにおいては、細胞の形態が丸く、コントロールに近い形態であった。このことから、ＨＡ３は炎症状態を緩和し、未刺激の状態へと近づける効果があることが分かった。
図１１には、同様のサンプルの蛍光顕微鏡像から算出した接着面積を示した。図１１の結果から、ＬＰＳ＋ＨＡ３は、ＬＰＳのみ、及び、ＬＰＳ＋ＨＡ０と比較して接着面積がより狭く、ＬＰＳ刺激による伸展がより抑制されていることがわかった。
【0121】
＜炎症性サイトカインの産生評価＞
１×１０４個のＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。培地で５ｍｇ／ｍＬに調製したＨＡ０、及び、ＨＡ３に、ＬＰＳを添加し１００ｎｇ／ｍＬとした。この溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。コントロールとして、培地のみを加えたサンプル（コントロール）とＬＰＳとを１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。
１×１０４個のＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。培地で５ｍｇ／ｍＬに調製したＨＡ０、及び、ＨＡ３に、ＬＰＳを添加し１００ｎｇ／ｍＬとした。この溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。コントロールとして、培地のみを加えたサンプル（コントロール）とＬＰＳとを１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。
【0122】
培養後、上清を回収し、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって、上清中に含まれている炎症性サイトカインの一種である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）の濃度を定量した。その結果、ＬＰＳのみを添加した場合はＴＮＦ－αが８００ｐｇ／ｍＬ産生されるのに対して、ＨＡ３を同時に添加することによって、３．５倍以上ＴＮＦ－αの産生を抑制することができた（図１２）。一方で、未修飾のヒアルロン酸であるＨ０は全く抗炎症効果を示さなかった。ＨＡ０とＨＡ３の濃度依存性についても同様の手法を用いて評価したところ、ＨＡ３は濃度の増加に伴ってＴＮＦ－αの産生量を低減しており、５ｍｇ／ｍＬで最も強い抗炎症効果を示した。一方でＨＡ０においては、いずれの濃度においても抗炎症効果は見られなかった（図１３）。
【0123】
また、図１４には、エチレンジアミンに代えて、ポリエチレンイミン（平均分子量３００）、及び、１，４－ジアミノブタンを用いてそれぞれ合成した特定ヒアルロン酸誘導体を用いた場合の結果を示した。
図１４中、ＥＤＡ－ＨＡとあるのは、エチレンジアミンを用いたものであり、Ｃ４とあるのは、エチレンジアミンに代えて、１，４－ジアミノブタンを用いたものであり、ＰＥＩＨＡとあるのは、ポリエチレンイミンを用いたものである。
図１４に示した結果から、式Ａ１及びＡ２におけるＬ２の炭素数が３個以下である、ＥＤＡ－ＨＡ、及び、ＰＥＩＨＡは、炭素数が４個であるＣ４と比較して、より優れた炎症性サイトカイン産生抑制効果を有していることがわかった。
なお、図１４中の縦軸は、ＬＰＳにおけるＴＮＦ－αの産生量を１としたときの各試料のＴＮＦ－αの産生量を比で表している。
図１４中、ＥＤＡ－ＨＡとあるのは、エチレンジアミンを用いたものであり、Ｃ４とあるのは、エチレンジアミンに代えて、１，４－ジアミノブタンを用いたものであり、ＰＥＩＨＡとあるのは、ポリエチレンイミンを用いたものである。
図１４に示した結果から、式Ａ１及びＡ２におけるＬ２の炭素数が３個以下である、ＥＤＡ－ＨＡ、及び、ＰＥＩＨＡは、炭素数が４個であるＣ４と比較して、より優れた炎症性サイトカイン産生抑制効果を有していることがわかった。
なお、図１４中の縦軸は、ＬＰＳにおけるＴＮＦ－αの産生量を１としたときの各試料のＴＮＦ－αの産生量を比で表している。
【0124】
＜ヒアルロン酸誘導体作製条件が抗炎症性に与える影響＞
ヒアルロン酸誘導体を作製する際に添加するエタノールの量と抗炎症効果の関係について評価を行った。ＨＡ３を作製する条件において、エタノール量を０～６５ｍＬまで変化させ、ヒアルロン酸誘導体を合成した。炎症性サイトカインの産生評価でしたのと同様の手法によって、ＴＮＦ－αの産生量を定量した。
その結果、エタノールを添加しなかった場合にはほとんど抗炎症効果が見られず、５０ｍＬエタノールを添加した条件で最も高い抗炎症効果が見られた（図１５）。
ヒアルロン酸誘導体を作製する際に添加するエタノールの量と抗炎症効果の関係について評価を行った。ＨＡ３を作製する条件において、エタノール量を０～６５ｍＬまで変化させ、ヒアルロン酸誘導体を合成した。炎症性サイトカインの産生評価でしたのと同様の手法によって、ＴＮＦ－αの産生量を定量した。
その結果、エタノールを添加しなかった場合にはほとんど抗炎症効果が見られず、５０ｍＬエタノールを添加した条件で最も高い抗炎症効果が見られた（図１５）。
【0125】
また、添加するＥＤＡと抗炎症効果との関係についても同様に評価した（図１６）。ヒアルロン酸誘導体を作製時に添加するＥＤＡとＥＤＣの量を種々変化させた、ＨＡ１～ＨＡ６を用いて実験を行った。なお、その結果、ＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ３とＥＤＡ量を増加させたサンプルにおいてより強い抗炎症効果が見られた。
【0126】
図１６に示した結果から、アミノ基の含有量が０．１０ｍｍｏｌ／ｇ以上であるＨＡ３は、優れた抗炎症性を有していることがわかった。また、アミノ基の含有量が０．４０ｍｍｏｌ／ｇ以上であるＨＡ３は、ＨＡ１と比較してより優れた抗炎症性を有していることがわかった。また、アミノ基の含有量１．１０ｍｍｏｌ／ｇであるＨＡ３はより優れた抗炎症性を有していることがわかった。
【0127】
特定アミンとしてポリエチレンイミンを用いた場合の反応溶液中のポリエチレンイミンの含有量と炎症性サイトカイン産生抑制効果との関係（但し、ＥＤＣはヒアルロン酸に含まれるカルボキシ基に対して１０モル％で固定）を図１７に示した。
図１７から、ヒアルロン酸が有するカルボキシ基に対する、ポリエチレンイミンが有するアミノ基の量（モル比）が０．５（５０％）以上であると、より優れた炎症性サイトカイン産生抑制効果を有する特定ヒアルロン酸誘導体が得られることがわかった。
図１７から、ヒアルロン酸が有するカルボキシ基に対する、ポリエチレンイミンが有するアミノ基の量（モル比）が０．５（５０％）以上であると、より優れた炎症性サイトカイン産生抑制効果を有する特定ヒアルロン酸誘導体が得られることがわかった。
【0128】
また同様にして、反応溶液中のＥＤＣの含有量と炎症性サイトカイン産生抑制効果との関係（但し、ポリエチレンイミンは、ヒアルロン酸に含まれるカルボキシ基に対して５０モル％で固定）を図１８に示した。
【0129】
＜ＥＤＡ以外の分子修飾の効果＞
ヒアルロン酸に修飾する官能基の効果を評価するために、ＥＤＡの代わりに、エタノールアミンを修飾して抗炎症効果を評価した。エタノールアミンについては、３０モル％のエタノールアミンを添加して、ＨＡ１１を合成した。これらのヒアルロン酸誘導体を用いて、抗炎症性を評価した。結果を図１９に示した。
上記の結果、ＨＡ１１についても抗炎症効果が得られた。
ヒアルロン酸に修飾する官能基の効果を評価するために、ＥＤＡの代わりに、エタノールアミンを修飾して抗炎症効果を評価した。エタノールアミンについては、３０モル％のエタノールアミンを添加して、ＨＡ１１を合成した。これらのヒアルロン酸誘導体を用いて、抗炎症性を評価した。結果を図１９に示した。
上記の結果、ＨＡ１１についても抗炎症効果が得られた。
【0130】
＜初代マクロファージ細胞に対する抗炎症効果＞
３×１０４個のマウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。培地で５ｍｇ／ｍＬに調製したＨＡ０、及び、ＰＥＩＨＡ１０、又は、０．５ｍｇ／ｍＬに調製したポリエチレンイミン（ＰＥＩ３００）に、ＬＰＳを添加し１００ｎｇ／ｍＬとした。この溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。
また、コントロールとして、ＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。
３×１０４個のマウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。培地で５ｍｇ／ｍＬに調製したＨＡ０、及び、ＰＥＩＨＡ１０、又は、０．５ｍｇ／ｍＬに調製したポリエチレンイミン（ＰＥＩ３００）に、ＬＰＳを添加し１００ｎｇ／ｍＬとした。この溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。
また、コントロールとして、ＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。
【0131】
培養後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によって、上清中に含まれているＴＮＦ－αの濃度を定量した。結果を図２０に示した。なお、図２０中、「ＬＰＳ」とあるのは、上記コントロールを意味し、「ＰＥＩ」とあるのはポリエチレンイミン（平均分子量３００）のみを用いたもの、「ＨＡ」とあるのは、ヒアルロン酸のみを用いたもの、「ＰＥＩＨＡ」とあるのは上記ポリエチレンイミンで修飾されたヒアルロン酸を意味する。
【0132】
図２０に示したとおり、ＰＥＩＨＡはＰＥＩ及びＨＡのそれぞれ単独で用いたのと比較して、ＴＮＦ－αの産生が抑制されていることがわかった。
【0133】
＜初代マクロファージ細胞の生存率に対する影響＞
３×１０４個のＢＭＤＭを９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。培地で調製したポリエチレンイミン（ＰＥＩ３００）、ＨＡ０、ＰＥＩＨＡ１０に、ＬＰＳを添加し１００ｎｇ／ｍＬとした。なお、ＰＥＩ３００とＰＥＩＨＡ１０は、第一級アミノ基の量が０．３～９ｍＭとなるように溶液の濃度を調整した。ＨＡ０はＰＥＩＨＡ１０と同じ質量％とした。この溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。コントロールとして、ＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。培養後、ＷＳＴ－８法を用いて細胞生存率を評価した。
３×１０４個のＢＭＤＭを９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。培地で調製したポリエチレンイミン（ＰＥＩ３００）、ＨＡ０、ＰＥＩＨＡ１０に、ＬＰＳを添加し１００ｎｇ／ｍＬとした。なお、ＰＥＩ３００とＰＥＩＨＡ１０は、第一級アミノ基の量が０．３～９ｍＭとなるように溶液の濃度を調整した。ＨＡ０はＰＥＩＨＡ１０と同じ質量％とした。この溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。コントロールとして、ＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。培養後、ＷＳＴ－８法を用いて細胞生存率を評価した。
【0134】
図２１に示したとおり、ＰＥＩＨＡはＰＥＩを単独で用いたのと比較して、高い細胞生存率を示すことが明らかとなった。
【0135】
＜初代マクロファージ細胞の生存率に対する影響＞
３×１０４個のＢＭＤＭを９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。培地で調製したＰＥＩＨＡ１０またはＰＥＩ３００とＨＡの混合物に、ＬＰＳを添加し１００ｎｇ／ｍＬとした。なお、ＰＥＩ３００とＰＥＩＨＡ１０は、第一級アミノ基の量が０．３～９ｍＭとなるように溶液の濃度を調整した。ＨＡの濃度はＰＥＩＨＡ１０と同じ質量％とした。この溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。コントロールとして、ＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。培養後、ＷＳＴ－８法を用いて細胞生存率を評価した。
３×１０４個のＢＭＤＭを９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。培地で調製したＰＥＩＨＡ１０またはＰＥＩ３００とＨＡの混合物に、ＬＰＳを添加し１００ｎｇ／ｍＬとした。なお、ＰＥＩ３００とＰＥＩＨＡ１０は、第一級アミノ基の量が０．３～９ｍＭとなるように溶液の濃度を調整した。ＨＡの濃度はＰＥＩＨＡ１０と同じ質量％とした。この溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。コントロールとして、ＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬで添加したサンプルを用いた。培養後、ＷＳＴ－８法を用いて細胞生存率を評価した。
【0136】
図２２に示したとおり、ＰＥＩとＨＡ（図中、「ＰＥＩ＋ＨＡ」と記載した。）の混合物、及び、ＰＥＩＨＡは、どちらも高い細胞生存率を示すことが明らかとなった。
【0137】
＜ファゴサイトーシス＞
ファゴサイトーシスとは、マクロファージなどの貪食細胞による貪食のことを指し、マクロファージが異物を除去するために行う。蛍光ビーズ（フルオレセインが微粒子に固定、粒径が１００ｎｍ）を用いて、ヒアルロン酸誘導体がファゴサイトーシスに与える効果を調べた。１×１０４個のＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。
培地で５重量％に調製したＨＡ０及びＨＡ３に、蛍光ビーズを添加し各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。コントロールとして、蛍光ビーズ懸濁液のみを加えたサンプル（コントロール）を用いた。培養後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）によって各ウェルを洗浄し、蛍光顕微鏡によって観察した（図２３上段、画像上、白く見える部分が蛍光染色された部分である）。
コントロールでは、各細胞に蛍光染色部分がみられるが、ＨＡ３添加試料では見られなかった。
ファゴサイトーシスとは、マクロファージなどの貪食細胞による貪食のことを指し、マクロファージが異物を除去するために行う。蛍光ビーズ（フルオレセインが微粒子に固定、粒径が１００ｎｍ）を用いて、ヒアルロン酸誘導体がファゴサイトーシスに与える効果を調べた。１×１０４個のＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。
培地で５重量％に調製したＨＡ０及びＨＡ３に、蛍光ビーズを添加し各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。コントロールとして、蛍光ビーズ懸濁液のみを加えたサンプル（コントロール）を用いた。培養後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）によって各ウェルを洗浄し、蛍光顕微鏡によって観察した（図２３上段、画像上、白く見える部分が蛍光染色された部分である）。
コントロールでは、各細胞に蛍光染色部分がみられるが、ＨＡ３添加試料では見られなかった。
【0138】
また、１％ドデシル硫酸ナトリウム／０．１ＭＮａＯＨを１００μＬ添加することで細胞を溶解し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの蛍光強度を算出した（図２３下段）。その結果、コントロールと比較して、ＨＡ０とＨＡ３を加えたサンプルにおいては、ファゴサイトーシスが大幅に抑制されていた（図２３下段）。これらの結果より、ヒアルロン酸誘導体はマクロファージの機能を抑制することで、抗炎症効果を発現していることが示唆された。
【0139】
＜ヒアルロン酸誘導体が細胞生存率及び細胞増殖に与える影響＞
ヒアルロン酸誘導体の細胞取り込みを評価するために、蛍光ラベル化ＨＡ３を作製した。ＨＡ３を合成する行程において、ＥＤＡを添加するときに、同時にフルオレセインアミン（０．０２ｍｍｏｌ）を添加した。フルオレセインアミンのアミノ基とヒアルロン酸のカルボキシ基が反応することで蛍光色素をヒアルロン酸に導入することができる。得られた蛍光ＨＡ３を培地に溶解し、０．６～５ｍｇ/ｍＬの濃度でＲＡＷ２６４．７（１×１０４個播種し２４時間予備培養）に添加した。培養後、ＰＢＳで各ウェルを洗浄し、１％ドデシル硫酸ナトリウム／０．１ＭＮａＯＨを１００μＬ添加することで細胞を溶解し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの蛍光強度を算出した。その結果、蛍光ＨＡ３の濃度の増加に伴った取り込み量の増加が確認された（図２４）。
ヒアルロン酸誘導体の細胞取り込みを評価するために、蛍光ラベル化ＨＡ３を作製した。ＨＡ３を合成する行程において、ＥＤＡを添加するときに、同時にフルオレセインアミン（０．０２ｍｍｏｌ）を添加した。フルオレセインアミンのアミノ基とヒアルロン酸のカルボキシ基が反応することで蛍光色素をヒアルロン酸に導入することができる。得られた蛍光ＨＡ３を培地に溶解し、０．６～５ｍｇ/ｍＬの濃度でＲＡＷ２６４．７（１×１０４個播種し２４時間予備培養）に添加した。培養後、ＰＢＳで各ウェルを洗浄し、１％ドデシル硫酸ナトリウム／０．１ＭＮａＯＨを１００μＬ添加することで細胞を溶解し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの蛍光強度を算出した。その結果、蛍光ＨＡ３の濃度の増加に伴った取り込み量の増加が確認された（図２４）。
【0140】
＜架橋によるハイドロゲルの作製＞
ハイドロゲルの力学強度の向上を目的として、アルデヒド基を含むスルホン化ナノセルロース（ｓＮＣ）を用いた。ｓＮＣのアルデヒド基とヒアルロン酸誘導体に導入したアミノ基は、イミン形成によって分子間で結合するため、ｓＮＣによってヒアルロン酸誘導体を架橋することが可能である。２質量％のｓＮＣ溶液（超純水、ｐＨ＝８）と５質量％のＨＡ３溶液（０．１Ｍホウ酸バッファー、ｐＨ＝９）を５０μＬずつ素早く混合してハイドロゲルを作製し、その粘弾特性を粘弾性測定装置によって評価した。プレゲル溶液１００μＬを粘弾性測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの円盤状の治具で固定し、２５ｏＣ、ひずみ１％、周波数１Ｈｚで測定を行った。その結果、溶液の貯蔵弾性率Ｇ′（中黒丸）が経時的に増加する様子が観察され、ゲル化が起きていることが確認された（図２５）。およそ２時間後にはＧ′はプラトーに達し、イミン形成の反応が完了していると考えられる。なお、損失弾性率Ｇ″は図中、中白丸で示した。
ハイドロゲルの力学強度の向上を目的として、アルデヒド基を含むスルホン化ナノセルロース（ｓＮＣ）を用いた。ｓＮＣのアルデヒド基とヒアルロン酸誘導体に導入したアミノ基は、イミン形成によって分子間で結合するため、ｓＮＣによってヒアルロン酸誘導体を架橋することが可能である。２質量％のｓＮＣ溶液（超純水、ｐＨ＝８）と５質量％のＨＡ３溶液（０．１Ｍホウ酸バッファー、ｐＨ＝９）を５０μＬずつ素早く混合してハイドロゲルを作製し、その粘弾特性を粘弾性測定装置によって評価した。プレゲル溶液１００μＬを粘弾性測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの円盤状の治具で固定し、２５ｏＣ、ひずみ１％、周波数１Ｈｚで測定を行った。その結果、溶液の貯蔵弾性率Ｇ′（中黒丸）が経時的に増加する様子が観察され、ゲル化が起きていることが確認された（図２５）。およそ２時間後にはＧ′はプラトーに達し、イミン形成の反応が完了していると考えられる。なお、損失弾性率Ｇ″は図中、中白丸で示した。
【産業上の利用可能性】
【0141】
本酸誘導体は、高い安全性と高い抗炎症性を示すインジェクタブルゲルを形成可能であり、抗炎症性材料として医療用途に大変有用である。
【図1】
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