(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024028887
(43)【公開日】2024-03-05
(54)【発明の名称】偽ウイルス粒子及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240227BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240227BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240227BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240227BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C12N15/63 Z
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/11 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023206628
(22)【出願日】2023-12-07
(62)【分割の表示】P 2019526380の分割
【原出願日】2017-07-28
(31)【優先権主張番号】1657424
(32)【優先日】2016-07-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(71)【出願人】
【識別番号】519030615
【氏名又は名称】アンギャニー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100106297
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 克博
(72)【発明者】
【氏名】ゴモル、 ヴェロニク
(72)【発明者】
【氏名】ヴェジーナ、 ルイス－フィリップ
(72)【発明者】
【氏名】ファイ、 ロイック
(72)【発明者】
【氏名】カタラ、 ヴィルジニー
(72)【発明者】
【氏名】フィチェット、 アンヌ－カトリーヌ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】それ自体は非免疫原性であり、真核細胞中で自己集合する多価の構造であって、合成が容易であり、かつその表面にタンパク質又はペプチドを担持することができるウイルス様粒子を提供する。
【解決手段】ａ）任意選択で、シグナルペプチド；ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；ｃ）コイルドコイルドメイン；及び、ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる細胞膜へのアンカードメインを連続して含む、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質、また、この融合タンパク質を用いて得られたウイルス様粒子を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】ａ）任意選択で、シグナルペプチド；ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；ｃ）コイルドコイルドメイン；及び、ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる細胞膜へのアンカードメインを連続して含む、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質、また、この融合タンパク質を用いて得られたウイルス様粒子を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
－ その少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜からなるエンベロープ；並びに、
－ 前記膜中に固定された少なくとも１種のＩ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、以下：
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではない、コイルドコイルドメイン又はオリゴマー形成配列；及び
ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる細胞膜へのアンカードメインであって、好ましくは、少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜へのアンカードメイン
の断片を連続して含み、
断片ｂ）及びｃ）はウイルス様粒子の表面に露出している、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質
を含む、ウイルス様粒子。
－ 前記膜中に固定された少なくとも１種のＩ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、以下：
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではない、コイルドコイルドメイン又はオリゴマー形成配列；及び
ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる細胞膜へのアンカードメインであって、好ましくは、少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜へのアンカードメイン
の断片を連続して含み、
断片ｂ）及びｃ）はウイルス様粒子の表面に露出している、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質
を含む、ウイルス様粒子。
【請求項2】
リンカーが、断片ｂ）とｃ）との間、及び／又は断片ｃ）とｄ）との間に存在する、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項3】
ｂ）目的のタンパク質又はペプチドが、
・アレルゲン及びそれらの断片、
・細胞表面タンパク質及びそれらの断片、
・慢性疾患又は神経変性疾患において蓄積するタンパク質及びペプチド、
・高血圧に関与するタンパク質及びペプチド、
・免疫グロブリン及びそれらの断片、
・サイトカイン及びそれらの断片、並びに
・ホルモン及びそれらの断片
から選択され；
ｃ）コイルドコイルドメインが、配列番号：２４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３３、及び配列番号：３０から選択され；そして
ｄ）アンカードメインが、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列（配列番号：２６）及びＰＤＬＰｌタンパク質のアンカー配列（配列番号：３１）
から選択される、請求項１又は２に記載のウイルス様粒子。
・アレルゲン及びそれらの断片、
・細胞表面タンパク質及びそれらの断片、
・慢性疾患又は神経変性疾患において蓄積するタンパク質及びペプチド、
・高血圧に関与するタンパク質及びペプチド、
・免疫グロブリン及びそれらの断片、
・サイトカイン及びそれらの断片、並びに
・ホルモン及びそれらの断片
から選択され；
ｃ）コイルドコイルドメインが、配列番号：２４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３３、及び配列番号：３０から選択され；そして
ｄ）アンカードメインが、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列（配列番号：２６）及びＰＤＬＰｌタンパク質のアンカー配列（配列番号：３１）
から選択される、請求項１又は２に記載のウイルス様粒子。
【請求項4】
目的のタンパク質又はペプチドが、アレルゲン及びそれらの断片から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
【請求項5】
ａ）任意選択で、シグナルペプチド；
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではない、コイルドコイルドメイン又はオリゴマー形成配列；及び
ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる細胞膜へのアンカードメインであって、好ましくは、少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜へのアンカードメイン
の断片を連続して含む、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質。
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではない、コイルドコイルドメイン又はオリゴマー形成配列；及び
ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる細胞膜へのアンカードメインであって、好ましくは、少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜へのアンカードメイン
の断片を連続して含む、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質。
【請求項6】
目的のタンパク質又はペプチドが、アレルゲン及びそれらの断片から選択される、請求項５に記載の膜貫通融合タンパク質。
【請求項7】
請求項５又は６に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項8】
少なくとも１つの請求項７に記載の核酸を含む宿主細胞又はベクター。
【請求項9】
治療における使用のための、請求項１～４のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
【請求項10】
アレルゲン免疫療法における使用のための、請求項１～４のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
【請求項11】
真核細胞における請求項７に記載の核酸の発現を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のウイルス様粒子の製造方法。
【請求項12】
真核細胞が植物細胞であり、かつ以下の工程：
ａ）強力なプロモーターに作動可能に連結された請求項５に記載の核酸を含む発現ベクターを用いたアグロバクテリアの形質転換；及び
ｂ）工程ａ）において得られたアグロバクテリアを用いた植物細胞のトランスフェクションであって、前記トランスフェクションが、以下の工程：
ｂ１） 噴霧水耕栽培又は水耕栽培条件下、かつＬＥＤ照光下の、好ましくは水耕栽培条件下４～６週間の、植物細胞の培養、
ｂ２） ｂ１）において得られた植物細胞の、減圧下、工程ａ）において得られたアグロバクテリウムを用いたアグロインフィルトレーションであって、好ましくはベンチュリ効果による減圧下で行われる、アグロインフィルトレーション、
ｂ３） ウイルス様粒子を得るために、典型的には３～６日間、ｂ２）において得られた植物細胞を、培養物に戻す工程
を含む、トランスフェクション；
次いで、特には酵素抽出による、得られたウイルス様粒子の抽出及び精製
を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
ａ）強力なプロモーターに作動可能に連結された請求項５に記載の核酸を含む発現ベクターを用いたアグロバクテリアの形質転換；及び
ｂ）工程ａ）において得られたアグロバクテリアを用いた植物細胞のトランスフェクションであって、前記トランスフェクションが、以下の工程：
ｂ１） 噴霧水耕栽培又は水耕栽培条件下、かつＬＥＤ照光下の、好ましくは水耕栽培条件下４～６週間の、植物細胞の培養、
ｂ２） ｂ１）において得られた植物細胞の、減圧下、工程ａ）において得られたアグロバクテリウムを用いたアグロインフィルトレーションであって、好ましくはベンチュリ効果による減圧下で行われる、アグロインフィルトレーション、
ｂ３） ウイルス様粒子を得るために、典型的には３～６日間、ｂ２）において得られた植物細胞を、培養物に戻す工程
を含む、トランスフェクション；
次いで、特には酵素抽出による、得られたウイルス様粒子の抽出及び精製
を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、以下の断片を連続して含む融合タンパク質に関する：
ａ）任意選択で、シグナルペプチド；
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではないコイルドコイルドメイン；及び
ｄ）膜貫通セグメント及び細胞質セグメントからなる細胞膜へのアンカードメイン、好ましくはその少なくとも一部が脂質ラフトの特色を有する細胞膜へのアンカードメイン。
本発明はまた、そのような融合タンパク質を用いて得られたウイルス様粒子（ＶＬＰ：virus-like particle）に関し、ここで前記タンパク質は、その膜に固定されている。
ａ）任意選択で、シグナルペプチド；
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではないコイルドコイルドメイン；及び
ｄ）膜貫通セグメント及び細胞質セグメントからなる細胞膜へのアンカードメイン、好ましくはその少なくとも一部が脂質ラフトの特色を有する細胞膜へのアンカードメイン。
本発明はまた、そのような融合タンパク質を用いて得られたウイルス様粒子（ＶＬＰ：virus-like particle）に関し、ここで前記タンパク質は、その膜に固定されている。
【背景技術】
【0002】
アレルゲン免疫療法は１００年前より前にＮｏｏｎ及びＦｒｅｅｍａｎ（１、２）により報告されているが、脱感作については、注射による処置が徐々に舌下経路による脱感作に置き換わっているという処置剤の投与方法を除くとほとんど進展がない。例えばフランスにおいては、２０１１年１月以来、花粉アレルギーに対しては、舌下錠剤形での脱感作が行われている。これらの脱感作錠の市場への登場は、アレルゲン免疫療法の侵襲性の低減に寄与しているが、その有効性を高めてはいない。実際のところ、これらはまだ「天然の」アレルゲン性抽出物であり、アレルゲンの濃縮率が低く、アレルギー源に含まれるアレルゲンの多様性をあまり体現しておらず、経口治療処置に使用されている。
【0003】
しかしながら、過去１０年にわたって、アレルゲン免疫療法の有効性を向上させ、また治療期間を短縮するために、新たな戦略が提案されている。
これらの脱感作戦略は、以下：
－ その免疫原性を保持しながら、そのアレルゲン性を低減するように修飾された天然のアレルゲン抽出物（Ｈｅｎｍａｒ ｅｔ ａｌ．）
－ 天然型組み換えアレルゲン又は低アレルゲン性となるように修飾された組み換えアレルゲン（Ｖａｌｅｎｔａ ｅｔ ａｌ．）
－ 遊離型又はキャリアタンパク質との融合型の形態のＴ細胞アレルゲンのエピトープに対応するペプチド（Ｌａｒｃｈｅ Ｍ．、Ｐａｔｅｌ Ｄ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）
－ アジュバント、あるいは
－ ナノ粒子又はウイルス様粒子に融合したアレルゲン（Ｋｕｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂａｃｈｍａｎｎ ＭＦ、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＧＴ、Ｈｅｎｍａｒ ｅｔ ａｌ．）
の使用に基づいている。
これらの脱感作戦略は、以下：
－ その免疫原性を保持しながら、そのアレルゲン性を低減するように修飾された天然のアレルゲン抽出物（Ｈｅｎｍａｒ ｅｔ ａｌ．）
－ 天然型組み換えアレルゲン又は低アレルゲン性となるように修飾された組み換えアレルゲン（Ｖａｌｅｎｔａ ｅｔ ａｌ．）
－ 遊離型又はキャリアタンパク質との融合型の形態のＴ細胞アレルゲンのエピトープに対応するペプチド（Ｌａｒｃｈｅ Ｍ．、Ｐａｔｅｌ Ｄ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）
－ アジュバント、あるいは
－ ナノ粒子又はウイルス様粒子に融合したアレルゲン（Ｋｕｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂａｃｈｍａｎｎ ＭＦ、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＧＴ、Ｈｅｎｍａｒ ｅｔ ａｌ．）
の使用に基づいている。
【0004】
しかしながら、修飾型アレルゲン性抽出物を利用する戦略は、アレルゲン源に含まれるアレルゲンの多様性の提示に乏しく、有効性が限られている。
修飾又は非修飾型の組換えアレルゲン又はペプチドは、可溶型のものはアジュバント非存在下では免疫原性が弱い。しかし、多くのアジュバントは忍容性に乏しく、ワクチンと同様に、その使用はアレルゲン免疫療法で推奨されていない。
修飾又は非修飾型の組換えアレルゲン又はペプチドは、可溶型のものはアジュバント非存在下では免疫原性が弱い。しかし、多くのアジュバントは忍容性に乏しく、ワクチンと同様に、その使用はアレルゲン免疫療法で推奨されていない。
【0005】
その一方でナノ粒子又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）に融合したアレルゲンの使用はアレルゲン免疫療法にとって特に魅力的な戦略である。ウイルス様粒子は、ウイルス抗原から自己集合する。これらは遺伝物質を含まないので、非感染性であり、かつ複製能を有しない。その一方で、これらはウイルスの元々の構造を模しており、そのため、免疫系に容易に認識され、非常に効果的に免疫記憶を活性化させることができる。Ｂ型肝炎、パピローマウイルス感染症、又はインフルエンザに対するＶＬＰ系ワクチン（Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｐａａｖｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｄ’Ａｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．）は、ＶＬＰ又はナノ粒子の表面で免疫系に提示されると抗原のワクチン効果を示す。
したがって、ＶＬＰは、抗原を提示する構造、特にはヒトにおける強い免疫応答の誘導を可能にするアレルゲンとして使用される可能性を有している。
ＶＬＰには、ウイルスキャプシドタンパク質から生産されるもの（ＣＰ ＶＬＰ）と、エンベロープウイルスから生産されるもの（Ｅｎｖ ＶＬＰ）という２つの主要なタイプがある。これらの２つのタイプの構造及び組成は大きく異なる。ＣＰ ＶＬＰは、一般的に、天然のウイルスと同様の機構によって宿主細胞において自己集合するキャプシドの組み換えタンパク質を生産することによって生産される。Ｅｎｖ ＶＬＰの産生が起こるのは、エンベロープタンパク質が合成され、宿主細胞の内膜系によって修飾され、次いで細胞膜の脂質ラフトに移行し、そこで濃縮されて、膜／タンパク質アセンブリ全体の細胞外出芽（endomenbrane system）を誘発するときである。生じる粒子、すなわちＶＬＰは、その表面にＥｎｖタンパク質の免疫原性エピトープを担持している。
したがって、ＶＬＰは、抗原を提示する構造、特にはヒトにおける強い免疫応答の誘導を可能にするアレルゲンとして使用される可能性を有している。
ＶＬＰには、ウイルスキャプシドタンパク質から生産されるもの（ＣＰ ＶＬＰ）と、エンベロープウイルスから生産されるもの（Ｅｎｖ ＶＬＰ）という２つの主要なタイプがある。これらの２つのタイプの構造及び組成は大きく異なる。ＣＰ ＶＬＰは、一般的に、天然のウイルスと同様の機構によって宿主細胞において自己集合するキャプシドの組み換えタンパク質を生産することによって生産される。Ｅｎｖ ＶＬＰの産生が起こるのは、エンベロープタンパク質が合成され、宿主細胞の内膜系によって修飾され、次いで細胞膜の脂質ラフトに移行し、そこで濃縮されて、膜／タンパク質アセンブリ全体の細胞外出芽（endomenbrane system）を誘発するときである。生じる粒子、すなわちＶＬＰは、その表面にＥｎｖタンパク質の免疫原性エピトープを担持している。
【0006】
このように、ウイルス様粒子の形態のアレルゲンの使用は、良好な免疫療法のための重要な要件と思われる。主要ダニアレルゲン（Ｄｅｒ ｐ １）又は主要ネコアレルゲン（Ｆｅｌ ｄ １）のペプチドに融合したＶＬＰを用いて得られた結果は、マウス及びヒトにおけるこれらの融合体の非常に高い免疫原性を示している（Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｋｕｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．）。この免疫原性は非常に高いため、これらのＶＬＰの単回注射でＩ型アレルギー反応から保護するのに十分なＩｇＧ産生を誘導することができる。
【0007】
しかしながら、これらのＶＬＰの調製は、残念ながら非常に複雑で、数多くの工程を含み、そのうちのいくつかは標準化が困難である。特に、一方で、ＶＬＰはＥ．ｃｏｌｉにおいてＱｂｅｔａバクテリオファージエンベロープタンパク質の発現後に産生され、他方、アレルゲンは、Ｅ．ｃｏｌｉで組み換え型で発現され、精製され、その後いくつかの工程で可溶化及び再度精製される。これらの２つの構成要素は、一旦生産及び精製されてから、ｉｎ ｖｉｔｒｏで連結される。この製造技術は、明らかに、複雑過ぎ、コストがかかり過ぎ、また、アレルギー患者の治療のために最終生成物を１日で利用できるように標準化するのがあまりに困難である。
【0008】
したがって、それ自体は非免疫原性であり、真核細胞中で自己集合する多価の構造であって、合成が容易であり、かつその表面にタンパク質又はペプチドを担持することができる構造が必要である。このような構造は、アレルギー患者の処置のためだけでなく、他の臨床的状況においても使用できるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本出願人は、自己集合し、かつ治療に使用することができるそのような構造をここに開発した。
特に、かかる構造は：
・その構造自体では、検出不能な免疫原性；
・三量体又は四量体などのオリゴマーへの自己集合能；
・脂質ラフトの特色を有する特定の脂質を含む膜；
・宿主細胞膜タンパク質の含有量が低い膜；
・様々な真核細胞種（酵母、昆虫、又は植物）において高収量で発現される能力；及び
・調製の容易さ。
のユニークな特徴を有している。
特に、かかる構造は：
・その構造自体では、検出不能な免疫原性；
・三量体又は四量体などのオリゴマーへの自己集合能；
・脂質ラフトの特色を有する特定の脂質を含む膜；
・宿主細胞膜タンパク質の含有量が低い膜；
・様々な真核細胞種（酵母、昆虫、又は植物）において高収量で発現される能力；及び
・調製の容易さ。
のユニークな特徴を有している。
【0010】
図の説明は以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A】オリゴマー形成配列に、及び細胞膜（好ましくは脂質ラフトのレベルで）へのアンカー配列に連結されたアレルゲンを産生するためのさまざまな発現カセットの図表示である。 Ａ）最適化された、好ましくはハーモナイズされたＤｅｒ ｐ２（ＤＰ２、配列番号：２２）をコードするｃＤＮＡが、１）タバコキチナーゼのシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ（ＰＳ Ｃｈｉｔ、配列番号：２１）に、２）転写因子（ＧＣＮ４－ｐＩＩ／三量体型Ｂ、－ＧＣＮ４－ＰＬＩ／四量体型Ｃ、－ＧＣＮ４－ＩＺＮ４／グリコシル化型Ｅ、－ＧＣＮ４－ｐＡＡ／七量体型Ｄ）由来の、若しくはコイルドコイル配列を有する任意の他のタンパク質ファミリー（ＳＮＡＲＥ、Ｇｏｌｇｉｎ、Ｆｉｂｒｉｔｉｎ、Ｇ）由来のオリゴマー形成（コイル）配列に、又は擬コイルドコイル合成配列（Ｆ））に、そして、最後に、３）エンベロープウイルスエンベロープタンパク質（インフルエンザＨ５のＴＭ／ＣＴ）由来の（Ｂ～Ｉ）、又は脂質ラフト（「ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ」）に固定されたＩ型タンパク質由来（Ｊ）のアンカー配列に、連結されている。
【図1B】Ｂ）オリゴマー形成又はコイルドコイル配列の構造を示す略図である。この配列は、「ｈｘｘｈｃｘｃ」型の７アミノ酸の繰り返しモチーフからなり、ここで、「ｈ」は疎水性アミノ酸であり、「ｃ」は荷電アミノ酸であり、「ｘ」は任意のアミノ酸である。
【図2】様々な形態のＶＬＰの発現及び産生に使用されるＡｌｌｅｒｇｏＰｕｒプラットフォーム
【図3】図１Ａに記載のタンパク質の産生：ＤＰ２（レーン１）、ＤＰ２－Ｔｒｉ（レーン２－３）、ＤＰ２－Ｔｅｔｒａ（レーン４－５）、又はＦＤＬ－Ｔｒｉ（レーン６－７）タンパク質の発現のために、減圧下でトランスフェクトされた植物から抽出したタンパク質を、Ｄｅｒ ｐ２又はＦｅｌ ｄ１アレルゲンに対する抗体を用いて免疫検出により分析した。免疫検出分析は、予想される重量に対応する分子量のタンパク質の特異的な産生を示す。アグロバクテリアの２つのクローン（Ｃｌ．１及びＣｌ．２）を各コンストラクトについて分析した。
【図4】アレルゲンを担持するＶＬＰのサイズ排除クロマトグラフィーによる精製及び特性分析：ＤＰ２－Ｔｒｉ（パネルＤ）、ＤＰ２－Ｔｅｔｒａ（パネルＥ）、ＤＰ２可溶型（パネルＦ）、ＦＤ１－Ｔｒｉ（パネルＧ）、ＤＰ２ｔｒｉＤＧＣＮ４（ＧＣＮ４欠失、パネルＨ）、ＤＰ２ｔｒｉ－Ｓｙｎ（ＧＣＮ４置換、パネルＩ）、及びＤＰ２ｔｒｉ－ＫＥＩ（ＧＣＮ４置換、パネルＪ）を産生する葉のタンパク質抽出物を、較正済みＳ－５００／ＨＲカラムにてクロマトグラフィーで分離した。各画分の総可溶性タンパク質含量を分光法により評価し（パネルＡ）、そして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後、クマシーブルーで染色した（パネルＢ）。溶出画分のアレルゲン含量を抗Ｄｅｒ ｐ２又は抗Ｆｅｌ ｄ１抗体を使用した免疫検出により明らかにした。Ｈ５Ｎ１由来のＶＬＰの形態でヘマグルチニンを産生する葉のタンパク質抽出物を較正済みＳ－５００／ＨＲカラムにてゲルろ過により分離し（パネルＣ）、対照として使用した。
【図5】電子顕微鏡及びネガティブ染色による評価を用いた単離アレルゲンを担持するＶＬＰの特性評価：アレルゲンを担持するＶＬＰは、インフルエンザビリオンについて報告されているものと非常によく似た形態及びサイズを有する。バーは５０ｎｍを表す。
【図6】Ｄｅｒ ｐ２に対するアレルギーを有する患者由来の血清を用いた、ＶＬＰの形態で産生されたアレルゲンの反応性：ＤＰ２（レーン１）、ＤＰ２－Ｔｒｉ（レーン２）、及びＤＰ２－Ｔｅｔｒａ（レーン３）タンパク質の発現のために減圧下でトランスフェクトされた植物から抽出したタンパク質を、Ｄｅｒ ｐ２に対するアレルギーを有する患者由来の血清を用いた免疫検出により分析した。免疫検出分析はＶＬＰに担持されるアレルゲンが、患者血清のＩｇＥにより認識されることを示す。
【図7】大規模ＶＬＰ生産の方法
【図8A】本発明に従ってアセンブリしたＶＬＰ及び融合タンパク質の構造：Ａ）本発明に係るＶＬＰの構造。ＶＬＰは、本発明に係る融合タンパク質が付着している細胞膜エンベロープから構成される。したがって、目的のタンパク質又はペプチド（例えば、アレルゲン）がその表面に露出している。
【図8B】Ｂ）ＶＬＰ内にアセンブリされた本発明に係る融合タンパク質の構造。オリゴマー形成配列は、融合タンパク質が、ＶＬＰの表面上に、多量体（polymer）（例えば、この場合、アレルゲン，Ａ）を形成できるようにする。
【図9A】ＶＬＰに結合した抗原は、非常に強い免疫原性を有するが、アレルゲン性を有しない。 パネルＡ：Ｆｌｅｘｉｖｅｎｔ法による、Ｄｅｒ ｐ２アレルゲンにより誘導される気道過敏性の評価。マウス（ｎ＝１０／群）をＤｅｒ ｐ２アレルゲン（溶液の形態（ＤＰ２－Ａｌｕｍ）、又はＶＬＰの形態（ＤＰ２－ＶＬＰ／ａｌｕｍ及びＤＰ２－ＶＬＰ／生理食塩水（saline）））により感作し、ダニ抽出物による負荷をかけた。最後の負荷の２４時間後に、吸入メタコリンに対する気道過敏性をＦｌｅｘｉｖｅｎｔ法によって測定した。ＶＬＰの形態のアレルゲンの存在下で誘発された肺反応性は対照マウスと同等であった。
【図9B】パネルＢ：肺の気管支肺胞肺洗浄液（ＢＡＬ）により採取した気道における炎症細胞の計数。マウス（ｎ＝１０／群）をＤｅｒ ｐ２アレルゲン（溶液の形態（ＤＰ２－Ａｌｕｍ）、又はＶＬＰの形態（ＤＰ２－ＶＬＰ／ａｌｕｍ及びＤＰ２－ＶＬＰ／生理食塩水））で感作し、ダニ抽出物による負荷をかけた。最後の負荷の２４時間後に、ＢＡＬ細胞を回収し、細胞を計数した（好酸球；好中球；マクロファージ；リンパ球）。溶液形態のＤｅｒ ｐ２アレルゲンが投与されたマウスでは、好中球が非常に優勢であった。
【図9C】パネルＣ：Ｄｅｒ ｐ２特異的ＩｇＧのアッセイ。マウス（ｎ＝１０／群）をＤｅｒ ｐ２アレルゲン（溶液の形態（ＤＰ２－Ａｌｕｍ）、又はＶＬＰの形態（ＤＰ２－ＶＬＰ／ａｌｕｍ及びＤＰ２－ＶＬＰ／生理食塩水）により感作し、ダニ抽出物による負荷をかけた。最後の負荷の２４時間後に、ＢＡＬ液及び心臓穿刺により採取した血清中のＩｇＧを測定した。ＤＰ２－ＶＬＰを注射されたマウスは、アジュバントの有無にかかわらず、可溶性Ｄｅｒ ｐ２を投与されたマウスよりも１０００倍高いＩｇＧ力価を有する。
【発明を実施するための形態】
【0012】
第１の態様によれば、本発明は、以下の断片を連続して含むＩ型又はＩＩ型の膜貫通融合タンパク質に関する：
ａ）任意選択で、シグナルペプチド；
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではないコイルドコイルドメイン（又はオリゴマー形成配列）；及び、
ｄ）膜貫通セグメント及び細胞質セグメントからなる、細胞膜、特には脂質ラフトへのアンカードメイン。
ａ）任意選択で、シグナルペプチド；
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではないコイルドコイルドメイン（又はオリゴマー形成配列）；及び、
ｄ）膜貫通セグメント及び細胞質セグメントからなる、細胞膜、特には脂質ラフトへのアンカードメイン。
【0013】
このような融合タンパク質は、真核細胞中で発現されると、ウイルス表面タンパク質のように挙動する。
いかなる理論に束縛されるものではないが、このタンパク質は、小胞体で合成され、次いでゴルジ体を介して細胞膜へ移行する。この膜貫通型融合タンパク質は、細胞膜の特定の領域、好ましくは脂質ラフトにいったん到達すると、前記膜の湾曲を引き起こし、最終的に出芽を形成し、これが細胞膜から分離して細胞外空間に放出される。出芽の間に、コイルドコイルドメイン（又はオリゴマー形成配列）に担持される目的のタンパク質又はペプチドは、新たに形成された粒子の外表面に露出される。貫通ドメインは、膜に固定されたままであり、表面には露出しない。これにより、その組成が好ましくは脂質ラフトの特色を有する細胞膜を含む、図８Ａに示すウイルス様粒子（ＶＬＰ）が得られ、ここで、本発明に係る融合タンパク質はそのアンカードメインのレベルで付着しており、目的のタンパク質又はペプチドが（そのオリゴマー形成配列により）オリゴマー型でその表面に露出している。
ＶＬＰの表面にアセンブルされた融合タンパク質の構造を図８Ｂに示す。
いかなる理論に束縛されるものではないが、このタンパク質は、小胞体で合成され、次いでゴルジ体を介して細胞膜へ移行する。この膜貫通型融合タンパク質は、細胞膜の特定の領域、好ましくは脂質ラフトにいったん到達すると、前記膜の湾曲を引き起こし、最終的に出芽を形成し、これが細胞膜から分離して細胞外空間に放出される。出芽の間に、コイルドコイルドメイン（又はオリゴマー形成配列）に担持される目的のタンパク質又はペプチドは、新たに形成された粒子の外表面に露出される。貫通ドメインは、膜に固定されたままであり、表面には露出しない。これにより、その組成が好ましくは脂質ラフトの特色を有する細胞膜を含む、図８Ａに示すウイルス様粒子（ＶＬＰ）が得られ、ここで、本発明に係る融合タンパク質はそのアンカードメインのレベルで付着しており、目的のタンパク質又はペプチドが（そのオリゴマー形成配列により）オリゴマー型でその表面に露出している。
ＶＬＰの表面にアセンブルされた融合タンパク質の構造を図８Ｂに示す。
【0014】
第２の態様によれば、本発明は、以下を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）から構成される：
－ 少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜からなるエンベロープ；並びに、
－ 前記膜（すなわち、前記エンベロープ）中に固定された少なくとも１種のＩ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、以下の断片：
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではないコイルドコイルドメイン（又はオリゴマー形成配列）；及び、
ｄ）膜貫通セグメント及び細胞質セグメントからなる細胞膜へのアンカードメイン、好ましくはその少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜へのアンカードメイン
を連続して含み、断片ｂ）及びｃ）はＶＬＰの表面に露出している。
本発明に係るＶＬＰにおいて、融合タンパク質は、そのアンカードメインｄ）によって、膜中（したがってエンベロープ内）に固定されている。
－ 少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜からなるエンベロープ；並びに、
－ 前記膜（すなわち、前記エンベロープ）中に固定された少なくとも１種のＩ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、以下の断片：
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではないコイルドコイルドメイン（又はオリゴマー形成配列）；及び、
ｄ）膜貫通セグメント及び細胞質セグメントからなる細胞膜へのアンカードメイン、好ましくはその少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜へのアンカードメイン
を連続して含み、断片ｂ）及びｃ）はＶＬＰの表面に露出している。
本発明に係るＶＬＰにおいて、融合タンパク質は、そのアンカードメインｄ）によって、膜中（したがってエンベロープ内）に固定されている。
【0015】
「ウイルス様粒子（又はＶＬＰ）」という用語は、一又は複数のタンパク質が固定されている細胞質エンベロープからなるナノ粒子であって、遺伝物質を含まず、非感染性であり複製能を有さず、かつ元のウイルスの構造によく似た構造へと自己集合する、ナノ粒子を意味することが意図される。ＶＬＰの構造は図８Ａに示されているが、ここで膜エンベロープは、固定されかつその表面タンパク質に露出されているタンパク質を含む。
【0016】
本発明に係るそのようなウイルス様粒子は、上に示したような有利な特性を有する。さらに、融合タンパク質の目的のタンパク質又はペプチドｂ）がアレルゲン若しくはアレルゲン断片、又はより一般的には抗原である場合、ウイルス様粒子は、抗原提示に有効であり、免疫系細胞の活性化のための高い能力を有する。これは、アレルギー患者の効果的な脱感作を可能にする。加えて、本発明に係るウイルス様粒子は、アレルゲン特異的ＩｇＧの産生を刺激し、一方それと同時に好塩基球へのアクセシビリティを最小限に抑える。
本発明に係るＶＬＰは、典型的には、１２０～２００ｎｍの直径を有する。
本発明に係るＶＬＰは、典型的には、１２０～２００ｎｍの直径を有する。
【0017】
第３の態様によれば、本発明は、真核細胞、好ましくは植物細胞内での本発明に係る融合タンパク質の発現を含む、ウイルス様粒子の製造方法に関する。
実際、好ましくは、開発された方法は、本発明に係る融合タンパク質の植物細胞における発現を含む。これらの融合タンパク質は、小胞体におけるその合成及び植物細胞の分泌内膜系における輸送後に、細胞膜に組み込まれると小胞を形成することができる。このプロセスは、感染した細胞の表面におけるウイルスの出芽と同じである。
この技術の主要な利点の１つは簡便であることであり、このことは、融合タンパク質の発現及び抽出後、その表面に目的のアレルゲンを担持するＶＬＰが好ましくは２段階で精製されるためである。植物内（in planta）で形成されたＶＬＰは、その表面に一定密度のアレルゲン又はアレルゲン断片を有する。そのため生成物の品質を容易に標準化することができ、その組成は一定となる。
実際、好ましくは、開発された方法は、本発明に係る融合タンパク質の植物細胞における発現を含む。これらの融合タンパク質は、小胞体におけるその合成及び植物細胞の分泌内膜系における輸送後に、細胞膜に組み込まれると小胞を形成することができる。このプロセスは、感染した細胞の表面におけるウイルスの出芽と同じである。
この技術の主要な利点の１つは簡便であることであり、このことは、融合タンパク質の発現及び抽出後、その表面に目的のアレルゲンを担持するＶＬＰが好ましくは２段階で精製されるためである。植物内（in planta）で形成されたＶＬＰは、その表面に一定密度のアレルゲン又はアレルゲン断片を有する。そのため生成物の品質を容易に標準化することができ、その組成は一定となる。
【0018】
本発明に係るＩ型又はＩＩ型の膜貫通融合タンパク質は、以下の断片を連続して含む：
ａ）任意選択で、シグナルペプチド；
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではないコイルドコイルドメイン（又はオリゴマー形成配列）；及び、
ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる、細胞膜へのアンカードメイン、好ましくは、少なくとも一部が脂質ラフトの特色を有する細胞膜へのアンカードメイン。
ａ）任意選択で、シグナルペプチド；
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではないコイルドコイルドメイン（又はオリゴマー形成配列）；及び、
ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる、細胞膜へのアンカードメイン、好ましくは、少なくとも一部が脂質ラフトの特色を有する細胞膜へのアンカードメイン。
【0019】
「融合タンパク質」という用語は、ｂ）からｄ）、及び任意にａ）のさまざまな断片を含むタンパク質を意味することが意図され、前記断片は異なる起源を有する。言い換えれば、ｂ）からｄ）、及び任意にａ）の断片は、天然に存在する場合は融合して存在することは決してない。
「連続して（successively）」という用語は、断片ａ）からｄ）（又はｂ）からｄ））が、ａ）－ｂ）－ｃ）－ｄ）（又はｂ）－ｃ）－ｄ）若しくはｄ）－ｃ）－ｂ））の順番で存在することを意味することが意図される。これらの様々な断片は互いに直接融合するか、あるいは１又は複数のリンカーを介して互いに融合することができる。好ましくは、本発明に係る融合タンパク質は、配列ｂ）とｃ）の間、及び／又は配列ｃ）とｄ）の間に存在するリンカーを含む。
融合タンパク質は、最初は断片ａ）～ｄ）を含み、ここでシグナルペプチドの存在は、前記タンパク質の小胞体への正確な輸送（trafficking）を可能にする。シグナルペプチドはその後切断される。したがって、本発明に係るＶＬＰの出芽及び形成中は、融合タンパク質はもはやシグナルペプチドａ）を含まず、断片ｂ）からｄ）のみを含む。したがって、本発明に係るＶＬＰはシグナルペプチドａ）を含まない。一方、以下の断片ｂ）からｄ）の記載は、ＶＬＰに当てはまる。
「連続して（successively）」という用語は、断片ａ）からｄ）（又はｂ）からｄ））が、ａ）－ｂ）－ｃ）－ｄ）（又はｂ）－ｃ）－ｄ）若しくはｄ）－ｃ）－ｂ））の順番で存在することを意味することが意図される。これらの様々な断片は互いに直接融合するか、あるいは１又は複数のリンカーを介して互いに融合することができる。好ましくは、本発明に係る融合タンパク質は、配列ｂ）とｃ）の間、及び／又は配列ｃ）とｄ）の間に存在するリンカーを含む。
融合タンパク質は、最初は断片ａ）～ｄ）を含み、ここでシグナルペプチドの存在は、前記タンパク質の小胞体への正確な輸送（trafficking）を可能にする。シグナルペプチドはその後切断される。したがって、本発明に係るＶＬＰの出芽及び形成中は、融合タンパク質はもはやシグナルペプチドａ）を含まず、断片ｂ）からｄ）のみを含む。したがって、本発明に係るＶＬＰはシグナルペプチドａ）を含まない。一方、以下の断片ｂ）からｄ）の記載は、ＶＬＰに当てはまる。
【0020】
「膜に固定されたＩ型膜貫通タンパク質」という表現は、そのＮ末端が細胞外、Ｃ末端が細胞質にある膜貫通タンパク質を意味することが意図される。したがって、Ｉ型膜貫通タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、任意選択でシグナルペプチドａ）、次いで目的のタンパク質又はペプチドｂ）、次いでコイルドコイルドメインｃ）、そして最後にアンカードメインｄ）を含む。
「膜に固定されたＩＩ型膜貫通タンパク質」という表現は、そのＣ末端が細胞外、Ｎ末端が細胞質にある膜貫通タンパク質を意味することが意図される。したがって、ＩＩ型膜貫通タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、アンカードメインｄ）、次いでコイルドコイルドメインｃ）、そして最後に目的のタンパク質又はペプチドｂ）を含む。
好ましくは、本発明に係る融合タンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質である。
「膜に固定されたＩＩ型膜貫通タンパク質」という表現は、そのＣ末端が細胞外、Ｎ末端が細胞質にある膜貫通タンパク質を意味することが意図される。したがって、ＩＩ型膜貫通タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、アンカードメインｄ）、次いでコイルドコイルドメインｃ）、そして最後に目的のタンパク質又はペプチドｂ）を含む。
好ましくは、本発明に係る融合タンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質である。
【0021】
シグナルペプチドａ）
シグナルペプチドａ）は、真核細胞に認識される任意のシグナルペプチドである。
好ましくは、シグナルペプチドはペクタートリアーゼの天然型シグナルペプチド及びタバコキチナーゼペプチドのシグナルペプチドから選択される。
好ましくは、シグナルペプチドは、配列番号：２１のタバコキチナーゼのものである。
シグナルペプチドａ）は、真核細胞に認識される任意のシグナルペプチドである。
好ましくは、シグナルペプチドはペクタートリアーゼの天然型シグナルペプチド及びタバコキチナーゼペプチドのシグナルペプチドから選択される。
好ましくは、シグナルペプチドは、配列番号：２１のタバコキチナーゼのものである。
【0022】
目的のタンパク質又はペプチドｂ）
本発明に係る使用され得る目的のタンパク質又はペプチドは、治療又は予防の目的の任意のアミノ酸配列であってよい。
本発明に係る使用され得る目的のタンパク質又はペプチドは、ウイルス様粒子の表面に完全に又は部分的に露出されることによる利点を有し、かつ、免疫細胞によって認識されることが可能で、かつ／若しくは生体反応を誘発することが可能な、任意のアミノ酸配列であってよい。
「目的のタンパク質」という用語は、少なくとも５１個、好ましくは少なくとも１００個、好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸を有する配列を意味することが意図される。
「目的のペプチド」という用語は、２～５０個のアミノ酸、好ましくは５～４５個のアミノ酸を含む配列を意味することが意図される。
本発明に係る使用され得るタンパク質又はペプチドは、好ましくは以下から選択される：
・アレルゲン及びそれらの断片。このようなタンパク質又はペプチドを含むウイルス様粒子の主要な用途は、免疫療法である。
・ウイルスタンパク質及びそれらの断片。このようなタンパク質又はペプチドを含むウイルス様粒子の主な利点は、ワクシネーションである。
・細胞表面タンパク質及びそれらの断片。このようなタンパク質又はペプチドを含むウイルス様粒子の主な利点は、特に、免疫活性の回復であり得る。
・慢性又は神経変性疾患において蓄積するタンパク質及びペプチド。
・高血圧に関与するタンパク質及びペプチド、例えば、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ及びアンジオテンシンＩＩ。
・免疫グロブリン、それらの断片（Ｆａｂ断片など）、及びそれらの誘導体（ｓｃＦｖなど）、
・サイトカイン及びそれらの断片、並びに
・ホルモン及びそれらの断片。
本発明に係る使用され得る目的のタンパク質又はペプチドは、治療又は予防の目的の任意のアミノ酸配列であってよい。
本発明に係る使用され得る目的のタンパク質又はペプチドは、ウイルス様粒子の表面に完全に又は部分的に露出されることによる利点を有し、かつ、免疫細胞によって認識されることが可能で、かつ／若しくは生体反応を誘発することが可能な、任意のアミノ酸配列であってよい。
「目的のタンパク質」という用語は、少なくとも５１個、好ましくは少なくとも１００個、好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸を有する配列を意味することが意図される。
「目的のペプチド」という用語は、２～５０個のアミノ酸、好ましくは５～４５個のアミノ酸を含む配列を意味することが意図される。
本発明に係る使用され得るタンパク質又はペプチドは、好ましくは以下から選択される：
・アレルゲン及びそれらの断片。このようなタンパク質又はペプチドを含むウイルス様粒子の主要な用途は、免疫療法である。
・ウイルスタンパク質及びそれらの断片。このようなタンパク質又はペプチドを含むウイルス様粒子の主な利点は、ワクシネーションである。
・細胞表面タンパク質及びそれらの断片。このようなタンパク質又はペプチドを含むウイルス様粒子の主な利点は、特に、免疫活性の回復であり得る。
・慢性又は神経変性疾患において蓄積するタンパク質及びペプチド。
・高血圧に関与するタンパク質及びペプチド、例えば、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ及びアンジオテンシンＩＩ。
・免疫グロブリン、それらの断片（Ｆａｂ断片など）、及びそれらの誘導体（ｓｃＦｖなど）、
・サイトカイン及びそれらの断片、並びに
・ホルモン及びそれらの断片。
【0023】
好ましくは、本発明に係る使用され得る目的のタンパク質又はペプチドはアレルゲンである。好ましくは、屋内性ダニ類、例えばコナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）又はシワダニ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ ｍａｎｅｉ）から生じる呼吸器アレルギーの要因となるアレルゲン、貯蔵庫ダニ、例えばネッタイタマニクダニ（Ｂｌｏｍｉａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来のアレルゲン、アシブトコナダニ（Ａｃａｒｕｓ ｓｉｒｏ）種のダニ（あるいは、Ｔｙｒｏｇｌｙｐｈｕｓ ｆａｒｉｎａｅとしても知られている）由来のアレルゲン、ゴキブリアレルゲン、草木の花粉アレルゲン、動物（ネコ、イヌ、ウマ）アレルゲン、カビアレルゲン、接触アレルギーの要因となるアレルゲン、例えばパラゴムノキラテックス、あるいは食物アレルギーの要因となるアレルゲン（乳、卵、魚、果物）から選択される。
コナヒョウヒダニアレルゲンの中でも、Ｄｅｒ ｆ １０、Ｄｅｒ ｆ １１、Ｄｅｒ ｆ １３、Ｄｅｒ ｆ １４、Ｄｅｒ ｆ １５、Ｄｅｒ ｆ １６、Ｄｅｒ ｆ １７、Ｄｅｒ ｆ １８、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０１、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０２、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０３、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０４、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０５、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０６、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０７、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０８、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０９、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１０、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１１、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１２、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１３、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１４、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１５、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１６、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１７、Ｄｅｒ ｆ ２０、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ４、Ｄｅｒ ｆ ５、Ｄｅｒ ｆ ６、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ ８、Ｄｅｒ ｆ ９、及びＤｅｒ ｆ ＨＳＰ７０に言及され得る。
ヤケヒョウヒダニアレルゲンの中でも、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ １５、Ｄｅｒ ｐ １８、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０２、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０３、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０４、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０５、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０６、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０７、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０８、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０９、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１０、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１１、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１２、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１３、Ｄｅｒ ｐ ２０、Ｄｅｒ ｐ ２１、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ６、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９に言及され得る。
動物アレルゲンのうち、前記動物の精液由来、上皮由来、乳由来、唾液由来、汗由来、及び／又は尿由来のアレルゲンに言及され得る。動物は、好ましくは、イヌ、ネコ、又はウマである。
ネコ（Felis domesticus）アレルゲンの中でも、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ １．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ２．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ３．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ４．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ５ 、Ｆｅｌ ｄ ５．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ６ 、Ｆｅｌ ｄ ６．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ７、Ｆｅｌ ｄ ７．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ８、Ｆｅｌ ｄ ８．０１０１、Ｆｅｌ ｄ Ｈｐ、Ｆｅｌ ｄ ＩｇＧ 又はＦｅｌ ｄ Ｓ１００に言及され得る。
イヌ（Canis familiaris）アレルゲンの中でも、Ｃａｎ ｆ １、Ｃａｎ ｆ １．０１０１、Ｃａｎ ｆ ２、Ｃａｎ ｆ ２．０１０１、Ｃａｎ ｆ ３、Ｃａｎ ｆ ３．０１０１、Ｃａｎ ｆ ４、Ｃａｎ ｆ ４．０１０１、Ｃａｎ ｆ ５、Ｃａｎ ｆ ５．０１０１、Ｃａｎ ｆ ６、Ｃａｎ ｆ ６．０１０１、Ｃａｎ ｆ ７、Ｃａｎ ｆ ７．０１０１、Ｃａｎ ｆ ８、Ｃａｎ ｆ Ｆｅｌｄ１－ｌｉｋｅ、Ｃａｎ ｆ Ｈｏｍｓ２－ｌｉｋｅ、Ｃａｎ ｆ Ｐｈｏｓｖｉｔｉｎ、又はＣａｎ ｆ ＴＣＴＰに言及され得る。
ウマ（Equus caballus）アレルゲンの中でも、Ｅｑｕ ｃ １、Ｅｑｕ ｃ １．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ２、Ｅｑｕ ｃ ２．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ２．０１０２、Ｅｑｕ ｃ ３、Ｅｑｕ ｃ ３．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ４、Ｅｑｕ ｃ ４．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ＰＲＶＢ、Ｅｑｕ ｃ １０、Ｅｑｕ ｃ １１、Ｅｑｕ ｃ １２、Ｅｑｕ ｃ ８、Ｅｑｕ ｃ ９、Ｅｑｕ ｃ ＡＬＡ、又はＥｑｕ ｃ ＢＬＧに言及され得る。
コナヒョウヒダニアレルゲンの中でも、Ｄｅｒ ｆ １０、Ｄｅｒ ｆ １１、Ｄｅｒ ｆ １３、Ｄｅｒ ｆ １４、Ｄｅｒ ｆ １５、Ｄｅｒ ｆ １６、Ｄｅｒ ｆ １７、Ｄｅｒ ｆ １８、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０１、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０２、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０３、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０４、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０５、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０６、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０７、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０８、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０９、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１０、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１１、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１２、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１３、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１４、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１５、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１６、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１７、Ｄｅｒ ｆ ２０、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ４、Ｄｅｒ ｆ ５、Ｄｅｒ ｆ ６、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ ８、Ｄｅｒ ｆ ９、及びＤｅｒ ｆ ＨＳＰ７０に言及され得る。
ヤケヒョウヒダニアレルゲンの中でも、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ １５、Ｄｅｒ ｐ １８、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０２、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０３、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０４、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０５、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０６、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０７、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０８、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０９、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１０、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１１、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１２、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１３、Ｄｅｒ ｐ ２０、Ｄｅｒ ｐ ２１、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ６、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９に言及され得る。
動物アレルゲンのうち、前記動物の精液由来、上皮由来、乳由来、唾液由来、汗由来、及び／又は尿由来のアレルゲンに言及され得る。動物は、好ましくは、イヌ、ネコ、又はウマである。
ネコ（Felis domesticus）アレルゲンの中でも、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ １．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ２．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ３．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ４．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ５ 、Ｆｅｌ ｄ ５．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ６ 、Ｆｅｌ ｄ ６．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ７、Ｆｅｌ ｄ ７．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ８、Ｆｅｌ ｄ ８．０１０１、Ｆｅｌ ｄ Ｈｐ、Ｆｅｌ ｄ ＩｇＧ 又はＦｅｌ ｄ Ｓ１００に言及され得る。
イヌ（Canis familiaris）アレルゲンの中でも、Ｃａｎ ｆ １、Ｃａｎ ｆ １．０１０１、Ｃａｎ ｆ ２、Ｃａｎ ｆ ２．０１０１、Ｃａｎ ｆ ３、Ｃａｎ ｆ ３．０１０１、Ｃａｎ ｆ ４、Ｃａｎ ｆ ４．０１０１、Ｃａｎ ｆ ５、Ｃａｎ ｆ ５．０１０１、Ｃａｎ ｆ ６、Ｃａｎ ｆ ６．０１０１、Ｃａｎ ｆ ７、Ｃａｎ ｆ ７．０１０１、Ｃａｎ ｆ ８、Ｃａｎ ｆ Ｆｅｌｄ１－ｌｉｋｅ、Ｃａｎ ｆ Ｈｏｍｓ２－ｌｉｋｅ、Ｃａｎ ｆ Ｐｈｏｓｖｉｔｉｎ、又はＣａｎ ｆ ＴＣＴＰに言及され得る。
ウマ（Equus caballus）アレルゲンの中でも、Ｅｑｕ ｃ １、Ｅｑｕ ｃ １．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ２、Ｅｑｕ ｃ ２．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ２．０１０２、Ｅｑｕ ｃ ３、Ｅｑｕ ｃ ３．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ４、Ｅｑｕ ｃ ４．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ＰＲＶＢ、Ｅｑｕ ｃ １０、Ｅｑｕ ｃ １１、Ｅｑｕ ｃ １２、Ｅｑｕ ｃ ８、Ｅｑｕ ｃ ９、Ｅｑｕ ｃ ＡＬＡ、又はＥｑｕ ｃ ＢＬＧに言及され得る。
【0024】
これらのアレルゲンの配列は特にＵｎｉｐｒｏｔデータベースにおいて知られている。
【0025】
好ましくは、本発明に係る使用され得る目的のタンパク質又はペプチドは、配列番号：２２（Ｄｅｒ ｐ ２の成熟配列）又は配列番号：３２（ネコアレルゲンＦｅｌ ｄ １のＣＨ１鎖の配列）のアレルゲンである。
【0026】
好ましくは、本発明に係る使用され得る目的のタンパク質又はペプチドは、ウイルスタンパク質又はその断片である。
ウイルスタンパク質の中でも特に、ジカ（Zika）ウイルスエンベロープタンパク質、そしてまたインフルエンザウイルスタンパク質、例えば、ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼに言及され得る。好ましくは、本発明に係る使用され得る目的のタンパク質又はペプチドは、配列番号：３４のヘマグルチニンＨＡ１鎖、又は配列番号：３５のジカウイルスエンベロープタンパク質である。
ウイルスタンパク質の中でも特に、ジカ（Zika）ウイルスエンベロープタンパク質、そしてまたインフルエンザウイルスタンパク質、例えば、ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼに言及され得る。好ましくは、本発明に係る使用され得る目的のタンパク質又はペプチドは、配列番号：３４のヘマグルチニンＨＡ１鎖、又は配列番号：３５のジカウイルスエンベロープタンパク質である。
【0027】
好ましくは、本発明に係る使用され得る目的のタンパク質又はペプチドは、細胞表面タンパク質又はその断片である。
表面タンパク質の中でも特に、腫瘍表面抗原に言及され得る。そのようなタンパク質及びその断片は、特に、例えば腫瘍治療において、免疫活性の回復に役立つ。
表面タンパク質の中でも特に、腫瘍表面抗原に言及され得る。そのようなタンパク質及びその断片は、特に、例えば腫瘍治療において、免疫活性の回復に役立つ。
【0028】
好ましくは、本発明に係る使用され得る目的のタンパク質又はペプチドは、神経変性又は慢性疾患において蓄積されるタンパク質である。
慢性疾患において蓄積されるペプチドのうち特に、アルツハイマー病に関与するβアミロイドペプチド、パーキンソン病に関与するアルファ－シヌクレインタンパク質、そしてまた関節リウマチに関与するＣＤ２０、ＴＮＦ－アルファ、又はＨＬＡ（ヒト白血球抗原）タンパク質に言及され得る。
慢性疾患において蓄積されるペプチドのうち特に、アルツハイマー病に関与するβアミロイドペプチド、パーキンソン病に関与するアルファ－シヌクレインタンパク質、そしてまた関節リウマチに関与するＣＤ２０、ＴＮＦ－アルファ、又はＨＬＡ（ヒト白血球抗原）タンパク質に言及され得る。
【0029】
コイルドコイルドメイン（又はオリゴマー形成配列）ｃ）
コイルドコイルドメイン、あるいはオリゴマー形成配列は、互いに平行であり、いくつかの特徴的な生物学的機能を有する組織化マトリックスを形成する、いくつかのセンス又はアンチセンスアルファ－ヘリックスモチーフを含む。これらのドメインは、大部分の生物において、遍在しており、かつ多様な種類のタンパク質に特異的なドメインとして見いだされる。起源の異なるコイルドコイルドメインをアセンブルして、ダイマーからヘプタマーにおよぶ形状を形成することができ；いくつかのコイルドコイルドメインは、それらのアミノ酸配列の点変異によって異なる重合レベルとなる。
コイルドコイルドメインは、典型的には、「ｈｘｘｈｃｘｃ」型の７アミノ酸の繰り返しモチーフからなり、ここで、「ｈ」は疎水性アミノ酸であり、「ｃ」は荷電アミノ酸であり、そして「ｘ」は任意のアミノ酸である。
コイルドコイルドメイン、あるいはオリゴマー形成配列は、互いに平行であり、いくつかの特徴的な生物学的機能を有する組織化マトリックスを形成する、いくつかのセンス又はアンチセンスアルファ－ヘリックスモチーフを含む。これらのドメインは、大部分の生物において、遍在しており、かつ多様な種類のタンパク質に特異的なドメインとして見いだされる。起源の異なるコイルドコイルドメインをアセンブルして、ダイマーからヘプタマーにおよぶ形状を形成することができ；いくつかのコイルドコイルドメインは、それらのアミノ酸配列の点変異によって異なる重合レベルとなる。
コイルドコイルドメインは、典型的には、「ｈｘｘｈｃｘｃ」型の７アミノ酸の繰り返しモチーフからなり、ここで、「ｈ」は疎水性アミノ酸であり、「ｃ」は荷電アミノ酸であり、そして「ｘ」は任意のアミノ酸である。
【0030】
本発明に係る使用され得るコイルドコイルドメインは、ウイルス起源のものではなく；すなわち、ウイルス性ではない。
本発明に従って使用され得るコイルドコイルドメインのうち、好ましくはコルテキシリン（ｃｏｒｔｅｘｉｌｌｉｎｅ）、ビメンチン、テトラブラチオン（ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ）、ゴルジン（ｇｏｌｇｉｎｓ）、「可溶性Ｎ－エチルマレイミド感受性因子（ＮＳＦ：Ｎ－ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）付着タンパク質受容体」あるいはＳＮＡＲＥスーパーファミリー、あるいは、ＧＣＮ４などの転写因子又はその変異体、例えばＧＣＮ４－ｐＬＩ若しくはＧＣＮ４－ＰＩＩに言及されよう。
好ましくは、コイルドコイルドメインは、ＧＣＮ４、ＧＣＮ４－ｐＬＩ、又はＧＣＮ４－ＰＩＩ転写因子由来のものである。
好ましくは、コイルドコイルドメインは、配列番号：２４（ＧＣＮＡ－ｐＩＩ 酵母ＧＣＮ４転写因子の三量体形成配列）、配列番号：２７（ＧＣＮ４－ｐＬＩ 酵母ＧＣＮ四量体因子の四量体形成配列）、配列番号：２８（ＧＣＮ４－ｐＡＡ 酵母ＧＣＮ４転写因子の七量体形成配列）、配列番号：２９（ＩＺＮ４ 酵母ＧＣＮ４転写因子のグリコシル化オリゴマー形成配列）、配列番号：３３（擬コイルドコイル合成配列）、及び配列番号：３０（ＳＮＡＲＥオリゴマー形成配列）から選択される。
本発明に従って使用され得るコイルドコイルドメインのうち、好ましくはコルテキシリン（ｃｏｒｔｅｘｉｌｌｉｎｅ）、ビメンチン、テトラブラチオン（ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ）、ゴルジン（ｇｏｌｇｉｎｓ）、「可溶性Ｎ－エチルマレイミド感受性因子（ＮＳＦ：Ｎ－ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）付着タンパク質受容体」あるいはＳＮＡＲＥスーパーファミリー、あるいは、ＧＣＮ４などの転写因子又はその変異体、例えばＧＣＮ４－ｐＬＩ若しくはＧＣＮ４－ＰＩＩに言及されよう。
好ましくは、コイルドコイルドメインは、ＧＣＮ４、ＧＣＮ４－ｐＬＩ、又はＧＣＮ４－ＰＩＩ転写因子由来のものである。
好ましくは、コイルドコイルドメインは、配列番号：２４（ＧＣＮＡ－ｐＩＩ 酵母ＧＣＮ４転写因子の三量体形成配列）、配列番号：２７（ＧＣＮ４－ｐＬＩ 酵母ＧＣＮ四量体因子の四量体形成配列）、配列番号：２８（ＧＣＮ４－ｐＡＡ 酵母ＧＣＮ４転写因子の七量体形成配列）、配列番号：２９（ＩＺＮ４ 酵母ＧＣＮ４転写因子のグリコシル化オリゴマー形成配列）、配列番号：３３（擬コイルドコイル合成配列）、及び配列番号：３０（ＳＮＡＲＥオリゴマー形成配列）から選択される。
【0031】
細胞膜へのアンカードメイン（又は膜貫通ドメイン）ｄ）
膜貫通ドメインは、細胞膜成分の特定の脂質と相互作用する親油性アミノ酸の短い配列である。好ましくは、細胞膜は、少なくとも一部に脂質ラフトの特色を有する部分を含む。
これらのアンカードメインは、ウイルスの表面タンパク質だけでなく、生細胞の膜中に天然に組み込まれているタンパク質にも共通している（ただし、コンセンサス配列によってではない）。各膜貫通ドメインは、細胞膜の変形（bending）と出芽に関与する。
膜貫通ドメインは、細胞膜成分の特定の脂質と相互作用する親油性アミノ酸の短い配列である。好ましくは、細胞膜は、少なくとも一部に脂質ラフトの特色を有する部分を含む。
これらのアンカードメインは、ウイルスの表面タンパク質だけでなく、生細胞の膜中に天然に組み込まれているタンパク質にも共通している（ただし、コンセンサス配列によってではない）。各膜貫通ドメインは、細胞膜の変形（bending）と出芽に関与する。
【0032】
本発明に係る使用され得るアンカードメインのうち、好ましくは、表１Ａに列挙したタンパク質由来のものが言及されよう：
【0033】
【表1】
【表2】
【0034】
本発明に係る使用され得るアンカードメインのうち、好ましくは下記表１Ｂに列挙したウイルスエンベロープタンパク質由来のものが言及されよう：
【0035】
【表3】
【表4】
【0036】
好ましくは、本発明に係る使用され得るアンカードメインは、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列（配列番号：２６）及びＰＤＬＰ１タンパク質（Ａ０Ａ０Ｄ３Ｄ８Ｓ３）のアンカー配列（配列番号：３１）から選択される。
【0037】
リンカー
好ましくは、本発明に係る融合タンパク質は、断片ｂ）とｃ）の間、及び／又は断片ｃ）とｄ）の間に存在するリンカーを含む。
リンカーは、フレキシブルアームを生成する短いアミノ酸配列（２～１０、好ましくは２～６アミノ酸）である。これらは、アンカードメインとコイルドコイルドメインが近接し過ぎているために正しいアセンブリに干渉する場合、アンカードメインとコイルドコイルドメインのらせんとの間にフレキシブルな空間を生成するのに有用であり得る。リンカーは、二つのドメイン（アンカードメインとコイルドコイルドメイン）間の直接連結が融合タンパク質の三次元構造全体に干渉しない条件下では必要とされない。
好ましくは、リンカーは、－（ＧＧＧＳ）ｎ－型であり、ここで、ｎは整数である。好ましくは、リンカーは、配列番号：２３（ｎ＝２）及び配列番号：２５（ｎ＝１）から選択される。
好ましくは、本発明に係る融合タンパク質は、断片ｂ）とｃ）の間、及び／又は断片ｃ）とｄ）の間に存在するリンカーを含む。
リンカーは、フレキシブルアームを生成する短いアミノ酸配列（２～１０、好ましくは２～６アミノ酸）である。これらは、アンカードメインとコイルドコイルドメインが近接し過ぎているために正しいアセンブリに干渉する場合、アンカードメインとコイルドコイルドメインのらせんとの間にフレキシブルな空間を生成するのに有用であり得る。リンカーは、二つのドメイン（アンカードメインとコイルドコイルドメイン）間の直接連結が融合タンパク質の三次元構造全体に干渉しない条件下では必要とされない。
好ましくは、リンカーは、－（ＧＧＧＳ）ｎ－型であり、ここで、ｎは整数である。好ましくは、リンカーは、配列番号：２３（ｎ＝２）及び配列番号：２５（ｎ＝１）から選択される。
【0038】
従って、好ましくは、本発明に係る融合タンパク質は、以下のようなものである：
ａ）任意選択のシグナルペプチドは、配列番号：２１の配列を有する；
ｂ）目的のタンパク質又はペプチドは、以下から選択される：
・アレルゲン及びそれらの断片、
・ウイルスタンパク質及びそれらの断片、
・細胞表面タンパク質及びそれらの断片、
・慢性及び神経変性疾患において蓄積するタンパク質及びペプチド、
・高血圧に関与するタンパク質及びペプチド、
・免疫グロブリン及びそれらの断片、
・サイトカイン及びそれらの断片、並びに
・ホルモン及びそれらの断片；
ｃ）コイルドコイルドメインは、配列番号：２４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３３、及び配列番号：３０から選択される；そして
ｄ）アンカードメインは、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列（配列番号：２６）及びＰＤＬＰｌタンパク質のアンカー配列（配列番号：３１）から選択される。
ａ）任意選択のシグナルペプチドは、配列番号：２１の配列を有する；
ｂ）目的のタンパク質又はペプチドは、以下から選択される：
・アレルゲン及びそれらの断片、
・ウイルスタンパク質及びそれらの断片、
・細胞表面タンパク質及びそれらの断片、
・慢性及び神経変性疾患において蓄積するタンパク質及びペプチド、
・高血圧に関与するタンパク質及びペプチド、
・免疫グロブリン及びそれらの断片、
・サイトカイン及びそれらの断片、並びに
・ホルモン及びそれらの断片；
ｃ）コイルドコイルドメインは、配列番号：２４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３３、及び配列番号：３０から選択される；そして
ｄ）アンカードメインは、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列（配列番号：２６）及びＰＤＬＰｌタンパク質のアンカー配列（配列番号：３１）から選択される。
【0039】
したがって、好ましくは、本発明に係る融合タンパク質は、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、及び配列番号：２０から選択される配列を含み、好ましくは該配列からなる。
【0040】
同様に、好ましくは、本発明に係るＶＬＰは、以下を含む：
－ 少なくともその一部が脂質ラフトの特色を有する組成を有する細胞膜から成るエンベロープ；及び
－ 前記膜に固定された少なくとも１つのＩ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、以下の断片：
ｂ）以下から選択される、目的のタンパク質又はペプチド：
・アレルゲン及びそれらの断片、
・ウイルスタンパク質及びそれらの断片、
・細胞表面タンパク質及びそれらの断片、
・慢性及び神経変性疾患において蓄積するタンパク質及びペプチド、
・高血圧に関与するタンパク質及びペプチド、
・免疫グロブリン及びそれらの断片、
・サイトカイン及びそれらの断片、並びに
・ホルモン及びそれらの断片；
ｃ）配列番号：２４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３３、及び配列番号：３０から選択されるコイルドコイルドメイン；並びに
ｄ）インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列（配列番号：２６）及びＰＤＬＰｌタンパク質のアンカー配列（配列番号：３１）から選択されるアンカードメイン
を連続して含み：
断片ｂ）及びｃ）はＶＬＰの外側に露出している。
－ 少なくともその一部が脂質ラフトの特色を有する組成を有する細胞膜から成るエンベロープ；及び
－ 前記膜に固定された少なくとも１つのＩ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、以下の断片：
ｂ）以下から選択される、目的のタンパク質又はペプチド：
・アレルゲン及びそれらの断片、
・ウイルスタンパク質及びそれらの断片、
・細胞表面タンパク質及びそれらの断片、
・慢性及び神経変性疾患において蓄積するタンパク質及びペプチド、
・高血圧に関与するタンパク質及びペプチド、
・免疫グロブリン及びそれらの断片、
・サイトカイン及びそれらの断片、並びに
・ホルモン及びそれらの断片；
ｃ）配列番号：２４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３３、及び配列番号：３０から選択されるコイルドコイルドメイン；並びに
ｄ）インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列（配列番号：２６）及びＰＤＬＰｌタンパク質のアンカー配列（配列番号：３１）から選択されるアンカードメイン
を連続して含み：
断片ｂ）及びｃ）はＶＬＰの外側に露出している。
【0041】
本発明の主題はまた、融合タンパク質をコードする核酸（又はヌクレオチド配列）である。
ヌクレオチド配列が得られたら、それはその後、従来の方法によって発現ベクター中に配置される。したがって、本発明の主題はまた、融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターである。好適な発現ベクターの選択は宿主細胞に発現ベクターを導入する方法に依存することとなる。典型的な発現ベクターは、真核性ＤＮＡエレメント、例えば、外因性遺伝子の転写開始配列、例えばプロモーター、及び転写物のプロセシングを制御するＤＮＡエレメント、例えば終結／ポリアデニル化配列、及びサイレンシング阻害因子の発現を可能とする発現カセットを含む。発現ベクターはまた、植物中又は植物細胞中へのＤＮＡ片の組み込み（integration）に必要とされるｔ－ＤＮＡなどの配列を含む。
好ましくは、発現ベクターは：
－ 融合タンパク質をコードし、好ましくは強力なプロモーター、好ましくは３５Ｓプロモーターに作動可能に連結されている、少なくとも１つのヌクレオチド配列；
－ サイレンシング阻害因子、好ましくはｐ１９の発現を可能にする発現カセット；及び
－ 転写物のプロセシングを制御するＤＮＡエレメント、例えば終結／ポリアデニル化配列、好ましくはＴｎｏｓ配列（ノパリンシンターゼ終結配列）
を含む。
好ましくは、発現ベクターはｐＡＧ０１である。
ヌクレオチド配列が得られたら、それはその後、従来の方法によって発現ベクター中に配置される。したがって、本発明の主題はまた、融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターである。好適な発現ベクターの選択は宿主細胞に発現ベクターを導入する方法に依存することとなる。典型的な発現ベクターは、真核性ＤＮＡエレメント、例えば、外因性遺伝子の転写開始配列、例えばプロモーター、及び転写物のプロセシングを制御するＤＮＡエレメント、例えば終結／ポリアデニル化配列、及びサイレンシング阻害因子の発現を可能とする発現カセットを含む。発現ベクターはまた、植物中又は植物細胞中へのＤＮＡ片の組み込み（integration）に必要とされるｔ－ＤＮＡなどの配列を含む。
好ましくは、発現ベクターは：
－ 融合タンパク質をコードし、好ましくは強力なプロモーター、好ましくは３５Ｓプロモーターに作動可能に連結されている、少なくとも１つのヌクレオチド配列；
－ サイレンシング阻害因子、好ましくはｐ１９の発現を可能にする発現カセット；及び
－ 転写物のプロセシングを制御するＤＮＡエレメント、例えば終結／ポリアデニル化配列、好ましくはＴｎｏｓ配列（ノパリンシンターゼ終結配列）
を含む。
好ましくは、発現ベクターはｐＡＧ０１である。
【0042】
融合タンパク質の発現を制御するために使用されるプロモーターは、強力なプロモーターであり、植物遺伝子プロモーター、例えば、ユビキチンプロモーター、リブロース－１，５－ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニットプロモーター、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Agrobacterium tumefaciens）プロモーター、ノパリンシンターゼ及びオクトピンシンターゼプロモーター、あるいは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓ及び３５Ｓなどのウイルスプロモーターであってよい。好ましくは強力なプロモーターは３５Ｓである。
【0043】
本発明の主題はまた、融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む宿主細胞である。宿主細胞は植物細胞であり得る。
【0044】
本発明の主題はまた、真核細胞、好ましくは植物細胞における融合タンパク質をコードする核酸の発現を含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法である。
植物を培養する一般的な方法、そしてまた植物組織中に発現ベクターを導入するための方法は、当業者が利用可能である。様々な方法があり、方法は選択された植物に依る。好ましくは、植物はＡｌｌｅｒｇｏｐｕｒプラットフォームに固有の技術にしたがって培養されることになる。この組換えタンパク質の生産方法は、出願ＦＲ１ ２５５ ５１０に記載されており、植物を、噴霧水耕栽培（aeroponic）又は水耕栽培（hydroponic）条件下で、かつＬＥＤ照光下で培養する、第１の工程を含む。この第１の工程の後、植物のアグロインフィルトレーション（agroinfiltration）を、減圧（vacuum）下で、本発明に係る融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含むアグロバクテリアを使用して行う。このアグロインフィルトレーション工程は、減圧をもたらす任意の手段により行うことができる。好ましくは、本発明に従って使用される方法では、該工程はベンチュリ（Venturi）効果による減圧下で行われる。本発明に係る使用可能なアグロバクテリアのうち、好ましくはＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１／１０５、又はＣ５８株に言及される。
アグロインフィルトレーション工程が行われたら、植物は、典型的には３～６日、培養物中に戻されるが、その間、理想的には、アグロインフィルトレーション後の最初の６時間の培養の間、前記植物に頻繁に水吹きを行う。次いで、ＶＬＰは、下記のように抽出及び精製される。
ＶＬＰ抽出は、酵素抽出により行うことができる。この方法は、特に出願ＷＯ２０１４／１５３６７４に記載されている方法の改変である。好ましくは、ＶＬＰの酵素抽出は、以下の工程により行われる：
－ 植物の地上部（すなわち、葉）を、減圧下（特に、アグロインフィルトレーションについて上に記載したとおり）、タンパク質分解活性を示さないペクトセルロース酵素を含む酵素溶液中；好ましくは、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、及び０．０４％メタ重亜硫酸塩を含む培地中に４％で配合したペクチナーゼ及びセルラーゼの混合物中で、浸潤（infiltration）させる工程、
－ 続いて葉を採取し、次いで酵素溶液中でインキュベートする工程、
－ 混合物を、オービタルシェーカー上で、２０～３０ｒｐｍで、室温（すなわち、およそ２０～２３℃）で、３０分～２時間振とうする工程、
－ 次いで消化物を、好ましくは２～３ｍｍ、次いで２５０μｍのクロスでろ過し、次いで任意に連続して遠心（例えば、１０００×ｇで２～５分）し、そして上清をタンジェンシャルろ過を行うために回収する工程。
植物を培養する一般的な方法、そしてまた植物組織中に発現ベクターを導入するための方法は、当業者が利用可能である。様々な方法があり、方法は選択された植物に依る。好ましくは、植物はＡｌｌｅｒｇｏｐｕｒプラットフォームに固有の技術にしたがって培養されることになる。この組換えタンパク質の生産方法は、出願ＦＲ１ ２５５ ５１０に記載されており、植物を、噴霧水耕栽培（aeroponic）又は水耕栽培（hydroponic）条件下で、かつＬＥＤ照光下で培養する、第１の工程を含む。この第１の工程の後、植物のアグロインフィルトレーション（agroinfiltration）を、減圧（vacuum）下で、本発明に係る融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含むアグロバクテリアを使用して行う。このアグロインフィルトレーション工程は、減圧をもたらす任意の手段により行うことができる。好ましくは、本発明に従って使用される方法では、該工程はベンチュリ（Venturi）効果による減圧下で行われる。本発明に係る使用可能なアグロバクテリアのうち、好ましくはＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１／１０５、又はＣ５８株に言及される。
アグロインフィルトレーション工程が行われたら、植物は、典型的には３～６日、培養物中に戻されるが、その間、理想的には、アグロインフィルトレーション後の最初の６時間の培養の間、前記植物に頻繁に水吹きを行う。次いで、ＶＬＰは、下記のように抽出及び精製される。
ＶＬＰ抽出は、酵素抽出により行うことができる。この方法は、特に出願ＷＯ２０１４／１５３６７４に記載されている方法の改変である。好ましくは、ＶＬＰの酵素抽出は、以下の工程により行われる：
－ 植物の地上部（すなわち、葉）を、減圧下（特に、アグロインフィルトレーションについて上に記載したとおり）、タンパク質分解活性を示さないペクトセルロース酵素を含む酵素溶液中；好ましくは、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、及び０．０４％メタ重亜硫酸塩を含む培地中に４％で配合したペクチナーゼ及びセルラーゼの混合物中で、浸潤（infiltration）させる工程、
－ 続いて葉を採取し、次いで酵素溶液中でインキュベートする工程、
－ 混合物を、オービタルシェーカー上で、２０～３０ｒｐｍで、室温（すなわち、およそ２０～２３℃）で、３０分～２時間振とうする工程、
－ 次いで消化物を、好ましくは２～３ｍｍ、次いで２５０μｍのクロスでろ過し、次いで任意に連続して遠心（例えば、１０００×ｇで２～５分）し、そして上清をタンジェンシャルろ過を行うために回収する工程。
【0045】
このような方法を図７に示す。
【0046】
したがって、好ましくは、本発明の主題はまた、以下の工程を含む、植物細胞又は植物において本発明に係るウイルス様粒子（ＶＬＰ）を製造する方法である：
ａ）強力なプロモーターに作動可能に連結された本発明に係る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでアグロバクテリアを形質転換する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られたアグロバクテリアで植物細胞又は植物をトランスフェクトする工程。
ａ）強力なプロモーターに作動可能に連結された本発明に係る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでアグロバクテリアを形質転換する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られたアグロバクテリアで植物細胞又は植物をトランスフェクトする工程。
【0047】
工程ａ）の形質転換は、典型的には当業者に知られている方法を使用して、例えば、４℃、－８０℃、及び３７℃での、ヒートショック及びそれに続く継代により行われる。
【0048】
工程ｂ）のトランスフェクションは、好ましくは、以下の工程を含む：
ｂ１）噴霧水耕栽培又は水耕栽培条件下、かつＬＥＤ照光下で、好ましくは４～６週間、植物細胞又は植物を培養する工程；
ｂ２）ｂ１）において得られた植物細胞又は植物を、減圧下、工程ａ）において得られたアグロバクテリアを用いてアグロインフィルトレーションする工程。このアグロインフィルトレーション工程は、好ましくはベンチュリ効果による減圧下で行われる。
ｂ３）ウイルス様粒子を得るために、ｂ２）において得られた植物細胞又は植物を、典型的には３～６日間、培養物に戻す工程。
最後に、得られたＶＬＰは、特には上記の酵素抽出により抽出及び精製される。
ｂ１）噴霧水耕栽培又は水耕栽培条件下、かつＬＥＤ照光下で、好ましくは４～６週間、植物細胞又は植物を培養する工程；
ｂ２）ｂ１）において得られた植物細胞又は植物を、減圧下、工程ａ）において得られたアグロバクテリアを用いてアグロインフィルトレーションする工程。このアグロインフィルトレーション工程は、好ましくはベンチュリ効果による減圧下で行われる。
ｂ３）ウイルス様粒子を得るために、ｂ２）において得られた植物細胞又は植物を、典型的には３～６日間、培養物に戻す工程。
最後に、得られたＶＬＰは、特には上記の酵素抽出により抽出及び精製される。
【0049】
本発明の主題はまた、以下を含むウイルス様粒子である：
－ その少なくとも一部が脂質ラフトの特色を有する組成を有する細胞膜からなるエンベロープ；及び
－ 前記膜に固定された、シグナルペプチドａ）を含まない少なくとも１つの本発明に係る融合タンパク質。
したがって、かかるウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、以下を含む：。
－ その少なくとも一部が脂質ラフトの特色を有する組成を有する細胞膜からなるエンベロープ；及び
－ 前記膜に固定された少なくとも１つのＩ又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、連続して：
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド：
ｃ）ウイルス起源ではない、コイルドコイルドメイン（又はオリゴマー形成配列）；及び
ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる、細胞膜へのアンカードメイン、好ましくは、少なくとも一部が脂質ラフトの特色を有する細胞膜へのアンカードメイン
を含み：
断片ｂ）及びｃ）はＶＬＰの外側に露出している。
－ その少なくとも一部が脂質ラフトの特色を有する組成を有する細胞膜からなるエンベロープ；及び
－ 前記膜に固定された、シグナルペプチドａ）を含まない少なくとも１つの本発明に係る融合タンパク質。
したがって、かかるウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、以下を含む：。
－ その少なくとも一部が脂質ラフトの特色を有する組成を有する細胞膜からなるエンベロープ；及び
－ 前記膜に固定された少なくとも１つのＩ又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、連続して：
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド：
ｃ）ウイルス起源ではない、コイルドコイルドメイン（又はオリゴマー形成配列）；及び
ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる、細胞膜へのアンカードメイン、好ましくは、少なくとも一部が脂質ラフトの特色を有する細胞膜へのアンカードメイン
を含み：
断片ｂ）及びｃ）はＶＬＰの外側に露出している。
【0050】
「脂質ラフトの特色を有する細胞膜の部分」という表現は、脂質ラフトのマイクロドメインに見られる脂質二重層（すなわち、細胞膜）を意味することが意図される。そのような二重層は、コレステロール及びリン脂質に、好ましくはホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミン、及びスフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質に富んでいるが、ドコサヘキサエン酸に乏しい。加えて、密度が低く、温和な界面活性剤（例えば、ポリソルベート）に不溶である。
【0051】
そのようなＶＬＰの特有の特徴は、（目的のタンパク質又はペプチドｂ以外は）免疫原性が検出不能であること、自発的に自己集合する能力、その特定の脂質（好ましくは脂質ラフトの特色を有する）含量、その膜に宿主細胞の膜タンパク質が非常に少ないこと、さまざまな真核細胞種（葉、昆虫、又は植物）において高収量で発現される能力、及び調製の容易さである。
【0052】
本発明に係るＶＬＰは、治療に使用され得る。ＶＬＰは薬物として使用され得る。またアレルゲン免疫療法（ＡＩＴ）において使用され得る。
【0053】
本出願に示した配列を下記表に要約する：
【0054】
【表5】
【0055】
以下の実施例は本発明の範囲を例証するものであるが、これを限定することを意図するものではない。変更及び改変が可能であり、これらが本発明の内容及び精神の範囲内に含まれることは当業者には明らかであろう。
【実施例0056】
例１：分子設計及び遺伝子の合成
ｃＤＮＡは、植物系による認識のためにコドン使用率を最適化及び次いでハーモナイズすることによって合成した。本発明の文脈において、好ましい最適化は、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）における発現のための最適化である。
ｃＤＮＡは、植物系による認識のためにコドン使用率を最適化及び次いでハーモナイズすることによって合成した。本発明の文脈において、好ましい最適化は、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）における発現のための最適化である。
【0057】
コンストラクトを図１に示す。特には、以下のとおりである：
Ａ：天然型のタンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号１）。このｃＤＮＡは、特許ＷＯ２００８／０５６２６５に記載の輸送シグナルと融合していてもしていなくてもよい。対応するタンパク質は配列番号２の配列を有する。
Ｂ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＩＩ三量体形成シグナルに、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号３）。対応するタンパク質は配列番号４の配列を有する。
Ｃ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＬＩ四量体形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号５）。対応するタンパク質は配列番号６の配列を有する。
Ｄ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＡＡ七量体形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号７）。対応するタンパク質は配列番号８の配列を有する。
Ｅ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＩＺＮ４グリコシル化オリゴマー形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号９）。対応するタンパク質は配列番号１０の配列を有する。
Ｆ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、コイルドコイルを模した合成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１１）。対応するタンパク質は配列番号１２の配列を有する。
Ｇ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、ＳＮＡＲＥオリゴマー形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１３）。対応するタンパク質は配列番号１４の配列を有する。
Ｈ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＩＩ三量体形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した、Ｄｅｒ ｐ２（配列番号２２）の２つのフラグメントをコードするｃＤＮＡ（配列番号１５）。対応するタンパク質は、配列番号１６の配列を有する。
Ｉ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＩＩ三量体形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合したＦｅｌ ｄ１アレルゲンのＣＨ １鎖（配列番号３２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１７）。対応するタンパク質は、配列番号１８の配列を有する。
Ｊ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＩＩ三量体形成配列に、そして脂質ラフトのＰＤＬＰ１タンパク質（Ａ０Ａ０Ｄ３Ｄ８Ｓ３）のアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１９）。対応するタンパク質は配列番号２０の配列を有する。
Ａ：天然型のタンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号１）。このｃＤＮＡは、特許ＷＯ２００８／０５６２６５に記載の輸送シグナルと融合していてもしていなくてもよい。対応するタンパク質は配列番号２の配列を有する。
Ｂ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＩＩ三量体形成シグナルに、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号３）。対応するタンパク質は配列番号４の配列を有する。
Ｃ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＬＩ四量体形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号５）。対応するタンパク質は配列番号６の配列を有する。
Ｄ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＡＡ七量体形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号７）。対応するタンパク質は配列番号８の配列を有する。
Ｅ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＩＺＮ４グリコシル化オリゴマー形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号９）。対応するタンパク質は配列番号１０の配列を有する。
Ｆ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、コイルドコイルを模した合成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１１）。対応するタンパク質は配列番号１２の配列を有する。
Ｇ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、ＳＮＡＲＥオリゴマー形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１３）。対応するタンパク質は配列番号１４の配列を有する。
Ｈ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＩＩ三量体形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合した、Ｄｅｒ ｐ２（配列番号２２）の２つのフラグメントをコードするｃＤＮＡ（配列番号１５）。対応するタンパク質は、配列番号１６の配列を有する。
Ｉ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＩＩ三量体形成配列に、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨ５ヘマグルチニンのアンカー配列に融合したＦｅｌ ｄ１アレルゲンのＣＨ １鎖（配列番号３２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１７）。対応するタンパク質は、配列番号１８の配列を有する。
Ｊ：タバコキチナーゼシグナル配列（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｊ．－Ｍ．１９９６）に、酵母ＧＣＮ４転写因子のＧＣＮ４－ｐＩＩ三量体形成配列に、そして脂質ラフトのＰＤＬＰ１タンパク質（Ａ０Ａ０Ｄ３Ｄ８Ｓ３）のアンカー配列に融合した成熟型のＤｅｒ ｐ２アレルゲン（配列番号２２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１９）。対応するタンパク質は配列番号２０の配列を有する。
【0058】
例２：プラスミドの調製
ＸｂａＩ／ｋｐｎＩ及びＳａｌＩ／ＳａｃＩ制限部位をそれぞれｃＤＮＡの５’及び３’末端に合成中に組み込む。次いでこれらの部位を使用してｐＡＧ０１バイナリー発現ベクター中にｃＤＮＡをクローニングする。ｃＤＮＡは３５Ｓプロモーター（３５Ｓ）の上流及びノパリンシンターゼ終結配列（ｔｎｏｓ）の下流にクローニングするが、ここで、ｐＡＧ０１ベクターはまた、生産率を高めるために組換えタンパク質と同時にｐ１９サイレンシング阻害因子を発現できるようにする発現カセットも含む。次いで該ベクターを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＬＢＡ４４０４株を形質転換する。
ＸｂａＩ／ｋｐｎＩ及びＳａｌＩ／ＳａｃＩ制限部位をそれぞれｃＤＮＡの５’及び３’末端に合成中に組み込む。次いでこれらの部位を使用してｐＡＧ０１バイナリー発現ベクター中にｃＤＮＡをクローニングする。ｃＤＮＡは３５Ｓプロモーター（３５Ｓ）の上流及びノパリンシンターゼ終結配列（ｔｎｏｓ）の下流にクローニングするが、ここで、ｐＡＧ０１ベクターはまた、生産率を高めるために組換えタンパク質と同時にｐ１９サイレンシング阻害因子を発現できるようにする発現カセットも含む。次いで該ベクターを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＬＢＡ４４０４株を形質転換する。
【0059】
例３：ベンサミアナタバコの葉においてＶＬＰの形態で産生されるＤｅｒ ｐ２の一過性発現－ＡｌｌｅｒｇｏＰｕｒプラットフォームの使用
一過性発現による産生のために、目的の遺伝子を植物細胞のゲノムに組み込むことなく、オリゴマー形成配列及びアンカー配列に連結されたＤｅｒ ｐ２をコードするｃＤＮＡを移入するために、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４を使用する。これは、遺伝子組み換え（transgenesis）ではなく、トランスフェクション（transfection）と呼ばれる。植物を、水耕栽培条件下、栄養培地（ＧＨＥ、フローラグロウ（floragrow）、フローラマイクロ（floramicro）、フローラブルーム（florabloom）、浸透水（osmosed water）１０ｌ当たり１０ｍｌ／１５ｍｌ／５ｍｌ）の存在下で培養する。
アグロバクテリウムは、２つの方法に従ってアグロインフィルトレーションにより葉組織に移入される。プロトタイプスクリーニングを目的としたプロテアーゼの小バッチの生産には、葉の下面の表皮に注射器を当てて手動でアグロバクテリアを注入する。アグロインフィルトレーションの４～６日後に葉から採取した葉の円板を種々のＶＬＰプロトタイプの分析に使用する。このスクリーニング工程により、最適な質の膜に固定されたＤｅｒ ｐ２アレルゲンを得るのに使用されることとなる発現ベクターを定めることができる。大規模生産にも同じ方法が使用されるが、この場合は、アグロインフィルトレーションを、減圧下、数リットルのアグロバクテリア培養物を含むチャンバー中で行い、数十の植物に同時に浸潤（infiltrate）させる。次にこれらの植物を培養物に３～６日間戻し、その後アレルゲンを担持するＶＬＰを精製する（図２）。
一過性発現による産生のために、目的の遺伝子を植物細胞のゲノムに組み込むことなく、オリゴマー形成配列及びアンカー配列に連結されたＤｅｒ ｐ２をコードするｃＤＮＡを移入するために、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４を使用する。これは、遺伝子組み換え（transgenesis）ではなく、トランスフェクション（transfection）と呼ばれる。植物を、水耕栽培条件下、栄養培地（ＧＨＥ、フローラグロウ（floragrow）、フローラマイクロ（floramicro）、フローラブルーム（florabloom）、浸透水（osmosed water）１０ｌ当たり１０ｍｌ／１５ｍｌ／５ｍｌ）の存在下で培養する。
アグロバクテリウムは、２つの方法に従ってアグロインフィルトレーションにより葉組織に移入される。プロトタイプスクリーニングを目的としたプロテアーゼの小バッチの生産には、葉の下面の表皮に注射器を当てて手動でアグロバクテリアを注入する。アグロインフィルトレーションの４～６日後に葉から採取した葉の円板を種々のＶＬＰプロトタイプの分析に使用する。このスクリーニング工程により、最適な質の膜に固定されたＤｅｒ ｐ２アレルゲンを得るのに使用されることとなる発現ベクターを定めることができる。大規模生産にも同じ方法が使用されるが、この場合は、アグロインフィルトレーションを、減圧下、数リットルのアグロバクテリア培養物を含むチャンバー中で行い、数十の植物に同時に浸潤（infiltrate）させる。次にこれらの植物を培養物に３～６日間戻し、その後アレルゲンを担持するＶＬＰを精製する（図２）。
【0060】
例４：Ｄｅｒ ｐ２アレルゲンを担持するＶＬＰの産生
例３において産生させたタンパク質の発現、そしてまた収率を、それぞれウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡによって分析する。結果をＶＬＰの形態で産生させた３つのアレルゲン（ＤＰ２－ｔｒｉ、ＤＰ２－ｔｅｔｒａ、及びＦＤ１－ｔｒｉ）について示す（図３）。
例３において産生させたタンパク質の発現、そしてまた収率を、それぞれウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡによって分析する。結果をＶＬＰの形態で産生させた３つのアレルゲン（ＤＰ２－ｔｒｉ、ＤＰ２－ｔｅｔｒａ、及びＦＤ１－ｔｒｉ）について示す（図３）。
【0061】
例５：ＶＬＰ形成の評価／サイズ分布分析
Ｄｅｒ ｐ２（ＤＰ２－ｔｒｉ／ＤＰ２－ｔｅｔｒａ）又はＦｅｌ ｄ１（ＦＤ１－Ｔｒｉ）アレルゲンを担持している構造のサイズ分布分析を行った。例３に記載したように、アグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４を用いたＮ．ベンサミアナ植物への減圧下で浸潤を行った後、全タンパク質抽出物をサイズ排除クロマトグラフィーによりＳ－５００（ＨＲ）高分解能カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にて分離した。溶出画分は、抗アレルゲン抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、それらの総タンパク質含有量及びそれらのＶＬＰアレルゲン含有量に関して制御した。分析したすべての抽出物について、溶出液中の可溶性タンパク質濃度は画分１４～１６で最大に達した（図４）。一方で、ウエスタンブロッティング分析では、画分６及び７（すなわち、マーカーとして使用したデキストランブルーの溶出前）におけるアレルゲンの蓄積が示され、これは、２ＭＤａ領域の非常に高分子量の構造へのアレルゲンの連結を示す。
３２ｍｌ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－５００／ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した。１．５ｍｌの全タンパク質抽出物のサンプルをロードし、次いで平衡化バッファーで溶出した。２４個の１．５ｍｌ溶出画分を回収し、２８０ｎｍにおける吸光度分光光度分析により測定したタンパク質中の含有量について分析した。各画分のタンパク質をアセトン沈殿により濃縮し、次いで同一容量の溶出バッファーに再溶解後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより分析した。この分離技術の再現性を確認するために、デキストランブルー２０００と可溶性タンパク質の溶出プロファイルを各クロマトグラムについて比較した。
Ｄｅｒ ｐ２（ＤＰ２－ｔｒｉ／ＤＰ２－ｔｅｔｒａ）又はＦｅｌ ｄ１（ＦＤ１－Ｔｒｉ）アレルゲンを担持している構造のサイズ分布分析を行った。例３に記載したように、アグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４を用いたＮ．ベンサミアナ植物への減圧下で浸潤を行った後、全タンパク質抽出物をサイズ排除クロマトグラフィーによりＳ－５００（ＨＲ）高分解能カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にて分離した。溶出画分は、抗アレルゲン抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、それらの総タンパク質含有量及びそれらのＶＬＰアレルゲン含有量に関して制御した。分析したすべての抽出物について、溶出液中の可溶性タンパク質濃度は画分１４～１６で最大に達した（図４）。一方で、ウエスタンブロッティング分析では、画分６及び７（すなわち、マーカーとして使用したデキストランブルーの溶出前）におけるアレルゲンの蓄積が示され、これは、２ＭＤａ領域の非常に高分子量の構造へのアレルゲンの連結を示す。
３２ｍｌ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－５００／ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した。１．５ｍｌの全タンパク質抽出物のサンプルをロードし、次いで平衡化バッファーで溶出した。２４個の１．５ｍｌ溶出画分を回収し、２８０ｎｍにおける吸光度分光光度分析により測定したタンパク質中の含有量について分析した。各画分のタンパク質をアセトン沈殿により濃縮し、次いで同一容量の溶出バッファーに再溶解後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより分析した。この分離技術の再現性を確認するために、デキストランブルー２０００と可溶性タンパク質の溶出プロファイルを各クロマトグラムについて比較した。
【0062】
例６：ＶＬＰの形態－電子顕微鏡による分析
精製した生成物（実施例３における産生後、精製して得られるもの）の透過型電子顕微鏡法は、分子ふるいクロマトグラフィーによって単離された高分子量構造がアレルゲンが結合しているＶＬＰであることを示している。サイズと、尖頭で覆われたリン脂質膜を含む形態との両方の点で、これらのＶＬＰはインフルエンザビリオンに酷似している（図５）。
精製した生成物（実施例３における産生後、精製して得られるもの）の透過型電子顕微鏡法は、分子ふるいクロマトグラフィーによって単離された高分子量構造がアレルゲンが結合しているＶＬＰであることを示している。サイズと、尖頭で覆われたリン脂質膜を含む形態との両方の点で、これらのＶＬＰはインフルエンザビリオンに酷似している（図５）。
【0063】
例７：アレルゲン又はＶＬＰに担持された低アレルゲン化物の産生
アレルゲンのＶＬＰへのカップリングは、患者の血清由来のＩｇＥにおけるそのｉｎ ｖｉｖｏ反応性を大幅に低下させる。
しかしながら、低アレルゲン化物の使用により、ＩｇＥの反応性、その結果としてアナフィラキシー反応の危険性がさらに低下する。ＶＬＰに担持された低アレルギー型のＤｅｒ ｐ２アレルゲンの反応性の低下を図６に示す。
アレルゲンのＶＬＰへのカップリングは、患者の血清由来のＩｇＥにおけるそのｉｎ ｖｉｖｏ反応性を大幅に低下させる。
しかしながら、低アレルゲン化物の使用により、ＩｇＥの反応性、その結果としてアナフィラキシー反応の危険性がさらに低下する。ＶＬＰに担持された低アレルギー型のＤｅｒ ｐ２アレルゲンの反応性の低下を図６に示す。
【0064】
例８：ＶＬＰの生産
ＶＬＰの詳細な生産方法を、その精製まで（例６に記載されるとおり）、図７に示す。
ＶＬＰの詳細な生産方法を、その精製まで（例６に記載されるとおり）、図７に示す。
【0065】
例９：可溶性アレルゲンと比較したＶＬＰの免疫原性能
高秩序の反復ネットワークの抗原提示は通常強い免疫応答を引き起こすのに対して、単量体として提示された同じ抗原は非免疫原性である。
アレルゲンが高秩序ネットワークの形態で提示された場合のアレルゲンに対する免疫応答を比較するために、可溶性単量体型の又はＶＬＰ担持型のＤｅｒ ｐ２アレルゲンでマウスを免疫した。Ｄｅｒ ｐ２アレルゲンに対するＩｇＧの力価をＥＬＩＳＡにより測定した。
高秩序の反復ネットワークの抗原提示は通常強い免疫応答を引き起こすのに対して、単量体として提示された同じ抗原は非免疫原性である。
アレルゲンが高秩序ネットワークの形態で提示された場合のアレルゲンに対する免疫応答を比較するために、可溶性単量体型の又はＶＬＰ担持型のＤｅｒ ｐ２アレルゲンでマウスを免疫した。Ｄｅｒ ｐ２アレルゲンに対するＩｇＧの力価をＥＬＩＳＡにより測定した。
【0066】
プロトコル
以下にプロトコルを示す。
以下にプロトコルを示す。
【0067】
【化1】
【0068】
屠殺後の分析：
・体重減少と行動の変化
・肺機能（ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ、プレチスモグラフィ）
・アレルゲンに対する血清学的応答（血清ＩｇＧ、ＩｇＥ、ブロット）
・好塩基球活性化テスト
・その後のフェーズにおける病理組織学及びその他の血清学的結果（例えば：ＩｇＧアイソフォーム）。
・体重減少と行動の変化
・肺機能（ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ、プレチスモグラフィ）
・アレルゲンに対する血清学的応答（血清ＩｇＧ、ＩｇＥ、ブロット）
・好塩基球活性化テスト
・その後のフェーズにおける病理組織学及びその他の血清学的結果（例えば：ＩｇＧアイソフォーム）。
【0069】
本試験により、Ｄｅｒ ｐ２アレルゲンに結合したＶＬＰが、可溶性Ｄｅｒ ｐ２とは対照的に、マウスにおいて気管支過敏症を誘発しないことが実証された（図９、パネルＡを参照）。さらに、Ｄｅｒ ｐ２に結合したＶＬＰは、好中球の活性化を伴う全身性Ｔｈ１型応答を引き起こす（図９、パネルＢ及びＣを参照）。
【0070】
例１０：ＶＬＰを使用した脱感作／ワクシネーション
有効なワクチンの主要パラメーターは以下のとおりである：アジュバントの非存在下での高抗体価の迅速な誘導、及び重大な副作用がないこと。
有効なワクチンの主要パラメーターは以下のとおりである：アジュバントの非存在下での高抗体価の迅速な誘導、及び重大な副作用がないこと。
【0071】
プロトコル
プロトコルを以下に示す。
プロトコルを以下に示す。
【0072】
【化2】
【0073】
参考文献
本出願において引用した文献は以下のとおりである：
1-Noon L. Prophylactic inoculation against hay fever Lancet 1911; 1: 1572-3
2-Freeman J. Further observation on the treatment of hay fever by hypodermic inoculations of pollen vaccine. Lancet 1911; 2: 814-817
3-Henmar et al. Clin Exp Immunol 2008; 153: 316-323
4-Valenta et al. J Allergy Clin Immunol 2007; 119: 826_830
5-Larche M. J Allergy Clin Immunol 2007; 119: 906-909
6-Patel D. et al. J Allergy Clin Immunol 2013; 131: 103-109
8-Chen et al. Allergy 2012; 67: 609-621
9-Kundig et al. J Allergy Clin Immunol 2006; 117: 1470-1476
10-BachmannMF, Jennings GT Phil Trans R Soc B Biol SCI 2011; 366: 2815-2822
11-Klimek et al. Am J Rhinol Allergy 2013; 27: 206-212
12-Henmar et al. Clin Exp Immunol 2008; 153: 316-323.
13-Jegerlehner et al. Eur J Immunol 2002; 32: 3305-3314.
14-D’aoust et al. Plant Biotech J 2008; 6: 930-940
15-Garland SM et al. N Engl J Med 2007; 356: 1928-1943
16-Paavonen et al. Lancet.2007; 369: 2161-2170
17-Schmitz et al. J. Exp. Med. 2009; 206: 1941-1955
18-Kundig et al. J Allerg Clin Immunol; 2006; 117: 1470-1476
19-Cielens et al. FEBS Letters 2000; 482: 261-264
本出願において引用した文献は以下のとおりである：
1-Noon L. Prophylactic inoculation against hay fever Lancet 1911; 1: 1572-3
2-Freeman J. Further observation on the treatment of hay fever by hypodermic inoculations of pollen vaccine. Lancet 1911; 2: 814-817
3-Henmar et al. Clin Exp Immunol 2008; 153: 316-323
4-Valenta et al. J Allergy Clin Immunol 2007; 119: 826_830
5-Larche M. J Allergy Clin Immunol 2007; 119: 906-909
6-Patel D. et al. J Allergy Clin Immunol 2013; 131: 103-109
8-Chen et al. Allergy 2012; 67: 609-621
9-Kundig et al. J Allergy Clin Immunol 2006; 117: 1470-1476
10-BachmannMF, Jennings GT Phil Trans R Soc B Biol SCI 2011; 366: 2815-2822
11-Klimek et al. Am J Rhinol Allergy 2013; 27: 206-212
12-Henmar et al. Clin Exp Immunol 2008; 153: 316-323.
13-Jegerlehner et al. Eur J Immunol 2002; 32: 3305-3314.
14-D’aoust et al. Plant Biotech J 2008; 6: 930-940
15-Garland SM et al. N Engl J Med 2007; 356: 1928-1943
16-Paavonen et al. Lancet.2007; 369: 2161-2170
17-Schmitz et al. J. Exp. Med. 2009; 206: 1941-1955
18-Kundig et al. J Allerg Clin Immunol; 2006; 117: 1470-1476
19-Cielens et al. FEBS Letters 2000; 482: 261-264
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
－ その少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜からなるエンベロープ；並びに、
－ 前記膜中に固定された少なくとも１種のＩ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、以下：
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではない、コイルドコイルドメイン又はオリゴマー形成配列；及び
ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる細胞膜へのアンカードメインであって、好ましくは、少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜へのアンカードメイン
の断片を連続して含み、
断片ｂ）及びｃ）はウイルス様粒子の表面に露出している、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質
を含む、ウイルス様粒子。
－ 前記膜中に固定された少なくとも１種のＩ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、以下：
ｂ）目的のタンパク質又はペプチド；
ｃ）ウイルス起源ではない、コイルドコイルドメイン又はオリゴマー形成配列；及び
ｄ）膜貫通セグメントと細胞質セグメントとからなる細胞膜へのアンカードメインであって、好ましくは、少なくとも一部が脂質ラフトの特色を示す細胞膜へのアンカードメイン
の断片を連続して含み、
断片ｂ）及びｃ）はウイルス様粒子の表面に露出している、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通融合タンパク質
を含む、ウイルス様粒子。
【外国語明細書】