【図1A】 様々な逆転写酵素（RT）タンパク質の高収率な作製を示す。各線の長さは、各組換えRTタンパク質間におけるR2 RTのアミノ酸配列の相対的な長さを示す。各線上に、全長タンパク質における配列特異的DNA結合ドメイン、RNA結合領域、RT領域およびエンドヌクレアーゼドメインを、左側（Ｎ末端）から右側（Ｃ末端）の方向に示す。

【図1B】 本明細書で述べる活性アッセイに使用するための、MBPタグおよび６×ヒスチジンタグを付加した精製RTタンパク質が、タンパク質不純物を含まない適切なものであることがSDS-PAGEおよびクマシー染色により示された。

【図1C】 ３種のカラムを使用して各タンパク質を精製した際の、回収した細菌の体積あたりの精製収率の代表的な結果を示す。各プロジェクトは別の反復実験を示す。アスタリスクは、バッチ精製法を用いてゲルに結合させた初回工程での収率を示し、これ以降の精製工程はすべて、充填済みの市販カラムを使用して行った。空隙容量（Void volume）画分における280nmと260nmの吸光度比が、最終精製用のゲル濾過カラムで得たモノマーピークをプールしたタンパク質の吸光度比よりも高い場合、核酸の汚染の指標となる。

【図2】 MBPタグおよび６×ヒスチジンタグを付加した精製RTタンパク質のプライマー伸長アッセイの結果を示す。精製したRNA鋳型の相補領域にDNAプライマーをアニールし、図に示した酵素と４種のdNTPとともにインキュベートした。各RTタンパク質はいずれも同じモル濃度で使用した。各レーンの「＋」および「－」は、変性PAGEおよびSYBR Gold染色を実施する前の、伸長産物の変性後にRNase Aを添加した場合と添加しなかった場合をそれぞれ示す。鋳型の５’末端まで完全に伸長されたことから、予想されたcDNA産物が得られたことが示され、そのサイズは、鋳型と対になったcDNAの３’末端に、鋳型に依存せずにヌクレオチド（nt）が付加された長さとなった。

【図3】 精製RTタンパク質によるプロセッシブかつ連続的な鋳型の複製を分析した結果を示す。使用したプライマーは、チミン（Ｔ）が１塩基突出した３’末端を有するDNAプライマーであった。使用した鋳型は、図の上部に示すように、24ntのRNAもしくはDNAまたはRNA－DNA複合体であった（鋳型５’－３’）。使用したRTタンパク質は、図に示すように、EureまたはBomoC(ed)であった（スペースの都合上、BomoC(ed)ではなくBomoCで示す）。図に示すように、0.4μMまたは4μMの２種の濃度で鋳型を使用した。各レーンの「＋」および「－」は、変性PAGEおよびSYBR Gold染色を実施する前の、伸長産物の変性後にRNase Aを添加した場合と添加しなかった場合をそれぞれ示す。RNase Aにより、二本鎖プライマーの非伸長鎖と鋳型を除去する。除去した非伸長鎖と鋳型は、写真に示したDNAプライマーおよび伸長産物の下方のゲル領域に泳動される。「No enz」は、酵素なしのコントロールである。「cDNA」は、単一の鋳型の複製によるプライマー伸長産物を示し、「Concat」は、連続的な鋳型の複製によるプライマー伸長産物を示す。

【図4A】 マンガンイオンの存在下における一本鎖RNAの３’末端の伸長を、変性PAGEおよびSYBR Gold染色で分析した結果を示す。各レーンの「＋」および「－」は、伸長産物の変性後にRNase Aを添加した場合と添加しなかった場合をそれぞれ示す。「No enz」で示したレーンは、インプットとしてのRNAオリゴヌクレオチドのみを使用した反応である。破線の左側の各ゲルレーンは、エンドヌクレアーゼ活性を不活性化したRTタンパク質であるBomoC(ed)を用いた反応を示し、破線の右側の各ゲルレーンは、エンドヌクレアーゼ活性を不活化する変異を持たないNBomoCを用いた反応を示す。BomoC(ed)を用いた反応では、Mn2+を含む３’テーリングバッファーを使用した条件下において、NbomoCで一貫して観察された全般的な核酸分解活性は認められず、グアニン四重鎖構造に折りたたまれたグアニンの３’テールを有する産物においても核酸分解活性はそれほど顕著ではなかった。NBoMoCを用いた反応で見られた分解産物は、エンドヌクレアーゼを不活性化する変異を有するNBoMoC(ed)を用いた反応では認められなかった。

【図4B】 BomoC(ed)は、Mg2+の存在下でも非存在下でも、Mn2+を含む反応においてddATPを利用してRNAの３’末端を伸長することができることを示す。MnCl2の滴定濃度は、いずれの反応でも0.5mM、1mM、2mMおよび5mMとした。

【図5】 Mn2+の存在下において、鋳型に依存せずにEure RTで一本鎖RNAを伸長し、変性PAGEおよびSYBR Gold染色で分析した画像である。図に示したddNTPを添加した条件または添加しない条件で、様々な種類のヌクレオチド三リン酸の組み合わせ（高濃度（500μM）のdATPまたはdTTPとdCTPの組み合わせを含む）とMn2+の存在下において、RNAオリゴヌクレオチドを伸長させた。

【図6A】 鋳型に依存せずに二本鎖核酸の３’末端を伸長し、変性PAGEおよびSYBR Gold染色で分析した結果を示す。このアッセイではBomoC(ed)酵素を使用した。「No enz」レーンは、インプットとしての二本鎖核酸のみを使用した反応である。各レーンの「＋」および「－」は、伸長産物の変性後にRNase Aを添加した場合と添加しなかった場合をそれぞれ示す。Mn2+を加えた反応において、図に示したヌクレオチドを各500μMの濃度で使用して、平滑末端を有する二本鎖RNA（dsRNA）または二本鎖DNA（dsDNA）を伸長した。dsRNAを使用したレーンのうち、「dTTP」レーンに見られる高分子量産物は、アーチファクトであり、再現性は見られなかった。

【図6B】 図に示すように、Mg2+またはMn2+を含むバッファー中で、各500μMの４種のdNTPまたはdATPのみを加えて、平滑末端を有する二本鎖RNA（dsRNA）を伸長したことを示す。

【図7A】 鋳型に依存せずにBomoC(ed)で一本鎖DNAを伸長し、変性PAGEおよびSYBR Gold染色で分析した結果を示す。「No enz」レーンは、インプットとしてのDNAのみを使用した反応である。（Ａ）図に示すように、Mg2+またはMn2+を含むバッファー中で、各500μMの４種のdNTPまたはdATPのみを加えて、DNAオリゴヌクレオチドを伸長したことを示す。

【図7B】 図に示すように、Mn2+および様々なヌクレオチドの存在下でDNAオリゴヌクレオチドを伸長したことを示す。

【図8】 鋳型に依存せずにEure RTで一本鎖DNAを伸長したこと示す画像である。図に示すように、Mg2+またはMn2+を含むバッファー中で、各500μMの４種のdNTPまたはdATPのみを加えてDNAオリゴヌクレオチドを伸長したことを示す。「No enz」レーンは、インプットとしてのDNAのみを使用した反応である。４種のdNTPを加えたMg2+含有バッファー中において検出された伸長産物の大部分は、オリゴヌクレオチドが別のオリゴヌクレオチドの３’末端にプライミングしたことによる非特異的なcDNA合成を示している。

【図9】 BomoC(ed)を使用した連続的な鋳型の複製によるcDNAのコンカテマー化を、変性PAGEおよびSYBR Gold染色で分析した結果を示す。この反応は、二本鎖プライマー、高濃度の１種のdNTP、およびこの高濃度dNTPに相補的な３’末端を有する鋳型を含んでいた。同じdNTP濃度での反応に使用した鋳型は、３’末端にＣを有するものであった。「単一の鋳型のcDNA」は、単一の鋳型の複製により伸長されたプライマーであり、「コンカテマー」は、複数の鋳型分子の複製産物である。鋳型に依存せずに２～４個のヌクレオチドが付加されることによってプライマーが伸長されると、プライマーのプライミングによるcDNA合成が不活性化されるため、40ntのマーカーの直下に、この伸長産物が泳動される。「＋」で示したレーンは、伸長産物の変性後にRNase Aを添加したレーンを示し、RNase Aの添加により、二本鎖プライマーの非伸長鎖および鋳型を除去した。

【図10】 Mg2+を含むがMn2+を含まないcDNA合成反応における二本鎖プライマーのDNAプライマー鎖への３’末端テーリングを、変性PAGEおよびSYBR Gold染色で分析した結果を示す。この反応は、平滑末端を有する二本鎖プライマー（左側）またはチミン（Ｔ）が１塩基突出した末端を有する二本鎖プライマー（右側）と、図に示した濃度の各dNTPを含んでいた。各反応は、250μMまたは2.5μMの４種のdNTPの混合物を含み、一部の反応では500μMの各dNTPをさらに添加した。また、各反応は、BomoC(ed)（スペースの都合上、BoMoで示す）またはEure RTを含んでいた。「No enz」レーンでは、１本のDNA鎖と１本のRNA鎖からなる二本鎖プライマーをインプットとして使用し、このRNA鎖は、３’末端の伸長がブロックされている。各レーンの「＋」および「－」は、伸長産物の変性後にRNase Aを添加した場合と添加しなかった場合をそれぞれ示す。特に、BomoC(ed)では、４種のdNTPを用いた反応において、プライマー鎖上のチミン（Ｔ）が１塩基突出した（より一般的にはピリミジンが１塩基突出した）末端によって、鋳型に依存しないヌクレオチドの付加が抑制されている。これは、破線で囲んだ枠内の伸長産物を、それぞれに対応する「No enz」＋RNase反応（インプットとしてのプライマー鎖のみの泳動を示すマーカー）と比較することによって確認することができる。平滑末端を有するプライマーには、数個のヌクレオチドが付加されているが、チミン（Ｔ）が１塩基突出した末端を有するプライマーではほとんど変化は見られない。インプットとしての各種プライマーを示した欄の下の、破線で囲んだ枠の下部にこの結果を図示する。

【図11】 １回目の鋳型の受け渡しにおけるユニークな特異性の発揮を示す。４種のdNTPの存在下において、チミン（Ｔ）が１塩基突出した末端を有する二本鎖プライマーと、３’末端にＡまたはＧを有する鋳型を使用して、BomoC(ed)を分析した。変性PAGEおよびSYBR Gold染色で伸長産物を分析した。左側のマーカーレーンのすぐ隣のレーンは、酵素を添加していないレーンである。各レーンの「＋」および「－」は、伸長産物の変性後にRNase Aを添加した場合と添加しなかった場合をそれぞれ示し、RNase Aの添加により、二本鎖プライマーの非伸長鎖および鋳型を除去した。３’末端にＡを有する鋳型のみをcDNAの合成に使用した。

【図12】 順序だった鋳型の受け渡しによるcDNAの複製後、cDNA ３’アダプター付き鋳型に対して５’ブロック基を使用することにより合成を停止させたことを示す。チミン（Ｔ）が１塩基突出した末端を有する35ntの二本鎖プライマー400nM、３’末端にアデニン（Ａ）リボヌクレオチドまたはddAを有する27ntのRNAオリゴヌクレオチド鋳型200nM、３’末端にシトシン（Ｃ）を有する23ntのcDNA ３’アダプター付き鋳型、４種のdNTP（各250μM）およびBomoC(ed)を含む反応から得た伸長産物を、変性PAGEおよびSYBR Gold染色で分析した。cDNAの合成を停止させるための５’ブロック基（amino modifier C6、IDT社）の有無においてのみ異なる２種の３’アダプター付き鋳型配列を試験した。いずれの３’アダプター付き鋳型も２種の濃度で使用した（１倍の濃度として400nMおよび５倍の濃度として2000nM）。「No enz」レーンは、３’末端の伸長がブロックされた非伸長RNA鎖を有する二本鎖プライマー鎖の泳動を示す。各レーンの「＋」および「－」は、伸長産物の変性後にRNase Aを添加した場合と添加しなかった場合をそれぞれ示す。RNase Aにより、二本鎖プライマーの非伸長鎖と鋳型を除去し、除去した非伸長鎖と鋳型は、写真に示したDNAプライマーおよび伸長産物の下方のゲル領域に泳動される。３’Aまたは３’ddAが付加された単一の鋳型からのプライマー伸長産物は「cDNA」で示した位置に泳動され、３’アダプターが付加された単一の鋳型からのcDNA伸長産物は「cDNA＋RNAアダプター」の位置に泳動され、さらに長い伸長産物は３’アダプター付き鋳型から合成されたタンデムリピートを有する。

【図13A-13B】 ほぼ無作為な鋳型のジャンピングと、順序だった鋳型の受け渡しを区別して示した、特異性の原理と結果を示す一連の概略図である。図１３Ｂにおいて、順序だった鋳型の受け渡しの第１の工程では、鋳型プールの鋳型分子に対してcDNAの合成が開始される（１つの鋳型の受け渡し＝cDNAeasi）。次に、第２の工程では、cDNAの３’末端をプライマーとして使用して、３’アダプターが付加された鋳型分子が複製される（２つの鋳型の受け渡し＝cDNAdeca）。

【図14A】 イルミナ社の次世代シーケンシング（NGS）アダプター配列を使用した、順序だった鋳型の受け渡しによるcDNAの合成を示す。BomoC(ed)、チミン（Ｔ）が１塩基突出した３’末端を有するプライマー、および鋳型の受け渡しによる合成を停止させるための５’末端のブロック基と３’末端のシトシン（Ｃ）を有するアダプター付き鋳型を含む反応から得られた伸長産物を、変性PAGEおよびSYBR Gold染色で分析した。使用した鋳型は、３’ddAが付加されたユニークな配列のRNAオリゴヌクレオチドであった。各レーンの「－」および「＋」は、伸長産物の変性後にRNase Aを添加しなかった場合とRNase Aを添加した場合をそれぞれ示し、RNase Aの添加により、二本鎖プライマーの非伸長鎖および鋳型を除去した。「No enz」は、酵素なしのコントロールである。「鋳型の末端」は、反応で使用したcDNA ３’アダプター付き鋳型を示し、「--」は、アダプターを付加していない鋳型を示し、「最適化」は、ランダムな配列を示し、「汎用」は、イルミナ社のリード１を含む約35ntのプライマーを示し、「全長」は、P5とバーコードi5とリード１から構成されたイルミナ社の約70ntのNGSアダプターの全長を示す。約35ntの汎用cDNA ５’アダプター付きプライマー（リード２の相補鎖を含む）を使用して、順序だった鋳型の受け渡しによるcDNAの合成が実証された。

【図14B】 約70ntのcDNA ５’アダプター付きプライマー（P7とバーコードi7とリード２の相補鎖を含む）を使用して、順序だった鋳型の受け渡しによるcDNAの合成が実証されたことを示す。単一の鋳型からのプライマー伸長産物は「cDNA」で示した位置に泳動され、３’アダプターが付加された単一の鋳型からのcDNA伸長産物は「cDNA＋終止アダプター」の位置に泳動される。

【図15A】 順序だった鋳型の受け渡しにより合成し、PCRを行っていないcDNAライブラリーを示す。このライブラリーは、チミン（Ｔ）が１塩基突出した末端を有し、約70ntのcDNA ５’アダプター付きプライマーと、３’末端のＣと５’末端のcDNA合成ブロック基を有し、約70ntのcDNA ３’アダプター付き鋳型を使用して作製されたものである。この概略図は、部分的に二本鎖構造をとったプライマー（プライマー鎖は、イルミナ社のNGSアダプターP7(i7)R2の相補鎖である）とアダプター付き鋳型（イルミナ社のNGSアダプターP5(i5)R2センス鎖）のそれぞれに含まれる各オリゴヌクレオチドを示す。順序だった鋳型の受け渡しのワークフローにおいて、鋳型RNAプールに３’ddAテール（アスタリスク（＊）で示す）が付加された。

【図15B】 963種のmiRNA配列の等モル混合物（miRXplore）を鋳型RNAプールとして使用した反応産物を、変性PAGEおよびSYBR Gold染色で分析した結果を示す。全長cDNAライブラリー（標識cDNA＋アダプター付き鋳型）と、miRNA鋳型のみから複製されたcDNA産物（標識cDNA）が反応産物の大半を占めている。過剰であったアダプター付きプライマーおよびアダプター付き鋳型の染色も認められる。「No enz」は、酵素なしのコントロールである。各レーンの「＋」または「－」は、伸長産物の変性後にRNase Aを添加した場合と添加しなかった場合を示し、RNase Aの添加により、二本鎖プライマーの非伸長鎖を除去し、約70ntの３’アダプター付き鋳型を切断した。このライブラリーをシーケンシングし、少ないサイクル数でPCRを行ったライブラリーと比較し、その結果を図１６Ｂに示した。

【図16A】 順序だった鋳型の受け渡しにより合成した後、少ないサイクル数でPCRを行ったcDNAライブラリーを示す。この概略図は、チミン（Ｔ）が１塩基突出した約35ntのcDNA ５’アダプター付きプライマー（cR2で示すプライマー＝イルミナ社のリード２の相補鎖）と、３’末端のＣと５’末端のcDNA合成ブロック基を有する約35ntのcDNA ３’アダプター付き鋳型（R1で示すアダプター付き鋳型＝イルミナ社のリード１；５’末端ブロック基＝黒丸）を使用したことを示す。鋳型プールを細い線で示す。この鋳型には、アスタリスクで示す３’ddAが付加されている。矢尻はcDNAの５’末端から３’末端の方向を示す（上の鎖）。これに続くPCR工程では、インデックス用の（i）バーコードとP5配列およびP7配列が組み込まれる。

【図16B】 963種のmiRNA配列の等モル混合物（miRXplore標準品）の各リードカウントを示す。少ないサイクル数でPCRを行ったPCRライブラリー（dsDNA、Y軸；８サイクルでのPCR）と、PCRを行っていないライブラリー（ssDNA、Ｘ軸）をシーケンシングし、得られた相対的リードカウントのlog2値からこれらのライブラリーを比較した。黒色のドットは各miRNAを示す。PCRを行っていないライブラリーのlog2値において、見かけ上ゼロを示したmiRNA値が１つ観察されるが、これは正確にはゼロではない。両方法における結果が一致した場合、実際のデータにフィットさせた直線上にドットがプロットされる。