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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024002987
(43)【公開日】2024-01-11
(54)【発明の名称】神経突起伸長用組成物および認知機能改善用組成物
(51)【国際特許分類】
A23L 33/10 20160101AFI20231228BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20231228BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20231228BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231228BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231228BHJP
A61K 31/353 20060101ALI20231228BHJP
A61K 36/74 20060101ALI20231228BHJP
【ＦＩ】
A23L33/10
A23L33/105
A23L2/00 F
A23L2/52
A61P25/28
A61P43/00 105
A61K31/353
A61K36/74
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023103793
(22)【出願日】2023-06-23
(31)【優先権主張番号】P 2022101185
(32)【優先日】2022-06-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】390006600
【氏名又は名称】ユーシーシー上島珈琲株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000822
【氏名又は名称】弁理士法人グローバル知財
(72)【発明者】
【氏名】森本 栞
(72)【発明者】
【氏名】岩井 和也
(72)【発明者】
【氏名】有木 真吾
(72)【発明者】
【氏名】浅岡 那月
(72)【発明者】
【氏名】光實 利貴人
【テーマコード（参考）】
4B018
4B117
4C086
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B018LB08
4B018LB10
4B018MD08
4B018MD57
4B018ME10
4B018ME14
4B018MF01
4B117LC04
4B117LG17
4B117LK06
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZA15
4C086ZB21
4C086ZC41
4C088AB14
4C088AC04
4C088BA10
4C088CA08
4C088MA52
4C088NA14
4C088ZA15
4C088ZB21
4C088ZC41
(57)【要約】
【課題】健全な神経細胞の神経突起を伸長させる神経突起伸長用又は認知機能改善用として用いる組成物を提供する。
【解決手段】プロシアニジンＢ１、又は、プロシアニジンＢ３、の何れかを有効成分として含む組成物は、神経機能を向上させ、神経突起伸長用又は認知機能改善用として用いることができる。また、コーヒーチェリー果皮抽出物を有効成分として含む組成物も、神経機能を向上させ、神経突起伸長用又は認知機能改善用として用いることができる。さらに、コーヒーチェリー果皮由来のプロシアニジンＢ１、プロシアニジンＢ２、又は、プロシアニジンＢ３、の何れかを有効成分として含む組成物も、神経機能を向上させ、神経突起伸長用又は認知機能改善用として用いることができる。
【選択図】図１
【解決手段】プロシアニジンＢ１、又は、プロシアニジンＢ３、の何れかを有効成分として含む組成物は、神経機能を向上させ、神経突起伸長用又は認知機能改善用として用いることができる。また、コーヒーチェリー果皮抽出物を有効成分として含む組成物も、神経機能を向上させ、神経突起伸長用又は認知機能改善用として用いることができる。さらに、コーヒーチェリー果皮由来のプロシアニジンＢ１、プロシアニジンＢ２、又は、プロシアニジンＢ３、の何れかを有効成分として含む組成物も、神経機能を向上させ、神経突起伸長用又は認知機能改善用として用いることができる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の少なくとも何れかを有効成分として含む神経突起伸長用組成物。
【請求項2】
コーヒーチェリー果皮抽出物を有効成分として含む神経突起伸長用組成物。
【請求項3】
前記有効成分が、プロシアニジン類である請求項２の神経突起伸長用組成物。
【請求項4】
前記プロシアニジン類が、プロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の少なくとも何れかである請求項３の神経突起伸長用組成物。
【請求項5】
前記プロシアニジン類が、プロシアニジンＢ２である請求項３の神経突起伸長用組成物。
【請求項6】
プロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の少なくとも何れかを有効成分として含む認知機能改善用組成物。
【請求項7】
コーヒーチェリー果皮抽出物を有効成分として含む認知機能改善用組成物。
【請求項8】
前記有効成分が、プロシアニジン類である請求項７の認知機能改善用組成物。
【請求項9】
前記プロシアニジン類が、プロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の少なくとも何れかである請求項８の認知機能改善用組成物。
【請求項10】
前記プロシアニジン類が、プロシアニジンＢ２である請求項８の認知機能改善用組成物。
【請求項11】
飲料、食品、サプリメント又は医薬品の形態である、請求項１～１０の何れかの組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、健全な神経細胞の神経突起を伸長させ、また、認知機能を改善させる組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
カカオ豆抽出物について、プロシアニジンを用いた神経機能の維持または回復用組成物が知られている（例えば、特許文献１を参照）。特許文献１では、プロシアニジンの神経突起伸長に関する記載がある。
しかしながら、特許文献１の神経機能の維持または回復用組成物では、カカオ豆抽出物のカカオポリフェノールについて、カテキン、エピカテキン、プロシアニジンＢ２に神経機能を維持・回復する効果があるとする内容である。また、特許文献１に開示される技術では、疲弊状態の神経細胞において細胞生存性回復率および神経突起伸長回復率の数値を改善するものであり、健全な神経細胞の神経突起を伸長させるものとは異なる。
しかしながら、特許文献１の神経機能の維持または回復用組成物では、カカオ豆抽出物のカカオポリフェノールについて、カテキン、エピカテキン、プロシアニジンＢ２に神経機能を維持・回復する効果があるとする内容である。また、特許文献１に開示される技術では、疲弊状態の神経細胞において細胞生存性回復率および神経突起伸長回復率の数値を改善するものであり、健全な神経細胞の神経突起を伸長させるものとは異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】再表２０１９／０５４４６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、健全な神経細胞の神経突起を伸長させる神経突起伸長用または認知機能改善用として用いる組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記課題を解決すべく、本発明の第１の観点によれば、組成物は、神経突起伸長用または認知機能改善用で、プロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の少なくとも何れかを有効成分として含むものであり、健全な神経機能を向上させることを特徴とする。プロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の少なくとも何れかを有効成分として含むことにより、神経細胞において、情報伝達に重要な役割を担う神経突起を伸長させることが可能となり、また、認識したり、記憶したり、判断したりする能力、すなわち、認知機能を改善することができる。
【0006】
本発明の第２の観点によれば、組成物は、神経突起伸長用または認知機能改善用で、コーヒーチェリー果皮抽出物を有効成分として含み、神経機能を向上させることを特徴とする。コーヒーチェリー果皮抽出物を有効成分として含むことにより、神経細胞において、情報伝達に重要な役割を担う神経突起を伸長させることが可能となり、また、認知機能を改善できる。
【0007】
本発明の第２の観点における組成物では、有効成分は、コーヒーチェリー果皮由来のプロシアニジン類であり、特に、プロシアニジン類がプロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の少なくとも何れかであることが好ましい。或いは、コーヒーチェリー果皮由来のプロシアニジン類がプロシアニジンＢ２であってもよい。
コーヒーチェリー果皮由来のプロシアニジンＢ１、Ｂ２又はＢ３を有効成分として含む組成物とすることにより、従来、廃棄されることが多かったコーヒーチェリーの果皮を有効利用でき、環境保全にも役立つ。
なお、本発明の第１及び第２の観点の組成物は、飲料、食品、サプリメント又は医薬品の形態として提供することができる。
コーヒーチェリー果皮由来のプロシアニジンＢ１、Ｂ２又はＢ３を有効成分として含む組成物とすることにより、従来、廃棄されることが多かったコーヒーチェリーの果皮を有効利用でき、環境保全にも役立つ。
なお、本発明の第１及び第２の観点の組成物は、飲料、食品、サプリメント又は医薬品の形態として提供することができる。
【発明の効果】
【0008】
本発明の組成物によれば、生物の神経系を構成する神経細胞（ニューロン）の情報伝達を担う神経突起を伸長させ、また、認知症患者の認知機能改善だけでなく、健常者の認知症予防機能が期待できるといった効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】コーヒーチェリー果皮抽出物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定性分析結果
【図2】実施例Ａの試料を添加後３日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像
【図3】実施例Ｂの試料を添加後３日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像
【図4】実施例Ｃの試料を添加後３日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像
【図5】実施例Ｄの試料を添加後３日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像
【図6】実施例Ａの試料を添加後６日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像
【図7】実施例Ｂの試料を添加後６日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像
【図8】実施例Ｃの試料を添加後６日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像
【図9】実施例Ｄの試料を添加後６日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像
【図10】未処置対照及び陽性対照の画像
【図11-1】神経突起の伸長を示す顕微鏡像（１）
【図11-2】神経突起の伸長を示す顕微鏡像（２）
【図12】ニューロンの形態とはたらきを示す模式図
【図13】老化促進モデルマウスを用いた認知機能試験におけるStep-through型受動的回避反応試験結果
【図14】老化促進モデルマウスを用いた認知機能試験におけるＢＤＮＦ（大脳皮質）の発現レベルを示すグラフ
【図15】老化促進モデルマウスを用いた認知機能試験における海馬Ａβ染色陽性面積を示すグラフ
【図16】通常モデルマウスを用いた肥満誘発性の認知機能試験における体重変化を示すグラフ
【図17】通常モデルマウスを用いた肥満誘発性の認知機能試験におけるＹ字迷路試験結果
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。
【実施例0011】
ラット副腎褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞は、神経成長因子（ＮＧＦ：nerve growth factor）の添加によって神経突起を伸長させ、交感神経細胞様に分化することから、神経細胞のモデル細胞として用いることができる。本実施例では、このＰＣ１２細胞を用いて、神経突起伸長作用を評価した。
【0012】
試験試料としては、４種類の試料、すなわち、コーヒーチェリー果皮抽出物（実施例Ａ）、プロシアニジンＢ１（実施例Ｂ）、プロシアニジンＢ２（実施例Ｃ）、プロシアニジンＢ３（実施例Ｄ）を用いた。プロシアニジンＢ１（CAS No. 20315-25-7）、プロシアニジンＢ２（CAS No.
29106-49-8）、およびプロシアニジンＢ３（CAS No. 20315-25-7）は何れもCayman Chemical社製である。
ここで、実施例Ａのコーヒーチェリー果皮抽出物は、以下の方法を用いて調製した。まず、インドネシア産（カネフォラ種）のコーヒーチェリーの表面を水で洗浄し、果皮と種子に分離し、その後、直ぐに果皮を凍結乾燥し、乾燥物をミキサーで粉砕した。コーヒーチェリー果皮凍結乾燥粉砕物５０ｇと５０ｖ／ｖ％エタノール５００ｍＬをフラスコに入れ、３時間スターラーで攪拌抽出した。得られた抽出液を遠心分離した後、７μｍのペーパーフィルターで濾過し、濾液を凍結乾燥してコーヒーチェリー果皮抽出物を得た。
得られたコーヒーチェリー果皮抽出物の総プロシアニジン類含有量は、該粉末全体重量中２０質量％であった（バニリン塩酸法によってエピカテキン当量として算出）。更に、コーヒーチェリー果皮抽出物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定性分析に供したところ、図１（１）に示す分析結果を得た。インドネシア産（カネフォラ種）のコーヒーチェリー果皮抽出物の分析結果として、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３のピークが検出された。
参考までに、ベトナム産（アラビカ種）のコーヒーチェリー果皮抽出物について、同条件で抽出し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定性分析を行った結果を図１（２）に示す。ベトナム産（アラビカ種）のコーヒーチェリー果皮抽出物では、プロシアニジンＢ２の大きなピークが検出された。このように、実施例Ａとして用いたコーヒーチェリー果皮抽出物とは異なるが、プロシアニジンＢ２を多く含有するコーヒーチェリーもあり、後述するとおり、実施例Ｃとして試薬ベースでもプロシアニジンＢ２の神経突起伸長作用を確認している。なお、ＬＣ条件、ＭＳ／ＭＳ条件を下記表１に示す。
29106-49-8）、およびプロシアニジンＢ３（CAS No. 20315-25-7）は何れもCayman Chemical社製である。
ここで、実施例Ａのコーヒーチェリー果皮抽出物は、以下の方法を用いて調製した。まず、インドネシア産（カネフォラ種）のコーヒーチェリーの表面を水で洗浄し、果皮と種子に分離し、その後、直ぐに果皮を凍結乾燥し、乾燥物をミキサーで粉砕した。コーヒーチェリー果皮凍結乾燥粉砕物５０ｇと５０ｖ／ｖ％エタノール５００ｍＬをフラスコに入れ、３時間スターラーで攪拌抽出した。得られた抽出液を遠心分離した後、７μｍのペーパーフィルターで濾過し、濾液を凍結乾燥してコーヒーチェリー果皮抽出物を得た。
得られたコーヒーチェリー果皮抽出物の総プロシアニジン類含有量は、該粉末全体重量中２０質量％であった（バニリン塩酸法によってエピカテキン当量として算出）。更に、コーヒーチェリー果皮抽出物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定性分析に供したところ、図１（１）に示す分析結果を得た。インドネシア産（カネフォラ種）のコーヒーチェリー果皮抽出物の分析結果として、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３のピークが検出された。
参考までに、ベトナム産（アラビカ種）のコーヒーチェリー果皮抽出物について、同条件で抽出し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定性分析を行った結果を図１（２）に示す。ベトナム産（アラビカ種）のコーヒーチェリー果皮抽出物では、プロシアニジンＢ２の大きなピークが検出された。このように、実施例Ａとして用いたコーヒーチェリー果皮抽出物とは異なるが、プロシアニジンＢ２を多く含有するコーヒーチェリーもあり、後述するとおり、実施例Ｃとして試薬ベースでもプロシアニジンＢ２の神経突起伸長作用を確認している。なお、ＬＣ条件、ＭＳ／ＭＳ条件を下記表１に示す。
【0013】
【表1】
【0014】
実施例Ａ～Ｄの試料を、５０ｖｏｌ％エタノールに溶解し、実施例Ａの試料を１００（ｍｇ／ｍＬ）、実施例Ｂ～Ｄの試料を２５（ｍｍｏｌ／Ｌ）に調製し、試験用原液とした。これらの試験用原液を５０ｖｏｌ％のエタノールで希釈し、実施例Ａの試料を２、５、及び１０（ｍｇ／ｍＬ）、実施例Ｂ～Ｄの試料をそれぞれ０．５、２、及び５（ｍｍｏｌ／ｍＬ）の溶液とした。これら溶液を分化培地でさらに希釈し、実施例Ａの試料については、２、５、及び１０（μｇ／ｍＬ）、実施例Ｂ～Ｄの試料については、それぞれ０．５、２、及び５（μｍｏｌ／Ｌ）の試験液を調製した（試験液中のエタノール濃度は０．０５ｖｏｌ％である）。
【0015】
試験操作としては、まず、ＰＣ１２細胞を、コラーゲンコートの２４ウェルプレートに播種し、１日間培養後、各試験液を添加した。具体的には、実施例Ａの試料については、２、５、及び１０（μｇ／ｍＬ）、実施例Ｂ～Ｄの試料については、それぞれ０．５、２、及び５（μｍｏｌ／Ｌ）の各試験液を分化培地中に添加した。３日間培養後、培養上清を新たに調製した各試験液を含む分化培地に交換し、さらに３日間培養した。３日間及び６日間培養後のＰＣ１２細胞を、倒立型位相差顕微鏡にて観察し撮影した。また、０．０５ｖｏｌ％のエタノール含有の分化培地のみを加えたものを未処置対照として同様に試験を行った。陽性対照には、ＮＧＦ(神経成長因子)（５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した分化培地を同様にして用いた。
図１０（１）は未処置対照の顕微鏡像、図１０（２）は陽性対照の顕微鏡像を示している。主な試験条件を下記表２に示す。
図１０（１）は未処置対照の顕微鏡像、図１０（２）は陽性対照の顕微鏡像を示している。主な試験条件を下記表２に示す。
【0016】
【表2】
【0017】
実施例Ａ～Ｄの試料を添加後、３日間培養したときのＰＣ１２細胞の顕微鏡像を、図２～図５に示し、６日間培養したときのＰＣ１２細胞の顕微鏡像を図６～図９に示す。
図２は、実施例Ａの試料を添加後、３日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像を示す。また、図６は、実施例Ａの試料を添加後、６日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像を示す。図２と図６のそれぞれにおいて、（１）は２μｇ／ｍＬ、（２）は５μｇ／ｍＬ、（３）は１０μｇ／ｍＬを示している。図２及び図６に示すように、実施例Ａの試料は、２、５及び１０（μｇ／ｍＬ）のそれぞれの濃度で神経突起が樹状に伸長し、繋がっている箇所が確認された。但し、１０μｇ／ｍＬではわずかに毒性が見られ、ＰＣ１２細胞が減少している箇所が確認された。
図２は、実施例Ａの試料を添加後、３日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像を示す。また、図６は、実施例Ａの試料を添加後、６日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像を示す。図２と図６のそれぞれにおいて、（１）は２μｇ／ｍＬ、（２）は５μｇ／ｍＬ、（３）は１０μｇ／ｍＬを示している。図２及び図６に示すように、実施例Ａの試料は、２、５及び１０（μｇ／ｍＬ）のそれぞれの濃度で神経突起が樹状に伸長し、繋がっている箇所が確認された。但し、１０μｇ／ｍＬではわずかに毒性が見られ、ＰＣ１２細胞が減少している箇所が確認された。
【0018】
図３は、実施例Ｂの試料を添加後３日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像を示している。また、図７は、実施例Ｂの試料を添加後６日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像を示している。同様に、図４は実施例Ｃの試料を添加後３日間培養時、図５は実施例Ｄの試料を添加後３日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像を示し、図８は実施例Ｃの試料を添加後６日間培養時、図９は実施例Ｄの試料を添加後６日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像を示している。図３～５、７～９においては、それぞれ（１）０．５μｍｏｌ／Ｌ（２）２μｍｏｌ／Ｌ（３）５μｍｏｌ／Ｌを示している。
図３～５、７～９に示すように、実施例Ｂ～Ｄの試料を添加した検体は、０．５、２、及び５（μｍｏｌ／Ｌ）のそれぞれの濃度で神経突起が樹状に伸長し、繋がっている箇所が見られた。実施例Ｂ～Ｄのいずれの試料を添加した検体においても５μｍｏｌ／Ｌでわずかに毒性が見られ、ＰＣ１２細胞が少なくなっている部分があった。
図３～５、７～９に示すように、実施例Ｂ～Ｄの試料を添加した検体は、０．５、２、及び５（μｍｏｌ／Ｌ）のそれぞれの濃度で神経突起が樹状に伸長し、繋がっている箇所が見られた。実施例Ｂ～Ｄのいずれの試料を添加した検体においても５μｍｏｌ／Ｌでわずかに毒性が見られ、ＰＣ１２細胞が少なくなっている部分があった。
【0019】
以上から、コーヒーチェリー果皮抽出物、プロシアニジンＢ１、プロシアニジンＢ２、プロシアニジンＢ３の全てについて、有効性が認められた。それぞれのプロシアニジンの構造と作用の関係で比較した場合、Ｂ１、Ｂ２，Ｂ３で顕著な差は認められず、いずれも用量依存的に神経突起伸長作用が認められた。一方で、細胞の増殖への影響を比較した場合、プロシアニジン類を試薬としてそれぞれ単独で用いた場合には、５μｍｏｌ／Ｌの高用量側で僅かに細胞毒性が見られたが、コーヒーチェリー果皮抽出物では１０μｇ／ｍＬ以下の用量範囲で細胞毒性は認められず、神経突起伸長効果も添加量とともにより顕著になる傾向が認められた。
【0020】
図１１－１及び図１１－２は、神経突起の伸長を示す顕微鏡像である。図１１－１（１）は未処置対照、図１１－１（２）と図１１－２（１）及び（２）は、実施例Ａの試料を添加後３日間培養時におけるＰＣ１２細胞の顕微鏡像であり、それぞれ図１１－１（２）は２μｇ／ｍＬ、図１１－２（１）は５μｇ／ｍＬ、図１１－２（２）は１０μｇ／ｍＬを示す。
また、図１２は、ニューロンの形態とはたらきを示す模式図（和田勝、“基礎から学ぶ生物学・細胞生物学”、第２版、羊土社、２０１４年、２４９頁、図１１－８を引用）を示す。
また、図１２は、ニューロンの形態とはたらきを示す模式図（和田勝、“基礎から学ぶ生物学・細胞生物学”、第２版、羊土社、２０１４年、２４９頁、図１１－８を引用）を示す。
【0021】
未処置対照と比較して、実施例Ａの試料を添加した検体を添加後３日間培養時におけるＰＣ１２細胞では、目視により確認したところ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、又は１０μｇ／ｍＬの何れについても、図中の矢印で指し示す箇所の様に神経突起の伸長が確認できた。したがって、例えば、図１２の模式図に示すニューロンの情報伝達を担う神経突起（樹状突起）の伸長が観察され、情報伝達機能が向上し、それに伴って認知機能の改善が期待される。コーヒーチェリー果皮抽出物であるＡの効果は、神経細胞の伸長を促進する効果が認められた。
【0022】
（老化促進モデルマウスを用いた認知機能試験）
まず、通常のマウスより早く老化が進むマウスを用いて認知機能試験を行った。具体的には、コーヒーチェリー果皮抽出物を１２週間反復経口投与し、老化促進モデルマウス（ＳＡＭＰ８）の認知機能を評価した。
まず、通常のマウスより早く老化が進むマウスを用いて認知機能試験を行った。具体的には、コーヒーチェリー果皮抽出物を１２週間反復経口投与し、老化促進モデルマウス（ＳＡＭＰ８）の認知機能を評価した。
【0023】
図１３は、老化促進モデルマウスを用いた認知機能試験におけるStep-through型受動的回避反応試験結果を示している。なお、図１３～１５において、それぞれの数値は、１２例の平均値±標準誤差を表す。Step-through型受動的回避反応試験とは、明室及び暗室から成る実験箱を用いて、マウスが明室から暗室に入った時に通電刺激を与えるタイプの受動的回避試験のことである。具体的には、まず、明室から暗室に入るまでの時間、すなわち反応潜時を測定する。マウスが明室から暗室に入ると電気ショックが与えられ、これを獲得試行という。獲得試行から一定時間経過後に、再生試行を行うが、ここでは通電刺激を与えず、反応潜時を測定する。認知機能が低下していると、明室から暗室に入るまでの反応潜時が短くなる。
【0024】
比較例Ｅは正常対照、比較例Ｆは病態対照であり認知機能が低下したもの、実施例Ｇは病態対照であり認知機能が低下したものにコーヒーチェリー果皮抽出物由来プロシアニジン類素材を摂取させたものを示している。正常対照の比較例Ｅには、老化速度が通常のモデルマウス（ＳＡＭＲ１）を使用した。実施例Ｇの試料の具体的な組成については、下記表３に示す通りである。
【0025】
【表3】
【0026】
ここで、コーヒーチェリー果皮抽出物由来プロシアニジン類素材中の総プロシアニジン類量はバニリン塩酸法で算出し、プロシアニジンＢ１、プロシアニジンＢ２、プロシアニジンＢ３はＨＰＬＣ―ＦＬ（蛍光検出器）を用いて定量分析を行った。クロロゲン酸類は３種ＣＱＡｓ（３－ＣＱＡ、５－ＣＱＡ，４－ＣＱＡ）、３種ＦＱＡｓ（３－ＦＱＡ，５－ＦＱＡ，４－ＦＱＡ）、及び３種ｄｉ―ＣＱＡｓ（３，５－ｄｉ―ＣＱＡ、３，４－ｄｉ―ＣＱＡ、４，５－ｄｉ―ＣＱＡ）の計９種クロロゲン酸類の総称であり、カフェイン、トリゴネリンと共にＨＰＬＣ－ＰＤＡ（フォトダイオードアレイ検出器）を用いて定量分析を行った。それぞれの定量分析方法については表４，５に示す。
【0027】
【表4】
【0028】
【表5】
【0029】
なお、９種クロロゲン酸類は標品である５－ＣＱＡのピーク面積値を基準として、それぞれのＲｅｌａｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＲＦ）を乗じて定量値を算出し、トリゴネリンは標品として用いたトリゴネリン塩酸塩当量とした。ＨＰＬＣ―ＰＤＡの標品はそれぞれ終濃度５，１０，５０，１００，５００ｍｇ／Ｌとなるように、ＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、ＨＰＬＣ－ＦＬの標品はそれぞれ終濃度０．１，０．５，１，５，１０ｍｇ／Ｌとなるように、水：メタノール：酢酸＝５０：５０：１（ｖ／ｖ／ｖ）の希釈溶媒に溶解して検量線を作成した。それぞれの分析に供するコーヒーチェリー果皮抽出物由来プロシアニジン類素材は、同溶媒を用いて検量線内の成分濃度となる任意の倍率で希釈を行った。
【0030】
図１３に示すように、病態対照である比較例Ｆでは、正常対照である比較例Ｅよりも反応潜時が短くなっており、認知機能が低下している。これに対して、病態対照であり認知症が進行したものにプロシアニジン類を摂取させた実施例Ｇでは、比較例Ｆよりも反応潜時が長くなった。
【0031】
図１４は、老化促進モデルマウスを用いた認知機能試験におけるＢＤＮＦ（大脳皮質）の発現レベルを示すグラフを示している。ＢＤＮＦ（Brain-derived neurotrophic factor）とは、脳由来神経栄養因子と呼ばれ、主に脳の海馬に発現する神経性因子であり、神経細胞の成長や再生を促す物質として知られている。図１４（１）はグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、図１４（２）はβ－アクチン（ＡＣＴＢ）に対するＢＤＮＦの発現レベルを示している。
図１４（１）及び（２）において、病態対照である比較例Ｆでは、正常対照である比較例ＥよりもＢＤＮＦの発現レベルが低下している。これに対して、病態対照であり認知機能が低下したものに、プロシアニジン類を摂取させた実施例Ｇでは、比較例ＦよりもＢＤＮＦの発現レベルが上昇することが分かった。
図１４（１）及び（２）において、病態対照である比較例Ｆでは、正常対照である比較例ＥよりもＢＤＮＦの発現レベルが低下している。これに対して、病態対照であり認知機能が低下したものに、プロシアニジン類を摂取させた実施例Ｇでは、比較例ＦよりもＢＤＮＦの発現レベルが上昇することが分かった。
【0032】
図１５は、老化促進モデルマウスを用いた認知機能試験における海馬Ａβ染色陽性面積を示すグラフを示している。Ａβ（アミロイドβ）は、アルツハイマー型認知症の発症に大きく関わっていると考えられているたんぱく質である。図１５のグラフでは、左脳海馬ＣＡ１領域について測定を行った。
海馬ＣＡ１領域において、病態対照である比較例Ｆでは、正常対照である比較例Ｅよりも陽性率が上昇しているが、病態対照であり認知機能が低下したものに、プロシアニジン類を摂取させた実施例Ｇでは、比較例ＦよりもＢＤＮＦの陽性率が低下していることが分かった。
海馬ＣＡ１領域において、病態対照である比較例Ｆでは、正常対照である比較例Ｅよりも陽性率が上昇しているが、病態対照であり認知機能が低下したものに、プロシアニジン類を摂取させた実施例Ｇでは、比較例ＦよりもＢＤＮＦの陽性率が低下していることが分かった。
【0033】
以上のことから、老化促進に伴い呈する病態に対しては、ＢＤＮＦ（大脳皮質）の産生促進、海馬ＣＡ１領域におけるＡβ蓄積抑制など、一定の抑制効果が示唆された。
【0034】
（通常モデルマウスを用いた肥満誘発性の認知機能試験）
次に、通常の動物モデルを用いて肥満による認知機能の低下が改善するかについて試験を行った。これは老化モデルで低用量（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）の場合に効果を確認できたため、更に用量を増やして（１５０又は３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、通常モデルで用量依存性を見たものである。具体的には、コーヒーチェリー果皮抽出物を１６週間反復経口投与し、食事誘発性肥満モデルマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の認知機能を評価した。
次に、通常の動物モデルを用いて肥満による認知機能の低下が改善するかについて試験を行った。これは老化モデルで低用量（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）の場合に効果を確認できたため、更に用量を増やして（１５０又は３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、通常モデルで用量依存性を見たものである。具体的には、コーヒーチェリー果皮抽出物を１６週間反復経口投与し、食事誘発性肥満モデルマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の認知機能を評価した。
【0035】
図１６は、通常モデルマウスを用いた肥満誘発性の認知機能試験における体重変化を示すグラフである。比較例Ｈは通常食を摂取させたもの、比較例Ｉは高脂肪食を摂取させたもの、実施例Ｊは高脂肪食と低用量のプロシアニジン類を同時に摂取させたもの、また実施例Ｋは高脂肪食と高用量のプロシアニジン類を同時に摂取させたものを示している。低用量群（実施例Ｊ）と高用量群（実施例Ｋ）の試料の違いについては、下記表６に示す通りである。表６に記載の分析値に関しても、上記表４，５に示す分析方法に準じて実施している。図１６に示すように、高脂肪食と高用量のプロシアニジン類を同時に摂取させた実施例Ｋでは、効果的に体重の増加が抑制されることが分かった。
【0036】
【表6】
【0037】
図１７は、通常モデル認知機能試験におけるＹ字迷路試験結果を示している。Ｙ字迷路試験とは、自発的交替行動を測定し短期記憶を評価する試験である。具体的には、Ｙ迷路内探索において、マウスが直前に進入したアームとは異なったアームに入ろうとする習性を利用し、かかる自発的交替行動を行う確率（交替率）を測定する。
通常食を摂取させた比較例Ｈと比べて、高脂肪食を摂取させた比較例Ｉでは、自発的交替行動を行う確率（交替率）が低下しているが、高脂肪食と低用量のプロシアニジン類を同時に摂取させた実施例Ｊでは交替率が上昇し、高脂肪食と高用量のプロシアニジン類を同時に摂取させた実施例Ｋでは交替率がさらに上昇しており、プロシアニジン類を同時に摂取させることで、認知機能が改善することが分かった。
通常食を摂取させた比較例Ｈと比べて、高脂肪食を摂取させた比較例Ｉでは、自発的交替行動を行う確率（交替率）が低下しているが、高脂肪食と低用量のプロシアニジン類を同時に摂取させた実施例Ｊでは交替率が上昇し、高脂肪食と高用量のプロシアニジン類を同時に摂取させた実施例Ｋでは交替率がさらに上昇しており、プロシアニジン類を同時に摂取させることで、認知機能が改善することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【0038】
本発明は、神経突起伸長剤、認知機能改善剤として有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
