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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024030075
(43)【公開日】2024-03-07
(54)【発明の名称】ニコチンアミドリボシドの製造方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
C12P 19/30 20060101AFI20240229BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240229BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240229BHJP
【ＦＩ】
C12P19/30 ZNA
C12N9/10
C12N15/31
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022132633
(22)【出願日】2022-08-23
(71)【出願人】
【識別番号】000005887
【氏名又は名称】三井化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】林 祥平
(72)【発明者】
【氏名】安楽城 正
(72)【発明者】
【氏名】中久保 周
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050CC04
4B050DD02
4B050LL05
4B064AE02
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
(57)【要約】
【課題】媒体の液性に関わらず適用できるニコチンアミドリボシドの製造方法及びニコチンアミドリボシドの製造に用いる組成物の提供。
【解決手段】リボース－１－リン酸と、ニコチンアミド化合物と、プリンヌクレオシドホスホリラーゼと、を水性媒体中で接触させる工程を含み、前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１又は配列番号１との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有する、ニコチンアミドリボシドの製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】リボース－１－リン酸と、ニコチンアミド化合物と、プリンヌクレオシドホスホリラーゼと、を水性媒体中で接触させる工程を含み、前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１又は配列番号１との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有する、ニコチンアミドリボシドの製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リボース－１－リン酸と、ニコチンアミド化合物と、プリンヌクレオシドホスホリラーゼと、を水性媒体中で接触させる工程を含み、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１又は配列番号１との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有する、ニコチンアミドリボシドの製造方法。
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１又は配列番号１との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有する、ニコチンアミドリボシドの製造方法。
【請求項2】
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはクロロフレクサス門に分類されている菌株由来の酵素を含む、請求項１に記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
【請求項3】
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはThermosporothrix属、Thermogemmatispora属、Dictyobacter属、Ktedonospora属、Ktedonosporobacter属、Ktedonobacter属、Tengunoibacter属及びReticulibacter属からなる群より選択される少なくとも１種の菌株由来の酵素を含む、請求項１又は請求項２に記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
【請求項4】
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１～配列番号４７のアミノ酸配列を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素を含む、請求項１又は請求項２に記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
【請求項5】
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素を含む、請求項１又は請求項２に記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
【請求項6】
前記水性媒体のｐＨが４．０～７．０である、請求項１又は請求項２に記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
【請求項7】
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼを反応させる工程の反応温度が５℃～５０℃である、請求項１又は請求項２に記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
【請求項8】
配列番号１又は配列番号１との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有するプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む、ニコチンアミドリボシドの製造に用いるための組成物。
【請求項9】
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはクロロフレクサス門に分類されている菌株由来の酵素を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはThermosporothrix属、Thermogemmatispora属、Dictyobacter属、Ktedonospora属、Ktedonosporobacter属、Ktedonobacter属、Tengunoibacter属及びReticulibacter属からなる群より選択される少なくとも１種の菌株由来の酵素を含む、請求項８又は請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１～配列番号４７のアミノ酸配列を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素を含む、請求項８又は請求項９に記載の組成物。
【請求項12】
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素を含む、請求項８又は請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ニコチンアミドリボシドの製造方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は生物に普遍的に存在する補酵素であり、還元型又は酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを用いて、細胞内の酸化還元反応に用いられる。細胞内でのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの合成経路は大きく３つに分けられる。１つ目はトリプトファンを原料にしたｄｅ ｎｏｖｏ経路であり、２つ目はニコチンアミド又はニコチン酸からのサルベージ経路であり、３つ目はニコチンアミドリボシドからのサルベージ経路である。
【0003】
哺乳類はニコチンアミド又はニコチン酸からのサルベージ経路、及びニコチンアミドリボシドからのサルベージ経路からニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生合成することができる。
ニコチンアミド又はニコチン酸からのサルベージ経路では、ニコチンアミドデアミナーゼ及びニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼにより、ニコチンアミド又はニコチン酸とホスホリボシル２リン酸（ＰＲＰＰ）とからニコチン酸モノヌクレオチド又はニコチンアミドモノヌクレオチドが生合成される。次いで、ニコチンアミド／ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼによるＡＤＰ化反応とアミノ化反応とによってニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが生合成される。
ニコチンアミドリボシドからのサルベージ経路では、ニコチンアミドリボシドキナーゼにより、アデノシン三リン酸をリン酸ドナーとしてニコチンアミドモノヌクレオチドが生合成され、次いでニコチンアミド／ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼによりニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが生合成されることが知られている。
ニコチンアミド又はニコチン酸からのサルベージ経路では、ニコチンアミドデアミナーゼ及びニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼにより、ニコチンアミド又はニコチン酸とホスホリボシル２リン酸（ＰＲＰＰ）とからニコチン酸モノヌクレオチド又はニコチンアミドモノヌクレオチドが生合成される。次いで、ニコチンアミド／ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼによるＡＤＰ化反応とアミノ化反応とによってニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが生合成される。
ニコチンアミドリボシドからのサルベージ経路では、ニコチンアミドリボシドキナーゼにより、アデノシン三リン酸をリン酸ドナーとしてニコチンアミドモノヌクレオチドが生合成され、次いでニコチンアミド／ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼによりニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが生合成されることが知られている。
【0004】
近年の研究では、上記生合成経路で示したニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの前駆体としてのニコチンアミドモノヌクレオチドやニコチンアミドリボシドが細胞内のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの量を増加させ、その結果、インスリン抵抗性や脂質異常症などの代謝異常症の改善に効果を示すことが報告されている。また、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの増加がアルツハイマー病の原因となるβ－アミロイドの産生を低下させる効果を示すことも報告されている。
【0005】
ニコチンアミドリボシドの合成方法としては、これまでに有機合成法及び酵素合成法が報告されている。有機合成法としては、テトラアセチルリボースを出発原料としてリボース骨格の水酸基が保護化されたニコチンアミドリボシドを合成し、次いで脱保護反応を行うことでニコチンアミドリボシドを得る方法が報告されている（たとえば、非特許文献１参照）。酵素合成法としては、ペントシルホスホリラーゼ（酵素番号ＥＣ２．４．２）に分類される酵素を用いてリボース－１－リン酸及びニコチンアミドからニコチンアミドリボシドを得る方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０１７／１２１７４６号明細書
【0007】
【非特許文献1】Beilstein J. Org. Chem., 15, 401-430 (2019)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
有機合成法ではニコチンアミドリボシドのα体とβ体の両方が合成されるため、立体選択性に課題がある。さらに、塩基性水溶液中ではニコチンアミドリボシドが容易に分解するため、低温かつ無水条件下で脱保護反応を実施する必要があり、製造コストの低減が課題となる。
酵素合成法は保護及び脱保護のプロセスを経由する必要がない、生成物の立体選択性が高いなどの点で有機合成法より優れているが、いまだ改善の余地がある。例えば、ニコチンアミドリボシドは塩基性の媒体中で容易に分解するため、中性から弱酸性の媒体中で酵素反応を実施できればニコチンアミドリボシドの収率が改善すると考えられる。
酵素合成法は保護及び脱保護のプロセスを経由する必要がない、生成物の立体選択性が高いなどの点で有機合成法より優れているが、いまだ改善の余地がある。例えば、ニコチンアミドリボシドは塩基性の媒体中で容易に分解するため、中性から弱酸性の媒体中で酵素反応を実施できればニコチンアミドリボシドの収率が改善すると考えられる。
【0009】
上記事情に鑑み、本開示の一実施形態は、媒体の液性に関わらず適用できるニコチンアミドリボシドの製造方法及びニコチンアミドリボシドの製造に用いる組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞リボース－１－リン酸と、ニコチンアミド化合物と、プリンヌクレオシドホスホリラーゼと、を水性媒体中で接触させる工程を含み、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１又は配列番号１との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有する、ニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜２＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはクロロフレクサス門に分類されている菌株由来の酵素を含む、＜１＞に記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜３＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはThermosporothrix属、Thermogemmatispora属、Dictyobacter属、Ktedonospora属、Ktedonosporobacter属、Ktedonobacter属、Tengunoibacter属及びReticulibacter属からなる群より選択される少なくとも１種の菌株由来の酵素を含む、＜１＞又は＜２＞に記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜４＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１～配列番号４７のアミノ酸配列を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素を含む、＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜５＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素を含む、＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜６＞前記水性媒体のｐＨが４．０～７．０である、＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜７＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼを反応させる工程の反応温度が５℃～５０℃である、＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜８＞配列番号１又は配列番号１との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有するプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む、ニコチンアミドリボシドの製造に用いるための組成物。
＜９＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはクロロフレクサス門に分類されている菌株由来の酵素を含む、＜８＞に記載の組成物。
＜１０＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはThermosporothrix属、Thermogemmatispora属、Dictyobacter属、Ktedonospora属、Ktedonosporobacter属、Ktedonobacter属、Tengunoibacter属及びReticulibacter属からなる群より選択される少なくとも１種の菌株由来の酵素を含む、＜８＞又は＜９＞に記載の組成物。
＜１１＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１～配列番号４７のアミノ酸配列を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素を含む、＜８＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜１２＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素を含む、＜８＞～＜１１＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜１＞リボース－１－リン酸と、ニコチンアミド化合物と、プリンヌクレオシドホスホリラーゼと、を水性媒体中で接触させる工程を含み、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１又は配列番号１との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有する、ニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜２＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはクロロフレクサス門に分類されている菌株由来の酵素を含む、＜１＞に記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜３＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはThermosporothrix属、Thermogemmatispora属、Dictyobacter属、Ktedonospora属、Ktedonosporobacter属、Ktedonobacter属、Tengunoibacter属及びReticulibacter属からなる群より選択される少なくとも１種の菌株由来の酵素を含む、＜１＞又は＜２＞に記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜４＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１～配列番号４７のアミノ酸配列を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素を含む、＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜５＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素を含む、＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜６＞前記水性媒体のｐＨが４．０～７．０である、＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜７＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼを反応させる工程の反応温度が５℃～５０℃である、＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載のニコチンアミドリボシドの製造方法。
＜８＞配列番号１又は配列番号１との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有するプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む、ニコチンアミドリボシドの製造に用いるための組成物。
＜９＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはクロロフレクサス門に分類されている菌株由来の酵素を含む、＜８＞に記載の組成物。
＜１０＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼはThermosporothrix属、Thermogemmatispora属、Dictyobacter属、Ktedonospora属、Ktedonosporobacter属、Ktedonobacter属、Tengunoibacter属及びReticulibacter属からなる群より選択される少なくとも１種の菌株由来の酵素を含む、＜８＞又は＜９＞に記載の組成物。
＜１１＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１～配列番号４７のアミノ酸配列を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素を含む、＜８＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜１２＞前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素を含む、＜８＞～＜１１＞のいずれか１つに記載の組成物。
【発明の効果】
【0011】
本開示の一実施形態によれば、媒体の液性に関わらず適用できるニコチンアミドリボシドの製造方法及びニコチンアミドリボシドの製造に用いる組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
【0013】
本開示において各成分は該当する物質を複数種含んでいてもよい。本開示において組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。
本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
【0014】
＜ニコチンアミドリボシドの製造方法＞
本開示のニコチンアミドリボシドの製造方法は、
リボース－１－リン酸と、ニコチンアミド化合物と、プリンヌクレオシドホスホリラーゼと、を水性媒体中で接触させる工程を含み、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１又は配列番号１との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有する、ニコチンアミドリボシドの製造方法である。
本開示のニコチンアミドリボシドの製造方法は、
リボース－１－リン酸と、ニコチンアミド化合物と、プリンヌクレオシドホスホリラーゼと、を水性媒体中で接触させる工程を含み、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは配列番号１又は配列番号１との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有する、ニコチンアミドリボシドの製造方法である。
【0015】
本開示の方法では、酵素番号ＥＣ２．４．２．１が与えられているトランスフェラーゼの１種であるプリンヌクレオシドホスホリラーゼの酵素反応を利用してニコチンアミドリボシドを製造する。より具体的には、プリンヌクレオシドホスホリラーゼの酵素反応を利用してリボース－１－リン酸のリン酸基をニコチンアミド化合物と置換する。
本発明者らの検討の結果、配列番号１又は配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有するプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、弱酸性の条件下においてリボース－１－リン酸のリン酸基をニコチンアミド化合物と置換する活性が他のプリンヌクレオシドホスホリラーゼに比べて高いことがわかった。
すなわち、本開示の方法によれば弱酸性の条件下でも効率よくニコチンアミドリボシドを製造することができる。
本発明者らの検討の結果、配列番号１又は配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有するプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、弱酸性の条件下においてリボース－１－リン酸のリン酸基をニコチンアミド化合物と置換する活性が他のプリンヌクレオシドホスホリラーゼに比べて高いことがわかった。
すなわち、本開示の方法によれば弱酸性の条件下でも効率よくニコチンアミドリボシドを製造することができる。
【0016】
本開示では、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを「ＰＮＰ」とも称し、配列番号１又は配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有するプリンヌクレオシドホスホリラーゼを「特定ＰＮＰ」とも称する。
【0017】
本開示の方法で製造されるニコチンアミドリボシドは、下記構造で示される化合物（β－ニコチンアミドリボシド）又はその塩である。ニコチンアミドリボシドの塩としては、塩化物イオン等と塩を形成したものが挙げられる。
【0018】
【化1】
【0019】
本開示の方法で使用するリボース－１－リン酸は、下記構造で示される化合物（Ｄ－リボース－１－リン酸）又はその塩である。リボース－１－リン酸の塩としては、アンモニウム、マグネシウム等と塩を形成したものが挙げられる。
【0020】
【化2】
【0021】
本開示の方法で使用するニコチンアミド化合物は、下記構造で示される化合物（ニコチンアミド）又はその誘導体である。ニコチンアミドの誘導体としては、ニコチンアミドのピリジン環に１つ以上の置換基が結合した状態の化合物が挙げられる。置換基としてはヒドロキシ基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、カルボキシ基、アルデヒド基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。本開示の方法では、ニコチンアミドとニコチンアミドの誘導体を併用してもよい。
【0022】
【化3】
【0023】
本開示の方法で使用する特定ＰＮＰは、１種のみでも２種以上の組み合わせであってもよい。
【0024】
水性媒体中でリボース－１－リン酸と、ニコチンアミド化合物と、特定ＰＮＰとを接触させると、特定ＰＮＰの酵素反応によりリボース－１－リン酸のリン酸基がニコチンアミド化合物と置換してニコチンアミドリボシドが生成する。
【0025】
水性媒体中でリボース－１－リン酸と、ニコチンアミド化合物と、特定ＰＮＰとを接触させる方法は、特に制限されない。例えば、リボース－１－リン酸、ニコチンアミド化合物、及び特定ＰＮＰを水性媒体にそれぞれ溶解する方法が挙げられる。リボース－１－リン酸、ニコチンアミド化合物、及び特定ＰＮＰを水性媒体に溶解する順序は特に制限されない。例えば、リボース－１－リン酸とニコチンアミド化合物とを溶解した水性媒体に特定ＰＮＰを溶解してもよい。
【0026】
水性媒体は、水を含み、リボース－１－リン酸、ニコチンアミド化合物、及び特定ＰＮＰを溶解できるものであれば特に制限されない。
必要に応じ、水性媒体は緩衝剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、有機溶媒、無機塩、ヌクレオシド化合物等を含んでもよい。
緩衝剤としては酢酸ナトリウムバッファー、酢酸アンモニウムバッファー、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）バッファー、ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸）バッファー等が挙げられ、これらの中でも酢酸ナトリウムバッファー、酢酸アンモニウムバッファー及びＭＥＳバッファーからなる群より選択される少なくとも１種の緩衝剤であることが好ましい。
必要に応じ、水性媒体は緩衝剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、有機溶媒、無機塩、ヌクレオシド化合物等を含んでもよい。
緩衝剤としては酢酸ナトリウムバッファー、酢酸アンモニウムバッファー、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）バッファー、ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸）バッファー等が挙げられ、これらの中でも酢酸ナトリウムバッファー、酢酸アンモニウムバッファー及びＭＥＳバッファーからなる群より選択される少なくとも１種の緩衝剤であることが好ましい。
【0027】
水性媒体のｐＨは特に制限されないが、生成したニコチンアミドリボシドの分解を抑制し、特定ＰＮＰの酵素反応を促進する観点からは、７．０以下であることが好ましく、６．７以下であることがより好ましく、６．５以下であることがさらに好ましい。
特定ＰＮＰの酵素反応を促進する観点からは、水性媒体のｐＨは４．０以上であることが好ましく、４．５以上であることがより好ましく、５．０以上であることがさらに好ましい。
特定ＰＮＰの酵素反応を促進する観点からは、水性媒体のｐＨは４．０以上であることが好ましく、４．５以上であることがより好ましく、５．０以上であることがさらに好ましい。
【0028】
水性媒体の温度は特に制限されないが、酵素反応を促進する観点からは５℃～５０℃であることが好ましく、１０℃～３５℃であることがより好ましく、２０℃～３５℃であることがさらに好ましい。
【0029】
水性媒体中でリボース－１－リン酸と、ニコチンアミド化合物と、特定ＰＮＰとを接触させる時間は特に制限されない。例えば、０．５時間～７２時間であることが好ましく、１時間～４８時間であることがより好ましく、３～２４時間であることがさらに好ましい。
【0030】
水性媒体中のリボース－１－リン酸、ニコチンアミド化合物、及び特定ＰＮＰの濃度は特に制限されない。例えば、それぞれ１ｍＭ～１０００ｍＭ、１０ｍＭ～８００ｍＭ、又は５０ｍＭ～６００ｍＭの範囲から選択してもよい。
【0031】
特定ＰＮＰは、クロロフレクサス（Chloroflexi）門に分類されている菌株由来の酵素であることが好ましく、クテドノバクテル（Ktedonobacteria）綱に分類されている菌株由来の酵素であることがより好ましく、Thermosporothrix属、Thermogemmatispora属、Dictyobacter属、Ktedonospora属、Ktedonosporobacter属、Ktedonobacter属、Tengunoibacter属及びReticulibacter属からなる群より選択される少なくとも１種の菌株由来の酵素であることがさらに好ましく、Thermosporothrix属に分類されている菌株由来の酵素であることが特に好ましい。また、Thermosporothrix属の中でも、Thermosporothrix hazakensis又はThermosporothrix sp. COM3由来の酵素であることが好ましく、Thermosporothrix hazakensis由来の酵素であることがより好ましい。
【0032】
特定ＰＮＰの中でも、後述する配列番号１～４７のアミノ酸配列を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素であることが好ましく、配列番号１、５、６、７、２２、２３、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６及び４７のアミノ酸配列を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素であることがより好ましく、配列番号１、２２及び２３のアミノ酸配列を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素であることがさらに好ましく、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素であることが特に好ましい。
【0033】
配列番号１～４７のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が提供しているＧｅｎＢａｎｋデータベースから取得可能である。
【0034】
特定ＰＮＰの配列番号１との配列同一性は６０％以上であれば特に制限されないが、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上であることが好ましい。
【0035】
本開示において酵素のアミノ酸配列の配列同一性の値（％）は、基準となる酵素のアミノ酸配列（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列）と、測定対象の酵素のアミノ酸配列との一致が最大となるようにアライメントさせ、一致するアミノ酸残基数をアライメントされたアミノ酸残基数で除したときの値を百分率で示した値（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を指す。なお、基準となる酵素と測定対象の酵素のアミノ酸配列をアライメントさせる場合には、欠失（ギャップ）を含んでもよい。
アミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の方法で算出できるが、本開示に示すアミノ酸配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）の検索プログラムであるＢｌａｓｔｐ（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ）を用いて計算した値である。
アミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の方法で算出できるが、本開示に示すアミノ酸配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）の検索プログラムであるＢｌａｓｔｐ（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ）を用いて計算した値である。
【0036】
特定ＰＮＰは、特定ＰＮＰを発現する形質転換体を用いて調製してもよい。形質転換体は、例えば、特定ＰＮＰの発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。
【0037】
発現ベクターは、特定ＰＮＰのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を含む。発現ベクターは、ポリヌクレオチドに加えて、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子をコードする領域等の領域をさらに含むことができる。発現ベクターは、プラスミドであっても組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。発現ベクターは、ウイルスベクターであっても無細胞系用ベクターであってもよい。
【0038】
発現ベクターを導入するための宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、バチルス属細菌等の原核細胞、及びサッカロマイセス属細菌、ピヒア属細菌、アスペルギルス属細菌等の真核細胞などが挙げられる。これらの中でもエシェリヒア属細菌が好ましく、大腸菌がより好ましい。
【0039】
発現ベクターを用いて宿主を形質転換し、形質転換した宿主を培養することにより、特定ＰＮＰを発現する形質転換体を得ることができる。宿主の培養のための培地は、ＬＢ培地などの通常用いられる培地から選択できる。
【0040】
本開示の方法では、特定ＰＮＰを発現する形質転換体をそのままニコチンアミドリボシドの製造に用いても、形質転換体から回収した特定ＰＮＰをニコチンアミドリボシドの製造に用いてもよい。形質転換体からの特定ＰＮＰの回収は、凍結融解、超音波破砕、溶解等の、この分野で慣用されている方法により行ってよい。
【0041】
＜組成物＞
本開示の組成物は、特定ＰＮＰを含む、ニコチンアミドリボシドの製造に用いるための組成物である。
本開示の組成物は、特定ＰＮＰを含む、ニコチンアミドリボシドの製造に用いるための組成物である。
【0042】
組成物に含まれる特定ＰＮＰの詳細及び好ましい態様は、上述した製造方法に使用される特定ＰＮＰの詳細及び好ましい態様と同様である。
【0043】
本開示の組成物を用いることで、酵素反応を生じさせる媒体の液性に関わらずニコチンアミドリボシドを製造することができる。本開示の組成物は、弱酸性の条件下でのニコチンアミドリボシドの製造に特に好適に使用できる。
【0044】
本開示の組成物を用いてニコチンアミドリボシドを製造する方法は、上述したニコチンアミドリボシドの製造方法であってもよい。すなわち、リボース－１－リン酸と、ニコチンアミド化合物と、本開示の組成物と、を水性媒体中で接触させてニコチンアミドリボシドを製造してもよい。
本開示の組成物を上述したニコチンアミドリボシドの製造方法に適用する場合、使用する材料及び製造条件の詳細及び好ましい態様は、上述した製造方法に使用される材料及び製造条件の詳細及び好ましい態様と同様である。
本開示の組成物を上述したニコチンアミドリボシドの製造方法に適用する場合、使用する材料及び製造条件の詳細及び好ましい態様は、上述した製造方法に使用される材料及び製造条件の詳細及び好ましい態様と同様である。
【0045】
組成物は、特定ＰＮＰ以外の成分を含んでもよい。例えば、水性媒体、緩衝剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、有機溶媒、無機塩、ヌクレオシド化合物等を含んでもよい。
緩衝剤としては酢酸ナトリウムバッファー、酢酸アンモニウムバッファー、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）バッファー、ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸）バッファー等が挙げられ、これらの中でも酢酸ナトリウムバッファー、酢酸アンモニウムバッファー及びＭＥＳバッファーから選ばれる緩衝剤であることが好ましい。
緩衝剤としては酢酸ナトリウムバッファー、酢酸アンモニウムバッファー、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）バッファー、ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸）バッファー等が挙げられ、これらの中でも酢酸ナトリウムバッファー、酢酸アンモニウムバッファー及びＭＥＳバッファーから選ばれる緩衝剤であることが好ましい。
【0046】
組成物のｐＨは特に制限されないが、生成したニコチンアミドリボシドの分解を抑制し、特定ＰＮＰの酵素反応を促進する観点からは、７．０以下であることが好ましく、６．７以下であることがより好ましく、６．５以下であることがさらに好ましい。
特定ＰＮＰの酵素反応を促進する観点からは、水性媒体のｐＨは４．０以上であることが好ましく、４．５以上であることがより好ましく、５．０以上であることがさらに好ましい。
特定ＰＮＰの酵素反応を促進する観点からは、水性媒体のｐＨは４．０以上であることが好ましく、４．５以上であることがより好ましく、５．０以上であることがさらに好ましい。
【0047】
組成物中の特定ＰＮＰの濃度は、特に制限されない。例えば、１ｍＭ～１０００ｍＭ、１０ｍＭ～８００ｍＭ、又は５０ｍＭ～６００ｍＭの範囲から選択してもよい。
【実施例0048】
以下、実施例に基づいて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【0049】
＜実施例１＞
配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰをコードする遺伝子を人工遺伝子合成法により取得し、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）で消化した。その後、ＤＮＡ断片とｐＵＣ１８（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）をライゲーションハイ（東洋紡（株））を用いて連結し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α株へ導入して形質転換株を得た。この形質転換株をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地で培養し、形質転換株よりプラスミドを抽出し、配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰをコードする遺伝子が挿入された目的のプラスミドを得た。配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰをコードする遺伝子が挿入されたプラスミドをＤＨ５α株へ導入し、配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰを発現する目的の形質転換体を得た。この形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地で１６時間培養し、次いで８０００ｒｐｍ、２０分の遠心分離を行い、菌体を集めた。集めた菌体を純水４ｍｌに懸濁して得た懸濁液を超音波破砕し、配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰ溶液を得た。
配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰをコードする遺伝子を人工遺伝子合成法により取得し、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）で消化した。その後、ＤＮＡ断片とｐＵＣ１８（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）をライゲーションハイ（東洋紡（株））を用いて連結し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α株へ導入して形質転換株を得た。この形質転換株をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地で培養し、形質転換株よりプラスミドを抽出し、配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰをコードする遺伝子が挿入された目的のプラスミドを得た。配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰをコードする遺伝子が挿入されたプラスミドをＤＨ５α株へ導入し、配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰを発現する目的の形質転換体を得た。この形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地で１６時間培養し、次いで８０００ｒｐｍ、２０分の遠心分離を行い、菌体を集めた。集めた菌体を純水４ｍｌに懸濁して得た懸濁液を超音波破砕し、配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰ溶液を得た。
【0050】
Ｄ－リボース－１－リン酸のアンモニウム塩（２００ｍＭ）及びニコチンアミド（３７０ｍＭ）をそれぞれ含むＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）を０．９ｍｌ調製した。その後、前記配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰ溶液０．０５ｇをＭＥＳバッファーに添加して、２０℃の条件下で酵素反応を開始した。
【0051】
反応開始から所定時間経過後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行い、β－ニコチンアミドリボシドに該当するクロマトグラフのピーク曲線下面積を算出してβ－ニコチンアミドリボシドの生成量（ＮＲ生成量）を調べた。ＨＰＬＣは、高速液体クロマトグラフ（日本分光製)を用いて、下記の条件で行った。
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液：１０ｍＭリン酸、メタノール：水＝１：９、分析カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ－ＭＧ－５（４．６μｍ×２５０ｍｍ）、検出方法：ＵＶ ２５４ｎｍ
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液：１０ｍＭリン酸、メタノール：水＝１：９、分析カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ－ＭＧ－５（４．６μｍ×２５０ｍｍ）、検出方法：ＵＶ ２５４ｎｍ
【0052】
＜比較例１～６＞
配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰをコードする遺伝子の代わりに、配列番号１に対する配列同一性が６０％未満である配列番号４８～５３のアミノ酸配列を有するＰＮＰをコードする遺伝子を用いて、実施例１と同様にして配列番号４８～５３のアミノ酸配列を有するＰＮＰ溶液をそれぞれ得た。得られたＰＮＰ溶液をそれぞれ使用したこと以外は実施例１と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰをコードする遺伝子の代わりに、配列番号１に対する配列同一性が６０％未満である配列番号４８～５３のアミノ酸配列を有するＰＮＰをコードする遺伝子を用いて、実施例１と同様にして配列番号４８～５３のアミノ酸配列を有するＰＮＰ溶液をそれぞれ得た。得られたＰＮＰ溶液をそれぞれ使用したこと以外は実施例１と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0053】
（反応初速の評価）
ＰＮＰの活性を評価する指標として、反応初期のβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
具体的には、反応開始から２時間後に測定したβ－ニコチンアミドリボシドの生成量（Ｙ軸）と反応時間（Ｘ軸）の関係をグラフにプロットし、グラフの原点とプロットを結ぶ直線の傾きを反応初速の指標とした。
その結果、実施例１ではβ－ニコチンアミドリボシドの生成が確認されたが、比較例１～６では直線の傾きがゼロに近く、β－ニコチンアミドリボシドの生成がほとんど確認されなかった。
ＰＮＰの活性を評価する指標として、反応初期のβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
具体的には、反応開始から２時間後に測定したβ－ニコチンアミドリボシドの生成量（Ｙ軸）と反応時間（Ｘ軸）の関係をグラフにプロットし、グラフの原点とプロットを結ぶ直線の傾きを反応初速の指標とした。
その結果、実施例１ではβ－ニコチンアミドリボシドの生成が確認されたが、比較例１～６では直線の傾きがゼロに近く、β－ニコチンアミドリボシドの生成がほとんど確認されなかった。
【0054】
（最終生成量の評価）
反応開始から２７時間後にβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べ、実施例１の結果を１００としたときの相対値に換算した。結果を表１に示す。表中の「－」はＨＰＬＣ分析の測定で生成量が検出限界以下であったか、極微量であったことを示す。
反応開始から２７時間後にβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べ、実施例１の結果を１００としたときの相対値に換算した。結果を表１に示す。表中の「－」はＨＰＬＣ分析の測定で生成量が検出限界以下であったか、極微量であったことを示す。
【0055】
【表1】
【0056】
以上の結果に示すように、ｐＨ６．０の弱酸性条件下で特定ＰＮＰを使用した実施例１は、特定ＰＮＰに該当しないＰＮＰを使用した比較例１～６に比べ、反応初速に優れ、かつ最終的なβ－ニコチンアミドリボシドの生成量が多かった。
【0057】
＜実施例２＞
Ｄ－リボース－１－リン酸のアンモニウム塩（２００ｍＭ）及びニコチンアミド（３７０ｍＭ）をそれぞれ含む酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ５．１）を０．９ｍｌ調製した。その後、実施例１と同様にして作製した配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰを発現する形質転換体の懸濁液を超音波破砕せずに０．０５ｇ添加して、２０℃の条件下で酵素反応を開始した。
反応開始から所定時間経過後に、実施例１と同様にしてβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
Ｄ－リボース－１－リン酸のアンモニウム塩（２００ｍＭ）及びニコチンアミド（３７０ｍＭ）をそれぞれ含む酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ５．１）を０．９ｍｌ調製した。その後、実施例１と同様にして作製した配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰを発現する形質転換体の懸濁液を超音波破砕せずに０．０５ｇ添加して、２０℃の条件下で酵素反応を開始した。
反応開始から所定時間経過後に、実施例１と同様にしてβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0058】
＜実施例３＞
酢酸アンモニウムバッファーのｐＨを５．３に変更したこと以外は実施例２と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
酢酸アンモニウムバッファーのｐＨを５．３に変更したこと以外は実施例２と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0059】
＜実施例４＞
酢酸アンモニウムバッファーのｐＨを６．０に変更したこと以外は実施例２と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
酢酸アンモニウムバッファーのｐＨを６．０に変更したこと以外は実施例２と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0060】
＜実施例５＞
酢酸アンモニウムバッファーのｐＨを６．６に変更したこと以外は実施例２と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
酢酸アンモニウムバッファーのｐＨを６．６に変更したこと以外は実施例２と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0061】
（反応初速の評価）
実施例１と同様にして求めた反応初速の指標を、実施例２の結果を１００としたときの相対値に換算した。結果を表２に示す。
実施例１と同様にして求めた反応初速の指標を、実施例２の結果を１００としたときの相対値に換算した。結果を表２に示す。
【0062】
【表2】
【0063】
（最終生成量の評価）
反応開始から３０時間後にβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べ、実施例２の結果を１００としたときの相対値に換算した。結果を表３に示す。
反応開始から３０時間後にβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べ、実施例２の結果を１００としたときの相対値に換算した。結果を表３に示す。
【0064】
【表3】
【0065】
表２及び表３に示すように、酵素反応に特定ＰＮＰを使用した場合は反応溶液のｐＨを弱酸性の範囲内で変更してもβ－ニコチンアミドリボシドの生成が確認された。
【0066】
＜実施例６＞
Ｄ－リボース－１－リン酸のアンモニウム塩（２００ｍＭ）及びニコチンアミド（３７０ｍＭ）をそれぞれ含むＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）を０．９ｍｌ調製した。その後、実施例１と同様にして作製した配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰを発現する形質転換体の懸濁液を超音波破砕せずに０．０５ｇ添加して、２０℃の条件下で酵素反応を開始させた。
反応開始から所定時間経過後に、実施例１と同様にしてβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
Ｄ－リボース－１－リン酸のアンモニウム塩（２００ｍＭ）及びニコチンアミド（３７０ｍＭ）をそれぞれ含むＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）を０．９ｍｌ調製した。その後、実施例１と同様にして作製した配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰを発現する形質転換体の懸濁液を超音波破砕せずに０．０５ｇ添加して、２０℃の条件下で酵素反応を開始させた。
反応開始から所定時間経過後に、実施例１と同様にしてβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0067】
＜実施例７＞
ｐＨ６．０のＭＥＳバッファーに代えてｐＨ６．５のＭＥＳバッファーを使用したこと以外は実施例６と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
ｐＨ６．０のＭＥＳバッファーに代えてｐＨ６．５のＭＥＳバッファーを使用したこと以外は実施例６と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0068】
＜実施例８＞
ｐＨ６．０のＭＥＳバッファーに代えてｐＨ７．０のＴｒｉｓバッファーを使用したこと以外は実施例６と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
ｐＨ６．０のＭＥＳバッファーに代えてｐＨ７．０のＴｒｉｓバッファーを使用したこと以外は実施例６と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0069】
＜実施例９＞
ｐＨ６．０のＭＥＳバッファーに代えてｐＨ７．５のＴｒｉｓバッファーを使用したこと以外は実施例６と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
ｐＨ６．０のＭＥＳバッファーに代えてｐＨ７．５のＴｒｉｓバッファーを使用したこと以外は実施例６と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0070】
（反応初速の評価）
実施例１と同様にして求めた反応初速の指標を、実施例８の結果を１００としたときの相対値に換算した。結果を表４に示す。
実施例１と同様にして求めた反応初速の指標を、実施例８の結果を１００としたときの相対値に換算した。結果を表４に示す。
【0071】
【表4】
【0072】
表４に示すように、酵素反応に特定ＰＮＰを使用した場合は反応溶液が弱塩基性である場合に比べ、反応溶液が弱酸性である場合のニコチンアミドリボシドの生成量が多かった。この理由としては特定ＰＮＰが弱酸性の条件下で特に優れた活性を示すこと、酵素反応により生成したβ－ニコチンアミドリボシドの分解が抑制されたこと、などが考えられる。
【0073】
＜実施例１０＞
Ｄ－リボース－１－リン酸のアンモニウム塩（２００ｍＭ）及びニコチンアミド（３７０ｍＭ）をそれぞれ含むＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）を０．９ｍｌ調製した。その後、実施例１と同様にして作製した配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰを発現する形質転換体の懸濁液を超音波破砕せずに０．０５ｇ添加して、２０℃の条件下で酵素反応を開始させた。
反応開始から所定時間経過後に、実施例１と同様にしてβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
Ｄ－リボース－１－リン酸のアンモニウム塩（２００ｍＭ）及びニコチンアミド（３７０ｍＭ）をそれぞれ含むＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）を０．９ｍｌ調製した。その後、実施例１と同様にして作製した配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＮＰを発現する形質転換体の懸濁液を超音波破砕せずに０．０５ｇ添加して、２０℃の条件下で酵素反応を開始させた。
反応開始から所定時間経過後に、実施例１と同様にしてβ－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0074】
＜実施例１１＞
反応温度を２５℃に変更したこと以外は実施例１０と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
反応温度を２５℃に変更したこと以外は実施例１０と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0075】
＜実施例１２＞
反応温度を３０℃に変更したこと以外は実施例１０と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
反応温度を３０℃に変更したこと以外は実施例１０と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0076】
＜実施例１３＞
反応温度を３５℃に変更したこと以外は実施例１０と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
反応温度を３５℃に変更したこと以外は実施例１０と同様にして酵素反応を開始させ、β－ニコチンアミドリボシドの生成量を調べた。
【0077】
（反応初速の評価）
実施例１と同様にして求めた反応初速の指標を、実施例１０の結果を１００としたときの相対値に換算した。結果を表５に示す。
実施例１と同様にして求めた反応初速の指標を、実施例１０の結果を１００としたときの相対値に換算した。結果を表５に示す。
【0078】
【表5】
【0079】
表５に示すように、反応溶液の温度が３０℃以上の場合に反応初速がより優れていることが確認された。
【0080】
＜ＰＮＰのアミノ酸配列＞
配列番号１～５３のアミノ酸配列を有するＰＮＰの詳細は下記の通りである。「配列同一性」は配列番号１との配列同一性を示す。
配列番号１～４７は、いずれもクロロフレクサス門に分類される菌株由来のＰＮＰのアミノ酸配列である。
配列番号８、３１、３５、４０、４４、４５及び４６以外のアミノ酸配列は、クロロフレクサス門のクテドノバクテル綱に分類される菌株由来のＰＮＰのアミノ酸配列であることが分かっている。これらの中でも配列番号１６、１７、１８、１９、２４、２６、２８、３０、３８、３９及び４３以外のアミノ酸配列は、クテドノバクテル網のThermosporothrix属、Thermogemmatispora属、Dictyobacter属、Ktedonospora属、Ktedonosporobacter属、Ktedonobacter属、Tengunoibacter属及びReticulibacter属から選ばれる菌株由来のＰＮＰのアミノ酸配列であることが分かっている。
配列番号１～５３のアミノ酸配列を有するＰＮＰの詳細は下記の通りである。「配列同一性」は配列番号１との配列同一性を示す。
配列番号１～４７は、いずれもクロロフレクサス門に分類される菌株由来のＰＮＰのアミノ酸配列である。
配列番号８、３１、３５、４０、４４、４５及び４６以外のアミノ酸配列は、クロロフレクサス門のクテドノバクテル綱に分類される菌株由来のＰＮＰのアミノ酸配列であることが分かっている。これらの中でも配列番号１６、１７、１８、１９、２４、２６、２８、３０、３８、３９及び４３以外のアミノ酸配列は、クテドノバクテル網のThermosporothrix属、Thermogemmatispora属、Dictyobacter属、Ktedonospora属、Ktedonosporobacter属、Ktedonobacter属、Tengunoibacter属及びReticulibacter属から選ばれる菌株由来のＰＮＰのアミノ酸配列であることが分かっている。
【0081】
（配列番号１）
Thermosporothrix hazakensisに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_111319557.1又はNo. GCE47107.1、配列同一性：１００．００％、アミノ酸配列：MQYENVAEAVRAIQARTTLKPRVALILGSGLGDLAAELVDATAIPYAEIPHFARSTVIGHAGRLLLGTLEGVPVVVMQGRFHLYEGYSPEVITFPIRVMRLLGAEILIVTNAAGGVNPAYATGDIMLLKDHIFLPGMAGLNPLIGPNDERFGERFPPLAHAYDVELREVARTVAQSWPDLTLQEGIYTMVTGPNYETSAELRFLRTIGTDAVGMSTVPEVVVARHMRMRVLGLSLISNEATGDEEAEVNHEEVLEAANAARPKFTALVRGIIRSLQ
Thermosporothrix hazakensisに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_111319557.1又はNo. GCE47107.1、配列同一性：１００．００％、アミノ酸配列：MQYENVAEAVRAIQARTTLKPRVALILGSGLGDLAAELVDATAIPYAEIPHFARSTVIGHAGRLLLGTLEGVPVVVMQGRFHLYEGYSPEVITFPIRVMRLLGAEILIVTNAAGGVNPAYATGDIMLLKDHIFLPGMAGLNPLIGPNDERFGERFPPLAHAYDVELREVARTVAQSWPDLTLQEGIYTMVTGPNYETSAELRFLRTIGTDAVGMSTVPEVVVARHMRMRVLGLSLISNEATGDEEAEVNHEEVLEAANAARPKFTALVRGIIRSLQ
【0082】
（配列番号２）
Thermogemmatispora carboxidivoransに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_052887964.1、配列同一性：６３．０４％）
Thermogemmatispora carboxidivoransに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_052887964.1、配列同一性：６３．０４％）
【0083】
（配列番号３）
Dictyobacter kobayashiiに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_126551910.1、配列同一性：６５．０９％）
Dictyobacter kobayashiiに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_126551910.1、配列同一性：６５．０９％）
【0084】
（配列番号４）
Ktedonospora formicarumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_220194470.1、配列同一性：６６．５５％）
Ktedonospora formicarumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_220194470.1、配列同一性：６６．５５％）
【0085】
（配列番号５）
Ktedonosporobacter rubrisoliに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_129894802.1又はNo. WP_242527237.1、配列同一性：７１．２７％）
Ktedonosporobacter rubrisoliに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_129894802.1又はNo. WP_242527237.1、配列同一性：７１．２７％）
【0086】
（配列番号６）
Tengunoibacter tsumagoiensisに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_126580994.1、配列同一性：７２．００％）
Tengunoibacter tsumagoiensisに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_126580994.1、配列同一性：７２．００％）
【0087】
（配列番号７）
Reticulibacter mediterraneiに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_220206210.1、配列同一性：７３．７２％）
Reticulibacter mediterraneiに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_220206210.1、配列同一性：７３．７２％）
【0088】
（配列番号８）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. RMF38962.1、配列同一性：６０．７３％）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. RMF38962.1、配列同一性：６０．７３％）
【0089】
（配列番号９）
Thermogemmatispora sp. に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBX5451239.1、配列同一性：６１．０９％）
Thermogemmatispora sp. に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBX5451239.1、配列同一性：６１．０９％）
【0090】
（配列番号１０）
Thermogemmatispora sp. に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBX5456753.1、配列同一性：６２．５５％）
Thermogemmatispora sp. に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBX5456753.1、配列同一性：６２．５５％）
【0091】
（配列番号１１）
Thermogemmatispora tikiterensisに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_112428829.1、配列同一性：６３．２７％）
Thermogemmatispora tikiterensisに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_112428829.1、配列同一性：６３．２７％）
【0092】
（配列番号１２）
Thermogemmatispora aurantiaに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_151727093.1、配列同一性：６３．６４％）
Thermogemmatispora aurantiaに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_151727093.1、配列同一性：６３．６４％）
【0093】
（配列番号１３）
Thermogemmatispora argillosaに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. BBH94885.1、配列同一性：６４．００％）
Thermogemmatispora argillosaに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. BBH94885.1、配列同一性：６４．００％）
【0094】
（配列番号１４）
Thermogemmatispora onikobensisに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_069802866.1、配列同一性：６４．１３％）
Thermogemmatispora onikobensisに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_069802866.1、配列同一性：６４．１３％）
【0095】
（配列番号１５）
Thermogemmatispora sp.に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBE3566025.1、配列同一性：６４．３６％）
Thermogemmatispora sp.に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBE3566025.1、配列同一性：６４．３６％）
【0096】
（配列番号１６）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBV9689750.1、配列同一性：６５．０９％）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBV9689750.1、配列同一性：６５．０９％）
【0097】
（配列番号１７）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBV9019792.1、配列同一性：６５．８２％）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBV9019792.1、配列同一性：６５．８２％）
【0098】
（配列番号１８）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBV8822435.1、配列同一性：６５．８２％）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBV8822435.1、配列同一性：６５．８２％）
【0099】
（配列番号１９）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBV8695491.1、配列同一性：６６．１８％）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBV8695491.1、配列同一性：６６．１８％）
【0100】
（配列番号２０）
Dictyobacter alpinusに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_126628037.1、配列同一性：６６．１８％）
Dictyobacter alpinusに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_126628037.1、配列同一性：６６．１８％）
【0101】
（配列番号２１）
Dictyobacter aurantiacusに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_126597151.1、配列同一性：６６．９１％）
Dictyobacter aurantiacusに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_126597151.1、配列同一性：６６．９１％）
【0102】
（配列番号２２）
Thermosporothrix sp. COM3に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. BBH88921.1、配列同一性：９９．６４％）
Thermosporothrix sp. COM3に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. BBH88921.1、配列同一性：９９．６４％）
【0103】
（配列番号２３）
Thermosporothrix hazakensisに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. PZW36453.1、配列同一性：１００．００％）
Thermosporothrix hazakensisに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. PZW36453.1、配列同一性：１００．００％）
【0104】
（配列番号２４）
Ktedonobacteria bacteriumbrp13に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. BCL80434.1、配列同一性：６７．０３％）
Ktedonobacteria bacteriumbrp13に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. BCL80434.1、配列同一性：６７．０３％）
【0105】
（配列番号２５）
Dictyobacter formicarumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_201360726.1、配列同一性：６７．６４％）
Dictyobacter formicarumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_201360726.1、配列同一性：６７．６４％）
【0106】
（配列番号２６）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBO0791435.1、配列同一性：６７．８８％）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBO0791435.1、配列同一性：６７．８８％）
【0107】
（配列番号２７）
Ktedonobacter sp.に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. HCI78926.1、配列同一性：６８．２５％）
Ktedonobacter sp.に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. HCI78926.1、配列同一性：６８．２５％）
【0108】
（配列番号２８）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBO0777434.1、配列同一性：６８．２５％）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBO0777434.1、配列同一性：６８．２５％）
【0109】
（配列番号２９）
Ktedonobacter sp. SOSP1-85に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_201379869.1、配列同一性：６９．０９％）
Ktedonobacter sp. SOSP1-85に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_201379869.1、配列同一性：６９．０９％）
【0110】
（配列番号３０）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBA2392883.1、配列同一性：６９．１８％）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBA2392883.1、配列同一性：６９．１８％）
【0111】
（配列番号３１）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. TMD61560.1、配列同一性：６９．２３％）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. TMD61560.1、配列同一性：６９．２３％）
【0112】
（配列番号３２）
Ktedonobacter racemiferに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_007906525.1、配列同一性：６９．４５％）
Ktedonobacter racemiferに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_007906525.1、配列同一性：６９．４５％）
【0113】
（配列番号３３）
Dictyobacter arantiisoliに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. GCF07079.1、配列同一性：６９．４５％）
Dictyobacter arantiisoliに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. GCF07079.1、配列同一性：６９．４５％）
【0114】
（配列番号３４）
Dictyobacter arantiisoliに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_216368759.1、配列同一性：６９．４５％）
Dictyobacter arantiisoliに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_216368759.1、配列同一性：６９．４５％）
【0115】
（配列番号３５）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. TMF47169.1、配列同一性：６９．６０％）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. TMF47169.1、配列同一性：６９．６０％）
【0116】
（配列番号３６）
Ktedonobacter robiniaeに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_201371297.1、配列同一性：６９．８２％）
Ktedonobacter robiniaeに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_201371297.1、配列同一性：６９．８２％）
【0117】
（配列番号３７）
Ktedonobacter sp. SOSP1-52に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_201387047.1、配列同一性：６９．８２％）
Ktedonobacter sp. SOSP1-52に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_201387047.1、配列同一性：６９．８２％）
【0118】
（配列番号３８）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBE3560227.1、配列同一性：７０．１８％）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBE3560227.1、配列同一性：７０．１８％）
【0119】
（配列番号３９）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBA2681952.1、配列同一性：７０．４８％）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBA2681952.1、配列同一性：７０．４８％）
【0120】
（配列番号４０）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBV9231619.1、配列同一性：７０．５５％）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBV9231619.1、配列同一性：７０．５５％）
【0121】
（配列番号４１）
Ktedonobacter sp. 13_1_20CM_4_53_11に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. OLE04335.1、配列同一性：７０．７０％）
Ktedonobacter sp. 13_1_20CM_4_53_11に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. OLE04335.1、配列同一性：７０．７０％）
【0122】
（配列番号４２）
Ktedonobacter sp.に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. HHS57294.1、配列同一性：７０．８０％）
Ktedonobacter sp.に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. HHS57294.1、配列同一性：７０．８０％）
【0123】
（配列番号４３）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBA2286753.1、配列同一性：７０．９１％）
Ktedonobacteraceae bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. MBA2286753.1、配列同一性：７０．９１％）
【0124】
（配列番号４４）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. TMC19297.1、配列同一性：７１．０６％）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. TMC19297.1、配列同一性：７１．０６％）
【0125】
（配列番号４５）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. TMB81982.1、配列同一性：７３．２６％）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. TMB81982.1、配列同一性：７３．２６％）
【0126】
（配列番号４６）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. TMC34895.1、配列同一性：７１．０６％）
Chloroflexi bacteriumに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. TMC34895.1、配列同一性：７１．０６％）
【0127】
（配列番号４７）
Ktedonobacter sp.に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. HCJ33365.1、配列同一性：７４．０７％）
Ktedonobacter sp.に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. HCJ33365.1、配列同一性：７４．０７％）
【0128】
（配列番号４８）
プロテオバクテリア門、ガンマプロテオバクテリア綱、Escherichia coliに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_000224877.1、配列同一性なし）
プロテオバクテリア門、ガンマプロテオバクテリア綱、Escherichia coliに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_000224877.1、配列同一性なし）
【0129】
（配列番号４９）
プロテオバクテリア門、ガンマプロテオバクテリア綱、Klebsiella sp. に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. CAA61136.1、配列同一性なし）
プロテオバクテリア門、ガンマプロテオバクテリア綱、Klebsiella sp. に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. CAA61136.1、配列同一性なし）
【0130】
（配列番号５０）
クレン古細菌門、テルモプロテウス綱、Aeropyrum pernix K1. に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. BAA79977.2、配列同一性なし）
クレン古細菌門、テルモプロテウス綱、Aeropyrum pernix K1. に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. BAA79977.2、配列同一性なし）
【0131】
（配列番号５１）
デイノコッカス－サーマス門、デイノコッカス綱、Thermus Thermophilus HB27に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_011172648.1、配列同一性：５２．４％）
デイノコッカス－サーマス門、デイノコッカス綱、Thermus Thermophilus HB27に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_011172648.1、配列同一性：５２．４％）
【0132】
（配列番号５２）
プロテオバクテリア門、ガンマプロテオバクテリア綱、Escherichia coliに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_000084573.1、配列同一性：４６．７％）
プロテオバクテリア門、ガンマプロテオバクテリア綱、Escherichia coliに由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_000084573.1、配列同一性：４６．７％）
【0133】
（配列番号５３）
デイノコッカス－サーマス門、デイノコッカス綱、Thermus Thermophilus HB27に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_011173486.1、配列同一性なし）
デイノコッカス－サーマス門、デイノコッカス綱、Thermus Thermophilus HB27に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Genbank Accession No. WP_011173486.1、配列同一性なし）
【配列表】