(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024030821
(43)【公開日】2024-03-07
(54)【発明の名称】画像処理装置、画像処理方法および画像処理プログラム
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20240229BHJP
C12M 1/34 20060101ALN20240229BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 Z
C12M1/34 D
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022133980
(22)【出願日】2022-08-25
(71)【出願人】
【識別番号】000006507
【氏名又は名称】横河電機株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100206081
【弁理士】
【氏名又は名称】片岡 央
(74)【代理人】
【識別番号】100167553
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 久典
(74)【代理人】
【識別番号】100181124
【弁理士】
【氏名又は名称】沖田 壮男
(72)【発明者】
【氏名】青木 秀年
【テーマコード（参考）】
2G043
4B029
【Ｆターム（参考）】
2G043AA03
2G043BA16
2G043CA04
2G043DA06
2G043FA01
2G043LA03
2G043MA01
2G043NA01
4B029AA07
4B029BB11
4B029BB12
4B029FA01
(57)【要約】
【課題】精度の高い試料の評価を可能とする画像処理装置、画像処理方法および画像処理プログラムを提供する。
【解決手段】画像処理装置は、取得処理部と、領域分け処理部と、区画処理部と、補正処理部と、統合処理部とを備える。取得処理部は、励起光による試料の励起光画像と、励起光により蛍光物質が発する蛍光による蛍光画像とを取得する。領域分け処理部は、励起光画像を、試料に相当する対象領域と、対象領域以外の領域である非対象領域とに分ける。区画処理部は、対象領域を複数の第１単位区画に分け、第１単位区画ごとに励起光量を定める。補正処理部は、第１単位区画ごとの励起光量に基づいて、第１単位区画に相当する蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する。統合処理部は、補正された複数の第２単位区画を統合することによって、補正された蛍光画像を得る。
【選択図】図１
【解決手段】画像処理装置は、取得処理部と、領域分け処理部と、区画処理部と、補正処理部と、統合処理部とを備える。取得処理部は、励起光による試料の励起光画像と、励起光により蛍光物質が発する蛍光による蛍光画像とを取得する。領域分け処理部は、励起光画像を、試料に相当する対象領域と、対象領域以外の領域である非対象領域とに分ける。区画処理部は、対象領域を複数の第１単位区画に分け、第１単位区画ごとに励起光量を定める。補正処理部は、第１単位区画ごとの励起光量に基づいて、第１単位区画に相当する蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する。統合処理部は、補正された複数の第２単位区画を統合することによって、補正された蛍光画像を得る。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
蛍光物質を含む試料に励起光を照射して得られる、前記励起光による前記試料の励起光画像と、前記励起光により前記蛍光物質が発する蛍光による蛍光画像とを取得する取得処理部と、
前記励起光画像を、前記試料に相当する対象領域と、前記対象領域以外の領域である非対象領域とに分ける領域分け処理部と、
前記対象領域を複数の第１単位区画に分け、前記第１単位区画ごとに励起光量を定める区画処理部と、
前記第１単位区画ごとの前記励起光量に基づいて、前記第１単位区画に相当する前記蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する補正処理部と、
前記補正された複数の前記第２単位区画を統合することによって、補正された前記蛍光画像を得る統合処理部と、
を備える画像処理装置。
前記励起光画像を、前記試料に相当する対象領域と、前記対象領域以外の領域である非対象領域とに分ける領域分け処理部と、
前記対象領域を複数の第１単位区画に分け、前記第１単位区画ごとに励起光量を定める区画処理部と、
前記第１単位区画ごとの前記励起光量に基づいて、前記第１単位区画に相当する前記蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する補正処理部と、
前記補正された複数の前記第２単位区画を統合することによって、補正された前記蛍光画像を得る統合処理部と、
を備える画像処理装置。
【請求項2】
前記補正処理部は、複数の前記第１単位区画のうちの第ｎ番目（ｎは２以上の整数）の前記第１単位区画における励起光量をＥｎとし、第ｎ番目の前記第１単位区画に相当する第ｎ番目の前記第２単位区画における蛍光光量をＰｎとし、前記励起光画像全体の励起光量の最大値をＥＡとして、次の式（１）で表される演算を行って、第ｎ番目の前記第２単位区画における補正された前記蛍光光量Ｐｃｎを求める、請求項１記載の画像処理装置。
【数1】
【請求項3】
前記補正処理部は、第ｎ番目の前記第１単位区画における励起光量Ｅｎを、前記非対象領域における励起光量を基準として求める、請求項２記載の画像処理装置。
【請求項4】
前記励起光画像および前記蛍光画像は、前記蛍光物質を含む前記試料を板状の導波基材の表面に接触させた状態で、前記励起光を前記導波基材の内部から前記試料に入射させて前記試料を撮像して得られた画像である、請求項１から請求項３の何れか一項に記載の画像処理装置。
【請求項5】
蛍光物質を含む試料に励起光を照射し、前記励起光による前記試料の励起光画像と、前記励起光により前記蛍光物質が発する蛍光による蛍光画像とを取得する取得ステップと、
前記励起光画像を、前記試料に相当する対象領域と、前記対象領域以外の領域である非対象領域とに分ける領域分けステップと、
前記対象領域を複数の第１単位区画に分け、前記第１単位区画ごとに励起光量を定める区画ステップと、
前記第１単位区画ごとの前記励起光量に基づいて、前記第１単位区画に相当する前記蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する補正ステップと、
前記補正された複数の前記第２単位区画を統合することによって、補正された前記蛍光画像を得る統合ステップと、
を含む画像処理方法。
前記励起光画像を、前記試料に相当する対象領域と、前記対象領域以外の領域である非対象領域とに分ける領域分けステップと、
前記対象領域を複数の第１単位区画に分け、前記第１単位区画ごとに励起光量を定める区画ステップと、
前記第１単位区画ごとの前記励起光量に基づいて、前記第１単位区画に相当する前記蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する補正ステップと、
前記補正された複数の前記第２単位区画を統合することによって、補正された前記蛍光画像を得る統合ステップと、
を含む画像処理方法。
【請求項6】
蛍光物質を含む試料に励起光を照射し、前記励起光による前記試料の励起光画像と、前記励起光により前記蛍光物質が発する蛍光による蛍光画像とを取得する取得ステップと、
前記励起光画像を、前記試料に相当する対象領域と、前記対象領域以外の領域である非対象領域とに分ける領域分けステップと、
前記対象領域を複数の第１単位区画に分け、前記第１単位区画ごとに励起光量を定める区画ステップと、
前記第１単位区画ごとの前記励起光量に基づいて、前記第１単位区画に相当する前記蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する補正ステップと、
前記補正された複数の前記第２単位区画を統合することによって、補正された前記蛍光画像を得る統合ステップと、
をコンピュータに実行させるための画像処理プログラム。
前記励起光画像を、前記試料に相当する対象領域と、前記対象領域以外の領域である非対象領域とに分ける領域分けステップと、
前記対象領域を複数の第１単位区画に分け、前記第１単位区画ごとに励起光量を定める区画ステップと、
前記第１単位区画ごとの前記励起光量に基づいて、前記第１単位区画に相当する前記蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する補正ステップと、
前記補正された複数の前記第２単位区画を統合することによって、補正された前記蛍光画像を得る統合ステップと、
をコンピュータに実行させるための画像処理プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、画像処理装置、画像処理方法および画像処理プログラムに関する。
【背景技術】
【0002】
細胞などの試料を評価するには、例えば、蛍光画像を観察する装置を使用できる。この装置は、蛍光物質を含ませた試料に光を照射し、蛍光物質が発する蛍光による蛍光画像を得る。試料は、蛍光画像に基づいて評価することができる（例えば、特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２０１９－３５８５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
前記技術では、複数の試料（細胞）が重なり合っている場合などに、光の散乱などが起こりやすくなる。その場合、蛍光の強度が蛍光物質の量を反映するとは限らないため、画像に基づいて正確に試料を評価するのが難しくなる可能性があった。
【0005】
本発明は、上述する問題点に鑑みてなされたもので、精度の高い試料の評価を可能とする画像処理装置、画像処理方法および画像処理プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の一態様は、蛍光物質を含む試料に励起光を照射して得られる、前記励起光による前記試料の励起光画像と、前記励起光により前記蛍光物質が発する蛍光による蛍光画像とを取得する取得処理部と、前記励起光画像を、前記試料に相当する対象領域と、前記対象領域以外の領域である非対象領域とに分ける領域分け処理部と、前記対象領域を複数の第１単位区画に分け、前記第１単位区画ごとに励起光量を定める区画処理部と、前記第１単位区画ごとの前記励起光量に基づいて、前記第１単位区画に相当する前記蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する補正処理部と、前記補正された複数の前記第２単位区画を統合することによって、補正された前記蛍光画像を得る統合処理部と、を備える画像処理装置である。
【0007】
本発明の一態様は、前記画像処理装置であって、前記補正処理部は、複数の前記第１単位区画のうちの第ｎ番目（ｎは２以上の整数）の前記第１単位区画における励起光量をＥｎとし、第ｎ番目の前記第１単位区画に相当する第ｎ番目の前記第２単位区画における蛍光光量をＰｎとし、前記励起光画像全体の励起光量の最大値をＥＡとして、次の式（１）で表される演算を行って、第ｎ番目の前記第２単位区画における補正された前記蛍光光量Ｐｃｎを求める。
【数1】
【0008】
本発明の一態様は、前記画像処理装置であって、前記補正処理部は、第ｎ番目の前記第１単位区画における励起光量Ｅｎを、前記非対象領域における励起光量を基準として求める。
【0009】
本発明の一態様は、前記画像処理装置であって、前記励起光画像および前記蛍光画像は、前記蛍光物質を含む前記試料を板状の導波基材の表面に接触させた状態で、前記励起光を前記導波基材の内部から前記試料に入射させて前記試料を撮像して得られた画像である。
【0010】
本発明の一態様は、蛍光物質を含む試料に励起光を照射し、前記励起光による前記試料の励起光画像と、前記励起光により前記蛍光物質が発する蛍光による蛍光画像とを取得する取得ステップと、前記励起光画像を、前記試料に相当する対象領域と、前記対象領域以外の領域である非対象領域とに分ける領域分けステップと、前記対象領域を複数の第１単位区画に分け、前記第１単位区画ごとに励起光量を定める区画ステップと、前記第１単位区画ごとの前記励起光量に基づいて、前記第１単位区画に相当する前記蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する補正ステップと、前記補正された複数の前記第２単位区画を統合することによって、補正された前記蛍光画像を得る統合ステップと、を含む画像処理方法である。
【0011】
本発明の一態様は、蛍光物質を含む試料に励起光を照射し、前記励起光による前記試料の励起光画像と、前記励起光により前記蛍光物質が発する蛍光による蛍光画像とを取得する取得ステップと、前記励起光画像を、前記試料に相当する対象領域と、前記対象領域以外の領域である非対象領域とに分ける領域分けステップと、前記対象領域を複数の第１単位区画に分け、前記第１単位区画ごとに励起光量を定める区画ステップと、前記第１単位区画ごとの前記励起光量に基づいて、前記第１単位区画に相当する前記蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する補正ステップと、前記補正された複数の前記第２単位区画を統合することによって、補正された前記蛍光画像を得る統合ステップと、をコンピュータに実行させるための画像処理プログラムである。
【発明の効果】
【0012】
本発明の一態様によれば、精度の高い試料の評価を可能とする画像処理装置、画像処理方法および画像処理プログラムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】実施形態に係る画像処理装置を備える観察システムの構成図である。
【図2】実施形態に係る画像処理装置を備える観察システムの制御系の構成を示すブロック図である。
【図3】培養容器における光の導波を説明する図である。
【図4】実施形態に係る画像処理方法のフロー図である。
【図5】励起光画像の濃淡値の例を示す図である。
【図6】補正処理の例を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、図面を参照して、本発明に係る画像処理装置、画像処理方法および画像処理プログラムの一実施形態について説明する。以下では、まず本発明の実施形態の概要について説明し、続いて本発明の実施形態の詳細について説明する。
【0015】
〔概要〕
本発明の実施形態は、精度の高い試料の評価を可能とするためのものである。具体的には、画像中の蛍光物質の量を相対的に比較可能とし、試料における蛍光物質の分布を可視化することによって、精度の高い試料の評価を実現する。
本発明の実施形態は、精度の高い試料の評価を可能とするためのものである。具体的には、画像中の蛍光物質の量を相対的に比較可能とし、試料における蛍光物質の分布を可視化することによって、精度の高い試料の評価を実現する。
【0016】
細胞などの試料を評価するには、蛍光物質を含ませた試料に励起光を照射する。励起光により蛍光物質が発する蛍光による蛍光画像を取得する。試料は、蛍光画像に基づいて評価することができる。
一般的な試料の評価では、蛍光画像の蛍光光量に基づいて蛍光物質の存在量を相対的に比較することができる。一般的な蛍光計測では、計測対象に対して均一に励起光が照射されることを前提としている。
一般的な試料の評価では、蛍光画像の蛍光光量に基づいて蛍光物質の存在量を相対的に比較することができる。一般的な蛍光計測では、計測対象に対して均一に励起光が照射されることを前提としている。
【0017】
しかし、試料と観察に用いる光学系の組み合わせによっては、蛍光光量に基づいて蛍光物質の存在量を把握することが難しくなることがある。例えば、試料内部を透過する過程で光が屈折・散乱するような暗視野光学系などの光学系を使用し、試料が細胞である場合、試料（細胞）の内部構造は均一ではなく、複数の細胞は互いに重なることもあるため、細胞内に入射した励起光は細胞内で散乱し、内部構造や細胞の重なりに応じて明暗が生じる。このような励起光の明暗が生じた場合、蛍光の強度は蛍光物質の量を反映しない。そのため、上記の光学系による画像情報から得た蛍光強度に基づいて蛍光物質の量を比較することは現実的ではない。
【0018】
本発明の実施形態では、励起光画像のうち、試料に相当する対象領域を複数の第１単位区画に分ける。第１単位区画ごとに励起光量を定める。励起光画像の第１単位区画に相当する蛍光画像の第２単位区画を定める。励起光画像の第１単位区画ごとの励起光量に基づいて、蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する。補正された複数の第２単位区画を統合する。
補正された蛍光画像は、蛍光物質の量を反映した蛍光光量を示すため、画像中の蛍光物質の量を相対的に比較可能になる。そのため、試料における蛍光物質の分布を可視化することができる。よって、精度の高い試料の評価が可能となる。
補正された蛍光画像は、蛍光物質の量を反映した蛍光光量を示すため、画像中の蛍光物質の量を相対的に比較可能になる。そのため、試料における蛍光物質の分布を可視化することができる。よって、精度の高い試料の評価が可能となる。
【0019】
〔実施形態〕
＜観察システム＞
図１は、実施形態に係る画像処理装置を備える観察システムの構成図である。図２は、観察システムの制御系の構成を示すブロック図である。図３は、培養容器１０における光の導波を説明する図である。
＜観察システム＞
図１は、実施形態に係る画像処理装置を備える観察システムの構成図である。図２は、観察システムの制御系の構成を示すブロック図である。図３は、培養容器１０における光の導波を説明する図である。
【0020】
図１に示すように、観察システム１００は、培養容器１０と、光源２０と、撮像部３０と、画像処理装置４０と、を備える。
【0021】
培養容器１０は、導波基材２と、囲壁３とを備えている。培養容器１０は、導波基材２上の細胞Ｘの培養を行うための容器である。細胞Ｘは、導波基材２の上面２ａに接触して保持される。培養容器１０は、導波基材２に測定光を導入し、撮像部３０で画像を取得することで、細胞Ｘの観察を行うことができる。細胞Ｘは、試料の一例である。
【0022】
導波基材２は、上面２ａ（表面）と底面２ｂとを有する板状体である。導波基材２は、側端面２ｃとして、左側端面２ｃ１および右側端面２ｃ２を有する。左側端面２ｃ１は、外部から励起光Ｌが入射される入射端面である。導波基材２の上面２ａおよび底面２ｂは平面である。囲壁３によって囲まれた空間は細胞培養空間Ｋである。細胞Ｘは、例えば、細胞培養空間Ｋに臨む上面２ａの一部領域に接着される。
【0023】
導波基材２は、入射端面とされた左側端面２ｃ１から入射された励起光Ｌを、内部で全反射させながら右側端面２ｃ２に向けて導波する導波路として機能する（図３参照）。導波基材２は、励起光Ｌに対して透明な材料によって形成されている。導波基材２は、例えば、ガラス、ポリスチレンなどによって形成することができる。
【0024】
囲壁３は、上面２ａと垂直な軸芯Ｌａを中心軸とする円筒状部材である。囲壁３は、導波基材２の上面２ａに立設されている。
【0025】
光源２０は、励起光Ｌを発する。光源２０としては、レーザ光源、ＬＥＤ、レーザーダイオード、白色光源などが使用できる。光源２０は、導波基材２の左側端面２ｃ１と対向するように、培養容器１０の側方に配置されている。
【0026】
図３に示すように、左側端面２ｃ１から導波基材２の内部に入射した励起光Ｌは、導波基材２の上面２ａと底面２ｂとで全反射されながら、導波基材２の右側端面２ｃ２に向かって導波される。
【0027】
導波基材２の上面２ａに細胞Ｘがあると、励起光Ｌの一部は導波基材２から細胞Ｘに進入する。細胞Ｘに進入した励起光Ｌは、細胞Ｘの内部、細胞Ｘと導波基材２との界面などで散乱した後、細胞Ｘから出射する。
【0028】
図１に示すように、撮像部３０は、細胞Ｘから出射した光を受光する撮像素子を備える。撮像素子には、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）画像センサ、ＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）画像センサなどが使用できる。撮像部３０は、細胞培養空間Ｋに臨む上面２ａの領域の全体または一部を撮像する。撮像部３０は、培養容器１０の上方に配置されている。
【0029】
＜画像処理装置＞
図２に示すように、画像処理装置４０は、制御部４１と、表示部４２と、記憶部４３と、操作部４４とを備える。表示部４２は、励起光画像および蛍光画像などを表示できる。記憶部４３は、制御部４１で得られた画像、演算結果などのデータを記憶する。操作部４４は、ユーザの入力操作を受け付ける。
図２に示すように、画像処理装置４０は、制御部４１と、表示部４２と、記憶部４３と、操作部４４とを備える。表示部４２は、励起光画像および蛍光画像などを表示できる。記憶部４３は、制御部４１で得られた画像、演算結果などのデータを記憶する。操作部４４は、ユーザの入力操作を受け付ける。
【0030】
制御部４１は、取得処理部１１と、領域分け処理部１２と、区画処理部１３と、補正処理部１４と、統合処理部１５と、を備える。
取得処理部１１は、撮像部３０によって撮像された励起光画像および蛍光画像を取得する。励起光画像および蛍光画像は、例えば、細胞培養空間Ｋに臨む上面２ａの領域の全体または一部の画像である（図１参照）。
取得処理部１１は、撮像部３０によって撮像された励起光画像および蛍光画像を取得する。励起光画像および蛍光画像は、例えば、細胞培養空間Ｋに臨む上面２ａの領域の全体または一部の画像である（図１参照）。
【0031】
励起光画像は、励起光Ｌによる画像である。励起光画像は、少なくとも１つの細胞Ｘを含む領域の画像である。
【0032】
培養容器１０内には、蛍光物質が添加されている。蛍光物質は、例えば、細胞内、細胞表面、細胞近傍（細胞外であって細胞の近傍）などに存在する。蛍光物質は、励起光によって蛍光を発する。蛍光画像は、蛍光物質が発する蛍光による画像である。
【0033】
取得処理部１１が取得する蛍光画像は、例えば、励起光画像と同じ領域の画像である。蛍光画像は、例えば、励起光画像と同じ倍率で取得された画像である。
【0034】
領域分け処理部１２は、励起光画像を対象領域と非対象領域とに分ける。対象領域は、励起光画像のうち細胞Ｘに相当する領域である。非対象領域は、励起光画像のうち対象領域以外の領域である。励起光画像を対象領域と非対象領域とに分けるには、公知の画像処理方法を用いることができる。
【0035】
区画処理部１３は、対象領域を複数の第１単位区画に分ける。第１単位区画は、例えば、対象領域における１または複数ピクセルであってよい。
【0036】
区画処理部１３は、第１単位区画ごとに励起光量を定める。第１単位区画の励起光量は、非対象領域における励起光量を基準として求めることができる。第１単位区画の励起光量は、例えば、次のようにして定めることができる。まず、非対象領域の複数箇所で得られた光量（励起光量）に基づいて背景光量を定める。背景光量は、非対象領域の複数箇所で得られた光量（励起光量）の平均値、中央値などであってよい。第１単位区画の励起光量は、その第１単位区画の平均光量から背景光量を減じることで得られる。すなわち、第１単位区画の平均光量と背景光量との差分をとることによって、第１単位区画の励起光量を定めることができる。
【0037】
補正処理部１４は、蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する。第２単位区画は、第１単位区画に相当する区画である。すなわち、第２単位区画は、蛍光画像において、第１単位区画と同じ範囲の区画である。言い換えれば、蛍光画像の第２単位区画は、対象領域の第１単位区画と一致する区画である。
【0038】
補正処理部１４は、第１単位区画の励起光量に基づいて、第２単位区画における蛍光光量を補正する。以下、蛍光光量の補正処理の一例を説明する。
複数の第１単位区画のうち第ｎ番目（ｎは２以上の整数）の第１単位区画における励起光量をＥｎとする。第ｎ番目の第１単位区画に相当する第ｎ番目の第２単位区画における蛍光光量をＰｎとする。励起光画像全体の励起光量の最大値をＥＡとする。
複数の第１単位区画のうち第ｎ番目（ｎは２以上の整数）の第１単位区画における励起光量をＥｎとする。第ｎ番目の第１単位区画に相当する第ｎ番目の第２単位区画における蛍光光量をＰｎとする。励起光画像全体の励起光量の最大値をＥＡとする。
【0039】
第ｎ番目の第２単位区画における蛍光光量Ｐｎに、次の式（１）で表される演算を行うことによって、補正された蛍光光量Ｐｃｎが得られる。
【0040】
【数2】
【0041】
式（１）で表される演算は、励起光画像全体の励起光量の最大値ＥＡに対する第１単位区画における励起光量Ｅｎの比を、蛍光光量Ｐｎに乗じる演算である。
【0042】
統合処理部１５は、補正された複数の第２単位区画を統合することによって、補正された蛍光画像を得る。
【0043】
【0044】
（取得ステップ）
図３に示すように、細胞Ｘを導波基材２の上面２ａに接触した状態で保持する。細胞Ｘとしては、例えば、導波基材２上で集団を形成する細胞が挙げられる。細胞Ｘとしては、ｉＰＳ細胞などがある。培養容器１０内には、蛍光物質が添加されている。細胞Ｘは蛍光物質を含む。蛍光物質は、例えば、細胞内、細胞表面、細胞近傍（細胞外であって細胞の近傍）などに存在する。
図３に示すように、細胞Ｘを導波基材２の上面２ａに接触した状態で保持する。細胞Ｘとしては、例えば、導波基材２上で集団を形成する細胞が挙げられる。細胞Ｘとしては、ｉＰＳ細胞などがある。培養容器１０内には、蛍光物質が添加されている。細胞Ｘは蛍光物質を含む。蛍光物質は、例えば、細胞内、細胞表面、細胞近傍（細胞外であって細胞の近傍）などに存在する。
【0045】
励起光Ｌを細胞Ｘに照射する。詳しくは、励起光Ｌを左側端面２ｃ１から導波基材２の内部に入射させる。励起光Ｌは、導波基材２の上面２ａと底面２ｂとで全反射されながら、導波基材２の右側端面２ｃ２に向かって導波される。
【0046】
励起光Ｌの一部は導波基材２から細胞Ｘに進入する。細胞Ｘに進入した励起光Ｌは、細胞Ｘの内部、細胞Ｘと導波基材２との界面などで散乱した後、細胞Ｘから出射する。培養容器１０内の蛍光物質は、励起光によって蛍光を発する。
図４に示すように、取得処理部１１（図２参照）は、撮像部３０によって撮像された励起光画像および蛍光画像を取得する（ステップＳ１１）。
図４に示すように、取得処理部１１（図２参照）は、撮像部３０によって撮像された励起光画像および蛍光画像を取得する（ステップＳ１１）。
【0047】
（領域分けステップ）
領域分け処理部１２（図２参照）は、励起光画像を対象領域と非対象領域とに分ける（ステップＳ１２）。
領域分け処理部１２（図２参照）は、励起光画像を対象領域と非対象領域とに分ける（ステップＳ１２）。
【0048】
図５は、励起光画像の濃淡値の例を示す図である。図５の横軸は距離（ピクセル）を表す。図５の縦軸は濃淡値（Gray Value）を表す。図５に示すように、対象領域Ｒ１は、非対象領域Ｒ２に比べて濃淡値が高い。そのため、例えば、濃淡値に基づいて対象領域Ｒ１と非対象領域Ｒ２とを分けることができる。
励起光画像を対象領域と非対象領域とに分ける際は、機械学習を利用してもよい。
励起光画像を対象領域と非対象領域とに分ける際は、機械学習を利用してもよい。
【0049】
（区画ステップ）
区画処理部１３（図２参照）は、対象領域を複数の第１単位区画に分ける。区画処理部１３は、第１単位区画ごとに励起光量を定める（図４に示すステップＳ１３）。第１単位区画の励起光量は、例えば、前述のように、第１単位区画の平均光量と背景光量との差分をとることによって算出できる。
励起光画像に、対象物（細胞Ｘ）とは関係のない不規則部分（不規則な光強度を示す部分）がある場合は、この不規則部分をノイズとして除去するか、励起光量を定める対象から外すことができる。
区画処理部１３（図２参照）は、対象領域を複数の第１単位区画に分ける。区画処理部１３は、第１単位区画ごとに励起光量を定める（図４に示すステップＳ１３）。第１単位区画の励起光量は、例えば、前述のように、第１単位区画の平均光量と背景光量との差分をとることによって算出できる。
励起光画像に、対象物（細胞Ｘ）とは関係のない不規則部分（不規則な光強度を示す部分）がある場合は、この不規則部分をノイズとして除去するか、励起光量を定める対象から外すことができる。
【0050】
（補正ステップ）
補正処理部１４（図２参照）は、第１単位区画の励起光量に基づいて、蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する（図４に示すステップＳ１４）。
蛍光光量を補正する方法としては、蛍光光量Ｐｎに、前述の式（１）で表される演算を行う方法がある。
補正処理部１４（図２参照）は、第１単位区画の励起光量に基づいて、蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正する（図４に示すステップＳ１４）。
蛍光光量を補正する方法としては、蛍光光量Ｐｎに、前述の式（１）で表される演算を行う方法がある。
【0051】
図６（Ａ）～図６（Ｃ）は、補正処理の具体例を示す説明図である。図６（Ａ）は、第１～第５番目の第１単位区画における励起光量Ｅ１～Ｅ５を示す図である。図６（Ａ）に示すように、励起光量の最大値ＥＡはＥ２である。そのため、最大値ＥＡに対する励起光量Ｅ１～Ｅ５の比（Ｅｎ／ＥＡ）は、それぞれ０．５、１．０、０．５、０．７５、０．２５である。比（Ｅｎ／ＥＡ）は補正値ともいう。
【0052】
図６（Ｂ）は、第１～第５番目の第２単位区画における蛍光光量Ｐ１～Ｐ５を示す図である。図６（Ｃ）は、第１～第５番目の第２単位区画における、補正された蛍光光量ＰＣ１～ＰＣ５を示す図である。図６（Ｂ）および図６（Ｃ）に示すように、蛍光光量Ｐ１～Ｐ５に、それぞれ０．５、１．０、０．５、０．７５、０．２５を乗じることによって、補正された蛍光光量ＰＣ１～ＰＣ５が得られる。
【0053】
（統合ステップ）
統合処理部１５は、補正された複数の第２単位区画を統合することによって、補正された蛍光画像を得る（図４に示すステップＳ１５）。
統合処理部１５は、補正された複数の第２単位区画を統合することによって、補正された蛍光画像を得る（図４に示すステップＳ１５）。
【0054】
＜画像処理プログラム＞
図２に示す制御部４１（取得処理部１１、領域分け処理部１２、区画処理部１３、補正処理部１４および統合処理部１５）の一部または全部は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）等のプロセッサがプログラムを実行することにより、ソフトウェア的に実現される。制御部４１（取得処理部１１、領域分け処理部１２、区画処理部１３、補正処理部１４および統合処理部１５）の一部または全部の機能は、ソフトウェアとハードウェア資源とが協働することによって実現される。
図２に示す制御部４１（取得処理部１１、領域分け処理部１２、区画処理部１３、補正処理部１４および統合処理部１５）の一部または全部は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）等のプロセッサがプログラムを実行することにより、ソフトウェア的に実現される。制御部４１（取得処理部１１、領域分け処理部１２、区画処理部１３、補正処理部１４および統合処理部１５）の一部または全部の機能は、ソフトウェアとハードウェア資源とが協働することによって実現される。
【0055】
上記のプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されてもよい。コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、例えばフレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＣＤ－ＲＯＭ（Compact Disc Read Only Memory）等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置などの非一時的な記録媒体である。プログラムは、通信回線を経由して受信されてもよい。
【0056】
なお、上述した制御部４１（取得処理部１１、領域分け処理部１２、区画処理部１３、補正処理部１４および統合処理部１５）の一部または全部は、ハードウェアによって実現されてもよい。例えば、ＬＳＩ（Large Scale Integration circuit）、ＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）、ＰＬＤ（Programmable Logic Device）またはＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）等を用いた電子回路（electronic circuitまたはcircuitry）によって実現されても良い。上述の機能の一部（例えば、取得処理部１１、領域分け処理部１２、区画処理部１３、補正処理部１４および統合処理部１５）は、予め画像処理装置４０に搭載されている必要はなく、追加のアプリケーションプログラムが画像処理装置４０にインストールされることで実現されてもよい。
【0057】
本実施形態の画像処理装置４０によれば、励起光画像の第１単位区画ごとの励起光量に基づいて、蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正することができる。補正された複数の第２単位区画を統合することによって、補正された蛍光画像を得る。この蛍光画像は、蛍光物質の量を反映した蛍光光量を示すため、画像中の蛍光物質の量を相対的に比較可能になる。そのため、試料における蛍光物質の分布を可視化することができる。よって、精度の高い試料の評価が可能となる。
【0058】
補正処理部１４は、励起光量の最大値ＥＡに対する第１単位区画における励起光量Ｅｎの比を、蛍光光量Ｐｎに乗じることによって、蛍光光量の補正を行うことができる。これにより、蛍光物質の量を反映した蛍光光量が得られる。よって、画像中の蛍光物質の量を相対的に比較可能とすることができる。
【0059】
補正処理部１４では、第１単位区画における励起光量Ｅｎを、非対象領域における励起光量（背景光量）を基準として求めることができる。例えば、第１単位区画の平均光量と背景光量との差分をとることによって、第１単位区画の励起光量を定めることができる。そのため、画像中の蛍光物質の量を相対的に比較しやすくなる。
【0060】
励起光画像および蛍光画像は、蛍光物質を含む細胞Ｘを導波基材２の上面２ａに接触させた状態で、励起光を導波基材２の内部から細胞Ｘに入射させて細胞Ｘを撮像して得られた画像であってよい。これにより、高コントラストな細胞Ｘの観察が可能となる。
【0061】
本実施形態の画像処理方法によれば、励起光画像の第１単位区画ごとの励起光量に基づいて、蛍光画像の第２単位区画における蛍光光量を補正することができる。補正された複数の第２単位区画を統合することによって、補正された蛍光画像を得る。この蛍光画像は、蛍光物質の量を反映した蛍光光量を示すため、画像中の蛍光物質の量を相対的に比較可能になる。そのため、試料における蛍光物質の分布を可視化することができる。よって、精度の高い試料の評価が可能となる。
【0062】
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されない。上述した実施形態において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の趣旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づいて種々変更可能である。
【符号の説明】
【0063】
２…導波基材、１１…取得処理部、１２…領域分け処理部、１３…区画処理部、１４…補正処理部、１５…統合処理部、４０…画像処理装置、Ｒ１…対象領域、Ｒ２…非対象領域、Ｌ…励起光、Ｘ…細胞。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】