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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024000313
(43)【公開日】2024-01-05
(54)【発明の名称】蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20231225BHJP
C12Q 1/6823 20180101ALI20231225BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6823 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022099035
(22)【出願日】2022-06-20
(71)【出願人】
【識別番号】000003193
【氏名又は名称】ＴＯＰＰＡＮホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100139686
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 史朗
(74)【代理人】
【識別番号】100169764
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100147267
【弁理士】
【氏名又は名称】大槻 真紀子
(72)【発明者】
【氏名】荻野 雅之
(72)【発明者】
【氏名】岩坂 美咲
(72)【発明者】
【氏名】牧野 洋一
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 雄太
(72)【発明者】
【氏名】堀内 陽介
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR66
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）において、フラップエンドヌクレアーゼによる蛍光基質の切断効率を向上させる技術を提供する。
【解決手段】蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている、一本鎖オリゴヌクレオチド。
【選択図】なし
【解決手段】蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている、一本鎖オリゴヌクレオチド。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、
自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、
前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている、一本鎖オリゴヌクレオチド。
自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、
前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている、一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項2】
前記蛍光物質が、５’末端のヌクレオチド残基に標識されており、
フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、前記蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離する、請求項１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、前記蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離する、請求項１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項3】
前記オリゴヌクレオチド断片の長さが２残基以上である、請求項２に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項4】
５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基である、請求項２又は３に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項5】
前記ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含み、
前記消光物質が、前記相補的でない塩基対を構成するヌクレオチド残基のうち、より５’側に位置するヌクレオチド残基に標識されている、請求項２又は３に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
前記消光物質が、前記相補的でない塩基対を構成するヌクレオチド残基のうち、より５’側に位置するヌクレオチド残基に標識されている、請求項２又は３に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項6】
核酸三重鎖構造をフラップエンドヌクレアーゼで切断する場合の切断効率を向上させる方法であって、
フラップエンドヌクレアーゼに核酸三重鎖構造を接触させる工程を含み、
前記核酸三重鎖構造が、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドと、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドとを含み、
前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、前記３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、
前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている一本鎖オリゴヌクレオチドである、方法。
フラップエンドヌクレアーゼに核酸三重鎖構造を接触させる工程を含み、
前記核酸三重鎖構造が、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドと、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドとを含み、
前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、前記３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、
前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている一本鎖オリゴヌクレオチドである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【0002】
微量な解析対象分子の検出方法として、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した方法が知られている。
【0003】
例えば、遺伝子診断において、標的核酸を正確かつ迅速に検出、定量する手法が数多く存在する。その中でも、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）は、操作性及び反応安定性が優れている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【0004】
ここで、図１を参照しながらＩＣＡについて説明する。図１は、ＩＣＡの一例を説明する模式図である。図１の例では、標的核酸１００中のＴ（チミン）塩基１０１の存在を検出する。まず、標的核酸１００に相補的なフラッププローブ１１０及び侵入プローブ１２０をハイブリダイズさせる。その結果、侵入プローブ１２０は、標的核酸１００の、フラッププローブ１１０がハイブリダイズする位置に隣接する部位にハイブリダイズする。そして、侵入プローブ１２０の３’末端の少なくとも１塩基は、フラッププローブ１１０と標的核酸１００がハイブリダイズしている領域１４１の５’末端の位置に侵入し、第１の三重鎖構造１３０が形成される。
【0005】
続いて、第１の三重鎖構造１３０にフラップエンドヌクレアーゼを反応させると、第１の三重鎖構造１３０のフラップ部位１４０が切断され、核酸断片１４０が生成される。続いて、核酸断片１４０は、核酸断片１５０にハイブリダイズして第２の三重鎖構造１６０を形成する。
【0006】
図１の例では、核酸断片１５０の５’末端には蛍光物質Ｆが結合されており、核酸断片１５０の５’末端から数塩基３’側に消光物質Ｑが結合されている。蛍光物質Ｆと消光物質Ｑは空間的近傍に位置する。このため、蛍光物質Ｆが発する蛍光は、消光物質Ｑにより消光される。
【0007】
続いて、第２の三重鎖構造１６０にフラップエンドヌクレアーゼを反応させると、第２の三重鎖構造１６０のフラップ部位１７０が切断され、核酸断片１７０が生成される。その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから遊離し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光を検出することにより、標的核酸１００中のＴ（チミン）塩基１０１の存在を検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開２００４－３０９４０５号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Eis P. S. et al, An invasive cleavage assay for direct quantitation of specific RNAs, Nature Biotechnology, 19 (7), 673-676, 2001.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
発明者らは、図１に例示するようなＩＣＡにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる蛍光基質の切断効率に改良の余地があることを見出した。そこで、本発明は、ＩＣＡにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる蛍光基質の切断効率を向上させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は以下の態様を含む。
［１］蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている、一本鎖オリゴヌクレオチド。
［２］前記蛍光物質が、５’末端のヌクレオチド残基に標識されており、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、前記蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離する、［１］に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［３］前記オリゴヌクレオチド断片の長さが２残基以上である、［２］に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［４］５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基である、［２］又は［３］に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［５］前記ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含み、前記消光物質が、前記相補的でない塩基対を構成するヌクレオチド残基のうち、より５’側に位置するヌクレオチド残基に標識されている、［２］～［４］のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［６］核酸三重鎖構造をフラップエンドヌクレアーゼで切断する場合の切断効率を向上させる方法であって、フラップエンドヌクレアーゼに核酸三重鎖構造を接触させる工程を含み、前記核酸三重鎖構造が、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドと、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドとを含み、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、前記３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている一本鎖オリゴヌクレオチドである、方法。
［１］蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている、一本鎖オリゴヌクレオチド。
［２］前記蛍光物質が、５’末端のヌクレオチド残基に標識されており、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、前記蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離する、［１］に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［３］前記オリゴヌクレオチド断片の長さが２残基以上である、［２］に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［４］５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基である、［２］又は［３］に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［５］前記ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含み、前記消光物質が、前記相補的でない塩基対を構成するヌクレオチド残基のうち、より５’側に位置するヌクレオチド残基に標識されている、［２］～［４］のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［６］核酸三重鎖構造をフラップエンドヌクレアーゼで切断する場合の切断効率を向上させる方法であって、フラップエンドヌクレアーゼに核酸三重鎖構造を接触させる工程を含み、前記核酸三重鎖構造が、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドと、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドとを含み、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、前記３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている一本鎖オリゴヌクレオチドである、方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、ＩＣＡにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる蛍光基質の切断効率を向上させる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
［一本鎖オリゴヌクレオチド］
一実施形態において、本発明は、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている、一本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。
一実施形態において、本発明は、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている、一本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。
【0015】
本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＩＣＡ用の蛍光基質であり、フラップエンドヌクレアーゼの基質であるということもできる。フラップエンドヌクレアーゼとしては、フラップエンドヌクレアーゼ１（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１１０１２５６１．１、Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ５’ ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＧＥＮ１）（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１１２３４８１．３）、ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３７５３３．１等が挙げられる。
【0016】
ここで、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に形成される三重鎖構造は、図１に示す第２の三重鎖構造１６０に対応する。すなわち、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドは、フラップ部位１４０に由来する核酸断片１４０に対応する。
【0017】
実施例において後述するように、蛍光基質において、蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基を４残基以上離すことにより、ＩＣＡにおけるフラップエンドヌクレアーゼによる切断効率を向上させことができる。その結果、ＩＣＡを行った場合に検出される蛍光シグナルを上昇させることができる。
【0018】
ＩＣＡにおけるフラップエンドヌクレアーゼによる切断効率が向上しているとは、蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基との間の距離が４残基未満である蛍光基質を用いてＩＣＡを行った場合と比較して、ＩＣＡを行った場合に検出される蛍光シグナルが高いことを意味する。
【0019】
本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドは、フラップエンドヌクレアーゼによる切断効率が向上した一本鎖オリゴヌクレオチドであるということができる。
【0020】
蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基を４残基以上離すとは、蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基との間の距離が４ヌクレオチド残基以上であることを意味する。
【0021】
例えば、蛍光物質が第１番目のヌクレオチド残基に標識されており、消光物質が第５番目のヌクレオチド残基に標識されている場合、蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基との間の距離は４残基である。
【0022】
本明細書において、「距離が４残基である」とは、「距離が４塩基長である」、「距離が４塩基である」、「塩基数が４である」等といいかえることができる。
【0023】
実施例において後述するように、蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基との間の距離は４又は５残基であることが好ましく、４残基であることがより好ましい。
【0024】
本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドは、２０～１５０塩基程度の長さを有していることが好ましい。また、ヘアピン構造を形成する塩基対の数は５～５０個程度であることが好ましい。
【0025】
本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含み、前記消光物質が、前記相補的でない塩基対を構成するヌクレオチド残基のうち、より５’側に位置するヌクレオチド残基に標識されているものであることが好ましい。実施例において後述するように、このような構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドは、フラップエンドヌクレアーゼによる切断効率が高い傾向にある。
【0026】
本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、相補的でない塩基対の数は、１～３であってもよく、１又は２であってもよく、１であってもよい。
【0027】
（蛍光物質）
蛍光物質としては、特に限定されず、例えば、フルオレセイン、ＡＴＴＯ４２５、Ａｌｅｘａ４８８、ＡＴＴＯ５４２、Ｙａｋｉｍａ Ｙ、Ｒｅｄｍｏｎｄ Ｒ、ＡＴＴＯ６４３、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ６８０、Ａｌｅｘａ５６８、ＦＡＭ、ＡＴＴＯ６３３、Ｃｙ５、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＡＴＴＯ６６３等が挙げられる。
蛍光物質としては、特に限定されず、例えば、フルオレセイン、ＡＴＴＯ４２５、Ａｌｅｘａ４８８、ＡＴＴＯ５４２、Ｙａｋｉｍａ Ｙ、Ｒｅｄｍｏｎｄ Ｒ、ＡＴＴＯ６４３、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ６８０、Ａｌｅｘａ５６８、ＦＡＭ、ＡＴＴＯ６３３、Ｃｙ５、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＡＴＴＯ６６３等が挙げられる。
【0028】
本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドは、蛍光物質が、５’末端のヌクレオチド残基に標識されており、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離するものであることが好ましい。また、この時に、遊離するオリゴヌクレオチド断片の長さが２残基以上であることが好ましい。遊離するオリゴヌクレオチド断片の長さは２又は３残基であることが好ましく、２残基であることがより好ましい。実施例において後述するように、このような一本鎖オリゴヌクレオチドは、フラップエンドヌクレアーゼによる切断効率が高い傾向にある。
【0029】
（消光物質）
消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものであれば特に限定されず、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）（登録商標）－１、ＢＨＱ（登録商標）－２、ＢＨＱ（登録商標）－３、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １（ＴＱ１）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２（ＴＱ２）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２ＷＳ（ＴＱ２ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３（ＴＱ３）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３ＷＳ（ＴＱ３ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４（ＴＱ４）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４ＷＳ（ＴＱ４ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５（ＴＱ５）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５ＷＳ（ＴＱ５ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６ＷＳ（ＴＱ６ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ７ＷＳ（ＴＱ７ＷＳ）、ＱＳＹ３５、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ等が挙げられる。消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものを選択する。
消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものであれば特に限定されず、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）（登録商標）－１、ＢＨＱ（登録商標）－２、ＢＨＱ（登録商標）－３、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １（ＴＱ１）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２（ＴＱ２）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２ＷＳ（ＴＱ２ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３（ＴＱ３）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３ＷＳ（ＴＱ３ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４（ＴＱ４）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４ＷＳ（ＴＱ４ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５（ＴＱ５）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５ＷＳ（ＴＱ５ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６ＷＳ（ＴＱ６ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ７ＷＳ（ＴＱ７ＷＳ）、ＱＳＹ３５、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ等が挙げられる。消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものを選択する。
【0030】
蛍光物質が消光物質の空間的近傍にある場合、蛍光物質からの蛍光は消光物質により消光される。「蛍光を消光する」とは、次のような意味である。消光物質が存在しない場合において、励起光を蛍光物質に対して照射したときの、蛍光物質から発光する蛍光の強度をＡとする。また、消光物質が蛍光物質の空間的近傍に存在する場合において、励起光を蛍光物質に対して照射したときの、蛍光物質から発光する蛍光の強度をＢとする。ここで、「蛍光を消光する」とは、上記Ｂ／Ａの値が、４０％以下であることを意味する。
【0031】
蛍光物質が消光物質の空間的近傍にある状態における、蛍光物質と消光物質距離との距離は、蛍光物質からの蛍光発光が消光物質により抑制される限り特に限定されず、１０ｎｍ以下であることが好ましく、５ｎｍ以下であることがより好ましく、２ｎｍ以下であることが更に好ましい。
【0032】
（オリゴヌクレオチド）
本実施形態の蛍光基質を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドは、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、天然の核酸であってもよいし、合成された核酸であってもよい。
本実施形態の蛍光基質を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドは、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、天然の核酸であってもよいし、合成された核酸であってもよい。
【0033】
天然の核酸としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ等が挙げられる。天然の核酸は、生体から回収されたものであってもよいし、生体と接触した水、有機物等から回収されたものであってもよい。天然の核酸の回収方法としては、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法が挙げられる。
【0034】
合成された核酸としては、例えば、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）等が挙げられる。
【0035】
核酸の合成方法は特に限定されず、ホスホロアミダイト法によるＤＮＡ固相合成等の公知の化学的合成法、公知の核酸増幅方法、逆転写反応等が挙げられる。核酸増幅方法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＭＡＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法等が挙げられる。
【0036】
本実施形態の蛍光基質において、５’末端のヌクレオチド残基の近傍に蛍光物質が配置されており、５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基であることが好ましい。プリン塩基には蛍光物質の蛍光を消光する傾向がある。このため、５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基であれば、蛍光物質の蛍光の消光が抑制され、好ましい。
【0037】
［核酸三重鎖構造をフラップエンドヌクレアーゼで切断する場合の切断効率を向上させる方法］
一実施形態において、本発明は、核酸三重鎖構造をフラップエンドヌクレアーゼで切断する場合の切断効率を向上させる方法であって、フラップエンドヌクレアーゼに核酸三重鎖構造を接触させる工程を含み、前記核酸三重鎖構造が、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドと、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドとを含み、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、前記３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている一本鎖オリゴヌクレオチドである、方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、核酸三重鎖構造をフラップエンドヌクレアーゼで切断する場合の切断効率を向上させる方法であって、フラップエンドヌクレアーゼに核酸三重鎖構造を接触させる工程を含み、前記核酸三重鎖構造が、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドと、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドとを含み、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、前記３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、前記消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている一本鎖オリゴヌクレオチドである、方法を提供する。
【0038】
本実施形態の方法において、ＩＣＡ、蛍光物質、消光物質、オリゴヌクレオチド等については上述したものと同様である。蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基が４残基以上離れている一本鎖オリゴヌクレオチドを蛍光基質として用いることにより、フラップエンドヌクレアーゼで切断する場合の切断効率を向上させることができる。
【0039】
本実施形態の方法において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、蛍光物質が、５’末端のヌクレオチド残基に標識されており、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離するものであることが好ましい。また、この時に、遊離するオリゴヌクレオチド断片の長さが２残基以上であることが好ましい。遊離するオリゴヌクレオチド断片の長さは２又は３残基であることが好ましく、２残基であることがより好ましい。実施例において後述するように、このような一本鎖オリゴヌクレオチドは、フラップエンドヌクレアーゼによる切断効率が高い傾向にある。
【0040】
本実施形態の方法において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’末端のヌクレオチド残基の近傍に蛍光物質が配置されており、５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基であることが好ましい。上述したように、５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基であれば、蛍光物質の蛍光の消光が抑制され、好ましい。
【0041】
本実施形態の方法において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含み、消光物質が、相補的でない塩基対を構成するヌクレオチド残基のうち、より５’側に位置するヌクレオチド残基に標識されているものであることが好ましい。実施例において後述するように、このような構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドは、フラップエンドヌクレアーゼによる切断効率が高い傾向にある。
【0042】
本実施形態の方法において、ＩＣＡは微小空間内で行うことが好ましい。具体的には、微小な複数のウェルを有するウェルアレイを有するデバイスを用いてＩＣＡを行うことが好ましい。
【0043】
ウェルは、無処理でそのまま使用してもよいし、目的に応じて、予めウェル内壁に抽出試薬、抗体等の検出試薬等を固定化する、ウェル開口部を脂質二重膜で覆う等の前処理を施してもよい。
【0044】
デバイスは、流路を有していてもよく、流路を介してＩＣＡの反応液をウェルアレイのウェルに供給してもよい。
【0045】
ウェルの直径は例えば３μｍ程度であってよく、ウェルの深さは例えば４．５μｍ程度であってよい。ウェルは、基材上に、三角格子状又は正方格子状を形成するように整列してウェルアレイを形成していてもよい。
【0046】
基材の材質としては、例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、シリコーン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、アモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。
【0047】
ウェルアレイにおけるウェルの個数は、１デバイスあたり１０万個～６００万個程度であることが好ましい。また、１ウェルあたりの容量は１ｆＬ～６ｐＬであることが好ましい。
【実施例0048】
［実験例１］
（蛍光基質の検討）
蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基の間の距離を様々に変更した蛍光基質を用いてＩＣＡを行い、反応性を比較した。
（蛍光基質の検討）
蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基の間の距離を様々に変更した蛍光基質を用いてＩＣＡを行い、反応性を比較した。
【0049】
下記表１及び表２に示す核酸断片を用いてＩＣＡを行った。表１中の標的核酸（配列番号１）は検出対象となる核酸である。本実験例のＩＣＡでは標的核酸中の小文字で示したｇ（グアニン）の存在を検出する。フラッププローブ（配列番号２）及び侵入プローブ（配列番号３）は、それぞれ、標的核酸（配列番号１）に相補的な塩基配列を有している。
【0050】
標的核酸（配列番号１）に、フラッププローブ（配列番号２）及び侵入プローブ（配列番号３）がそれぞれハイブリダイズすると、三重鎖構造が形成される。ここで、フラッププローブ（配列番号２）の小文字部分「5’-cgcgccgaggc-3’」（配列番号４）は塩基対形成せず、フラップ部位を形成する。
【0051】
フラップエンドヌクレアーゼは、上記三重鎖構造を認識して、フラッププローブ（配列番号２）を切断し、核酸断片（配列番号４）が切り出される。
【0052】
【表1】
【0053】
【表2】
【0054】
上記表２に示す蛍光基質１（配列番号５）は、蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基の間の距離が２残基である蛍光基質であり、具体的には下記式（１）のような構造を有する。蛍光基質１におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。また、下記式（１）に示すように、蛍光基質１は、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含んでいる。
【0055】
【化1】
【0056】
上記表２に示す蛍光基質２（配列番号６）は、蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基の間の距離が３残基である蛍光基質であり、具体的には下記式（２）のような構造を有する。蛍光基質２におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。また、下記式（２）に示すように、蛍光基質２は、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含んでいる。
【0057】
【化2】
【0058】
上記表２に示す蛍光基質３（配列番号７）は、蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基の間の距離が４残基である蛍光基質であり、具体的には下記式（３）のような構造を有する。蛍光基質３におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。また、下記式（３）に示すように、蛍光基質３は、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含んでいる。
【0059】
【化3】
【0060】
上記表２に示す蛍光基質４（配列番号８）は、蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基の間の距離が５残基である蛍光基質であり、具体的には下記式（４）のような構造を有する。蛍光基質４におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。また、下記式（４）に示すように、蛍光基質４は、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含んでいる。
【0061】
【化4】
【0062】
蛍光基質１に、切り出された核酸断片（配列番号４）がハイブリダイズした場合、上記表２において、蛍光基質１の太文字で表すＣ（シトシン）残基は、フラップエンドヌクレアーゼの基質認識能の揺らぎにより切断される。その結果、蛍光物質が消光物質から離れて、励起光の照射により蛍光シグナルが検出される。蛍光基質１において、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、遊離するオリゴヌクレオチド断片の長さは１残基である。
【0063】
蛍光基質２、３、４に、切り出された核酸断片（配列番号４）がハイブリダイズした場合、上記表２において、蛍光基質２、３、４の太文字で表すＴ（チミン）残基は三重鎖構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼの基質となり、切断される。その結果、蛍光物質が消光物質から離れて、励起光の照射により蛍光シグナルが検出される。蛍光基質２、３、４において、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、遊離するオリゴヌクレオチド断片の長さは、それぞれ、１、２、３残基である。
【0064】
まず、下記表３に示す組成で反応溶液を調製し微量試験チューブに入れた。続いて、チューブをリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、６６℃で６０分間加熱したときの蛍光強度変化（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。また、比較のために、標的核酸の代わりに滅菌水を添加した反応溶液を調製し、同様の測定を行った。
【0065】
【表3】
【0066】
図２（ａ）は、蛍光基質１を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。図２（ｂ）は、蛍光基質２を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。図２（ｃ）は、蛍光基質３を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。図２（ｄ）は、蛍光基質４を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。図２（ａ）～（ｄ）において、各蛍光基質の蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基の間の距離は、それぞれ、２、３、４、５残基である。
【0067】
その結果、蛍光基質における蛍光物質が標識されたヌクレオチド残基と、消光物質が標識されたヌクレオチド残基の間の距離が４残基以上である場合に、フラップエンドヌクレアーゼによる蛍光基質の切断効率が高く、４残基である場合に特に高いことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0068】
本発明によれば、ＩＣＡにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる蛍光基質の切断効率を向上させる技術を提供することができる。
【符号の説明】
【0069】
１００…標的核酸、１０１…塩基、１１０…フラッププローブ、１２０…侵入プローブ、１３０…第１の三重鎖構造、１４０，１７０…フラップ部位（核酸断片）、１４１…領域、１５０…核酸断片、１５１…ミスマッチ部位、１６０…第２の三重鎖構造、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。
【図1】
【図2】
【配列表】