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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024031825
(43)【公開日】2024-03-07
(54)【発明の名称】多孔質ジルコニア粒子
(51)【国際特許分類】
B01J 20/06 20060101AFI20240229BHJP
B01J 20/28 20060101ALI20240229BHJP
C01G 25/02 20060101ALI20240229BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240229BHJP
【ＦＩ】
B01J20/06 A
B01J20/28 Z
C01G25/02
C07K16/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023110519
(22)【出願日】2023-07-05
(31)【優先権主張番号】P 2022133208
(32)【優先日】2022-08-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000004547
【氏名又は名称】日本特殊陶業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000497
【氏名又は名称】弁理士法人グランダム特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】北村 昌大
(72)【発明者】
【氏名】米倉 宏
(72)【発明者】
【氏名】山口 将吾
【テーマコード（参考）】
4G048
4G066
4H045
【Ｆターム（参考）】
4G048AA02
4G048AB02
4G048AB04
4G048AC08
4G048AD03
4G048AE05
4G066AA23B
4G066AA23C
4G066AB10B
4G066AB13B
4G066AB19B
4G066BA09
4G066BA20
4G066BA25
4G066BA35
4G066BA36
4G066CA54
4G066DA07
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA60
(57)【要約】
【課題】カラムへの充填にも適し、タンパク質の吸着能力が高い多孔質ジルコニア粒子を提供する。
【解決手段】タンパク質の固定に用いられる多孔質ジルコニア粒子である。多孔質ジルコニア粒子は、粒子破壊強度が０．４ＭＰａ以上であり、水銀圧入法を用いて測定した細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上である。
【選択図】なし
【解決手段】タンパク質の固定に用いられる多孔質ジルコニア粒子である。多孔質ジルコニア粒子は、粒子破壊強度が０．４ＭＰａ以上であり、水銀圧入法を用いて測定した細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質の固定に用いられる多孔質ジルコニア粒子であって、
粒子破壊強度が０．４ＭＰａ以上であり、
水銀圧入法を用いて測定した細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上である、多孔質ジルコニア粒子。
粒子破壊強度が０．４ＭＰａ以上であり、
水銀圧入法を用いて測定した細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上である、多孔質ジルコニア粒子。
【請求項2】
前記総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上０．８ｃｍ３／ｇ以下である、請求項１に記載の多孔質ジルコニア粒子。
【請求項3】
前記総細孔容積が０．６ｃｍ３／ｇ以上０．７ｃｍ３／ｇ以下である、請求項１に記載の多孔質ジルコニア粒子。
【請求項4】
前記タンパク質は、免疫グロブリンであることを特徴とする請求項１に記載の多孔質ジルコニア粒子。
【請求項5】
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＥ、及びＩｇＤからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項４に記載の多孔質ジルコニア粒子。
【請求項6】
表面に、キレート剤が担持されていることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の多孔質ジルコニア粒子。
【請求項7】
前記キレート剤は、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＡ）である請求項６に記載の多孔質ジルコニア粒子。
【請求項8】
前記キレート剤の担持量は、蛍光Ｘ線（ＸＲＦ）による元素分析で、０．６６ｍａｓｓ％以上２．７６ｍａｓｓ％以下である請求項６に記載の多孔質ジルコニア粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は多孔質ジルコニア粒子に関する。
【背景技術】
【0002】
特定タンパク質を選択的に吸着させることで、特定タンパク質を分離精製するカラムが検討されている。
例えば、特許文献１では、この目的のために多孔質ジルコニア粒子を採用した技術が開示されている。この文献では、窒素吸着実験（ガス吸着法）によるＢＥＴ法により測定された累積細孔容積を規定することで、特定タンパク質の吸着量を向上させている。
例えば、特許文献１では、この目的のために多孔質ジルコニア粒子を採用した技術が開示されている。この文献では、窒素吸着実験（ガス吸着法）によるＢＥＴ法により測定された累積細孔容積を規定することで、特定タンパク質の吸着量を向上させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第２０２０／１５３２５３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかし、特許文献１のように、表面性状の測定に関して、ガス吸着法による評価を採用すると、その測定範囲からほぼ１次粒子のパラメータに依存した値が得られてしまう。よって、ガス吸着法による評価をしても、１次粒子間の状態等の２次粒子体の表面性状の把握は困難であった。そのため、ＢＥＴ法により測定された累積細孔容積を規定しても、必ずしも特定タンパク質の吸着量は十分でない場合があった。
また、多孔質ジルコニア粒子をカラムに充填して使用する場合、粒子にはカラム使用の際に崩壊等しないことも要求される。
本開示は、上記実情に鑑みてなされたものであり、カラムへの充填にも適し、タンパク質の吸着能力が高い多孔質ジルコニア粒子を提供することを目的とする。本開示は、以下の形態として実現することが可能である。
また、多孔質ジルコニア粒子をカラムに充填して使用する場合、粒子にはカラム使用の際に崩壊等しないことも要求される。
本開示は、上記実情に鑑みてなされたものであり、カラムへの充填にも適し、タンパク質の吸着能力が高い多孔質ジルコニア粒子を提供することを目的とする。本開示は、以下の形態として実現することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【0005】
［１］
タンパク質の固定に用いられる多孔質ジルコニア粒子であって、
粒子破壊強度が０．４ＭＰａ以上であり、
水銀圧入法を用いて測定した細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上である、多孔質ジルコニア粒子。
［２］
前記総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上０．８ｃｍ３／ｇ以下である、［１］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［３］
前記総細孔容積が０．６ｃｍ３／ｇ以上０．７ｃｍ３／ｇ以下である、［１］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［４］
前記タンパク質は、免疫グロブリンであることを特徴とする［１］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［５］
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＥ、及びＩｇＤからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする［４］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［６］
表面に、キレート剤が担持されていることを特徴とする［１］から［５］のいずれか１項に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［７］
前記キレート剤は、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＡ）である［６］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［８］
前記キレート剤の担持量は、蛍光Ｘ線（ＸＲＦ）による元素分析で、０．６６ｍａｓｓ％以上２．７６ｍａｓｓ％以下である［６］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
タンパク質の固定に用いられる多孔質ジルコニア粒子であって、
粒子破壊強度が０．４ＭＰａ以上であり、
水銀圧入法を用いて測定した細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上である、多孔質ジルコニア粒子。
［２］
前記総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上０．８ｃｍ３／ｇ以下である、［１］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［３］
前記総細孔容積が０．６ｃｍ３／ｇ以上０．７ｃｍ３／ｇ以下である、［１］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［４］
前記タンパク質は、免疫グロブリンであることを特徴とする［１］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［５］
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＥ、及びＩｇＤからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする［４］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［６］
表面に、キレート剤が担持されていることを特徴とする［１］から［５］のいずれか１項に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［７］
前記キレート剤は、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＡ）である［６］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
［８］
前記キレート剤の担持量は、蛍光Ｘ線（ＸＲＦ）による元素分析で、０．６６ｍａｓｓ％以上２．７６ｍａｓｓ％以下である［６］に記載の多孔質ジルコニア粒子。
【発明の効果】
【0006】
本開示の多孔質ジルコニア粒子は、カラムへの充填にも適し、タンパク質の吸着能力が高い。
総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上０．８ｃｍ３／ｇ以下である場合には、粒子強度が強く、カラムからの粒子漏れが十分に抑制される。
総細孔容積が０．６ｃｍ３／ｇ以上０．７ｃｍ３／ｇ以下である場合には、粒子強度がより強くなり、カラムで使用する際にピペッティング操作をする場合や、通液速度が速い場合でも、破壊されにくくなり、ハンドリング性が向上する。また、総細孔容積がこの範囲内である場合には、市販のプロテインＡと同程度の吸着能力を確保できる。
本開示の多孔質ジルコニア粒子は、固定されるタンパク質が、免疫グロブリンである場合には、選択性が非常に高い。
本開示の多孔質ジルコニア粒子は、固定されるタンパク質が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＥ、及びＩｇＤからなる群より選択される少なくとも１種である場合には、選択性が極めて高い。
本開示の多孔質ジルコニア粒子の表面に、キレート剤が担持されていると、選択性がより高まる。
キレート剤が、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＡ）であると、選択性が高い。
キレート剤の担持量が、蛍光Ｘ線（ＸＲＦ）による元素分析で、０．６６ｍａｓｓ％以上２．７６ｍａｓｓ％以下であると、選択性が高い。
総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上０．８ｃｍ３／ｇ以下である場合には、粒子強度が強く、カラムからの粒子漏れが十分に抑制される。
総細孔容積が０．６ｃｍ３／ｇ以上０．７ｃｍ３／ｇ以下である場合には、粒子強度がより強くなり、カラムで使用する際にピペッティング操作をする場合や、通液速度が速い場合でも、破壊されにくくなり、ハンドリング性が向上する。また、総細孔容積がこの範囲内である場合には、市販のプロテインＡと同程度の吸着能力を確保できる。
本開示の多孔質ジルコニア粒子は、固定されるタンパク質が、免疫グロブリンである場合には、選択性が非常に高い。
本開示の多孔質ジルコニア粒子は、固定されるタンパク質が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＥ、及びＩｇＤからなる群より選択される少なくとも１種である場合には、選択性が極めて高い。
本開示の多孔質ジルコニア粒子の表面に、キレート剤が担持されていると、選択性がより高まる。
キレート剤が、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＡ）であると、選択性が高い。
キレート剤の担持量が、蛍光Ｘ線（ＸＲＦ）による元素分析で、０．６６ｍａｓｓ％以上２．７６ｍａｓｓ％以下であると、選択性が高い。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【発明を実施するための形態】
【0008】
以下、本開示を詳しく説明する。尚、本明細書において、数値範囲について「－」を用いた記載では、特に断りがない限り、下限値及び上限値を含むものとする。例えば、「１０－２０」という記載では、下限値である「１０」、上限値である「２０」のいずれも含むものとする。すなわち、「１０－２０」は、「１０以上２０以下」と同じ意味である。 また、本明細書において、各数値範囲の上限値及び下限値は、任意に組み合わせることができる。
【0009】
１．多孔質ジルコニア粒子
本開示の多孔質ジルコニア粒子は、タンパク質の固定に用いられる。
（１）多孔質ジルコニア粒子の粒子径
多孔質ジルコニア粒子の粒子径は、カラムに充填して使用するに際して、カラムに設置されるフィルターからの漏れを抑制する観点から、１０μｍ以上が好ましく、３０μｍ以上がより好ましく、４５μｍ以上が更に好ましい。他方、タンパク質の吸着効率の観点から、１００μｍ以下が好ましく、９０μｍ以下がより好ましく、８０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、多孔質ジルコニア粒子の粒子径は、１０μｍ以上１００μｍ以下が好ましく、３０μｍ以上９０μｍ以下がより好ましく、４５μｍ以上８０μｍ以下が更に好ましい。
尚、多孔質ジルコニア粒子を所望の粒子径とするためには例えば分級が好適に用いられる。分級としては、公知の分級処理を用いることができる。例えば、ふるいを用いることができる。カラムは、例えば分取用のオープンカラムクロマトグラフィー、中圧カラムクロマトグラフィーなどに用いられる。
多孔質ジルコニア粒子の粒子径は、顕微鏡によって観察することによって、粒子径を規定できる。多孔質ジルコニア粒子を顕微鏡によって観察し、当該粒子の画像を取得する。取得した画像から、粒子のそれぞれの面積を画像処理によって算出する。算出した粒子の面積と同じ面積を有する円の直径（面積円相当径）をそれぞれの粒子ごとに算出する。そして、算出した円の直径を平均化したものを粒子径として規定できる。
本開示の多孔質ジルコニア粒子は、タンパク質の固定に用いられる。
（１）多孔質ジルコニア粒子の粒子径
多孔質ジルコニア粒子の粒子径は、カラムに充填して使用するに際して、カラムに設置されるフィルターからの漏れを抑制する観点から、１０μｍ以上が好ましく、３０μｍ以上がより好ましく、４５μｍ以上が更に好ましい。他方、タンパク質の吸着効率の観点から、１００μｍ以下が好ましく、９０μｍ以下がより好ましく、８０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、多孔質ジルコニア粒子の粒子径は、１０μｍ以上１００μｍ以下が好ましく、３０μｍ以上９０μｍ以下がより好ましく、４５μｍ以上８０μｍ以下が更に好ましい。
尚、多孔質ジルコニア粒子を所望の粒子径とするためには例えば分級が好適に用いられる。分級としては、公知の分級処理を用いることができる。例えば、ふるいを用いることができる。カラムは、例えば分取用のオープンカラムクロマトグラフィー、中圧カラムクロマトグラフィーなどに用いられる。
多孔質ジルコニア粒子の粒子径は、顕微鏡によって観察することによって、粒子径を規定できる。多孔質ジルコニア粒子を顕微鏡によって観察し、当該粒子の画像を取得する。取得した画像から、粒子のそれぞれの面積を画像処理によって算出する。算出した粒子の面積と同じ面積を有する円の直径（面積円相当径）をそれぞれの粒子ごとに算出する。そして、算出した円の直径を平均化したものを粒子径として規定できる。
【0010】
（２）粒子破壊強度
多孔質ジルコニア粒子の粒子破壊強度は、カラムへ充填して使用する際に強度不足による不具合を抑制する観点から、０．４ＭＰａ以上であり、１．２ＭＰａ以上が好ましく、１．７ＭＰａ以上がより好ましい。粒子破壊強度の上限値は特に限定されないが、通常、２００ＭＰａである。
粒子破壊強度は、微小圧縮試験機を用いて測定できる。具体的には、多孔質ジルコニア粒子を試料とし、微小圧縮試験機（島津製作所、ＭＣＴ２１１）を用いて、試料に一定の負荷速度で荷重を負荷し、粒子が破壊した時点の荷重値を、荷重に対して垂直に見た粒子の投影面積で割った値を圧縮強度（ＭＰａ）とする。さらに、この操作を４回繰り返し、５個の試料について圧縮強度を測定し、その平均値を粒子破壊強度とする。試料としては、粒子の直径が４０μｍ以上６０μｍ以下の多孔質ジルコニア粒子を選別して用いることができる。
多孔質ジルコニア粒子の粒子破壊強度は、カラムへ充填して使用する際に強度不足による不具合を抑制する観点から、０．４ＭＰａ以上であり、１．２ＭＰａ以上が好ましく、１．７ＭＰａ以上がより好ましい。粒子破壊強度の上限値は特に限定されないが、通常、２００ＭＰａである。
粒子破壊強度は、微小圧縮試験機を用いて測定できる。具体的には、多孔質ジルコニア粒子を試料とし、微小圧縮試験機（島津製作所、ＭＣＴ２１１）を用いて、試料に一定の負荷速度で荷重を負荷し、粒子が破壊した時点の荷重値を、荷重に対して垂直に見た粒子の投影面積で割った値を圧縮強度（ＭＰａ）とする。さらに、この操作を４回繰り返し、５個の試料について圧縮強度を測定し、その平均値を粒子破壊強度とする。試料としては、粒子の直径が４０μｍ以上６０μｍ以下の多孔質ジルコニア粒子を選別して用いることができる。
【0011】
（３）総細孔容積
総細孔容積は、細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、０．４ｃｍ３／ｇ以上である。この範囲であると、タンパク質の十分な吸着能力を発揮する。例えば、この範囲であると、ジルコニア製品「Ｚｉｒ Ｃｈｒｏｍ」（Ｚｉｒ Ｃｈｒｏｍ Ｓｅｐｅｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）のＩｇＧ吸着量よりも高い能力を発揮し、市販のプロテインＡの半分程度のＩｇＧ吸着量を確保できる。
総細孔容積は、細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、０．４ｃｍ３／ｇ以上０．８ｃｍ３／ｇ以下であることが好ましい。この範囲であると、タンパク質の十分な吸着能力を発揮し、かつ、十分な粒子強度を確保して、粒子の崩壊に起因するカラムからの粒子漏れを抑制できる。
総細孔容積は、細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、０．６ｃｍ３／ｇ以上０．７ｃｍ３／ｇ以下であることが好ましい。この範囲であると、タンパク質の十分な吸着能力を発揮し、かつ、十分な粒子強度を確保して、粒子の崩壊に起因するカラムからの粒子漏れを抑制できる。０．７ｃｍ３以下とすることで、更に高い粒子強度が期待でき、カラムで使用する際にピペッティング操作をする場合や、通液速度が速い場合でも、破壊されにくくなり、ハンドリング性が向上する。０．６ｃｍ３以上とすることで、市販のプロテインＡと同程度の吸着量を発揮できる。
総細孔容積は、気孔径分布を解析することによって求める。具体的には、気孔径分布の解析は、次のように行う。水銀ポロシメータ（マイクロメリティックス社 オートポアＩＶ９５１０）を用いて接触角を１３０°、表面張力を４８５ｍＮ／ｍの条件で水銀圧入法により測定された気孔径及びｌｏｇ微分細孔容積を、それぞれ横軸及び縦軸とする気孔径分布のグラフを作成して解析する。測定に用いるサンプル量は、０．１５ｇ－０．２５ｇとする。
総細孔容積は、細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、０．４ｃｍ３／ｇ以上である。この範囲であると、タンパク質の十分な吸着能力を発揮する。例えば、この範囲であると、ジルコニア製品「Ｚｉｒ Ｃｈｒｏｍ」（Ｚｉｒ Ｃｈｒｏｍ Ｓｅｐｅｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）のＩｇＧ吸着量よりも高い能力を発揮し、市販のプロテインＡの半分程度のＩｇＧ吸着量を確保できる。
総細孔容積は、細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、０．４ｃｍ３／ｇ以上０．８ｃｍ３／ｇ以下であることが好ましい。この範囲であると、タンパク質の十分な吸着能力を発揮し、かつ、十分な粒子強度を確保して、粒子の崩壊に起因するカラムからの粒子漏れを抑制できる。
総細孔容積は、細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、０．６ｃｍ３／ｇ以上０．７ｃｍ３／ｇ以下であることが好ましい。この範囲であると、タンパク質の十分な吸着能力を発揮し、かつ、十分な粒子強度を確保して、粒子の崩壊に起因するカラムからの粒子漏れを抑制できる。０．７ｃｍ３以下とすることで、更に高い粒子強度が期待でき、カラムで使用する際にピペッティング操作をする場合や、通液速度が速い場合でも、破壊されにくくなり、ハンドリング性が向上する。０．６ｃｍ３以上とすることで、市販のプロテインＡと同程度の吸着量を発揮できる。
総細孔容積は、気孔径分布を解析することによって求める。具体的には、気孔径分布の解析は、次のように行う。水銀ポロシメータ（マイクロメリティックス社 オートポアＩＶ９５１０）を用いて接触角を１３０°、表面張力を４８５ｍＮ／ｍの条件で水銀圧入法により測定された気孔径及びｌｏｇ微分細孔容積を、それぞれ横軸及び縦軸とする気孔径分布のグラフを作成して解析する。測定に用いるサンプル量は、０．１５ｇ－０．２５ｇとする。
【0012】
２．タンパク質
固定の対象となるタンパク質は、特に限定されない。本開示の多孔質ジルコニア粒子は、免疫グロブリン、特に、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＥ、及びＩｇＤからなる群より選択される少なくとも１種を選択的に固定することに優れている。
尚、本開示において、「固定」とは、物理的固定と、化学的固定を含む。本開示の多孔質ジルコニア粒子は、その細孔内でのタンパク質の固定に、毛細管現象によりタンパク質が挿入される物理的固定と、ジルコニア表面に共有結合などの化学結合を利用した化学的固定を利用しており、高いタンパク質固定能を有している。
固定の対象となるタンパク質は、特に限定されない。本開示の多孔質ジルコニア粒子は、免疫グロブリン、特に、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＥ、及びＩｇＤからなる群より選択される少なくとも１種を選択的に固定することに優れている。
尚、本開示において、「固定」とは、物理的固定と、化学的固定を含む。本開示の多孔質ジルコニア粒子は、その細孔内でのタンパク質の固定に、毛細管現象によりタンパク質が挿入される物理的固定と、ジルコニア表面に共有結合などの化学結合を利用した化学的固定を利用しており、高いタンパク質固定能を有している。
【0013】
３．キレート剤
多孔質ジルコニア粒子の表面には、キレート剤が担持されていてもよい。キレート剤を担持することで、選択性がより高まる。
キレート剤は、特に限定されない。キレート剤として、下記一般式（１）で表される化合物、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＥＴＰＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＥＴＰＰＡ）、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。尚、塩としては、例えば、アルカリ金属(ナトリウム等)の塩が好適に例示される。
多孔質ジルコニア粒子の表面には、キレート剤が担持されていてもよい。キレート剤を担持することで、選択性がより高まる。
キレート剤は、特に限定されない。キレート剤として、下記一般式（１）で表される化合物、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＥＴＰＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＥＴＰＰＡ）、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。尚、塩としては、例えば、アルカリ金属(ナトリウム等)の塩が好適に例示される。
【0014】
【化1】
（一般式（１）中、Ｒ１は炭素数１～１０のアルキレン基である。また、Ｒ２～Ｒ５は炭素数１～１０のアルキレン基であり、互いに同一であっても異なっていてもよい。）
【0015】
一般式（１）のＲ１における炭素数１～１０のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、イソブチレン基等が例示される。
また、Ｒ２～Ｒ５における炭素数１～１０のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、イソブチレン基等が例示される。
また、Ｒ２～Ｒ５における炭素数１～１０のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、イソブチレン基等が例示される。
【0016】
キレート剤としては、免疫グロブリンに対する選択性をより高めるという観点から、一般式（１）で表される化合物が好ましい。一般式（１）で表される化合物の中でも、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＡ；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａｋｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ Ａｃｉｄ））が特に好ましい。
ＥＤＴＰＡ修飾により、粒子表面にリン酸基由来の静電的効果が付与される。抗体精製では、主な夾雑物としてアルブミンやトランスフェリン等の酸性物質が例示される。本修飾によって、粒子表面の酸性物質に対する静電的反発が高まる。そして、粒子表面への酸性物質の吸着が抑制され、その結果、免疫グロブリン吸着の選択性が向上すると推測される。
ＥＤＴＰＡ修飾により、粒子表面にリン酸基由来の静電的効果が付与される。抗体精製では、主な夾雑物としてアルブミンやトランスフェリン等の酸性物質が例示される。本修飾によって、粒子表面の酸性物質に対する静電的反発が高まる。そして、粒子表面への酸性物質の吸着が抑制され、その結果、免疫グロブリン吸着の選択性が向上すると推測される。
【0017】
キレート剤の担持量は、特に限定されない。キレート剤の担持量は、免疫グロブリンに対する選択性をより高めるという観点から、キレート剤の担持量は、蛍光Ｘ線（ＸＲＦ）による元素分析で、０．６６ｍａｓｓ％以上２．７６ｍａｓｓ％以下であることが好ましく、１．００ｍａｓｓ％以上２．００ｍａｓｓ％以下であることがより好ましく、１．２０ｍａｓｓ％以上１．８０ｍａｓｓ％以下であることが更に好ましい。尚、キレート剤の担持量は、キレート剤が担持された状態での多孔質ジルコニア粒子を１００ｍａｓｓ％とした値である。
【0018】
キレート剤の担持態様は、明らかではないが、ジルコニウム原子に、キレート剤に由来する配位子が結合しているものと推測される。例えば、キレート剤がエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸の場合には、図１の構造であると推測される。
【0019】
４．多孔質ジルコニア粒子の製造方法
多孔質ジルコニア粒子の製造方法は、特に限定されないが、以下の製造方法が好適に採用される。
（１）多孔質ジルコニア粒子の製造
多孔質ジルコニア粒子を製造するためには、まず、多孔質ジルコニア粒子（多孔質ジルコニア粉末原料）を製造する。多孔質ジルコニア粒子（多孔質ジルコニア粉末原料）は、例えば、次の方法によって製造できる。ジルコンを原料として、オキシ塩化ジルコニウム（ＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏ）溶液を得る。そして、加水分解反応により、Ｚｒ（ＯＨ）４微粒子とし、これを焼成して、多孔質ジルコニア粒子（多孔質ジルコニア粉末原料）とする。
多孔質ジルコニア粒子の製造方法は、特に限定されないが、以下の製造方法が好適に採用される。
（１）多孔質ジルコニア粒子の製造
多孔質ジルコニア粒子を製造するためには、まず、多孔質ジルコニア粒子（多孔質ジルコニア粉末原料）を製造する。多孔質ジルコニア粒子（多孔質ジルコニア粉末原料）は、例えば、次の方法によって製造できる。ジルコンを原料として、オキシ塩化ジルコニウム（ＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏ）溶液を得る。そして、加水分解反応により、Ｚｒ（ＯＨ）４微粒子とし、これを焼成して、多孔質ジルコニア粒子（多孔質ジルコニア粉末原料）とする。
【0020】
（２）多孔質ジルコニア粒子の製造
多孔質ジルコニア粉末原料と水（Ｈ２Ｏ）を、水分割合（％）が所定の値となるようにボールミルで混合してスラリーを作製する。スラリーをスプレードライヤーにて造粒し、所定の粒径の粒子を製造する。この粒子を所定温度で、所定時間、焼成する。多孔質ジルコニア粉末原料としては、特に限定されないが、例えば、第一稀元素化学工業製ＵＥＰ－１００、新日本電工製のＰＣＳ９０、新日本電工製のＰＣＳ１４０等を好適に用いることができる。
スラリーにおける水分量は、特に限定されない。水分量は、所望の総細孔容積を有する多孔質ジルコニア粒子を製造する観点から、スラリー全体を１００質量％とした場合に、６５質量％以上９０質量％以下であることが好ましく、７５％質量以上８５質量％以下であることがより好ましく、７７％質量以上８３％質量以下であることが更に好ましい。
焼成温度は、特に限定されない。焼成温度は、所望の総細孔容積を有する多孔質ジルコニア粒子を製造する観点から、６００℃以下であることが好ましく、３５０℃以上５５０℃以下であることがより好ましく、４２０℃以上５２０℃以下であることが更に好ましい。
焼成時間は、特に限定されない。焼成時間は、所望の総細孔容積を有する多孔質ジルコニア粒子を製造する観点から、１０時間以下であることが好ましく、１時間以上５時間以下であることがより好ましく、１．５時間以上３時間以下であることが更に好ましい。
多孔質ジルコニア粉末原料と水（Ｈ２Ｏ）を、水分割合（％）が所定の値となるようにボールミルで混合してスラリーを作製する。スラリーをスプレードライヤーにて造粒し、所定の粒径の粒子を製造する。この粒子を所定温度で、所定時間、焼成する。多孔質ジルコニア粉末原料としては、特に限定されないが、例えば、第一稀元素化学工業製ＵＥＰ－１００、新日本電工製のＰＣＳ９０、新日本電工製のＰＣＳ１４０等を好適に用いることができる。
スラリーにおける水分量は、特に限定されない。水分量は、所望の総細孔容積を有する多孔質ジルコニア粒子を製造する観点から、スラリー全体を１００質量％とした場合に、６５質量％以上９０質量％以下であることが好ましく、７５％質量以上８５質量％以下であることがより好ましく、７７％質量以上８３％質量以下であることが更に好ましい。
焼成温度は、特に限定されない。焼成温度は、所望の総細孔容積を有する多孔質ジルコニア粒子を製造する観点から、６００℃以下であることが好ましく、３５０℃以上５５０℃以下であることがより好ましく、４２０℃以上５２０℃以下であることが更に好ましい。
焼成時間は、特に限定されない。焼成時間は、所望の総細孔容積を有する多孔質ジルコニア粒子を製造する観点から、１０時間以下であることが好ましく、１時間以上５時間以下であることがより好ましく、１．５時間以上３時間以下であることが更に好ましい。
【0021】
（３）キレート剤の担持
キレート剤の溶液（例えばＥＤＴＰＡ水溶液）と、造粒した多孔質ジルコニア粒子とを混合し、加温することで、多孔質ジルコニア粒子にキレート剤を担持する（修飾反応する）。
溶液におけるキレート剤の濃度は限定されない。キレート剤の濃度は、０．０００６２５Ｍ以上０．０２Ｍ以下の範囲が好ましい。キレート剤の濃度によって、担持量をコントロールできる。
修飾反応の温度条件は、特に限定されない。反応温度は、例えば６０℃以上１００℃以下であることが好ましい。
修飾反応の時間条件は、特に限定されない。反応時間は、反応温度に応じて調整できる。例えば６０℃であれば約３日間、１００℃（環流条件）であれば３時間程度で反応は収束する。
修飾反応後に、遠心分離にて反応溶液を除去し、その後、多孔質ジルコニア粒子を乾燥して、表面にキレート剤が担持された多孔質ジルコニア粒子（表面修飾多孔質ジルコニア粒子）が得られる。
キレート剤の溶液（例えばＥＤＴＰＡ水溶液）と、造粒した多孔質ジルコニア粒子とを混合し、加温することで、多孔質ジルコニア粒子にキレート剤を担持する（修飾反応する）。
溶液におけるキレート剤の濃度は限定されない。キレート剤の濃度は、０．０００６２５Ｍ以上０．０２Ｍ以下の範囲が好ましい。キレート剤の濃度によって、担持量をコントロールできる。
修飾反応の温度条件は、特に限定されない。反応温度は、例えば６０℃以上１００℃以下であることが好ましい。
修飾反応の時間条件は、特に限定されない。反応時間は、反応温度に応じて調整できる。例えば６０℃であれば約３日間、１００℃（環流条件）であれば３時間程度で反応は収束する。
修飾反応後に、遠心分離にて反応溶液を除去し、その後、多孔質ジルコニア粒子を乾燥して、表面にキレート剤が担持された多孔質ジルコニア粒子（表面修飾多孔質ジルコニア粒子）が得られる。
【実施例0022】
実施例により本開示を更に具体的に説明する。以下の実験では、水銀圧入法による総細孔容積と、タンパク質の吸着量との関係等を検討した。また、比較のために、ＢＥＴ法による総細孔容積と、タンパク質の吸着量との関係も検討した。
【0023】
＜実験Ａ＞
１．多孔質ジルコニア粒子の作製
（１）Ｎｏ．１２
原料ジルコニア粉末として、第一稀元素化学工業製ＵＥＰ－１００を用いた。スプレードライ装置として、大川原化工機製ＭＬＤ－２２を用いた。
原料ジルコニア粉末と水とを、水分量８０質量％（原料ジルコニア粉末：水＝２０：８０（質量比））になるようにして、ボールミルにて混合及び粉砕し、スラリーを作製した。
作製したスラリーを１００ｍＬ／ｍｉｎの供給速度でスプレードライ装置に投入し、アトマイザ回転数９０００ｒｐｍ、出口乾燥温度９０℃でスプレードライにて造粒した。
得られた平均径約５０μｍの造粒紛を５００℃（３時間昇温（５００℃まで昇温にかけた時間）、２時間キープ（５００℃を２時間保持））で焼成し、その後、分級して、粒径を４５μｍ以上１００μｍ以下に揃えてＮｏ．１２の造粒紛を得た。
１．多孔質ジルコニア粒子の作製
（１）Ｎｏ．１２
原料ジルコニア粉末として、第一稀元素化学工業製ＵＥＰ－１００を用いた。スプレードライ装置として、大川原化工機製ＭＬＤ－２２を用いた。
原料ジルコニア粉末と水とを、水分量８０質量％（原料ジルコニア粉末：水＝２０：８０（質量比））になるようにして、ボールミルにて混合及び粉砕し、スラリーを作製した。
作製したスラリーを１００ｍＬ／ｍｉｎの供給速度でスプレードライ装置に投入し、アトマイザ回転数９０００ｒｐｍ、出口乾燥温度９０℃でスプレードライにて造粒した。
得られた平均径約５０μｍの造粒紛を５００℃（３時間昇温（５００℃まで昇温にかけた時間）、２時間キープ（５００℃を２時間保持））で焼成し、その後、分級して、粒径を４５μｍ以上１００μｍ以下に揃えてＮｏ．１２の造粒紛を得た。
【0024】
（２）Ｎｏ．１－１１，１３－１６、比較例Ａ，Ｂ
以下に示す表１のように、スラリー作製時の水分量（スラリー中の水分量）、混合粉砕条件（混合粉砕時間）、スプレードライ条件（スプレーの供給速度）、焼成条件（焼成温度及び焼成時間）を変動させることで、細孔容積や強度等の粒子特性のコントロールを行った以外はＮｏ．１２と同様にして、Ｎｏ．１－１１，１３－１６、比較例Ａ，Ｂの多孔質ジルコニア粒子を作製した。
以下に示す表１のように、スラリー作製時の水分量（スラリー中の水分量）、混合粉砕条件（混合粉砕時間）、スプレードライ条件（スプレーの供給速度）、焼成条件（焼成温度及び焼成時間）を変動させることで、細孔容積や強度等の粒子特性のコントロールを行った以外はＮｏ．１２と同様にして、Ｎｏ．１－１１，１３－１６、比較例Ａ，Ｂの多孔質ジルコニア粒子を作製した。
【0025】
【表1】
【0026】
２．多孔質ジルコニア粒子の特性測定
（１）水銀圧入法による細孔容積の測定
総細孔容積は、気孔径分布を解析することによって求めた。具体的には、気孔径分布の解析は、次のように行った。水銀ポロシメータ（マイクロメリティックス社 オートポアＩＶ９５１０）を用いて接触角を１３０°、表面張力を４８５ｍＮ／ｍの条件で水銀圧入法により測定された気孔径及びｌｏｇ微分細孔容積を、それぞれ横軸及び縦軸とする気孔径分布のグラフを作成して解析した。測定に用いたサンプル量は、０．１５ｇ－０．２５ｇとした。
（１）水銀圧入法による細孔容積の測定
総細孔容積は、気孔径分布を解析することによって求めた。具体的には、気孔径分布の解析は、次のように行った。水銀ポロシメータ（マイクロメリティックス社 オートポアＩＶ９５１０）を用いて接触角を１３０°、表面張力を４８５ｍＮ／ｍの条件で水銀圧入法により測定された気孔径及びｌｏｇ微分細孔容積を、それぞれ横軸及び縦軸とする気孔径分布のグラフを作成して解析した。測定に用いたサンプル量は、０．１５ｇ－０．２５ｇとした。
【0027】
（２）ＩｇＧの固定、及びＩｇＧ量の測定
各多孔質ジルコニア粒子に対して、それぞれ次のようにして、ＩｇＧを固定し、固定されたＩｇＧ量を求めた。
多孔質ジルコニア粒子へのＩｇＧの固定は、以下のように行った。スピッツに５００μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を入れて、この液に多孔質ジルコニア粒子３ｍｇを加えた。多孔質ジルコニア粒子を十分に分散させた後、ＩｇＧ（７５０μｇ／５００μＬ）を５００μＬ加えて、遮光下、４℃で一晩撹拌した。
スピッツを、１２，０００回転で１０分間遠心して、多孔質ジルコニア粒子を沈殿分離した。上澄み溶液に残存する未固定のＩｇＧ量を、プロテインアッセイ染色液（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用い、マイクロプレートリーダー（ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００ＰＲＯ，ＴＥＣＡＮ）により定量した。始めに加えたＩｇＧ量と、未固定のＩｇＧ量との差分を固定されたＩｇＧ量（ＩｇＧ抗体吸着量）とした。
各多孔質ジルコニア粒子に対して、それぞれ次のようにして、ＩｇＧを固定し、固定されたＩｇＧ量を求めた。
多孔質ジルコニア粒子へのＩｇＧの固定は、以下のように行った。スピッツに５００μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を入れて、この液に多孔質ジルコニア粒子３ｍｇを加えた。多孔質ジルコニア粒子を十分に分散させた後、ＩｇＧ（７５０μｇ／５００μＬ）を５００μＬ加えて、遮光下、４℃で一晩撹拌した。
スピッツを、１２，０００回転で１０分間遠心して、多孔質ジルコニア粒子を沈殿分離した。上澄み溶液に残存する未固定のＩｇＧ量を、プロテインアッセイ染色液（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用い、マイクロプレートリーダー（ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００ＰＲＯ，ＴＥＣＡＮ）により定量した。始めに加えたＩｇＧ量と、未固定のＩｇＧ量との差分を固定されたＩｇＧ量（ＩｇＧ抗体吸着量）とした。
【0028】
（３）粒子破壊強度
多孔質ジルコニア粒子を試料とし、微小圧縮試験機（島津製作所、ＭＣＴ２１１）を用いて、試料に一定の負荷速度で荷重を負荷し、粒子が破壊した時点の荷重値を、荷重に対して垂直に見た粒子の投影面積で割った値を圧縮強度（ＭＰａ）とした。さらに、この操作を４回繰り返し、５個の試料について圧縮強度を測定し、その平均値を粒子破壊強度とした。試料としては、４０μｍ以上６０μｍ以下の多孔質ジルコニア粒子を選別して用いた。
多孔質ジルコニア粒子を試料とし、微小圧縮試験機（島津製作所、ＭＣＴ２１１）を用いて、試料に一定の負荷速度で荷重を負荷し、粒子が破壊した時点の荷重値を、荷重に対して垂直に見た粒子の投影面積で割った値を圧縮強度（ＭＰａ）とした。さらに、この操作を４回繰り返し、５個の試料について圧縮強度を測定し、その平均値を粒子破壊強度とした。試料としては、４０μｍ以上６０μｍ以下の多孔質ジルコニア粒子を選別して用いた。
【0029】
（４）ＢＥＴ法による総細孔容積の測定
Ｎｏ．１，３，７，１２，１６については、ＢＥＴ法による総細孔容積の測定も行った。ＢＥＴ法による総細孔容積は、マイクロメリティックス 自動比表面積／細孔分布測定装置（ＴｒｉＳｔａｒＩＩ 島津製作所）を用いて測定した。各多孔質ジルコニア粒子を５０ｍｇ程度秤量し、８０℃で３時間脱気乾燥した物を試料として用いた。各値は、窒素吸着実験からＢＥＴ法により算出した。
Ｎｏ．１，３，７，１２，１６については、ＢＥＴ法による総細孔容積の測定も行った。ＢＥＴ法による総細孔容積は、マイクロメリティックス 自動比表面積／細孔分布測定装置（ＴｒｉＳｔａｒＩＩ 島津製作所）を用いて測定した。各多孔質ジルコニア粒子を５０ｍｇ程度秤量し、８０℃で３時間脱気乾燥した物を試料として用いた。各値は、窒素吸着実験からＢＥＴ法により算出した。
【0030】
３．実験結果（その１）
水銀圧入法による総細孔容積と、ＩｇＧ抗体の吸着量及び粒子破壊強度との関係を表２に示す。
Ｎｏ．２－１２，１４，１６は、次の要件〔１〕〔２〕の全てを満たしている。
要件〔１〕粒子破壊強度が０．４ＭＰａ以上である。
要件〔２〕水銀圧入法を用いて測定した細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上である。
これに対して、比較例Ａ，Ｂは以下の要件を満たしていない。
比較例Ａでは、要件〔２〕を満たしてない。
比較例Ｂでは、要件〔１〕を満たしてない。
水銀圧入法による総細孔容積と、ＩｇＧ抗体の吸着量及び粒子破壊強度との関係を表２に示す。
Ｎｏ．２－１２，１４，１６は、次の要件〔１〕〔２〕の全てを満たしている。
要件〔１〕粒子破壊強度が０．４ＭＰａ以上である。
要件〔２〕水銀圧入法を用いて測定した細孔直径１０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の範囲において、総細孔容積が０．４ｃｍ３／ｇ以上である。
これに対して、比較例Ａ，Ｂは以下の要件を満たしていない。
比較例Ａでは、要件〔２〕を満たしてない。
比較例Ｂでは、要件〔１〕を満たしてない。
【0031】
【表2】
【0032】
Ｎｏ．２－１２，１４，１６は、優れたタンパク質固定能を示し、かつ強度が高いことが分かった。よって、Ｎｏ．２－１２，１４，１６は、カラムへの充填にも適し、タンパク質の吸着能力が高いことが分かった。
【0033】
３．実験結果（その２）
Ｎｏ．１，３，７，１２，１６について、ＢＥＴ法による総細孔容積と、ＩｇＧ抗体の吸着量との関係を表３に示す。表３のＩｇＧ抗体吸着量は、各Ｎｏ．について表２と同じ値となっている。例えば、表２のＮｏ．１は「１９２μｇ」であり、表３のＮｏ．１も「１９２μｇ」となっている。
表３の結果から、表３で示したＢＥＴ法による総細孔容積の値の領域では、ＢＥＴ法による総細孔容積と、ＩｇＧ抗体の吸着量との間には、相関関係がない場合があることが確認された。例えば、Ｎｏ．１６は、ＢＥＴ法による総細孔容積がＮｏ．１よりも小さいにも拘わらずにＩｇＧ抗体の吸着量が多くなっている。また、Ｎｏ．１，３，７は、ＢＥＴ法による総細孔容積が近い値であるにも拘わらずにＩｇＧ抗体吸着量が大きく異なっている。このように、ＢＥＴ法による総細孔容積の値のある領域においては、ＢＥＴ法による総細孔容積と、ＩｇＧ抗体吸着量との間には、相関関係がない場合があることが確認された。
Ｎｏ．１，３，７，１２，１６について、ＢＥＴ法による総細孔容積と、ＩｇＧ抗体の吸着量との関係を表３に示す。表３のＩｇＧ抗体吸着量は、各Ｎｏ．について表２と同じ値となっている。例えば、表２のＮｏ．１は「１９２μｇ」であり、表３のＮｏ．１も「１９２μｇ」となっている。
表３の結果から、表３で示したＢＥＴ法による総細孔容積の値の領域では、ＢＥＴ法による総細孔容積と、ＩｇＧ抗体の吸着量との間には、相関関係がない場合があることが確認された。例えば、Ｎｏ．１６は、ＢＥＴ法による総細孔容積がＮｏ．１よりも小さいにも拘わらずにＩｇＧ抗体の吸着量が多くなっている。また、Ｎｏ．１，３，７は、ＢＥＴ法による総細孔容積が近い値であるにも拘わらずにＩｇＧ抗体吸着量が大きく異なっている。このように、ＢＥＴ法による総細孔容積の値のある領域においては、ＢＥＴ法による総細孔容積と、ＩｇＧ抗体吸着量との間には、相関関係がない場合があることが確認された。
【0034】
【表3】
【0035】
４．実験結果のまとめ
Ｎｏ．２－１２，１４，１６のように、要件〔１〕〔２〕の全てを満たしていると、優れたタンパク質固定能を示し、かつ強度が高いことが分かった。よって、Ｎｏ．２－１２，１４，１６は、カラムへの充填にも適し、タンパク質の吸着能力が高いことが分かった。
Ｎｏ．２－１２，１４，１６のように、要件〔１〕〔２〕の全てを満たしていると、優れたタンパク質固定能を示し、かつ強度が高いことが分かった。よって、Ｎｏ．２－１２，１４，１６は、カラムへの充填にも適し、タンパク質の吸着能力が高いことが分かった。
【0036】
＜実験Ｂ＞
１．表面修飾多孔質ジルコニア粒子の作製
ＥＤＴＰＡ水溶液と、実験Ａの欄のＮｏ．９粒子とを混合し、加温して修飾反応した。反応条件は、６０℃還流条件で、７２時間とした。修飾反応後に、遠心分離にて反応溶液を除去し、その後、多孔質ジルコニア粒子を乾燥して、表面にキレート剤が担持された多孔質ジルコニア粒子（表面修飾多孔質ジルコニア粒子）を得た。
ＥＤＴＰＡ水溶液におけるＥＤＴＰＡの濃度は、０Ｍ、０．０００６２５Ｍ、０．００２５Ｍ、０．００１Ｍの４種類とした。
反応後に得られた多孔質ジルコニア粒子について蛍光Ｘ線（ＸＲＦ）による元素分析をしたところ、ＥＤＴＰＡの担持量は、０Ｍの場合には０ｍａｓｓ％、０．０００６２５Ｍの場合には０．６６ｍａｓｓ％、０．００２５Ｍの場合には１．５０ｍａｓｓ％、０．００１Ｍの場合には２．７６ｍａｓｓ％であった。
１．表面修飾多孔質ジルコニア粒子の作製
ＥＤＴＰＡ水溶液と、実験Ａの欄のＮｏ．９粒子とを混合し、加温して修飾反応した。反応条件は、６０℃還流条件で、７２時間とした。修飾反応後に、遠心分離にて反応溶液を除去し、その後、多孔質ジルコニア粒子を乾燥して、表面にキレート剤が担持された多孔質ジルコニア粒子（表面修飾多孔質ジルコニア粒子）を得た。
ＥＤＴＰＡ水溶液におけるＥＤＴＰＡの濃度は、０Ｍ、０．０００６２５Ｍ、０．００２５Ｍ、０．００１Ｍの４種類とした。
反応後に得られた多孔質ジルコニア粒子について蛍光Ｘ線（ＸＲＦ）による元素分析をしたところ、ＥＤＴＰＡの担持量は、０Ｍの場合には０ｍａｓｓ％、０．０００６２５Ｍの場合には０．６６ｍａｓｓ％、０．００２５Ｍの場合には１．５０ｍａｓｓ％、０．００１Ｍの場合には２．７６ｍａｓｓ％であった。
【0037】
２．ＩｇＧ,ＨＳＡ,Ｔｒｆの固定、及び固定量の測定
各多孔質ジルコニア粒子に対して、それぞれ次のようにして、ＩｇＧを固定し、固定されたＩｇＧ量を求めた。
多孔質ジルコニア粒子へのＩｇＧの固定は、以下のように行った。スピッツに５００μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を入れて、この液に多孔質ジルコニア粒子３ｍｇを加えた。多孔質ジルコニア粒子を十分に分散させた後、ＩｇＧ（７５０μｇ／５００μＬ）を５００μＬ加えて、遮光下、４℃で一晩撹拌した。
スピッツを、１２，０００回転で１０分間遠心して、多孔質ジルコニア粒子を沈殿分離した。上澄み溶液に残存する未固定のＩｇＧ量を、プロテインアッセイ染色液（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用い、マイクロプレートリーダー（ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００ＰＲＯ，ＴＥＣＡＮ）により定量した。始めに加えたＩｇＧ量と、未固定のＩｇＧ量との差分を固定されたＩｇＧ量（ＩｇＧ抗体吸着量）とした。
ＩｇＧの場合と同様にして、ＨＳＡ（Albumin from human serum）,Ｔｒｆ（Transferrin human）の固定、及び固定量の測定をした。
すなわち、各多孔質ジルコニア粒子に対して、それぞれ次のようにして、ＨＳＡ（又はＴｒｆ）を固定し、固定されたＨＳＡ（又はＴｒｆ）量を求めた。
多孔質ジルコニア粒子へのＨＳＡ（又はＴｒｆ）の固定は、以下のように行った。スピッツに５００μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を入れて、この液に多孔質ジルコニア粒子３ｍｇを加えた。多孔質ジルコニア粒子を十分に分散させた後、ＨＳＡ（又はＴｒｆ）（７５０μｇ／５００μＬ）を５００μＬ加えて、遮光下、４℃で一晩撹拌した。
スピッツを、１２，０００回転で１０分間遠心して、多孔質ジルコニア粒子を沈殿分離した。上澄み溶液に残存する未固定のＨＳＡ（又はＴｒｆ）量を、プロテインアッセイ染色液（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用い、マイクロプレートリーダー（ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００ＰＲＯ，ＴＥＣＡＮ）により定量した。始めに加えたＨＳＡ（又はＴｒｆ）量と、未固定のＨＳＡ（又はＴｒｆ）量との差分を固定されたＨＳＡ量（又はＴｒｆ量）（ＨＳＡ抗体吸着量（又はＴｒｆ抗体吸着量））とした。
各多孔質ジルコニア粒子に対して、それぞれ次のようにして、ＩｇＧを固定し、固定されたＩｇＧ量を求めた。
多孔質ジルコニア粒子へのＩｇＧの固定は、以下のように行った。スピッツに５００μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を入れて、この液に多孔質ジルコニア粒子３ｍｇを加えた。多孔質ジルコニア粒子を十分に分散させた後、ＩｇＧ（７５０μｇ／５００μＬ）を５００μＬ加えて、遮光下、４℃で一晩撹拌した。
スピッツを、１２，０００回転で１０分間遠心して、多孔質ジルコニア粒子を沈殿分離した。上澄み溶液に残存する未固定のＩｇＧ量を、プロテインアッセイ染色液（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用い、マイクロプレートリーダー（ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００ＰＲＯ，ＴＥＣＡＮ）により定量した。始めに加えたＩｇＧ量と、未固定のＩｇＧ量との差分を固定されたＩｇＧ量（ＩｇＧ抗体吸着量）とした。
ＩｇＧの場合と同様にして、ＨＳＡ（Albumin from human serum）,Ｔｒｆ（Transferrin human）の固定、及び固定量の測定をした。
すなわち、各多孔質ジルコニア粒子に対して、それぞれ次のようにして、ＨＳＡ（又はＴｒｆ）を固定し、固定されたＨＳＡ（又はＴｒｆ）量を求めた。
多孔質ジルコニア粒子へのＨＳＡ（又はＴｒｆ）の固定は、以下のように行った。スピッツに５００μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を入れて、この液に多孔質ジルコニア粒子３ｍｇを加えた。多孔質ジルコニア粒子を十分に分散させた後、ＨＳＡ（又はＴｒｆ）（７５０μｇ／５００μＬ）を５００μＬ加えて、遮光下、４℃で一晩撹拌した。
スピッツを、１２，０００回転で１０分間遠心して、多孔質ジルコニア粒子を沈殿分離した。上澄み溶液に残存する未固定のＨＳＡ（又はＴｒｆ）量を、プロテインアッセイ染色液（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用い、マイクロプレートリーダー（ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００ＰＲＯ，ＴＥＣＡＮ）により定量した。始めに加えたＨＳＡ（又はＴｒｆ）量と、未固定のＨＳＡ（又はＴｒｆ）量との差分を固定されたＨＳＡ量（又はＴｒｆ量）（ＨＳＡ抗体吸着量（又はＴｒｆ抗体吸着量））とした。
【0038】
３．結果
結果を図２に示す。担持量が０．６６ｍａｓｓ％以上２．７６ｍａｓｓ％以下の場合には、担持していない場合（０ｍａｓｓ％の場合）よりも、免疫グロブリンに対する選択性が高いことが分かった。すなわち、ＨＳＡ吸着量に対するＩｇＧ吸着量の比の値、Ｔｒｆ吸着量に対するＩｇＧ吸着量の比の値は、担持量が０．６６ｍａｓｓ％以上２．７６ｍａｓｓ％以下の場合の方が、担持していない場合（０ｍａｓｓ％の場合）よりも大きくなっていた。
結果を図２に示す。担持量が０．６６ｍａｓｓ％以上２．７６ｍａｓｓ％以下の場合には、担持していない場合（０ｍａｓｓ％の場合）よりも、免疫グロブリンに対する選択性が高いことが分かった。すなわち、ＨＳＡ吸着量に対するＩｇＧ吸着量の比の値、Ｔｒｆ吸着量に対するＩｇＧ吸着量の比の値は、担持量が０．６６ｍａｓｓ％以上２．７６ｍａｓｓ％以下の場合の方が、担持していない場合（０ｍａｓｓ％の場合）よりも大きくなっていた。
【0039】
＜他の実施形態（変形例）＞
尚、この発明は上記の実施例や実施形態に限られるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において種々の態様において実施することが可能である。
尚、この発明は上記の実施例や実施形態に限られるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において種々の態様において実施することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【0040】
本開示の多孔質ジルコニア粒子は、抗体分離精製に用いる場合に、ジルコニア結晶相が持つ、耐薬品性、高い構造強度、焼成による再生利用可能性など、従来技術にはない有利な効果を奏する。よって、抗体製品の製造プロセスの低コスト化に大きく貢献するものと期待される。抗体医薬を始めとする抗体の精製と分離に利用されるカラム製品としての応用としてのみならず、食品中アレルゲン等の特異的なタンパク質の除去への利用も考えられる。
【図1】
【図2】