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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024031964
(43)【公開日】2024-03-07
(54)【発明の名称】抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/30 20060101AFI20240229BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240229BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240229BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240229BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240229BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240229BHJP
【ＦＩ】
C07K16/30 ZNA
A61K47/68
A61P35/00
A61P11/00
A61K39/395 L
C12N15/13
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023137027
(22)【出願日】2023-08-25
(31)【優先権主張番号】63/373,668
(32)【優先日】2022-08-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】512212195
【氏名又は名称】アッヴィ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】オイニーン・オハインマイア
(72)【発明者】
【氏名】エミリー・ジェイ・フェーブル
(72)【発明者】
【氏名】レジーナ・エム・ライリー
(72)【発明者】
【氏名】アンドリュー・シー・フィリップス
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076DD41
4C076EE59
4C076FF70
4C085AA26
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA50
4H045BA51
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA20
(57)【要約】
【課題】がんを治療するための、より標的化された有力な療法を開発すること。
【解決手段】本開示は、ＳＥＺ６抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を、そのようなＡＤＣを使用する組成物及び方法を含めて、提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本開示は、ＳＥＺ６抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を、そのようなＡＤＣを使用する組成物及び方法を含めて、提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（ＩＶ）：
（式中、ｎが、１～１０の整数であり、Ａｂが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＳＥＺ６抗体であり、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号３として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号４として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号５として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号６として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号７として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号８として示されるアミノ酸配列を有する）
の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【化1】
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号３として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号４として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号５として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号６として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号７として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号８として示されるアミノ酸配列を有する）
の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【請求項2】
抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１に記載の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【請求項3】
抗体が、
（ａ）配列番号１として示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び
（ｂ）配列番号２として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
（ａ）配列番号１として示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び
（ｂ）配列番号２として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【請求項4】
抗体が、
（ａ）配列番号９として示されるアミノ酸を有する重鎖及び
（ｂ）配列番号１０として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、請求項１に記載の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
（ａ）配列番号９として示されるアミノ酸を有する重鎖及び
（ｂ）配列番号１０として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、請求項１に記載の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【請求項5】
式（ＩＶ）：
（式中、ｎが、１～１０の整数であり、Ａｂが、配列番号９として示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの重鎖、及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの軽鎖を含む抗ＳＥＺ６抗体である）
の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【化2】
の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【請求項6】
ｎが６である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【請求項7】
ｎが２である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【請求項8】
ｎが４である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【請求項9】
ｎが８である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【請求項10】
ｎが１０である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体。
【請求項11】
治療有効量の、請求項１～５のいずれかに記載の抗体薬物複合体を含み、組成物中の抗体薬物複合体の主な化学種が、６であるｎを有する、組成物。
【請求項12】
治療有効量の、請求項１～５のいずれかに記載の抗体薬物複合体、及び薬学的に許容される賦形剤を含み、組成物が、６又は約６のＤＡＲを有する、医薬組成物。
【請求項13】
小細胞肺がんを治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項14】
小細胞肺がんを治療する方法であって、治療有効量の、請求項１２に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる、２０２２年８月２６日出願の米国仮出願第６３／３７３，６６８号の利益を主張する。
【0002】
配列表
本出願は、電子的に提出された、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２３年８月４日作成の前記配列表は、ＳｅｑＬｉｓｔ＿３５０７９４－４６１００と命名され、サイズが１４，９６５バイトである。
本出願は、電子的に提出された、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２３年８月４日作成の前記配列表は、ＳｅｑＬｉｓｔ＿３５０７９４－４６１００と命名され、サイズが１４，９６５バイトである。
【0003】
本出願は、抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。
【背景技術】
【0004】
発作関連ホモログ６（ＳＥＺ６）は、選択されたニューロン系細胞の細胞表面にみられる膜貫通タンパク質である（Ｓｈｉｍｉｚｕ－Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ、ら Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｉｚｕｒｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ、ＳＥＺ６．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９５；２１６（１）：３８２－９頁；Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ ＪＭ、ら）。ＳＥＺ６は、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を含む神経内分泌腫瘍において選択的に発現される（Ｋｕｄｏｈ Ｓ，ら Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ １（ＡＳＣＬ１）ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ；ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＡＳＣＬ１－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０２０；１５３（６）：４４３－４５６頁）。小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）は、全ての診断された肺がんのうちの１３～１５％を占める高悪性度の神経内分泌癌であり、約２６０，０００件の新規症例が毎年世界中で診断され、約３３，０００件が米国で診断され、２５，０００人が死に至る。進展型疾患についての５年生存率は２％（患者の約６５％）であり、限局段階疾患の５年生存率は１５％である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｓｈｉｍｉｚｕ－Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ、ら Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｉｚｕｒｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ、ＳＥＺ６．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９５；２１６（１）：３８２－９頁
【非特許文献2】Ｋｕｄｏｈ Ｓ，ら Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ １（ＡＳＣＬ１）ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ；ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＡＳＣＬ１－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０２０；１５３（６）：４４３－４５６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
がんの従来の治療処置はしばしば無効であり、ゆえに依然として、がんを治療するための、より標的化された有力な療法を開発する必要性がある。化学的リンカーを介して細胞毒性薬物に結合した、ＳＥＺ６を標的とする抗体を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、ＳＥＺ６を発現する腫瘍を有する患者を治療するための、標的化された療法をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【0007】
（発明の要旨）
式（ＩＶ）：
式（ＩＶ）：
【0008】
【化1】
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号３として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号４として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号５として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号６として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号７として示されるアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号８として示されるアミノ酸配列を有する）
の抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体が、本明細書で提供される。
【0009】
一部の実施形態において、抗体薬物複合体の抗ＳＥＺ６抗体は、（ａ）配列番号１として示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び（ｂ）配列番号２として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【0010】
一部の実施形態において、抗体薬物複合体の抗ＳＥＺ６抗体は、ＩｇＧ１抗体である。
【0011】
一部の実施形態において、抗体薬物複合体の抗ＳＥＺ６抗体は、（ａ）配列番号９として示されるアミノ酸を有する重鎖及び（ｂ）配列番号１０として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【0012】
一部の実施形態において、抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体は、式（ＩＶ）：
【0013】
【化2】
【0014】
一部の実施形態において、抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体は、６であるｎを有する。
【0015】
一部の実施形態において、抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体は、２であるｎを有する。
【0016】
一部の実施形態において、抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体は、４であるｎを有する。
【0017】
一部の実施形態において、抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体は、８であるｎを有する。
【0018】
一部の実施形態において、抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体は、１０であるｎを有する。
【0019】
治療有効量の、本明細書で開示される抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体を含み、組成物中の抗体薬物複合体の主な化学種が、６であるｎを有する、組成物も、本明細書で提供される。
【0020】
治療有効量の、本明細書で開示される抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体、及び薬学的に許容される賦形剤を含み、組成物が、６又は約６のＤＡＲを有する、医薬組成物も、本明細書で提供される。
【0021】
小細胞肺がんを治療する方法であって、治療有効量の、本明細書で開示される抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、方法も本明細書で提供される。
【0022】
小細胞肺がんを治療する方法であって、治療有効量の、本明細書で開示される抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体を含む、治療有効量の、本明細書で開示される医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、方法も本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1A】Ｃａｌｕ－６（肺腺癌）細胞株についての、ＴＯＰ１阻害剤化合物の投与後の細胞増殖を示すグラフである。
【図1B】Ａ３７５（悪性黒色腫）細胞株についての、ＴＯＰ１阻害剤化合物の投与後の細胞増殖を示すグラフである。
【図2A】ＡＤＣ－１、陰性対照である非標的指向性ＡＤＣ（ＡＤＣ－２）又はＴＯＰ１阻害剤単独（実施例１Ｇ）の、ＳＣＬＣ細胞株に対する、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陽性であった細胞株：Ｈ５２６に対するインビトロ活性を示すグラフである。
【図2B】ＡＤＣ－１、陰性対照である非標的指向性ＡＤＣ（ＡＤＣ－２）又はＴＯＰ１阻害剤単独（実施例１Ｇ）の、ＳＣＬＣ細胞株に対する、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陽性であった細胞株：Ｈ１４６に対するインビトロ活性を示すグラフである。
【図2C】ＡＤＣ－１、陰性対照である非標的指向性ＡＤＣ（ＡＤＣ－２）又はＴＯＰ１阻害剤単独（実施例１Ｇ）の、ＳＣＬＣ細胞株に対する、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陽性であった細胞株：Ｈ１８７に対するインビトロ活性を示すグラフである。
【図2D】ＡＤＣ－１、陰性対照である非標的指向性ＡＤＣ（ＡＤＣ－２）又はＴＯＰ１阻害剤単独（実施例１Ｇ）の、ＳＣＬＣ細胞株に対する、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陽性であった細胞株：Ｈ１９６３ＦＰ５に対するインビトロ活性を示すグラフである。
【図2E】ＡＤＣ－１、陰性対照である非標的指向性ＡＤＣ（ＡＤＣ－２）又はＴＯＰ１阻害剤単独（実施例１Ｇ）の、ＳＣＬＣ細胞株に対する、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陽性であった細胞株：ＣＯＲＬ９５に対するインビトロ活性を示すグラフである。
【図2F】ＡＤＣ－１、陰性対照である非標的指向性ＡＤＣ（ＡＤＣ－２）又はＴＯＰ１阻害剤単独（実施例１Ｇ）の、ＳＣＬＣ細胞株に対する、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陰性であった細胞株：ＳＢＣ５に対するインビトロ活性を示すグラフである。
【図2G】ＡＤＣ－１、陰性対照である非標的指向性ＡＤＣ（ＡＤＣ－２）又はＴＯＰ１阻害剤単独（実施例１Ｇ）の、ＳＣＬＣ細胞株に対する、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陰性であった２つの細胞株：ＳＷ１２７１に対するインビトロ活性を示すグラフである。
【図2H】ＡＤＣ－１、陰性対照である非標的指向性ＡＤＣ（ＡＤＣ－２）又はＴＯＰ１阻害剤単独（実施例１Ｇ）の、ＳＣＬＣ細胞株に対する、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陽性であった細胞株：Ｈ５２４に対するインビトロ活性を示すグラフである。
【図3A】Ｈ１９６３細胞株由来異種移植片（ＣＤＸ）マウスモデルにおける、ＡＤＣ－１処理の用量応答曲線を示すグラフである。
【図3B】Ｈ５２６細胞株由来異種移植片（ＣＤＸ）マウスモデルにおける、ＡＤＣ－１処理の用量応答曲線を示すグラフである。
【図3C】ＬＵ９５患者由来異種移植片（ＰＤＸ）マウスモデルにおける、ＡＤＣ－１処理の用量応答曲線を示すグラフである。
【図3D】ＬＵ１４９患者由来異種移植片（ＰＤＸ）マウスモデルにおける、ＡＤＣ－１処理の用量応答曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本開示において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に定めない限り、複数の指示対象を含む。用語「ａ」（又は「ａｎ」）、さらに用語「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は、文脈が別途明確に定めない限り、本明細書において互換可能に使用可能である。
【0025】
本開示において使用される場合、別途明記されない限り、用語「約」及び「およそ」は概して、当業者が、列挙される値と同等である（すなわち、同じ機能又は結果を有する）と考える数の範囲を指す。多くの例において、用語「約」及び「およそ」は、最も近い意義ある数字に丸められた数を含んでいてよい。特定の実施形態において、用語「約」及び「およそ」は、当業者により判断される正常な変動、例えば、２０％又は１０％又は５％以内の変動などを可能にするように解釈される。特定の実施形態において、用語「約」及び「およそ」は、正確な列挙される値を包含する。文脈が別途明確に定めない限り、本明細書において提供される全ての数値は、用語、約により修飾される。
【0026】
特定の実施形態において、ＴＯＰ１阻害剤を含む抗ＳＥＺ６ ＡＤＣを含む、抗ＳＥＺ６抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、及びＡＤＣを使用する方法が、本明細書で開示される。
【0027】
トポイソメラーゼ１阻害剤（ＴＯＰ１ｉ）
トポイソメラーゼ１（ＴＯＰ１）は、ＤＮＡ複製中に形成されるスーパーコイルを除去する。ＴＯＰ１阻害剤（ＴＯＰ１ｉ）は、ＴＯＰ１－ＤＮＡ複合体に結合し、これを安定化させ、ＤＮＡ鎖切断及びアポトーシスを誘導することができる。
トポイソメラーゼ１（ＴＯＰ１）は、ＤＮＡ複製中に形成されるスーパーコイルを除去する。ＴＯＰ１阻害剤（ＴＯＰ１ｉ）は、ＴＯＰ１－ＤＮＡ複合体に結合し、これを安定化させ、ＤＮＡ鎖切断及びアポトーシスを誘導することができる。
【0028】
特定の実施形態において、構造式（Ｉ）によるトポイソメラーゼＩ阻害薬（「ＴＯＰ１ｉ薬」）が本明細書において提供され、トポイソメラーゼＩ阻害薬は、抗ＳＥＺ６抗体への結合により、細胞への標的化された送達を目的としていてよい。
【0029】
【化3】
【0030】
特定の実施形態において、ＴＯＰ１ｉ薬は、（７Ｓ）－１４－（３－アミノビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－７－エチル－７－ヒドロキシ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－８，１１（７Ｈ，１３Ｈ）－ジオンである。
【0031】
特定の実施形態において、本明細書において意図されるＴＯＰ１ｉ薬は、構造式（ＩＩ）：
【0032】
【化4】
【0033】
【化5】
において示されるように、リンカーを介して抗体に結合していてよい。
【0034】
リンカー薬物ＬＤ１（構造式（ＩＩＩ））
特定の実施形態において、ＴＯＰ１ｉリンカー薬物（ＬＤ１）は、式（ＩＩＩ）による化合物である。特定の実施形態において、ＬＤ１は、（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミドである。
特定の実施形態において、ＴＯＰ１ｉリンカー薬物（ＬＤ１）は、式（ＩＩＩ）による化合物である。特定の実施形態において、ＬＤ１は、（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミドである。
【0035】
【化6】
【0036】
抗ＳＥＺ６ ＡＤＣ
特定の実施形態において、本明細書において記載されるＴＯＰ１ｉ薬（すなわち、式（Ｉ））は、抗ＳＥＺ６抗体に結合して、抗ＳＥＺ６ ＴＯＰ１ｉ抗体薬物複合体を形成してよい。抗体薬物複合体は、ＳＥＺ６発現腫瘍などの標的組織に、１つ以上の薬物部分を選択的に送達する。ゆえに、特定の実施形態において、本開示は、小細胞肺がんの治療における治療上の使用のための、抗ＳＥＺ６ ＴＯＰ１ｉ ＡＤＣを提供する。
特定の実施形態において、本明細書において記載されるＴＯＰ１ｉ薬（すなわち、式（Ｉ））は、抗ＳＥＺ６抗体に結合して、抗ＳＥＺ６ ＴＯＰ１ｉ抗体薬物複合体を形成してよい。抗体薬物複合体は、ＳＥＺ６発現腫瘍などの標的組織に、１つ以上の薬物部分を選択的に送達する。ゆえに、特定の実施形態において、本開示は、小細胞肺がんの治療における治療上の使用のための、抗ＳＥＺ６ ＴＯＰ１ｉ ＡＤＣを提供する。
【0037】
特定の実施形態において、ＴＯＰ１ｉ薬は、リンカー部分により抗ＳＥＺ６抗体に結合している。特定の実施形態において、リンカーは、１つの位置ではＴＯＰ１ｉ薬に対する共有結合を、別の位置では抗体に対する共有結合を形成することにより、ＴＯＰ１ｉ薬を抗ＳＥＺ６抗体に連結させる。特定の実施形態において、共有結合は、リンカーにおける官能基と、ＴＯＰ１ｉ薬及び抗ＳＥＺ６抗体における官能基との間の反応により形成される。特定の実施形態において、本開示の抗ＳＥＺ６ ＡＤＣは、式（ＩＩＩ）のＴＯＰ１ｉリンカー薬物に結合した抗ＳＥＺ６抗体から構成される。
【0038】
特定の実施形態において、「Ａｂ」は、配列番号９として示されるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗ＳＥＺ６抗体を指す。特定の実施形態において、Ａｂは、式（ＩＩＩ）のＴＯＰ１ｉリンカー薬物に結合している。
【0039】
Ａｂ抗ＳＥＺ６抗体
特定の実施形態において、Ａｂは、ヒト化抗ＳＥＺ６ ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。特定の実施形態において、Ａｂは、当技術分野で開発された規則に従って、及び／又は既知の可変領域のデータベースに対し配列を整列させることにより特定される、可変領域及びＣＤＲ（相補性決定領域）を含む。
特定の実施形態において、Ａｂは、ヒト化抗ＳＥＺ６ ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。特定の実施形態において、Ａｂは、当技術分野で開発された規則に従って、及び／又は既知の可変領域のデータベースに対し配列を整列させることにより特定される、可変領域及びＣＤＲ（相補性決定領域）を含む。
【0040】
これらの領域を特定する方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ、ｅｄｓ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、２００１及びＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．、２０００に記載されている。例えば、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２（本明細書では「Ｋａｂａｔ」と呼ばれる）により提供される機構のうちの１つに従って、又はＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）（本明細書では「ＡｂＭ」と呼ばれる）に従って特定されてよい。ＡｂＭは、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ（ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ＬｏｎｄｏｎのＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎにより維持される）のＡｂｙｓｉｓデータベースから得られる。
【0041】
特定の実施形態において、Ａｂは、配列番号９（出現順で、可変領域は太字であり、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有する。定常領域はイタリック体である。ＣＤＲは下線を有し、それぞれ配列番号３、４及び５として示されるアミノ酸配列を有する。）として示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【0042】
【化7】
【0043】
特定の実施形態において、Ａｂは、配列番号１０（出現順で、可変領域は太字であり、配列番号２として示されるアミノ酸配列を有する。定常領域はイタリック体である。ＣＤＲは下線を有し、それぞれ配列番号６、７及び８として示されるアミノ酸配列を有する。）として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【0044】
【化8】
【0045】
特定の実施形態において、Ａｂは、配列番号９として示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの重鎖、及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの軽鎖を含む。
【0046】
特定の実施形態において、Ａｂは、配列番号３として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３を含む。ＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＡｂＭ定義を使用して特定され、残りのＣＤＲアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔ定義を使用して特定された。
【0047】
特定の実施形態において、Ａｂは、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号２として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【0048】
結合した薬物の数
特定の実施形態において、本明細書で開示されるＡＤＣは、抗体の形状、及び少なくとも部分的に、結合を引き起こすのに使用される方法次第で、各種化学量論的モル比で抗体部分に結合した薬物分子を含む。
特定の実施形態において、本明細書で開示されるＡＤＣは、抗体の形状、及び少なくとも部分的に、結合を引き起こすのに使用される方法次第で、各種化学量論的モル比で抗体部分に結合した薬物分子を含む。
【0049】
用語「薬物量」又は「薬物積載」は、個々のＡＤＣ分子における抗体１つあたりの薬物分子の数を指す。抗ＳＥＺ６ ＡＤＣに結合したＴＯＰ１ｉ薬の数は変動してよく、抗ＳＥＺ６抗体における利用可能な結合部位の数により制限される。本発明の抗ＳＥＺ６ ＡＤＣについて意図される場合、リンカーは、抗ＳＥＺ６ ＡＤＣにおいて、抗体に単一のＴＯＰ１ｉ薬を結合させる。抗ＳＥＺ６ ＡＤＣが、使用及び／又は保存条件下で許容されないレベルの凝集を呈しない限り、最大１０であるｎを有する抗ＳＥＺ６ ＡＤＣ（すなわち、式（ＩＶ））が意図される。特定の実施形態において、抗ＳＥＺ６ ＡＤＣは、１～１０の範囲にあるｎを有する。特定の実施形態において、抗ＳＥＺ６ ＡＤＣは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０から選択されるｎを有する。特定の実施形態において、ｎは、２、３、４、５又は６である。特定の実施形態において、ｎは、２、４、６、８又は１０である。特定の実施形態において、ｎは、２、４又は６である。特定の実施形態において、ｎは６である。特定の実施形態において、薬物積載は、薬物分子１個、薬物分子２個、薬物分子３個、薬物分子４個、薬物分子５個、薬物分子６個、薬物分子７個、薬物分子８個、薬物分子９個又は薬物分子１０個を含んでいてよい。
【0050】
抗ＳＥＺ６ ＡＤＣ組成物を生成する結合方法が本明細書において提供され、ＡＤＣの主な化学種は６であるｎを有し、組成物は、６又は約６の薬物－抗体比（ＤＡＲ）を有する。ＤＡＲは、組成物中の、各抗体に結合した薬物の平均数である。他の結合方法は当技術分野で既知であり、様々な数の結合した薬物を有する（例えば、２、３、４、５、６又は７であるｎを有する）ＡＤＣ及び様々なＤＡＲ（例えば、４、５、６又は約４、約５又は約６のＤＡＲ）の組成物を生成するのに利用可能である。
【0051】
例示的なＡＤＣ
特定の実施形態において、式（ＩＶ）：
特定の実施形態において、式（ＩＶ）：
【0052】
【化9】
【0053】
特定の実施形態において、ｎは、２、４、６、８又は１０の値を有する。特定の実施形態において、ｎは６である。特定の実施形態において、構造式（ＩＶ）の抗ＳＥＺ６ ＡＤＣは、配列番号９として示されるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を有するＡｂを含み、ｎは、２、４、６、８又は１０の値を有する。特定の実施形態において、構造式（ＩＶ）の抗ＳＥＺ６ ＡＤＣは、配列番号９として示されるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を有するＡｂを含み、ｎは６の値を有する。
【0054】
本明細書において使用される場合、「ＡＤＣ－１」は、構造式（ＩＶ）によるＡＤＣを含むＡＤＣ組成物であり、Ａｂは、配列番号９として示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの重鎖、及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの軽鎖、及び約６の薬物－抗体比（ＤＡＲ）を有し、主な化学種は６であるｎを有する。ＡＤＣ－１を作製するのに使用される手順は、以下の実施例に記載される。一実施形態において、ＡＤＣ－１は、２種以上の様々な値のｎを有する複数のＡＤＣ－１化学種を含む組成物である。一部の実施形態において、ＡＤＣ－１の組成物は、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４又は約６．５の平均薬物－抗体比（ＤＡＲ）を有する。一部の実施形態において、ＡＤＣ－１の組成物は、抗ＳＥＺ６抗体１つあたりに結合した平均６分子のトポイソメラーゼ１阻害剤（ＴＯＰ１ｉ）を有する。一部の実施形態において、組成物中のＡＤＣ－１の主な化学種は、ｎ＝６を有する。一部の実施形態において、ＡＤＣ－１は約６の平均ＤＡＲを有する。
【0055】
使用方法
特定の実施形態において、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を治療するための方法であって、治療有効量の式（ＩＶ）のＡＤＣを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
特定の実施形態において、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を治療するための方法であって、治療有効量の式（ＩＶ）のＡＤＣを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
【0056】
用語「対象」は、本明細書において使用される場合、ヒトを指す。用語「ヒト」、「患者」及び「対象」は、本明細書において互換可能に使用される。
【0057】
用語「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、本明細書において使用される場合、疾患及び／又はその付随する症状を軽減又は抑制する方法を指す。
【0058】
句「治療有効量」は、特定の対象又は対象集団において治療のために投与された場合に、治療されるべき状態若しくは障害の症状のうちの１つ以上の発症を防止する、又は治療されるべき状態若しくは障害の症状のうちの１つ以上をある程度軽減するのに十分なＡＤＣの量を指す。
【実施例0059】
本明細書において記載されるＡＤＣ、抗体及びＴＯＰ１ｉの例示的な実施形態についての特定の特性及び性質を強調する以下の実施例が、例示の目的で提供される。
［実施例１］
［実施例１］
【0060】
【化10】
（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド
【0061】
【化11】
ｔｅｒｔ－ブチル（３－（メトキシ（メチル）カルバモイル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）カルバメート
３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－カルボン酸（４．９ｇ）、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２．２ｇ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１１．３０ｍＬ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）中溶液に、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（８．６１ｇ）を少しずつ、１０℃で添加した。反応混合物を２０℃で１２時間撹拌した。２つの付加反応を引き起こし、記載されたように２０℃で１２時間撹拌させた。３つの反応全てを組み合わせた。反応をジクロロメタン（２００ｍＬ）で希釈し、１Ｎ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）に添加した。形成された沈殿物を濾過し、濾液を分離させた。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル中１～５０％酢酸エチルで溶出する、シリカゲルでのクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ４．９７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ３．６６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４ （ｓ， ６Ｈ）， １．４５ （ｓ， ９Ｈ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ２７１．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0062】
【化12】
ｔｅｒｔ－ブチル（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）カルバメート
５－ブロモベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール（８．８３ｇ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、ｎ－ブチルリチウム（１７．５７ｍＬ、ヘキサン中２．５Ｍ）をゆっくりと、－６５℃で窒素ガス下で添加した。混合物を－６５℃で３０分間撹拌した。実施例１Ａ（４．７５ｇ）のテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）中溶液をゆっくりと添加した。混合物を－６５℃で３時間撹拌した。３つの付加反応を引き起こし、－６５℃で３時間撹拌させた。４つの反応全てを組み合わせた。混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液（５００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３×５００ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層をブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル中１～５０％酢酸エチルで溶出する、シリカゲルでのクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．６３ （ｄｄ， １Ｈ）， ７．４５ （ｄ， １Ｈ）， ６．８２ （ｄ， １Ｈ）， ６．０３ （ｓ， ２Ｈ）， ５．０４ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ２．５０ （ｓ， ６Ｈ）， １．４６ （ｓ， ９Ｈ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３５４．２ （Ｍ＋Ｎａ）＋．
【0063】
【化13】
Ｎ－（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド
ステップ１：実施例１Ｂ（６．２ｇ）のジクロロメタン（６２ｍＬ）中溶液に、トリフルオロ酢酸（６２ｍＬ）をゆっくりと、０℃で添加した。反応を２５℃で４時間撹拌した。２つの付加反応を引き起こし、２５℃で４時間撹拌した。各混合物を減圧下で濃縮した。各残渣を、さらなる精製なしに次のステップに使用した。
【0064】
ステップ２：上記粗生成物のジクロロメタン（６２ｍＬ）中溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１６．３４ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸無水物（３．９６ｍＬ）を液滴で、０℃で添加した。混合物を２５℃で２時間撹拌した。２つの付加反応を記載されたように引き起こし、２５℃で２時間撹拌した。３つの反応全てを組み合わせ、水（２００ｍＬ）中に注ぎ、ジクロロメタン（２×２００ｍＬ）で抽出した。有機層をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル中２５％酢酸エチルで溶出する、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．６１ （ｄｄ， １Ｈ）， ７．４３ （ｄ， １Ｈ）， ７．００ （ｓ， １Ｈ）， ６．８５ （ｄ， １Ｈ）， ６．０５ （ｓ， ２Ｈ）， ２．６２ （ｓ， ６Ｈ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３２８．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0065】
【化14】
２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－（３－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）アセトアミド
実施例１Ｃ（４．３ｇ）の無水酢酸（２５ｍＬ）中溶液に、硝酸銅（ＩＩ）三水和物（４．７６ｇ）を少しずつ、０℃で添加した。混合物を０℃で３時間撹拌した。３つの付加反応を引き起こし、記載されたように０℃で３時間撹拌した。４つの反応全てを組み合わせた。混合物を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（５×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル中７５％酢酸エチルで溶出する、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．６１ （ｓ， １Ｈ）， ６．７７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．６４ （ｓ， １Ｈ）， ６．２１ （ｓ， ２ Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ６ Ｈ）． ＭＳ （ＡＰＣＩ＋） ｍ／ｚ ３７３．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0066】
【化15】
Ｎ－（３－（６－アミノベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド
実施例１Ｄ（４ｇ）のエタノール（４０ｍＬ）及び水（８ｍＬ）中溶液に、鉄（５．４ｇ）及び塩化アンモニウム（５．１７ｇ）を、窒素下で添加した。混合物を１００℃で３時間撹拌した。３つの付加反応を引き起こし、記載されたように１００℃で３時間撹拌した。周囲温度に冷却した後、４つの反応全てを組み合わせた。混合物を水（１Ｌ）中に注ぎ、酢酸エチル（５×５００ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル中１０～７５％酢酸エチルで溶出する、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．２２ （ｓ， １Ｈ）， ６．７０ （ｓ， １Ｈ）， ６．５０ （ｓ， ２Ｈ）， ６．１４ （ｓ， １Ｈ）， ５．９２ （ｓ， ２Ｈ）， ２．６３ （ｓ， ６Ｈ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３４３．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0067】
【化16】
（Ｓ）－Ｎ－（３－（７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド
実施例１Ｅ（３．５ｇ）及び（Ｓ）－４－エチル－４－ヒドロキシ－７，８－ジヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３，４－ｆ］インドリジン－３，６，１０（４Ｈ）－トリオン（２．６９ｇ）のトルエン（１４０ｍＬ）中懸濁液に、パラ－トルエンスルホン酸一水和物（１．９４５ｇ）を添加した。混合物を１１５℃で１２時間撹拌した。３つの付加反応を引き起こし、記載されたように１１５℃で１２時間撹拌した。周囲温度に冷却した後、４つの反応全てを組み合わせた。混合物を濾過し、収集された固体をアセトニトリル（２００ｍＬ）で粉砕して、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド－ｄ６） δ ｐｐｍ １０．２８ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ６．４７ （ｓ， １Ｈ）， ６．３０ （ｄｄ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３６ （ｓ， ２Ｈ）， ２．８７ （ｓ， ６Ｈ）， １．９４ － １．７７ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８８ （ｔ， ３Ｈ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ５７０．３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0068】
【化17】
（７Ｓ）－１４－（３－アミノビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－７－エチル－７－ヒドロキシ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－８，１１（７Ｈ，１３Ｈ）－ジオン
実施例１Ｆ（３ｇ）のメタノール（３０ｍＬ）中溶液に、ＨＣｌ（６０ｍＬ、メタノール中４Ｍ）を添加した。混合物を６５℃で４時間撹拌した。４つの付加反応を引き起こし、先に記載されたように６５℃で４時間撹拌した。周囲温度に冷却した後、５つの反応全てを組み合わせた。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をメタノール（２００ｍＬ）で粉砕して、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド－ｄ６） δ ｐｐｍ ９．２３ （ｓ， ３Ｈ）， ７．５４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ６．３０ （ｄ， ２Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３９ － ５．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７９ （ｓ， ６Ｈ）， １．８７ （七重線， ２Ｈ）， ０．８８ （ｔ， ３Ｈ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４７４．３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0069】
【化18】
ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（（Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート
（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－メチルブタンアミド）プロパン酸（２．４９ｇ）、２－ヒドロキシピリジン１－オキシド（１．３１ｇ）及びＮ１－（（エチルイミノ）メチレン）－Ｎ３，Ｎ３－ジメチルプロパン－１，３－ジアミン塩酸塩（２．２６ｇ）のアセトニトリル（４０ｍＬ）中懸濁液に、２，６－ルチジン（２．７４ｍＬ）を添加した。混合物を周囲温度で３０分間撹拌した。分離フラスコ内で、実施例１Ｇ（４ｇ）及び２，６－ルチジン（２．７４ｍＬ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中で組み合わせ、上記溶液を添加した。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタン（３００ｍＬ）中に溶解させ、飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、ジクロロメタン中０～１０％メタノールで溶出する、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．６５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８９ （ｄ， １Ｈ）， ７．６１ （ｓ， １Ｈ）， ７．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２２ （ｓ， １Ｈ）， ６．７７ （ｄ， １Ｈ）， ６．４６ （ｓ， １Ｈ）， ６．２９ （ｄ， ２Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２９ （ｑ， １Ｈ）， ３．８７ － ３．７７ （ｍ， １Ｈ）， ２．７６ （ｓ， ６Ｈ）， １．９９ （ｑ， １Ｈ）， １．９２ － １．８１ （ｍ， ２Ｈ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）， １．２５ （ｄ， ３Ｈ）， ０．９２ － ０．８０ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ７４４．４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0070】
【化19】
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３－（（Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）－３－メチルブタンアミド
実施例１Ｈ（５．５ｇ）を、トリフルオロ酢酸（３０ｍＬ）で、周囲温度で３０分間処理した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣を水（２００ｍＬ）中５０％アセトニトリル中に溶解させた。溶液を凍結乾燥して、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．８０ （ｓ， １Ｈ）， ８．５９ （ｄ， １Ｈ）， ８．１０ （ｄ， ３Ｈ）， ７．６０ （ｓ， １Ｈ）， ７．４８ （ｓ， １Ｈ）， ７．２３ （ｓ， １Ｈ）， ６．３３ － ６．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４１ （ｄ， ２Ｈ）， ５．３５ － ５．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３５ （ｐ， １Ｈ）， ３．６６ － ３．６３ （ｍ， １Ｈ）， ２．７７ （ｓ， ６Ｈ）， ２．１７ － ２．０６ （ｍ， １Ｈ）， １．９１ － １．８３ （ｍ， ２Ｈ）， １．３１ （ｄ， ３Ｈ）， １．０１ － ０．９６ （ｄｄ， ６Ｈ）， ０．８９ （ｔ， ３Ｈ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ６４４．４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0071】
【化20】
（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド
２－ブロモ酢酸（１．４３５ｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２６ｍＬ）中溶液に、エチル２－エトキシキノリン－１（２Ｈ）－カルボキシレート（２．５５ｇ）を添加した。混合物を周囲温度で１０分間撹拌した。分離フラスコ内で、実施例１Ｉ（４．５ｇ）及び２，６－ルチジン（３．６１ｍＬ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２６ｍＬ）中で組み合わせ、上記溶液を添加した。混合物を周囲温度で３０分間撹拌した。混合物をトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）で酸性化し、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中５～７５％アセトニトリルで３０分間にわたり溶出する、Ｌｕｎａカラム（２５０×５０ｍｍ、１０ｍｍ）を使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ機構での逆相ＨＰＬＣにより精製して、凍結乾燥後に表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．５７ （ｓ， １Ｈ）， ８．３２ （ｄ， １Ｈ）， ８．１６ （ｄ， １Ｈ）， ７．６７ （ｓ， １Ｈ）， ７．５２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ６．３０ （ｄｄ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３８ （ｄ， ２Ｈ）， ４．２８ － ４．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０３ － ３．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７６ （ｓ， ６Ｈ）， ２．０２ （ｈ， １Ｈ）， １．８６ （ｄｄｐ， ２Ｈ）， １．２５ （ｄ， ３Ｈ）， ０．９３ － ０．８４ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ７６４．４６ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0072】
［実施例２］ 細胞増殖
細胞生存率に対するＴＯＰ１ｉ薬の効果を、代謝的に活性な細胞についてのＡＴＰの存在をモニタリングすることにより評価した。結果が図１Ａ、１Ｂ及び表１に示される。Ｃａｌｕ－６細胞（肺腺癌）及びＡ３７５細胞（悪性黒色腫）の増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光を使用して定量化した。図１Ａ、１Ｂ及び表１において示されるように、式（Ｉ）の化合物（実施例１Ｇ）は、増殖するＣａｌｕ－６細胞（０．５７ｎＭ、図１Ａ）及びＡ３７５（０．５０ｎＭ、図１Ｂ）の生存率を低減させることについてナノモル濃度以下の効力を呈した。このナノモル濃度以下の効力は、同じアッセイにおいてＴＯＰ１ｉ薬ＳＮ－３８の効力を上回って改善され、アッセイはＥＣ５０ ６．５８ｎＭ（Ｃａｌｕ－６）及び２．３０ｎＭ（Ａ３７５）を示した。
細胞生存率に対するＴＯＰ１ｉ薬の効果を、代謝的に活性な細胞についてのＡＴＰの存在をモニタリングすることにより評価した。結果が図１Ａ、１Ｂ及び表１に示される。Ｃａｌｕ－６細胞（肺腺癌）及びＡ３７５細胞（悪性黒色腫）の増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光を使用して定量化した。図１Ａ、１Ｂ及び表１において示されるように、式（Ｉ）の化合物（実施例１Ｇ）は、増殖するＣａｌｕ－６細胞（０．５７ｎＭ、図１Ａ）及びＡ３７５（０．５０ｎＭ、図１Ｂ）の生存率を低減させることについてナノモル濃度以下の効力を呈した。このナノモル濃度以下の効力は、同じアッセイにおいてＴＯＰ１ｉ薬ＳＮ－３８の効力を上回って改善され、アッセイはＥＣ５０ ６．５８ｎＭ（Ｃａｌｕ－６）及び２．３０ｎＭ（Ａ３７５）を示した。
【0073】
【表1】
【0074】
【化21】
【0075】
［実施例３］ 抗体の調製及び精製
抗体Ａｂを、それぞれ配列番号９及び１０の重鎖及び軽鎖配列を有するＩｇＧ１抗体として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させた。結合前にＡｂを単離及び精製した。
抗体Ａｂを、それぞれ配列番号９及び１０の重鎖及び軽鎖配列を有するＩｇＧ１抗体として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させた。結合前にＡｂを単離及び精製した。
【0076】
［実施例４］ 結合の手順（ＡＤＣ－１）
以下に記載されるように、Ａｂをリンカー薬物（実施例１Ｊ）に結合させて、抗体薬物複合体ＡＤＣ－１を形成させた。
以下に記載されるように、Ａｂをリンカー薬物（実施例１Ｊ）に結合させて、抗体薬物複合体ＡＤＣ－１を形成させた。
【0077】
実施例３のＡｂ抗体を、過剰量の還元剤で全体的に還元し、次いで過剰量の薬物－リンカーと結合させた。このことが、６つの薬物分子を主に含有するＡＤＣ、すなわち６であるｎ及び６又は約６のＤＡＲを有する式（ＩＶ）のＡＤＣを含む最終薬物生成物をもたらす。ＡＤＣ－１のＤＡＲは、ＬＣ－ＭＳにより決定した。ＬＣ－ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ／ＭＳＤ ＴＯＦ ６２２０ ＥＳＩ質量分析計に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ機構を使用して実施した。ＡＤＣ－１を、５ｍＭ（最終濃度）Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ（登録商標）ＴＣＥＰ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で還元し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｔｒａｐ（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）脱塩カートリッジにローディングし、周囲温度で、０．２分で、１０％Ｂ～７５％Ｂの勾配で溶出させた。移動相Ａは０．１％ギ酸（ＦＡ）含有Ｈ２Ｏであり、移動相Ｂは０．１％ＦＡ含有アセトニトリルであり、流速は０．２ｍＬ／分であった。共溶出する軽鎖及び重鎖のエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量スペクトルを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒＴＭ取得ソフトウェアを使用して取得した。抽出された強度対ｍ／ｚスペクトルを、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアの最大エントロピー機能を使用してデコンボリューションして、還元された各抗体断片の質量を決定した。結合した薬物の数に強度を掛けることにより正規化された、軽鎖及び重鎖についての、そのままの及び修正されたピークの強度を合計することにより、デコンボリューションされたスペクトルからＤＡＲを算出した。合計され、正規化された強度を強度の合計で割り、２つの軽鎖及び２つの重鎖についての合計結果から、完全ＡＤＣ－１についての最終平均ＤＡＲ値を算出した。
【0078】
４℃のＡｂ抗体の溶液を、ＰＢＳＥ（リン酸カリウム二塩基性／塩化ナトリウム／エチレンジアミン四酢酸緩衝液）（１２５ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、６．３ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）で処理して、最終濃度０．１ｍＭを達成した。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、１０ｍＭ、１０モル当量、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を、穏やかに撹拌プレート混合（２２５ｒｐｍ）しながら５分間、Ａｂ抗体溶液（０．５Ｘ ＰＢＳＥ中およそ１０～２０ｍｇ／ｍＬ）に添加した。４℃での２０時間のインキュベーション後、溶液を２２℃にした。
【0079】
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ０．５７ｍ２カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、還元Ａｂ抗体を、ＰＢＳＥ緩衝液に緩衝液交換するため、ＵＦＤＦ（限外濾過／透析濾過）を行った。Ａｂ抗体が濃度４０ｍｇ／ｍＬに達するまで、限外濾過（ＵＦ）を実施した。透析濾過（ＤＦ）は１０透析濾過体積（ＤＶ）のＰＢＳＥで実施した。
【0080】
６．６モル当量の、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド中リンカー薬物（実施例１Ｊ）の１０ｍＭ溶液を、穏やかに撹拌プレート混合しながら、２３℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、無菌の精製水で調製された、８．０当量の１００ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶液に添加し、穏やかに混合し、その後２３℃で２時間インキュベートした。
【0081】
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ０．５７ｍ２カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、生じた抗体薬物複合体（ＡＤＣ－１）を、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）及び１５ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ６の混合物に、その後１５ｍＭヒスチジン緩衝液に緩衝液交換するため、ＵＦＤＦを行った。限外濾過及び透析濾過を実施した。ＡＤＣ－１溶液を収集し、次いで緩衝液でさらに希釈した。最終ＡＤＣ－１溶液を０．２２μｍフィルターで無菌濾過し、－８０℃で保存した。
【0082】
［実施例５Ａ］ 対照ＡＤＣ（ＡＤＣ－２）
本明細書において使用される場合、ＡＤＣ－２は、ＬＤ１（式（ＩＩＩ）、実施例１Ｊ）に結合した抗体、Ａｂ２を有するＡＤＣである。Ａｂ２は、ＣＭＶ糖タンパク質Ｈに結合するモノクローナル抗体であるＭＳＬ１０９である。ＭＳＬ１０９は、非標的指向性対照抗体／陰性対照抗体として使用される。
本明細書において使用される場合、ＡＤＣ－２は、ＬＤ１（式（ＩＩＩ）、実施例１Ｊ）に結合した抗体、Ａｂ２を有するＡＤＣである。Ａｂ２は、ＣＭＶ糖タンパク質Ｈに結合するモノクローナル抗体であるＭＳＬ１０９である。ＭＳＬ１０９は、非標的指向性対照抗体／陰性対照抗体として使用される。
【0083】
［実施例５Ｂ］ 結合の手順（ＡＤＣ－２）
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩水溶液（ＥＤＴＡ、０．５Ｍ、９７４μＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、Ａｂ２の精製溶液（２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４中１２．３ｍｇ／ｍＬ）２４３．３ｍＬに添加した。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、５００ｍＭ、６．０モル当量、２４２．４μＬ、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を、２ｍＭ ＥＤＴＡ含有Ａｂ２溶液に添加し、穏やかに撹拌し、４℃で２０時間維持した。４℃（１．０Ｍ、ｐＨ８．０）のトリス緩衝液を、溶液（２４．５ｍＬ、１０％ ｖ／ｖ）に添加した。リンカー－薬物ＬＤ１（実施例１Ｊ、（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド）を、ｐＨ８．０の還元抗体（１０当量、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、９０％純度中ＬＤ１、実施例１Ｊの１０ｍＭ溶液２２．５ｍＬ）に添加した。結合を穏やかに撹拌し、周囲温度のウォーターバス中で１．５時間静置させた。結合を、４当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインの水溶液（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１Ｘ ＤＰＢＳ、０．８ｍＬ中１００ｍＭ溶液）の添加によりクエンチした。混合物を穏やかに撹拌し、周囲温度で１時間静置させた。トリス緩衝液（１５％、Ｓｉｇｍａ、１．０Ｍ、ｐＨ７．４、４４ｍＬ）を添加して、生じたＡＤＣ－２溶液をｐＨ７．５に調節した。ＡＤＣ－２溶液を４℃で一晩保存した。ＡＤＣ－２溶液を濃縮し、限外濾過／透析濾過（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ０．２２ｍ２カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））により緩衝液交換した。最終ＡＤＣ－２溶液を、０．２２μｍフィルターで濾過し、生じたＡＤＣ－２試料を４℃で保存した。ＡＤＣ－２の最終体積は１３８ｍＬであった。
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩水溶液（ＥＤＴＡ、０．５Ｍ、９７４μＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、Ａｂ２の精製溶液（２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４中１２．３ｍｇ／ｍＬ）２４３．３ｍＬに添加した。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、５００ｍＭ、６．０モル当量、２４２．４μＬ、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を、２ｍＭ ＥＤＴＡ含有Ａｂ２溶液に添加し、穏やかに撹拌し、４℃で２０時間維持した。４℃（１．０Ｍ、ｐＨ８．０）のトリス緩衝液を、溶液（２４．５ｍＬ、１０％ ｖ／ｖ）に添加した。リンカー－薬物ＬＤ１（実施例１Ｊ、（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド）を、ｐＨ８．０の還元抗体（１０当量、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、９０％純度中ＬＤ１、実施例１Ｊの１０ｍＭ溶液２２．５ｍＬ）に添加した。結合を穏やかに撹拌し、周囲温度のウォーターバス中で１．５時間静置させた。結合を、４当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインの水溶液（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１Ｘ ＤＰＢＳ、０．８ｍＬ中１００ｍＭ溶液）の添加によりクエンチした。混合物を穏やかに撹拌し、周囲温度で１時間静置させた。トリス緩衝液（１５％、Ｓｉｇｍａ、１．０Ｍ、ｐＨ７．４、４４ｍＬ）を添加して、生じたＡＤＣ－２溶液をｐＨ７．５に調節した。ＡＤＣ－２溶液を４℃で一晩保存した。ＡＤＣ－２溶液を濃縮し、限外濾過／透析濾過（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ０．２２ｍ２カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））により緩衝液交換した。最終ＡＤＣ－２溶液を、０．２２μｍフィルターで濾過し、生じたＡＤＣ－２試料を４℃で保存した。ＡＤＣ－２の最終体積は１３８ｍＬであった。
【0084】
［実施例６］ インビトロでのＳＥＺ６発現及び細胞生存率アッセイ
ＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ－Ｈ５２６（「Ｈ５２６」）、ＮＣＩ－Ｈ５２４（「Ｈ５２４」）、ＮＣＩ－Ｈ１４６（「Ｈ１４６」）、ＮＣＩ－Ｈ１９６３（「Ｈ１９６３」）及びＳＷ－１２７１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。ＣＯＲ－Ｌ９５細胞を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（＃９６０２０７３３）から得た。ＳＢＣ－５細胞を、医薬基盤研細胞バンク（ＪＣＲＢ）から得た。
ＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ－Ｈ５２６（「Ｈ５２６」）、ＮＣＩ－Ｈ５２４（「Ｈ５２４」）、ＮＣＩ－Ｈ１４６（「Ｈ１４６」）、ＮＣＩ－Ｈ１９６３（「Ｈ１９６３」）及びＳＷ－１２７１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。ＣＯＲ－Ｌ９５細胞を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（＃９６０２０７３３）から得た。ＳＢＣ－５細胞を、医薬基盤研細胞バンク（ＪＣＲＢ）から得た。
【0085】
ＳＣＬＣ細胞株（表２、１列目に示される）を、白色３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３７６５）に、１，０００～２，０００細胞／３０μＬ １０％熱不活化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＲＰＭＩ－１６４０基本培地で播種した。細胞プレートを、３７℃で一晩、５％ＣＯ２中でインキュベートした。Ｔｅｃａｎ Ｄ３００ｅデジタルディスペンサーを使用して、ＡＤＣのストック濃度又は実施例１Ｇ及びＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含有する溶液を使用する用量応答を、０日目に細胞に行い、３７℃でさらに１０日間（ＡＤＣ）又は３日間（実施例１Ｇ）、５％ＣＯ２中でインキュベートした。試料は二連で試験した。プレートを読み取り前に３０分間振とうしたことを除き、製造業者の説明書に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７５７０）を用いて細胞生存率を評価した。発光をＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２で読み取り、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
【0086】
結果：
図２Ａ～２Ｇ及び表２において示されるように、ＳＥＺ６を標的とするＡＤＣ－１は有力な活性を有し、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陽性であった５つのＳＣＬＣ細胞株（ＮＣＩ－Ｈ５２４、ＮＣＩ－Ｈ５２６、ＣＯＲ－Ｌ９６、ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ１９６３ＦＰ５）に対し、ｎＭ以下～低ｎＭの増殖阻害ＩＣ５０を示した。対照的に、ＡＤＣ－１は、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陰性であった２つのＳＣＬＣ細胞株（ＳＷ－１２７１及びＳＢＣ－５）において活性でなかった。さらに、非標的指向性ＡＤＣ－２は全ての細胞株において不活性であり、ＡＤＣ－１のＳＥＺ６依存性細胞殺傷特異性を裏付けた。全ての細胞株は、ｎＭ以下～低ｎＭのＩＣ５０により示されるように、実施例１Ｇに対し感受性であった。これらのデータは、ＳＥＺ６を発現するＳＣＬＣ細胞株における、ＡＤＣ－１のＳＥＺ６特異的活性を示す。
図２Ａ～２Ｇ及び表２において示されるように、ＳＥＺ６を標的とするＡＤＣ－１は有力な活性を有し、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陽性であった５つのＳＣＬＣ細胞株（ＮＣＩ－Ｈ５２４、ＮＣＩ－Ｈ５２６、ＣＯＲ－Ｌ９６、ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ１９６３ＦＰ５）に対し、ｎＭ以下～低ｎＭの増殖阻害ＩＣ５０を示した。対照的に、ＡＤＣ－１は、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡについて陰性であった２つのＳＣＬＣ細胞株（ＳＷ－１２７１及びＳＢＣ－５）において活性でなかった。さらに、非標的指向性ＡＤＣ－２は全ての細胞株において不活性であり、ＡＤＣ－１のＳＥＺ６依存性細胞殺傷特異性を裏付けた。全ての細胞株は、ｎＭ以下～低ｎＭのＩＣ５０により示されるように、実施例１Ｇに対し感受性であった。これらのデータは、ＳＥＺ６を発現するＳＣＬＣ細胞株における、ＡＤＣ－１のＳＥＺ６特異的活性を示す。
【0087】
【表2】
【0088】
［実施例７］ ＡＤＣ－１は、インビボでのがん異種移植片の増殖を阻害する
図３Ａ及び３Ｂ：マウスＣＤＸモデル
成体メスＳＣＩＤ－ｂｇ（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウス）又はＳＣＩＤ ＣＢ．１７（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウス）マウス（およそ２２ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から得た。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣ）により承認された施設内で、定常的な空気循環を備える固形底プレキシガラスケージに、マウスを１０匹の群で収容した。動物を、１２時間明：暗周期の明期に試験した。
図３Ａ及び３Ｂ：マウスＣＤＸモデル
成体メスＳＣＩＤ－ｂｇ（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウス）又はＳＣＩＤ ＣＢ．１７（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウス）マウス（およそ２２ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から得た。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣ）により承認された施設内で、定常的な空気循環を備える固形底プレキシガラスケージに、マウスを１０匹の群で収容した。動物を、１２時間明：暗周期の明期に試験した。
【0089】
ＮＣＩ－Ｈ６９（「Ｈ６９」）、ＮＣＩ－Ｈ１９６３（「Ｈ１９６３」）及びＮＣＩ－Ｈ５２６（「Ｈ５２６」）細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。細胞を１０％ ＲＰＭＩ－１６４０培地で維持した。細胞培養培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を添加した。
【0090】
５００万個の細胞を、０日目にマウスの右側腹部に皮下接種した。注射体積は、培養培地及びマトリゲル（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）の１：１混合物から構成される０．１ｍＬであった。腫瘍をおよそ２００ｍｍ３にサイズ適合させた。療法を、腫瘍をサイズ適合させてから２４時間後に開始した。４つの処理群が存在した：（１）媒体、（２）ＡＤＣ－１、（３）ＡＤＣ－２及び（４）トポテカン（ＡＤＣ－１、ＡＤＣ－２及びトポテカンは媒体中で製剤化した）。各々を１日１回投与した。腫瘍体積を週に２～３回算出した。腫瘍の長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）の測定を電子キャリパーにより行い、体積を次の式：Ｖ＝ＬｘＷ２／２に従って算出した。
【0091】
図３Ｃ～３Ｄ：マウスＰＤＸモデル
ＳＣＬＣ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルを、以前に記載されたようにステージＩＶ腫瘍から樹立し（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ら ２０１５ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；ＰＭＩＤ：２５９５５０２７）、マウスにおいて継代して、有効性研究のため、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの右下乳腺脂肪体の皮下に単一細胞懸濁液を注射するのに十分な細胞数を発生させた。腫瘍細胞を注射すると、長さ及び幅を測定するためキャリパーを使用して腫瘍体積を収集し、楕円の式（体積＝長さｘ幅ｘ幅ｘ０．５、幅が長さよりも短い場合；単位：ｍｍ３）を使用して腫瘍体積を算出した。腫瘍が９０～３００ｍｍ３の範囲に達した後、マウスを、１群あたりマウス５～１０匹の処理群にランダム化し、各群はおよそ同じ平均腫瘍体積を有していた。マウスのランダム化された処理群は、以下のものを投与された：単回腹腔内（ｉｐ）用量としての媒体；トポテカン標準治療（Ｈｏｓｐｉｒａ；０．５ｍｇ／ｋｇ １日１回で、５合計用量がｉｐ投与された；０．９％生理食塩水で製剤化）；又はＡＤＣ（ＡＤＣ－１又はＡＤＣ－２；媒体中で製剤化）、各々が単回ｉｐ用量として投与された。腫瘍体積を経時的にモニタリングすることにより有効性を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでデータをプロットした。
ＳＣＬＣ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルを、以前に記載されたようにステージＩＶ腫瘍から樹立し（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ら ２０１５ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；ＰＭＩＤ：２５９５５０２７）、マウスにおいて継代して、有効性研究のため、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの右下乳腺脂肪体の皮下に単一細胞懸濁液を注射するのに十分な細胞数を発生させた。腫瘍細胞を注射すると、長さ及び幅を測定するためキャリパーを使用して腫瘍体積を収集し、楕円の式（体積＝長さｘ幅ｘ幅ｘ０．５、幅が長さよりも短い場合；単位：ｍｍ３）を使用して腫瘍体積を算出した。腫瘍が９０～３００ｍｍ３の範囲に達した後、マウスを、１群あたりマウス５～１０匹の処理群にランダム化し、各群はおよそ同じ平均腫瘍体積を有していた。マウスのランダム化された処理群は、以下のものを投与された：単回腹腔内（ｉｐ）用量としての媒体；トポテカン標準治療（Ｈｏｓｐｉｒａ；０．５ｍｇ／ｋｇ １日１回で、５合計用量がｉｐ投与された；０．９％生理食塩水で製剤化）；又はＡＤＣ（ＡＤＣ－１又はＡＤＣ－２；媒体中で製剤化）、各々が単回ｉｐ用量として投与された。腫瘍体積を経時的にモニタリングすることにより有効性を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでデータをプロットした。
【0092】
治療応答の大きさ（ＴＧＩｍａｘ）及び永続性（ＴＧＤ）のパラメーターを、薬物の有効性を表すのに使用した。ＴＧＩｍａｘは、実験中の最大腫瘍増殖阻害である。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は１００＊（１－Ｔｖ／Ｃｖ）により算出し、式中、Ｔｖ及びＣｖは、それぞれ処理及び対照群の平均腫瘍体積である。ＴＧＤ又は腫瘍増殖遅延は、対照群と比較して延長された、体積１ｃｍ３に達するのに必要な、処理腫瘍についての時間であった。ＴＧＤは１００＊（Ｔｔ／Ｃｔ－１）により算出し、Ｔｔ及びＣｔは、それぞれ処理及び対照群の、１ｃｍ３に達するまでの期間の中央値である。
【0093】
結果：
Ｈ１９６３担腫瘍マウスにおいて単一薬剤として投与されると、ＡＤＣ－１は、（ＴＧＩｍａｘ＝９４％、ｐ＝０．００２）で腫瘍増殖を有意に阻害し、ＴＧＤ４７２％超の長続きする応答を引き起こした。Ｈ５２６細胞株では、ＡＤＣ－１阻害剤は、（ＴＧＩｍａｘ＝９７．４％、ｐ０．００１以下）で腫瘍増殖を有意に阻害し、ＴＧＤ３３６．７％の長続きする応答を引き起こした（図３Ａ及び図３Ｂ）。
Ｈ１９６３担腫瘍マウスにおいて単一薬剤として投与されると、ＡＤＣ－１は、（ＴＧＩｍａｘ＝９４％、ｐ＝０．００２）で腫瘍増殖を有意に阻害し、ＴＧＤ４７２％超の長続きする応答を引き起こした。Ｈ５２６細胞株では、ＡＤＣ－１阻害剤は、（ＴＧＩｍａｘ＝９７．４％、ｐ０．００１以下）で腫瘍増殖を有意に阻害し、ＴＧＤ３３６．７％の長続きする応答を引き起こした（図３Ａ及び図３Ｂ）。
【0094】
ＡＤＣ－１処理は、（１）細胞株異種移植片（ＣＤＸ；Ｈ１９６３）及び（２）患者由来異種移植片（ＰＤＸ；ＬＵ９５及びＬＵ１４９）モデルにおいて、長続きする応答（検出可能な疾患なし）を発生させた。強い有効性（３０日超の間、測定可能な疾患なし）が、増殖が速い高悪性度のＨ５２６ＣＤＸモデルにおいて観察され、媒体処理された腫瘍は１７日間で２０００ｍｍ３超に増殖した。非標的指向性ＡＤＣ－２ではほとんど応答がなかった（中程度の腫瘍増殖遅延～腫瘍増殖遅延なし）ことから、有効性応答はＳＥＺ６標的特異的であった。ＡＤＣ－１は、ヒト臨床曝露を概算するための用量及びレジメンで１サイクルとして投与された、ＳＣＬＣについての第二選択標準治療であるトポテカンよりも有効であった（図３Ａ～Ｄ）。
【0095】
【表3】
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【配列表】
【外国語明細書】