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特開2024-3202エイコサペンタエン酸を生産する微生物及びエイコサペンタエン酸の製造法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024003202
(43)【公開日】2024-01-11
(54)【発明の名称】エイコサペンタエン酸を生産する微生物及びエイコサペンタエン酸の製造法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20231228BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231228BHJP
C12P 7/6432 20220101ALI20231228BHJP
C12N 1/19 20060101ALN20231228BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20231228BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20231228BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21
C12N1/15 ZNA
C12P7/6432
C12N1/19
C12N5/10
C12N15/31
【審査請求】有
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023194578
(22)【出願日】2023-11-15
(62)【分割の表示】P 2020535922の分割
【原出願日】2019-08-09
(31)【優先権主張番号】P 2018151234
(32)【優先日】2018-08-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】308032666
【氏名又は名称】協和発酵バイオ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002000
【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所
(72)【発明者】
【氏名】大利 徹
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 康治
(72)【発明者】
【氏名】林 祥平
(72)【発明者】
【氏名】中 真以
(72)【発明者】
【氏名】氏原 哲朗
(57)【要約】
【課題】本発明は、効率的にＥＰＡを生産する微生物及び該微生物を用いたＥＰＡの製造法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという。）を生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、下記（１）及び（２）の置換がされたアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、変異型ＯｒｆＢという。）を含み、且つエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという。）を生産し得る微生物等に関する。（１）２３０番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する置換（但し、他のアミノ酸残基がフェニルアラニン又はトリプトファンである場合を除く）
（２）６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１を他のアミノ酸残基に置換する置換
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという。）を生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、下記（１）及び（２）の置換がされたアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、変異型ＯｒｆＢという。）を含み、且つエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという。）を生産し得る微生物等に関する。（１）２３０番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する置換（但し、他のアミノ酸残基がフェニルアラニン又はトリプトファンである場合を除く）
（２）６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１を他のアミノ酸残基に置換する置換
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという。）を生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、下記（１）及び（２）の置換がされたアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、変異型ＯｒｆＢという。）を含み、且つエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという。）を生産し得る微生物。
（１）２３０番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する置換（但し、他のアミノ酸残基がフェニルアラニン又はトリプトファンである場合を除く）
（２）６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１を他のアミノ酸残基に置換する置換
（１）２３０番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する置換（但し、他のアミノ酸残基がフェニルアラニン又はトリプトファンである場合を除く）
（２）６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１を他のアミノ酸残基に置換する置換
【請求項2】
ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ蛋白質（以下、ＯｒｆＢホモログという。）のアミノ酸配列において、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、下記（３）及び（４）の置換がされたアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、変異型ＯｒｆＢホモログという。）を含み、且つＥＰＡを生産し得る微生物。
（３）配列番号２の２３０番目に対応するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する置換（但し、他のアミノ酸残基がフェニルアラニン又はトリプトファンである場合を除く）
（４）配列番号２の６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目に対応するアミノ酸残基の少なくとも１を他のアミノ酸残基に置換する置換
（３）配列番号２の２３０番目に対応するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する置換（但し、他のアミノ酸残基がフェニルアラニン又はトリプトファンである場合を除く）
（４）配列番号２の６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目に対応するアミノ酸残基の少なくとも１を他のアミノ酸残基に置換する置換
【請求項3】
前記（１）の置換が、２３０番目のアミノ酸残基をロイシンに置換する置換である、請求項１に記載の微生物。
【請求項4】
前記（３）の置換が、配列番号２の２３０番目に対応するアミノ酸残基をロイシンに置換する置換である、請求項２に記載の微生物。
【請求項5】
ＤＨＡを生産する能力を有する微生物が、ラビリンチュラ類微生物である請求項１～４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項6】
ラビリンチュラ類微生物が、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属するラビリンチュラ類微生物である請求項５に記載の微生物。
【請求項7】
ＤＨＡを生産する能力を有する微生物が、ＤＨＡ代謝経路を有さない微生物にＤＨＡを合成する活性を有する下記（ａ）～（ｊ）の各ドメインをコードする遺伝子が導入された微生物である請求項１～４のいずれか１項に記載の微生物。
（ａ）β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ（以下、ＫＳという。）ドメイン
（ｂ）マロニル－ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（以下、ＭＡＴという。）ドメイン
（ｃ）ＡＣＰドメイン
（ｄ）ケトレダクターゼ（以下、ＫＲという。）ドメイン
（ｅ）ポリケチドシンターゼデヒドラターゼ（以下、ＰＳ－ＤＨという。）ドメイン
（ｆ）鎖伸長因子（以下、ＣＬＦという。）ドメイン
（ｇ）アシルトランスフェラーゼ（以下、ＡＴという。）ドメイン
（ｈ）ＦａｂＡ様β－ヒドロキシアシル－ＡＣＰデヒドラターゼ（以下、ＦａｂＡ－ＤＨという。）ドメイン
（ｉ）エノイルＡＣＰ－レダクターゼ（以下、ＥＲという。）ドメイン
（ｊ）ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（以下、ＰＰＴという。）ドメイン
（ａ）β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ（以下、ＫＳという。）ドメイン
（ｂ）マロニル－ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（以下、ＭＡＴという。）ドメイン
（ｃ）ＡＣＰドメイン
（ｄ）ケトレダクターゼ（以下、ＫＲという。）ドメイン
（ｅ）ポリケチドシンターゼデヒドラターゼ（以下、ＰＳ－ＤＨという。）ドメイン
（ｆ）鎖伸長因子（以下、ＣＬＦという。）ドメイン
（ｇ）アシルトランスフェラーゼ（以下、ＡＴという。）ドメイン
（ｈ）ＦａｂＡ様β－ヒドロキシアシル－ＡＣＰデヒドラターゼ（以下、ＦａｂＡ－ＤＨという。）ドメイン
（ｉ）エノイルＡＣＰ－レダクターゼ（以下、ＥＲという。）ドメイン
（ｊ）ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（以下、ＰＰＴという。）ドメイン
【請求項8】
ＤＨＡ代謝経路を有さない微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物である請求項７に記載の微生物。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＥＰＡ、又はＥＰＡ含有組成物を採取する、ＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物の製造法。
【請求項10】
下記（Ｉ）又は（ＩＩ）のＥＰＡを生産し得る微生物を用いるＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物の製造法。
（Ｉ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、下記（１）及び（２）の置換がされたアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢを含み、且つＥＰＡを生産し得る微生物
（ＩＩ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列において、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、下記（３）及び（４）の置換がされたアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢホモログを含み、且つＥＰＡを生産し得る微生物
（１）２３０番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する置換（但し、他のアミノ酸残基がフェニルアラニン又はトリプトファンである場合を除く）
（２）６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１を他のアミノ酸残基に置換する置換
（３）配列番号２の２３０番目に対応するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する置換（但し、他のアミノ酸残基がフェニルアラニン又はトリプトファンである場合を除く）
（４）配列番号２の６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目に対応するアミノ酸残基の少なくとも１を他のアミノ酸残基に置換する置換
（Ｉ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、下記（１）及び（２）の置換がされたアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢを含み、且つＥＰＡを生産し得る微生物
（ＩＩ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列において、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、下記（３）及び（４）の置換がされたアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢホモログを含み、且つＥＰＡを生産し得る微生物
（１）２３０番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する置換（但し、他のアミノ酸残基がフェニルアラニン又はトリプトファンである場合を除く）
（２）６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１を他のアミノ酸残基に置換する置換
（３）配列番号２の２３０番目に対応するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する置換（但し、他のアミノ酸残基がフェニルアラニン又はトリプトファンである場合を除く）
（４）配列番号２の６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目に対応するアミノ酸残基の少なくとも１を他のアミノ酸残基に置換する置換
【請求項11】
前記（１）の置換が、２３０番目のアミノ酸残基をロイシンに置換する置換であり、
前記（３）の置換が、配列番号２の２３０番目に対応するアミノ酸残基をロイシンに置換する置換である、
請求項１０に記載のＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物の製造法。
前記（３）の置換が、配列番号２の２３０番目に対応するアミノ酸残基をロイシンに置換する置換である、
請求項１０に記載のＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エイコサペンタエン酸を生産する微生物及び該微生物を用いてエイコサペンタエン酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという。）、エイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという。）、アラキドン酸（以下、ＡＲＡという。）、ドコサペンタエン酸（以下、ＤＰＡという。）等、分子内に不飽和結合を複数有する長鎖脂肪酸のことを多価不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡという。）という。ＰＵＦＡは、動脈硬化や高脂血症の予防等様々な生理機能を有することが知られている（非特許文献１及び非特許文献２）。
【0003】
ＰＵＦＡの生合成経路としては、好気経路と多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼ（以下、ＰＵＦＡ－ＰＫＳという。）による嫌気経路の二種類が知られている。好気経路は、脂肪酸合成酵素によって合成されたパルミチン酸等の長鎖脂肪酸に、複数の不飽和化酵素による二重結合の導入や鎖伸長酵素による炭素鎖の伸長がなされることによりＰＵＦＡが合成される経路で、多くの生物が有する古くから知られている合成経路である（非特許文献３）。
【0004】
一方、ＰＵＦＡ－ＰＫＳによる嫌気経路は、アセチル－ＣｏＡやマロニル－ＣｏＡからＰＵＦＡを合成する経路で、一部の海洋性細菌やラビリンチュラ類真核生物が有することが知られている（非特許文献４及び非特許文献５）。
【0005】
ＰＵＦＡ－ＰＫＳは、複数の蛋白質から構成される複合酵素（以下、蛋白質複合体ともいう。）であり、各蛋白質にはＰＵＦＡの合成に関わる複数の機能ドメインが存在している。
【0006】
ＰＵＦＡ－ＰＫＳに存在する機能ドメインとしては、マロニル－ＡＣＰとアシル－ＡＣＰの縮合に関わるとされているβ－ケトアシル－アシルキャリアー蛋白質シンターゼドメイン（以下、ＫＳドメインという。）、ホスホパンテテイニル基を介してチオエステル結合によりアシル基と結合し、脂肪酸合成の場として機能するとされているアシルキャリアー蛋白質ドメイン（以下、ＡＣＰドメインという。）、縮合により生成するカルボニル基を還元するとされているケトレダクターゼドメイン（以下、ＫＲドメインという。）、ＫＲドメインにより生成した水酸基を脱水して二重結合を形成するとされているＤＨドメイン、炭素鎖の伸長に関わるとされている鎖伸長因子ドメイン（以下、ＣＬＦドメインという。）、得られた二重結合を還元するとされているエノイルレダクターゼドメイン（以下、ＥＲドメインという。）、アシル基の転移に関わるとされているアシルトランスフェラーゼドメイン（以下、ＡＴドメインという。）及びマロニル－ＣｏＡ：アシルトランスフェラーゼドメイン（以下、ＭＡＴドメインという。）、並びにＡＣＰドメインを活性化するとされているホスホパンテテイントランスフェラーゼドメイン（以下、ＰＰＴドメインという。）があり、これら複数のドメインが協働して働くことで脂肪酸の炭素鎖が伸長すると考えられている。
【0007】
ＰＵＦＡ－ＰＫＳは、その種類によって生産するＰＵＦＡの種類が異なることが知られている。例えば、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．及びＭｏｒｉｔｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳではＤＨＡが、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ及びＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳではＥＰＡが、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ ｍａｒｉｎａ由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳではＡＲＡが主要な産物として生産され、他のＰＵＦＡはほとんど生産されないか、生産されるとしても主生産物に比べると少量である。
【0008】
このように、ＰＵＦＡ－ＰＫＳは高い生産物特異性を有しており、これまでにＰＵＦＡ－ＰＫＳの機能解析を目的とした多くの研究がなされている。非特許文献４及び６では、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌やストラメノパイル類真核生物からＰＵＦＡ－ＰＫＳ遺伝子をクローニングして異種生物中で発現させ、ＰＵＦＡを生産させる検討がなされている。
【0009】
非特許文献７では、ＤＨＡを生産するＭｏｒｉｔｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳの構成遺伝子であるｐｆａＢ遺伝子と、ＥＰＡを生産するＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍａｔｏｐｈｏｒｉ由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成するｐｆａＢ遺伝子とを用いた研究により、ＡＴドメインをコードするｐｆａＢ遺伝子が生産されるＰＵＦＡの種類に関与することが開示されている。
【0010】
非特許文献８では、大腸菌にＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳのＤＨドメインを導入すると、脂肪酸の生産量が増加し、かつ不飽和脂肪酸の割合が増加することが開示されている。
【0011】
ＥＰＡの工業的な生産方法としては、魚油から精製するなどの方法が知られているが、副生物が多いという課題がある（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【特許文献1】国際公開第２００８／１４４４７３号
【特許文献2】日本国特開２０１３－０５５８９３号公報
【非特許文献】
【0013】
【非特許文献1】Ａｎｎｕ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂｏｌ．，１９９１，３５，１２８－１３１
【非特許文献2】Ｊ．Ａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，１９９４，１３，６５８－６６４
【非特許文献3】Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８３，５２，５３７－５７９
【非特許文献4】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９３，２９０－２９３
【非特許文献5】ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１１，６，ｅ２０１４６
【非特許文献6】Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００９，４７，４７２－４７８
【非特許文献7】ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００９，２９５，１７０－１７６
【非特許文献8】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１８，８４７－８５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
上述したように、ＥＰＡの工業的な生産方法としては、魚油から精製する方法等が用いられているが、副生物が多く、生産効率が悪いという課題があるため、効率的なＥＰＡの生産方法が求められている。
【0015】
したがって、本発明は、効率的にＥＰＡを生産する微生物及び該微生物を用いたＥＰＡの製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明者らは、ＤＨＡを生産する能力を有する微生物において、特定のアミノ酸残基に変異を導入したＯｒｆＢを発現させることにより、ＥＰＡを高濃度で含有するＰＵＦＡを生産できることを見出し、本発明を完成させた。
【0017】
本発明は、以下に関する。
１．ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、変異型ＯｒｆＢという。）を含み、且つエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという。）を生産し得る微生物。
２．ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ蛋白質（以下、ＯｒｆＢホモログという。）のアミノ酸配列において、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、配列番号２の６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１に対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、変異型ＯｒｆＢホモログという。）を含み、且つＥＰＡを生産し得る微生物。
３．ＤＨＡを生産する能力を有する微生物が、ラビリンチュラ類微生物である前記１または２に記載の微生物。
４．ラビリンチュラ類微生物が、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属するラビリンチュラ類微生物である前記３に記載の微生物。
５．ＤＨＡを生産する能力を有する微生物が、ＤＨＡ代謝経路を有さない微生物にＤＨＡを合成する活性を有する下記（ａ）～（ｊ）の各ドメインをコードする遺伝子が導入された微生物である前記１または２に記載の微生物。
（ａ）ＫＳドメイン
（ｂ）ＭＡＴドメイン
（ｃ）ＡＣＰドメイン
（ｄ）ＫＲドメイン
（ｅ）ポリケチドシンターゼデヒドラターゼ（以下、ＰＳ－ＤＨという。）ドメイン
（ｆ）ＣＬＦドメイン
（ｇ）ＡＴドメイン
（ｈ）ＦａｂＡ様β－ヒドロキシアシル－ＡＣＰデヒドラターゼ（以下、ＦａｂＡ－ＤＨという。）ドメイン
（ｉ）ＥＲドメイン
（ｊ）ＰＰＴドメイン
６．ＤＨＡ代謝経路を有さない微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物である前記５に記載の微生物。
７．前記１～６のいずれか１に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＥＰＡ、又はＥＰＡ含有組成物を採取する、ＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物の製造法。
８．下記（Ｉ）又は（ＩＩ）のＥＰＡを生産し得る微生物を用いるＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物の製造法。
（Ｉ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢを含み、且つＥＰＡを生産し得る微生物
（ＩＩ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列において、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、配列番号２の６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢホモログを含み、且つＥＰＡを生産し得る微生物
１．ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、変異型ＯｒｆＢという。）を含み、且つエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという。）を生産し得る微生物。
２．ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ蛋白質（以下、ＯｒｆＢホモログという。）のアミノ酸配列において、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、配列番号２の６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１に対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、変異型ＯｒｆＢホモログという。）を含み、且つＥＰＡを生産し得る微生物。
３．ＤＨＡを生産する能力を有する微生物が、ラビリンチュラ類微生物である前記１または２に記載の微生物。
４．ラビリンチュラ類微生物が、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属するラビリンチュラ類微生物である前記３に記載の微生物。
５．ＤＨＡを生産する能力を有する微生物が、ＤＨＡ代謝経路を有さない微生物にＤＨＡを合成する活性を有する下記（ａ）～（ｊ）の各ドメインをコードする遺伝子が導入された微生物である前記１または２に記載の微生物。
（ａ）ＫＳドメイン
（ｂ）ＭＡＴドメイン
（ｃ）ＡＣＰドメイン
（ｄ）ＫＲドメイン
（ｅ）ポリケチドシンターゼデヒドラターゼ（以下、ＰＳ－ＤＨという。）ドメイン
（ｆ）ＣＬＦドメイン
（ｇ）ＡＴドメイン
（ｈ）ＦａｂＡ様β－ヒドロキシアシル－ＡＣＰデヒドラターゼ（以下、ＦａｂＡ－ＤＨという。）ドメイン
（ｉ）ＥＲドメイン
（ｊ）ＰＰＴドメイン
６．ＤＨＡ代謝経路を有さない微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物である前記５に記載の微生物。
７．前記１～６のいずれか１に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＥＰＡ、又はＥＰＡ含有組成物を採取する、ＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物の製造法。
８．下記（Ｉ）又は（ＩＩ）のＥＰＡを生産し得る微生物を用いるＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物の製造法。
（Ｉ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢを含み、且つＥＰＡを生産し得る微生物
（ＩＩ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物であって、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列において、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、配列番号２の６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢホモログを含み、且つＥＰＡを生産し得る微生物
【発明の効果】
【0018】
本発明の微生物は、ＤＨＡを生産する能力を有する微生物において、特定のアミノ酸残基に変異を導入し、基質に対する特異性を変化させた変異型ＯｒｆＢを発現させることにより、ＥＰＡを効率的に生産できる。本発明のＥＰＡの製造法は、工業的レベルでＤＨＡを生産可能な微生物において変異型ＯｒｆＢを発現させることにより、低コスト且つ高効率でＥＰＡを生産することができ、ＥＰＡの工業的レベルでの生産に適用し得る。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明において、「多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）」とは、炭素鎖長が１８以上で不飽和結合数が２以上の長鎖脂肪酸をいう。また、本明細書において「ドメイン」とは、蛋白質中の連続するアミノ酸配列からなる一部分であって、当該蛋白質において、特定の生物学的活性又は機能を有する領域である。
【0021】
本発明において、「ＰＵＦＡ－ＰＫＳ」とはＰＵＦＡ ｓｙｎｔｈａｓｅと同義である。ＰＵＦＡ ｓｙｎｔｈａｓｅは、マロニル－ＣｏＡ等を炭素源として用いて特異的な長鎖の不飽和脂肪酸を合成する酵素群であり、ＫＳ、ＭＡＴ、ＡＣＰ、ＫＲ、ＰＳ－ＤＨ、ＣＬＦ、ＡＴ、ＦａｂＡ－ＤＨ、ＥＲ、ＰＰＴａｓｅの各ドメインを含有するものをいう（ＡＣＯＳ Ｌｉｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ：ＰＵＦＡ ｓｙｎｔｈａｓｅ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９３，２９０－２９３；ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１１，６，ｅ２０１４６等）。
【0022】
ＫＳドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、マロニルＡＣＰとアシルＡＣＰの縮合に関わるドメインをいう。
【0023】
ＭＡＴドメイン、ＡＴドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、アシル基の転移に関わるドメインのことをいう。
【0024】
ＡＣＰドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、ホスホパンテテイニル基を介してチオエステル結合によりアシル基と結合し、脂肪酸合成の場として機能する、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性に必須のドメインをいう。
【0025】
ＫＲドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、縮合により生成するケトン基の還元に関わるドメインをいう。
【0026】
ＤＨドメインである、ＰＳ－ＤＨドメイン及びＦａｂＡ－ＤＨドメインは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、ケトン基を還元することによって生じた水酸基の脱水に関わるドメインのことをいう。
【0027】
ＣＬＦドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、炭素鎖の伸長に関わるドメインのことをいう。
【0028】
ＥＲドメインとは、アシル転移酵素ドメイン、マロニル－ＣｏＡ：ＡＣＰアシル転移酵素ドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、アシル基の転移に関わるドメインのことをいう。
【0029】
ＰＰＴａｓｅとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する酵素であり、ＡＣＰドメインの活性化に関わる酵素のことをいう。
【0030】
本明細書において、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３）、又はＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９０，１８３，６３）を用いて決定できる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによってヌクレオチド配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
【0031】
本明細書において「外来の」とは内在性ではなく、異種由来のものをいい、形質転換前の宿主生物が、本発明により導入されるべき遺伝子を有していない場合、その遺伝子によりコードされる蛋白質が実質的に発現しない場合、及び異なる遺伝子により当該蛋白質のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に内因性蛋白質の活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子を宿主生物に導入することを意味するために用いられる。
【0032】
〔微生物〕
本発明の微生物は、ドコサヘキサンエン酸（ＤＨＡ）を生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質（変異型ＯｒｆＢ）を含み、且つエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を生産し得ることを特徴とする。
本発明の微生物は、ドコサヘキサンエン酸（ＤＨＡ）を生産する能力を有する微生物であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質（変異型ＯｒｆＢ）を含み、且つエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を生産し得ることを特徴とする。
【0033】
ＤＨＡを生産する能力を有する微生物とは、下記の（１）及び（２）が挙げられる。
（１）ＤＨＡ代謝能を有する微生物。
（２）ＤＨＡ代謝能を有さない微生物を宿主生物として、該宿主生物にＤＨＡを生合成する活性を有するＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成するドメインである、ＫＳドメイン、ＭＡＴドメイン、ＡＣＰドメイン、ＫＲドメイン、ＰＳ－ＤＨドメイン、ＣＬＦドメイン、ＡＴドメイン、ＦａｂＡ－ＤＨドメイン、ＥＲドメイン及びＰＰＴドメインをコードする遺伝子が導入されたことによりＤＨＡ生産能を有する微生物。
（１）ＤＨＡ代謝能を有する微生物。
（２）ＤＨＡ代謝能を有さない微生物を宿主生物として、該宿主生物にＤＨＡを生合成する活性を有するＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成するドメインである、ＫＳドメイン、ＭＡＴドメイン、ＡＣＰドメイン、ＫＲドメイン、ＰＳ－ＤＨドメイン、ＣＬＦドメイン、ＡＴドメイン、ＦａｂＡ－ＤＨドメイン、ＥＲドメイン及びＰＰＴドメインをコードする遺伝子が導入されたことによりＤＨＡ生産能を有する微生物。
【0034】
本明細書において、「宿主生物」とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元の生物のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元の生物が微生物の場合は、親株、宿主株ともいう。
【0035】
（１）ＤＨＡ代謝能を有する微生物としては、ラビリンチュラ類に属する微生物が挙げられる。ラビリンチュラ類に属する微生物としては、例えば、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の微生物が挙げられる。好ましくはオーランチオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ・ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）等が挙げられるが、生来的にＤＨＡ代謝経路を有する限り、これらに限定されない。
【0036】
ＤＨＡ代謝能を有する微生物としては、具体的には例えば、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する微生物が好ましく、例えばオーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１１５２４）などが挙げられ、さらにその変異株であってＤＨＡ生産能を有する微生物を用いてもよい。
【0037】
前記のオーランチオキトリウム エスピー ＯＨ４株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６（郵便番号３０５－８５６６）に所在する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センターに寄託された。受領日（寄託日）は平成２５年（西暦２０１３年）１月１１日であり、受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ－１１５２４である。
【0038】
（２）ＤＨＡ代謝能を有さない微生物とは、生来的にＤＨＡ生産能を有さない微生物をいう。ＤＨＡ代謝能を有さない微生物としては、例えば、細菌、微細藻類、真菌、原生生物、原生動物が挙げられる。
【0039】
細菌としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、及びオーレオスピラ（Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ）属からなる群より選ばれる１の属に属する微生物が挙げられる。これらの中でも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ－０１１０、及びＡｕｒｅｉｓｐｉｒａ ｍａｒｉｎａ ＪＣＭ２３２０１からなる群より選ばれる１の微生物が好ましい。
【0040】
微細藻類としては、例えば、ユーグレナ藻綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属およびペラネマ（Ｐｅｒａｎｅｍａ）属］、緑藻綱（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属］、サヤツナギ綱（Ｄｉｎｏｂｒｙａｃｅａｅ）［例として、サヤツナギ（Ｄｉｎｏｂｒｙｏｎ）属、プラチクリシス（Ｐｌａｔｙｃｈｒｙｓｉｓ）属およびクリソクロムリナ（Ｃｈｒｙｓｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ）属］、渦鞭毛藻綱（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、クリプセコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、ギムノジニウム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）属、ペリジリウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）属、セラチウム（Ｃｅｒａｔｉｕｍ）属、ギロジニウム（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）属およびオキシルリス（Ｏｘｙｒｒｈｉｓ）属］、クリプト藻綱（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属およびロドモナス（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ）属］、黄緑藻綱（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、オリストディスカス（Ｏｌｉｓｔｈｏｄｉｓｃｕｓ）属］［かつ、鞭毛虫リゾクロリス類（Ｒｈｉｚｏｃｈｌｏｒｉｄａｃｅａｅ）ならびにアファノカエテパシェリ（Ａｐｈａｎｏｃｈａｅｔｅ ｐａｓｃｈｅｒｉ）、ブミレリアスティゲオクロニウム（Ｂｕｍｉｌｌｅｒｉａ ｓｔｉｇｅｏｃｌｏｎｉｕｍ）およびバウケリアゲミナタ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ ｇｅｍｉｎａｔａ）の遊走子／配偶子においてのようなアメーバ状期を生じる藻類の品種を含む］、真正眼点藻綱（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）およびプリムネシウム藻綱（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｏｐｙｃｅａｅ）［例えば、プリムネシウム（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ）属およびディアクロネマ（Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ）属を含む］が挙げられる。
【0041】
これらの属内の好ましい種は、特に限定されないが、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓが挙げられる。
【0042】
真菌としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属［例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）を含む酵母］、もしくはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属のような他の酵母、又は他の真菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属のような繊維状真菌などが挙げられる。
【0043】
宿主細胞として利用できる細胞株は、通常の意味での野生型であってよく、又は、栄養要求性変異株、抗生物質耐性変異株であってもよく、各種マーカー遺伝子を有するように形質転換されていてもよい。例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン等の抗生物質に耐性を示す株が挙げられる。
【0044】
（２）ＤＨＡ代謝能を有さない微生物にＤＨＡ生産能を獲得させるための、ＤＨＡを生合成する活性を有するＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する各ドメインをコードする遺伝子としては、上記した（１）ＤＨＡ代謝能を有する微生物が有するＤＨＡを生合成する活性を有するＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する各ドメイン（ＫＳドメイン、ＭＡＴドメイン、ＡＣＰドメイン、ＫＲドメイン、ＰＳ－ＤＨドメイン、ＣＬＦドメイン、ＡＴドメイン、ＦａｂＡ－ＤＨドメイン、ＥＲドメイン及びＰＰＴドメイン）をコードする遺伝子が好ましい。
【0045】
ＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する各ドメインは、該ドメインが協働してＤＨＡを生産する限りにおいて、各ドメインは限定されないが、例えば、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有する各ドメインが挙げられる。
【0046】
本明細書において「協働する」とは、ある蛋白質を他の蛋白質と共存させたとき、一体となって特定の反応を行うことであり、特に本明細書では、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性に必要な複数のドメインを共存させたとき、他のドメインと一体となってＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を示すことをいう。
【0047】
本明細書において「既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳ」とは、好ましくは、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属からなる群より選ばれる属に属する微生物が元来有しているＰＵＦＡ－ＰＫＳを、より好ましくは、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＡＴＣＣ ＭＹＡ－１３８１、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＴＣＣ ２０８８８、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ ＡＴＣＣ ３４３０４からなる群より選ばれる微生物が、元来有しているＰＵＦＡ－ＰＫＳが挙げられる。
【0048】
各ドメインからなるＰＵＦＡ－ＰＫＳがＤＨＡ合成活性を有することは、各ドメインをコードする遺伝子で形質転換した微生物を造成し、該微生物を培地に培養し、培養物中にＤＨＡを生成、蓄積させ、該培養物中に蓄積したＤＨＡを、ガスクロマトグラフィーで測定することにより、確認できる。
【0049】
ＰＵＦＡ－ＰＫＳは上記したドメインを有する複数の蛋白質から構成される蛋白質複合体（複合酵素）であり、ＯｒｆＢはＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する蛋白質である。図１に、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）属に属する微生物におけるＰＵＦＡ－ＰＫＳの蛋白質複合体を構成するドメイン構造の模式図を示す。ＯｒｆＢ内には、１個のＫＳドメイン、ＣＬＦドメイン、ＡＴドメイン、ＥＲドメインがある。
【0050】
変異型ＯｒｆＢとしては、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の蛋白質が挙げられる。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列において、該アミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、配列番号２で表されるアミノ酸配列の６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列において、該アミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、配列番号２で表されるアミノ酸配列の６番目、６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【0051】
前記（ａ）の蛋白質について、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくとも２３０番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されていることが好ましく、２３０番目のアミノ酸残基に加えて、さらに６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されていることがより好ましく、６番目及び２３０番目のアミノ酸残基、６５番目及び２３０番目のアミノ酸残基、６番目、６５番目及び２３０番目のアミノ酸残基又は６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されていることが特に好ましい。
【0052】
また、前記（ｂ）の蛋白質について、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列において、ＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、少なくとも配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３０番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されていることが好ましく、２３０番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基に加えて、さらに６番目、６５番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１が他のアミノ酸残基に置換されていることがより好ましく、６番目及び２３０番目のアミノ酸残基、６５番目及び２３０番目のアミノ酸残基、６番目、６５番目及び２３０番目のアミノ酸残基又は６５番目、２３０番目、２３１番目及び２７５番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されていることが特に好ましい。
【0053】
ＯｒｆＢホモログとは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と高い相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＯｒｆＢと構造及び機能が類似することにより、該蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
【0054】
ＯｒｆＢホモログの具体例としては、配列番号２７で表されるＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ由来のＰｈｏＣ、配列番号２８で表されるＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ由来のＥｐａＣ、配列番号２９で表されるＭｏｒｉｔｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ由来のＤｈａＣ、配列番号３０で表されるＡｕｒｅｉｓｐｉｒａ ｍａｒｉｎａ由来のＡｒａＣ、配列番号３１で表されるＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．（ＡＴＣＣ２０８８８）由来のＯｒｆＢ等が挙げられる。ＯｒｆＢとＯｒｆＢホモログとのアミノ酸配列のアライメントの結果の一例を図２に示す。
【0055】
アミノ酸配列のアライメントは、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２，４６７３，（１９９４）］を用いて作成し得る。ＣｌｕｓｔａｌＷは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より利用できる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いる。
【0056】
変異型ＯｒｆＢとしては、より好ましくは、上記（ａ）又は（ｂ）記載の蛋白質のアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換の少なくとも１がなされた蛋白質が挙げられる。
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列の６番目のアミノ酸残基又はＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列の該アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がセリンに置換
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列の６５番目のアミノ酸残基又はＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列の該アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がロイシンに置換
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列の２３０番目のアミノ酸残基又はＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列の該アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がロイシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－アスパラギン、グリシン、Ｌ－アスパラギン酸又はＬ－アラニンに置換
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列の２３１番目のアミノ酸残基又はＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列の該アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列の２７５番目のアミノ酸残基又はＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列の該アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がグリシンに置換
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列の６番目のアミノ酸残基又はＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列の該アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がセリンに置換
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列の６５番目のアミノ酸残基又はＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列の該アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がロイシンに置換
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列の２３０番目のアミノ酸残基又はＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列の該アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がロイシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－アスパラギン、グリシン、Ｌ－アスパラギン酸又はＬ－アラニンに置換
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列の２３１番目のアミノ酸残基又はＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列の該アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列の２７５番目のアミノ酸残基又はＯｒｆＢホモログのアミノ酸配列の該アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がグリシンに置換
【0057】
上記置換後のアミノ酸残基は相互に置換可能なアミノ酸としてもよい。以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【0058】
上記置換されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどが挙げられる。
【0059】
〔微生物の造成方法〕
ＤＨＡを生産する能力を有する微生物に変異型ＯｒｆＢ又は変異型ＯｒｆＢホモログを発現させる方法としては、例えば、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）が挙げられる。
（Ｉ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物に、変異型ＯｒｆＢ又は変異型ＯｒｆＢホモログをコードする外来の遺伝子を導入する。
（ＩＩ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物における内因性のＯｒｆＢ又はＯｒｆＢホモログをコードする遺伝子に変異を導入する。
ＤＨＡを生産する能力を有する微生物に変異型ＯｒｆＢ又は変異型ＯｒｆＢホモログを発現させる方法としては、例えば、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）が挙げられる。
（Ｉ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物に、変異型ＯｒｆＢ又は変異型ＯｒｆＢホモログをコードする外来の遺伝子を導入する。
（ＩＩ）ＤＨＡを生産する能力を有する微生物における内因性のＯｒｆＢ又はＯｒｆＢホモログをコードする遺伝子に変異を導入する。
【0060】
前記（Ｉ）について、変異型ＯｒｆＢ又は変異型ＯｒｆＢホモログをコードする外来の遺伝子の導入としては、自律複製可能なプラスミドとして当該宿主生物の細胞中に存在する場合、該細胞中の置換対象の遺伝子を対応する外来の遺伝子と置換する場合、変異型ＯｒｆＢ又は変異型ＯｒｆＢホモログをコードする外来の遺伝子を当該細胞における染色体ＤＮＡ中のＯｒｆＢをコードする遺伝子とは別の領域に組み込む場合を含む。なお、外来の遺伝子を導入する際には宿主となる微生物のコドン使用頻度を参考に配列の至適化を行うことが好ましい。
【0061】
前記（ＩＩ）について、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて部位特異的変異を導入することにより、内因性のＯｒｆＢ又はＯｒｆＢホモログをコードする遺伝子に変異を導入し得る。
【0062】
本明細書において、「遺伝子」とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域、プロモーター領域及びターミネーター領域などを含んでもよいＤＮＡをいう。宿主生物に細菌などの原核生物を親株として用いる場合は、該ＤＮＡとしては、リボソーム結合領域であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現に転写終結因子は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【0063】
宿主生物に導入する遺伝子としては、例えば、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え遺伝子とすることにより、宿主細胞に導入し得る。発現ベクターには、プロモーター、転写終結シグナル、形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カルボキシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、リジン等のアミノ酸要求変異を相補する遺伝子等、ウラシル、アデニン等の核酸塩基要求性変異を相補する遺伝子等）も含むことができる。ウラシル要求株の場合、マーカー遺伝子としては、例えばオロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ３遺伝子）、又はオロチジル酸ピロホスホリラーゼ遺伝子（ｕｒａ５遺伝子）が挙げられる。
【0064】
プロモーターとして、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡの塩基配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、好適に使用される。ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３－ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が、その宿主細胞の性質等に応じて利用可能である。
【0065】
プロモーター及びターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントとして、例えば、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などが挙げられる。好ましい調節配列としては、例えば、”Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）に記載されている配列が挙げられる。
【0066】
ベクターとして、目的とする遺伝子を発現させることができれば、特に限定されない。ベクターを構築するための試薬類、例えば制限酵素又はライゲーション酵素等の種類についても特に限定されず、市販品を適宜用いることができる。
【0067】
宿主生物として、ラビリンチュラ類微生物を用いる場合のプロモーターとしては、ラビリンチュラ類微生物の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されず、例えば、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｔｕプロモーター、解糖系遺伝子の発現プロモーターが挙げられる。
【0068】
親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０（キアゲン社製）、ｐＥＴ－３（ノバジェン社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（Ｆｅｒｍ ＢＰ－５４０７）より調整］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（Ｆｅｒｍ ＢＰ－５４０８）より調整］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、２００７、Ｖｏｌ．７３、Ｎｏ．２０、ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＡＣ３１（国際公開第９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）、ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）が挙げられる。
【0069】
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されず、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターが挙げられる。また、例えば、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターが挙げられる。
【0070】
親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等が挙げられる。
【0071】
前記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されず、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４－６７９（２０００）］が挙げられる。
【0072】
親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５１（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が挙げられる。
【0073】
前記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されず、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターが挙げられる。
【0074】
組換え遺伝子を宿主生物の染色体に組み込む方法としては、相同組換え法を用いることができる。相同組換え法としては、例えば、導入したい親株内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え系を利用して、組換え遺伝子を導入する方法が挙げられる。エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え遺伝子を導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５（２０００）］が挙げられる。
【0075】
さらに、組換え遺伝子と共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラ―ゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得できる。
【0076】
また、相同組換え法としては、例えば、アグロバクテリウムを介したＡＴＭＴ法［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（２００９），ｖｏｌ．７５，ｐ．５５２９－５５３５］が挙げられる。さらに、目的の形質を安定して保持する形質転換体を得ることができれば、ＡＴＭＴ法の改良法等を含み、これらに限定されない。
【0077】
導入する遺伝子を宿主生物において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等の方法が挙げられる。
【0078】
上記した方法により取得した微生物が目的の微生物であることは、該微生物を培養し、その培養物に蓄積されたＥＰＡをガスクロマトグラフィーで検出することで、確認できる。
【0079】
本発明の微生物は、例えば、２０℃にて４８時間培養した時に産生される最終産物（ＰＵＦＡ）におけるＥＰＡ／ＤＨＡ比が、実施例において後述するガスクロマトグラフィー質量分析法で測定したときに、０．１以上であることが好ましく、より好ましくは０．２以上、さらに好ましくは０．５以上である。
【0080】
〔ＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物の製造法〕
本発明は、上記造成された微生物を培地に培養し、培養物中にＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物を採取することを特徴とする、ＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物の製造法（以下、本発明の製造法という。）を含む。
本発明は、上記造成された微生物を培地に培養し、培養物中にＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物を採取することを特徴とする、ＥＰＡ又はＥＰＡ含有組成物の製造法（以下、本発明の製造法という。）を含む。
【0081】
ＥＰＡ含有組成物は、例えば、ＥＰＡ含有油脂又はＥＰＡ含有リン脂質を、好ましくはＥＰＡ含有油脂が挙げられる。該微生物の培養物は、該微生物を適当な培地に接種して、常法にしたがって培養することにより得られる。
【0082】
培地としては、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む公知の培地をいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、ガラクトース等の炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリウムなどが例示できる。これらの炭素源は、例えば、培地１リットル当たり２０～３００ｇの濃度で使用できる。特に好ましい態様によれば、初発の炭素源を消費した後に、炭素源をフィードすることにより引き続き培養できる。このような条件で培養することにより、消費させる炭素源の量を増大させて、ＥＰＡ含有組成物の生産量を向上できる。
【0083】
また、窒素源としては、例えば、酵母エキス、コーンスティープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、アンモニア等の無機窒素が挙げられる。無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
【0084】
上記の各成分を含有する培地は、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨを４．０～９．５の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。培養温度は、一般的には１０～４５℃であり、好ましくは２０～３７℃である。培養温度は、ＥＰＡ含有組成物を生産しうる培養温度に制御することが好ましい。培養時のｐＨは、一般的には３．５～９．５であり、好ましくは４．５～９．５である。特に好ましいｐＨは目的によって異なり、油脂を多く生産するためには、ｐＨ５．０～８．０である。
【0085】
培養時間は、例えば２～７日間とすることができ、通気攪拌培養等で培養を行うことができる。培養物から培養液と微生物とを分離する方法は、当業者により公知の常法により行うことができ、例えば、遠心分離法や濾過等により行うことができる。上記の培養物から分離した微生物を、例えば超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行うことにより、ＥＰＡ含有組成物が得られる。
【0086】
上記の製造法で製造されるＥＰＡ含有組成物は、例えば、低温溶媒分別法［高橋是太郎，油化学，４０：９３１－９４１（１９９１）］、又はリパーゼ等の加水分解酵素で短鎖の脂肪酸を遊離除去する方法［高橋是太郎，油化学，４０：９３１－９４１（１９９１）］等の方法により、ＥＰＡ含有組成物を濃縮して、ＥＰＡ含量が高いＥＰＡ含有組成物を得ることができる。
【0087】
ＥＰＡ含有組成物からＥＰＡを分離して採取することにより、ＥＰＡを製造することができる。例えば、加水分解法によりＥＰＡ含有組成物からＥＰＡを含有する混合脂肪酸を調整した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法などにより、ＥＰＡを分離して採取することにより、ＥＰＡを製造できる。
【0088】
また、ＥＰＡ含有組成物からＥＰＡアルキルエステルを分離して採取することにより、ＥＰＡアルキルエステルを製造できる。ＥＰＡアルキルエステルは、ＥＰＡアルキルエステルであれば特に限定されないが、好ましくは、ＥＰＡエチルエステルが挙げられる。
【0089】
ＥＰＡ含有組成物からＥＰＡアルキルエステルを分離して採取するには、例えばアルコーリシス法によりＥＰＡ含有組成物からＥＰＡアルキルエステルを含有する混合脂肪酸アルキルエステルを調整した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法等により、ＥＰＡアルキルエステルを分離して採取することにより行うことができる。
【実施例0090】
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0091】
［実施例１］
変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いたＥＰＡの製造－１
（１）各発現プラスミドの造成
［ＯｒｆＡ蛋白質発現プラスミドの造成］
林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．（ＡＴＣＣ２０８８８）株由来のＯｒｆＡ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＥＴ２１－ｏｒｆＡを得た。
変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いたＥＰＡの製造－１
（１）各発現プラスミドの造成
［ＯｒｆＡ蛋白質発現プラスミドの造成］
林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．（ＡＴＣＣ２０８８８）株由来のＯｒｆＡ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＥＴ２１－ｏｒｆＡを得た。
【0092】
［ＯｒｆＣ蛋白質発現プラスミドの造成］
常法により抽出したＡｕｒａｎｃｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＯＨ４株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号７及び８で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＯｒｆＣ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ及び大腸菌ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１ （メルクミリポア社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＭｆｅＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、Ａｕｒａｎｃｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＯＨ４株由来のＯｒｆＣ蛋白質の発現プラスミドｐＣＯＬＡ－ＯＨ４＿ｏｒｆＣを得た。
常法により抽出したＡｕｒａｎｃｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＯＨ４株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号７及び８で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＯｒｆＣ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ及び大腸菌ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１ （メルクミリポア社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＭｆｅＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、Ａｕｒａｎｃｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＯＨ４株由来のＯｒｆＣ蛋白質の発現プラスミドｐＣＯＬＡ－ＯＨ４＿ｏｒｆＣを得た。
【0093】
［ＨｅｔＩ蛋白質発現プラスミドの造成］
林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ． ＰＣＣ７１２０（ＡＴＣＣ２７８９３）株由来のＨｅｔＩ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＳＴＶ－ｈｅｔＩを得た。
林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ． ＰＣＣ７１２０（ＡＴＣＣ２７８９３）株由来のＨｅｔＩ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＳＴＶ－ｈｅｔＩを得た。
【0094】
（２）変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡライブラリーの構築
［野生型ＯｒｆＢ発現プラスミドの造成］
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．（ＡＴＣＣ２０８８８）株由来のＯｒｆＢ発現プラスミドｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ１（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）をＡｇｅＩで処理してＡｇｅＩ処理断片を取得し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈキット（東洋紡社製）を用いて該ＡｇｅＩ処理断片の末端を平滑化したのちセルフライゲーションした。これより、ｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ１のＴ７ターミネーター下流のＡｇｅＩ認識配列が削除されたｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ１’を得た。
［野生型ＯｒｆＢ発現プラスミドの造成］
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．（ＡＴＣＣ２０８８８）株由来のＯｒｆＢ発現プラスミドｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ１（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）をＡｇｅＩで処理してＡｇｅＩ処理断片を取得し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈキット（東洋紡社製）を用いて該ＡｇｅＩ処理断片の末端を平滑化したのちセルフライゲーションした。これより、ｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ１のＴ７ターミネーター下流のＡｇｅＩ認識配列が削除されたｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ１’を得た。
【0095】
続いて、常法により抽出したＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＯＨ４株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号９、１０、１１及び１２で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、ＯｒｆＢをコードするＤＮＡ（配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を含むＤＮＡ断片を増幅した。当該増幅したＤＮＡ断片においては、コーディング領域の４７１３番目の塩基が、アデニンからチミジンに置換されており、ＮｄｅＩ認識配列（４７１２～４７１７番目の塩基配列）が削除されている。得られたＤＮＡ断片及びｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ１’を制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることによりｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢを得た。
【0096】
続いて、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢを鋳型に、配列番号９、１２、１３及び１４で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、ＯｒｆＢをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。当該ＤＮＡ断片においては、コーディング領域の２６２５番目の塩基が、グアニンからアデニンに置換され、２６２３～２６２８番目の塩基配列にＳｐｈＩ認識配列が導入されている。得られたＤＮＡ断片及びｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ１’を制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、Ａｕｒａｎｃｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＯＨ４株由来の野生型ＯｒｆＢを発現するプラスミドｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢｓを得た。
【0097】
［変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡライブラリーの構築］
続いて、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢｓを鋳型とし、配列番号１５及び１６で表わされるプライマーを用い、ＴａＫａＲａ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を用いてエラープローンＰＣＲを行った。エラープローンＰＣＲにおいては、変異を誘発するため、ＰＣＲ反応液中のＭｇＣｌの濃度を５ｍＭとした。
続いて、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢｓを鋳型とし、配列番号１５及び１６で表わされるプライマーを用い、ＴａＫａＲａ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を用いてエラープローンＰＣＲを行った。エラープローンＰＣＲにおいては、変異を誘発するため、ＰＣＲ反応液中のＭｇＣｌの濃度を５ｍＭとした。
【0098】
エラープローンＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を精製後、制限酵素ＮｄｅＩ及びＡｇｅＩで処理し、同一の制限酵素処理を行ったｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢｓとライゲーションした。これより、変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡライブラリーを構築した。
【0099】
（３）ＥＰＡの生産性評価
林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法で、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ（配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質）をコードする遺伝子が欠失した大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を造成した。
林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法で、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ（配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質）をコードする遺伝子が欠失した大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を造成した。
【0100】
ｐＥＴ２１－ｏｒｆＡ、ｐＣＯＬＡ－ＯＨ４＿ｏｒｆＣ及びｐＳＴＶ－ｈｅｔＩ、並びにｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢｓ又は変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡライブラリーで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。
【0101】
得られた大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２ｍＬへ植菌し、３０℃にて１６時間振とう培養を行った。
【0102】
得られた培養液１ｍＬを、新たに調製した、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２０ｍＬの入った２００ｍＬ羽根つきフラスコに植菌し、２３０ｒｐｍ、２０℃にて４８時間培養した。
【0103】
培養後、培養液を採取し、Ｂｌｉｇｈ―Ｄｙｅｒ法［Ｂｌｉｇｈ，ｅ．Ｇ．ａｎｄ Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（１９５９）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，９１１－９１７］にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素・メタノール溶液にて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。ガスクロマトグラフィー質量分析法でＤＨＡメチルエステル、ＥＰＡメチルエステルに相当するピークのエリア面積から培養液中のＤＨＡとＥＰＡの存在量を算出し、さらにＥＰＡとＤＨＡの存在比についても計算した。
【0104】
その結果、野生型のＯｒｆＢを生産する大腸菌はＥＰＡを生産しなかったのに対し、変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡライブラリーで形質転換した大腸菌において、ＥＰＡを生産した株が確認された。
【0105】
当該ＥＰＡを生産した大腸菌が生産する変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡの塩基配列を決定したところ、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換されていた。
【0106】
（４）さらなる変異型ＯｒｆＢの取得
さらに、２３０番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換されているアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡを鋳型として、前記と同様の方法でエラープローンＰＣＲを行い、前記と同様の方法で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株に導入し、ＥＰＡの生産性を確認した。
さらに、２３０番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換されているアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡを鋳型として、前記と同様の方法でエラープローンＰＣＲを行い、前記と同様の方法で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株に導入し、ＥＰＡの生産性を確認した。
【0107】
その結果、前記で取得した、２３０番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換されているアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌よりも、さらにＥＰＡの生産性が向上した株が確認された。
【0108】
ＥＰＡの生産性が向上した大腸菌が発現する変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡの塩基配列を決定したところ、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換されていたのに加え、６番目のＬ－アスパラギンがＬ－セリンに、６５番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換されていた。
【0109】
上記培養液中のＥＰＡ、ＤＨＡ及びＤＰＡを測定した結果のまとめを表１に示す。
【0110】
【表1】
【0111】
表１に示すとおり、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のアミノ酸残基をＬ－ロイシンに置換した変異型ＯｒｆＢ、又は６番目のアミノ酸残基をＬ－セリンに、６５番目のアミノ酸残基をＬ－ロイシンに、及び２３０番目のアミノ酸残基をＬ－ロイシンに置換した変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いることにより、野生型のＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いた場合に比べ、効率的にＥＰＡを製造できることがわかった。
【0112】
［実施例２］
変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いたＥＰＡの製造－２
（１）各発現プラスミドの造成
実施例１（２）で取得したｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢを鋳型に、配列番号９及び１７で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＯｒｆＢのＫＳドメインのＮ末端領域をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。
変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いたＥＰＡの製造－２
（１）各発現プラスミドの造成
実施例１（２）で取得したｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢを鋳型に、配列番号９及び１７で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＯｒｆＢのＫＳドメインのＮ末端領域をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。
【0113】
また、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢを鋳型に、配列番号１６で表わされるプライマー及び配列番号１８、１９、２０、２１又は２２で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のアミノ酸残基がＬ－トリプトファン、Ｌ－アスパラギン、グリシン、Ｌ－アスパラギン酸又はＬ－アラニンに置換された変異型ＯｒｆＢのＫＳドメインのＣ末端領域をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。
【0114】
取得した、ＫＳドメインのＮ末端領域又はＣ末端領域をコードするＤＮＡ断片並びに配列番号９及び１６で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のアミノ酸残基がＬ－トリプトファン、Ｌ－アスパラギン、グリシン、Ｌ－アスパラギン酸又はＬ－アラニンに置換された変異型ＯｒｆＢのＫＳドメインの全長をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を取得した。
【0115】
当該ＤＮＡ断片及びｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢｓを制限酵素ＮｄｅＩ及びＡｇｅＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｗ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｎ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｇ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｄ及びｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ａを得た。
【0116】
また、実施例１（３）で取得した大腸菌より、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のアミノ酸残基がＬ－ロイシンに置換されている変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡを有するプラスミドｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌを取得した。
【0117】
（２）ＥＰＡの製造
ｐＥＴ２１－ｏｒｆＡ、ｐＣＯＬＡ－ＯＨ４＿ｏｒｆＣ及びｐＳＴＶ－ｈｅｔＩ、並びに野生型ＯｒｆＢ又は６種類の変異型ＯｒｆＢの発現プラスミド（ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢｓ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｗ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｎ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｇ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｄ又はｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ａ）で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。
ｐＥＴ２１－ｏｒｆＡ、ｐＣＯＬＡ－ＯＨ４＿ｏｒｆＣ及びｐＳＴＶ－ｈｅｔＩ、並びに野生型ＯｒｆＢ又は６種類の変異型ＯｒｆＢの発現プラスミド（ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢｓ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｗ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｎ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｇ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｄ又はｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ａ）で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。
【0118】
得られた大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２ｍＬへ植菌し、３０℃にて１６時間振とう培養を行った。
【0119】
得られた培養液１ｍＬを、新たに調製した、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２０ｍＬが入った２００ｍＬ羽根つきフラスコに植菌し、２３０ｒｐｍ、２０℃にて４８時間培養した。
【0120】
培養後、培養液を採取し、Ｂｌｉｇｈ―Ｄｙｅｒ法にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素・メタノール溶液にて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。
【0121】
培養液中のＥＰＡ、ＤＨＡ及びＤＰＡを測定した結果を表２に示す。
【0122】
【表2】
【0123】
表２に示すとおり、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のアミノ酸残基をＬ－ロイシンに置換した変異型ＯｒｆＢを用いたときと同様、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のアミノ酸残基をＬ－トリプトファン、Ｌ－アスパラギン、グリシン、Ｌ－アスパラギン酸又はＬ－アラニンに置換した変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いても、野生型のＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いた場合に比べ、効率的にＥＰＡを製造できることがわかった。
【0124】
［実施例３］
変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いたＥＰＡの製造－３
（１）各発現プラスミドの造成
［ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ２３０Ｌの造成］
ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌを鋳型に、配列番号２３及び１６で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＯｒｆＢのＫＳドメインをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片及びｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌを制限酵素ＮｄｅＩ及びＡｇｅＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ２３０Ｌを得た。
変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いたＥＰＡの製造－３
（１）各発現プラスミドの造成
［ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ２３０Ｌの造成］
ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌを鋳型に、配列番号２３及び１６で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＯｒｆＢのＫＳドメインをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片及びｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌを制限酵素ＮｄｅＩ及びＡｇｅＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ２３０Ｌを得た。
【0125】
ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ２３０Ｌは、Ａｕｒａｎｃｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＯＨ４株由来のＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち６番目のアミノ酸残基がＬ－セリンに、２３０番目のアミノ酸残基がＬ－ロイシンに置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有する。
【0126】
［ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌの造成］
ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌを鋳型に、配列番号２４、２５、２６及び１６で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、ＯｒｆＢのＫＳドメインをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片及びｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌを制限酵素ＮｄｅＩ及びＡｇｅＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌを得た。
ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌを鋳型に、配列番号２４、２５、２６及び１６で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、ＯｒｆＢのＫＳドメインをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片及びｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌを制限酵素ＮｄｅＩ及びＡｇｅＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌを得た。
【0127】
ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌは、Ａｕｒａｎｃｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＯＨ４株由来のＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち６５番目のアミノ酸残基がＬ－ロイシンに、２３０番目のアミノ酸残基がＬ－ロイシンに置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有する。
【0128】
［ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌの造成］
実施例１（４）で取得した、２３０番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに、６番目のＬ－アスパラギンがＬ－セリンに、６５番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換したＯｒｆＢを生産する大腸菌よりプラスミドを抽出し、ｐＣＤＦ－ＯＦ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌを得た。
実施例１（４）で取得した、２３０番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに、６番目のＬ－アスパラギンがＬ－セリンに、６５番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換したＯｒｆＢを生産する大腸菌よりプラスミドを抽出し、ｐＣＤＦ－ＯＦ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌを得た。
【0129】
ｐＣＤＦ－ＯＦ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌは、Ａｕｒａｎｃｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＯＨ４株由来のＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち６番目のアミノ酸残基がＬ－セリンに、６５番目のアミノ酸残基がＬ－ロイシンに、及び２３０番目のアミノ酸残基がＬ－ロイシンに置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有する。
【0130】
（２）ＥＰＡの製造
ｐＥＴ２１－ｏｒｆＡ、ｐＣＯＬＡ－ＯＨ４＿ｏｒｆＣ及びｐＳＴＶ－ｈｅｔＩ、並びに野生型ＯｒｆＢ又は４種類の変異型ＯｒｆＢの発現プラスミド（ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢｓ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ２３０Ｌ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌ又はｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌ）で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。
ｐＥＴ２１－ｏｒｆＡ、ｐＣＯＬＡ－ＯＨ４＿ｏｒｆＣ及びｐＳＴＶ－ｈｅｔＩ、並びに野生型ＯｒｆＢ又は４種類の変異型ＯｒｆＢの発現プラスミド（ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢｓ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ２３０Ｌ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ２３０Ｌ、ｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌ又はｐＣＤＦ－ＯＨ４＿ｏｒｆＢ－Ｎ６Ｓ－Ｆ６５Ｌ－Ｆ２３０Ｌ）で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。
【0131】
得られた大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２ｍＬへ植菌し、３０℃にて１６時間振とう培養を行った。
【0132】
得られた培養液１ｍＬを、新たに調製した、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２０ｍＬが入った２００ｍＬ羽根つきフラスコに植菌し、２３０ｒｐｍ、２０℃にて４８時間培養した。
【0133】
培養後、培養液を採取し、Ｂｌｉｇｈ―Ｄｙｅｒ法にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素・メタノール溶液にて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。
【0134】
培養液中のＥＰＡ、ＤＨＡ及びＤＰＡを測定した結果を表３に示す。
【0135】
【表3】
【0136】
表３に示すとおり、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のアミノ酸残基に加え、６番目のアミノ酸残基及び／又は６５番目のアミノ酸残基をそれぞれＬ－セリン、Ｌ－ロイシンに置換した変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いると、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のアミノ酸残基がＬ－ロイシンに置換した変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いた場合と比べ、より効率的にＥＰＡを製造できることがわかった。
【0137】
［実施例４］
変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いたＥＰＡの製造－４
実施例３で取得した、２３０番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに、６５番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換されているアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡを鋳型として、実施例１（２）と同様の方法でエラープローンＰＣＲを行い、実施例１（３）と同様の方法で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株に導入し、ＥＰＡの生産性を確認した。
変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いたＥＰＡの製造－４
実施例３で取得した、２３０番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに、６５番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換されているアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡを鋳型として、実施例１（２）と同様の方法でエラープローンＰＣＲを行い、実施例１（３）と同様の方法で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株に導入し、ＥＰＡの生産性を確認した。
【0138】
その結果、２３０番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに、６５番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換されているアミノ酸配列からなる変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌よりも、さらにＥＰＡの生産性が向上した株が確認された。
【0139】
ＥＰＡの生産性が向上した大腸菌が発現する変異型ＯｒｆＢをコードするＤＮＡの塩基配列を決定したところ、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに、６５番目のＬ－フェニルアラニンがＬ－ロイシンに置換されていたのに加え、２３１番目のＬ－イソロイシンがＬ－スレオニンに、２７５番目のＬ－アスパラギン酸がＬ－グリシンに置換されていた。
【0140】
上記培養液中のＥＰＡ、ＤＨＡ及びＤＰＡを測定した結果のまとめを表４に示す。
【0141】
【表4】
【0142】
表４に示すとおり、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のアミノ酸残基及び６５番目のアミノ酸残基に加え、２３１番目のアミノ酸残基がＬ－スレオニンに、２７５番目のアミノ酸残基がグリシンに置換した変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いると、ＯｒｆＢのアミノ酸配列のうち２３０番目のアミノ酸残基及び６５番目のアミノ酸残基がそれぞれＬ－ロイシンに置換した変異型ＯｒｆＢを生産する大腸菌を用いた場合と比べ、より効率的にＥＰＡを製造できることがわかった。
【0143】
本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１８年８月１０日付けで出願された日本特許出願（特願２０１８－１５１２３４）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【図1】
【図2】
【配列表】