特開 2024-32622 腸内細菌を有効成分とする抗肥満剤およびその作製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024032622

(43)【公開日】2024-03-12

(54)【発明の名称】腸内細菌を有効成分とする抗肥満剤およびその作製方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/741 20150101AFI20240305BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20240305BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240305BHJP

【ＦＩ】

A61K35/741

A61P3/04

A61P43/00 105

C12N1/20 A ZNA

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022136372

(22)【出願日】2022-08-29

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】000006884

【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100193725

【弁理士】

【氏名又は名称】小森 幸子

(74)【代理人】

【識別番号】100163038

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 武志

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】伊吹 達也

(72)【発明者】

【氏名】山崎 竜太

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AC14

4B065BC03

4B065BD09

4B065BD12

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC54

4C087CA09

4C087NA14

4C087ZA70

4C087ZB21

(57)【要約】

【課題】新規の抗肥満剤およびその作製方法を提供する。
【解決手段】アリスティペス属細菌を有効成分とする抗肥満剤であって、前記細菌がアリスティペス インディスティンクタス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ）またはアリスティペス ファインゴルディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）であることを特徴とする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌またはその膜小胞（ＭＶ）を有効成分とする抗肥満剤。

【請求項2】

前記細菌はアリスティペス インディスティンクタス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ）またはアリスティペス ファインゴルディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）である、請求項１に記載の抗肥満剤。

【請求項3】

前記抗肥満剤は脂肪細胞の分化抑制剤、脂肪蓄積抑制剤、または蓄積した脂肪の減少剤である、請求項１または請求項２に記載の抗肥満剤。

【請求項4】

アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌またはその膜小胞（ＭＶ）を有効成分とする抗肥満剤の作製方法であって、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌を培養する工程ａを含み、かつ
前記工程ａで培養した培養液から菌体を取得する工程ｂ１、または
前記工程ａで培養した培養液を遠心分離およびろ過してＭＶを取得する工程２ｂ、
を含む、抗肥満剤の作製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腸内細菌を有効成分とする抗肥満剤、およびその作製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

肥満症は脂肪沈着過多のため、身体が異常に肥満する病態をいい、世界的に患者規模の大きな疾患の一つである。また、肥満症は糖尿病、高脂血症、高血圧等を促進する危険性があり早急に治療すべき疾患である。

【0003】

しかし、肥満症の治療薬（抗肥満剤）の開発は効果不十分、副作用等の観点から困難であり、現在日本で承認されている抗肥満剤は僅かである（非特許文献１）。

【0004】

一方、近年のＤＮＡ解析の発展と腸内細菌学の確立によって、腸内環境の変化が宿主の生体恒常性の維持と密接に関与することが明らかになってきた。例えば、アッカーマンシア ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ，「ＡＭ」という。）はムチンを単一の栄養源とする腸内細菌であり肥満症との関連性が報告されている（非特許文献２）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】日内会誌，８４巻，ｐ．１２９０～１２９４，１９９５年

【非特許文献2】Ｇｕｔ，６５巻，ｐ．４２６～４３６，２０１６年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかし、ＡＭ以外の腸内細菌に関しては未だ肥満症に関連する知見を得ておらず研究・開発を行う余地が残っていた。

【0007】

そこで、本発明は抗肥満作用を有する腸内細菌を新たに特定し、その作用に基づく新規の抗肥満剤、およびその作製方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、鋭意研究を行った結果、意外にもアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌またはその膜小胞（ＭＶ）が抗肥満剤としての使用に適することを見出した。すなわち、本発明の抗肥満剤の特徴は以下の通りである。

【0009】

［１］アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌またはその膜小胞（ＭＶ）を有効成分とする抗肥満剤。

【0010】

[２]前記細菌はアリスティペス インディスティンクタス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ）またはアリスティペス ファインゴルディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）である、上記[１]に記載の抗肥満剤。

【0011】

[３]前記抗肥満剤は脂肪細胞の分化抑制剤、脂肪蓄積抑制剤、または蓄積した脂肪の減少剤である、上記[１]または[２]に記載の抗肥満剤。

【0012】

[４]アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌またはその膜小胞（ＭＶ）を有効成分とする抗肥満剤の作製方法であって、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌を培養する工程ａを含み、かつ
前記工程ａで培養した培養液から菌体を取得する工程ｂ１、または
前記工程ａで培養した培養液を遠心分離およびろ過してＭＶを取得する工程２ｂ、
を含む、抗肥満剤の作製方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌またはその膜小胞（ＭＶ）を有効成分とする抗肥満剤、およびその作製方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は脂肪細胞の分化のプロセスを示す図である。

【図2】図２は膜小胞を模擬的に説明する図である。

【図3】図３は上段がＡｌｉｓｔｉｐｅｓ ｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ（ＡＩ）の膜小胞、下段がＡＭの膜小胞を示す写真図である。

【図4A】図４ＡはＡＭ、ＡＩの加熱死菌体（ＨＫＢ）が脂肪細胞の分化を抑制することを示す写真図である。

【図4B】図４ＢはＡＭ、ＡＩのＨＫＢが脂肪細胞の分化を抑制することを示す棒グラフである。

【図5A】図５ＡはＡＭ、ＡＩの膜小胞（ＭＶ）が脂肪細胞の分化を抑制することを示す写真図である。

【図5B】図５ＢはＡＭ、ＡＩのＭＶが脂肪細胞の分化を抑制することを示す棒グラフである。

【図6】図６はＡＭ、ＡＩが脂肪細胞の分化に関連する因子のタンパク質発現（図６（Ａ）、図６（Ｂ））およびｍＲＮＡ発現（図６（Ｃ））を抑制することを示す図である。

【図7】図７はＡＭ、ＡＩがアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）の分泌を抑制することを示す図である。

【図8A】図８ＡはＡＩ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ（ＡＦ）のＨＫＢが脂肪細胞の分化を抑制することを示す写真図である。

【図8B】図８ＢはＡＩ、ＡＦのＨＫＢが脂肪細胞の分化を抑制することを示す棒グラフである。

【図9A】図９ＡはＡＩ、ＡＦのＭＶが脂肪細胞の分化を抑制することを示す写真図である。

【図9B】図９ＢはＡＩ、ＡＦのＭＶが脂肪細胞の分化を抑制することを示す棒グラフである。

【図10】図１０はＡＩ、ＡＦが脂肪細胞の分化に関連する因子のタンパク質発現（図１０（Ａ））およびｍＲＮＡ発現（図１０（Ｂ））を抑制することを示す図である。

【図11A】図１１ＡはＡＩ、ＡＦが脂肪細胞の脂肪油滴の蓄積を抑制することを示す写真図である。

【図11B】図１１ＢはＡＩ、ＡＦが脂肪細胞の脂肪油滴の蓄積を抑制することを示す棒グラフである。

【図12A】図１２ＡはＡＩ、ＡＦが脂肪細胞の脂肪油滴を減少させることを示す写真図である。

【図12B】図１２ＢはＡＩ、ＡＦが脂肪細胞の脂肪油滴を減少させることを示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の腸内細菌を有効成分とする抗肥満剤に関して詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は本発明の一実施形態としての一例であり、これらの内容に特定されるものではない。

【0016】

本発明者等は、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌またはその膜小胞（ＭＶ）が抗肥満剤の有効成分となることを予期せず発見した。アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌は、例えば、アリスティペス インディスティンクタス（「ＡＩ」という。）またはアリスティペス ファインゴルディイ（「ＡＦ」という。）である。

【0017】

なお、抗肥満剤として使用する場合に、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌は生菌体の形態であってもよいし、加熱死菌体（「ＨＫＢ」という。）等の死菌体の形態であってもよいし、細菌から抽出された膜小胞（「ＭＶ」という。）の形態であってもよい。

【0018】

また、本発明者等は、上記アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌が作用して前駆細胞から脂肪細胞への分化抑制作用、脂肪細胞における脂肪蓄積抑制作用、肥大化脂肪細胞における蓄積した脂肪の減少作用を有することを予期せず発見した。

【0019】

また、本発明者等は、上記アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌の加熱死菌体（ＨＫＢ）または上記細菌が生成する膜小胞（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ，「ＭＶ」という。）が、前駆細胞、小型脂肪細胞、肥大化脂肪細胞にそれぞれ作用することを予期せず発見した。以下、さらに詳しく説明する。

【0020】

本発明において、抗肥満剤は医薬組成物であってもよい。また、医薬組成物の製剤化の場合には許容可能な添加剤を併用してもよい。添加剤は、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。

【0021】

抗肥満剤は、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌またはその膜小胞（ＭＶ）を有効成分とするが、本願発明の効果を妨げない程度に上記細菌以外の成分を含んでいてもよい。上記細菌以外の成分として、例えば、培地成分、水等の溶媒、糖質、タンパク質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、生体必須微量金属（硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、炭酸カリウム等）、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）以外の細菌やプロバイオティクス、薬学的に許容可能な担体等が挙げられる。

【0022】

抗肥満剤が経口製剤の場合、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等の固形製剤、溶液、懸濁液、乳濁液等の液状製剤の形態をとることができる。

【0023】

本発明の抗肥満剤の摂取量は本発明の効果が奏される限り特に限定されるものではない。また、摂取者の年齢、健康状態、体重等に応じて適宜調整することができる。

【0024】

例えば、有効成分であるアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌を、下限として１日当たり１×１０^２個以上、より好ましくは１×１０^６個以上摂取することが望ましい。また上限として１日当たり１×１０^１５個以下、より好ましくは１×１０^１１個以下接種することが望ましい。

【0025】

１日当たりの摂取量が下限値を下回る場合、抗肥満剤としての効果が薄れるおそれがあり、また上限値を上回る場合には抗肥満剤としての効果が一定に達して、摂取量当たりの効果が表れない可能性がある。

【0026】

本発明の抗肥満剤の摂取期間は、理想的には肥満が解消されるまで長期間にわたり継続的に摂取することが望ましい。その効果をよりよく発揮させるために、下限として、例えば、４週間以上継続的に摂取することが好ましく、また、数か月から数年以上継続的に摂取することがより好ましい。下限値を下回る場合には抗肥満剤としての効果が薄れるおそれがある。

【0027】

なお、抗肥満剤を長期間、継続的に摂取するにあたり、旅行や仕事等のやむを得ない事情により使用者が摂取を怠ってしまう場合も考えられるが、そのような場合には１週間に１～３回摂取したり、数日空けてその後１日に２～３回摂取する等、摂取頻度を適宜調整してもよい。

【0028】

本発明の抗肥満剤の摂取対象者は、特に限定しないが、例えば、肥満症、糖尿病、高脂血症、高血圧、または生活習慣病等に罹患する者、またはそれらの疾患を予防する必要のある者が挙げられる。本抗肥満剤は、上記疾患を治療する効果を有するだけでなく、症状の悪化を緩和または改善する効果、上記疾患を予防する効果を有する。

【0029】

抗肥満剤の有効成分となるアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）は、バクテロイデス門に属するヒトの腸内細菌の一種である。本発明のアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌には、上記のＡＩ、ＡＦの他に、アリスティペス イフミイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｉｈｕｍｉｉ）、アリスティペス イノプス シュコポロフ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｉｎｏｐｓ Ｓｈｋｏｐｏｒｏｖ）、アリスティペス オンダドンキィ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ）、アリスティペス プトレディネス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ）、アリスティペス シャヒィ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｈａｈｉｉ）、アリスティペス ティモネシス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）、アリスティペス セネガレンシス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ）、アリスティペス オベシ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｏｂｅｓｉ）、アリスティペス メガグチ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｍｅｇａｇｕｔｉ）、アリスティペス プロヴェンセンシス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｐｒｏｖｅｃｅｎｓｉｓ）、アリスティペス ディスパー（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｄｉｓｐｅｒ）、アリスティペス コムニス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、アリスティペス マッシレンシス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等が含まれてもよい。

【0030】

加熱死菌（ｈｅａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，「ＨＫＢ」という。）は、生菌体に対し所定時間の加熱処理を施すことにより死菌化したものである。本発明における生菌体および死菌体は、例えば濃縮・希釈、凍結、乾燥、粉末化等の処理を行ってもよい。加熱処理は、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、生菌体を殺菌するために通常用いられる条件で行われる。また、加熱処理は死菌化する方法としての一例であり、死菌化する方法は加熱処理に特定されるものではない。

【0031】

脂肪細胞の分化に関して、図１を用いて説明する。脂肪細胞は、小型脂肪細胞１０３と、小型脂肪細胞１０３がカロリーの過剰摂取や運動不足により過剰に脂肪滴を蓄えてサイズが増大した肥大化脂肪細胞１０４からなる。いずれの脂肪細胞も中胚葉系の幹細胞１０１からできる前駆細胞１０２が分化して生じたものである。

【0032】

脂肪細胞の数が増加しかつサイズが増大することで脂肪組織容量が増大した場合には肥満症の症状が現れる。また、肥大化脂肪細胞１０４が悪玉のアディポサイトカインを生産することにより体内でインスリン抵抗性を引き起し、その結果として糖尿病、高脂血症、高血圧等が促進される。

【0033】

従って、前駆細胞１０２が小型脂肪細胞１０３へ分化する過程を抑制するか、小型脂肪細胞１０３が脂肪滴を過剰に蓄積して肥大化脂肪細胞１０４を形成する過程を抑制するか、あるいは肥大化脂肪細胞１０４が既に蓄積した脂肪滴を減少させる作用を特定の物質が有する場合には、その物質が抗肥満剤の有効成分とみなすことができる。

【0034】

膜小胞（ＭＶ）に関して、図２を用いて説明する。ＭＶ２０２は生きた腸内細菌２０１が生成する小胞である。なお、本発明において開示されるＭＶの効果を発揮するものであれば、ＭＶ２０２は人工的に作製されてもよい。腸内細菌２０１から作製される場合には、ＭＶ２０２は腸内細菌２０１の細胞膜から形成される。腸内細菌２０１は一般に約１μｍ程度の大きさを有するため、腸内細菌それ自体は腸管上皮２０３の細胞間隙を通過せず、ＭＶ２０２またはＭＶ２０２の膜成分が細胞間隙を通過することにより、血管２０４等を経由して（離れた場所に存在する）脂肪細胞の前駆細胞１０２、小型脂肪細胞１０３や肥大化脂肪細胞１０４等に作用する。腸内細菌２０１は、その他に樹状細胞２０５を介してＴ細胞２０６等へ作用する等、腸内の恒常性に機能する。

【0035】

図３は上段がＡＩに由来するＭＶ、下段がＡＭに由来するＭＶの写真図である。一般に、ＭＶの平均粒子径は約１００ｎｍ前後である。

【0036】

本発明の抗肥満剤はアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌またはその膜小胞（ＭＶ）を有効成分とするものであり、抗肥満剤として使用する際、細菌は生菌体、加熱死菌体（ＨＫＢ）等の死菌体または膜小胞（ＭＶ）のいずれの形態であってもよい。作製方法を簡潔に説明すると、まずアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌を培養する工程ａを経て、次に工程ａで培養した培養液から菌体を取得する（工程ｂ１）か、または工程ａで培養した培養液をろ過および遠心分離してＭＶを取得する（工程ｂ２）ことにより、抗肥満剤を作製することができる。詳細は以下の実施例において説明する。

【実施例0037】

以下の例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明がこれらの例に限定されるものではない。

【0038】

（実施例１）
〈腸内細菌の培養〉
アッカーマンシア ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＹＩＴ １１７７４, 「ＡＭ１１７７４」という。）およびアリスティペス インディスティンクタス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ ＹＩＴ １２０６０, 「ＡＩ１２０６０」という。）は凍結保存されているものを使用し、ＧＡＭ（１％のＧｌｕｃｏｓｅ含有）培地により嫌気条件下にて、３７℃で継代、静置培養を行った。Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＹＩＴ ９０３７（「ＬＣ９０３７」という。）は凍結保存されているものを使用し、ＭＲＳ（１％のＬａｃｔｏｓｅ含有）培地により、３７℃で継代、静置培養を行った。

【0039】

なお、実施例９以降に登場するアリスティペス ファインゴルディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ ＹＩＴ １２６８５,「ＡＦ１２６８５」という。）も実施例１と同様の手法により培養を行った。

【0040】

（実施例２）
〈細胞〉
マウス線維芽細胞株３Ｔ３－Ｌ１は凍結保存されているものを使用した。なお、３Ｔ３－Ｌ１は脂肪細胞へ分化誘導されることで細胞内に脂肪滴を蓄積する特徴を有することから脂質代謝の細胞モデル系として広く用いられている。３Ｔ３－Ｌ１は、１０％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）を用いて、５％ＣＯ_２下３７℃で継代培養を行った。

【0041】

（実施例３）
〈ＭＶの単離と加熱死菌体の作製〉
ＡＭ１１７７４、ＡＩ１２０６０、およびＬＣ９０３７のＭＶは、継代後４８時間後の培養上清から単離した。それぞれの菌体培養液を遠心（８，０００×ｇ、２０ｍｉｎ、４℃）し、菌体を除去し培養上清を回収した。

【0042】

回収した培養上清は、孔径０．４５μｍのＰＥＳシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した後、分画分子量が１００ｋＤａの限外ろ過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によりＭＶを含む培養上清を濃縮した。濃縮した培養上清を遠心（２００，０００×ｇ、２ｈ、４℃）してＭＶをペレット化し、以後の測定に適した溶媒で懸濁した。

【0043】

なお、実施例９以降に登場するＡＦ１２６８５のＭＶも実施例３と同様の手法により作製している。

【0044】

上記の培養液から遠心分離により除去した菌体を、ＭｉｌｌｉＱ水に懸濁後、遠心（１０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）し、菌体を洗浄した。この操作を３回繰り返した後、ＭｉｌｌｉＱ水に懸濁した菌体の入ったチューブを、煮沸した１００℃のお湯に１０分間入れて加熱した。加熱後の菌体を凍結乾燥し、粉末とすることで、加熱死菌体（ＨＫＢ）を作製した。

【0045】

なお、実施例９以降に登場するＡＦ１２６８５のＨＫＢも実施例３と同様の手法により作製している。

【0046】

（実施例４）
〈脂肪細胞の分化誘導抑制作用の検討〉
２４ウェルプレートに３Ｔ３－Ｌ１を所定の細胞数（１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で播種し、３７℃、５％のＣＯ_２下でコンフルエントより３日後の状態まで、計６日間培養した。

【0047】

その後、ＡｄｉｐｏＩｎｄｕｃｅｒ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）の分化誘導剤であるＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、３－Ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅおよびＩｎｓｕｌｉｎをそれぞれが終濃度で２．５μＭ、０．５ｍＭおよび１０μｇ／ｍＬとなるように加えた１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを添加し、同時に各菌のＨＫＢまたはＭＶを処置して２日間培養した。

【0048】

２日後、ＨＫＢまたはＭＶを含む１０μｇ／ｍＬのＩｎｓｕｌｉｎ含有１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに交換し、さらに２日間の培養を継続した。その後、通常の１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地に交換し、３日後に培養上清および細胞を用い、細胞内の油滴量、タンパク質、遺伝子の発現量およびアディポネクチンの産生量解析に供した。

【0049】

なお、実施例９に登場するＡＦ（およびＡＩ）の脂肪細胞の分化誘導抑制作用の試験も実施例４と同様の手法により行っている。実施例１０、１１に関しては実施例４の手順と一部が重複する。詳細は実施例１０、１１の各説明箇所において述べる。

【0050】

（実施例５）
〈Ｏｉｌ－ｒｅｄ Ｏによる細胞内油滴量の測定〉
２４ウェルプレートにて培養した３Ｔ３－Ｌ１の培養上清を除去し、ＰＢＳにて１回洗浄した後、１０％中性緩衝ホルマリンを加え、一晩４℃にて静置し、細胞を固定した。

【0051】

その後、ＭｉｌｌｉＱ水にて３回洗浄し、リピットアッセイキットのＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色液（コスモバイオ）を加え、室温にて１時間染色した。染色後、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄液にＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色液の色が無くなるまで数回洗浄を繰り返した。洗浄後、３７℃にて細胞を乾燥させ、細胞染色像を顕微鏡にて撮影した。

【0052】

染色した３Ｔ３－Ｌ１に、リピットアッセイキットの抽出液（コスモバイオ）を添加して３０分間放置し、Ｏｉｌ－ｒｅｄ Ｏを抽出した。抽出後、抽出液の吸光度（５０５ｎｍ）をプレートリーダーで測定して３Ｔ３－Ｌ１の細胞内油滴量を定量し、脂肪細胞への分化度の指標とした。

【0053】

なお、実施例９以降に登場するＡＦ（およびＡＩ）のＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏによる細胞内油滴量の測定も実施例５と同様の手法により行っている。

【0054】

実施例５の結果を図４Ａ、４Ｂ、図５Ａ、５Ｂに示す。これらの結果は、ＡＭ、ＡＩが脂肪細胞の分化を抑制することができたか否かを検討したものである。

【0055】

図４Ａおよび図４Ｂの試験では、３Ｔ３－Ｌ１に対し分化誘導剤を添加したのと同時に各菌のＨＫＢを１μｇ／ｍＬ添加し、２日間の分化誘導後、５日培養して、３Ｔ３－Ｌ１をＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色した。図４Ａはその際の染色像（写真）である。

【0056】

図４Ａにおいて、「Ｄｉｆｆ」、「ＡＭ１１７７４ ＨＫＢ」、「ＡＩ１２０６０ ＨＫＢ」、「ＬＣ９０３７ ＨＫＢ」はそれぞれ、分化誘導剤のみのコントロール、ＡＭ１１７７４のＨＫＢ、ＡＩ１２０６０のＨＫＢ、ＬＣ９０３７のＨＫＢをそれぞれ添加して培養した３Ｔ３－Ｌ１の染色像であることを示す。

【0057】

図４Ａから、「ＬＣ９０３７ ＨＫＢ」は「Ｄｉｆｆ」と変わらない染色度合いである一方、それらと比較して、「ＡＭ１１７７４ ＨＫＢ」と「ＡＩ１２０６０ ＨＫＢ」は染色の度合いが明らかに低かった。

【0058】

また、図４Ｂは染色した３Ｔ３－Ｌ１からＯｉｌ ｒｅｄ Ｏを抽出し、吸光度により脂肪油滴量を数値化した棒グラフである。縦軸は吸光度を百分率で示しており、未分化の３Ｔ３－Ｌ１の前駆細胞（Ｎｏｎ－ｄｉｆｆ）を１００％とした場合の各添加条件における３Ｔ３－Ｌ１の脂肪油滴量を数値化している。横軸は左、中央、右の順に、分化誘導剤のみのコントロール（Ｄｉｆｆ）、ＨＫＢ１μｇ／ｍＬ（ＨＫＢ１）、ＨＫＢ１０μｇ／ｍＬ（ＨＫＢ１０）のそれぞれの濃度で添加した細胞群を示す。

【0059】

図４Ｂから、「ＬＣ９０３７」のＨＫＢを添加した場合は、分化誘導剤のみのコントロール（Ｄｉｆｆ）と変わらない脂肪油滴量の蓄積であった一方、「ＡＭ１１７７４」と「ＡＩ１２０６０」は１μｇ／ｍＬのＨＫＢ濃度で脂肪油滴量の蓄積に対し強い抑制効果が認められた。

【0060】

図５Ａおよび図５Ｂの試験では、３Ｔ３－Ｌ１に対し分化誘導剤を添加したのと同時に各菌のＭＶを０．１μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ添加し、２日間の分化誘導後、５日培養して、３Ｔ３－Ｌ１をＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色した。図５Ａはその際の染色像（写真）である。

【0061】

図５Ａにおいて、「Ｄｉｆｆ」、「ＡＭ１１７７４ ＭＶ」、「ＡＩ１２０６０ ＭＶ」、「ＬＣ９０３７ ＭＶ」はそれぞれ、分化誘導剤のみのコントロール、ＡＭ１１７７４のＭＶ、ＡＩ１２０６０のＭＶ、ＬＣ９０３７のＭＶをそれぞれ添加して培養した３Ｔ３－Ｌ１の染色像であることを示す。

【0062】

図５Ａから、「ＬＣ９０３７ ＭＶ」はいずれの濃度においても「Ｄｉｆｆ」と変わらない染色度合いである一方、それらと比較して、「ＡＭ１１７７４ ＭＶ」と「ＡＩ１２０６０ ＭＶ」は染色の度合いが明らかに低かった。また、「ＡＭ１１７７４ ＭＶ」と「ＡＩ１２０６０ ＭＶ」は濃度依存的に染色の度合いが減少した。

【0063】

また、図５Ｂは染色した３Ｔ３－Ｌ１からＯｉｌ ｒｅｄ Ｏを抽出し、吸光度により脂肪油滴量を数値化した棒グラフである。縦軸は吸光度を百分率で示しており、未分化の３Ｔ３－Ｌ１の前駆細胞（Ｎｏｎ－ｄｉｆｆ）を１００％とした場合の各添加条件における３Ｔ３－Ｌ１の脂肪油滴量を数値化している。横軸は左、中央左、中央右、右の順に、分化誘導剤のみのコントロール（Ｄｉｆｆ）、ＭＶ０．１μｇ／ｍＬ（ＭＶ０．１）、ＭＶ１μｇ／ｍＬ（ＭＶ１）、ＭＶ１０μｇ／ｍＬ（ＭＶ１０）のそれぞれの濃度で添加した細胞群を示す。

【0064】

図５Ｂから、「ＬＣ９０３７」のＭＶを添加した場合は、分化誘導剤のみのコントロール（Ｄｉｆｆ）と変わらない脂肪油滴量の蓄積であった一方、「ＡＭ１１７７４」と「ＡＩ１２０６０」は０．１μｇ／ｍＬのＭＶ濃度で脂肪油滴量の蓄積に対し強い抑制効果が認められた。また、抑制効果は濃度依存的に増加していた。

【0065】

以上の結果から、ＡＭ、ＡＩのＨＫＢ、ＭＶに関し、脂肪細胞の脂肪油滴量の蓄積に強い抑制効果があり、また抑制効果は濃度依存的に増加することが確認できた。

【0066】

（実施例６）
〈ウェスタンブロットによるタンパク質発現解析〉
実施例４に従って培養した３Ｔ３－Ｌ１の２４ウェルプレートに細胞可溶化溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１％ ＮＰ－４０、０．１％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍＬ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を加え、細胞を溶解させた。この溶解液について１０％アクリルアミドゲルを使用して電気泳動を実施し、ゲル内のタンパク質を、セミドライ型転写装置を用いてイモビロンＰＶＤＦメンブランに転写した。

【0067】

転写後、メンブランをブロッキングし、抗ＰＰＡＲ－γラビットモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃２４４３Ｓ）、抗ＣＥＢＰ ラビットポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃２２９５Ｓ）および、抗ＧＡＰＤＨマウスモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ，＃ＡＭ４３００）の一次抗体溶液に一晩浸した。

【0068】

さらにペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体もしくは抗ラビットＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の二次抗体溶液に１時間浸した後、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍまたはＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてメンブラン上の目的タンパク質を検出した。

【0069】

なお、実施例９に登場するウェスタンブロットによるタンパク質発現解析の手法も実施例６と同様である。実施例９では内部標準としてＧＡＰＤＨの代わりにβ－ａｃｔｉｎを用いている。

【0070】

（実施例７）
〈リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析〉
実施例４に従って２４ウェルプレートで培養した３Ｔ３－Ｌ１を回収し、ｉｌｌｕｓｔｒａ ＲＮＡｓｐｉｎ ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ）を用い、所定の方法によりトータルＲＮＡを精製した。精製したＲＮＡをＧｏＳｃｒｉｐｔ（標章）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により逆転写を行い、ＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（標章）１２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、添付の操作手順に従ってリアルタイムＰＣＲを行った。

【0071】

なお、ＰＰＡＲ－γの遺伝子に対するプライマーは、公知のｍＲＮＡ塩基配列よりＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＰＰＡＲ－γ＿Ｆｗ（５´－ＧＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＡＣＡＧＧＡＡＡＧ－３´）、ＰＰＡＲ－γ＿Ｒｖ（５´－ＣＣＣＡＴＣＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴ－３´）を設計した。

【0072】

なお、実施例９に登場するリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析の手法も実施例７と同様である。

【0073】

実施例６、７の結果を図６（Ａ）～図６（Ｃ）に示す。図６（Ａ）～図６（Ｃ）は、ＡＭ、ＡＩのＨＫＢまたはＭＶが脂肪細胞の３Ｔ３－Ｌ１の分化を抑制する効果を有するか否かを、脂肪細胞の分化に関連のあるタンパク質発現量（図６（Ａ）、６（Ｂ））またはｍＲＮＡ発現量（図６（Ｃ））を介して検討したものである。各図において、「Ｎｏｎ－ｄｉｆｆ」は未分化の３Ｔ３－Ｌ１を表し、「Ｄｉｆｆ」は分化誘導処理のみをした３Ｔ３－Ｌ１を表す。「ＧＡＰＤＨ」は内部標準である。

【0074】

図６（Ａ）は、分化誘導剤の添加と同時にＡＭ１１７７４、ＡＩ１２０６０、およびＬＣ９０３７のＨＫＢを添加し、２日間の分化誘導後、５日間培養した後の３Ｔ３－Ｌ１のＰＰＡＲ－γおよびＣＥＢＰαタンパク質の発現量を、ウェスタンブロットにより確認した。

【0075】

ここで、ＰＰＡＲ－γは核内レセプタースーパーファミリーに属するタンパク質であり、脂肪細胞に分化した際に発現するマスターレギュレーターである。ＣＥＢＰαタンパク質はそのコファクターである。ＰＰＡＲ－γおよびＣＥＢＰαの各タンパク質の発現量を測定することにより、３Ｔ３－Ｌ１の分化度合いを確認できる。

【0076】

ＰＰＡＲ－γおよびＣＥＢＰαの各タンパク質の発現量を、ウェスタンブロットにより確認したところ、ＡＩ１２０６０およびＡＭ１１７７４のＨＫＢを添加した場合、添加量が０．１μｇ／ｍＬあたりからＰＰＡＲ－γおよびＣＥＢＰαの各タンパク質の発現が抑制された。

【0077】

また、図６（Ｂ）は、分化誘導剤の添加と同時にＡＭ１１７７４、ＡＩ１２０６０、およびＬＣ９０３７のＭＶを添加し、２日間の分化誘導後、５日間培養した後の３Ｔ３－Ｌ１のＰＰＡＲ－γおよびＣＥＢＰαタンパク質の発現量を、ウェスタンブロットにより確認した。その結果、図６（Ａ）のＨＫＢの場合と同様に、添加量が０．１μｇ／ｍＬあたりからＰＰＡＲ－γおよびＣＥＢＰαの各タンパク質の発現が抑制された。

【0078】

また、図６（Ｃ）は、図６（Ａ）および図６（Ｂ）におけるＰＰＡＲ－γのｍＲＮＡの発現量を示す。各細胞におけるＰＰＡＲ－γのｍＲＮＡ量は、内部標準のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量により補正した結果を示している。その結果、図６（Ａ）、図６（Ｂ）のタンパク質発現量と並行してｍＲＮＡの発現が抑制されていることが確認できた。

【0079】

以上の結果から、タンパク質発現のレベル、ｍＲＮＡ発現のレベルにおいて、ＡＭ、ＡＩのＨＫＢおよびＭＶが脂肪細胞の３Ｔ３－Ｌ１の分化を抑制する効果を有することが確認できた。従って、ＡＭおよびＡＩのＨＫＢおよびＭＶは抗肥満剤、特に、肥満細胞の分化抑制剤の有効成分とみなすことができた。

【0080】

（実施例８）
〈培養上清中のアディポネクチン量の測定〉
培養上清中のアディポネクチンの検出はＨｕｍａｎ Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ／Ａｃｒｐ３０ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＥＬＩＳＡ法により行った。Ｃａｐｔｕｒｅ抗体を所定の濃度にＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに１００μＬずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。各ウェルを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＢＳＡ／ＰＢＳ）を１００μＬずつ添加し、３７℃で９０分間ブロッキングを行った。

【0081】

ブロッキング後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳで１０００倍に希釈した培養上清を１００μＬずつ添加し、４℃で一晩反応させた。反応後、３回の洗浄操作を行い、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳで所定の濃度に希釈したＤｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体を１００μＬずつ添加し、室温で１２０分間反応させた後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳで所定の濃度に希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを１００μＬずつ添加し、暗中室温で２０分間反応させた。

【0082】

その後、洗浄液にて３回洗浄後、１－Ｓｔｅｐ（標章）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５０μＬずつ添加し、室温で２０分間反応させた。発色を確認後、２ＭのＨ_２ＳＯ_４を５０μＬずつ加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍおよび５９５ｎｍの吸光度を測定した。

【0083】

実施例８の結果を図７に示す。図７は、ＡＭ、ＡＩのＨＫＢまたはＭＶが脂肪細胞の３Ｔ３－Ｌ１の分化を抑制する効果を有するか否かを、アディポネクチンの分泌量を介して確認した結果である。アディポネクチンはアディポサイトカインの一種であり、分化した脂肪細胞から分泌される生理活性タンパク質である。

【0084】

図７は、ＨＫＢまたはＭＶ添加後３Ｔ３－Ｌ１を培養し、培養上清を回収して、アディポネクチン量をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す棒グラフである。「Ｎｏｎ－ｄｉｆｆ」は未分化の３Ｔ３－Ｌ１を指し、「Ｄｉｆｆ」は分化誘導処理のみをした３Ｔ３－Ｌ１を指す。縦軸がアディポネクチン量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸が各菌のＭＶまたはＨＫＢを添加した３Ｔ３－Ｌ１を示す。

【0085】

図７から、ＰＰＡＲ－γの発現量と同様に、ＡＩ１２０６０およびＡＭ１１７７４のＨＫＢ、ＭＶを添加した場合、３Ｔ３－Ｌ１によるアディポネクチンの培養上清への分泌量も少なかった。以上から、ＡＩ１２０６０およびＡＭ１１７７４のＨＫＢ、ＭＶは、３Ｔ３－Ｌ１の脂肪細胞への分化を抑制することがさらに確認できた。

【0086】

実施例１～８の結果から、ＡＭ、ＡＩのＨＫＢ、ＭＶが脂肪細胞への分化抑制効果を示すことが明らかとなった。そこで、実施例９以降ではアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌、特にアリスティペス インディスティンクタス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ）、アリスティペス ファインゴルディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）のＨＫＢ、ＭＶに焦点を当てて、分化抑制作用、脂肪蓄積抑制作用、蓄積した脂肪の減少作用の検討を行った。

【0087】

（実施例９）
〈ＡＩおよびＡＦの分化抑制作用の検討〉
実施例１～８の結果から、ＡＩのＨＫＢおよびＭＶがそれぞれ抗肥満作用、特に肥満細胞の分化抑制作用を有することが明らかとなった。そこで、同様の手法を用いて同じアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌であるＡＦが同様の作用を有するものであるかＡＩと併せて検討した。解析手法に関しては、これまでに説明してきた実施例１～７の解析手法と同様である。

【0088】

これらの結果を図８～１０に示す。まず、図８Ａ、８Ｂ、図９Ａ、９Ｂは、分化した脂肪細胞の特徴である脂肪油滴量の蓄積に対して、ＡＦ、ＡＩの腸内細菌が抑制効果を有するか否かを検討した。

【0089】

図８Ａ、８Ｂは分化誘導剤の添加と同時にＡＦ、ＡＩのＨＫＢを添加した３Ｔ３－Ｌ１のＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色の結果である。図８Ａは各菌のＨＫＢを０．０１μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬの範囲で添加し、２日間の分化誘導後、５日間培養した３Ｔ３－Ｌ１のＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色による染色像である。「Ｄｉｆｆ」は分化誘導剤のみのコントロールである。

【0090】

コントロールと比較して、ＡＦとＡＩは染色の度合いが濃度依存的に減少していくことが確認できた。

【0091】

また、図８Ｂは染色した３Ｔ３－Ｌ１からＯｉｌ ｒｅｄ Ｏを抽出し、吸光度により脂肪油滴量を数値化した棒グラフである。縦軸は吸光度を百分率で示しており、分化誘導剤のみのコントロール（Ｄｉｆｆ）を１００％とした場合の各添加条件における３Ｔ３－Ｌ１の脂肪油滴量を数値化している。横軸は左、中央左、中央右、右の順に、分化誘導剤のみのコントロール（Ｄｉｆｆ）、ＨＫＢ０．０１μｇ／ｍＬ（ＨＫＢ０．０１）、ＨＫＢ０．１μｇ／ｍＬ（ＨＫＢ０．１）、ＨＫＢ１μｇ／ｍＬ（ＨＫＢ１）のそれぞれの濃度で添加した細胞群を示す。

【0092】

図８Ｂから、分化誘導剤のみのコントロールと比較して、ＡＦおよびＡＩは０．０１μｇ／ｍＬのＨＫＢ濃度で脂肪油滴量の蓄積に対し強い抑制効果が認められ、その効果は濃度依存的に増加することが確認できた。

【0093】

図９Ａ、９Ｂは、分化誘導剤の添加と同時にＡＦ、ＡＩのＭＶを添加した３Ｔ３－Ｌ１のＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色の結果である。図９Ａは各菌のＭＶを０．０１μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬの範囲で添加し、２日間の分化誘導後、５日間培養した３Ｔ３－Ｌ１のＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色による染色像である。「Ｄｉｆｆ」は分化誘導剤のみのコントロールである。

【0094】

コントロールと比較して、ＡＦとＡＩは染色の度合いが濃度依存的に減少していくことが確認できた。

【0095】

また、図９Ｂは染色した３Ｔ３－Ｌ１からＯｉｌ ｒｅｄ Ｏを抽出し、吸光度により脂肪油滴量を数値化した棒グラフである。縦軸は吸光度を百分率で示しており、分化誘導剤のみのコントロール（Ｄｉｆｆ）を１００％とした場合の各添加条件における３Ｔ３－Ｌ１の脂肪油滴量を数値化している。横軸は左、中央左、中央右、右の順に、分化誘導剤のみのコントロール（Ｄｉｆｆ）、ＭＶ０．０１μｇ／ｍＬ（ＭＶ０．０１）、ＭＶ０．１μｇ／ｍＬ（ＭＶ０．１）、ＭＶ１μｇ／ｍＬ（ＭＶ１）のそれぞれの濃度で添加した細胞群を示す。

【0096】

図９Ｂから、分化誘導剤のみのコントロールと比較して、ＡＦおよびＡＩは０．０１μｇ／ｍＬのＭＶ濃度で脂肪油滴量の蓄積に対し強い抑制効果が認められ、その効果は濃度依存的に増加することが確認できた。

【0097】

以上の結果から、ＡＦ、ＡＩのＨＫＢ、ＭＶに関し脂肪細胞の脂肪油滴量の蓄積に強い抑制効果があり、また抑制効果は濃度依存的に増加することが確認できた。

【0098】

次に、図１０はＡＦ、ＡＩのＨＫＢまたはＭＶが脂肪細胞の３Ｔ３－Ｌ１の分化を抑制する効果を有するか否かを、脂肪細胞の分化に関連のあるタンパク質発現量（図１０（Ａ））またはｍＲＮＡ発現量（図１０（Ｂ））を介して確認したものである。

【0099】

なお、実施例９に登場するタンパク質発現解析の手法は実施例６と同様であるが、内部標準に関してはＧＡＰＤＨの代わりにβ－ａｃｔｉｎを用いている。

【0100】

図１０（Ａ）は、分化誘導剤の添加と同時にＡＦ、ＡＩのＨＫＢまたはＭＶを添加し、２日間の分化誘導後、５日間培養した後の３Ｔ３－Ｌ１のＰＰＡＲ－γおよびＣＥＢＰαタンパク質の発現量を、ウェスタンブロットにより確認した。

【0101】

ＡＦおよびＡＩのＨＫＢまたはＭＶを添加した場合、濃度依存的にＰＰＡＲ－γおよびＣＥＢＰαタンパク質の発現が抑制されたことが確認できた。

【0102】

また、図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）におけるＰＰＡＲ－γのｍＲＮＡの発現量を示す。各細胞におけるＰＰＡＲ－γのｍＲＮＡ量は、内部標準のβ－ａｃｔｉｎのｍＲＮＡ発現量により補正した結果を示している。その結果、図１０（Ａ）のタンパク質発現量と並行してｍＲＮＡの発現が抑制されていることが確認できた。

【0103】

以上の結果から、タンパク質発現のレベル、ｍＲＮＡ発現のレベルにおいて、ＡＦ、ＡＩのＨＫＢおよびＭＶが脂肪細胞の３Ｔ３－Ｌ１の分化を抑制する効果を有することが確認できた。従って、ＡＩと同様に、同じアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌であるＡＦのＨＫＢおよびＭＶも、脂肪細胞の分化抑制剤の有効成分とみなすことができた。

【0104】

（実施例１０）
〈ＡＩおよびＡＦの脂肪蓄積抑制作用の検討〉
実施例１～９までの検討により、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌、例えばＡＩおよびＡＦは抗肥満剤、特に脂肪細胞の分化抑制剤として有用であることが明らかとなった。

【0105】

つまり、本剤は、図１の前駆細胞１０２から小型脂肪細胞１０３へ分化する過程を抑制する作用を有する。そこで、実施例１０では、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌が、小型脂肪細胞１０３が脂肪滴を過剰に蓄積して肥大化脂肪細胞１０４を形成する過程を抑制する作用、すなわち脂肪蓄積抑制作用を有するか否か検討した。

【0106】

解析手法に関しては、これまでに説明してきた実施例１～３，５の解析手法と同様である。ただし、ＡＦ、ＡＩが脂肪蓄積抑制作用を有するか検討するため、実施例４の手法のみ一部変更した（以下、「実施例４Ａ」という）。詳細は以下の通りである。

【0107】

〈〈実施例４Ａ〉〉
２４ウェルプレートに３Ｔ３－Ｌ１を所定の細胞数（１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で播種し、３７℃、５％のＣＯ_２下でコンフルエントより３日後の状態まで、計６日間培養した。

【0108】

その後、ＡｄｉｐｏＩｎｄｕｃｅｒ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）の分化誘導剤であるＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、３－Ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅおよびＩｎｓｕｌｉｎをそれぞれが終濃度２．５μＭ、０．５ｍＭおよび１０μｇ／ｍＬとなるように加えた１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを添加して３日間培養した。

【0109】

３日後、１０μｇ／ｍＬのＩｎｓｕｌｉｎ含有１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに交換し、同時に１μｇ／ｍＬの各菌のＭＶを処置したウェルと無処置のウェルを作製し、さらに２１日間の培養を行った。培地交換は２～３日ごとに５００μＬの各菌のＭＶを含むＩｎｓｕｌｉｎ含有１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで行った。その後、その細胞を用いて細胞内の油滴量をＯｉｌｒｅｄ Ｏを用いて検討した。

【0110】

結果を図１１Ａ、１１Ｂに示す。図１１Ａ、１１Ｂは分化誘導剤の添加から培養３日後にＡＦ、ＡＩのＭＶを添加した３Ｔ３－Ｌ１のＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色の結果である。図１１ＡはＡＦ、ＡＩのＭＶを１ μｇ／ｍＬ添加し、２１日間の培養を行った後の３Ｔ３－Ｌ１のＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色による染色像である。「Ｃｔｒｌ」は分化誘導剤のみのコントロールである。コントロールと比較して、ＡＦとＡＩは染色の度合いが明らかに減少していた。

【0111】

また、図１１Ｂは染色した３Ｔ３－Ｌ１からＯｉｌ ｒｅｄ Ｏを抽出し、吸光度により脂肪油滴量を数値化した棒グラフである。縦軸は吸光度を百分率で示しており、分化誘導剤のみのコントロール（Ｃｔｒｌ）を１００％とした場合の各添加条件における３Ｔ３－Ｌ１の脂肪油滴量を数値化している。横軸は左、中央、右の順に、コントロール、ＡＩのＭＶ、ＡＦのＭＶをそれぞれ添加した細胞群を示す。

【0112】

図１１Ｂから、コントロールと比較して、ＡＦおよびＡＩは脂肪油滴量の蓄積に対し強い抑制効果が認められた。

【0113】

以上の検討から、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌、例えばＡＩおよびＡＦは抗肥満剤、特に脂肪細胞の脂肪蓄積抑制剤としても有用であることが明らかとなった。つまり、本剤は小型脂肪細胞１０３が脂肪滴を過剰に蓄積して肥大化脂肪細胞１０４を形成する過程を抑制する作用を有する。

【0114】

（実施例１１）
〈ＡＩおよびＡＦの蓄積した脂肪の減少作用の検討〉
実施例１～１０までの検討により、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌、例えばＡＩおよびＡＦは抗肥満剤、特に脂肪細胞の分化抑制剤または脂肪蓄積抑制剤として有用であることが明らかとなった。

【0115】

そこで、実施例１１では、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌が肥大化脂肪細胞１０４に既に蓄積した脂肪滴を減少させる作用を有するか否か検討した。

【0116】

解析手法に関しては、これまでに説明してきた実施例１～３，５の解析手法と同様である。ただし、ＡＦ、ＡＩが蓄積した脂肪の減少作用を有するか検討するため、実施例４の手法のみ一部変更した（以下、「実施例４Ｂ」という）。詳細は以下の通りである。

【0117】

〈〈実施例４Ｂ〉〉
２４ウェルプレートに３Ｔ３－Ｌ１を所定の細胞数（１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下でコンフルエントより３日後の状態まで、計６日間培養した。

【0118】

その後、ＡｄｉｐｏＩｎｄｕｃｅｒ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）の分化誘導剤であるＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、３－Ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅおよびＩｎｓｕｌｉｎをそれぞれが終濃度２．５μＭ、０．５ｍＭおよび１０μｇ／ｍＬとなるように加えた１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを添加して２日間培養した。

【0119】

２日後、１０μｇ／ｍＬのＩｎｓｕｌｉｎ含有１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに交換し、さらに２１日間の培養を行い、肥大化脂肪細胞を作製した。培地交換は２～３日ごとに５００μＬのＩｎｓｕｌｉｎ含有１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで行った。

【0120】

その後、１μｇ／ｍＬの各菌のＭＶを処置したウェルと無処置のウェルを作製し、２～３日ごとに各菌のＭＶを含むＩｎｓｕｌｉｎ含有１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで培地交換を行いながら、引き続き１０日間培養した。その細胞を用いて細胞内の油滴量をＯｉｌｒｅｄ Ｏを用いて検討した。

【0121】

結果を図１２Ａ、１２Ｂに示す。図１２Ａ、１２Ｂは分化誘導剤を添加して肥大化脂肪細胞を作製した後に、ＡＦ、ＡＩのＭＶを添加した３Ｔ３－Ｌ１のＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色の結果である。図１２ＡはＡＦ、ＡＩのＭＶを１ μｇ／ｍＬ添加し、１０日間の培養を行った後の３Ｔ３－Ｌ１のＯｉｌ－ｒｅｄ Ｏ染色による染色像である。「Ｃｔｒｌ」は分化誘導剤のみのコントロールである。コントロールと比較して、ＡＦとＡＩは染色の度合いが明らかに減少していた。

【0122】

また、図１２Ｂは染色した３Ｔ３－Ｌ１からＯｉｌ ｒｅｄ Ｏを抽出し、吸光度により脂肪油滴量を数値化した棒グラフである。縦軸は吸光度を百分率で示しており、分化誘導剤のみのコントロール（Ｃｔｒｌ）を１００％とした場合の各添加条件における３Ｔ３－Ｌ１の脂肪油滴量を数値化している。横軸は左、中央、右の順に、コントロール、ＡＩのＭＶ、ＡＦのＭＶをそれぞれ添加した細胞群を示す。

【0123】

図１２Ｂから、コントロールと比較して、ＡＦおよびＡＩは脂肪油滴量の蓄積に対し強い減少効果が認められた。

【0124】

以上の検討から、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌、例えばＡＩおよびＡＦは抗肥満剤、特に脂肪細胞の蓄積した脂肪の減少剤としても有用であることが明らかとなった。つまり、本剤は肥大化脂肪細胞１０４が既に蓄積した脂肪滴を減少させる作用を有する。

【0125】

以上実施例１～１１の結果から、本発明の抗肥満剤は、前駆細胞１０２が小型脂肪細胞１０３へ分化する過程を抑制し、小型脂肪細胞１０３が脂肪滴を過剰に蓄積して肥大化脂肪細胞１０４を形成する過程を抑制し、さらに肥大化脂肪細胞１０４が既に蓄積した脂肪滴を減少させる作用を有することが明らかとなった。

【0126】

また、実施例中、発明者等はアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌から加熱死菌体（ＨＫＢ）および膜小胞（ＭＶ）を単離して各試験に使用したが、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌自体が有効成分を生成するのであるから、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌自体を抗肥満剤に含有させても有効に作用する。

【0127】

また、これまで示してきた特徴から、本発明は、抗肥満剤としてだけではなく、糖尿病治療剤、高脂血症治療剤、高血圧治療剤、または生活習慣病治療剤、またはそれらの疾患の予防剤としても有効に作用する。

【0128】

また、本発明の抗肥満剤は、有効成分であるアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）細菌を、下限として１日当たり１×１０^２個以上、より好ましくは１×１０^６個以上摂取することが望ましい。また上限として１日当たり１×１０^１５個以下、より好ましくは１×１０^１１個以下接種することが望ましい。

【0129】

また、本発明の抗肥満剤の摂取期間は、理想的には肥満が解消されるまで長期間にわたり継続的に摂取することが望ましい。その効果をよりよく発揮するために、下限として、例えば、４週間以上継続的に摂取することが好ましく、また数か月から数年以上継続的に摂取することがより好ましい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】