特開 2024-32967 ジスフェリン二重ベクターを用いた遺伝子治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024032967

(43)【公開日】2024-03-12

(54)【発明の名称】ジスフェリン二重ベクターを用いた遺伝子治療

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20240305BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240305BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240305BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/864 100Z

C12N7/01

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

A61K48/00

A61P21/00

A61K35/76

C12N5/10

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024014797

(22)【出願日】2024-02-02

(62)【分割の表示】P 2022567513の分割

【原出願日】2021-05-12

(31)【優先権主張番号】63/024,338

(32)【優先日】2020-05-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】515289842

【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ルイーズ ロディーノ－クラパック

(57)【要約】

【課題】ジスフェリン二重ベクターを用いた遺伝子治療の提供。
【解決手段】ヒトジスフェリンタンパク質の断片をコードする組換えポリヌクレオチドが本明細書に記載される。さらに、そのような組換えポリヌクレオチドを含むプラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、細胞、および組成物がさらに記載される。そのような組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、細胞および組成物は、ジスフェリン異常症を処置するために使用され得る。ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、三好ミオパチー、および遠位前方コンパートメントミオパチーを含む常染色体劣性障害であり、これらは総称してジスフェリン異常症として知られる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１３日に出願された米国仮出願第６３／０２４，３３８号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張し、この仮出願の内容は参考として本出願に援用される。

【0002】

電子提出物の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の部分として、その全体が参照により組み込まれ、以下のように識別されるコンピュータ可読形式の配列表を含む：ファイル名：１０６８８７＿８０７０＿ＳＬ．ｔｘｔ；サイズ：１２９，１２３バイト、作成；２０２１年５月１１日。

【0003】

技術分野
本開示は、ヒトジスフェリン遺伝子の断片を含むポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むプラスミド、ウイルスベクター、細胞、および組成物、ならびに、ジスフェリン欠損症、例えば肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型、ミオシミオパシーおよび遠位前方コンパートメントミオパチーを有する対象を処置するためにそのようなポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、および組成物を使用する方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

背景
ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、三好ミオパチー、および遠位前方コンパートメントミオパチーを含む常染色体劣性障害であり、これらは総称してジスフェリン異常症として知られる。肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）は、世界中で１／１００，０００～１／２００，０００の発生率が報告されている米国で最も一般的なＬＧＭＤの１つである。三好ミオパチーは、ジスフェリン異常症のより限定された遠位下肢形態である。実際、疾患範囲を考慮すると、ＬＧＭＤ２Ｂは、腓腹筋の萎縮によって遠位で始まることが多く、その後、時間とともに広がり近位筋に影響を及ぼす。ジスフェリンの喪失は、慢性筋線維喪失、炎症、脂肪置換および線維症を伴う進行性型のジストロフィーをもたらし、これらはすべて筋力低下の悪化につながる。

【0005】

ジスフェリン遺伝子は大きく、これまでに同定された５５個のエクソンはゲノムＤＮＡの少なくとも１５０ｋｂに及んでいる。これらのエクソンは、およそ６．５ｋｂのｃＤＮＡおよび２，０８８アミノ酸のタンパク質を予測する。ジスフェリンは、Ｃ末端疎水性膜貫通ドメインと、複数のＣ２ドメインを有するより長い細胞質配向親水性領域とで構成される２３７ｋＤａのタンパク質である。ジスフェリンの欠損は、骨格筋のＣａ^２＋依存性膜修復を損なうことが、多くの研究により示されている（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４０８４－４０８８，２００１；Ｓｃｈｎｅｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３４９５－３５０４，２００３）。さらに、ジスフェリンは、アネキシンＡ１およびＡ２、ＡＨＮＡＫ、およびカベオリン－３を含む膜修復に関与する他のタンパク質と相互作用することが示されている。骨格筋が機械的に活動的であり、損傷を受けやすいことを考慮すると、このシステムの重要性が強調される。したがって、強固な膜再封機構が存在しなければならない。ジスフェリンが存在しないかまたは突然変異していると、膜修復が損なわれ、筋線維壊死から始まる一連の事象が起こり、筋線維の喪失および進行性の四肢衰弱が生じる。筋線維再生能力の喪失は、ジスフェリン欠乏の寄与する結果であると考えられる。ジスフェリンはまた、小胞輸送およびエンドサイトーシス、Ｔ小管形成などに関連している。

【0006】

ジスフェリン遺伝子の突然変異は、総称してジスフェリン異常症として知られる肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、三好ミオパチーおよび遠位前方コンパートメントミオパチーを含む対立遺伝子常染色体劣性障害を引き起こす（例えば、Ｇｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７：ｅ３９２３３，２０１２，Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，１６８－１７２，２００３，Ｍｏｏｒｅ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ ６５：９９５－１００３，２００６，Ｒｏｓａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖ ４２：１４－２１，２０１０，Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｓ ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｎｅｕｒｏｌ．２：２５６－２７０，２０１５，Ｅｖｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：２８５２９－２８５３９，２０１０、およびＫｌｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２１：１７６８－１７７６，２００７を参照のこと。それらは各々参照によりその全体が組み込まれる）。ジスフェリン欠乏症のあまり一般的でない表現型は、硬性脊椎症候群を呈する（Ｋｌｉｎｇｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ４１：１６６－１７３，２０１０、これは参照によりその全体が組み込まれる）。典型的には、患者は２０代前半に徐々に進行する衰弱および高血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を呈する。患者の約１／３が発症後１５年以内に車椅子に依存するようになる。臨床的には、心臓は温存され、認知機能は影響を受けない。筋力低下の分布が比較的制限された表現型バリアントは、この障害の生活の質に大きく影響し得る潜在的な局所遺伝子置換治療の段階を設定した（Ｇｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３９２３３，２０１２，Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ４２：２２－２９，２０１０）。単一ヌクレオチド変化は典型的なＤＹＳＦ遺伝子突然変異であり、これはまた、導入遺伝子産物を免疫拒絶から保護するのに役立つ遺伝子導入の成功に有利である（Ｒｏｄｉｎｅ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：１０９－１１７，２０１０，Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３：１４２９－１４３７，２０１０，Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６６：２９０－２９７，２００９、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。）。
ジスフェリン異常症のための治療法も処置もない。集合的に、遺伝子置換または代用遺伝子置換を評価した前臨床研究は、複数の戦略が膜修復の回復においていくらかの有効性を示すことを示した。ジスフェリン遺伝子は、１５０ｋｂのゲノムＤＮＡを包含する５５個のエクソンを含み、その関連ｃＤＮＡは６．５ｋｂである。しかし、遺伝子置換の場合、ＡＡＶのパッケージング限界は４．７ｋｂであり、これは６．５ｋｂのジスフェリンのｃＤＮＡ配列よりも低い。したがって、機能的全長ジスフェリンタンパク質を必要とする対象に送達することができる新しい機構を必要とするＬＧＭＤ２Ｂの処置が必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４０８４－４０８８，２００１

【非特許文献2】Ｓｃｈｎｅｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３４９５－３５０４，２００３

【非特許文献3】Ｇｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７：ｅ３９２３３，２０１２

【非特許文献4】Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３，１６８－１７２，２００３

【非特許文献5】Ｍｏｏｒｅ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ ６５：９９５－１００３，２００６

【非特許文献6】Ｒｏｓａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖ ４２：１４－２１，２０１０

【非特許文献7】Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｓ ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｎｅｕｒｏｌ．２：２５６－２７０，２０１５

【非特許文献8】Ｅｖｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：２８５２９－２８５３９，２０１０

【非特許文献9】Ｋｌｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２１：１７６８－１７７６，２００７

【非特許文献10】Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ４２：２２－２９，２０１０

【非特許文献11】Ｒｏｄｉｎｅ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：１０９－１１７，２０１０

【非特許文献12】Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３：１４２９－１４３７，２０１０

【非特許文献13】Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６６：２９０－２９７，２００９

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

要旨
ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードする組換えポリヌクレオチドであって、組換えポリヌクレオチドが第１のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列が、（ａ）配列番号１、６、または１８のヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１、６、または１８のそれぞれの全長にわたって配列番号１、配列番号６、または配列番号１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号１３または１５のそれぞれの全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｅ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、断片が配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｆ）（ｅ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｅ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列、からなる、組換えポリヌクレオチドが本明細書において開示される。

【0009】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、プロモーター、イントロン、選択マーカーまたは複製起点（ＯＲＩ）から選択される１またはそれを超える追加のヌクレオチド配列をさらに含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ＩＴＲを含む追加のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＡＡＶ３ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは２つのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３または配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、プロモーターを含む追加のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは筋肉特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、デスミンプロモーター、骨格アルファ－アクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合エレメント、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子から選択される。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモーターはＭＨＣＫ７プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは組換えプロモーターである。いくつかの実施形態では、組換えプロモーターは組換え筋肉特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、組換え筋肉特異的プロモーターは、組換えミオシン重鎖クレアチンキナーゼ筋肉特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、イントロンを含む追加のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、５’ドナー部位、分岐点、および／または３’スプライス部位を含む。いくつかの実施形態では、イントロンはキメライントロンである。いくつかの実施形態では、イントロンは、ヒトβ－グロビン遺伝子由来の５’ドナー部位を含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖由来の分岐点を含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖由来の３’スプライスアクセプター部位を含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、選択マーカーを含む追加のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、β－ラクタマーゼ遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子である。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号６または配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0014】

いくつかの実施形態では、組換えヌクレオチドは、１またはそれを超えるＩＴＲ以外のＡＡＶ配列を含まない。

【0015】

いくつかの実施形態では、組換えヌクレオチドは、１またはそれを超えるＩＴＲ以外のウイルス配列を含まない。

【0016】

ヒトジスフェリンタンパク質の断片をコードする組換えポリヌクレオチド配列であって、組換えポリヌクレオチドが第２のヌクレオチド配列を含み、第２のヌクレオチド配列が、（ａ）配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２、８または１９のそれぞれの全長にわたって配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号１４または１６のそれぞれの全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｅ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド配列；または（ｆ）（ｄ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｅ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列、からなる、組換えポリヌクレオチド配列が本明細書において開示される。

【0017】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、選択マーカー、複製起点（ＯＲＩ）、非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む１またはそれを超える追加のヌクレオチド配列をさらに含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ＩＴＲを含む追加のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＡＡＶ３ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、組換えヌクレオチドは２つのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３または１７のヌクレオチド配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ポリＡシグナルを含むヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルは人工ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、選択マーカーを含む追加のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、β－ラクタマーゼ遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子である。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、組換えヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第１の断片をコードする第１のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0022】

いくつかの実施形態では、組換えヌクレオチドは、１またはそれを超えるＩＴＲ以外のＡＡＶ配列を含まない。

【0023】

いくつかの実施形態では、組換えヌクレオチドは、１またはそれを超えるＩＴＲ以外のウイルス配列を含まない。

【0024】

（ａ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質のＮ末端断片をコードする第１の組換えポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶベクターであって、第１の組換えポリヌクレオチドが第１のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号１、６または１８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１、６または１８のそれぞれの全長にわたって配列番号１、配列番号６または１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５のそれぞれの全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、断片が配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列からなる、第１のＡＡＶベクター；および（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質のＣ末端断片をコードする第２の組換えポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶベクターであって、第２の組換えポリヌクレオチドが第２のヌクレオチド配列を含み、第２のヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号２、８、または１９のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２、８または１９のそれぞれの全長にわたって配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６のそれぞれの全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列からなる、第２のＡＡＶベクター、を含む、二重アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムが本明細書においてさらに開示される。

【0025】

本明細書中にさらに開示されるのは、本明細書中に開示される組換えポリヌクレオチドのいずれかを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ヒトジスフェリンタンパク質のＮ末端断片をコードする。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ヒトジスフェリンタンパク質のＣ末端断片をコードする。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．２０、またはＡＡＶｒｈ．７４である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶｒｈ．７４である。

【0026】

本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物である。

【0027】

（ａ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質のＮ末端断片をコードする第１の組換えポリヌクレオチドを含む第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、第１の組換えポリヌクレオチドが第１のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号１、６または１８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１、６または１８のそれぞれの全長にわたって配列番号１、配列番号６または１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５のそれぞれの全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、断片が配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列からなる、第１のｒＡＡＶベクター；および（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質のＣ末端断片をコードする第２の組換えポリヌクレオチドを含む第２のｒＡＡＶベクターであって、第２の組換えポリヌクレオチドが第２のヌクレオチド配列を含み、第２のヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号２、８、または１９のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２、８または１９のそれぞれの全長にわたって配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６のそれぞれの全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列からなる、第２のｒＡＡＶベクター、を含む、組成物が本明細書においてさらに開示される。

【0028】

いくつかの実施形態では、第１および第２のｒＡＡＶベクターのモル比は、約１００：１～１：１００、約１０：１～１：１０、約２：１～１：２または約１：１である。

【0029】

（ａ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）配列番号１または６のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１または６の全長にわたって配列番号１または６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５の全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第２のＩＴＲを含み、ポリヌクレオチドが、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲに挟まれている、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、本明細書においてさらに開示される。

【0030】

いくつかの実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＡＡＶ３ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＩＴＲは、配列番号３または１７のヌクレオチド配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、プロモーター、イントロン、選択マーカー、または複製起点（ＯＲＩ）を含む１またはそれを超える追加のポリヌクレオチド配列をさらに含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、プロモーターを含む追加のポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは筋肉特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、ミオシン重鎖複合体－Ｅボックス筋肉クレアチンキナーゼ融合エンハンサー／プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは組換えプロモーターである。いくつかの実施形態では、組換えプロモーターは組換え筋肉特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、組換え筋肉特異的プロモーターはＭＨＣＫ７プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、イントロンを含む追加のポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、５’ドナー部位、分岐点、および／または３’スプライス部位を含む。いくつかの実施形態では、イントロンはキメライントロンである。いくつかの実施形態では、イントロンは、ヒトβ－グロビン遺伝子由来の５’ドナー部位を含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖由来の分岐点を含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖由来の３’スプライスアクセプター部位を含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、選択マーカーを含む追加のポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、β－ラクタマーゼ遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号６または配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0036】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、１またはそれを超えるＩＴＲ以外のＡＡＶ配列を含まない。

【0037】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、１またはそれを超えるＩＴＲ以外のウイルス配列を含まない。

【0038】

（ａ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号２または８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２または８の全長にわたって配列番号２または８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６の全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド；または（ｖｉ）（ｖ）のポリヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第２のＩＴＲを含み、ポリヌクレオチドが、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲに挟まれている、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、本明細書においてさらに開示される。

【0039】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、選択マーカー、複製起点（ＯＲＩ）、非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む１またはそれを超えるポリヌクレオチド配列をさらに含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＡＡＶ３ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３または１７のヌクレオチド配列を含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ポリＡシグナルを含む追加のポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルは人工ポリＡシグナルである。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、選択マーカーを含む追加のポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、β－ラクタマーゼ遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子である。

【0043】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号８または配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0045】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、１またはそれを超えるＩＴＲ以外のＡＡＶ配列を含まない。

【0046】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、１またはそれを超えるＩＴＲ以外のウイルス配列を含まない。

【0047】

以下を含む、二重アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムが本明細書において開示される：（Ｉ）（ａ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）配列番号１または６のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１または６の全長にわたって配列番号１または６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５の全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号９のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第２のＩＴＲを含む、第１のＡＡＶベクターであって、ポリヌクレオチドが第１および第２のＩＴＲに挟まれている、第１のＡＡＶベクター；（ＩＩ）第２のＡＡＶベクターであって、（ａ）第３の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）配列番号２または８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２または８の全長にわたって配列番号２または８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６の全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号１０のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第４のＩＴＲを含む、第２のＡＡＶベクターであって、ポリヌクレオチドが第３および第４のＩＴＲに挟まれている、第２のＡＡＶベクター。

【0048】

（ａ）本明細書において開示される組換えポリヌクレオチドを含むプラスミド；（ｂ）アデノウイルスヘルパープラスミド；および（ｃ）ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）パッケージングシステムが、本明細書においてさらに開示される。いくつかの例では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ｐＨＥＬＰプラスミドを含む。

【0049】

（ａ）本明細書において開示される組換えポリヌクレオチドを含むプラスミド；および（ｂ）アデノウイルスヘルパープラスミドを含む、アデノ随伴ウイルスパッケージングシステムが、本明細書においてさらに開示される。いくつかの例では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ｐＨＥＬＰプラスミドを含む。

【0050】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生する方法であって、細胞をＡＡＶパッケージングシステムと接触させることを含み、ＡＡＶパッケージングシステムが、（ａ）本明細書において開示される組換えポリヌクレオチドを含むプラスミド；（ｂ）アデノウイルスヘルパープラスミド；および（ｃ）ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドを含む、方法が本明細書においてさらに開示される。いくつかの例では、細胞は宿主細胞であり、必要に応じて哺乳動物宿主細胞であり、さらに必要に応じてＨＥＫ２９３である。

【0051】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生する方法であって、パッケージング細胞株にＡＡＶパッケージングシステムを形質導入することを含み、ＡＡＶパッケージングシステムが、（ａ）本明細書に開示される組換えポリヌクレオチドのいずれかを含むＡＡＶ発現カセットを含むプラスミド；および（ｂ）アデノウイルスヘルパープラスミドを含み、パッケージング細胞株が、アデノ随伴ウイルスのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現する、方法が本明細書においてさらに開示される。いくつかの例では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子はＲｅｐ７８である。いくつかの例では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子はＲｈ７４ ｃａｐ遺伝子である。

【0052】

本明細書中にさらに開示されるのは、本明細書中に開示される組換えポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞である。

【0053】

ＡＡＶ発現カセットを含む細胞が本明細書にさらに開示され、ＡＡＶ発現カセットは本明細書に開示される組換えポリヌクレオチドのいずれかを含む。いくつかの例において、プラスミドは、配列番号１８または１９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチドを含む。いくつかの例において、プラスミドは配列番号１８または１９のポリヌクレオチドを含む。

【0054】

ジスフェリン異常症を処置する方法であって、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、（ａ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質のＮ末端をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む有効量の第１の組換えポリヌクレオチドであって、第１のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号１、６または１８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１、６または１８のそれぞれの全長にわたって配列番号１、配列番号６または１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５のそれぞれの全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列からなる、有効量の第１の組換えポリヌクレオチド；および（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質のＣ末端断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む有効量の第２の組換えポリヌクレオチドであって、第２のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号２、８、または１９のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２、８または１９のそれぞれの全長にわたって配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６のそれぞれの全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列からなる、有効量の第２の組換えポリヌクレオチド、を投与することを含む方法が本明細書においてさらに開示される。

【0055】

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは筋肉内または静脈内投与される。

【0056】

いくつかの実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、同時または順次投与される。

【0057】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0058】

ジスフェリン異常症を処置する方法であって、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、（ａ）有効量の第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質のＮ末端をコードする第１のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドが、（ｉ）配列番号１または６のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１または６の全長にわたって配列番号１または６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５の全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号９のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；からなる、有効量の第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および、（ｂ）有効量の第２のＡＡＶベクターであって、ヒトジスフェリンタンパク質のＣ末端断片をコードする第２のポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドが、（ｉ）配列番号２または８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２または８の全長にわたって配列番号２または８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６の全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号１０のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド；からなる、有効量の第２のＡＡＶベクターを、投与することを含む方法が本明細書においてさらに開示される。

【0059】

いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第１および第２のＡＡＶベクターは同時に投与される。

【0060】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0061】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症を処置する方法は、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、有効量の本明細書に開示されるＡＡＶ二重ベクターシステムのいずれかを投与することを含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ二重ベクターシステムは、筋肉内または静脈内に投与する。

【0063】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0064】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症を処置する方法は、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、有効量の本明細書に開示される組成物のいずれかを投与することを含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、組成物は筋肉内または静脈内投与される。

【0066】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0067】

本明細書でさらに開示されるのは、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象のジスフェリン異常症を処置するための医薬の製造における組成物の使用であり、組成物は、（ａ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質のＮ末端をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む第１の組換えポリヌクレオチドであって、第１のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号１、６または１８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１、６または１８のそれぞれの全長にわたって配列番号１、配列番号６または１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５のそれぞれの全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列からなる、第１の組換えポリヌクレオチド；および（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質のＣ末端断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えポリヌクレオチドであって、第２のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号２、８、または１９のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２、８または１９のそれぞれの全長にわたって配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６のそれぞれの全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列からなる、第２の組換えポリヌクレオチドを含む。

【0068】

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、同時に投与される。

【0069】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0070】

本明細書で開示されるのは、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象のジスフェリン異常症を処置するための医薬の製造における組成物の使用であり、組成物は、（ａ）有効量の第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質のＮ末端をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含み、第１のポリヌクレオチドが、（ｉ）配列番号１または６のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１または６の全長にわたって配列番号１または６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５の全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号９のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；からなる、有効量の第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および、（ｂ）有効量の第２のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ヒトジスフェリンタンパク質のＣ末端断片をコードする第２のポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドが、（ｉ）配列番号２または８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２または８の全長にわたって配列番号２または８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６の全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号１０のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド；からなる、有効量の第２のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第１および第２のＡＡＶベクターは同時に投与される。

【0072】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0073】

ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象におけるジスフェリン異常症を処置するための医薬の製造における組成物の使用であって、組成物が本明細書において開示されるＡＡＶ二重ベクターシステムのいずれかを含む、使用が本明細書において開示される。

【0074】

いくつかの実施形態では、組成物は筋肉内または静脈内投与される。

【0075】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0076】

ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象におけるジスフェリン異常症を処置するための医薬の製造における、開示される組成物のいずれかの使用が本明細書において開示される。

【0077】

いくつかの実施形態では、組成物は筋肉内または静脈内投与される。

【0078】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0079】

いくつかの実施形態では、有効量の第１のＡＡＶベクターは、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１ｘ１０^６～１ｘ１０^１６ｖｇ／ｋｇ、約１ｘ１０^８～１ｘ１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約１ｘ１０^１０～１ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇである。

【0080】

いくつかの実施形態では、有効量の第２のＡＡＶベクターは、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１ｘ１０^６～１ｘ１０^１６ｖｇ／ｋｇ、約１ｘ１０^８～１ｘ１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約１ｘ１０^１０～１ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇである。

【0081】

いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、少なくとも１、２、３、４、または５回投与される。

【0082】

いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、少なくとも１、２、３、４、または５回投与される。

【0083】

いくつかの実施形態では、有効量のＡＡＶ二重ベクターシステムは、約１ｘ１０^１０～１ｘ１０^１３ベクターゲノム（ｖｇ）、約１ｘ１０^１１～１ｘ１０^１３ｖｇ、１ｘ１０^１２～１ｘ１０^１３ｖｇである。

【0084】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ二重ベクターシステムは、少なくとも１、２、３、４、または５回投与される。

【0085】

いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、約１ｘ１０^１０～１ｘ１０^１３ベクターゲノム（ｖｇ）、約１ｘ１０^１１～１ｘ１０^１３ｖｇ、１ｘ１０^１２～１ｘ１０^１３ｖｇである。

【0086】

いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１、２、３、４、または５回投与される。

【0087】

ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドであって、組換えポリヌクレオチド配列が、配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチドが本明細書において開示される。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。

【0088】

ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを作製する方法であって、組換えポリヌクレオチド配列が、配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、方法が、細胞を、ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質のＮ末端をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドであって、第１のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号１、６または１８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１、６または１８のそれぞれの全長にわたって配列番号１、配列番号６または１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５のそれぞれの全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列からなる、組換えポリヌクレオチド；および（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質のＣ末端断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えポリヌクレオチドであって、第２のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号２、８、または１９のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２、８または１９のそれぞれの全長にわたって配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６のそれぞれの全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列からなる、第２の組換えポリヌクレオチドと、接触させることを含む、方法が本明細書において開示される。

【0089】

ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを作製する方法であって、組換えポリヌクレオチドが、配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、方法が、細胞を、以下を含む二重ＡＡＶベクターシステムと接触させることを含む、方法が本明細書において開示される。（Ｉ）（ａ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）配列番号１または６のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１または６の全長にわたって配列番号１または６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５の全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号９のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第２のＩＴＲを含む、第１のＡＡＶベクターであって、ポリヌクレオチドが第１および第２のＩＴＲに挟まれている、第１のＡＡＶベクター；（ＩＩ）第２のＡＡＶベクターであって、（ａ）第３の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号２または８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２または８の全長にわたって配列番号２または８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６の全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号１０のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第４のＩＴＲを含む、第２のＡＡＶベクターであって、ポリヌクレオチドが第３および第４のＩＴＲに挟まれている、第２のＡＡＶベクター。

【0090】

いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、筋肉細胞、心臓細胞、幹細胞、衛星細胞、および／または肝臓細胞である。

【0091】

ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを作製する方法であって、組換えポリヌクレオチド配列が、配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、方法が、細胞を、ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質のＮ末端をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドであって、第１のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号１、６または１８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１、６または１８のそれぞれの全長にわたって配列番号１、配列番号６または１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５のそれぞれの全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列からなる、組換えポリヌクレオチド；および（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質のＣ末端断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えポリヌクレオチドであって、第２のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号２、８、または１９のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２、８または１９のそれぞれの全長にわたって配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６のそれぞれの全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列からなる、第２の組換えポリヌクレオチドを、対象に投与することを含む、方法が本明細書において開示される。

【0092】

ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを作製する方法であって、組換えポリヌクレオチドが、配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、方法が、以下を含む二重ＡＡＶベクターシステムを対象に投与することを含む、方法が本明細書において開示される。（Ｉ）（ａ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）配列番号１または６のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１または６の全長にわたって配列番号１または６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５の全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号９のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第２のＩＴＲを含む、第１のＡＡＶベクターであって、ポリヌクレオチドが第１および第２のＩＴＲに挟まれている、第１のＡＡＶベクター；（ＩＩ）第２のＡＡＶベクターであって、（ａ）第３の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）配列番号２または８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２または８の全長にわたって配列番号２または８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６の全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号１０のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第４のＩＴＲを含む、第２のＡＡＶベクターであって、ポリヌクレオチドが第３および第４のＩＴＲに挟まれている、第２のＡＡＶベクター。

【0093】

対象における、対象の筋ジストロフィーを処置する方法であって、ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドの発現を含み、組換えポリヌクレオチド配列が、配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、方法が本明細書で開示される。

【0094】

いくつかの実施形態では、本方法は、対象に、（ａ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質のＮ末端をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む第１の組換えポリヌクレオチドであって、第１のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号１、６または１８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１、６または１８のそれぞれの全長にわたって配列番号１、配列番号６または１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５のそれぞれの全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列からなる、第１の組換えポリヌクレオチド；および（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質のＣ末端断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えポリヌクレオチドであって、第２のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号２、８、または１９のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２、８または１９のそれぞれの全長にわたって配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６のそれぞれの全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列からなる、第２の組換えポリヌクレオチド、を投与することを含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、本方法は、二重ＡＡＶベクターシステムを有する対象に投与することを含み、二重ＡＡＶベクターシステムは以下を含む。（Ｉ）（ａ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）配列番号１または６のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１または６の全長にわたって配列番号１または６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５の全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号９のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第２のＩＴＲを含む、第１のＡＡＶベクターであって、ポリヌクレオチドが第１および第２のＩＴＲに挟まれている、第１のＡＡＶベクター；（ＩＩ）第２のＡＡＶベクターであって、（ａ）第３の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）配列番号２または８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２または８の全長にわたって配列番号２または８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６の全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、ｈＤＹＳＦタンパク質の断片が、配列番号１０のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第４のＩＴＲを含む、第２のＡＡＶベクターであって、ポリヌクレオチドが第３および第４のＩＴＲに挟まれている、第２のＡＡＶベクター。

【0096】

いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ヒツジ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、またはネコから選択される哺乳動物である。

【0097】

いくつかの実施形態では、対象は、ジスフェリン異常症に罹患している。いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【図面の簡単な説明】

【0098】

【図1】図１は、ジスフェリン異常症を処置するための二重ＡＡＶベクターシステムの概略図を提供する。５’ベクター（例えば、５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクター）、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ５’．ＰＴＧ（ＰＴＧ＝プロモーター／導入遺伝子）は、筋肉特異的ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン、コンセンサスコザック配列および配列番号１２のアミノ酸１～１１１３に対応するＤＹＳＦ ｃＤＮＡの５’部分を含む。３’ベクター（例えば、３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクター）、ｐＡＡＶ．ＤＹＳＦ３’．ＰＯＬＹＡは、配列番号１２のアミノ酸７９４～２０８０に対応するＤＹＳＦ ｃＤＮＡの３’部分と、ポリアデニル化シグナルを有するＤＹＳＦ ３’ＵＴＲとを含む。

【0099】

【図2】図２は、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ５’．ＰＴＧ ＤＮＡベクタープラスミドマップを提供する。

【0100】

【図3】図３は、ｐＡＡＶ．ＤＹＳＦ３’．ＰＯＬＹＡベクターＤＮＡプラスミドＭａｐを提供する。

【0101】

【図4-1】図４Ａ～４Ｄは、二重ベクターシステムの送達後のジスフェリン発現を示す。免疫染色（図４Ａ）およびウエスタンブロット（図４Ｃ）により、両方のベクターの送達後に強固な全長ジスフェリン発現が見られた。いずれかのベクターのみの送達では、異常なジスフェリン発現はなかった（図４Ｂ：免疫染色、図４Ｄ：ウエスタンブロット）。３２２２は全長の対照である。

【図4-2】図４Ａ～４Ｄは、二重ベクターシステムの送達後のジスフェリン発現を示す。免疫染色（図４Ａ）およびウエスタンブロット（図４Ｃ）により、両方のベクターの送達後に強固な全長ジスフェリン発現が見られた。いずれかのベクターのみの送達では、異常なジスフェリン発現はなかった（図４Ｂ：免疫染色、図４Ｄ：ウエスタンブロット）。３２２２は全長の対照である。

【0102】

【図5】図５Ａ～５Ｃは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶ送達後のジスフェリン発現の時間経過の結果を示す。図５Ａは、左前脛骨筋（ＬＴＡ）への二重ベクターの送達後に見られるジスフェリン免疫標識（上パネル）による全長ジスフェリン発現を実証する。ジスフェリン発現は処置後１、３、および６ヶ月間持続し、病理学的異常応答はなかった（Ｈ＆Ｅ、下パネル）。スケールバー、１００μｍ。Ｎ＝４／時点。図５Ｂは、注射されたＬＴＡ（１群あたり２つ）における全長ジスフェリンの発現を実証する１、３、６ヶ月の試料のウエスタンブロットを示す。γ－チューブリンをローディング対照として使用した。図５Ｃは、様々な組織に関する注射後３ヶ月および６ヶ月でのゲノムＤＮＡ（μｇ）あたりのベクターゲノムの体内分布プロットを示す。注：ＬＴＡを処置した；対数軸。

【0103】

【図6】図６は、３ヶ月または１２ヶ月のエンドポイントでの、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶの筋肉内注射によって処置した４匹の個々の動物由来の標的筋肉（ＬＴＡ）および非標的組織のウエスタンブロット分析を示す。

【0104】

【図7-1】図７Ａ～７Ｃは、ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶの全身送達後のジスフェリン発現を示す。図７Ａは、６ｘ１０^１２ｖｇ（２．４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づく）のＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶの全身送達後の組織のジスフェリン免疫標識を示す（ｎ＝６／用量）。示されている筋肉は、Ｄｙｓｆ－／－、処置（ＡＡＶ．ＤＶ）および野生型（ＷＴ）組織についての心臓、腓腹筋、横隔膜および四頭筋である。図７Ｂは、前脛骨筋（ＬＴＡ）、腓腹筋（ＲＧＡＳ）、四頭筋（ＬＱＤ）、三頭筋（ＲＴｒｉ）および横隔膜における中心核の定量化を示す。＊ｐ＜０．０５試料と野生型との間の有意差、＃試料と野生型との間の有意差なし。図７Ｃは、２３７ｋＤの全長ジスフェリンバンドを示す組織溶解物（Ｈ：心臓、Ｇ：腓腹筋、Ｑ：四頭筋、Ｄ：横隔膜）のウエスタンブロットを示し、γ－チューブリンがローディング対照として含まれる。

【図7-2】図７Ａ～７Ｃは、ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶの全身送達後のジスフェリン発現を示す。図７Ａは、６ｘ１０^１２ｖｇ（２．４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づく）のＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶの全身送達後の組織のジスフェリン免疫標識を示す（ｎ＝６／用量）。示されている筋肉は、Ｄｙｓｆ－／－、処置（ＡＡＶ．ＤＶ）および野生型（ＷＴ）組織についての心臓、腓腹筋、横隔膜および四頭筋である。図７Ｂは、前脛骨筋（ＬＴＡ）、腓腹筋（ＲＧＡＳ）、四頭筋（ＬＱＤ）、三頭筋（ＲＴｒｉ）および横隔膜における中心核の定量化を示す。＊ｐ＜０．０５試料と野生型との間の有意差、＃試料と野生型との間の有意差なし。図７Ｃは、２３７ｋＤの全長ジスフェリンバンドを示す組織溶解物（Ｈ：心臓、Ｇ：腓腹筋、Ｑ：四頭筋、Ｄ：横隔膜）のウエスタンブロットを示し、γ－チューブリンがローディング対照として含まれる。

【0105】

【図8】図８は、ＡＡＶｒｈ．７４．ＤＹＳＦ．ＤＶ送達後の用量依存性膜膜再封活性を示す。

【0106】

【図9】図９は、ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶの全身送達後の線維症および炎症の逆転を示す。ＢｌａＪマウスを、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、６ｘ１０^１２ｖｇ（２．４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）で処置した。ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶ（ｎ＝６）。腰筋を除去し、線維症（中央列）およびＣＤ８単核細胞の存在について分析した。遺伝子送達後、両方のパラメータが有意に減少した。

【0107】

【図10】図１０Ａ～１０Ｂは、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶの全身送達がＤｙｓｆ－／－マウスにおいて機能障害を回復させることを実証する。図１０Ａ：横隔膜筋ストリップを採取し、特定の力を評価するためのプロトコルに供した。処置された横隔膜は力の有意な改善を示し（＊＊Ｐ＞０．０１、ＡＮＯＶＡ）、これは両方の用量で野生型の力と異ならなかった［２ｅ１２ｖｇの総ＡＡＶ．ＤＹＳＦ ＤＶ（８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づく）、または６ｅ１２ｖｇの総ＡＡＶ．ＤＹＳＦ．ＤＶ（２．４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づく）］。図１０Ｂは、膜再密封における用量依存性応答があったことを示す。低用量では有意な改善はなかった。

【0108】

【図11】図１１Ａ～１１Ｄは、ＡＡＶキャプシドおよびジスフェリンに対するＴ細胞応答のモニタリングからの結果を示す。末梢血単核細胞を単離し、ＡＡＶ５およびＡＡＶｒｈ．７４キャプシド（青色バー）ならびにヒトジスフェリン（緑色）を含むペプチドに曝露した。ＡＡＶ５キャプシドおよびジスフェリンに対するＴ細胞応答を３ヶ月（図１１Ａ）および６ヶ月（図１１Ｂ）で監視した。ＡＡＶｒｈ．７４キャプシドおよびジスフェリンに対するＴ細胞応答を３ヶ月（図１１Ｃ）および６ヶ月（図１１Ｄ）で監視した。

【0109】

【図12-1】図１２Ａ～１２Ｃは、非ヒト霊長類におけるジスフェリン発現を示す。図１２Ａは、ＡＡＶ５．ＤＹＳＦまたはＡＡＶｒｈ．７４．ＤＹＳＦ．ＤＶのいずれかの注射の３ヶ月後および６ヶ月後のＮＨＰ組織の組織学（Ｈ＆Ｅ）およびジスフェリン免疫蛍光（ＩＦ）画像を示す。Ｈ＆Ｅ染色切片は、免疫浸潤の欠如および線維の壊死を示す。ＩＦ切片は、天然（シャム）と比較して注射組織におけるジスフェリンの過剰発現を示す。図１２Ｂは、ＡＡＶ５．ＤＹＳＦおよびＡＡＶｒｈ．７４．ＤＹＳＦ．ＤＶの両方についての注射後３ヶ月および６ヶ月の組織のウエスタンブロット画像を示す。重要なことに、注射された組織は、シャム対照と比較して、ジスフェリンの過剰発現を示す。陽性（＋）対照は野生型マウス組織であり、陰性（－）対照は１２９－Ｄｙｓｆ－／－非注射組織である。図１２Ｃは、左ＴＡにＡＡＶｒｈ．７４．ＤＹＳＦ．ＤＶをＩＭ注射した後のベクターゲノムの体内分布を示す。対数スケールに注意。

【図12-2】図１２Ａ～１２Ｃは、非ヒト霊長類におけるジスフェリン発現を示す。図１２Ａは、ＡＡＶ５．ＤＹＳＦまたはＡＡＶｒｈ．７４．ＤＹＳＦ．ＤＶのいずれかの注射の３ヶ月後および６ヶ月後のＮＨＰ組織の組織学（Ｈ＆Ｅ）およびジスフェリン免疫蛍光（ＩＦ）画像を示す。Ｈ＆Ｅ染色切片は、免疫浸潤の欠如および線維の壊死を示す。ＩＦ切片は、天然（シャム）と比較して注射組織におけるジスフェリンの過剰発現を示す。図１２Ｂは、ＡＡＶ５．ＤＹＳＦおよびＡＡＶｒｈ．７４．ＤＹＳＦ．ＤＶの両方についての注射後３ヶ月および６ヶ月の組織のウエスタンブロット画像を示す。重要なことに、注射された組織は、シャム対照と比較して、ジスフェリンの過剰発現を示す。陽性（＋）対照は野生型マウス組織であり、陰性（－）対照は１２９－Ｄｙｓｆ－／－非注射組織である。図１２Ｃは、左ＴＡにＡＡＶｒｈ．７４．ＤＹＳＦ．ＤＶをＩＭ注射した後のベクターゲノムの体内分布を示す。対数スケールに注意。

【0110】

【図13】図１３は、ベクター由来のジスフェリン発現を確認するための抗ＦＬＡＧの使用を実証する。Ｎ末端ＦＬＡＧタグを使用して、内因性およびＡＡＶ由来のジスフェリンを区別した。

【発明を実施するための形態】

【0111】

詳細な説明
定義

【0112】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義されているものなどの用語は、本出願および関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書で明示的にそのように定義されない限り、理想化されたまたは過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解されよう。以下に明示的に定義されていないが、そのような用語は、それらの共通の意味に従って解釈されるべきである。

【0113】

本明細書の説明で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。

【0114】

本技術の実施は、別段の指示がない限り、当業者の技能の範囲内である、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。

【0115】

文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に記載の本発明の様々な特徴を任意の組み合わせで使用することができることが特に意図される。さらに、本開示は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略することができることも企図している。例示のために、本明細書が複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと述べている場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれかまたはそれらの組み合わせは、単独または任意の組み合わせで省略および放棄され得ることが特に意図される。

【0116】

特に明記しない限り、全ての特定の実施形態、特徴、および用語は、列挙された実施形態、特徴、または用語、およびそれらの生物学的等価物の両方を含むことを意図する。

【0117】

範囲を含むすべての数値表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、必要に応じて１．０または０．１の増分で、あるいは＋／－１５％、あるいは１０％、あるいは５％、あるいは２％の変動で（＋）または（－）変動する近似値であり、そのような範囲が含まれる。常に明示的に述べられているわけではないが、すべての数値指定の前に「約」という用語があることを理解されたい。また、常に明示的に述べられているわけではないが、本明細書に記載される試薬は単なる例示であり、そのような試薬の等価物は当技術分野で公知であることも理解されたい。

【0118】

本技術の実施は、別段の指示がない限り、当業者の技能の範囲内である、有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ
ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照のこと。

【0119】

本明細書で使用される場合、「増加した」、「減少した」、「高い」、「低い」という用語またはそれらの任意の文法上の変形は、参照組成物、ポリペプチド、タンパク質などの約９０％、８０％、５０％、２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変形を指す。

【0120】

「許容され得る」、「有効な」または「十分な」という用語は、本明細書に開示される任意の成分、範囲、剤形などの選択を説明するために使用される場合、前記成分、範囲、剤形などが開示される目的に適していることを意図する。

【0121】

また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された１またはそれを超える項目のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合は組み合わせの欠如を指し、包含する。

【0122】

本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関連する場合、そのようなものの等価物または生物学的等価物が本開示の範囲内で意図されることは、明示的な列挙なしに推測されるべきであり、別段の意図がない限り、推測されるべきである。本明細書で使用される場合、「その生物学的等価物」という用語は、参照タンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸に言及する場合、「その等価物」と同義であることを意図しており、所望の構造または機能を依然として維持しながら最小の配列同一性を有するものを意図する。本明細書で具体的に列挙されない限り、本明細書で言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、その等価物も含むことが企図される。例えば、等価物は、参照配列の長さにわたって少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは９８％のパーセントの相同性もしくは同一性を意図し、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と実質的に等価な生物学的活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドに言及する場合、その等価物は、１つの態様では、ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、さらなる態様では、参照ポリヌクレオチドまたはその相補体と同一または同様の活性または機能を有するポリヌクレオチドである。

【0123】

タンパク質またはポリペプチドの等価物（本明細書では参照と呼ぶ）は、参照と少なくとも５０％（または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）の同一性を共有し、参照の機能および製造可能性を保持する。

【0124】

本明細書で使用される場合、「機能」、「活性」、および「酵素活性」という用語は互換的に使用される。ジスフェリンの喪失は、骨格筋のＣａ２＋依存性膜修復を損なうことが示されてい（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：４０８４－４０８８，２００１およびＳｃｈｎｅｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３４９５－３５０４，２００３）。さらに、ジスフェリンは、アネキシンＡ１およびＡ２、ＡＨＮＡＫ、ならびにカベオリン－３を含む、膜修復に関与する他のタンパク質と相互作用することが示されている（Ｓｃｈｎｅｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３４９５－３５０４，２００３，Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８５６８－８５７７，１９９８，Ｄｏｎｓａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３４３－１３４６，２００１、およびＭｏｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｓａｆ．１：７９－９１，２００２）。筋線維再生能力の喪失は、ジスフェリン欠乏の寄与する結果であると考えられる（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２９９－１３０６，２００１）。ジスフェリンはまた、小胞輸送およびエンドサイトーシスならびにＴ小管形成に関連している（Ｅｖｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８５：２８５２９－２８５３９，２０１０，Ｋｌｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ ｆｏｒ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１：１７６８－１７７６，２００７、およびＫｌｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ ４１：１６６－１７３，２０１０）。したがって、ジスフェリンの活性の例としては、限定されないが、骨格筋における膜修復、例えば、膜再封、筋線維再生能の予防または回復、小胞輸送、エンドサイトーシス、および横行（Ｔ－）小管形成が挙げられる。膜修復アッセイ、小胞輸送アッセイ、および管形成アッセイは当技術分野で公知であり、インビトロでジスフェリン活性を測定するために使用することができる。例えば、Ｃａｒｍｅｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６８：１９５－２０７，２０１７，Ｖａｓｓｉｌｉｅｖａ ａｎｄ Ｎｕｓｒａｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４０：３－１４，２００８，Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８４（１）：２４８－５９，２０１４を参照のこと。これらは各々、参照によりそれらの全体が組み込まれる。ジスフェリンの活性を測定するためのさらなる方法は、例えばＧｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３９２３３，２０１２およびＳｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｓ ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｎｅｕｒｏｌ．２：２５６－２７０，２０１５．に見られる。

【0125】

ポリヌクレオチドの等価物（本明細書では参照と呼ぶ）は、参照と少なくとも５０％（または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）の同一性を共有し、参照によってコードされるものと同じポリペプチドをコードするか、または参照によってコードされるポリペプチドの等価物をコードする。

【0126】

参照配列のアミノ酸／ヌクレオチド残基または連続セグメントと等価な（または対応する）試験配列の位置または連続セグメントに到達するために、試験配列と参照配列との間で配列アラインメントが行われる。互いにアライメントされた位置またはセグメントは、等価物として決定される。

【0127】

「アフィニティタグ」という用語は、アフィニティタグに結合することができる、すなわちアフィニティを有するリガンドを使用して、融合タンパク質の検出および／または細胞環境からの融合タンパク質の精製を可能にするために融合タンパク質内に含まれ得るポリペプチドを指す。リガンドは、抗体、樹脂、または相補的ポリペプチドであり得るが、これらに限定されない。アフィニティタグは、小さなペプチド、一般的には約４～１６アミノ酸長のペプチドを含み得るか、またはより大きなポリペプチドを含み得る。一般的に使用されるアフィニティタグには、とりわけ、ポリアルギニン、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ポリヒスチジン、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｎ利用物質タンパク質（ＮｕｓＡ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、およびグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる（例えば、ＧＳＴ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｈａｎｄｂｏｏｋ－Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈを参照のこと）。一実施形態では、親和性タグは、ポリヒスチジンタグ、例えばＨｉｓ_６タグ（配列番号２１）である。融合タンパク質にアフィニティタグを含めることにより、アフィニティタグに緊密かつ特異的に結合することができるアフィニティ媒体を使用して、アフィニティ精製によって融合タンパク質を細胞環境から精製することが可能になる。親和性媒体は、例えば、アガロースまたは金属ビーズなどの固定相（マトリックス）に共有結合した金属荷電樹脂またはリガンドを含み得る。例えば、ポリヒスチジンタグ付き融合タンパク質（Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質とも呼ばれる）は、Ｎｉ^２＋またはＣｏ^２＋ローディング樹脂を使用する固定化金属イオンクロマトグラフィーによって回収することができ、抗ＦＬＡＧアフィニティーゲルを使用してＦＬＡＧタグ付き融合タンパク質を捕捉することができ、アガロースなどの固体支持体に架橋されたグルタチオンを使用してＧＳＴタグ付き融合タンパク質を捕捉することができる。一態様では、アフィニティタグは精製タグまたはマーカーである。

【0128】

本明細書で使用される場合、「精製」、「精製すること」、または「分離すること」という用語は、細胞溶解物またはポリペプチドの混合物などの複合混合物から１またはそれを超える生体材料（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはウイルスベクター）を単離するプロセスを指す。精製、分離、または単離は完全である必要はなく、すなわち、複合混合物のいくつかの成分は、精製プロセス後に、１またはそれを超える生体材料（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはウイルスベクター）と共に残存し得る。しかしながら、精製生成物は、精製前の複合混合物と比較して１またはそれを超える生体材料（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはウイルスベクター）について濃縮されるべきであり、複合混合物内に最初に存在する他の成分のかなりの部分が精製プロセスによって除去されるべきである。

【0129】

本明細書で使用される「細胞」という用語は、必要に応じて対象または市販の供給源から得られる、原核細胞または真核細胞のいずれかを指し得る。いくつかの例では、細胞は、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞または哺乳動物宿主細胞である。いくつかの例では、宿主細胞は、本明細書では産生細胞またはパッケージング細胞とも呼ばれる。いくつかの例では、細胞株はパッケージング細胞株である。

【0130】

「真核細胞」は、モネラ属を除く全ての生物界を含む。これらは、膜結合核を介して容易に区別することができる。動物、植物、菌類、原生生物は真核生物であり、すなわち、細胞が内膜と細胞骨格によって複雑な構造に組織化されている生物である。最も特徴的な膜結合構造は核である。特に明記しない限り、「宿主」という用語は、例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核宿主を含む。真核細胞または宿主の非限定的な例としては、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、鳥類、爬虫類およびヒト、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、Ｓｆ９細胞、幹細胞、衛星細胞および筋肉細胞が挙げられる。筋肉細胞の例には、骨格筋細胞、心筋細胞、および平滑筋細胞が含まれるが、これらに限定されない。

【0131】

「原核細胞」は、通常、核または任意の他の膜結合オルガネラを欠き、２つのドメイン、細菌および古細菌に分けられる。染色体ＤＮＡに加えて、これらの細胞は、エピソームと呼ばれる環状ループに遺伝情報を含むこともできる。細菌細胞は非常に小さく、ほぼ動物ミトコンドリアのサイズ（直径約１～２μｍおよび長さ１０μｍ）である。原核細胞は、３つの主要な形状：棒状、球状、およびらせんを特徴とする。真核生物のような精巧な複製プロセスを経る代わりに、細菌細胞は二分裂によって分裂する。例としては、バチルス細菌、大腸菌細菌およびサルモネラ菌が挙げられるが、これらに限定されない。

【0132】

核酸配列に適用される「コードする」という用語は、その天然の状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合に、転写および／または翻訳されてポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡを産生することができる場合にポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、そこからコード配列を推定することができる。

【0133】

用語「同等物」または「生物学的同等物」は、特定の分子、生物学的または細胞物質に言及するときに交換可能に使用され、所望の構造または機能性を依然として維持しながら（例えば、類似の機能または活性を有する）、最小限の相同性を有するものを意図する。明示的に述べられていないが、参照ポリペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチドに対する等価物または生物学的等価物に言及する場合、等価物または生物学的等価物は、参照ポリペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチドに対する列挙された構造的関係および等価または実質的に等価な生物学的活性を有することを理解されたい。例えば、等価なポリペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチドの非限定的な例としては、それに対してあるいはポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列に関して、参照ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の長さにわたって、少なくとも６０％、あるいは少なくとも６５％、あるいは少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチドが挙げられる。あるいは、等価なポリペプチドは、そのような参照ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし、実質的に等価または等価な生物学的活性を有するポリヌクレオチドまたはその相補体によってコードされるものである。高ストリンジェンシーの条件は、本明細書に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、その等価物は、基準ポリヌクレオチドの長さにわたって基準ポリヌクレオチド、例えば野生型ポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％、または少なくとも９７％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチドまたはその相補体によってコードされるポリペプチドである。そのような等価なポリペプチドは、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同じ生物学的活性を有する。

【0134】

等価なポリヌクレオチドの非限定的な例としては、参照ポリヌクレオチドに対して少なくとも６０％、あるいは少なくとも６５％、あるいは少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％、あるいは少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。同等物はまた、参照ポリヌクレオチドに対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその相補体を意図する。そのような等価なポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドと同じ生物学的活性を有する。

【0135】

別の配列に対してある特定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、アラインメントされたとき、その割合の塩基（またはアミノ酸）が、参照ポリヌクレオチドの長さにわたって２つの配列を比較したときに同一であることを意味する。アラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０，セクション７．７．１８、表７．７．１に記載されているものを使用して決定することができる。特定の実施形態では、デフォルトパラメータがアライメントに使用される。非限定的な例示的なアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、例示的なプログラムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを含み、以下のデフォルトパラメータを使用する：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０シーケンス；ソート基準＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見ることができる。配列同一性およびパーセント同一性は、それらをｃｌｕｓｔａｌＷ（２０１７年１月１３日に最終アクセスされた、ウェブアドレス：ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能）またはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／で入手可能）に組み込むことによって決定することができる。

【0136】

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的でアラインメントされ得る各配列中の位置を比較することによって決定され得る。比較される配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占められる場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致または相同位置の数の関数である。「無関係な」または「非相同な」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を共有する。

【0137】

本明細書で使用される場合、「少なくとも９０％同一」という用語は、２つの比較される配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）の約９０％～約１００％の同一性を指す。それはまた、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、約９１％～約１００％、約９２％～約１００％、約９３％～約１００％、約９４％～約１００％、約９５％～約１００％、約９６％～約１００％、約９７％～約１００％、約９８％～約１００％、または約９９％～約１００％の同一性を含む。

【0138】

本明細書で使用される場合、「保持する」、「類似する」および「同一である」という用語は、ポリヌクレオチド、タンパク質および／またはペプチドの機能、活性または機能活性を説明する際に交換可能に使用され、参照タンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはペプチドの活性の少なくとも約２０％（限定されないが、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または約１００％を含む）の機能活性を指す。

【0139】

「ハイブリダイゼーション」は、１またはそれを超えるポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対合、フーグステイン結合、または任意の他の配列特異的な様式で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本またはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などのより広範なプロセスにおける工程を構成し得る。

【0140】

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５°Ｃ～約３７°Ｃのインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％～約２５％のホルムアミド濃度；約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０°Ｃ～約５０°Ｃのインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％～約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ～２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５°Ｃ～約６８°Ｃのインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は５分～２４時間であり、１回、２回、またはそれを超える洗浄工程を伴い、洗浄インキュベーション時間は、約１、２、または１５分である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を使用するＳＳＣの等価物を使用することができることが理解される。一態様において、等価なポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするものである。別の態様では、等価なポリペプチドは、ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。

【0141】

本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0142】

本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、特定の（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ）、指定された（ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）効果を達成することを意図するように、任意の分子、生物学的または細胞材料を修飾するために使用され得る。

【0143】

本明細書で使用される場合、「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために互換的に使用される。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖もしくは多本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基およびピリミジン塩基もしくは他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ、および／または小さいヘアピンＲＮＡを含む、および／またはコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡであるか、またはｍＲＮＡをコードする。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、例えば、操作されたｄｓ ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡから合成されたｄｓ ｃＤＮＡである。

【0144】

「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣体の２またはそれを超えるサブユニットの化合物を指すために交換可能に、それらの最も広い意味で使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテルなどによって連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンならびにＤおよびＬの両方の光学異性体、アミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸を指す。

【0145】

本明細書で使用される場合、連続するアミノ酸配列は、少なくとも２つのアミノ酸を有する配列を指す。しかしながら、第１の部分および第２の部分の連続するアミノ酸配列は、第１の部分が第２の部分に直接コンジュゲートされるようにアミノ酸配列を限定しないことに留意されたい。第１の部分が、連結などの第３の部分を介して第２の部分に連結され、その結果１つの連続したアミノ酸配列を形成することも可能である。

【0146】

本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」、「コンジュゲートした」、「コンジュゲートすること」および「コンジュゲーション」という用語は、分子間、特に２つのアミノ酸配列および／または２つのポリペプチド間の結合の形成を指す。コンジュゲーションは、直接的（すなわち、結合）または間接的（すなわち、さらなる分子を介する）であり得る。コンジュゲーションは共有結合または非共有結合であり得る。

【0147】

本明細書で使用される場合、連続するアミノ酸配列は、直接的または間接的に（例えばリンカーを介して）互いにコンジュゲートした２またはそれを超えるポリペプチドを含み得る。

【0148】

本明細書で使用される場合、「組換え発現系」という用語は、組換えによって形成された特定の遺伝物質の発現のための１つまたは複数の遺伝子構築物を指す。

【0149】

「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞内に運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含むミセル生体適合性ポリマー；リポタンパク質；脂質ナノ粒子；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌、またはウイルス、例えば狂犬病ウイルス、フラビウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、ならびに様々な真核生物および原核生物宿主における発現について記載されており、遺伝子治療ならびに単純なタンパク質発現のために使用され得る、当技術分野で典型的に使用される他の組換えビヒクルである。

【0150】

本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞または組織に送達することができる。本明細書で使用される「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、「ｍＲＮＡベースの送達」、「形質導入」などは、導入に使用される方法に関係なく、外因性ポリヌクレオチド（「導入遺伝子」と呼ばれることもある）の宿主細胞への導入を指す用語である。そのような方法には、ベクター媒介遺伝子導入などの様々な周知の技術（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または例えばプロタミン複合体、脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子、および無機ナノ粒子を含む様々な他のタンパク質ベースもしくは脂質ベースの遺伝子送達複合体、またはそれらの組み合わせによる）、ならびに「ネイキッド」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術（例えば、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入に使用される様々な他の技術）が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、修飾されていなくてもよく、または、１またはそれを超える修飾を含んでいてもよい。例えば、修飾ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャッピング；１００～２５０個のアデノシン残基の尾部を付加する酵素的ポリアデニル化（配列番号２２）；および５－メチルシチジンによるシチジンの置換および／またはプソイドウリジンによるウリジンの置換の一方または両方を含んでもよい。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で安定にまたは一過的に維持され得る。安定な維持には、典型的には、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の複製起点を含むか、あるいは、染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）などの宿主細胞のレプリコンまたは核もしくはミトコンドリア染色体に組み込まれることが必要である。当該分野で公知であり、本明細書に記載されるように、哺乳動物細胞への遺伝子の移入を媒介することができるいくつかのベクターが知られている。

【0151】

「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合、それは環状で二本鎖である。プラスミドは、微生物の集団内での水平方向の遺伝子導入のための機構を提供し、典型的には、所与の環境状態下で選択的利点を提供する。プラスミドは、競争的な環境ニッチにおいて天然に存在する抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を保有し得るか、あるいは産生されたタンパク質は、同様の状況下で毒素として作用し得る。

【0152】

遺伝子工学で用いられる「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と呼ばれる。そのような用途のために多くのプラスミドが市販されている。複製される遺伝子は、特定の抗生物質に対して細胞を耐性にする遺伝子およびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ、またはポリリンカー）を含むプラスミドのコピーに挿入され、マルチクローニングサイトは、この位置にＤＮＡ断片を容易に挿入することを可能にするいくつかの一般的に使用される制限部位を含む短い領域である。プラスミドの別の主な用途は、大量のタンパク質を作製することである。この場合、研究者らは、目的の遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を増殖させる。細菌が抗生物質耐性を付与するタンパク質を産生するのと同様に、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように誘導することもできる。

【0153】

「酵母人工染色体」または「ＹＡＣ」は、大きなＤＮＡ断片（１００ｋｂより大きく３０００ｋｂまで）をクローニングするために使用されるベクターを指す。これは人工的に構築された染色体であり、酵母細胞における複製および保存に必要なテロメア、セントロメアおよび複製起点配列を含む。最初の環状プラスミドを使用して構築され、それらは制限酵素を使用することによって線状化され、次いで、ＤＮＡリガーゼは、凝集末端の使用によって線状分子内に目的の配列または遺伝子を付加することができる。ＹＡＣ、ＹＩｐｓ（酵母インテグレーティングプラスミド）およびＹＥｐｓ（酵母エピソーマルプラスミド）などの酵母発現ベクターは、酵母自体が真核細胞であるので、翻訳後修飾を有する真核タンパク質産物を得ることができるので極めて有用であるが、ＹＡＣはＢＡＣよりも不安定であり、キメラ効果を生じることが分かっている。

【0154】

本明細書で使用される場合、「ウイルスキャプシド」または「キャプシド」という用語は、ウイルス粒子のタンパク質性シェルまたはコートを指す。キャプシドは、ウイルスゲノムをキャプシド化し、保護し、輸送し、宿主細胞に放出するように機能する。キャプシドは、一般に、タンパク質のオリゴマー構造サブユニット（「キャプシドタンパク質」）から構成される。本明細書で使用される場合、「キャプシド化された」という用語は、ウイルスキャプシド内に封入されていることを意味する。

【0155】

本明細書で使用される場合、ウイルスまたはプラスミドの言及における「ヘルパー」という用語は、ウイルス粒子または本明細書に開示される改変ＡＡＶなどの組換えウイルス粒子の複製およびパッケージングに必要な追加の成分を提供するために使用されるウイルスまたはプラスミドを指す。ヘルパーウイルスによってコードされる成分は、ビリオンアセンブリ、キャプシド化、ゲノム複製および／またはパッケージングに必要な任意の遺伝子を含み得る。例えば、ヘルパーウイルスは、ウイルスゲノムの複製に必要な酵素をコードし得る。ＡＡＶ構築物と共に使用するのに適したヘルパーウイルスおよびプラスミドの非限定的な例としては、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）またはヘルペスウイルス（ウイルス）が挙げられる。

【0156】

本明細書で使用される場合、生物学的試料または試料は、対象、細胞株または培養細胞もしくは組織から得ることができる。例示的な試料としては、細胞試料、組織試料、血液などの液体試料および生物学的起源の他の液体試料（眼液（房水および硝子体液）、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または射精前液、女性射精液、汗、涙、嚢胞液、胸膜および腹膜液、心膜液、腹水、リンパ、キームス、乳び、胆汁、間質液、月経、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物／潮、滑液、粘膜分泌物、便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺液、胚盤胞腔液、または臍帯血が挙げられるが、これらに限定されない。

【0157】

本明細書で使用される場合、「検出可能なマーカー」という用語は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成することができる少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的なリストには、例えば比色測定、蛍光、発光によって検出可能なシグナルを生成する酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコース６リン酸脱水素酵素、蛍光、発光色素などの発色団、電子顕微鏡によって、または、その導電率、アンペロメトリー、ボルタメトリー、インピーダンスなどによって検出可能な電気特性によって検出される電子密度を有するグループが含まれ、例えば、分子が物理的および／または化学的特性において検出可能な変化を誘発するのに十分な大きさである場合、その検出は、回折、表面プラズモン共鳴、表面変化、接触角変化などの光学的方法、または原子間力顕微鏡、トンネル効果、あるいは^３２Ｐ、^３５Ｓ、^８９Ｚｒまたは^１２５Ｉなどの放射性分子などの物理的方法により達成することができる。

【0158】

本明細書で使用される場合、「精製マーカー」という用語は、精製または同定に有用な少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的なリストには、Ｈｉｓ、ｌａｃＺ、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＢＣＣＰ、ｃ－ｍｙｃ、ＣａＭ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｃｈｅｒｒｙ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５、Ｓｎａｐ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、ＳｔｒｅｐまたはＳタンパク質が含まれる。適切な直接または間接蛍光マーカーとしては、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｃｈｅｒｒｙ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＮＰ、ＡＭＣＡ、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｔａｍｒａ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ローダミン、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣまたは任意の他の蛍光色素もしくはハプテンが挙げられる。

【0159】

本明細書で使用される場合、エピトープタグは、抗体によって認識される抗原として作用するタンパク質または炭水化物などの生物学的構造または配列である。特定の実施形態において、エピトープタグは、精製マーカーおよび／またはアフィニティタグと交換可能に使用される。

【0160】

「組成物」は、２またはそれを超える化合物の組み合わせ、例えば、活性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルスベクター、または抗体と、不活性（例えば、検出可能な標識）または活性（例えば、遺伝子送達ビヒクル）の別の化合物または組成物との組み合わせを意味することを意図している。

【0161】

「医薬組成物」は、活性ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体と、不活性または活性の担体、例えば固体支持体との組み合わせを含み、組成物をインビトロ、インビボまたはエクスビボでの診断または治療使用に適したものにすることを意図している。

【0162】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、および油／水または水／油エマルジョンなどのエマルジョン、および様々な種類の湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれかを包含する。組成物はまた、安定剤および保存剤を含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ）を参照のこと。

【0163】

「対象」、「個体」または「患者」は、本明細書では互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物としては、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、家畜、スポーツ動物、ペット、ウマおよび霊長類、特にヒトが挙げられるが、これらに限定されない。ヒトの処置に有用であることに加えて、本発明はまた、哺乳動物、げっ歯類などを含むコンパニオン哺乳動物、エキゾチック動物および家畜の獣医学的処置にも有用である。１つの実施形態において、哺乳動物には、ウマ、イヌおよびネコが含まれる。本発明の別の実施形態において、ヒトは、１８歳未満の青年または乳児である。

【0164】

疾患を「処置すること」または「処置」には、以下が含まれる：（１）疾患を予防すること、すなわち、疾患に罹りやすい可能性があるが、疾患の症候をまだ経験または示していない患者において疾患の臨床症候を発症させないこと；（２）疾患を阻害すること、すなわち、疾患またはその臨床症候の発症を停止または減少させること；または（３）疾患を軽減すること、すなわち疾患またはその臨床症候の退行を引き起こすこと。一態様では、「処置」という用語は予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）または予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）を除外する。

【0165】

「処置」という用語に関連する「罹患している」という用語は、疾患と診断されているか、または疾患に罹りやすい患者または個体を指す。

【0166】

「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１またはそれを超える投与、適用または投薬で投与することができる。そのような送達は、個々の投与単位が使用されるべき期間、治療剤のバイオアベイラビリティ、投与経路などを含む多くの変数に依存する。しかしながら、任意の特定の対象に対する本発明の治療剤の特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、ならびに処置される特定の障害の重症度および投与形態を含む様々な因子に依存することが理解される。処置投与量は、一般に、安全性および有効性を最適化するために用量設定され得る。一態様では、有効量は治療有効量である。典型的には、インビトロおよび／またはインビボ試験からの用量－効果関係は、最初に、患者投与のための適切な用量に関する有用な指針を提供することができる。一般に、インビトロで有効であることが分かった濃度に見合った血清レベルを達成するのに有効な量の化合物を投与することが望まれる。これらのパラメータの決定は、十分に当業者の技術の範囲内である。これらの考慮事項、ならびに有効な製剤および投与手順は、当技術分野で周知であり、標準的な教科書に記載されている。この定義と一致して、本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、エクスビボ、インビトロまたはインビボでＲＮＡウイルス複製を阻害するのに十分な量である。

【0167】

投与という用語は、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレー経鼻、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）による投与を含むが、これらに限定されず、単独または一緒に、各投与経路に適した従来の非毒性の薬学的に許容され得る担体、アジュバント、賦形剤およびビヒクルを含有する適切な投与単位製剤で製剤化することができる。本発明は、投与経路、製剤または投与スケジュールによって限定されない。

【0168】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの標準的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、特定の機能が共感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞でのみ増殖する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特徴付けられているＡＡＶの血清型は１３種類ある。ＡＡＶの一般的な情報および総説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ １：１６９－２２８，１９８９、およびＢｅｒｎｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４３－１７６４，１９９９に見出すことができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝的レベルでさえ構造的にも機能的にも非常に密接に関連していることがよく知られているので、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ １６５－１７４，１９８８，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．；およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１，１９７４を参照のこと）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに示し、ＡＡＶ２で発現されるものなどの３つの関連するキャプシドタンパク質を全て有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーションを明らかにするヘテロ二重鎖分析；および「逆位末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在によってさらに示唆される。同様の感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が同様の調節制御下にあることを示唆する。

【0169】

本明細書で使用される「ＡＡＶ発現カセット」は、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれている１またはそれを超える目的のポリヌクレオチ（または導入遺伝子）を含むヌクレオチド配列を指す。そのようなＡＡＶ発現カセットは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードおよび発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に存在する場合、複製され、感染性ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶベクター）にパッケージングされ得る。

【0170】

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶベクター」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシド化ポリヌクレオチドＡＡＶ発現カセットで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは典型的に、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ＡＡＶベクター粒子の産生は、そのようなプラスミドがＡＡＶベクター粒子内に含まれるので、必然的にＡＡＶ発現カセットの産生を含む。

【0171】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む長さ約４．７ｋｂである。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提示されており、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって訂正されている。他の例として、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており；ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９に提供されており；ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており；ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６に提供されており；ＡＡＶ－６の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており；ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されており（ＡＡＶ－８に関する米国特許第７，２８２，１９９号および第７，７９０，４４９号も参照されたい）；ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており；ＡＡＶ－１０ゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており；ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶｒｈ．７４のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド化／パッケージングおよび宿主細胞染色体組込みを指示するシス作用配列がＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置についてｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名される）は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（例えば、ＡＡＶ２ヌクレオチド２１０７および２２２７において）と合わせて、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製に最終的に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連キャプシドタンパク質の産生を担う。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。

【0172】

本開示の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子と、核酸分子に隣接する１またはそれを超えるＡＡＶ ＩＴＲとを含む。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２およびＡＡＶ－１３を含む組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。シュードタイプ化ｒＡＡＶの産生は、例えば国際公開第０１／８３６９２号に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えばキャプシド突然変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景のセクションで述べたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ．７４を用いる。

【0173】

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語は、それらの混合物を含む複数の細胞を含む。

【0174】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図している。「から本質的になる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、記載された目的のために組み合わせにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量汚染物質、ならびにリン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などの薬学的に許容され得る担体を排除しない。「からなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、他の成分の微量要素、および本発明の組成物を投与するための実質的な方法の工程、または組成物を製造するため、もしくは意図した結果を達成するためのプロセスの工程を超えるものを除くことを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。

【0175】

ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、巨大分子の天然源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を指す。「単離された核酸」という用語は、断片として天然に存在しない核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチド、タンパク質および／または宿主細胞を指すために本明細書で使用され、精製ポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。他の実施形態では、「単離された」という用語は、通常は天然に関連している細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（複数可）が含まれる構成成分、細胞およびその他のものから分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離された細胞である。当業者には明らかなように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（複数可）は、その天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。

【0176】

ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される「組換え」という用語は、分子クローニングなどの組換えの実験室的方法によって形成された分子を指す。分子クローニング技術は当技術分野で公知であり、ポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅、ポリヌクレオチドの酵素消化、ポリヌクレオチドの発現カセット（例えば、哺乳動物発現カセット）へのライゲーション、ポリヌクレオチドによる細胞の形質転換、トランスフェクションまたは形質導入、およびポリペプチドを産生するためのポリヌクレオチドの発現を含み得るが、これらに限定されない。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２０１２を参照されたい。「組換えポリヌクレオチド」という用語は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの断片を含むことを意味する。例えば、組換えポリヌクレオチドは、ヒトジスフェリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの断片を含み得る。組換えポリヌクレオチドは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの断片のＰＣＲ増幅によって産生され得る。組換えポリペプチドは、１またはそれを超える組換えポリヌクレオチドの発現によって産生され得る。

【0177】

ヒトジスフェリン（ｈＤＳＹＳＦ）タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドが本明細書に開示される。ヒトジスフェリン（ｈＤＳＹＳＦ）タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞および組成物が、本明細書中にさらに開示される。そのようなポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞および組成物を作製および使用する方法もまた、本明細書中に開示される。

【0178】

ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードする組換えポリヌクレオチドであって、組換えポリヌクレオチドが第１のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列が、（ａ）配列番号１、６、または１８のヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１、６、または１８のそれぞれの全長にわたって配列番号１、配列番号６、または配列番号１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号１３または１５のそれぞれの全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｅ）ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質が配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｆ）（ｅ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｅ）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列、からなる、組換えポリヌクレオチドが本明細書において開示される。

【0179】

ヒトジスフェリンタンパク質の断片をコードする組換えポリヌクレオチド配列であって、組換えポリヌクレオチドが第１のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列が、（ａ）配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２、８または１９のそれぞれの全長にわたって配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号１４または１６のそれぞれの全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；（ｅ）ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド配列；または（ｆ）（ｅ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｅ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列、からなる、組換えポリヌクレオチド配列が本明細書においてさらに開示される。

【0180】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが本明細書においてさらに開示される。いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、（ａ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）配列番号１または６のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１または６の全長にわたって配列番号１または６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３または１５の全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質が、配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第２のＩＴＲを含み、ポリヌクレオチドは、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲに挟まれている。

【0181】

いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、（ａ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）配列番号２または８のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２または８の全長にわたって配列番号２または８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１４または１６の全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第２のＩＴＲを含み、ポリヌクレオチドは、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲに挟まれている。

【0182】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットが本明細書においてさらに開示される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、（ａ）本明細書に開示される逆位末端反復配列（ＩＴＲのいずれかを含む第１のＩＴＲであって；（ｂ）本明細書中に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれか；（ｃ）本明細書に開示されるＩＴＲのいずれかを含む第２のＩＴＲを含み、（ｂ）の５’ｈＹＤＳＹＦポリヌクレオチドは、（ａ）および（ｃ）の第１および第２のＩＴＲに挟まれている。

【0183】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、（ａ）本明細書に開示される逆位末端反復配列（ＩＴＲのいずれかを含む第１のＩＴＲであって；（ｂ）本明細書中に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれか；（ｃ）本明細書に開示されるＩＴＲのいずれかを含む第２のＩＴＲを含み、（ｂ）の３’ｈＹＤＳＹＦポリヌクレオチドは、（ａ）および（ｃ）の第１および第２のＩＴＲに挟まれている。

【0184】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが本明細書においてさらに開示される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、（ａ）本明細書に開示される逆位末端反復配列（ＩＴＲのいずれかを含む第１のＩＴＲであって；（ｂ）本明細書中に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれか；（ｃ）本明細書に開示されるＩＴＲのいずれかを含む第２のＩＴＲを含み、（ｂ）の５’ｈＹＤＳＹＦポリヌクレオチドは、（ａ）および（ｃ）の第１および第２のＩＴＲに挟まれている。

【0185】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、（ａ）本明細書に開示される逆位末端反復配列（ＩＴＲのいずれかを含む第１のＩＴＲであって；（ｂ）本明細書中に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれか；（ｃ）本明細書に開示されるＩＴＲのいずれかを含む第２のＩＴＲを含み、（ｂ）の３’ｈＹＤＳＹＦポリヌクレオチドは、（ａ）および（ｃ）の第１および第２のＩＴＲに挟まれている。

【0186】

二重アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムが本明細書においてさらに開示される。いくつかの実施形態では、二重ＡＡＶベクターシステムは、（ａ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む第１のＡＡＶベクターおよび（ｂ）本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む第２のＡＡＶベクターを含む。

【0187】

二重アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムが本明細書においてさらに開示される。いくつかの実施形態では、二重ＡＡＶベクターシステムは、（ａ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれかを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる第１のＡＡＶベクター（ｂ）本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれかを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる第２のＡＡＶベクターを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。

【0188】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが本明細書においてさらに開示される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む。

【0189】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、ウイルスまたはウイルス粒子）、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞および組成物は、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、プロモーター、イントロン、選択マーカーまたは複製起点（ＯＲＩ）を含むか、それからなるか、それから本質的になる１またはそれを超えるヌクレオチド配列をさらに含む。

【0191】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞および組成物は、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、選択マーカー、複製起点（ＯＲＩ）、非翻訳領域（ＵＴＲ）またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む１またはそれを超える追加のヌクレオチド配列をさらに含む。

【0192】

ジスフェリン異常症を処置する方法が本明細書でさらに開示される。いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症を処置する方法は、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞、および組成物のいずれかを投与することを含む。

【0193】

本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞および組成物のいずれかの、ジスフェリン異常症を処置するための医薬の製造における使用が本明細書でさらに開示される。

【0194】

相同組換えフラグメントおよびｈＤＹＳＦ断片

【0195】

ＡＡＶ媒介遺伝子治療は、複数の疾患のための望ましい処置戦略を提示するが、ＡＡＶビリオンの制限的な４．７ｋｂのパッケージング限界によって妨げられる。現在の治療法または有効な治療がない疾患、例えば、ジスフェリン異常症が特に興味深い。本明細書では、２つの部分ゲノムの相同組換えによってジスフェリン遺伝子の全長を作製または産生する方法が開示される。一例では、２つの部分的にパッケージングされたゲノムが、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ５’．ＰＴＧおよびｐＡＡＶ．ＤＹＳＦ３’．ＰＯＬＹＡとして図１に示されている。２つのゲノムが、ＡＡＶベクターにパッケージングされることによるウイルス送達または非ウイルス法（例えば、ＬＮＰ）のいずれによるかにかかわらず、細胞（例えば、筋細胞）に送達されると、それらは全長ジスフェリンコード領域を含む転写物を生成し、機能的ジスフェリンタンパク質の発現をもたらす。２つのポリヌクレオチド間の重複領域は、全長ジスフェリン遺伝子を含有する転写物をもたらす相同組換えを促進する。全長ジスフェリン遺伝子を２つの部分的にパッケージングされたゲノムに分離することによって、この方法は、ＡＡＶパッケージングの制限を回避し、機能的な全長ジスフェリン遺伝子を産生することに成功する。一実施形態では、転写物は、配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む発現カセットである。一実施形態では、転写物は、配列番号２０の配列を含む発現カセットである。

【0196】

いくつかの実施形態では、ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドであって、組換えポリヌクレオチド配列が、配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチドが本明細書において開示される。いくつかの例では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの例では、組換えポリペプチドを作製する方法が本明細書に開示される。いくつかの例では、この方法は、細胞を、ｈＤＹＳＦタンパク質の５’断片をコードする組換えポリヌクレオチドおよびｈＤＹＳＦタンパク質の３’断片をコードする第２の組換えポリヌクレオチドと接触させることを含む。いくつかの例では、この方法は、細胞を、本明細書に記載の二重ＡＡＶベクターシステムと接触させることを含む。いくつかの例では、細胞は、真核細胞であり、必要に応じて筋肉細胞、心臓細胞、および／または肝臓細胞である。いくつかの例では、この方法は、ｈＤＹＳＦタンパク質の５’断片をコードする組換えポリヌクレオチドおよびｈＤＹＳＦタンパク質の３’断片をコードする第２の組換えポリヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの例では、この方法は、本明細書に記載の二重ＡＡＶベクターシステムを対象に投与することを含む。いくつかの例では、この方法は、配列番号２０、または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドを発現させることによって、対象の筋ジストロフィーを処置することを含む。いくつかの例では、対象は、必要に応じてＬＧＭＤ２Ｂまたは三好ミオパチーから選択される、ジスフェリン異常症を罹患している。

【0197】

また、本明細書中には、それぞれがヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードする２つの組換えポリヌクレオチドも開示され、それらは上記のような相同組換えによる全長ジスフェリン遺伝子の産生をもたらし得る。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドはｈＤＹＳＦタンパク質の５’断片をコードする。いくつかの実施形態では、ｈＤＹＳＦタンパク質の５’断片をコードする組換えポリヌクレオチドは、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドと呼ばれる。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドはｈＤＹＳＦタンパク質の３’断片をコードする。いくつかの実施形態では、ｈＤＹＳＦタンパク質の３’断片をコードする組換えポリヌクレオチドは、３’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドと呼ばれる。

【0198】

５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチド

【0199】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域の３３３０～３３６５、３３３０～３３６０、３３３０～３３５５、３３３５～３３６５、３３３５～３３５０、３３４０～３３６５、３３４０～３３６０、または３３４０～３３５５の連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域の３３６０、３３５９、３３５８、３３５７、３３５６、３３５５、３３５４、３３５３、３３５２、３３５１、３３５０、３３４９、３３４８、３３４７、３３４６、３３４５、３３４４、３３４３、３３４２、３３４１、もしくは３３４０またはそれよりも少ない連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0200】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域の３３３０～３３６５、３３３０～３３６０、３３３０～３３５５、３３３５～３３６５、３３３５～３３５０、３３４０～３３６５、３３４０～３３６０、または３３４０～３３５５の連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域の３３６０、３３５９、３３５８、３３５７、３３５６、３３５５、３３５４、３３５３、３３５２、３３５１、３３５０、３３４９、３３４８、３３４７、３３４６、３３４５、３３４４、３３４３、３３４２、３３４１、もしくは３３４０またはそれよりも少ない連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％である。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0201】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域の３３３０～３３６５、３３３０～３３６０、３３３０～３３５５、３３３５～３３６５、３３３５～３３５０、３３４０～３３６５、３３４０～３３６０、または３３４０～３３５５の連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域内に３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個またはそれよりも少ないヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域の３３６０、３３５９、３３５８、３３５７、３３５６、３３５５、３３５４、３３５３、３３５２、３３５１、３３５０、３３４９、３３４８、３３４７、３３４６、３３４５、３３４４、３３４３、３３４２、３３４１、もしくは３３４０、またはそれよりも少ない連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域内に３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個またはそれよりも少ないヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域内に１５個またはそれよりも少ないヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域内に１０個またはそれよりも少ないヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域内に５個またはそれよりも少ないヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域内に１個のヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド１００～４０００、１００～３９００、１００～３８００、１００～３７５０、１００～３７１６、１５０～４０００、１５０～３９００、１５０～３８００、１５０～３７５０、１５０～３７１６、２００～４０００、２００～３９００、２００～３８００、２００～３７５０、２００～３７１６、２５０～４０００、２５０～３９００、２５０～３８００、２５０～３７５０、２５０～３７１６、３００～４０００、３００～３９００、３００～３８００、３００～３７５０、３００～３７１６、３５０～４０００、３５０～３９００、３５０～３８００、３５０～３７５０、３５０～３７１６、３７０～４０００、３７０～３９００、３７０～３８００、３７０～３７５０、３７０～３７１６、３７７～４０００、３７７～３９００、３７７～３８００、３７７～３７５０、または３７７～３７１６の領域内に少なくとも１個のヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド３７７～３７１６の領域内に少なくとも１個のヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0202】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１の３３３０～３３６５、３３３０～３３６０、３３３０～３３５５、３３３５～３３６５、３３３５～３３５０、３３４０～３３６５、３３４０～３３６０、または３３４０～３３５５の連続するヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、５’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１の３３６０、３３５９、３３５８、３３５７、３３５６、３３５５、３３５４、３３５３、３３５２、３３５１、３３５０、３３４９、３３４８、３３４７、３３４６、３３４５、３３４４、３３４３、３３４２、３３４１、もしくは３３４０、またはそれよりも少ない連続するヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、５’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域のヌクレオチド配列と少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0203】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域のヌクレオチド配列に対して１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個またはそれよりも少ないヌクレオチドのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域のヌクレオチド配列に対して５個またはそれよりも少ないヌクレオチドのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域のヌクレオチド配列に対して２個またはそれよりも少ないヌクレオチドのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域のヌクレオチド配列に対して１個またはそれよりも少ないヌクレオチドのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0204】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１の３３６０、３３５９、３３５８、３３５７、３３５６、３３５５、３３５４、３３５３、３３５２、３３５１、３３５０、３３４９、３３４８、３３４７、３３４６、３３４５、３３４４、３３４３、３３４２、３３４１、もしくは３３４０、またはそれよりも少ない連続するヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、５’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、５’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域を含み、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置３４００～３７１６、３４００～３７００、３４００～３６５０、３４００～３６００、３４００～３５５０、３４００～３５００、３３９０～３７１６、３３９０～３７００、３３９０～３６５０、３３９０～３６００、３３９０～３５５０、３３９０～３５００、３３８０～３７１６、３３８０～３７００、３３８０～３６５０、３３８０～３５００、３３７１～３７１６、３３７１～３７００、３３７１～３６５０、３３７１～３６００、３３７１～３５５０、または３３７１～３５００を含む領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0205】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１の３３３０～３３６５、３３３０～３３６０、３３３０～３３５５、３３３５～３３６５、３３３５～３３５０、３３４０～３３６５、３３４０～３３６０、または３３４０～３３５５の連続するヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、５’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置１～１００、１～２００、１～３００、１～３５０、１～３７５、１～３７６、１００～２００、１００～３００、１００～３５０、１００～３７５、１００～３７６、２００～３００、２００～３５０、２００～３７５、または２００～３７６からなる領域を含まない。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置１～３７６からなる領域を含まない。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0206】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１の３３６０、３３５９、３３５８、３３５７、３３５６、３３５５、３３５４、３３５３、３３５２、３３５１、３３５０、３３４９、３３４８、３３４７、３３４６、３３４５、３３４４、３３４３、３３４２、３３４１、もしくは３３４０、またはそれよりも少ない連続するヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、５’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置１～１００、１～２００、１～３００、１～３５０、１～３７５、１００～２００、１００～３００、１００～３５０、１００～３７５、２００～３００、２００～３５０、２００～３７５からなる領域を含まない。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置１～３７６からなる領域を含まない。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0207】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１の全長にわたって配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１の全長にわたって配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１の全長にわたって配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１の全長にわたって配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0208】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１３の全長にわたって配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１３の全長にわたって配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１３の全長にわたって配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１３の全長にわたって配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0209】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、野生型ｈＤＳＹＦタンパク質のＮ末端領域を含むｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、野生型ｈＤＳＹＦタンパク質のＮ末端領域を含むｈＤＹＳＦタンパク質の断片は、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質と呼ばれる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸残基１～１１１３、２００～１１１３、４００～１１１３、５００～１１１３、６００～１１１３、６５０～１１３、６５０～１１００、７００～１１００、７００～１１１３、７００～１０５０、７００～１０００、８００～１１１３、８００～１１００、８００～１０５０、９００～１１１３、９００～１１００、１０００～１１１３、または１０００～１１００を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる領域を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＮ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸残基１～１１１３、２００～１１１３、４００～１１１３、５００～１１１３、６００～１１１３、６５０～１１３、６５０～１１００、７００～１１００、７００～１１１３、７００～１０５０、７００～１０００、８００～１１１３、８００～１１００、８００～１０５０、９００～１１１３、９００～１１００、１０００～１１１３、または１０００～１１００を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、アミノ酸残基９９９～１１１３、９９９～１１００、１０００～１１１３、または１０００～１１００を含む、からなる、または本質的にからなる領域を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0210】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、少なくとも１０００アミノ酸長であり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸残基９９９～１１１３、９９９～１１００、１０００～１１１３、または１０００～１１００を含む領域を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＮ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、少なくとも１０００アミノ酸長であり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸残基９９９～１１１３、９９９～１１００、１０００～１１１３、または１０００～１１００を含む領域を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0211】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0212】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＮ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＮ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＮ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＮ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＮ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号９の全長にわたって配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号９の全長にわたって配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号９の全長にわたって配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９２％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号９の全長にわたって配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号９の全長にわたって配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0213】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号６の全長にわたって配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号６の全長にわたって配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号６の全長にわたって配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0214】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１５の全長にわたって配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１５の全長にわたって配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１５の全長にわたって配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0215】

３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチド

【0216】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域の３５００～４１００、３５００～４０００、３５００～３９００、３５００～３８８０、３５００～３８７０、３６００～４１００、３６００～４０００、３６００～３９００、３６００～３８８０、３６００～３８７０、３７００～４１００、３７００～４０００、３７００～３９００、３７００～３８８０、３７００～３８７０、３８００～４１００、３８００～４０００、または３８００～３９００の連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域の４１００、４０００、３９００、３８８０、もしくは３８７０、またはそれよりも少ない連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0217】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域の３５００～４１００、３５００～４０００、３５００～３９００、３５００～３８８０、３５００～３８７０、３６００～４１００、３６００～４０００、３６００～３９００、３６００～３８８０、３６００～３８７０、３７００～４１００、３７００～４０００、３７００～３９００、３７００～３８８０、３７００～３８７０、３８００～４１００、３８００～４０００、または３８００～３９００の連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域の４１００、４０００、３９００、３８８０、もしくは３８７０、またはそれよりも少ない連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％である。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域の全長にわたって配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0218】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域の３５００～４１００、３５００～４０００、３５００～３９００、３５００～３８８０、３５００～３８７０、３６００～４１００、３６００～４０００、３６００～３９００、３６００～３８８０、３６００～３８７０、３７００～４１００、３７００～４０００、３７００～３９００、３７００～３８８０、３７００～３８７０、３８００～４１００、３８００～４０００、または３８００～３９００の連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域内に３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個またはそれよりも少ないヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域の４１００、４０００、３９００、３８８０、もしくは３８７０、またはそれよりも少ない連続ヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域内に３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個またはそれよりも少ないヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域内に１５個またはそれよりも少ないヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域内に１０個またはそれよりも少ないヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域内に５個またはそれよりも少ないヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域内に１個のヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２６００～６８５０、２６００～６８００、２６００～６７８０、２６００～６７５０、２６００～６７２５、２６００～６７００、２７００～６８５０、２７００～６８００、２７００～６７８０、２７００～６７５０、２７００～６７２５、２７００～６７００、２７００～６６８０、２７００～６６５０、２７００～６６２５、２７００～６６２０、２７００～６６１９、２７５０～６８５０、２７５０～６８００、２７５０～６７８０、２７５０～６７５０、２７５０～６７２５、２７５０～６７００、２７５０～６６８０、２７５０～６６５０、２７５０～６６２５、２７５０～６６２０、２７５０～６６１９、２７５４～６８５０、２７５４～６８００、２７５４～６７８０、２７５４～６７５０、２７５４～６７２５、２７５４～６７００、２７５４～６６８０、２７５４～６６５０、２７５４～６６２５、２７５４～６６２０、または２７５４～６６１９の領域内に少なくとも１個のヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、５’ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド２７５４～６６１９の領域内に少なくとも１個のヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0219】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１の３５００～４１００、３５００～４０００、３５００～３９００、３５００～３８８０、３５００～３８７０、３６００～４１００、３６００～４０００、３６００～３９００、３６００～３８８０、３６００～３８７０、３７００～４１００、３７００～４０００、３７００～３９００、３７００～３８８０、３７００～３８７０、３８００～４１００、３８００～４０００、または３８００～３９００の連続するヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、５’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置６６２０～６９１４、６６２０～６９００、６６２０～６８００、６６２０～６７００、６７００～６９１４、６７００～６８００、６８００～６９１４、または６８００～６９００からなる領域を含まない。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置６６２０～６９１４からなる領域を含まない。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0220】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１１の４１００、４０００、３９００、３８８０、もしくは３８７０、またはそれよりも少ない連続するヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、３’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置６６２０～６９１４、６６２０～６９００、６６２０～６８００、６６２０～６７００、６７００～６９１４、６７００～６８００、６８００～６９１４、または６８００～６９００からなる領域を含まない。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド位置６６２０～６９１４からなる領域を含まない。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0221】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号２の全長にわたって配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号２の全長にわたって配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号２の全長にわたって配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号２の全長にわたって配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0222】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１４の全長にわたって配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１４の全長にわたって配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１４の全長にわたって配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１４の全長にわたって配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0223】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、野生型ｈＤＳＹＦタンパク質のＣ末端領域を含むｈＤＹＳＦタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、野生型ｈＤＳＹＦタンパク質のＣ末端領域を含むｈＤＹＳＦタンパク質の断片は、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質と呼ばれる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸残基７５０～２０８０、７５０～２０００、７５０～１９００、７７５～２０８０、７７５～２０００、７７５～１９００、７９４～２０８０、７９４～２０００、または７９４～１９００を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる領域を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＣ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸残基７５０～２０８０、７５０～２０００、７５０～１９００、７７５～２０８０、７７５～２０００、７７５～１９００、７９４～２０８０、７９４～２０００、または７９４～１９００を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる領域を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0224】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、１４００、１３５０、１３２５、１３００、１２９０、もしくは１２８７、またはそれよりも少ないアミノ酸長を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸残基７５０～２０８０、７５０～２０００、７５０～１９００、７７５～２０８０、７７５～２０００、７７５～１９００、７９４～２０８０、７９４～２０００、または７９４～１９００を含む領域を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＣ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、少なくとも１４００、１３５０、１３２５、１３００、１２９０、もしくは１２８７、またはそれよりも少ないアミノ酸長であり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸残基７５０～２０８０、７５０～２０００、７５０～１９００、７７５～２０８０、７７５～２０００、７７５～１９００、７９４～２０８０、７９４～２０００、または７９４～１９００を含む領域を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0225】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、１４００、１３５０、１３２５、１３００、１２９０、もしくは１２８７、またはそれよりも少ないアミノ酸長を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸残基６７８～７９３、６７８～７５０、６７８～７２５、または６７８～７００を含む領域を含まない。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0226】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0227】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＣ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＣ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＣ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＣ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってＣ末端ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１０の全長にわたって配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１０の全長にわたって配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１０の全長にわたって配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９２％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１０の全長にわたって配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ｈＤＹＳＦタンパク質は、配列番号１０の全長にわたって配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0228】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号８の全長にわたって配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号８の全長にわたって配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号８の全長にわたって配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0229】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１６の全長にわたって配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１６の全長にわたって配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、配列番号１６の全長にわたって配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。

【0230】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＳＹＦポリヌクレオチドおよび３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドの配列は、少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、９５０、９６０、または９６３ヌクレオチドの重複を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ｈＤＳＹＦタンパク質およびＣ末端ｈＤＳＹＦタンパク質の配列は、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、または３２０アミノ酸の重複を含む。

【0231】

逆位末端反復配列

【0232】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞および組成物は、１またはそれを超える逆位末端反復配列（ＩＴＲＳ）を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞および組成物は、２個、３個、４個、５個、もしくは６個、またはそれを超えるＩＴＲを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる２個、３個、４個、５個、もしくは６個、またはそれを超えるヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、２個またはそれを超えるＩＴＲは同じである。いくつかの実施形態では、２個またはそれを超えるＩＴＲは異なる。

【0233】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは２個またはそれを超えるＩＴＲに挟まれている。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ＩＴＲの第１の対に挟まれている。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドは、ＩＴＲの第２の対に挟まれている。いくつかの実施形態では、ＩＴＲの第１の対におけるＩＴＲは同じである。いくつかの実施形態では、ＩＴＲの第１の対におけるＩＴＲは異なる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲの第２の対におけるＩＴＲは同じである。いくつかの実施形態では、ＩＴＲの第２の対におけるＩＴＲは異なる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲの第１の対におけるＩＴＲは、ＩＴＲの第２の対におけるＩＴＲと同じである。いくつかの実施形態では、ＩＴＲの第１の対における少なくとも１つのＩＴＲは、ＩＴＲの第２の対における少なくとも１つのＩＴＲと同じである。いくつかの実施形態では、ＩＴＲの第１の対におけるＩＴＲは、ＩＴＲの第２の対におけるＩＴＲとは異なる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲの第１の対における少なくとも１つのＩＴＲは、ＩＴＲの第２の対における少なくとも１つのＩＴＲとは異なる。

【0234】

いくつかの実施形態では、ＩＴＲはウイルス性ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２およびＡＡＶ－１３の少なくとも１つの由来のＩＴＲから選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２
ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ５ ＩＴＲである。ＡＡＶ１～６のＩＴＲ配列は、例えばＧｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（１）：４２６－３９，２００６に見ることができ、その全体が参照により組み込まれる。

【0235】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは逆位末端反復配列（ＩＴＲ）以外のＡＡＶ配列を含まない。

【0236】

いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは逆位末端反復配列（ＩＴＲ）以外のウイルス配列を含まない。

【0237】

いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３の全長にわたって配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３の全長にわたって配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３の全長にわたって配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３のヌクレオチド配列に対する１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１個、またはそれより少ないヌクレオチドのミスマッチを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３のヌクレオチド配列に対する５個またはそれより少ないヌクレオチドのミスマッチを含むヌクレオチド配列を含む。

【0238】

プロモーター

【0239】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞および組成物は、１またはそれを超えるプロモーターを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは真核生物プロモーターである。真核生物プロモーターの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ホスホリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）プロモーター、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ヒトＵ６核（Ｕ６）プロモーターおよびＵＡＳプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、プロモーターは哺乳動物プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。

【0240】

いくつかの実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。組織の例としては、筋肉組織、上皮組織、結合組織および神経組織が挙げられるが、これらに限定されない。組織特異的プロモーターの例には、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ－２プロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｂＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３プロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４５プロモーター、およびＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

【0241】

いくつかの実施形態では、プロモーターは筋肉特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、ミオシン重鎖複合体－Ｅボックス筋肉クレアチンキナーゼ融合エンハンサー／プロモーターである。

【0242】

いくつかの実施形態では、プロモーターは組換えプロモーターである。いくつかの実施形態では、組換えプロモーターは組換え筋肉特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、組換え筋肉特異的プロモーターは、組換えミオシン重鎖クレアチンキナーゼ筋肉特異的プロモーターである。別の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、デスミンプロモーター、骨格アルファ－アクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合エレメント、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子を含む。

【0243】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号４の全長にわたって配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0244】

イントロン

【0245】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞および組成物は、１またはそれを超えるイントロンを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、イントロンは真核生物イントロンである。いくつかの実施形態では、イントロンは哺乳動物イントロンである。いくつかの実施形態では、イントロンは合成イントロンである。いくつかの実施形態では、イントロンはキメライントロンである。いくつかの実施形態では、イントロンは非コードエクソンに由来する。いくつかの実施形態では、イントロンは、５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドの上流にあり、またはそれに対して５’である。

【0246】

いくつかの実施形態では、イントロンは、５’ドナー部位、分岐点、または３’スプライス部位のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、５’ドナー部位、分岐点、または３’スプライス部位のうちの２またはそれを超えるものを含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、５’ドナー部位、分岐点、および３’スプライス部位を含む。

【0247】

いくつかの実施形態では、イントロンは、ヒトβ－グロビン遺伝子由来の５’ドナー部位を含む。

【0248】

いくつかの実施形態では、イントロンは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖由来の分岐点を含む。

【0249】

いくつかの実施形態では、イントロンは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖由来の３’スプライスアクセプター部位を含む

【0250】

いくつかの実施形態では、イントロンは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、配列番号５の全長にわたって配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0251】

選択マーカー

【0252】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞および組成物は、１またはそれを超える選択マーカーを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、細菌選択マーカーである。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。抗生物質耐性遺伝子の例としては、β－ラクタマーゼ、カナマイシン耐性遺伝子、Ｔｎ５由来のｎｅｏ遺伝子、大腸菌ゲノム由来の突然変異体ＦａｂＩ遺伝子、およびＵＲＡ３（酵母由来のオロチジン－５’リン酸デカルボキシラーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、β－ラクタマーゼ遺伝子である。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子である。

【0253】

ポリアデニル化シグナル

【0254】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステム、ウイルスパッケージングシステム、細胞および組成物は、１またはそれを超えるポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルは人工ポリＡシグナルである。

【0255】

いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルは、配列番号７の全長にわたって配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0256】

発現カセットおよびパッケージングシステム

【0257】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットが本明細書においてさらに開示される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、（ａ）本明細書に開示される逆位末端反復配列（ＩＴＲのいずれかを含む第１のＩＴＲであって；（ｂ）本明細書中に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれか；（ｃ）本明細書に開示されるＩＴＲのいずれかを含む第２のＩＴＲを含み、（ｂ）の５’ｈＹＤＳＹＦポリヌクレオチドは、（ａ）および（ｃ）の第１および第２のＩＴＲに挟まれている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含むＡＡＶ発現カセットは、５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットと呼ばれる。

【0258】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが本明細書においてさらに開示される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、（ａ）本明細書に開示される逆位末端反復配列（ＩＴＲのいずれかを含む第１のＩＴＲであって；（ｂ）本明細書中に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれか；（ｃ）本明細書に開示されるＩＴＲのいずれかを含む第２のＩＴＲを含み、（ｂ）の３’ｈＹＤＳＹＦポリヌクレオチドは、（ａ）および（ｃ）の第１および第２のＩＴＲに挟まれている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含むＡＡＶ発現カセットは、３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットと呼ばれる。

【0259】

いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットは、（ａ）第１の反転末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１の全長にわたって配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１３の全長にわたって配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質が、配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第２のＩＴＲを含み、ポリヌクレオチド配列は、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲに挟まれている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶ発現カセットのいずれかは、プロモーター、イントロン、選択マーカー、または複製起点（ＯＲＩ）を含む１またはそれを超える追加のポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号６の全長にわたって配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１５の全長にわたって配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは逆位末端反復配列（ＩＴＲ）以外のＡＡＶ配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは逆位末端反復配列（ＩＴＲ）以外のウイルス配列を含まない。

【0260】

いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットは、（ａ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１４の全長にわたって配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列；（ｖ）ｈＤＹＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ｈＤＹＳＦタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または（ｖｉ）（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列；からなるポリヌクレオチド、および（ｃ）第２のＩＴＲを含み、ポリヌクレオチド配列は、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲに挟まれている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号８の全長にわたって配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１６の全長にわたって配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、選択マーカー、複製起点（ＯＲＩ）、非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む１またはそれを超えるポリヌクレオチド配列をさらに含む。

【0261】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）パッケージングシステムが本明細書においてさらに開示される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶパッケージングシステムは、（ａ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセット（ｂ）アデノウイルスヘルパープラスミド；および（ｃ）ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子はＡＡＶ複製を媒介する。いくつかの実施形態では、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子は、Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡから選択される。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドは、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ６２、およびＲｅｐ４０から選択される１またはそれを超えるライフサイクルタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から選択される、１またはそれを超えるキャプシドタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットは１またはそれを超えるＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲの血清型は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の血清型と同じである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲの血清型は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の血清型とは異なる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の血清型は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の血清型と同じである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の血清型は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の血清型とは異なる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ
ＡＡＶ発現カセットのいずれかを含むＡＡＶパッケージングシステムを５’ｈＤＹＳＦ
ＡＡＶパッケージングシステムと呼ぶ。

【0262】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶパッケージングシステムは、（ａ）本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセット（ｂ）アデノウイルスヘルパープラスミド；および（ｃ）ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子はＡＡＶ複製を媒介する。いくつかの実施形態では、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子は、Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡから選択される。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドは、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ６２、およびＲｅｐ４０から選択される１またはそれを超えるライフサイクルタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から選択される、１またはそれを超えるキャプシドタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットは１またはそれを超えるＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ
ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲの血清型は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の血清型と同じである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲの血清型は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の血清型とは異なる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ
ｒｅｐ遺伝子の血清型は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の血清型と同じである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の血清型は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の血清型とは異なる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットのいずれかを含むＡＡＶパッケージングシステムを３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶパッケージングシステムと呼ぶ。

【0263】

いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルスパッケージングシステムは、（ａ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセット；および（ｂ）アデノウイルスヘルパープラスミドのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子はＡＡＶ複製を媒介する。いくつかの実施形態では、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子は、Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡから選択される。

【0264】

いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルスパッケージングシステムは、（ａ）本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセット；および（ｂ）アデノウイルスヘルパープラスミドのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子はＡＡＶ複製を媒介する。いくつかの実施形態では、アデノウイルス由来の１またはそれを超える遺伝子は、Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡから選択される。

【0265】

ウイルスベクター

【0266】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶウイルスまたはＡＡＶ粒子）が、本明細書においてさらに開示される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含むＡＡＶベクターは、５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターと呼ばれる。

【0267】

いくつかの実施形態では、５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターは、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットのいずれかを含む。

【0268】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含むＡＡＶベクターは、３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターと呼ばれる。

【0269】

いくつかの実施形態では、３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターは、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットのいずれかを含む。

【0270】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、ｒｈ．１０、ｒｈ．２０、またはｒｈ．７４のＡＶＶである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは血清型ｒｈ．７４のＡＡＶである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは血清型５のＡＡＶではない。

【0271】

本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に開示される２またはそれを超えるＡＡＶベクターを含む二重アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムである。いくつかの実施形態では、二重ＡＡＶベクターシステムは、（ａ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む第１のＡＡＶベクターおよび（ｂ）本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む第２のＡＡＶベクターを含む。

【0272】

いくつかの実施形態では、二重ＡＡＶベクターシステムは、（ａ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれかを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる第１のＡＡＶベクター（ｂ）本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれかを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる第２のＡＡＶベクターを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。

【0273】

組成物

【0274】

本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む、からなる、またはから本質的になる組成物である。本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む、からなる、またはから本質的になる組成物である。本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦプラスミドのいずれかを含む、からなる、またはから本質的になる組成物である。本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦプラスミドのいずれかを含む、からなる、またはから本質的になる組成物である。本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に開示される二重ＡＡＶベクターシステムのいずれかを含む、からなる、またはから本質的になる組成物である。本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいずれかを含む、からなる、またはから本質的になる組成物である。

【0275】

（ａ）本明細書に開示する５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む、それからなる、または本質的にそれからなる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；および（ｂ）薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる、組成物が本明細書でさらに開示される。

【0276】

（ａ）本明細書に開示する３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む、それからなる、または本質的にそれからなる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；および（ｂ）薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる、組成物が本明細書でさらに開示される。

【0277】

（ａ）第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、第１のｒＡＡＶが、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む、それからなる、または本質的にそれからなるもの；および（ｂ）第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、第２のｒＡＡＶが、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む、それからなる、または本質的にそれからなるもの、を含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる、組成物が本明細書でさらに開示される。

【0278】

（ａ）第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、第１のＡＡＶ粒子が、本明細書に開示する５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれかを含む、それからなる、または本質的にそれからなるもの；および（ｂ）第２のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、第２のＡＡＶ粒子が、本明細書に開示する３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれかを含む、それからなる、または本質的にそれからなるもの、を含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる、組成物が本明細書でさらに開示される。

【0279】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意の組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントをさらに含む。許容され得る担体、希釈剤およびアジュバントは、レシピエントに対して非毒性であり、好ましくは使用される投与量および濃度で不活性であり、緩衝液およびプルロニック（登録商標）などの界面活性剤を含む。許容され得る担体の例としては、リン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0280】

薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤は、注射可能な使用に適したものであり得る。注射用途に適した薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤の例としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。すべての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の管理、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。

【0281】

滅菌注射用溶液は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、または二重ベクターシステムを、必要に応じて、上に列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要な量で組み込み、続いてフィルタ滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、滅菌された活性成分を、塩基性分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末が、以前に滅菌濾過されたその溶液から得られる。

【0282】

ＡＡＶベクターの産生方法

【0283】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ウイルスまたはウイルス粒子）を産生する方法が本明細書に開示される。ＡＡＶベクターを産生する方法は当技術分野で公知である。例えば、そのような方法は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ産生の一般原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５３３－１５３９，１９９２；およびＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９，１９９２に概説されており、その各々は参照によりその全体が組み込まれる。ＡＡＶを産生するための様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２，１９８４；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６，１９８４；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１，１９８５；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３，１９８８；ａｎｄ Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９，１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８，１９８９；米国特許第５，１７３，４１４号；国際公開第９５／１３３６５号および対応する米国特許第５，６５８．７７６号；国際公開第９５／１３３９２号；国際公開第９６／１７９４７号；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；国際公開第９７／０９４４１号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；国際公開第９７／０８２９８号（ＰＣＴ／ＵＳ ９６／１３８７２）；国際公開第９７／２１８２５号（ＰＣＴ／ＵＳ ９６／２０７７７）；国際公開第９７／０６２４３号（ＰＣＴ／ＦＲ ９６／０１０６４）；国際公開第９９／１１７６４号；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０，１９９５；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５，１９９３；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２，１９９６；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；および米国特許６，２５８，５９５号に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる。

【0284】

いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生するための方法は、本明細書に開示されるＡＡＶパッケージングシステムのいずれかで細胞を形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、アデノ随伴ウイルスのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を安定に発現する組換え細胞である。いくつかの実施形態では、本方法は、形質導入細胞の集団を産生するために細胞を培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、形質導入細胞の集団から上清を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、上清を１またはそれを超える精製工程に供して精製ＡＡＶベクター試料を生成することをさらに含み、ＡＡＶベクター試料は細胞デブリおよびタンパク質を実質的に含まない。代替的に、または追加して、本方法は、形質導入細胞の集団を溶解して細胞溶解物を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞溶解物を１またはそれを超える精製工程に供して精製ＡＡＶベクター試料を生成することをさらに含み、ＡＡＶベクター試料は、細胞デブリおよびタンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、精製ＡＡＶベクター試料の純度は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％純粋である。

【0285】

いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生するための方法は、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶパッケージングシステムのいずれかで細胞を形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、アデノ随伴ウイルスのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を安定に発現する組換え細胞である。いくつかの実施形態では、本方法は、形質導入細胞の集団を産生するために細胞を培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、形質導入細胞の集団から上清を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、上清を１またはそれを超える精製工程に供して精製ＡＡＶベクター試料を生成することをさらに含み、ＡＡＶベクター試料は細胞デブリおよびタンパク質を実質的に含まない。代替的に、または追加して、本方法は、形質導入細胞の集団を溶解して細胞溶解物を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞溶解物を１またはそれを超える精製工程に供して精製ＡＡＶベクター試料を生成することをさらに含み、ＡＡＶベクター試料は、細胞デブリおよびタンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、精製ＡＡＶベクター試料の純度は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％純粋である。

【0286】

いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生するための方法は、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶパッケージングシステムのいずれかで細胞を形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、アデノ随伴ウイルスのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を安定に発現する組換え細胞である。いくつかの実施形態では、本方法は、形質導入細胞の集団を産生するために細胞を培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、形質導入細胞の集団から上清を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、上清を１またはそれを超える精製工程に供して精製ＡＡＶベクター試料を生成することをさらに含み、ＡＡＶベクター試料は細胞デブリおよびタンパク質を実質的に含まない。代替的に、または追加して、本方法は、形質導入細胞の集団を溶解して細胞溶解物を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞溶解物を１またはそれを超える精製工程に供して精製ＡＡＶベクター試料を生成することをさらに含み、ＡＡＶベクター試料は、細胞デブリおよびタンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、精製ＡＡＶベクター試料の純度は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％純粋である。

【0287】

細胞

【0288】

本明細書中にさらに開示されるのは、本明細書中に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞である。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。真核細胞の非限定的な例としては、哺乳動物、例えばハムスター、マウス、ラット、イヌ、ヒツジまたはヒトの細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含むプラスミドでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、細胞に、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットのいずれかを形質導入する。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれかに感染する。

【0289】

本明細書中にさらに開示されるのは、本明細書中に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含むプラスミドでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、細胞に、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットのいずれかを形質導入する。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれかに感染する。

【0290】

本明細書に開示される細胞のいずれも、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞であり得る。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞およびＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３株）などの安定に形質転換された癌細胞である。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞でない細胞、例えば低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎臓細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。原核細胞の非限定的な例には、細菌細胞（例えば、大腸菌）および古細菌細胞が含まれる。本開示の細胞は、細胞バンク、例えば、非ＧＭＰ目的用のアクセション細胞バンク（ＡＣＢ）またはＧＭＰマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を産生するために使用することができる。細胞のアリコートは、一実施形態では、産生用のバイオリアクタ内で培養する前に、元の接種材料からより大きな体積に拡大される。

【0291】

処置方法

【0292】

ジスフェリン異常症を処置する方法が本明細書でさらに開示される。いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症を処置する方法は、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、（ａ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む有効量の第１のポリヌクレオチド；および（ｂ）本明細書中に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかを含む有効量の第２のポリヌクレオチドを、投与することを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレー経鼻、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）によって投与される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレー経鼻、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）によって投与される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、同時に投与される。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、順次投与される。いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0293】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症を処置する方法は、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、（ａ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのいずれかを含む有効量の第１のＡＡＶベクター；および（ｂ）本明細書中に開示される３’ｈＤＹＳＦアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのいずれかを含む有効量の第２のＡＡＶベクターを、投与することを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレー経鼻、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）によって投与される。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレー経鼻、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）によって投与される。いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第１および第２のＡＡＶベクターは同時に投与される。いくつかの実施形態では、第１および第２のＡＡＶベクターは順次投与される。いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0294】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症を処置する方法は、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、（ａ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットのいずれかを含む有効量の第１のＡＡＶ発現カセット；および（ｂ）本明細書に開示される３’ｈＤＳＹＦ ＡＡＶ発現カセットのいずれかを含む有効量の第２のＡＡＶ発現カセットを投与することを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶ発現カセットは、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレー経鼻、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）によって投与される。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶ発現カセットは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶ発現カセットは、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレー経鼻、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）によって投与される。いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶ発現カセットは筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、第１および第２のＡＡＶ発現カセットは同時に投与される。いくつかの実施形態では、第１および第２のＡＡＶ発現カセットは順次投与される。いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0295】

いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症を処置する方法は、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、（ａ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかおよび本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれか；（ｂ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれかおよび本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれか；（ｃ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットのいずれかおよび本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットのいずれか；または（ｄ）本明細書に開示される二重ＡＡＶベクターシステムのいずれかを含む、有効量の組成物を投与することを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、組成物は、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレー経鼻、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0296】

本明細書中にさらに開示されるのは、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象におけるジスフェリン異常症を処置するための医薬の製造における組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、ベクターシステムおよび組成物のいずれかの使用である。
本明細書において開示されるのは、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象におけるジスフェリン異常症を処置するための医薬の製造における、（ａ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれかおよび本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦポリヌクレオチドのいずれか；（ｂ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれかおよび本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターのいずれか；（ｃ）本明細書に開示される５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットのいずれかおよび本明細書に開示される３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶ発現カセットのいずれか；または（ｄ）（ｅ）本明細書に開示される二重ＡＡＶベクターシステムのいずれかを含む組成物の使用である。いくつかの実施形態では、組成物は、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレー経鼻、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は筋肉内または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ジスフェリン異常症は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである。

【0297】

本発明の方法で投与されるＡＡＶベクターの力価は、例えば、特定のＡＡＶ、投与様式、処置目標、個体、および標的とされる細胞型（複数可）に応じて異なり、当技術分野で標準的な方法によって決定され得る。ＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり少なくとも約１ｘ１０^６、約１ｘ１０^７、約１ｘ１０^８、約１ｘ１０^９、約１ｘ１０^１０、約１ｘ１０^１１、約１ｘ１０^１２、約１ｘ１０^１３～約１ｘ１０^１４またはそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投与量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表され得る。例えば、ＡＡＶの投与量は、少なくとも約１ｘ１０^６、約１ｘ１０^７、約１ｘ１０^８、約１ｘ１０^９、約１ｘ１０^１０、約１ｘ１０^１１、約１ｘ１０^１２、約２ｘ１０^１２、約３ｘ１０^１２、約４ｘ１０^１２、約５ｘ１０^１２、約６ｘ１０^１２、約７ｘ１０^１２、約８ｘ１０^１２、約９ｘ１０^１２、約１ｘ１０^１３～約１ｘ１０^１４ウイルスゲノムの範囲であり得る。

【0298】

ＡＡＶ投与量は、ＥＬＩＳＡ、逆転写酵素活性の評価、ＦＡＣＳ、形質導入アッセイ、ノーザンブロッティング（例えば、半定量的ノーザン）、ドットブロット分析またはＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない複数の方法によって決定することができる。ＡＡＶ用量は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）でＡＡＶベクターゲノムを測定することによって決定できることは周知である。そのようなｑＰＣＲ法は、従来の形質導入アッセイからの矛盾または任意の結果を克服する。ＰＣＲ投与量決定の一実施形態では、プラスミドＤＮＡが較正標準として使用される。プラスミドの形態は、ｑＰＣＲ法からの投与量結果に影響を及ぼし得る。一実施形態では、環状またはスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドを定量標準として使用する。

【0299】

いくつかの実施形態では、投与量は、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、ｖｇ／ｋｇの単位で表され得る。例えば、ＡＡＶの投与量は、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１ｘ１０^６～１ｘ１０^１６ｖｇ／ｋｇ、約１ｘ１０^８～１ｘ１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約１ｘ１０^１０～１ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は、約少なくとも１ｘ１０^６、約１ｘ１０^７、約１ｘ１０^８、約１ｘ１０^９、約１ｘ１０^１０、約１ｘ１０^１１、約１ｘ１０^１２、約２ｘ１０^１２、約４ｘ１０^１２、約６ｘ１０^１２、約８ｘ１０^１２、約１ｘ１０^１３、約２ｘ１０^１３、約２．４ｘ１０^１３、約３ｘ１０^１３、約４ｘ１０^１３、約５ｘ１０^１３、約６ｘ１０^１３、約７ｘ１０^１３、約８ｘ１０^１３、約９ｘ１０^１３、約１ｘ１０^１４、約１ｘ１０^１５、または少なくとも約１ｘ１０^１６ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、投与量は、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、少なくとも２ｘ１０^１２、４ｘ１０^１２、６ｘ１０^１２、８ｘ１０^１２、１ｘ１０^１３、２ｘ１０^１３、２．４ｘ１０^１３、３ｘ１０^１３、４ｘ１０^１３、５ｘ１０^１３、６ｘ１０^１３、７ｘ１０^１３、または８ｘ１０^１３ｖｇ／ｋｇである。

【0300】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、少なくとも約１ｘ１０^６、約１ｘ１０^７、約１ｘ１０^８、約１ｘ１０^９、約１ｘ１０^１０、約１ｘ１０^１１、約１ｘ１０^１２、約２ｘ１０^１２、約３ｘ１０^１２、約４ｘ１０^１２、約５ｘ１０^１２、約６ｘ１０^１２、約７ｘ１０^１２、約８ｘ１０^１２、約９ｘ１０^１２、約１ｘ１０^１３ｖｇを注射あたり１．５ｍｌの総体積で投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、少なくとも約１ｘ１０^６、約１ｘ１０^７、約１ｘ１０^８、約１ｘ１０^９、約１ｘ１０^１０、約１ｘ１０^１１、約１ｘ１０^１２、約２ｘ１０^１２、約３ｘ１０^１２、約４ｘ１０^１２、約５ｘ１０^１２、約６ｘ１０^１２、約７ｘ１０^１２、約８ｘ１０^１２、約９ｘ１０^１２、約１ｘ１０^１３、約２ｘ１０^１３、約５ｘ１０^１３、約７ｘ１０^１３、約１ｘ１０^１４ｖｇの総１日用量を投与することを含む。キャプシド化されたベクターゲノム力価を決定する１つの例示的な方法は、参照によりその全体が組み込まれるＰｏｚｓｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（４）：８５５－８６９，２０１７に記載される方法のような定量的ＰＣＲを用いる。

【0301】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかは、１日に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回、対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかは、１週間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回、対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかは、１ヶ月に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１回、対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日ごとに対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４週間ごとに対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日にわたって対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０週間にわたって対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヶ月にわたって対象に投与される。

【0302】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかを全身投与することを含む。例えば、全身投与は、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、消化管からの吸収などの経腸投与、および注射、注入または埋め込みによる非経口投与が含まれる。

【0303】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかを局所的に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかを１またはそれを超える組織に投与することを含む。いくつかの実施形態では、組織は、筋肉組織、上皮組織、結合組織および神経組織から選択される。いくつかの実施形態では、組織は筋肉組織である。

【0304】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかを対象の足に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステム、または組成物のいずれかを対象の短指伸筋（ＥＤＢ）に投与することを含む。

【0305】

併用療法も本発明によって企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時処置および逐次処置の両方を含む。本発明の方法と標準的な医学的処置（例えば、コルチコステロイド）との組み合わせは、新規な治療との組み合わせと同様に、特に企図される。

【0306】

いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される方法は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステムまたは組成物のいずれかを対象に投与することの前または後に、対象におけるジスフェリン遺伝子における突然変異の有無を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステムまたは組成物のいずれかが、ジスフェリン遺伝子における突然変異の存在が検出されたときに対象に投与される。例示的なジスフェリン突然変異としては、限定されないが、ｃ．１３９２ｄｕｐＡ、ｃ．３０３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｗ１０１２Ｘ）、ｃ．２８５８ｄｕｐＴ、ｃ．２７７９ｄｅｌ Ｇ、ｃ．５５９４ｄｅｌＧ、ｃ．４２０１ｄｕｐＡ、ｃ．１７９５＿１７９９ｄｕｐＴＡＣＴ、ｃ．３８３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ１２７８Ｘ）、ｃ．７５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ２５３Ｗ）、ｃ．８５５＋１ｄｅｌＧ、ｃ．３１２６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｗ１０４２Ｘ）、ｃ．１６６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ５５５Ｗ）、ｃ．６１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ２０４Ｘ）、ｃ．３１１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１０３８Ｘ）、ｃ．１３６８Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｃ４５６Ｗ）、ｃ．５７１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１９０５Ｘ）、ｃ．３８２６Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｉ１２７６Ｖ）、ｃ．３８４３＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．４１６７＋１Ｇ＞Ｃ、ｃ．２６４３＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．７９７Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｉ２６６Ｐ）、ｃ４８７６ｄｅｌＧ、ｃ．３４７７Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｙ１１５９Ｘ）、ｃ．３１３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ１０４６Ｈ）、ｃ．５０９Ｃ＞Ａ（ｐ．Ａ１７０Ｅ）、ｃ．３９６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ１３２３Ｘ）、３１９１＿３１９６ｄｕｐＧＡＧＧＣＧ、ｃ．３９９２Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１３３１Ｌ）、ｃ．３５１６＿３５１７ｄｅｌＴＴ、ｃ．２４７ｄｅｌＧ、ｃ．１１８０＋１１Ｃ＞Ｔ、ｃ８９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇ２９９Ｅ）、ｃ．５０７８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ１６９３Ｑ）、ｃ．５９７９ｄｕｐＡ、ｃ．３３４８＋１＿３３４８＋４ｄｅｌＧＴＡＴ、ｃ．５３１４＿５３１８ｄｅｌＡＧＣＣＣ、およびｃ５６５Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｌ１８９Ｖ）が挙げられる。いくつかの例では、ジスフェリン遺伝子は、ｃ．１３９２ｄｕｐＡ、ｃ．３０３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｗ１０１２Ｘ）、ｃ．２８５８ｄｕｐＴ、ｃ．２７７９ｄｅｌ Ｇ、ｃ．５５９４ｄｅｌＧ、ｃ．４２０１ｄｕｐＡ、ｃ．１７９５＿１７９９ｄｕｐＴＡＣＴ、ｃ．３８３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ１２７８Ｘ）、ｃ．７５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ２５３Ｗ）、ｃ．８５５＋１ｄｅｌＧ、ｃ．３１２６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｗ１０４２Ｘ）、ｃ．１６６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ５５５Ｗ）、ｃ．６１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ２０４Ｘ）、ｃ．３１１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１０３８Ｘ）、ｃ．１３６８Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｃ４５６Ｗ）、ｃ．５７１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１９０５Ｘ）、ｃ．３８２６Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｉ１２７６Ｖ）、ｃ．３８４３＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．４１６７＋１Ｇ＞Ｃ、ｃ．２６４３＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．７９７Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｉ２６６Ｐ）、ｃ４８７６ｄｅｌＧ、ｃ．３４７７Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｙ１１５９Ｘ）、ｃ．３１３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ１０４６Ｈ）、ｃ．５０９Ｃ＞Ａ（ｐ．Ａ１７０Ｅ）、ｃ．３９６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ１３２３Ｘ）、３１９１＿３１９６ｄｕｐＧＡＧＧＣＧ、ｃ．３９９２Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１３３１Ｌ）、ｃ．３５１６＿３５１７ｄｅｌＴＴ、ｃ．２４７ｄｅｌＧ、ｃ．１１８０＋１１Ｃ＞Ｔ、ｃ８９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇ２９９Ｅ）、ｃ．５０７８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ１６９３Ｑ）、ｃ．５９７９ｄｕｐＡ、ｃ．３３４８＋１＿３３４８＋４ｄｅｌＧＴＡＴ、ｃ．５３１４＿５３１８ｄｅｌＡＧＣＣＣ、およびｃ５６５Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｌ１８９Ｖ）を含むがこれらに限定されない１またはそれを超える突然変異を含む。

【0307】

いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される方法は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステムまたは組成物のいずれかを対象に投与することの前または後に、対象におけるジスフェリンタンパク質のレベルを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される方法は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステムまたは組成物のいずれかを対象に投与した後に、対象におけるジスフェリンタンパク質のレベルを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ジスフェリンのレベルを検出することは、ジスフェリン遺伝子の発現を検出することを含む。ジスフェリン遺伝子の発現を検出することは、ジスフェリンＤＮＡまたはＲＮＡレベルを定量することを含み得る。代替的または追加的に、ジスフェリンタンパク質のレベルを検出することは、ジスフェリンタンパク質のレベルを定量することを含む。いくつかの実施形態では、ジスフェリンタンパク質のレベルは、対象からの試料において検出される。いくつかの実施形態では、試料は体液試料である。体液試料の例としては、血液、尿、汗、唾液、便および滑液が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、血液試料は血漿試料または血清試料である。いくつかの例において、本方法は、例えばＡｔｈｅｎａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＣＰＴ：８１４０８（１））からのジスフェリンＤＮＡシーケンシング試験をさらに含む。

【0308】

いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される方法は、対象に投与されるポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステムまたは組成物のいずれかの用量または投与頻度を改変することをさらに含む。いくつかの実施形態では、用量または投与頻度の改変は、ジスフェリンタンパク質レベルの検出に基づく。いくつかの実施形態では、用量または投与頻度は、対象におけるジスフェリンタンパク質レベルが、より早い時点（例えば、ポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステムもしくは組成物を投与する前、または最初の用量のポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステムもしくは組成物を投与した後であるがその後の用量のポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、二重ベクターシステムもしくは組成物を投与する前）からの対象のジスフェリンタンパク質レベルと比較して増加する場合に減少する。

【0309】

キット

【0310】

なおさらなる態様では、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、細胞およびシステムのうちの１またはそれを超えるいずれかまたは組成物、および使用説明書を含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる、キットが提供される。一態様では、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、細胞およびシステムのうちの１またはそれを超えるいずれかまたは組成物は、検出可能に標識されているか、または精製もしくは検出可能なマーカーをさらに含む。いくつかの場合において、キットは、ａ）本明細書中に記載される組換えポリヌクレオチドである第１のポリヌクレオチドおよび本明細書中に記載される組換えポリヌクレオチドである第２のポリヌクレオチド；またはｂ）本明細書に記載のＡＡＶベクターである第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および本明細書に記載のＡＡＶベクターである第２のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；またはｃ）本明細書に記載のＡＡＶ二重ベクターシステム；またはｄ）本明細書に記載の組成物；またはｅ）本明細書に記載の細胞（例えば、宿主細胞、必要に応じて哺乳動物細胞）；および必要に応じて使用のための使用説明書を含む。

【実施例0311】

実施例１：二重ＡＡＶベクターシステムの生成

【0312】

この実施例は、本明細書に開示される二重ＡＡＶベクターシステムを産生するための例示的な方法を提供する。この実施例では、二重ＡＡＶベクターｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶが産生される。ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶは、筋肉特異的ＭＨＣＫ７プロモーターの制御下の二重ベクター（ＤＶ）からのヒトジスフェリンを発現する非複製組換えＡＡＶ血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）である。二重ベクターは、ジスフェリンｃＤＮＡ配列の５’部分または３’部分のいずれかを含み、これらの部分は約１ｋｂ重複しており、組換えを促進して全長ヒトジスフェリン遺伝子を産生する。ヒトジスフェリンｃＤＮＡの一部を含む発現カセットは、ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれている（図１）。

【0313】

ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶを構築するために、ヒトジスフェリンｃＤＮＡを、ＡＡＶのパッケージング容量（＜４．７ｋｂ）に合う２つの構築物に分割した。５’ベクター（例えば、５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクター）、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ５’．ＰＴＧ（ＰＴＧ＝プロモーター／導入遺伝子）は、筋肉特異的ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン、コンセンサスコザック配列およびジスフェリンアミノ酸配列のアミノ酸１～１１１３に対応するＤＹＳＦ ｃＤＮＡの５’部分を含む。３’ベクター（例えば、３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクター）、ｐＡＡＶ．ＤＹＳＦ３’．ＰＯＬＹＡは、ジスフェリンアミノ酸配列のアミノ酸７９４～２０８０に対応するＤＹＳＦ
ｃＤＮＡの３’部分と、ポリアデニル化シグナルを有するＤＹＳＦ ３’ＵＴＲとを含む。５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターおよび３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターの発現カセットの配列は、それぞれ配列番号６および８として開示されている。

【0314】

以前の研究では、骨格筋、横隔膜、および心筋発現を達成するＭＨＣＫ７プロモーター（Ｓａｌｖａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５，３２０－３２９（２００７）、参照によりその全体が組み込まれる）およびＡＡＶｒｈ７４を使用して心臓発現が検証されている（Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ
ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２，２５６－２７０（２０１５）（参照によりその全体が組み込まれる））。５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターおよび３’ｈＤＳＹＦ ＡＡＶベクターを別々のＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにキャプシド化した。ＡＡＶｒｈ．７４血清型の分子クローンをアカゲザルリンパ節からクローニングした。これは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）に記載されており、その全体が参照により組み込まれる。

【0315】

５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクター（ＡＡＶベクタープラスミドｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ５’．ＰＴＧ）

【0316】

第１の組換え一本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターＤＮＡプラスミドｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ５’．ＰＴＧを使用して産生した。ヒトジスフェリン部分ｃＤＮＡ配列の５’部分（ヒトｃＤＮＡ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００３４９４．３）を駆動するＭＨＣＫ７発現カセットをベクター骨格ｐＡＡＶ－ＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入することによってプラスミドを構築した。（プラスミドマップについては図２を参照のこと。具体的な配列情報については表１を参照のこと。）キメライントロンが存在し、ヒトβ－グロビン遺伝子の第１のイントロン由来の５’ドナー部位および分岐点および免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のリーダーと本体との間にあるイントロン由来の３’スプライスアクセプター部位とから構成されていた。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列はＡＡＶ２の逆位末端反復配列であり、これはウイルスＤＮＡ複製およびｒＡＡＶベクターゲノムのパッケージングの両方に必要である。２つのＩＴＲ間の配列は、ＡＡＶｒｈ７４ビリオンにキャプシド化されるＤＮＡの部分である。

【表1】

【0317】

３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクター（ＡＡＶベクタープラスミドｐＡＡＶ．ＤＹＳＦ３’．ＰＯＬＹ）

【0318】

第２の組換え一本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターＤＮＡプラスミドｐＡＡＶ．ＤＹＳＦ３’．ＰＯＬＹＡを使用して産生した。ヒトジスフェリン部分ｃＤＮＡ配列（ヒトｃＤＮＡ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００３４９４．３）をベクター骨格ｐＡＡＶ－ＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入することによってプラスミドを構築した。（プラスミドマップについては図３を参照のこと。具体的な配列情報については表２を参照のこと。）内因性ジスフェリン３’非翻訳領域およびポリＡシグナル配列を効率的な転写終結のために使用した。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列はＡＡＶ２の逆位末端反復配列であり、これはウイルスＤＮＡ複製およびｒＡＡＶベクターゲノムのパッケージングの両方に必要である。２つのＩＴＲ間の配列は、ＡＡＶｒｈ７４ビリオンにキャプシド化されるＤＮＡの部分である。

【表2】

【0319】

ＡＡＶヘルパープラスミド（ｐＮＬＲｅｐ２－Ｃａｐｒｈ７４）

【0320】

親プラスミドｐＮＬｒｅｐをｐ５Ｅ１８およびｐＣＬＲ３Ｋから構築した。（Ｂａｎｓａｌ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ
ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４２３，１６８－１７２（２００３）を参照のこと。これは参照によりその全体が組み込まれる）。ｐ５Ｅ１８はｐＡＡＶ／Ａｄに基づく。これはＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含み、ｐ５プロモーターはｒｅｐの５’末端から除去され、ｃａｐの３’末端に配置され、ｐ５とｒｅｐとの間に３ｋｂスペーサー配列が存在することになる（具体的な配列情報については表３を参照）。ｐＣＬＲ３Ｋを生成するために、ヒトコラーゲンイントロンをＰＣＲによって増幅し、次いで、位置１，０５２でｐＡｄ／ＡＡＶにクローニングした。ｐＮＬｒｅｐを構築するために、ｐ５Ｅ１８のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ断片を、ｐＣＬＲ３ｋ由来の３ｋｂコラーゲンイントロンを含むＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ断片で置き換えた。ｒｈ７４ ｃａｐ遺伝子をＰＣＲ増幅し、Ｓｗａ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ制限部位を使用してｐＮＬｒｅｐ中のＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子の代わりにクローニングして、ｐＮＬＲｅｐ２－Ｃａｐｒｈ７４を得た。ＡＡＶ ｒｈ７４キャプシド遺伝子の同一性をＤＮＡプラスミドシーケンシングによって確認した。

【表3】

【0321】

アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨＥＬＰ）

【0322】

プラスミドｐＨＥＬＰは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ ９４５３８）から入手し、サイズが１１，６３５ｂｐである（具体的な配列情報については表４を参照のこと）。プラスミドは、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡを含む（アデノウイルスＥ１機能は２９３個の細胞によって提供される）。プラスミドはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ骨格に基づいており、また、アンピシリンに対する耐性を付与するＴＥＭ－１β－ラクタマーゼ遺伝子をコードするｂｌａ遺伝子（１０，１８２～１１，０４２ｂｐ）、細菌ＣｏｌＥ１複製起点（９，３１５～１０，１６７ｂｐ）およびｆ１一本鎖ＤＮＡ複製起点（１１，１７２～１１，６２７ｂｐ）も含む。このプラスミドに存在するアデノウイルス配列は、アデノウイルスゲノムの約２８％（９，２８０／３５，９３８）のみを表し、逆位末端反復配列などの複製に重要なシス要素を含有しない。これら３つのアデノウイルス遺伝子の同一性を、実施したＤＮＡプラスミドシーケンシングによって確認した。ＤＮＡ分析により、３つのアデノウイルス５型遺伝子領域との１００％の相同性が明らかになった（参照によりその全体が組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３６９９６５）。

【表4】

【0323】

実施例２：二重ＡＡＶベクターシステムを使用したウイルス生成物の製造

【0324】

ＨＥＫ２９３細胞を、最適化リン酸カルシウム共沈殿法を使用して３つの産生プラスミド（（ｉ）ＡＡＶベクタープラスミド、例えば５’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクターまたは３’ｈＤＹＳＦ ＡＡＶベクター；（ｉｉ）アデノウイルス（Ａｄ）ヘルパープラスミド；および（ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパープラスミド）でトランスフェクトした。細胞をトランスフェクトすることは、ＡＡＶベクタープラスミド、Ａｄヘルパープラスミド、ＡＡＶヘルパープラスミドおよびＣａＣｌ_２を含有するＤＮＡ／カルシウム溶液を調製することと、最適な沈殿物を得るために等体積の２×ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水と混合することとを含む。次いで、沈殿物をＨＥＫ ２９３細胞に添加し、インキュベートした。次いで、沈殿物をＨＥＫ ２９３細胞に添加し、インキュベートした。インキュベーション後、培地を交換し、その時点でヌクレアーゼを添加した。

【0325】

実施例３：ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶ筋肉内送達の有効性の決定。

【0326】

約１ｋｂの重複配列を有するＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦカセットの５’および３’部分を含む２つのＡＡＶ発現カセットを生成した（図１参照）。プラスミドをＡＡＶｒｈ．７４ベクターにパッケージングした。４週齢のＤｙｓｆ^－／－マウスを前脛骨筋への筋肉内注射によって１ｘ１０^１１ｖｇの各ベクターで処置し、１ヶ月で剖検した。免疫染色（図４Ａ）およびウエスタンブロット（図４Ｃ）により、両方のベクターの送達後に強固な全長ジスフェリン発現が見られた。いずれかのベクターのみの送達では、異常なジスフェリン発現はなかった（図４Ｂ、免疫染色、および図４Ｄ、ウエスタンブロット）。３２２２は全長の対照である。ジスフェリンを発現する筋線維の数を定量し、表５に示した。

【表5】

【0327】

前脛骨筋への筋肉内注射後の安全性を評価するための時間経過研究を開始した（表６）。タンパク質発現およびベクター生体内分布も評価した。１、３、６、９および１２ヶ月のエンドポイントで、動物を完全に剖検し、ジスフェリン発現（図５Ａ～５Ｃ（１、３、および６ヶ月が示されている））、ベクター生体内分布（表７）ならびに筋肉および非標的器官の組織病理学について評価した。脛骨筋（ＴＡ）を注射した。各動物について組織病理学について分析した組織には以下が含まれた：生殖腺、肝臓、心臓、肺、脾臓、腎臓、横隔膜、左（処置）および右前脛骨筋。所見は同定されなかった。

【表6】

【表7】

【0328】

筋肉内注射後、注射された前脛骨筋でジスフェリンの発現が見られた（図６）。静脈内送達後、ジスフェリンの発現が骨格筋および心筋で見られた（図７Ａ）。

【0329】

マウスのさらなるコホートを処置して、膜修復のための最小有効用量を決定した。３つの用量のＡＡＶベクターを、８週齢の１２９Ｄｙｓｆ－／－マウスのＦＤＢに注射した（ｎ＝６／群）。対照Ｄｙｓｆ－／－群に生理食塩水を投与し、１２９ＷＴマウスの群を系統特異的正常対照とした。図８に示すように、ＡＡＶｒｈ．７４．ＤＹＳＦ．ＤＶ処置は、用量依存性膜再封を明らかにした。並行した発現研究は、高用量が線維形質導入の＞５０％の発現をもたらすことを示す。この用量は、筋重量に対して正規化した場合、発現および安全性研究のために前脛骨筋に与えたものと同等である（図４Ａ～５Ｃ）。

【表8】

【0330】

ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶの全身送達

【0331】

二重ベクター送達の全身送達の実現可能性／有効性を試験するために用量設定研究を行った。この系統における確立された機能的ＭＲＩ／ＭＲＳ結果に基づいて、ＢｌａＪマウス（ＢＬ６マウスに戻し交配したＡＪジスフェリン欠損マウス）を研究に使用した。３群のマウス（群あたりｎ＝６）を、６週齢で、生理食塩水、２ｅ１２ｖｇの総ＡＡＶ．ＤＹＳＦ ＤＶ（８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づく）、または６ｅ１２ｖｇの総ＡＡＶ．ＤＹＳＦ．ＤＶ（２．４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、定量標準としてのスーパーコイルＤＮＡまたはプラスミドに基づく）のいずれかによる尾静脈注射によって処置した。エンドポイント分析は３ヶ月で行われ、横隔膜生理学、ＦＤＢにおける膜修復アッセイ、およびジスフェリン発現を定量化し組織病理学を評価するための完全剖検を含んだ。^４

【0332】

４ヶ月の研究エンドポイントで、完全な剖検を行った。横隔膜を力測定に供し、膜修復の回復についてＦＤＢ筋肉を試験し、発現、ベクター生体内分布および組織病理学について筋肉および器官を採取した。高用量では、ジスフェリン発現は全ての筋肉に広がっていた（図７Ａおよび７Ｂ）が、低用量では低レベルの可変発現を有していた。２０週目で、ＢｌａＪは組織学的に非常に軽度の表現型を有する。対照と比較して、再生のマーカーとして中心核の有意な増加がある。処置マウスは、高用量で中心核形成の有意な減少を示した（図７Ｂ）。最も影響を受けた筋肉である腰筋は、高用量（６ｅ１２ｖｇ）での処置で線維症および炎症の減少を示した（図９）。横隔膜の力欠損は高用量と低用量の両方で回復し（図１０Ａ）、ＦＤＢ筋の膜修復に用量依存的応答があった（図１０Ｂ）。

【0333】

実施例４：ＮＨＰにおけるＡＡＶ５およびＡａｖｒｈ．７４．Ｍｈｃｋ７．Ｄｙｓｆ．Ｄｖ送達による全長ジスフェリン発現の安全性および有効性

【0334】

方法：筋肉内注射によってＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＦＬＡＧで４つのＮＨＰを処置した。２つのＮＨＰをＡＡＶ５．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦで処置し、２つをＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＦＬＡＧで処置した。本発明者らの臨床試験デザインを反映して、１匹の動物を３ヶ月で分析し、２匹を６ヶ月で分析した。動物は、ＡＡＶ５およびｒｈ．７４キャプシドおよびジスフェリンに対するＴ細胞（図１１Ａ～１１Ｄ）ならびに抗ＡＡＶ Ａｂ力価（表９）を測定するためのＥＬＩＳｐｏｔ分析を含むベースライン化学および免疫学的研究を受けた。

【0335】

ＰＢＭＣを刺激するために使用されるペプチドプールは、すべての可能な抗原エピトープを捕捉するように、１５アミノ酸長であり、１０アミノ酸が重複するように設計された。ペプチドに反応する細胞はインターフェロン－γを放出し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによってスポットとして定量される。１００万細胞あたりのスポットを、陽性反応閾値として５０スポット／１ｘ１０^６細胞でカウントした。持続的な免疫応答は観察されなかった。全ての動物は、研究エンドポイント（図１６Ａ）で発現した。これらの研究を研究全体にわたって２週間ごとに繰り返した。研究エンドポイントでは、遺伝子発現研究に加えて、重要な臓器組織の組織病理学および体内分布研究を含む動物に対して完全な剖検を行った。

【0336】

結果：観察可能な毒性は見られなかった。出願人らは、アカゲザルとヒトのジスフェリンを区別しない抗ジスフェリン抗体を使用して、ジスフェリンの過剰発現を実証した（図１２Ａ～１２Ｃ）。ベクター由来のジスフェリン発現を確認するために、抗ＦＬＡＧ免疫染色も行った（図１３）。ＡＡＶ５．ＤＹＳＦ注射ＴＡでは、筋肉はジスフェリンの１０４．９％（３ｍｏ）および１２２．６％（６ｍｏ）の過剰発現を示したが、ＡＡＶｒｈ．７４．ＤＹＳＦ．ＤＶ注入ＴＡは、非注射対照と比較して１２２．０％（３ｍｏ）および１１５．２％（６ｍｏ）の過剰発現を有していた。ＮＨＰにおける組織レベルで毒性は観察されず、炎症または筋線維壊死は見られなかった。免疫学的アッセイは、ＥＬＩＳｐｏｔによってキャプシドまたは導入遺伝子に対するいかなる異常な応答も示さなかった（図１１Ａ～１１Ｄ）。さらに、全血球計算および化学パネルは、いずれのマカクにおいても異常値を示さなかった。予想通り、抗ＡＡＶ抗体力価は遺伝子導入後に上昇した。エンドポイント抗ＡＡＶｒｈ．７４力価は、抗ＡＡＶ５よりも低かった。

【表9】

【0337】

同等物

【0338】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本技術が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0339】

本明細書に例示的に記載された本技術は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制限がない状態で適切に実施され得る。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、広範に、限定することなく読まれるものとする。さらに、本明細書で使用される用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、示され説明された特徴またはその一部の均等物を除外する意図はないが、特許請求される本技術の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。

【0340】

したがって、本明細書で提供される材料、方法、および例は、好ましい態様の代表であり、例示的なものであり、本技術の範囲に対する限定として意図されるものではないことを理解されたい。

【0341】

本技術は、本明細書において広く一般的に説明されている。一般的な開示に含まれるより狭い種および亜属グループ化の各々も、本技術の一部を形成する。これは、除外された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を除去するという条件または否定的限定を伴う本技術の一般的説明を含む。

【0342】

さらに、本技術の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、当業者は、本技術がそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されることを認識するであろう。

【0343】

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それぞれが個別に参照により組み込まれるのと同じ程度に、その全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。

【0344】

他の態様は、以下の特許請求の範囲内に記載される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードする組換えポリヌクレオチドであって、前記組換えポリヌクレオチドが第１のヌクレオチド配列を含み、前記第１のヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号１、６、または１８のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、６、または１８のそれぞれの全長にわたって配列番号１、配列番号６、または配列番号１８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１３または１５のそれぞれの全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）前記ｈＤＹＳＦタンパク質の前記断片をコードするヌクレオチド配列であって、前記断片が配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または
（ｆ）（ｅ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｅ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列、
からなる、組換えポリヌクレオチド。
（項目２）
逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、プロモーター、イントロン、選択マーカーまたは複製起点（ＯＲＩ）から選択される１またはそれを超える追加のヌクレオチド配列をさらに含む、項目１に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目３）
前記ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲである、項目２に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目４）
前記ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＡＡＶ３ ＩＴＲである、項目３に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目５）
２つのＩＴＲを含む、項目２～４のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目６）
前記ＩＴＲが配列番号３または配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、項目２～５のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目７）
前記プロモーターが筋肉特異的プロモーターを含む、項目２～６に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目８）
前記筋肉特異的プロモーターが、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、デスミンプロモーター、骨格アルファ－アクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合エレメント、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子から選択される、項目７に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目９）
前記筋肉特異的プロモーターがＭＨＣＫ７プロモーターを含む、項目７に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１０）
前記プロモーターが組換えプロモーターを含む、項目２～６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１１）
前記組換えプロモーターが組換え筋肉特異的プロモーターを含む、項目１０に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１２）
前記プロモーターが配列番号４のヌクレオチド配列を含む、項目２～１１のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１３）
前記イントロンが、５’ドナー部位、分岐点および／または３’スプライス部位を含む、項目２～１２のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１４）
前記イントロンがキメライントロンを含む、項目２～１３のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１５）
前記イントロンがヒトβ－グロビン遺伝子由来の５’ドナー部位を含む、項目２～１４のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１６）
前記イントロンが免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖由来の分岐点を含む、項目２～１５のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１７）
前記イントロンが免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖由来の３’スプライスアクセプター部位を含む、項目２～１６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１８）
前記イントロンが配列番号５のヌクレオチド配列を含む、項目２～１７のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１９）
前記選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、項目２～１８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目２０）
前記抗生物質耐性遺伝子がβ－ラクタマーゼ遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子である、項目１９に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目２１）
配列番号６または配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目２２）
項目１～２１のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドであって、前記組換えヌクレオチドが、前記ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない、組換えポリヌクレオチド。
（項目２３）
項目１～２２のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドであって、前記組換えヌクレオチドが、１またはそれを超えるＩＴＲ以外のＡＡＶ配列を含まない、組換えポリヌクレオチド。
（項目２４）
１またはそれを超えるＩＴＲ以外のウイルス配列を含まない、項目１～２２のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目２５）
ヒトジスフェリンタンパク質の断片をコードする組換えポリヌクレオチド配列であって、前記組換えポリヌクレオチドが第２のヌクレオチド配列を含み、前記第２のヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、８または１９のそれぞれの全長にわたって配列番号２、８または１９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１４または１６のそれぞれの全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；
（ｅ）前記ｈＤＹＳＦタンパク質の前記断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ｈＤＹＳＦタンパク質の前記断片が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド配列；または
（ｆ）（ｄ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｅ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列、
からなる、組換えポリヌクレオチド配列。
（項目２６）
逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、選択マーカー、複製起点（ＯＲＩ）、非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む１またはそれを超える追加のヌクレオチドをさらに含む、項目２５に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目２７）
前記ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲである、項目２６に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目２８）
前記ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＡＡＶ３ ＩＴＲである、項目２７に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目２９）
２つのＩＴＲをさらに含む、項目２５、２７または２８のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド。
（項目３０）
前記ＩＴＲが配列番号３または１７のヌクレオチド配列を含む、項目２６～２９のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目３１）
前記ポリＡシグナルが人工ポリＡシグナルである、項目２６～３０のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目３２）
前記ポリＡシグナルが配列番号７のヌクレオチド配列を含む、項目２６～３１のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目３３）
前記選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子を含む、項目２６～３２のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目３４）
前記抗生物質耐性遺伝子がβ－ラクタマーゼ遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子を含む、項目３３に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目３５）
配列番号８または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、項目２５に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目３６）
項目２５～３５のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドであって、前記組換えヌクレオチドが、前記ｈＤＹＳＦタンパク質の第１の断片をコードする第１のポリヌクレオチド配列をさらに含まない、組換えポリヌクレオチド。
（項目３７）
項目２５～３６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドであって、前記組換えヌクレオチドが、１またはそれを超えるＩＴＲ以外のＡＡＶ配列を含まない、組換えポリヌクレオチド。
（項目３８）
１またはそれを超えるＩＴＲ以外のウイルス配列を含まない、項目２５～３６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目３９）
（ａ）第１のＡＡＶベクターであって、項目１～２４のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、第１のＡＡＶベクター；および
（ｂ）第２のＡＡＶベクターであって、項目２５～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、第２のＡＡＶベクター
を含む、二重アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステム。
（項目４０）
項目１～２４のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
（項目４１）
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．２０、またはＡＡＶｒｈ．７４である、項目４０に記載のＡＡＶベクター。
（項目４２）
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ．７４である、項目４０に記載のＡＡＶベクター。
（項目４３）
項目２５～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
（項目４４）
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．２０、またはＡＡＶｒｈ．７４である、項目４３に記載のＡＡＶベクター。
（項目４５）
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ．７４である、項目４３に記載のＡＡＶベクター。
（項目４６）
項目１～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドまたは項目４０～４５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物。
（項目４７）
（ａ）項目４０～４２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；および
（ｂ）項目４３～４５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む、第２のｒＡＡＶベクター
を含む、組成物。
（項目４８）
第１および第２のｒＡＡＶベクターのモル比が、約１００：１～１：１００、約１０：１～１：１０、約２：１～１：２または約１：１である、項目４７記載の組成物。
（項目４９）
（ａ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；
（ｂ）ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、
ｉ．配列番号１または６のヌクレオチド配列；
ｉｉ．配列番号１または６の全長にわたって配列番号１または６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列；
ｉｉｉ．配列番号１３または１５のヌクレオチド配列；
ｉｖ．配列番号１３または１５の全長にわたって配列番号１３または１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；
ｖ．前記ｈＤＹＳＦタンパク質の前記断片をコードするヌクレオチド配列であって、前記ｈＤＹＳＦタンパク質の前記断片が、配列番号９のアミノ酸配列からなる、ヌクレオチド配列；または
ｖｉ．（ｖ）のヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；
からなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）第２のＩＴＲ
を含み、
前記ポリヌクレオチドが、前記第１のＩＴＲおよび前記第２のＩＴＲに挟まれている、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
（項目５０）
プロモーター、イントロン、選択マーカー、または複製起点（ＯＲＩ）から選択される１またはそれを超える追加のポリヌクレオチドをさらに含む、項目４９に記載のＡＡＶベクター。
（項目５１）
前記ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲである、項目４９または５０に記載のＡＡＶベクター。
（項目５２）
前記ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＡＡＶ３ ＩＴＲである、項目５１に記載のＡＡＶベクター。
（項目５３）
前記第１のＩＴＲおよび／または前記第２のＩＴＲが配列番号３または１７のヌクレオチド配列を含む、項目４９～５２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目５４）
前記プロモーターが筋肉特異的プロモーターである、項目５０～５３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目５５）
前記筋肉特異的プロモーターがミオシン重鎖複合体－Ｅボックス筋肉クレアチンキナーゼ融合エンハンサー／プロモーターである、項目５４に記載のＡＡＶベクター。
（項目５６）
前記プロモーターが組換えプロモーターである、項目５０～５３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目５７）
前記組換えプロモーターが組換え筋肉特異的プロモーターである、項目５６に記載のＡＡＶベクター。
（項目５８）
前記組換え筋特異的プロモーターがＭＨＣＫ７プロモーターである、項目５７に記載のＡＡＶベクター。
（項目５９）
前記プロモーターが配列番号４のヌクレオチド配列を含む、項目５０～５８のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目６０）
前記イントロンが、５’ドナー部位、分岐点、および／または３’スプライス部位を含む、項目５０～５９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目６１）
前記イントロンがキメライントロンである、項目５０～６０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目６２）
前記イントロンが、ヒトβグロビン遺伝子由来の５’ドナー部位を含む、項目５０～６１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目６３）
前記イントロンが、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖由来の分岐点を含む、項目５０～６２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目６４）
前記イントロンが、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖由来の３’スプライスアクセプター部位を含む、項目５０～６３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目６５）
前記イントロンが配列番号５のヌクレオチド配列を含む、項目５０～６４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目６６）
前記選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、項目５０～６５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目６７）
前記抗生物質耐性遺伝子がβ－ラクタマーゼ遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子である、項目６６に記載のＡＡＶベクター。
（項目６８）
配列番号６または配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、項目４９～６７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目６９）
前記ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない、項目４９～６８のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目７０）
１またはそれを超えるＩＴＲ以外のＡＡＶ配列を含まない、項目４９～６９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目７１）
１またはそれを超えるＩＴＲ以外のウイルス配列を含まない、項目４９～６９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目７２）
（ａ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；
（ｂ）ヒトジスフェリンタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、
ｉ．配列番号２または８のヌクレオチド配列；
ｉｉ．配列番号２または８の全長にわたって配列番号２または８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列；
ｉｉｉ．配列番号１４または１６のヌクレオチド配列；
ｉｖ．配列番号１４または１６の全長にわたって配列番号１４または１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列；
ｖ．前記ｈＤＹＳＦタンパク質の前記断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ｈＤＹＳＦタンパク質の前記断片が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ポリヌクレオチド；または
ｖｉ．（ｖ）のポリヌクレオチド配列の全長にわたって（ｖ）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド；
からなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）第２のＩＴＲ
を含み、
前記ポリヌクレオチドが、前記第１のＩＴＲおよび前記第２のＩＴＲに挟まれている、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
（項目７３）
選択マーカー、複製起点（ＯＲＩ）、非翻訳領域（ＵＴＲ）またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナルから選択される１またはそれを超えるポリヌクレオチドをさらに含む、項目７２に記載のＡＡＶベクター。
（項目７４）
前記ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲである、項目７２または７３に記載のＡＡＶベクター。
（項目７５）
前記ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＡＡＶ３ ＩＴＲである、項目７４に記載のＡＡＶベクター。
（項目７６）
前記ＩＴＲが配列番号３または１７のヌクレオチド配列を含む、項目７２～７５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目７７）
前記ポリＡシグナルが人工ポリＡシグナルである、項目７３～７６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目７８）
前記ポリＡシグナルが配列番号７のヌクレオチド配列を含む、項目７３～７７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目７９）
前記選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、項目７３～７８のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目８０）
前記抗生物質耐性遺伝子がβ－ラクタマーゼ遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子である、項目７９に記載のＡＡＶベクター。
（項目８１）
配列番号８または配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、項目７２～８０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目８２）
前記ｈＤＹＳＦタンパク質の第２の断片をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含まない、項目７２～８１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目８３）
１またはそれを超えるＩＴＲ以外のＡＡＶ配列を含まない、項目７２～８２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目８４）
１またはそれを超えるＩＴＲ以外のウイルス配列を含まない、項目７２～８２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
（項目８５）
（ａ）項目４０～４２および４９～７１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む、第１のＡＡＶベクター；および
（ｂ）項目４３～４５および７２～８４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む、第２のＡＡＶベクター
を含む、二重アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステム。
（項目８６）
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．２０、またはＡＡＶｒｈ．７４である、項目８５に記載の二重アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステム。
（項目８７）
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ．７４である、項目８５に記載の二重アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステム。
（項目８８）
（ａ）項目１～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むプラスミド；
（ｂ）アデノウイルスヘルパープラスミド；および
（ｃ）ｒｅｐ－ｃａｐプラスミド
を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）パッケージングシステム。
（項目８９）
（ａ）項目１～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むプラスミド；および
（ｂ）アデノウイルスヘルパープラスミド
を含む、アデノ随伴ウイルスパッケージングシステム。
（項目９０）
前記アデノウイルスヘルパープラスミドがｐＨＥＬＰプラスミドを含む、項目８８または８９に記載のアデノ随伴ウイルスパッケージングシステム。
（項目９１）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生する方法であって、細胞を、項目１～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドまたは項目８８に記載のＡＡＶパッケージングシステムと接触させることを含む方法。
（項目９２）
前記細胞が宿主細胞であり、必要に応じて哺乳動物宿主細胞であり、さらに必要に応じてＨＥＫ２９３である、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生する方法であって、パッケージング細胞株に、項目１～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドを形質導入することを含み、前記パッケージング細胞株が、アデノ随伴ウイルスのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現する、方法。
（項目９４）
前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子がＲｅｐ７８である、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子がＲｈ７４ ｃａｐ遺伝子である、項目９３に記載の方法。
（項目９６）
項目１～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含む細胞。
（項目９７）
項目１～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドを含む細胞。
（項目９８）
前記プラスミドが、配列番号１８または１９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、項目８８～９０のいずれか一項に記載のＡＡＶパッケージングシステム、項目９１～９５のいずれか一項に記載の方法、または項目９６もしくは９７に記載の細胞。
（項目９９）
前記プラスミドが、配列番号１８または１９のポリヌクレオチドを含む、項目８８～９０のいずれか一項に記載のＡＡＶパッケージングシステム、項目９１～９５のいずれか一項に記載の方法、または項目９６もしくは９７に記載の細胞。
（項目１００）
ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、
（ａ）有効量の第１のポリヌクレオチドであって、前記第１のポリヌクレオチドが項目１～２４のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドである、有効量の第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）有効量の第２のポリヌクレオチドであって、前記第２のポリヌクレオチドが項目２５～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドである、第２のポリヌクレオチド
を投与することを含む、ジスフェリン異常症を処置する方法。
（項目１０１）
前記第１のポリヌクレオチドおよび／または第２のポリヌクレオチドが筋肉内または静脈内に投与される、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記第１および第２のポリヌクレオチドが同時または順次投与される、項目１００または１０１に記載の方法。
（項目１０３）
ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、
（ａ）有効量の第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記第１のＡＡＶベクターが項目４０～４２および４９～７１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターである、第１のＡＡＶベクター；および
（ｂ）有効量の第２のＡＡＶベクターであって、前記第２のＡＡＶベクターが項目４３～４５および７２～８４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターである、第２のＡＡＶベクター
を投与することを含む、ジスフェリン異常症を処置する方法。
（項目１０４）
前記第１のＡＡＶベクターおよび／または第２のＡＡＶベクターが筋肉内または静脈内に投与される、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記第１および第２のＡＡＶベクターが同時または順次投与される、項目１０３または１０４に記載の方法。
（項目１０６）
ジスフェリン異常症を処置する方法であって、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、有効量の項目３９または８５～８７のいずれか一項に記載のＡＡＶ二重ベクターシステムを投与することを含む方法。
（項目１０７）
前記ＡＡＶ二重ベクターシステムが筋肉内または静脈内投与される、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
ジスフェリン異常症を処置する方法であって、ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象に、有効量の項目４６～４８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
（項目１０９）
前記組成物が筋肉内または静脈内投与される、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記ジスフェリン異常症が肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである、項目１００～１０９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象におけるジスフェリン異常症を処置するための医薬の製造における組成物の使用であって、前記組成物が、
（ａ）項目１～２４のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドである、第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）項目２５～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドである、第２のポリヌクレオチド
を含む、使用。
（項目１１２）
ジスフェリン異常症の必要とする対象におけるジスフェリン異常症を処置するための医薬の製造における組成物の使用であって、前記組成物が、
（ａ）有効量の第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記第１のＡＡＶベクターが項目４０～４２および４９～７１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターである、第１のＡＡＶベクター；および
（ｂ）有効量の第２のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記第２のＡＡＶベクターが項目４３～４５および７２～８４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターである、第２のＡＡＶベクター
を含む、使用。
（項目１１３）
ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象におけるジスフェリン異常症を処置するための医薬の製造における組成物の使用であって、前記組成物が項目３９または８５～８７に記載のＡＡＶ二重ベクターシステムを含む、使用。
（項目１１４）
ジスフェリン異常症の処置を必要とする対象におけるジスフェリン異常症を処置するための医薬の製造における、項目４６～４８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
（項目１１５）
前記組成物が筋肉内または静脈内に投与される、項目１１１～１１４のいずれか一項に記載の使用。
（項目１１６）
前記ジスフェリン異常症が肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである、項目１１１～１１４のいずれか一項に記載の使用。
（項目１１７）
前記有効量の前記第１のＡＡＶベクターが、約１ｘ１０^６～１ｘ１０^１６ｖｇ／ｋｇ、約１ｘ１０^８～１ｘ１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約１ｘ１０^１０～１ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇであり、前記投与量が、スーパーコイルＰＣＲ定量化標準によって測定される、項目１００～１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記有効量の前記第１のＡＡＶベクターが１．２ｅ１３ｖｇ／ｋｇであり、前記投与量がスーパーコイルＰＣＲ定量標準によって測定される、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記有効量の前記第２のＡＡＶベクターが、約１ｘ１０^６～１ｘ１０^１６ｖｇ／ｋｇ、約１ｘ１０^８～１ｘ１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約１ｘ１０^１０～１ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇであり、前記投与量が、スーパーコイルＰＣＲ標準によって測定される、項目１００～１１０および１１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
前記有効量の前記第２のＡＡＶベクターが１．２ｅ１３ｖｇ／ｋｇであり、前記投与量がスーパーコイルＰＣＲ定量標準によって測定される、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
総ＡＡＶベクター投与量が２．４ｅ１３ｖｇ／ｋｇであり、前記投与量がスーパーコイルＰＣＲ標準によって測定される、項目１１７～１２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
ヒトジスフェリン（ｈＤＹＳＦ）タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドであって、前記組換えポリヌクレオチド配列が、配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチド。
（項目１２３）
前記組換えポリヌクレオチド配列が配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、項目１２２に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１２４）
項目１２２に記載の組換えポリヌクレオチドを作製する方法であって、項目１～２４のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドおよび項目２５～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドと細胞を接触させること、またはこれらを細胞において発現させることを含む方法。
（項目１２５）
項目３９および８５～８７のいずれか一項に記載の二重ＡＡＶベクターシステムと細胞を接触させることを含む、項目１２２に記載の組換えポリヌクレオチドを作製する方法。
（項目１２６）
前記細胞が真核細胞である、項目１２４または１２５に記載の組換えポリヌクレオチドを作製する方法。
（項目１２７）
前記細胞が、筋肉細胞、心臓細胞、幹細胞、衛星細胞および／または肝臓細胞である、項目１２４または１２５に記載の組換えポリヌクレオチドを作製する方法。
（項目１２８）
項目１２２に記載の組換えポリヌクレオチドを作製する方法であって、項目１～２４のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドおよび項目２５～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを対象に投与することを含む方法。
（項目１２９）
項目１２２に記載の組換えポリヌクレオチドを作製する方法であって、項目３９および８５～８７のいずれか一項に記載の二重ＡＡＶベクターシステムまたは項目４７もしくは４８に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。
（項目１３０）
対象の筋ジストロフィーを処置する方法であって、前記対象における項目１２２に記載の組換えポリヌクレオチドの発現を含む方法。
（項目１３１）
項目１～２４のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドおよび項目２５～３８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドまたは項目４７もしくは４８に記載の組成物を対象に投与することを含む、項目１３０に記載の方法。
（項目１３２）
項目３９および８５～８７のいずれか一項に記載の二重ＡＡＶベクターシステムを対象に投与することを含む、項目１３０に記載の方法。
（項目１３３）
前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ヒツジ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、またはネコから選択される哺乳動物である、項目１２８～１３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３４）
前記対象がジスフェリン異常症に罹患している、項目１２８～１３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３５）
前記ジスフェリン異常症が肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）または三好ミオパチーである、項目１３４に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13】

【配列表】

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【外国語明細書】