特開 2024-33780 細胞増殖促進装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024033780

(43)【公開日】2024-03-13

(54)【発明の名称】細胞増殖促進装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20240306BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 C

C12M1/00 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022137596

(22)【出願日】2022-08-31

(71)【出願人】

【識別番号】519058631

【氏名又は名称】藤野 英己

(71)【出願人】

【識別番号】514266404

【氏名又は名称】日本気圧バルク工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100130281

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 道幸

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100165489

【弁理士】

【氏名又は名称】榊原 靖

(74)【代理人】

【識別番号】100214813

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 幸江

(72)【発明者】

【氏名】藤野 英己

(72)【発明者】

【氏名】天野 英紀

【テーマコード（参考）】

4B029

【Ｆターム（参考）】

4B029AA01

4B029BB11

4B029CC01

4B029DF04

4B029DG10

(57)【要約】

【課題】
培養容器内の環境条件を変化させることにより、細胞の増殖をより促進させることができる細胞増殖促進装置を提供する。
【解決手段】
内部に細胞および培地を収容する培養容器１０と、培養容器１０内の圧力を下げるための減圧手段２０と、を備え、細胞および培地を収容した状態の培養容器１０内を、減圧手段２０により０．０１気圧以上１．０気圧未満の範囲の任意の圧力である微真空状態に維持し、また、培養容器３０内の酸素濃度を、０．０１％以上２１％以下の範囲の任意の濃度に維持するための酸素濃度調整手段５０を備える。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞の増殖を促進するための細胞増殖促進装置であって、
内部に前記細胞および培地を収容する培養容器と、
前記培養容器内の圧力を下げるための減圧手段と、を備え、
前記細胞および前記培地を収容した状態の前記培養容器内を、前記減圧手段により０．０１気圧以上１．０気圧未満の範囲の任意の圧力である微真空状態に維持することを特徴とする細胞増殖促進装置。

【請求項2】

前記培養容器内の酸素濃度を、０．０１％以上２１％以下の範囲の任意の濃度に維持するための酸素濃度調整手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の細胞増殖促進装置。

【請求項3】

前記培養容器は、前記培養容器外から前記細胞、液体または気体の少なくとも１つを取り込む開閉手段と、前記培養容器外との間で前記細胞、液体または気体の少なくとも１つの吸排出を行う吸排出手段と、を備えることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞増殖促進装置。

【請求項4】

前記培養容器は、前記培養容器内の圧力の変化により開閉して前記培養容器外から前記細胞、液体または気体の少なくとも１つを取り込む開閉手段と、前記培養容器外との間で前記細胞、液体または気体の少なくとも１つの吸排出を行う吸排出手段と、を備えることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞増殖促進装置。

【請求項5】

前記培養容器は、前記培養容器外から前記細胞、液体または気体の少なくとも１つを取り込む開閉手段と、前記培養容器外との間で前記細胞、液体または気体の少なくとも１つの吸排出を行う吸排出手段と、を備え、
前記培養容器は、動物の体内に埋め込み可能であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞増殖促進装置。

【請求項6】

前記培養容器は、前記培養容器内の圧力の変化により開閉して前記培養容器外から前記細胞、液体または気体の少なくとも１つを取り込む開閉手段と、前記培養容器外との間で前記細胞、液体または気体の少なくとも１つの吸排出を行う吸排出手段と、を備え、
前記培養容器は、動物の体内に埋め込み可能であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞増殖促進装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞の増殖を促進するための細胞増殖促進装置に関する。

【背景技術】

【0002】

従来から、再生医療、食品、化粧品、医薬品等の分野において動植物の細胞を活用することを目的として、細胞の増殖を促進させる培養装置および培養方法の研究が行われている。培養を行う上で重要な要因としては、温度、ガス濃度、培養液の組成、ｐＨ等が挙げられる。なかでも低酸素雰囲気下で培養を行うことで細胞の増殖が促進されることが報告されており、培養容器内を低酸素環境にする試薬や装置が開発されている。

【0003】

例えば、特許文献１には、アスコルビン酸類等の有機物を主剤とする雰囲気調整剤、アルデヒド除去剤並びに細胞及び培地を収容した培養容器を、ガスバリア性密閉容器内に設置し、密閉容器内の酸素濃度を１８％以下、炭酸ガス濃度を２％以上１０％以下として細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法が記載されている。

【0004】

また、特許文献２には、内部のガスが所定の二酸化炭素濃度に調節された恒温槽内に配置される培養ユニットであって、密閉容器と、鉄粉等の脱酸素剤を収容する脱酸素剤容器と、酸素濃度検出部と、恒温槽内から密閉容器内に供給され得るガスの経路を切り換える制御装置と、を備え、恒温槽内のガスを、脱酸素剤を用いて酸素濃度を調節して密閉容器内に供給することを特徴とする培養ユニットが記載されている。

【0005】

また、特許文献３には、扉を有する気密の培養室であって、空気中のＮ_２を自動的に濃縮するＮ_２濃縮器とＮ_２の貯留タンクのそれぞれの自動弁Ｖ_１、Ｖ_２を制御部により開閉して制御しながらＯ_２濃度を目標の一定値に保つよう構成したことを特徴とする低酸素培養器が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００９－２９１１６６号公報

【特許文献2】特開２０１７－２３０８８号公報

【特許文献3】特開平８－５６６４６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、特許文献１の雰囲気調整剤を収容した培養容器、特許文献２の脱酸素剤を備えた培養ユニット、特許文献３の低酸素培養器は、酸素濃度を低濃度に調整し低酸素環境下での細胞増殖を可能にしているものの、その増殖は増殖スピード、費用等の点で様々な分野での需要の高まりに対応するには十分とは言えなかった。そのため、細胞の増殖をさらに促進させて、より効率的に培養することが求められていた。

【0008】

本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、その目的は、培養容器内の環境条件を変化させることにより、細胞の増殖をより促進させることができる細胞増殖促進装置を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

請求項１記載の細胞増殖促進装置は、内部に細胞および培地を収容する培養容器と、培養容器内の圧力を下げるための減圧手段と、を備え、細胞および培地を収容した状態の培養容器内を、減圧手段により０．０１気圧以上１．０気圧未満の範囲の任意の圧力である微真空状態に維持することを特徴とする。

【0010】

請求項２記載の細胞増殖促進装置は、培養容器内の酸素濃度を、０．０１％以上２１％以下の範囲の任意の濃度に維持するための酸素濃度調整手段を備えることを特徴とする。

【0011】

請求項３記載の細胞増殖促進装置は、培養容器が、培養容器外から細胞、液体または気体の少なくとも１つを取り込む開閉手段と、培養容器外との間で細胞、液体または気体の少なくとも１つの吸排出を行う吸排出手段と、を備えることを特徴とする。

【0012】

請求項４記載の細胞増殖促進装置は、培養容器が、培養容器内の圧力の変化により開閉して培養容器外から細胞、液体または気体の少なくとも１つを取り込む開閉手段と、培養容器外との間で細胞、液体または気体の少なくとも１つの吸排出を行う吸排出手段と、を備えることを特徴とする。

【0013】

請求項５記載の細胞増殖促進装置は、培養容器が、培養容器外から細胞、液体または気体の少なくとも１つを取り込む開閉手段と、培養容器外との間で細胞、液体または気体の少なくとも１つの吸排出を行う吸排出手段と、を備え、培養容器は、動物の体内に埋め込み可能であることを特徴とする。

【0014】

請求項６記載の細胞増殖促進装置は、培養容器が、培養容器内の圧力の変化により開閉して培養容器外から細胞、液体または気体の少なくとも１つを取り込む開閉手段と、培養容器外との間で細胞、液体または気体の少なくとも１つの吸排出を行う吸排出手段と、を備え、培養容器は、動物の体内に埋め込み可能であることを特徴とする。

【発明の効果】

【0015】

本願の発明によれば、減圧手段により培養容器内を常圧より低圧の任意の圧力である微真空状態に維持することができ、これを用いて細胞を培養することによって、細胞の増殖をより促進させることができる細胞増殖促進装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明に係る細胞増殖促進装置の一実施形態を示す説明図である。

【図2】実施例１の細胞の培養結果を示す説明図である。

【図3】実施例２の細胞の培養結果を示す説明図である。

【図4】本発明に係る細胞増殖促進装置の別の実施形態を示す説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明の形態について図面を参照しながら具体的に説明する。図１は、本発明に係る細胞増殖促進装置の一実施形態を示す模式図である。図２は、実施例１の細胞の培養結果を示す説明図である。図３は、実施例２の細胞の培養結果を示す説明図である。図４は、本発明に係る細胞増殖促進装置の別の実施形態を示す模式図である。

【0018】

本発明に係る細胞増殖促進装置１は、細胞の増殖を促進するためのものであって、図１に示すように、培養容器１０と、減圧手段２０とを備えている。培養する細胞は任意であるが、例えば、間葉系幹細胞、筋芽細胞、骨芽細胞等である。培地は、特に制限はなく、培養する細胞に適したものを選択することができる。

【0019】

培養容器１０は、その内部に細胞および培地を収容するものである。培養容器１０の大きさ、形状は、その中に細胞および培地を収容することができ、細胞が増殖可能な空間を有していれば、特に限定されない。細胞および培地を収容する方法は、予め細胞および培地を収容した細胞培養用ディッシュ等の容器を培養容器１０の内部に収容してもよいし、細胞および培地を培養容器１０の内部に直接収容してもよい。細胞および培地を培養容器１０の内部に直接収容する場合は、培養容器１０の内壁面上の全部または一部に細胞を接着し保持する細胞接着部を備えていてもよい。

【0020】

減圧手段２０は、培養容器１０内の圧力を下げるためのものである。減圧手段２０の配置については任意であり、培養容器１０の中でも外でもよい。減圧手段２０が培養容器１０内に配置されている場合、培養容器１０内の空気は減圧手段２０により培養容器１０外に押し出される。または、減圧手段２０が培養容器１０外に配置されている場合、培養容器１０内の空気は減圧手段２０により培養容器１０外に吸い出される。減圧手段２０は、例えば、減圧用コンプレッサ、ポンプ等である。

【0021】

本発明の細胞増殖促進装置１は、細胞および培地を収容した状態の培養容器１０内を、減圧手段２０により０．０１気圧以上１．０気圧未満の範囲の任意の圧力である微真空状態に維持している。細胞増殖促進装置１は、減圧手段２０により、培養容器１０内を所望する低圧環境に制御することができる。このため、培養容器１０は、微真空状態に耐え得るものである必要がある。

【0022】

前述したように本発明の細胞増殖促進装置１は、培養容器１０内を減圧手段２０により微真空状態に維持することができる。そして、微真空状態である低圧環境下で細胞を培養すると、低圧環境が培養容器１０内に収容された細胞に対して影響を及ぼし、低酸素環境よりも細胞の増殖を促進することができる。細胞増殖促進装置１を用いた微真空状態での細胞増殖促進効果については、下記実施例において具体的に説明する。

【0023】

なお、細胞増殖促進装置１は、培養容器１０内の圧力をモニタするための圧力計や、酸素濃度をモニタするための酸素濃度計を備えていてもよい。本発明において低圧とは、大気圧（常圧）である１．０気圧未満、０気圧より大きい値であり、微真空状態とは、通常の大気圧（１．０気圧）より低い０．０１気圧以上１．０気圧未満の範囲の任意の圧力の気体で満たされた空間の状態を意味する。

【0024】

また、本発明の細胞増殖促進装置２は、図４に示すように、上述した培養容器１０および減圧手段２０と同様の機能を有する培養容器３０および減圧手段４０に加えて、酸素濃度調整手段５０を備えていてもよい。酸素濃度調整手段５０は、培養容器３０内の酸素濃度を、０．０１％以上２１％以下の範囲の任意の濃度に維持するためのものである。なお、細胞増殖促進装置２に酸素濃度調整手段５０を備えていない構成にしてもよい。

【0025】

酸素濃度調整手段５０の構成については特に限定されない。例えば、外気および／または培養容器３０内からの排気が通過する位置に酸素濃度調整手段５０を配置し、ＰＳＡ（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｓｗｉｎｇ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）法等により吸着剤に窒素を選択的に吸着させて酸素と窒素を分離し、高酸素濃度の空気を排出し、低酸素濃度の空気を培養容器３０内に供給する。または、高酸素濃度の空気もしくは酸素貯蔵タンクから酸素を供給する方法等がある。

【0026】

本発明の細胞増殖促進装置２は、細胞および培地を収容した状態の培養容器３０内を、減圧手段４０により、常圧より低圧の任意の圧力に維持し、かつ、酸素濃度調整手段５０により、圧力によって定まる酸素濃度よりも低濃度、あるいはそれよりも高濃度の任意の酸素濃度に維持することができる。これにより、培養容器３０内の環境を、所望する低圧、および、圧力によって定まる酸素濃度以外も含む所望する酸素濃度に制御することができる。

【0027】

細胞増殖促進装置２の培養容器３０は、培養容器３０外から細胞、液体または気体の少なくとも１つを取り込む開閉手段３２と、培養容器３０外との間で細胞、液体または気体の少なくとも１つの吸排出を行う吸排出手段３４と、を備えていてもよい。細胞、液体または気体は、例えば、培養細胞、培地、薬剤、体液、老廃物、空気、酸素、窒素等が挙げられる。

【0028】

開閉手段３２は、外部からの電気信号等により制御が可能な電磁開閉弁等の任意のタイミングで開閉するものであってもよいし、培養容器３０内の圧力の変化により開閉するものであってもよい。吸排出手段３４は、管路であり、管路には弁を設けてもよい。つまり、開閉手段３２と吸排出手段３４はいずれも培養容器３０外から細胞、液体または気体の少なくとも１つを取り込む機能を有しているため、別々に設けてもよいが、兼用してもよく、また、それぞれ複数設けてもよい。これにより、培養容器３０の内部と外部との間で、例えば、ガス、栄養、老廃物等の物質をやり取りすることができる。

【0029】

また、本発明の細胞増殖促進装置２の開閉手段３２および吸排出手段３４を備えた培養容器３０は、動物の体内に埋め込み可能であってもよい。なお、動物とは人間を含むものである。開閉手段３２および吸排出手段３４を備えた培養容器３０を動物の体内に埋め込むことにより、開閉手段３２および／または吸排出手段３４から被験体自身の体液を取り込み、これを用いて細胞を増殖させることが可能になる。これにより、培養する細胞の免疫拒絶のリスクを回避することができる。

【0030】

以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。本発明は、以下の実施例により何ら限定されるものではない。

【実施例0031】

本実施例である低圧群では、細胞増殖促進装置１は、図１に示すように、培養容器１０および減圧手段２０を備えている。培養容器１０は、容量１２３Ｌであって、内部の温度を一定に保ち、内部の圧力を低圧に維持可能なものである。また、減圧手段２０は、培養容器１０外に配置され、培養容器１０内の空気を培養容器１０外に吸い出して圧力を下げるための減圧用コンプレッサである。なお、培養容器１０には、圧力計と酸素濃度計を備えていることが好ましい。

【0032】

次に、本実施例における細胞増殖促進装置１を用いた細胞培養方法について説明する。まずは、培養容器１０内が常圧、通常の酸素濃度の状態で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を播種した直径３５ｍｍのディッシュを培養容器１０内に収容する。そして、減圧手段２０を稼働させて培養容器１０内部の圧力を０．６気圧に低下させ、これを維持する。

【0033】

このとき培養容器１０内の酸素濃度を１０％とする。培養容器１０内の圧力を減圧手段２０により目的とする所定の低圧に維持し、かつ、図１には示していないが、培養容器１０外に配置されたＰＳＡ方式の酸素濃度調整手段５０を用いて、窒素ガスを培養容器１０内に供給することによって、培養容器１０内の酸素濃度は、所定の低圧により定まる所定の低酸素濃度よりも低い酸素濃度に維持される。本実施例において細胞増殖促進装置１は、培養容器１０内の圧力を１．０気圧から０．０１気圧までの間の任意の圧力に調整可能である。３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４８時間培養を行い、その後、細胞数を測定する。

【0034】

［比較例１］
比較例１である通常群では、細胞を１．０気圧、酸素濃度２１％の通常環境で培養したこと以外は実施例１と同様に培養を行い、その後、細胞数を測定する。

【0035】

［比較例２］
比較例２である低酸素群では、細胞を１．０気圧、酸素濃度７％の低酸素環境で培養したこと以外は実施例１と同様に培養を行い、その後、細胞数を測定する。

【0036】

その結果、増殖した細胞数は、図２に示すように、比較例１の通常群に対する実施例１の低圧群の比率は１．７であり、比較例１の通常群に対する比較例２の低酸素群の比率は１．５であった。よって、実施例１では、低圧群は、従来の培養方法である常圧・通常の酸素濃度である通常群、常圧・低酸素濃度である低酸素群と比べて、細胞の増殖をより促進した。すなわち、細胞の増殖には、低圧であることが寄与しているといえる。

【実施例0037】

本実施例である低圧群では、培養容器１０内部の圧力を０．５気圧に維持し、培養容器１０内の気体中の酸素濃度に代えて培養容器１０内の培地の溶存酸素濃度を測定し、それを３ｍｇ／Ｌとし、培地に使用するウシ胎児血清（ＦＢＳ）の濃度を１０％以外に５％、１％を加え３種類としたこと以外は、実施例１と同様に細胞増殖促進装置１を用いて細胞培養を行う。３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４８時間培養を行い、その後、細胞数を測定する。

【0038】

［比較例３］
比較例３である通常群では、細胞を１．０気圧、溶存酸素濃度６．７ｍｇ／Ｌの通常環境で培養したこと以外は実施例２と同様に培養を行い、その後、細胞数を測定する。

【0039】

その結果、増殖した細胞数は、図３に示すように、比較例３の通常群ＦＢＳ１０％を１とした場合、これに対する実施例２の低圧群ＦＢＳ１０％の比率が２．１であった。また、通常群ＦＢＳ１０％に対する通常群ＦＢＳ５％の比率は０．９であり、低圧群ＦＢＳ５％の比率は２．０であった。また、通常群ＦＢＳ１０％に対する通常群ＦＢＳ１％の比率は０．２であり、低圧群ＦＢＳ１％の比率は０．７であった。

【0040】

よって、実施例２では、低圧群は、従来の培養方法である常圧・通常の酸素濃度である通常群と比べて、いずれの血清濃度でも細胞の増殖をより促進した。すなわち、細胞の増殖には、低圧であることが寄与しているといえる。また、低圧群は血清濃度をＦＢＳ１％に低下させても、通常群ＦＢＳ１０％または５％より少し低いものの同程度の培養効率であり、高価な血清の添加量を大幅に減少させて培養にかかる費用を低減させることが可能である。