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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024035173
(43)【公開日】2024-03-13
(54)【発明の名称】高感度ＰＣＲ法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20240306BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240306BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240306BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023139190
(22)【出願日】2023-08-29
(31)【優先権主張番号】P 2022137094
(32)【優先日】2022-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り
(71)【出願人】
【識別番号】000125347
【氏名又は名称】学校法人近畿大学
(74)【代理人】
【識別番号】100118924
【弁理士】
【氏名又は名称】廣幸 正樹
(72)【発明者】
【氏名】藤井 政幸
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA17
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR62
4B063QR66
4B063QS10
4B063QS25
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】従来遺伝子の一塩基変異を識別するには、ＴａｑＭａｎプローブを用いて行われていたが、遺伝子－プローブ間の結合親和性（融解温度）の差を利用して識別するので、不要なものも増幅される。したがって、一塩基変異を識別する精度、検出感度がともに低いという課題があった。
【解決手段】プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
３’－末端から２番目にポリメラーゼ活性を阻害する人工型核酸が配置され、前記３’－末端に天然型のＤＮＡが配置された化学修飾プライマーを用いる高感度ＰＣＲ法では、３’－末端が標的となる塩基と一致しない場合、３’－末端を除去し、人工型核酸を露出させ、ポリメラーゼ活性を停止させるので、きわめて精度の高い検出が可能になる。
【選択図】図１
【解決手段】プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
３’－末端から２番目にポリメラーゼ活性を阻害する人工型核酸が配置され、前記３’－末端に天然型のＤＮＡが配置された化学修飾プライマーを用いる高感度ＰＣＲ法では、３’－末端が標的となる塩基と一致しない場合、３’－末端を除去し、人工型核酸を露出させ、ポリメラーゼ活性を停止させるので、きわめて精度の高い検出が可能になる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
３’－末端から２番目にポリメラーゼ活性を阻害する人工型核酸が配置され、前記３’－末端に天然型のＤＮＡが配置された化学修飾プライマーを用いる高感度ＰＣＲ法。
３’－末端から２番目にポリメラーゼ活性を阻害する人工型核酸が配置され、前記３’－末端に天然型のＤＮＡが配置された化学修飾プライマーを用いる高感度ＰＣＲ法。
【請求項2】
さらに、サイバーグリーンを含むことを特徴とする請求項１に記載された高感度ＰＣＲ法。
【請求項3】
前記人工型核酸は、糖の２’位を２’－ＯＭｅ若しくは２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＭｅで置換したＲＮＡ誘導体である請求項１または２の何れかに記載された高感度ＰＣＲ法。
【請求項4】
前記人工型核酸を含むプライマーの各塩基間の骨格はリン酸ジエステル結合若しくはホスホロチオエート結合の何れかである請求項１または２の何れかに記載された高感度ＰＣＲ法。
【請求項5】
前記化学修飾プライマーの前記３’－末端から３番目から５’－末端までは、ポリメラーゼ活性を阻害しないヌクレオチドである請求項１または２の何れかに記載された高感度ＰＣＲ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は一塩基の変異型を高精度で検出することができる高感度ＰＣＲ法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
遺伝子の一塩基変異を識別する場合はＴａｑＭａｎプローブを用いる方法が良く使われている。
【0003】
特許文献１には、ＴａｑＭａｎプローブに加えてポリメラーゼの５’－エクソヌクレアーゼ活性により分解されないＷＴ（ワイルドタイプ）ブロッカー核酸断片を、変異点を含む領域に結合させたのち、プライマーを結合させＰＣＲを行う。ＤＮＡに変異点があれば、ＷＴブロッカー核酸断片は変異型ＤＮＡへの結合が弱く、ＰＣＲは行われるが、変異点のない野生型ＤＮＡには強く結合して野生型のＰＣＲを妨害する。一方、ＴａｑＭａｎプローブは反対に野生型ＤＮＡへの結合は弱く、変異型ＤＮＡにより強く結合してポリメラーゼの５’－エクソヌクレアーゼ活性により分解されてＰＣＲの進行に伴って蛍光が増強すると開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開第２０１６／０９３３３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
ＴａｑＭａｎプローブを用いた方法は、遺伝子－プローブ間の結合親和性（融解温度）の差を利用して遺伝子の一塩基変異を識別するので、ＴａｑＭａｎプローブもＷＴブロッカーも変異型ＤＮＡか野生型ＤＮＡの一方に１００％結合し、他方に全く結合しない温度設定は原理的に不可能である。ＴａｑＭａｎプローブが目的外の野生型ＤＮＡにも、ＷＴブロッカーが目的外の変異型ＤＮＡにもある程度結合する分だけ検出感度を低下させることになる。そのため、同一細胞内に発現する野生型遺伝子とその一塩基変異遺伝子に由来するｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲによって定量解析することはできず、一塩基変異遺伝子を標的とした薬物の効果を遺伝子レベルで定量解析する手段がなかった。
【0006】
したがって、まず、検出感度が５０－１００コピー以上の検体が検出限界となる。つまり、それ以下の検体数で増幅するほどの高感度性は有していない。また、変異識別精度（野生型中に混在する変異型比率）は１－５％程度が限界であった。また、個々の評価系毎に精密なプライマー、プローブ設計、反応温度設定が必要となり、検査毎に変異識別精度、検出精度にバラツキが生じやすくなる。また、ＴａｑＭａｎプローブは高価である。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明に係る高感度ＰＣＲ法は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、ポリメラーゼ活性を阻害するヌクレオチドも３’－末端になければ増幅が可能であるが、３’－末端に露出すると、ポリメラーゼ活性が阻害されるという性質を利用することで、一塩基変異を検出する。
【0008】
より具体的に本発明に係る高感度ＰＣＲ法は、
プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
３’－末端から２番目にポリメラーゼ活性を阻害する人工型核酸が配置され、前記３’－末端に天然型のＤＮＡが配置された化学修飾プライマーを用いることを特徴とする。
プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
３’－末端から２番目にポリメラーゼ活性を阻害する人工型核酸が配置され、前記３’－末端に天然型のＤＮＡが配置された化学修飾プライマーを用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【0009】
本発明は新規化学修飾プライマーと、プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼを組み合わせたサイバーグリーン法を利用するＰＣＲ技術である。融解温度の違いに基づく検出は行わないので、従来とは異なる原理による一塩基変異の識別方法と言える。
【0010】
したがって、非常に少ないコピー数（１０コピー数からでも可能）の検出対象遺伝子であっても増幅ができ、また、０．０１％の混入量でも明確に検出が可能である。
【0011】
また、フォワードとリバースの両プライマーで変異点を指定することができるので、２箇所が同時に一致する検体のみ増幅させることができ、非常に高感度な検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明に用いるプライマーの構成を示す図である。
【図2】本発明に係るＰＣＲ法の動作原理を説明する図である。
【図3】（ａ）プライマーＰＯＭ２－１をＫＲＡＳｗｔ（３５Ｇ）に対して使用した結果であり、（ｂ）ＫＲＡＳＧ１２Ｄ（３５Ａ）に対して使用した結果の増幅曲線を示すグラフである。
【図4】テンプレートＴａ－ｔ５（０．２μＭ）（配列番号５）と、プライマーＰＯＭ２ｃ（０．２μＭ）（配列番号８）を１：１で混合して、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー（１Ｕ）を加えて、７２℃で１分間反応させ、その溶液を液体クロマトグラフィーで調べた結果を表すグラフである。
【図5】（ａ）プライマーＰＯＭ２ａをＫＲＡＳＧ１２Ｄ（３５Ａ）に対して用いた増幅曲線であり、（ｂ）ＫＲＡＳｗｔ（３５Ｇ）に対して用いた増幅曲線である。
【図6】（ｃ）プライマーＰＯＭ２ａをＫＲＡＳＧ１２Ａ（３５Ｃ）に対して用いた増幅曲線であり、（ｄ）ＫＲＡＳＧ１２Ｖ（３５Ｔ）に対して用いた増幅曲線である。
【図7】プライマーＰＯＭ２ａを、濃度を変えたＴａ（３５Ａ）に対してＰＣＲを行った際の増幅曲線である。
【図8】８．３×１０－９μＭのＴｇ（３５Ｇ）に含まれた８．３×１０－１３μＭのＴａ（３５Ａ）を検出することを示す増幅曲線である。
【図9】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型のうち、δ株（ｏ－ＢＡ．５）、ＢＡ１株、ＢＡ２株を識別する原理を説明する図である。
【図10】プライマー対の利用方法を説明する図である。
【図11】プライマーＰＯＢ２ｇを用いて、濃度を８．３×１０－９μＭ～８．３×１０－１３μＭまで変化させたＴｇ（３５Ｇ）に対してＰＣＲを行った際の増幅曲線である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下に本発明に係る高感度ＰＣＲ法について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。また、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。
【0014】
本発明はプライマー中に意図的にポリメラーゼ活性を阻害するヌクレオチドを挿入し、プライマーの３’－末端が遺伝子と異なっている場合に３’－末端の塩基を除去する３’－エクソヌクレアーゼ活性を利用し、ポリメラーゼ活性を阻害するヌクレオチドを３’－末端に露出させ、それ以上プライマーからの伸長が生じないようにすることで、一塩基変異を検出する。
【0015】
本発明に係る高感度ＰＣＲ法では、プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、３’－末端から２番目にポリメラーゼ活性を阻害する人工型核酸が配置され、前記３’－末端に天然型のＤＮＡが配置された化学修飾プライマーを利用する。
【0016】
プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼとは、鋳型鎖との間で間違った塩基があると、その塩基を取り除く機能を有するＤＮＡポリメラーゼのことをいう。３’－エクソヌクレアーゼ活性を有していればよい。このようなＤＮＡポリメラーゼは、ＨｉＦｉポリメラーゼとも呼ばれており、市販経路で入手することが可能である。例えば、ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）、ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（アジレントテクノロジーズ社）、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＤＡＮポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好適に利用できる。
【0017】
図１には本発明で利用するプライマーを図示する。プライマーは、５’－末端からヌクレオチド２０がリン酸ジエステル結合によって、連結された構造をしている。ヌクレオチド２０は、核酸塩基１８が連結した糖１４にリン酸ジエステル部１６が結合したものである。核酸塩基１８と糖１４が連結したものはヌクレオシドと呼ばれる。したがって、ヌクレオシド同士がリン酸ジエステル部１６で結合していると言ってよい。
【0018】
本発明で利用するプライマー１０では、３’－末端から２番目のヌクレオチド２０ｂの糖１４の２’位の化学修飾が、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する修飾であればよい。なお、３’－末端のヌクレオチド２０ａは天然型のヌクレオチドである。なお、天然型とはデオキシリボース若しくはリボースをいい、天然に存在し、ポリメラーゼ活性を阻害しないものをいう。
【0019】
３’－末端から２番目のヌクレオチド２０ｂの具体例としては、一般式２’－ＯＲ１ＲＮＡ（糖１４の２’位がＲ１とエーテル結合したＲＮＡの意味）で表される２’－Ｏ修飾ＲＮＡ誘導体が挙げられる。一般式を（１）式に示す。なお、ここでは塩基部分はアデニンを記載しているが、例示であり、他の塩基であってもよい（以下の構造式の例示においても同じ）。
【0020】
【化1】
【0021】
ここでＲ１はメチル基、エチル基、アリル基、プロパルギル基、メトキシエチル基と言った官能基が好適に利用できる。（２）式はＲ１がメチル基（２’－Ｏ－メチルアデノシン）、（３）式はＲ１がメトキシエチル基（２’－Ｏ－（メトキシエチル）アデノシン）の場合を示す。（３）式ではリボースの２’－Ｏにメトキシエチル基が(エーテル)結合している。
【0022】
【化2】
【0023】
また、３’－末端から２番目のヌクレオチド２０ｂのヌクレオシド自体が、２’，４’－Ｌｏｃｋｅｄ ＲＮＡやＢＮＡＮＣ（Ｍｅ）であってもよい。（４）式にはＢＮＡＮＣ（Ｍｅ）（２’－Ｏ，４’－Ｃ－（Ｎ－メチルアミノメチレン）アデノシン）を示す。（４）式では、リボースの２’－Ｏと４’－ＣがＮ－メチルアミノメチレン基で架橋されている。これらのヌクレオチドが３’－末端にあれば、ポリメラーゼ活性が阻害されるからである。
【0024】
【化3】
【0025】
プライマー１０の３’－末端から３番目のヌクレオチドから５’－末端までのヌクレオチド２０は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－ＯＭｅＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、モルフォリノ核酸等のＤＮＡポリメラーゼの反応を阻害しない範囲であらゆる修飾核酸含んでも構わない。また、蛍光色素や機能性分子などとの核酸コンジュゲートを含んでよい。
【0026】
また、３’－末端のヌクレオチド２０ａのリン酸ジエステル部１６ａは、ホスホロチオエート結合であってもよい。例えば、リン酸と二重結合している酸素が硫黄に置き換わっていてもよい。このようにリン酸ジエステル部１６ａを修飾しても３’－末端にあると、エキソヌクレアーゼ活性によって３’－末端の塩基が削除されると、ポリメラーゼ活性を阻害することができるからである。
【0027】
糖１４に化学修飾を受けているヌクレオチド若しくはリン酸ジエステル部１６ａの少なくとも何れかを有するものを人工型ヌクレオチドと呼ぶ。本発明において、人工型ヌクレオチドはポリメラーゼ活性を阻害する。また、人工型核酸と呼んでもよい。また、人工型ヌクレオチドには、それ以外の形状であって、３’－末端に存在するとポリメラーゼ活性を阻害するものを含めてよい。また、人工型ヌクレオチドを含むプライマーを化学修飾プライマーとも呼ぶ。
【0028】
また、本発明に係る高感度ＰＣＲ法では、二重螺旋を組んでいるＤＮＡと特異的に結合する色素を用いるのが良い。特にＰＣＲを行う際は、必要である。核酸の染色に用いられる非対称のシアニン系色素であるサイバーグリーンは好適に利用できる。なお、二重螺旋を組むＤＮＡに特異的に結合する色素であれば、サイバーグリーンに限定されるものではなく、サイバーグリーンの誘導体であってもよい。
【0029】
＜動作原理＞
本発明に係るＰＣＲ法の動作原理を図２に示す。図２（ａ）には、対象となるＤＮＡとプライマー１０を示す。対象ＤＮＡの一方を主鎖３０とし、その対象鎖を補鎖３２とする。いま主鎖３０の所定の部分の塩基配列が「ｇａｔ」であったとする。なお、塩基配列のａ、ｔ、ｇ、ｃは、それぞれアデニン、チミン、グアニン、シトシンを表す。補鎖３２の対応箇所は５’－末端から「ａｔｃ」の配列となる。
本発明に係るＰＣＲ法の動作原理を図２に示す。図２（ａ）には、対象となるＤＮＡとプライマー１０を示す。対象ＤＮＡの一方を主鎖３０とし、その対象鎖を補鎖３２とする。いま主鎖３０の所定の部分の塩基配列が「ｇａｔ」であったとする。なお、塩基配列のａ、ｔ、ｇ、ｃは、それぞれアデニン、チミン、グアニン、シトシンを表す。補鎖３２の対応箇所は５’－末端から「ａｔｃ」の配列となる。
【0030】
この主鎖３０中の逆三角印をつけたアデニン（ａ）を検出対象塩基とする。この場合、プライマー１０の３’－末端はアデニン（ａ）が結合した天然型ヌクレオチドとなり、３’－末端から２番目は、グアニン（ｇ）が結合した人工型ヌクレオチドとなる。
【0031】
このプライマー１０でＰＣＲを行うと、図２（ｂ）に示す様に、アニーリングによって、主鎖３０と補鎖３２が分離したのち、プライマー１０が補鎖３２に結合し、プライマー１０の３’－末端から続けてプライマー１０を伸長させる。つまり、通常のＰＣＲが行われ、増幅が行われる。
【0032】
一方、図２（ｃ）には、主鎖３０のアデニン（ａ）がグアニン（ｇ）に変位してしまったＤＮＡが示されている。これに図２（ａ）で用いたのと同じプライマー１０を使って、ＰＣＲを行う。この際にはプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼが用いられる。
【0033】
アニーリング工程で主鎖３０と分離した補鎖３２の対象箇所がアデニン（ａ）と結合するチミン（ｔ）ではなく、シトシン（ｃ）になっている（図２（ｄ））ので、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性によりプライマー１０のアデニン（ａ）を除く（図２（ｅ））。そして、ポリメラーゼは、続いて伸長を行おうとする。
【0034】
しかし、プライマー１０の３’－末端は人工型ヌクレオチドとなっており、ポリメラーゼはポリメラーゼ活性を発揮できず、核酸の伸長は行われてない（図２（ｆ））。結果、主鎖３０中の一塩基の違いによって、ＰＣＲによる増幅は実施されない。なお、適度な位置に設定されたリバースプライマーは、補鎖３２との間でポリメラーゼ反応を行うが、１対の２本鎖ＤＮＡから１対の２本鎖ＤＮＡしか生成できないので、何度サイクルを繰り返しても、全体としてのコピー数は増えない。以上のように、本発明に係る高感度ＰＣＲ法は一塩基の違いを確実に検出することができる。
【0035】
＜利用の形態＞
本発明に係る高感度ＰＣＲ法では、後述する実施例に示す様に、特定タンパク質の変異点を高感度で検出することができるため、一塩基変異検出のためのマスターミックスを構成することができる。具体的には、本発明に係るプライマーとプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼ、ＤＮＡと特異的に結合する色素、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、バッファー等を最適料に含むものである。
本発明に係る高感度ＰＣＲ法では、後述する実施例に示す様に、特定タンパク質の変異点を高感度で検出することができるため、一塩基変異検出のためのマスターミックスを構成することができる。具体的には、本発明に係るプライマーとプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼ、ＤＮＡと特異的に結合する色素、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、バッファー等を最適料に含むものである。
【0036】
ここでプライマーは、３’－末端には標的となる塩基（若しくはその相補塩基）で、３’－末端から２番目にはポリメラーゼ活性を阻害する人工型ヌクレオチドが結合したものである。
【実施例0037】
（実施例１）
以下に本発明に係る高感度ＰＣＲ法について実施例を示しながら説明を行う。
以下に本発明に係る高感度ＰＣＲ法について実施例を示しながら説明を行う。
【0038】
＜増幅対象の説明＞
対象となるＤＮＡは、ガン遺伝子とされているＫＲＡＳ遺伝子とした。ＫＲＡＳ遺伝子は、そのｍＲＮＡ全長５４３０ｂｐのうちＫＲＡＳタンパク質コード領域（１９１．．７６０）（タンパク質情報配列）のａｔｇ（開始コドン）から始まる配列の中で３５番目に変異点を持つことが知られている。
対象となるＤＮＡは、ガン遺伝子とされているＫＲＡＳ遺伝子とした。ＫＲＡＳ遺伝子は、そのｍＲＮＡ全長５４３０ｂｐのうちＫＲＡＳタンパク質コード領域（１９１．．７６０）（タンパク質情報配列）のａｔｇ（開始コドン）から始まる配列の中で３５番目に変異点を持つことが知られている。
【0039】
ＫＲＡＳのタンパク質コード領域の中の２０５番から９６塩基分をテンプレートとした。野生型ＫＲＡＳの２０５番から９６塩基分の配列を配列番号１として、表１に示す。配列番号１を「ＫＲＡＳ野生種：ＫＲＡＳｗｔ（３５Ｇ）、もしくはＴｇ（３５Ｇ）」と呼ぶ。
【0040】
また、変異種としてグアニンをアデニンに変異させたもの「ＫＲＡＳＧ１２Ｄ（３５Ｇ＞Ａ）、若しくはＴａ（３５Ａ）」を配列番号２、グアニンをシトシンに変異させたもの「ＫＲＡＳＧ１２Ａ（３５Ｇ＞Ｃ）、若しくはＴｃ（３５Ｃ）」を配列番号３、グアニンをチミンに変異させたもの「ＫＲＡＳＧ１２Ｖ（３５Ｇ＞Ｔ）、若しくはＴｔ（３５Ｔ）」を配列番号４として用意した。なお、アミノ酸Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｖはそれぞれグリシン、アスパラギン酸、アラニン、バリンを表す。開始コドンから３５番目の変異点は配列番号１、２、３、４においては５’－末端から２１番目にあたる。
【0041】
また、確認実験用のテンプレートとしてＴａ（３５Ａ）の５’－末端から２１塩基分の補鎖の５’－末端にチミンを５つ結合させたものをＴａ－ｔ５として配列番号５とした。
【0042】
【表1】
【0043】
これに対して、表２を参照して、３’－末端をグアニン、アデニン、シトシン、チミンとしたフォワードプライマーをそれぞれＰＯＭ２ｇ、ＰＯＭ２ａ、ＰＯＭ２ｃ、ＰＯＭ２ｔとし、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９とした。これらのプライマーは表１の下線で示す配列番号１～４の５’－末端の１番目から２１番目までを結合対象とするように設計した。
【0044】
また、これらのプライマーは（２）式で示すように、３’－末端から２番目のヌクレオチドは糖１４ｂの２’の位置に「－ＯＣＨ３」（「－ＯＭｅ」とも記載できる。）修飾がされている人工型ヌクレオチドである。すなわち、３’－末端から２番目のヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルグアノシンである。これを「Ｇｍ」として表した。３’－末端から２番目のヌクレオチド２０ｂは「修飾されたヌクレオチド：人工型ヌクレオチド」である。
【0045】
また、これらのフォワードプライマーの３’－末端を除去したプライマーをＰＯＭ２－１として配列番号１０で示した。
【0046】
また、ＰＯＭ２ｇ、ＰＯＭ２ａ、ＰＯＭ２ｃ、ＰＯＭ２ｔの３’－末端と３’－末端から２番目のヌクレオシドを結合するリン酸ジエステル結合部１６ａをホスホロチオエートにしたプライマーをＰＳＭ２＾ｇ、ＰＳＭ２＾ａ、ＰＳＭ２＾ｃ、ＰＳＭ２＾ｔとし、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４で示した。
【0047】
ホスホロチオエートはリン酸ジエステル結合部１６ａのリン酸と二重結合をしている酸素を硫黄に置き換えたものである。表２では、ホスホロチオエート結合を有するという意味で３’－末端の塩基記号の左肩に「＾」記号をつけて表した。
【0048】
また、ＫＲＡＳの野生型および変異型に対するリバースプライマーをＰＲｅｖとして配列番号１５で示した。これは表１の増幅部分の３’－末端から２２塩基分である。リバースプライマーＰＲｅｖは、表１の配列の３’－末端から下線を引いた部分に結合する。
【0049】
【表2】
【0050】
ＰＣＲには、Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ標準プロトコールに従った。また、プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ ポリメラーゼＴＭ」を用いた。実行サイクルは、９８℃で３０秒間保持（熱変性）した後、５５℃３０秒間保持（アニーリング）、７２℃６０秒間保持（ポリメラーゼ反応）のサイクルを３０～５０サイクル行った。最後に９８℃３０秒保持を行った。反応開始前の各成分の最終濃度を表３に示す。なお、「ｍａｓｔｅｒｍｉｘ」には、プライマーは含まれていない。プライマーは上記のプライマーを用いている。また「ｄｓＧｒｅｅｎ」は、二重螺旋を組んでいるＤＮＡと特異的に結合する色素である。このプロトコールを単に「標準プロトコール」と呼ぶ。以下の実施例は断りのない限り標準プロトコールに従ってＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ装置は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アジレントテクノロジーズ）社製ＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。
【0051】
【表3】
【0052】
＜最初の予備実験＞
図３にプライマーＰＯＭ２－１を用いた場合の結果を示す。図３（ａ）はＫＲＡＳｗｔ（３５Ｇ）に対して使用した結果の増幅曲線を示し、図３（ｂ）はＫＲＡＳＧ１２Ｄ（３５Ａ）に対して使用した結果の増幅曲線を示す。折れ線の数は試行数毎の結果である。両グラフとも横軸はサイクル数であり、縦軸は蛍光強度（ΔＲｎ）を表す。閾値ラインは三角印をつけた。両グラフとも閾値ラインは一番上のラインである。両グラフともＰＣＲサイクルを繰り返しても閾値ラインを超えず、増幅されなかった。
図３にプライマーＰＯＭ２－１を用いた場合の結果を示す。図３（ａ）はＫＲＡＳｗｔ（３５Ｇ）に対して使用した結果の増幅曲線を示し、図３（ｂ）はＫＲＡＳＧ１２Ｄ（３５Ａ）に対して使用した結果の増幅曲線を示す。折れ線の数は試行数毎の結果である。両グラフとも横軸はサイクル数であり、縦軸は蛍光強度（ΔＲｎ）を表す。閾値ラインは三角印をつけた。両グラフとも閾値ラインは一番上のラインである。両グラフともＰＣＲサイクルを繰り返しても閾値ラインを超えず、増幅されなかった。
【0053】
＜３’－エクソヌクレアーゼ活性＞
次に、テンプレートＴａ－ｔ５（０．２μＭ）（配列番号５）と、プライマーＰＯＭ２ｃ（０．２μＭ）（配列番号８）を１：１で混合して、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー（１Ｕ）を加えて、７２℃で１分間反応させ、その溶液を液体クロマトグラフィーで調べた結果を図４に示す。図４を参照して、横軸は滞留時間（分）であり、縦軸は強度（μＶ）である。その結果、プライマーとして入れたＰＯＭ２ｃのピークは観測されず、３’－末端が欠如したＰＯＭ２－１とテンプレートのＴａ－ｔ５だけが観測された。
次に、テンプレートＴａ－ｔ５（０．２μＭ）（配列番号５）と、プライマーＰＯＭ２ｃ（０．２μＭ）（配列番号８）を１：１で混合して、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー（１Ｕ）を加えて、７２℃で１分間反応させ、その溶液を液体クロマトグラフィーで調べた結果を図４に示す。図４を参照して、横軸は滞留時間（分）であり、縦軸は強度（μＶ）である。その結果、プライマーとして入れたＰＯＭ２ｃのピークは観測されず、３’－末端が欠如したＰＯＭ２－１とテンプレートのＴａ－ｔ５だけが観測された。
【0054】
以上のように、３’－末端がテンプレートの該当箇所（ここでは２１番目）の塩基が、プライマーの３’－末端と一致していない場合は、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼの３’－エクソヌクレアーゼ活性によって、プライマーの３’－末端の塩基は除去されることが確認できた。
【0055】
＜一塩基検出の立証＞
次に、テンプレートとして、Ｔｇ（３５Ｇ）（配列番号１）、Ｔａ（３５Ａ）（配列番号２）、Ｔｃ（３５Ｃ）（配列番号３）、Ｔｔ（３５Ｔ）（配列番号４）に対して、プライマーＰＯＭ２ａ（配列番号７）、ＰＯＭ２ｃ（配列番号８）、ＰＯＭ２ｔ（配列番号９）、ＰＳＭ２＾ｇ（配列番号１１）、ＰＳＭ２＾ａ（配列番号１２）、ＰＳＭ２＾ｃ（配列番号１３）、ＰＳＭ２＾ｔ（配列番号１４）を用いて標準プロトコールのリアルタイムＰＣＲを行った。
次に、テンプレートとして、Ｔｇ（３５Ｇ）（配列番号１）、Ｔａ（３５Ａ）（配列番号２）、Ｔｃ（３５Ｃ）（配列番号３）、Ｔｔ（３５Ｔ）（配列番号４）に対して、プライマーＰＯＭ２ａ（配列番号７）、ＰＯＭ２ｃ（配列番号８）、ＰＯＭ２ｔ（配列番号９）、ＰＳＭ２＾ｇ（配列番号１１）、ＰＳＭ２＾ａ（配列番号１２）、ＰＳＭ２＾ｃ（配列番号１３）、ＰＳＭ２＾ｔ（配列番号１４）を用いて標準プロトコールのリアルタイムＰＣＲを行った。
【0056】
図５および図６にプライマーＰＯＭ２ａを用いた場合の結果を例示する。図５（ａ）はＫＲＡＳＧ１２Ｄ（３５Ａ）と共にリアルタイムＰＣＲを行った結果であり、図５（ｂ）は、ＫＲＡＳｗｔ（３５Ｇ）、図６（ｃ）はＫＲＡＳＧ１２Ａ（３５Ｃ）、図６（ｄ）はＫＲＡＳＧ１２Ｖ（３５Ｔ）の場合の結果である。
【0057】
これら全ての図に対して、横軸はサイクル数であり、縦軸は蛍光強度（ΔＲｎ）を表す。また、閾値線は三角印で表したラインである。また、各リアルタイムＰＣＲは同一条件のものを３回繰り返し、それらをプロットした。図５および図６からサイクル数を重ねて閾値線を超え、増幅したと認められるのはＰＯＭ２ａをＫＲＡＳＧ１２Ｄ（３５Ａ）に対して用いた場合のみであった。他の組み合わせは、サイクル数を重ねても増幅を認められなかった。増幅が認められなかった状態を「検出されず」と呼ぶ。
【0058】
その他の組み合わせも合わせて結果を表４に示す。表４を参照して、左端列はプライマーの名称を示し、上端行には、各テンプレート毎のＣｔ値を表す。表４を参照して、プライマーの３’－末端の塩基とテンプレートの２１番目の塩基が同じ場合のみＣｔ値を測定することができ、他の場合は、「検出されず」という結果になった。
【0059】
【表4】
【0060】
これは、プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼが、プライマーの３’－末端と、テンプレートの２１番目の塩基の組み合わせが一致しないため、プライマーの３’－末端を削除し、３’－末端から２番目の修飾されたヌクレオチド２０ｂによって、ポリメラーゼ活性を失ったためであると結論できる。つまり、本発明の高感度ＰＣＲ法であれば、特定の位置における一塩基の違いを検出することができた。
【0061】
＜ＰＯＭ２の検出感度＞
次に本発明の検出感度について調べた。テンプレートとしては、Ｔａ（３５Ａ）（配列番号２）を用い、プライマーはＰＯＭ２ａ（配列番号７）を用いた。プライマーＰＯＭ２の初期濃度は２．０×１０－１μＭ、テンプレートＴａ（３５Ａ）の濃度は１倍（８．３×１０－９μＭ）、１／１０倍、１／１００倍、１／１０００倍、１／１００００倍の５種類を用意した。結果を図７および表５に示す。図７を参照して、横軸はサイクル数であり、縦軸は蛍光強度（ΔＲｎ）である。表５には、サイクル閾値Ｃｔ値およびＣｔ値間の差であるΔＣｔの値を記す。
次に本発明の検出感度について調べた。テンプレートとしては、Ｔａ（３５Ａ）（配列番号２）を用い、プライマーはＰＯＭ２ａ（配列番号７）を用いた。プライマーＰＯＭ２の初期濃度は２．０×１０－１μＭ、テンプレートＴａ（３５Ａ）の濃度は１倍（８．３×１０－９μＭ）、１／１０倍、１／１００倍、１／１０００倍、１／１００００倍の５種類を用意した。結果を図７および表５に示す。図７を参照して、横軸はサイクル数であり、縦軸は蛍光強度（ΔＲｎ）である。表５には、サイクル閾値Ｃｔ値およびＣｔ値間の差であるΔＣｔの値を記す。
【0062】
表５も参照すると、理論的には濃度が１０分の１になるとΔＣｔ値は３．３２ずつ大きくなるはずであるが、表５の測定値も実験誤差を含んでほぼその差になっており、定量性が確認できた。また、１サンプル中わずか１０コピー（１０分子）からでも増幅させることができたことがわかる。
【0063】
【表5】
【0064】
＜希少変異の検出＞
本発明に係る高感度ＰＣＲ法では、上記の様にサンプルが非常に少ない場合でも、確実に増幅することができる。さらに、この高感度ＰＣＲ法は、検出点の塩基が異なれば、増幅されないので、サンプル中にわずかに変異型が混在している場合でも検出することができる。そこで、野生型（ＫＲＡＳｗｔ（３５Ｇ）中に変異型であるＫＲＡＳＧ１２Ｄ（Ｇ３５＞Ａ）が０．０１％混入しているサンプルの検出および定量（Ｔｇ（３５Ｇ）／Ｔａ（３５Ａ）＝１／０．０００１）が可能であることを調べた。
本発明に係る高感度ＰＣＲ法では、上記の様にサンプルが非常に少ない場合でも、確実に増幅することができる。さらに、この高感度ＰＣＲ法は、検出点の塩基が異なれば、増幅されないので、サンプル中にわずかに変異型が混在している場合でも検出することができる。そこで、野生型（ＫＲＡＳｗｔ（３５Ｇ）中に変異型であるＫＲＡＳＧ１２Ｄ（Ｇ３５＞Ａ）が０．０１％混入しているサンプルの検出および定量（Ｔｇ（３５Ｇ）／Ｔａ（３５Ａ）＝１／０．０００１）が可能であることを調べた。
【0065】
テンプレートとしてＴｇ（３５Ｇ）（配列番号１）を８．３×１０－９μＭとし、Ｔａ（３５Ａ）（配列番号２）を８．３×１０－１３μＭを用意した。
【0066】
また、プライマーとしてＰＯＭ２ｇ（配列番号６）とＰＯＭ２ａ（配列番号７）をそれぞれ２．０×１０－１μＭを用意した。これらを用いて表３のプロトコールでＲＴ－ＰＣＲを行った。結果を図８および表６に示す。
【0067】
図８を参照して、横軸はサイクル数であり、縦軸は蛍光強度（ΔＲｎ）である。また、図８は、プライマーＰＯＭ２ａを用いた場合の結果と、プライマーＰＯＭ２ｇを用いた場合の結果を重ね合わせたものであり、リアルタイムＰＣＲは、それぞれのプライマー毎に行った。
【0068】
この結果よりＣｔ値を求め、結果を表６に示す。表６を参照して、プライマーＰＯＭ２ｇを用いた場合にはテンプレートＴｇ（３５Ｇ）に対してＣｔ値は３１．４８±０．３３であり、テンプレートＴａ（３５Ａ）に対しては、Ｃｔ値は４２．１２±０．４４であり、ΔＣｔは１０．６４±０．３６となった。この結果はプライマーＰＯＭ２ｇがテンプレートＴｇ（３５Ｇ）をテンプレートＴａ（３５Ａ）よりも２の１０．６４乗倍、すなわち約１５９６倍敏感に検出できたことを意味している。
【0069】
【表6】
【0070】
＜ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型の検出＞
現在世界中で猛威を振舞っているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスであるが、本発明に係る高感度ＰＣＴ法を用いることで、検体量がわずかであっても、非常に高い精度で検出が可能である。このウイルスの識別には、スパイクタンパク質部分の変異で区別している。表７には野生型「Ｗｕ」、オミクロンＢＡ１型「ｏ－ＢＡ．１」、オミクロンＢＡ２型「ＢＡ．２」、オミクロンＢＡ５型「ＢＡ．５」の１３５５番目と１４８６番目の変異を示す。野生株において、これらの変異点を含むアミノ酸は４５２番目ロイシン「Ｌ」と４９６番目のグリシン「Ｇ」である。
現在世界中で猛威を振舞っているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスであるが、本発明に係る高感度ＰＣＴ法を用いることで、検体量がわずかであっても、非常に高い精度で検出が可能である。このウイルスの識別には、スパイクタンパク質部分の変異で区別している。表７には野生型「Ｗｕ」、オミクロンＢＡ１型「ｏ－ＢＡ．１」、オミクロンＢＡ２型「ＢＡ．２」、オミクロンＢＡ５型「ＢＡ．５」の１３５５番目と１４８６番目の変異を示す。野生株において、これらの変異点を含むアミノ酸は４５２番目ロイシン「Ｌ」と４９６番目のグリシン「Ｇ」である。
【0071】
【表7】
【0072】
表７からスパイクタンパクｍＲＮＡの１３５５と１４８６の２点の変異の組み合わせによって、ｏ－ＢＡ１株、ＢＡ２株、ＢＡ５株を識別することができる。図９にその検出原理を示す。
【0073】
図９を参照して、スパイクタンパク質の１３５５から５’－末端側に一定長のフォワードプライマーＭｘを設ける。また、１４８６から３’－末端側に一定長のリバースプライマーｙＭを設ける。すでに示したように、本発明に係る高感度ＰＣＲ法では、このような場合、フォワードおよびリバースのプライマー両方で伸長動作が起こらないと増幅しない。したがって、表７の１３５５番目と１４８６番目を３’－末端とし、その１つ前のヌクレオチドを修飾されたヌクレオチドとすることで、これらのタイプを検出できる。具体的には、表８のようにプライマーを設定した。
【0074】
【表8】
【0075】
表８を参照して、それぞれのフォワードプライマーは「Ｆ」の頭文字を持ち、リバースプライマーは「Ｒ」の頭文字を持つ。野生型のフォワードプライマーＦ１３５５ｗ／ｏは３’－末端に１３５５番目のチミン「Ｔ」を有し、リバースプライマーＲ１４８６ｗ／ＢＡ２の３’－末端に１４８６番目のグアニン「Ｇ」に結合するシトシン「Ｃ」が配置されている。以下ＢＡ１型株、ＢＡ２株、ＢＡ５株とも同様にフォワードプライマーの３’－末端には、１３５５番目の塩基を配置しリバースプライマーの３’－末端には１４８６番目の塩基の相手方塩基を配置した。
【0076】
そして、フォワードプライマー、リバースプライマーとも３’－末端から２番目の塩基には、糖部の２’に－ＯＭｅの修飾を行った。いずれのプライマーも３’－末端から２番目の塩基はシトシン「Ｃ」であったので、ヌクレオシドとしては２’－Ｏ－メチルシチジンとなる。表８では「（Ｃｍ）」と表した。
【0077】
テンプレートとしては、それぞれの変異株のスパイクタンパクを用い、ＰＣＲのプロトコールは、標準プロトコールに従った。リアルタイムＰＣＲの結果を表９に示す。
【0078】
【表9】
【0079】
表９を参照して、ウイルス型毎のプライマーによって、適用型が一致したスパイクタンパクだけが検出された。また、Ｃｔの値より、定量検出も可能である。
【0080】
これは各ウイルス毎のプライマーが、それぞれのウイルスを検出するためのプライマーとして使用できることを示している。つまり、ｏ－ＢＡ．５株に適用するプライマーの組合せは、ｏ－ＢＡ．５株用プライマーであり、ｏ－ＢＡ．１株に適用するプライマーの組合せは、ｏ－ＢＡ．１株用プライマーであり、ｏ－ＢＡ．２株に適用するプライマーの組合せは、ｏ－ＢＡ．２株用プライマーと言える。
【0081】
図１０には、これらのプライマーの利用例を示す。唾液検体を３分割し、それぞれの専用プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行う。すると、増幅しなかったプライマーに対応するウイルス変異株に対しては陰性であると判断できる。そして増幅した場合に、そのプライマーに対応するウイルス株に対して陽性であると判断できる。図１０では、ｏ－ＢＡ．２株用プライマーの場合だけ増幅が確認でき、唾液検体は、ｏ－ＢＡ．２株に対して陽性であると判断できる。また、この時のＣｔから定量分析も可能となる。
【0082】
＜他のポリメラーゼ＞
上記の実施例では、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社)を用いていたが、プルーフリーディング活性を有していれば、他のポリメラーゼでも当然本発明に係る高感度ＰＣＲ法は実施することができる。
上記の実施例では、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社)を用いていたが、プルーフリーディング活性を有していれば、他のポリメラーゼでも当然本発明に係る高感度ＰＣＲ法は実施することができる。
【0083】
表２で示したプライマーＰＯＭ２とＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ポリメラーゼ(アジレントテクノロジーズ社)およびＰｈｕｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のポリメラーゼを使ってＫＲＡＳの変移識別と同じ実験を行った。プロトコールは標準プロトコールを用いた。結果を表１０および表１１に示す。
【0084】
【表10】
【0085】
【表11】
【0086】
表１０および表１１からわかるように、プライマーの３’－末端が一致した場合だけ増幅されており、プルーフリーディング活性を有すれば、ポリメラーゼの種類によらないことがわかる。
【0087】
＜他の構成を有するプライマー＞
修飾プライマーであるＰＯＭ２は３’－末端から２番目のヌクレオシドが（２）式の構造をしているものであり、３’－末端にいるとポリメラーゼ活性を阻害する。ポリメラーゼ活性を阻害する他の構造のプライマーとして（３）式のリボース、（４）式のリボースを用いたヌクレオシドについて実施を行った。（３）式のリボースのヌクレオシドを用いたプライマーをＰＯＭＥと呼び、（４）式のリボースのヌクレオシドを用いたプライマーをＰＯＢと呼ぶ。
修飾プライマーであるＰＯＭ２は３’－末端から２番目のヌクレオシドが（２）式の構造をしているものであり、３’－末端にいるとポリメラーゼ活性を阻害する。ポリメラーゼ活性を阻害する他の構造のプライマーとして（３）式のリボース、（４）式のリボースを用いたヌクレオシドについて実施を行った。（３）式のリボースのヌクレオシドを用いたプライマーをＰＯＭＥと呼び、（４）式のリボースのヌクレオシドを用いたプライマーをＰＯＢと呼ぶ。
【0088】
これらのヌクレオシドを用いたプライマーを用い、標準プロトコールに従ったＲＴ－ＰＣＲを実行し、ＫＲＡＳの検出を行った。プライマーの配列を表１２に示す。
【0089】
【表12】
【0090】
プライマーＰＯＭＥの３’－末端から２番目のヌクレオチドは（ＧＭＥ）と表した。（３）式のリボースの構造である。プライマーＰＯＢ３’－末端から２番目のヌクレオチドは（ＧＢ）と表した。（４）式の構造のリボースである。プロトコールは、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼの場合と同じとした。結果を表１３に示す。なお、ＧＭＥおよびＧＢともグアニンの修飾型である。
【0091】
【表13】
【0092】
表１３を参照して、プライマーＰＯＭＥもプライマーＰＯＢも３’－末端が一致した場合のみ増幅が行われており、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性によって、人工型ヌクレオチドが露出したケースではポリメラーゼ活性が阻害されていることがわかる。
【0093】
＜ＰＯＢ２の検出感度＞
ＰＯＢ２は３’－末端から２番目のヌクレオシドが（４）式の構造をしているものである。このプライマーについても検出感度を調べた。実験条件は＜ＰＯＭ２の検出感度＞と同じである。すなわち、プライマーＰＯＢ２ｇの初期濃度は２．０×１０－１μＭ、テンプレートＴｇ（３５Ｇ）の濃度は１倍（８．３×１０－９μＭ）、１／１０倍、１／１００倍、１／１０００倍、１／１００００倍の５種類を用意した。
ＰＯＢ２は３’－末端から２番目のヌクレオシドが（４）式の構造をしているものである。このプライマーについても検出感度を調べた。実験条件は＜ＰＯＭ２の検出感度＞と同じである。すなわち、プライマーＰＯＢ２ｇの初期濃度は２．０×１０－１μＭ、テンプレートＴｇ（３５Ｇ）の濃度は１倍（８．３×１０－９μＭ）、１／１０倍、１／１００倍、１／１０００倍、１／１００００倍の５種類を用意した。
【0094】
結果を図１１および表１４に示す。図１１を参照して、横軸はサイクル数であり、縦軸は蛍光強度（ΔＲｎ）である。表１４を参照すると、理論的には濃度が１０分の１になるとΔＣｔ値は３．３２ずつ大きくなるはずであるが、表１４の測定値も実験誤差を含んでほぼその差になっており、定量性が確認できた。また、１サンプル中わずか１０コピー（１０分子）からでも増幅させることができたことがわかる。
【0095】
【表14】
【0096】
また、同様の実験をプライマーＰＯＢ２ａについても行った。この場合、標的となるテンプレートはＴａ（３５Ａ）（表１参照）である。この場合も図１１と同様の結果を得た。Ｃｔ値およびΔＣｔ値を表１５に示す。
【0097】
【表15】
【0098】
＜標的物質が異なる場合＞
他の標的塩基配列における一塩基変異を識別する例として、ＥＧＦＲ遺伝子ＷＴ（２６３０Ｃ）のＴ７９０Ｍ変異（２６３０Ｔ）について調べた。変異型は５’末端側から２６３０番目がシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）に変異している。表１５にはＥＧＦＲ遺伝子ＷＴと、変異型においてテンプレートとした部分の塩基配列を示す。それぞれ配列番号３２および３３とした。
他の標的塩基配列における一塩基変異を識別する例として、ＥＧＦＲ遺伝子ＷＴ（２６３０Ｃ）のＴ７９０Ｍ変異（２６３０Ｔ）について調べた。変異型は５’末端側から２６３０番目がシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）に変異している。表１５にはＥＧＦＲ遺伝子ＷＴと、変異型においてテンプレートとした部分の塩基配列を示す。それぞれ配列番号３２および３３とした。
【0099】
【表16】
【0100】
Ｔ－ＥＧＦＲ－２６３０ｃ／ＷＴにおいて、増幅の標的は変異点から５’末端に向かう２３塩基とした。このためのプライマーを表１７に示す。フォワードプライマーの３’末端から２番目に２’－ＯＭｅ（（２）式）を導入した。これを（Ａｍ）と示す。これは修飾されたアラニン（２’－Ｏ－メチルアデノシン）である。野生型においては、フォワードプライマーの３’末端はシトシン（ｃ）であり、変異型はフォワードプライマーの３’末端はチミン（ｔ）である。それぞれのフォワードプライマーおよび、リバースプライマーを配列番号３４、３５および配列番号３６、３７とした。
【0101】
【表17】
【0102】
野生型Ｔ－ＥＧＦＲ－２６３０ｃ／ｗｔおよび変異型Ｔ－ＥＧＦＲ－２６３０ｔ／Ｔ７９０Ｍに対して配列番号３４、３５のプライマーセットおよび配列番号３６、３７のプライマーセットを用いて標準プロトコールのリアルタイムＰＣＲを行った。結果のＣｔ値およびΔＣｔ値を表１８に示す。
【0103】
【表18】
【0104】
表１８を参照して、野生型プライマーを用いた場合は、野生型（Ｔ－ＥＧＦＲ－２６３０ｃ／ｗｔ）に対してはＣｔ値が２０．１程度であったが、変異型（Ｔ－ＥＧＦＲ－２６３０ｔ／Ｔ７９０Ｍ）に対しては３３．１とΔＣｔは１３．０±０．１となった。すなわち、野生型プライマーＦ－ＥＧＦＲ／２６３０Ｍ２ｃを用いた場合には野生型テンプレートを変異型テンプレートよりも２の１３．０乗倍、約８１９２倍敏感に検出した。
【0105】
一方、変異型プライマーＦ－ＥＧＦＲ／２６３０Ｍ２ｔを用いた場合には野生型テンプレートに対してＣｔ値は３３．４±０．２１であったが、変異型テンプレートに対しては、Ｃｔ値は１８．９±０．１３であり、ΔＣｔは１４．５±０．１となった。この結果は変異型プライマーが変異型テンプレートを野生型テンプレートよりも２の１４．５乗倍、２３１７０倍敏感に検出できたことを示している。癌遺伝子変異診断におけるリキッドバイオプシによるセルフリーＤＮＡ解析では野生型遺伝子に対して０．０１％（１／１００００）の変異型遺伝子の検出が目標値としてあげられているので、２３１７０倍という値はそれを上回る検出感度を示している。
【0106】
変異型用プライマー（配列番号３６、３７）を使って変異型ＥＧＦＲの検出に対する濃度依存性を調べた。実験条件は＜検出感度＞と同じである。すなわち、野生型プライマーの初期濃度はフォワードプライマーおよびリバースプライマー共に２．０×１０－１μＭ、テンプレート変異型ＥＧＦＲの濃度は１倍（８．３×１０－９μＭ）、１／１０倍、１／１００倍、１／１０００倍、１／１００００倍の５種類を用意した。結果のＣｔ値およびΔＣｔ値の結果を表１９に示す。
【0107】
【表19】
【0108】
表１９を参照すると、理論的には濃度が１０分の１になるとΔＣｔ値は３．３２ずつ大きくなるはずであるが、表１９の測定値も実験誤差を加味するとほぼその差になっており、定量性が確認できた。また、１サンプル中わずか１０コピー（１０分子）からでも増幅させることができたことがわかる。
【0109】
次にＥＧＦＲ遺伝子ＷＴ（２６３０Ｃ）のｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０欠失変異に対する本発明に係る高感度ＰＣＲ法の効果を調べた。標的としたのは、ＥＧＦＲ遺伝子２４６１から２５６０までの１００塩基とした。野生型とｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０欠失変異型の塩基配列を表２０に示す。それぞれの塩基配列は、配列番号３８および配列番号３９とした。
【0110】
【表20】
【0111】
ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０欠失変異型（配列番号３９）は、野生型（配列番号３８）に対して、５’末端から３７番目から５１番目までの１５塩基が欠失している。配列番号３９では欠失直前のグアニン（ｇ）と欠失直後のアデニン（ａ）に下線を引いた。これらを識別するためのプライマーを表２１に示す。
【0112】
【表21】
【0113】
表２１を参照して、Ｆ－ＥＧＦＲ２４６１－２５６０（配列番号４０）は、野生型Ｔ－ＥＧＦＲ２４６１－２５６０／ＷＴの５’端からの３０塩基に対するフォワードプライマーである。Ｒ－ＥＧＦＲ２４６１－２５６０（配列番号４１）は、野生型Ｔ－ＥＧＦＲ２４６１－２５６０／ＷＴの３’末端からの３０塩基に対するリバースプライマーである。
【0114】
Ｆ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌ７４６－Ａ７５０ ２４９７Ｍ２ｇ（配列番号４２）と、Ｆ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌ７４６－Ａ７５０ ２４９７Ｍ２ａ（配列番号４４）は、ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０欠失変異型（配列番号３９）に対するフォワードプライマーである。これらの３’－末端から２番目のヌクレオチドは糖１４ｂの２’の位置に「－ＯＣＨ３」修飾がされている人工型ヌクレオチドである。すなわち、３’－末端から２番目のヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルグアノシンである。表２１中では、「Ｇｍ」と表した。
【0115】
また、Ｆ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０ ２４９７Ｍ２ａ（配列番号４４）とＲ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０ ２５１１Ｍ２ｃ（配列番号４５）は、ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０欠失変異型（配列番号３９）に対するリバースプライマーである。これらの３’－末端から２番目のヌクレオチドは糖１４ｂの２’の位置に「－ＯＣＨ３」修飾がされている人工型ヌクレオチドである。すなわち、３’－末端から２番目のヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルウリジンである。表２１中では、「Ｕｍ」と表した。
【0116】
これらのプライマーを組み合わせた識別検討を行った。プライマーの組み合わせおよびそれらを用いた標準プロトコールによるリアルタイムＰＣＲの結果を表２２に示す。
【0117】
【表22】
【0118】
表２２を参照して、実験アでは野生型を検出するプライマーの組み合わせＦ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０／２４９７Ｍ２ｇとＲ－ＥＧＦＲ２４６１－２５６０を用いると野生型テンプレートＴ－ＥＧＦＲｗｔ２４６１－２５６０に対してＣｔ値は２１．８６±０．０９、欠失型テンプレートＴ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０に対してＣｔ値は３２．７８±０．２８、ΔＣｔは１０．９２であった。すなわち、このプライマーの組み合わせにより野生型テンプレートを変異型テンプレートよりも２の１０．９２乗倍、約１９３８倍敏感に検出することができた。
【0119】
実験イでは欠失型を検出するプライマーの組み合わせＦ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０ ２４９７Ｍ２ａとＲ－ＥＧＦＲ２４６１－２５６０を用いると野生型テンプレートＴ－ＥＧＦＲｗｔ２４６１－２５６０に対してＣｔ値は３０．４０±０．４３、欠失型テンプレートＴ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０に対してＣｔ値は１６．７４±０．０５、ΔＣｔ値は１３．６６であった。すなわち、このプライマーの組み合わせにより野生型テンプレートを変異型テンプレートよりも２の１３．６６乗倍、約１２９４４倍敏感に検出することができた。前述のとおり、癌遺伝子変異診断におけるリキッドバイオプシによるセルフリーＤＮＡ解析では野生型遺伝子に対して０．０１％（１／１００００）の変異型遺伝子の検出が目標値としてあげられているので、１２９４４倍という値はそれを上回る検出感度を示している。
【0120】
実験ウでは野生型を検出するプライマーの組み合わせＦ－ＥＧＦＲ２４６１－２５６０とＲ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０ ２５１１Ｍ２ｔを用いると野生型テンプレートＴ－ＥＧＦＲｗｔ２４６１－２５６０に対してＣｔ値は３０．９４±０．０９、欠失型テンプレートＴ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０に対してＣｔ値は＞４５．０ （検出されず） 、ΔＣｔは＞１４．０６であった。すなわち、このプライマーの組み合わせにより野生型テンプレートを変異型テンプレートよりも２の１４．０６乗倍以上、１７０８０倍以上敏感に検出することができた。
【0121】
実験エでは欠失型を検出するプライマーの組み合わせＦ－ＥＧＦＲ２４６１－２５６０とＲ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０ ２５１１Ｍ２ｃを用いると野生型テンプレートＴ－ＥＧＦＲｗｔ２４６１－２５６０に対してＣｔ値は３１．４９±０．０２、欠失型テンプレートＴ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０に対してＣｔ値は１８．４０±０．０８、ΔＣｔ値は１３．０９であった。すなわち、このプライマーの組み合わせにより野生型テンプレートを変異型テンプレートよりも２の１３．０９乗倍、約８７１９倍敏感に検出することができた。
【0122】
前述のとおり、癌遺伝子変異診断におけるリキッドバイオプシによるセルフリーＤＮＡ解析では野生型遺伝子に対して０．０１％（１／１００００）の変異型遺伝子の検出が目標値としてあげられているので、８７１９倍という値はほぼそれに近い検出感度を示している。
【0123】
【表23】
【0124】
表２３を参照すると、理論的にはＥＧＦＲ欠失変異テンプレートＴ－ＥＧＦＲ－ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０の濃度が初期濃度８．３×１０－９μＭから１０分の１になるごとにΔＣｔ値は３．３２ずつ大きくなるはずであるが、表２３の測定値も３．５６～３．８１となっており、実験誤差範囲内でほぼその差になっており、定量性が確認できた。また、１サンプル中わずか１０コピー（１０分子）からでも増幅させることができたことがわかる。
【0125】
以上のことから、本高感度ＰＣＲ法は２’位修飾核酸を３’－末端から２番目に含む化学修飾プライマー全般とプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ全般を用いるＰＣＲ法に広く適用できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【0126】
本発明に係る高感度ＰＣＲ法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ中の一塩基変異を高精度に識別して定量解析できるＰＣＲ法として、分子生物学研究における細胞内のｍＲＮＡ定量解析キット、感染症防疫におけるウイルス変異株の検出キット、癌遺伝子変異コンパニオン診断におけるリキッドバイオプシによるセルフリーＤＮＡ解析キット等にも好適に利用することができる。
【符号の説明】
【0127】
１０ プライマー
１４ 糖
１４ｂ （３’－末端から２番目のヌクレオチドの）糖
１６ リン酸ジエステル部
１６ａ （３’－末端のヌクレオチド２０ａの）リン酸ジエステル部
１８ 核酸塩基
２０ ヌクレオチド
２０ａ ３’－末端のヌクレオチド
２０ｂ ３’－末端から２番目のヌクレオチド
３０ 主鎖
３２ 補鎖
１４ 糖
１４ｂ （３’－末端から２番目のヌクレオチドの）糖
１６ リン酸ジエステル部
１６ａ （３’－末端のヌクレオチド２０ａの）リン酸ジエステル部
１８ 核酸塩基
２０ ヌクレオチド
２０ａ ３’－末端のヌクレオチド
２０ｂ ３’－末端から２番目のヌクレオチド
３０ 主鎖
３２ 補鎖
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】