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特開2024-35219免疫調節薬の有効性をスクリーニングするためのモデル及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024035219
(43)【公開日】2024-03-13
(54)【発明の名称】免疫調節薬の有効性をスクリーニングするためのモデル及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/078 20100101AFI20240306BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240306BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240306BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240306BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240306BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20240306BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240306BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240306BHJP
【ＦＩ】
C12N5/078
G01N33/50 Z
A61K45/00
A61P37/02
C12Q1/02
C12N5/09
C12N5/0783
G01N33/15 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023141427
(22)【出願日】2023-08-31
(31)【優先権主張番号】2022110665716
(32)【優先日】2022-09-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】523332862
【氏名又は名称】シャンハイ ライド バイオテック カンパニー，リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100134784
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和美
(72)【発明者】
【氏名】シエ ピン
(72)【発明者】
【氏名】タンイー ウェン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
4C084
【Ｆターム（参考）】
2G045AA29
2G045AA40
2G045CB01
2G045DA13
2G045DA14
2G045FA37
2G045FB13
4B063QA20
4B063QR40
4B063QS36
4B065AA90X
4B065CA60
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB071
(57)【要約】
【課題】免疫調節薬の有効性をスクリーニングするためのモデル及び方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、免疫調節薬の有効性をスクリーニングするためのモデル及び方法を開示する。前記方法は、ＰＶＤＦカプセルチューブを含む動物モデルを構築することを含み、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの動物モデルの薬力学的データ、ペアフロー多細胞サブグループの表現型同定データ及びマルチオミクスデータを分析することを含む。前記ＰＶＤＦカプセルチューブは、単一細胞懸濁液化の腫瘍細胞及び免疫細胞を含む細胞を収容し、前記腫瘍細胞及び免疫細胞は、臨床患者の新鮮な腫瘍組織又は体液に由来する。本発明により構築される動物モデルは、免疫系標的と調節薬の有効性のスクリーニングを行うことができ、また同時に複数の患者に対する免疫薬物のスクリーニングを行うことを実現し、臨床精密医療及び新薬開発のために迅速、効果的かつ機能的及び機序的研究方法を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、免疫調節薬の有効性をスクリーニングするためのモデル及び方法を開示する。前記方法は、ＰＶＤＦカプセルチューブを含む動物モデルを構築することを含み、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの動物モデルの薬力学的データ、ペアフロー多細胞サブグループの表現型同定データ及びマルチオミクスデータを分析することを含む。前記ＰＶＤＦカプセルチューブは、単一細胞懸濁液化の腫瘍細胞及び免疫細胞を含む細胞を収容し、前記腫瘍細胞及び免疫細胞は、臨床患者の新鮮な腫瘍組織又は体液に由来する。本発明により構築される動物モデルは、免疫系標的と調節薬の有効性のスクリーニングを行うことができ、また同時に複数の患者に対する免疫薬物のスクリーニングを行うことを実現し、臨床精密医療及び新薬開発のために迅速、効果的かつ機能的及び機序的研究方法を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブであって、前記細胞は単一細胞懸濁液中の腫瘍細胞及び免疫細胞を含み、さらに、前記腫瘍細胞及び免疫細胞は、臨床患者の新鮮な腫瘍組織又は体液に由来することを特徴とする、細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ。
【請求項2】
前記腫瘍組織は、臨床的に外科的に切除された腫瘍組織又は生検された腫瘍組織を含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ。
【請求項3】
前記体液は、血液、骨髄、胸水と腹水、及び脳脊髄液のうちの一つ又は複数を含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ。
【請求項4】
前記ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブの平均タンパク質透過性は約３００～１０００ｋＤａであり、又は５００～７００ｋＤａであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ。
【請求項5】
前記ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブは、使用前に活性化、超純水洗浄及び高圧滅菌によって前処理されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ。
【請求項6】
前記活性化は、前記ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブを無水アルコールですすぐことによって達成されることを特徴とする、請求項５に記載の細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ。
【請求項7】
前記封入された細胞は、富化された患者の自己免疫細胞であり、前記腫瘍細胞は、単一細胞懸濁液中の陰性選択細胞（ストローマ細胞及び免疫細胞）であり、前記患者の自己免疫細胞は、患者の固形腫瘍組織中の腫瘍浸潤リンパ球から分取されるか、又は患者の末梢血若しくは骨髄中の末梢血単核球から分取されたリンパ球であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ。
【請求項8】
前記分取に使用される分取方法は、抗ヒトＣＤ４５に結合された磁気ビーズに免疫細胞を付着させて分取することを含むことを特徴とする、請求項７に記載の細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ。
【請求項9】
前記分取に使用される分取方法は、抗ヒトＣＤ４５及び抗ヒト線維芽細胞マーカーに結合された磁気ビーズを用いて免疫細胞及び線維芽細胞を除去することにより腫瘍細胞を分取することを含むことを特徴とする、請求項７に記載の細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ。
【請求項10】
前記免疫細胞（ＣＤ３＋Ｔ細胞）に対する腫瘍細胞の比率範囲は、１．５：１～１５：１、又は１．５：１～９：１であることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ。
【請求項11】
全生細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは０．５％～１５％であり、かつ、前記免疫細胞の生存率は２０％以上であることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞を封入するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の少なくとも一つのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブを含む動物モデルであって、前記ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブは皮下又は同所に移植され、好ましくは、前記動物はマウスであり、より好ましくは、前記マウスは、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、ＮＣＧマウス、ＮＳＧマウス、及びＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスからなる群から選択される免疫不全マウスであることを特徴とする、動物モデル。
【請求項13】
前記ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブの数は、１～８であることを特徴とする、請求項１２に記載の動物モデル。
【請求項14】
以下のステップを含む免疫調節薬の有効性を迅速にスクリーニングするための方法であって、
（１）被験薬物を請求項１２に記載の動物モデルに投与するステップであって、前記薬物は免疫調節薬であり、前記薬物は固体、半固体又は液体の形態であり、好ましくは、前記薬物は、静脈内注射、強制経口投与、腹腔内注射、又は皮下注射によって投与される；
（２）ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の全細胞生存率又は免疫細胞生存率、並びに腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と細胞表現型を検出するステップであって、好ましくは、前記全細胞生存率又は免疫細胞生存率を検出する方法は、化学発光法であり、前記相対比率と細胞表現型を検出する方法は、フローサイトメトリーである；
（３）ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報を検出するステップであって、好ましくは、前記生物学的情報を検出する方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列である；
ここで、ステップ（２）及び（３）は任意の順序で完了することができ、より好ましくは、前記フローサイトメトリーは、７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２７０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＰＤＬ１、ＰＤ１、ＣＤ６８及びＣＤ２５の細胞発現を測定することを特徴とする、方法。
（１）被験薬物を請求項１２に記載の動物モデルに投与するステップであって、前記薬物は免疫調節薬であり、前記薬物は固体、半固体又は液体の形態であり、好ましくは、前記薬物は、静脈内注射、強制経口投与、腹腔内注射、又は皮下注射によって投与される；
（２）ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の全細胞生存率又は免疫細胞生存率、並びに腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と細胞表現型を検出するステップであって、好ましくは、前記全細胞生存率又は免疫細胞生存率を検出する方法は、化学発光法であり、前記相対比率と細胞表現型を検出する方法は、フローサイトメトリーである；
（３）ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報を検出するステップであって、好ましくは、前記生物学的情報を検出する方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列である；
ここで、ステップ（２）及び（３）は任意の順序で完了することができ、より好ましくは、前記フローサイトメトリーは、７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２７０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＰＤＬ１、ＰＤ１、ＣＤ６８及びＣＤ２５の細胞発現を測定することを特徴とする、方法。
【請求項15】
免疫調節薬の有効性を迅速にスクリーニングするための動物モデルの製造における、請求項１に記載のポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブの使用であって、
好ましくは、前記動物は免疫不全マウスであり、
より好ましくは、複数の患者のポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブは同時に移植され、各ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブは、異なる患者に由来する細胞を含むことを特徴とする、使用。
好ましくは、前記動物は免疫不全マウスであり、
より好ましくは、複数の患者のポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブは同時に移植され、各ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）カプセルチューブは、異なる患者に由来する細胞を含むことを特徴とする、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学の分野に関し、特に免疫調節薬の有効性を迅速にスクリーニングするためのモデル及び方法、ならびに前記モデルの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、免疫標的及び調節機能を有する多数の薬物が開発され、多くの臨床疾患の治療に使用されている。ここで、ＣＴＬＡ４抗体（イピルムマブ）及びＰＤ１抗体（キイトルーダ、オプジーボ）は、黒色腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、及び頭頸部扁平上皮がんなどの腫瘍の治療に進歩的に使用されている。ＴＮＦα抗体アダリムマブは、関節リウマチや活動性大腸炎などの治療に使用されている。最新のＩＬ１２／ＩＬ２３ｐ４０抗体ウステキヌマブは、乾癬、炎症性大腸炎、及び全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患の治療に使用されている。しかし、すべての患者がこれらの免疫調節薬に対して良好な反応を示すわけではなく、同時に、臨床診断及び治療の特性は、治療計画の時間制限及び指導性に非常に厳しいものであり、例えば、古典的なヒト化マウスＰＤＸ実験又は免疫性疾患のモデリングと投与は、２～５ヶ月かかるだけでなく、臨床患者の多様なニーズ（複数の免疫薬の選択）を満たすことができず、新薬開発のプロセスも遅らせる。そのため、患者に対する正確な治療、また異なる集団における薬物のバイオマーカーの同定を可能にする迅速かつ効果的な機能的なスクリーニング方法が急務となっている。
【0003】
しかし、現在の技術的解決策はすべて、化学療法薬に対するｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の薬物感受性スクリーニングを行い、すべての実験研究対象は腫瘍細胞であり、テストされる薬物は主に化学療法薬又は腫瘍標的薬（ＵＳ００５６７６９２４Ａ、１９９７；ＵＳ００５６９８４１３Ａ、１９９７；ＣＮ１０８３５１３４８Ａ、２０１７）であり、免疫系標的又は調節薬の有効性の迅速なスクリーニングを満たすことができない。
【発明の概要】
【0004】
本発明が解決しようとする課題は、免疫系標的又は調節薬の有効性のスクリーニングに時間がかかり、患者に対する正確な治療を満たすことができないという問題を克服するために、免疫調節薬の有効性をスクリーニングするためのモデル及び方法を提供することである。本発明は、従来の免疫薬の有効性のスクリーニングと比較して、免疫薬の有効性のスクリーニングの時間を大幅に短縮することができ、免疫薬の反応性のために適切なバイオマーカーをスクリーニングし、これにより臨床患者に対する正確な治療を実現することができる。
【0005】
既存の化学療法薬や腫瘍標的薬の薬物感受性スクリーニングに使用される実験研究対象は、免疫細胞を含まない、又はほとんどの免疫細胞が除去される腫瘍細胞であり、免疫細胞を標的とする薬物又は免疫系を調節する薬物に対するスクリーニング方法がない。本発明は多数の実験を通じて、動物モデルにおける模擬免疫系を調節することにより、腫瘍、炎症、及び感染などに対する免疫薬の効果及びメカニズムを検出し、且つ免疫薬の反応性のために適切なバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ）をスクリーニングし、それによって免疫系標的又は調節薬の有効性の迅速なスクリーニングを達成する新しい動物モデルを開発した。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】「ＩＯ－ＦＩＶＥ（Ｉｍｍｕｎｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｆａｓｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｅｓｔ）技術による免疫薬の迅速なスクリーニング方法」の模式図である。腫瘍免疫を例にすると、患者の腫瘍組織を採取し、加工処理して腫瘍細胞及び自己免疫細胞を所定の比率で混合し（推奨１．５：１～１５：１）、ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅチューブを密封し、免疫不全マウスに皮下又は同所に接種して薬物を投与し、５～１４日後、ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅを取り出し、全細胞活性の検出、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による細胞サブグループの比率及び表現型の同定を行い、薬物投与の前後のさまざまなオミクス（例えば、トランスクリプトーム）分析を行う。自己免疫疾患の場合、患者の炎症組織（例えば、リンパ節）と末梢血から免疫細胞を採取し、ＦＡＣＳによる細胞表現型の同定を行い、チューブを密封し、ｉｎ ｖｉｖｏで接種と投与し、５～１４日後、ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅを取り出し、免疫細胞活性の検出、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による細胞サブグループの比率及び表現型の同定を行い、薬物投与の前後のさまざまなオミクス（トランスクリプトームなど）分析を行う。
【図2】（実施例１）一例の卵巣がん患者に対する０日目のフローサイトメトリーによる腫瘍組織の単一細胞懸濁液（ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅカプセルチューブ）の表現型検出を示す。
【図3】（実施例１）卵巣がん患者に対する１０日目のＣＴＧ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ）化学発光法によるカプセルチューブ内の全細胞（腫瘍細胞及び免疫細胞を含む）の生存率の検出を示す。
【図4】（実施例１）卵巣がん患者に対する１０日目のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるカプセルチューブ内の腫瘍組織の単一細胞懸濁液の表現型検出と分析を示す。
【図5】（実施例２）一例の卵巣がん患者に対する０日目のフローサイトメトリーによる腫瘍組織の単一細胞懸濁液（ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅカプセルチューブ）の表現型検出を示す。
【図6】（実施例２）卵巣がん患者に対する１０日目のＣＴＧ法によるカプセルチューブ内の全細胞（腫瘍細胞及び免疫細胞を含む）の生存率の検出を示す。
【図7】（実施例２）卵巣がん患者に対する１０日目のＦＡＣＳによるミニカプセルチューブ内の腫瘍組織（腫瘍細胞及び免疫細胞）の表現型検出を示す。
【図8】（実施例３）一例の卵巣がん患者に対する０日目のフローサイトメトリーによる腫瘍組織の単一細胞懸濁液の異なるタイプ（精製前、腫瘍細胞精製後、免疫細胞精製後、腫瘍サンプルへの免疫細胞添加後）の表現型検出を示す。
【図9】（実施例３）卵巣がん患者に対する１０日目のＣＴＧ法による（腫瘍組織精製前、腫瘍サンプルへの免疫細胞添加後）カプセルチューブ内の全細胞（腫瘍細胞及び免疫細胞を含む）の生存率の検出を示す。
【図10】（実施例３）卵巣がん患者に対する１０日目のＦＡＣＳによる各ミニカプセルチューブ内の腫瘍組織（腫瘍細胞及び免疫細胞）の表現型検出を示す。
【図11】（実施例４）一例の肺がん患者に対する０日目のフローサイトメトリーによる腫瘍組織の単一細胞懸濁液（ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅカプセルチューブ）の表現型検出を示す。
【図12】（実施例４）肺がん患者に対する１４日目のＣＴＧ法によるカプセルチューブ内の全細胞（腫瘍細胞及び免疫細胞を含む）の生存率の検出を示す。
【図13】（実施例４）肺がん患者に対する１４日目のＦＡＣＳによるミニカプセルチューブ内の腫瘍組織（腫瘍細胞及び免疫細胞）の表現型検出を示す。
【図14】（実施例５）二つ例のＡＭＬ患者に対する０日目のフローサイトメトリーによる腫瘍組織（末梢血）の単一細胞懸濁液（ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅカプセルチューブ）の表現型検出を示す。
【図15】（実施例５）二つ例のＡＭＬ患者に対する１４日目のＣＴＧ法によるカプセルチューブ内の全細胞（腫瘍細胞及び免疫細胞を含む）の生存率の検出を示す。
【図16】（実施例５）ａ．一例のＡＭＬ患者免疫反応型１２４＃に対する１４日目のＦＡＣＳによるミニカプセルチューブ内の腫瘍組織（腫瘍細胞及び免疫細胞）の表現型検出を示す。ｂ．二つ例のＡＭＬ患者、１２４＃（免疫反応型）及び１２３＃（免疫非反応型）患者に対する１４日目のＦＡＣＳによる生細胞におけるＣＤ８＋Ｔの比率の分析を示す。
【図17】（実施例５）ａ．ヒートマップは、二つ例のＡＭＬ患者の０日目のトランスクリプトーム差次的遺伝子シグナル伝達経路を示す。ｂ．二つ例のＡＭＬ患者の差次的遺伝子発現ｃｌｕｓｔｅｒにおける腫瘍増殖レベル、血管新生レベル、好中球活性レベル、及びエフェクター（Ｔ）細胞レベルのバイオマーカーの比較分析を示す。
【図18】（実施例５）二つ例のＡＭＬ患者に対する差次的遺伝子における重要な膜タンパク質分子の発現差異の分析を示す。
【図19】（実施例５）二つ例のＡＭＬ患者に対するゲノムＣＮＶと突然変異などの分析を示す。
【図20】（実施例６）三つ例のＡＭＬ患者に対する０日目のフローサイトメトリーによる腫瘍組織（末梢血、骨髄と組み合わせた末梢血）の単一細胞懸濁液（ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅカプセルチューブ）の表現型検出を示す。
【図21】（実施例６）三つ例のＡＭＬ患者に対する１４日目のＣＴＧ法によるカプセルチューブ内の全細胞（腫瘍細胞及び免疫細胞を含む）の生存率の検出を示す。
【図22】（実施例６）三つ例の患者に対する１４日目のＦＡＣＳによるミニカプセルチューブ内の腫瘍組織（腫瘍細胞及び免疫細胞）の表現型検出を示す。
【図23】（実施例７）一例のＡＭＬ患者に対する０日目のフローサイトメトリーによる腫瘍組織（骨髄と組み合わせた末梢血）の単一細胞懸濁液（ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅカプセルチューブ）の表現型検出を示す。
【図24】（実施例７）一例のＡＭＬ患者に対する１４日目のＣＴＧ法によるカプセルチューブ内の全細胞（腫瘍細胞及び免疫細胞を含む）の生存率の検出を示す。
【図25】（実施例７）一例の患者に対する１４日目のＦＡＣＳによるミニカプセルチューブ内の腫瘍組織（腫瘍細胞及び免疫細胞）の比率を示す。
【図26】（実施例８）二つ例のＡＭＬ患者に対する０日目のフローサイトメトリーによる腫瘍組織（骨髄）の単一細胞懸濁液（ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅカプセルチューブ）の表現 型検出を示す。
【図27】二つ例の患者を同じマウスに接種した実験（２人の患者と１匹のマウス）、及び古典的な一例の患者を１匹のマウスに接種した実験（１人の患者と１匹のマウス）を含む、（実施例８）二つ例のＡＭＬ患者に対する１０日目のＣＴＧ法によるカプセルチューブ内の全細胞（腫瘍細胞及び免疫細胞を含む）の生存率の検出を示す。
【図28】（実施例８）二つ例の患者に対する１０日目のＦＡＣＳによるミニカプセルチューブ内の腫瘍組織（腫瘍細胞及び免疫細胞）の比率を示す。
【発明を実施するための形態】
【0007】
本発明は、以下の技術的解決手段を通じて上記技術的問題を解決する。
【0008】
本発明の第１の態様は、前記細胞は、単一細胞懸濁液化の腫瘍細胞及び免疫細胞を含み、ここで、
前記腫瘍細胞及び免疫細胞は、臨床患者の新鮮な腫瘍組織又は体液に由来する、細胞を収容するＰＶＤＦカプセルチューブを提供する。
前記腫瘍細胞及び免疫細胞は、臨床患者の新鮮な腫瘍組織又は体液に由来する、細胞を収容するＰＶＤＦカプセルチューブを提供する。
【0009】
本発明のいくつかの実施形態において、前記腫瘍組織は、臨床的に外科的に切除された腫瘍組織又は生検された腫瘍組織を含む。
【0010】
本発明のいくつかの実施形態において、前記体液は、血液、骨髄、胸水と腹水、及び脳脊髄液のうちの一つ又は複数を含む。
【0011】
本発明のいくつかの実施形態において、前記カプセルチューブの平均タンパク質透過性は３００～１０００Ｋｄａであり、好ましくは５００～７００Ｋｄａである。
【0012】
本発明のいくつかの実施形態において、前記カプセルチューブは、使用前に活性化、超純水洗浄及び高圧滅菌によって処理される必要があり、活性化方法は、好ましくは無水エタノールである。
【0013】
本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、単一細胞懸濁液を分取することによって濃縮された自己免疫細胞であり、前記腫瘍細胞は、単一細胞懸濁液を分取するときに通過する腫瘍細胞であり、ここで、
前記単一細胞懸濁液は、患者の固形腫瘍組織中の腫瘍浸潤リンパ球、及び／又は、前記患者の末梢血中の末梢血単核細胞に由来する。
前記単一細胞懸濁液は、患者の固形腫瘍組織中の腫瘍浸潤リンパ球、及び／又は、前記患者の末梢血中の末梢血単核細胞に由来する。
【0014】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記分取に使用される分取機器は、
（１）好ましくは、Ａｎｔｉ－ＣＤ４５ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ｈｕｍａｎ、及び／又は、Ａｎｔｉ－Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ｈｕｍａｎである、分取磁気ビーズ；
（２）好ましくは、ＬＳカラムである、分取装置；を含む。
（１）好ましくは、Ａｎｔｉ－ＣＤ４５ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ｈｕｍａｎ、及び／又は、Ａｎｔｉ－Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ｈｕｍａｎである、分取磁気ビーズ；
（２）好ましくは、ＬＳカラムである、分取装置；を含む。
【0015】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記細胞懸濁液は、
（１）腫瘍サンプル中の非腫瘍組織及び壊死組織を除去し、腫瘍サンプルを１～２ｍｍのサイズの組織ブロックに切断し、１％ＰＳＢを含むＨＢＳＳ緩衝液で洗浄及び遠心分離し、腫瘍組織ブロックを回収するステップ；
（２）コラゲナーゼで消化し、血清を含む培地で消化を終了し、細胞懸濁液を回収する；遠心分離により上清を除去し、細胞沈殿物を回収するステップ；
（３）３～５倍容量の赤血球溶解液で溶解させ、遠心分離により上清を除去し、細胞沈殿物を回収し、赤血球溶解を２回繰り返す；前記赤血球溶解液が１３９．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１６．９６ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．２を含むステップ；
（４）細胞沈殿物を１％ＦＢＳを含むＰＢＳで再懸濁し、遠心分離により上清を除去し、細胞沈殿物を回収し、細胞濃度を調整するステップ；によって製造される。
（１）腫瘍サンプル中の非腫瘍組織及び壊死組織を除去し、腫瘍サンプルを１～２ｍｍのサイズの組織ブロックに切断し、１％ＰＳＢを含むＨＢＳＳ緩衝液で洗浄及び遠心分離し、腫瘍組織ブロックを回収するステップ；
（２）コラゲナーゼで消化し、血清を含む培地で消化を終了し、細胞懸濁液を回収する；遠心分離により上清を除去し、細胞沈殿物を回収するステップ；
（３）３～５倍容量の赤血球溶解液で溶解させ、遠心分離により上清を除去し、細胞沈殿物を回収し、赤血球溶解を２回繰り返す；前記赤血球溶解液が１３９．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１６．９６ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．２を含むステップ；
（４）細胞沈殿物を１％ＦＢＳを含むＰＢＳで再懸濁し、遠心分離により上清を除去し、細胞沈殿物を回収し、細胞濃度を調整するステップ；によって製造される。
【0016】
本発明のいくつかの実施形態において、前記腫瘍細胞及び免疫細胞の比率範囲は、１．５：１～１５：１であり、好ましくは１．５：１～９：１である。
【0017】
本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、０．５％以上であり、好ましくは０．５％～１５％であり、及び／又は、前記免疫細胞の生存率は＞２０％である。
【0018】
本発明の第２の態様は、好ましくは皮下又は同所に前記カプセルチューブを含む動物モデルを提供する。
【0019】
本発明のいくつかの実施形態において、前記動物はマウスである。
【0020】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記マウスは免疫不全マウスであり、例えば、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、ＮＣＧマウス、ＮＳＧマウス又はＮｏｄ－ｓｃｉｄマウスである。
【0021】
本発明のいくつかの実施形態において、前記カプセルチューブの数は、１～８個である。
【0022】
本発明の第３の態様は、以下を含む免疫調節薬の有効性を迅速にスクリーニングするための方法を提供する：
（１）前記マウスモデルに被験薬物を投与するステップ、ここで、
前記被験薬物は、免疫調節薬であり、固体、半固体及び液体のうちの一つ又は複数を含み、
前記被験薬物の投与方法は、静脈内注射、経口投与、腹腔内注射及び皮下注射のうちの一つ又は複数を含む。
（２）カプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の全細胞活性又は免疫細胞活性、腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と細胞表現型を検出するステップ、ここで、
前記全細胞活性又は免疫細胞活性の検出は、好ましくはＣＴＧ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ）化学発光法であり、
前記相対比率と細胞表現型の検出は、好ましくはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）である。
（３）カプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報を検出するステップ、ここで、
前記生物学的情報の検出は、好ましくは、ＤＮＡ－ｓｅｑ、及び／又は、ＲＮＡ－ｓｅｑである。
（１）前記マウスモデルに被験薬物を投与するステップ、ここで、
前記被験薬物は、免疫調節薬であり、固体、半固体及び液体のうちの一つ又は複数を含み、
前記被験薬物の投与方法は、静脈内注射、経口投与、腹腔内注射及び皮下注射のうちの一つ又は複数を含む。
（２）カプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の全細胞活性又は免疫細胞活性、腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と細胞表現型を検出するステップ、ここで、
前記全細胞活性又は免疫細胞活性の検出は、好ましくはＣＴＧ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ）化学発光法であり、
前記相対比率と細胞表現型の検出は、好ましくはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）である。
（３）カプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報を検出するステップ、ここで、
前記生物学的情報の検出は、好ましくは、ＤＮＡ－ｓｅｑ、及び／又は、ＲＮＡ－ｓｅｑである。
【0023】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、ステップ（２）及び（３）は任意の順序である。
【0024】
好ましくは、ステップ（２）において、前記ＦＡＣＳは、
７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２７０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＰＤＬ１、ＰＤ１、ＣＤ６８及びＣＤ２５のうちの一つ又は複数を含む、抗体標識工程；
前記ＦＡＣＳは、前記抗体標識が完了した後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳを添加した後に検出される、フローサイトメトリー検出工程；
好ましくはＦｌｏｗｊｏである、ソフトウェアによるデータ分析工程；のうちの一つ又は複数を含む。
７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２７０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＰＤＬ１、ＰＤ１、ＣＤ６８及びＣＤ２５のうちの一つ又は複数を含む、抗体標識工程；
前記ＦＡＣＳは、前記抗体標識が完了した後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳを添加した後に検出される、フローサイトメトリー検出工程；
好ましくはＦｌｏｗｊｏである、ソフトウェアによるデータ分析工程；のうちの一つ又は複数を含む。
【0025】
本発明の第４の態様は、免疫調節薬の有効性を迅速にスクリーニングするための動物モデルの製造における、第１の態様に記載のカプセルチューブの使用を提供する。
【0026】
本発明のいくつかの実施形態において、前記動物モデルは、好ましくは、免疫不全マウスである。
【0027】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記動物モデルは、１～８人の患者、好ましくは１～４人の患者に対して同時に薬物スクリーニングを行うことができる。
【0028】
本技術分野の常識に違反しない限り、前記各好ましい条件は、任意に組み合わせて、本発明の各好ましい実施例を得ることができる。
【0029】
本発明で使用される試薬及び原料はいずれも市販品として入手できる。
【0030】
本発明の正の進歩性効果は、以下のとおりである。
【0031】
本発明は、カプセルチューブを含む動物モデルを構築することにより、免疫系標的と調節薬のスクリーニングを行う。本発明によって提供されるモデル及び方法は、臨床患者に対する免疫薬の感受性及び有効性についての迅速なスクリーニング方法を提供し、ｉｎ ｖｉｖｏでの動物モデルから薬力学的データ、ペアフロー多細胞サブグループの表現型同定データ及びマルチオミクス分析データを取得し、臨床精密医療及び新薬開発のために迅速、効果的かつ機能的及び機序的研究方法を提供する。
【実施例0032】
以下、実施例の形態によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を前記実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法及び条件、或いは商品の説明書に従って選ばれる。
【0033】
実施例１ 一例の卵巣がん患者に対する免疫療法の迅速かつ機能的なスクリーニングと潜在的なバイオマーカーの同定
１．実験動物の準備とサンプルの採取
本実験では、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスをサプライヤー（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）に注文し、ＳＰＦレベルの動物ハウスで飼育し、実験開始前に少なくとも３日間動物を適応性飼育した。
患者からの新鮮な腫瘍サンプルを採取し、抗凝固チューブに入れ、コールドチェーン（２～８℃）で短時間で中央検査室に輸送した。
【0034】
２．細胞の処理
患者の腫瘍サンプル中の非腫瘍組織及び壊死組織を除去し、腫瘍サンプルを１～２ｍｍサイズの組織ブロックに切断し、１％ＰＳＢ（ペニシリン－ストレプトマイシン＋アムホテリシンＢ）を含むＨＢＳＳ緩衝液で洗浄及び遠心分離し、腫瘍組織ブロックを回収した。１×コラゲナーゼで３７℃で１～２時間消化した。前記分取方法は以下の通りである：
血清を含む培地（ＲＰＭＩ１６４０、Ｇｉｂｃｏから購入）で消化を終了し、細胞懸濁液を７０μＭのフィルターで回収した。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞沈殿物を回収した。３～５倍の赤血球溶解液（１３９．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１６．９６ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌでｐＨ ７．２に調整した）を使用して４℃で５分間溶解させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞沈殿物を回収し、赤血球溶解を２回繰り返した。細胞沈殿物を１％ＦＢＳを含むＰＢＳで再懸濁し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞沈殿物を回収し、細胞濃度を１×１０８個／ｍｌに調整した。
患者の腫瘍サンプル中の非腫瘍組織及び壊死組織を除去し、腫瘍サンプルを１～２ｍｍサイズの組織ブロックに切断し、１％ＰＳＢ（ペニシリン－ストレプトマイシン＋アムホテリシンＢ）を含むＨＢＳＳ緩衝液で洗浄及び遠心分離し、腫瘍組織ブロックを回収した。１×コラゲナーゼで３７℃で１～２時間消化した。前記分取方法は以下の通りである：
血清を含む培地（ＲＰＭＩ１６４０、Ｇｉｂｃｏから購入）で消化を終了し、細胞懸濁液を７０μＭのフィルターで回収した。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞沈殿物を回収した。３～５倍の赤血球溶解液（１３９．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１６．９６ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌでｐＨ ７．２に調整した）を使用して４℃で５分間溶解させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞沈殿物を回収し、赤血球溶解を２回繰り返した。細胞沈殿物を１％ＦＢＳを含むＰＢＳで再懸濁し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞沈殿物を回収し、細胞濃度を１×１０８個／ｍｌに調整した。
【0035】
２０μｌ／１０７細胞の濃度でＡｎｔｉ－ＣＤ４５ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ｈｕｍａｎを添加するか、又はＡｎｔｉ－ＣＤ４５ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ｈｕｍａｎとＡｎｔｉ－Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ｈｕｍａｎを添加し、室温で３０分間インキュベートした。１％ＦＢＳを含むＰＢＳを添加して磁気ビーズをすすぎ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、１％ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞沈殿物を再懸濁した。磁気ビーズを分取装置（ＬＳカラム、Ｍｉｌｔｅｒｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に装填し、１％ＦＢＳを含むＰＢＳでＬＳカラムを２回洗浄し、ＬＳカラムから流下する液体（腫瘍細胞）、及びＬＳカラム中の細胞（濃縮された免疫細胞）をそれぞれ回収した。回収した細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏから購入）で再懸濁し、計数した。
【0036】
一般に、腫瘍組織は、Ａｎｔｉ－ＣＤ４５ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ｈｕｍａｎとＡｎｔｉ－Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ｈｕｍａｎの二つのマイクロビーズを添加して精製する必要があり、腫瘍組織の微小環境から免疫細胞及び間質線維芽細胞を保護することができる。しかし、一部の腫瘍組織内の免疫細胞の浸潤が多すぎ、半分の割合を超える場合、例えば、実体腫瘍の胸水と腹水の転移サンプルには、ＣＤ４５抗体マイクロビーズのみを添加して免疫細胞を濃縮することができる。
【0037】
３．フローサイトメトリー検出とデータ分析
精製前の患者の腫瘍組織サンプルの単一細胞懸濁液、精製後の腫瘍細胞、及び濃縮された免疫細胞（ＣＤ３＋Ｔを含む）をそれぞれ採取し、次に、異なる所定の比率（１．５：１～１５：１）の腫瘍細胞及び免疫細胞の混合懸濁液を調製し、それぞれが約０．１Ｍ～０．３Ｍ（ｍｉｌｌｉｏｎ、百万細胞）であった。実験の目的に応じて各サンプルの懸濁液を複数の部分に分け、対応するフローサイトメトリー抗体混合液を添加し、直接標識などの対照とする補償実験群を設置し、遮光して２～８℃で２５～３０分間インキュベートした。卵巣がんに対する予備ＦＡＣＳパネルは以下の通りである：７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２７０、ＰＤ１、ＣＤ６８又はＣＤ２５などの抗体。
抗体標識が完了した後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳを添加し、４℃で６００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。２５０μｌの２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を含むＰＢＳを加えて細胞沈殿物を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。フローサイトメトリー検出のデータ分析は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって行われた。
精製前の患者の腫瘍組織サンプルの単一細胞懸濁液、精製後の腫瘍細胞、及び濃縮された免疫細胞（ＣＤ３＋Ｔを含む）をそれぞれ採取し、次に、異なる所定の比率（１．５：１～１５：１）の腫瘍細胞及び免疫細胞の混合懸濁液を調製し、それぞれが約０．１Ｍ～０．３Ｍ（ｍｉｌｌｉｏｎ、百万細胞）であった。実験の目的に応じて各サンプルの懸濁液を複数の部分に分け、対応するフローサイトメトリー抗体混合液を添加し、直接標識などの対照とする補償実験群を設置し、遮光して２～８℃で２５～３０分間インキュベートした。卵巣がんに対する予備ＦＡＣＳパネルは以下の通りである：７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２７０、ＰＤ１、ＣＤ６８又はＣＤ２５などの抗体。
抗体標識が完了した後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳを添加し、４℃で６００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。２５０μｌの２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を含むＰＢＳを加えて細胞沈殿物を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。フローサイトメトリー検出のデータ分析は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって行われた。
【0038】
４．セルローディングチューブ
生物学的安全キャビネット、即ち直径１～２ｍｍのＰＶＤＦチューブからカプセル装置を取り出し、平均孔径の透過サイズは約５００ＫＤａ分子量であり、細胞懸濁液を充填する前に、ＰＶＤＦチューブに、無水エタノールによる活性化（又はメタノール等による活性化）、超純水洗浄及び高圧滅菌等の処理を施した。その中の長さ１．５ｃｍのカプセルチューブを取り、細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏから購入）で繰り返し洗浄した。
フローサイトメトリー分析により、同時にＣＤ８＋Ｔ細胞が全生細胞の０．５％以上を占めることを満たすように、ＣＤ４５－腫瘍細胞とＣＤ３＋リンパ球を所定（１．５：１～１５：１）の比率で均一に混合した後にＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。
生物学的安全キャビネット、即ち直径１～２ｍｍのＰＶＤＦチューブからカプセル装置を取り出し、平均孔径の透過サイズは約５００ＫＤａ分子量であり、細胞懸濁液を充填する前に、ＰＶＤＦチューブに、無水エタノールによる活性化（又はメタノール等による活性化）、超純水洗浄及び高圧滅菌等の処理を施した。その中の長さ１．５ｃｍのカプセルチューブを取り、細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏから購入）で繰り返し洗浄した。
フローサイトメトリー分析により、同時にＣＤ８＋Ｔ細胞が全生細胞の０．５％以上を占めることを満たすように、ＣＤ４５－腫瘍細胞とＣＤ３＋リンパ球を所定（１．５：１～１５：１）の比率で均一に混合した後にＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。
【0039】
５．接種と投与
穿刺針を使用して、上記ＰＶＤＦチューブをマウスの皮下にランダムに接種し、創傷を医療用組織接着剤（３Ｍから購入）で接着し、対照群と投与群（例えば、１．パクリタキセル、シスプラチン及びアバスチン／ベバシズマブ；２．ＰＤ１抗体；３．ＰＡＲＰ阻害剤ニラパリブと組み合わせたＰＤ１抗体；４．ニラパリブ）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
穿刺針を使用して、上記ＰＶＤＦチューブをマウスの皮下にランダムに接種し、創傷を医療用組織接着剤（３Ｍから購入）で接着し、対照群と投与群（例えば、１．パクリタキセル、シスプラチン及びアバスチン／ベバシズマブ；２．ＰＤ１抗体；３．ＰＡＲＰ阻害剤ニラパリブと組み合わせたＰＤ１抗体；４．ニラパリブ）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
【0040】
６．細胞生存率と表現型検出
投与３～２１日後（１０日目）にマウスを安楽死させ、ＰＶＤＦチューブを取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ化学発光法を用いて細胞生存率を定量化測定し、ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型をフローサイトメトリーで検出し、またＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報の変化を分子生物学的方法（ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＤＮＡ－ｓｅｑ技術）によって検出した。
投与３～２１日後（１０日目）にマウスを安楽死させ、ＰＶＤＦチューブを取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ化学発光法を用いて細胞生存率を定量化測定し、ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型をフローサイトメトリーで検出し、またＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報の変化を分子生物学的方法（ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＤＮＡ－ｓｅｑ技術）によって検出した。
【0041】
７．データ分析
０日目のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）スクリーニング：初期腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の同定、カプセルチューブ内の混合細胞のフローサイトメトリーデータは、ＣＤ４５－腫瘍細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ免疫細胞＝１．６：１であり、ＣＤ８＋％＝３．１％であり、同時に腫瘍内部のＴリンパ球、特にＣＤ８－活性化細胞がＰＤ１分子を高発現し、ＣＤ８＋ＴもＣＤ２７０とＰＤ１の両方の免疫チェックポイント分子を弱く発現していることを示唆し、図２に示された通りである。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験終点：対照群の細胞の生存率の値（図３に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、被験薬物の有効性の結果を算出した。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の違いをフローサイトメトリーにより検出した（図４に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。１０日目のＣＴＧ及びＦＡＣＳ検出は、ＰＤ１単剤群又はＰＡＲＰ阻害剤との併用投与群にかかわらず、ＰＤ１抗体が、患者の自己免疫細胞を効果的に動員して卵巣がん腫瘍細胞の増殖及び代謝を阻害することができることを示し、ここで、ＰＤ１抗体によるＰＤ１分子の遮断及びダウンレギュレートに伴い、ＣＤ２７０分子（ＨＶＥＭ）は、ＰＤ１単剤群でもＰＡＲＰ阻害剤との併用投与群でも、ある程度アップレギュレートされた。
０日目又は１０日目の臨床サンプル中のＰＶＤＦカプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報の変化を分子生物学的方法（ＤＮＡ－ｓｅｑ、ＲＮＡ－ｓｅｑなどのオミクス技術）によって検出した。
したがって、本発明は、以下の各実施例においても使用される「ＩＯ－ＦＩＶＥ」（Ｉｍｍｕｎｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｆａｓｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｅｓｔ）技術による免疫薬の迅速なスクリーニングのための方法を提供した。
０日目のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）スクリーニング：初期腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の同定、カプセルチューブ内の混合細胞のフローサイトメトリーデータは、ＣＤ４５－腫瘍細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ免疫細胞＝１．６：１であり、ＣＤ８＋％＝３．１％であり、同時に腫瘍内部のＴリンパ球、特にＣＤ８－活性化細胞がＰＤ１分子を高発現し、ＣＤ８＋ＴもＣＤ２７０とＰＤ１の両方の免疫チェックポイント分子を弱く発現していることを示唆し、図２に示された通りである。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験終点：対照群の細胞の生存率の値（図３に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、被験薬物の有効性の結果を算出した。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の違いをフローサイトメトリーにより検出した（図４に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。１０日目のＣＴＧ及びＦＡＣＳ検出は、ＰＤ１単剤群又はＰＡＲＰ阻害剤との併用投与群にかかわらず、ＰＤ１抗体が、患者の自己免疫細胞を効果的に動員して卵巣がん腫瘍細胞の増殖及び代謝を阻害することができることを示し、ここで、ＰＤ１抗体によるＰＤ１分子の遮断及びダウンレギュレートに伴い、ＣＤ２７０分子（ＨＶＥＭ）は、ＰＤ１単剤群でもＰＡＲＰ阻害剤との併用投与群でも、ある程度アップレギュレートされた。
０日目又は１０日目の臨床サンプル中のＰＶＤＦカプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報の変化を分子生物学的方法（ＤＮＡ－ｓｅｑ、ＲＮＡ－ｓｅｑなどのオミクス技術）によって検出した。
したがって、本発明は、以下の各実施例においても使用される「ＩＯ－ＦＩＶＥ」（Ｉｍｍｕｎｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｆａｓｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｅｓｔ）技術による免疫薬の迅速なスクリーニングのための方法を提供した。
【0042】
実施例２ 一例の卵巣がん患者に対する免疫療法の迅速かつ機能的なスクリーニングと潜在的なバイオマーカーの同定
１．実験動物の準備、サンプルの採取、細胞の処理、フローサイトメトリー検出とデータ分析の方法、及びセルローディングチューブの要件は、実施例１と同じである。
１．実験動物の準備、サンプルの採取、細胞の処理、フローサイトメトリー検出とデータ分析の方法、及びセルローディングチューブの要件は、実施例１と同じである。
【0043】
２．接種と投与
穿刺針を使用して、上記ＰＶＤＦチューブをマウスの皮下にランダムに接種し、創傷を医療用組織接着剤（３Ｍから購入）で接着し、対照群と投与群（例えば、１．パクリタキセル、シスプラチン及びベバシズマブ併用療法；２．ＰＤ１抗体；３．ベバシズマブと組み合わせたＰＤ１抗体；４．シスプラチンと組み合わせたＰＤ１抗体）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
穿刺針を使用して、上記ＰＶＤＦチューブをマウスの皮下にランダムに接種し、創傷を医療用組織接着剤（３Ｍから購入）で接着し、対照群と投与群（例えば、１．パクリタキセル、シスプラチン及びベバシズマブ併用療法；２．ＰＤ１抗体；３．ベバシズマブと組み合わせたＰＤ１抗体；４．シスプラチンと組み合わせたＰＤ１抗体）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
【0044】
３．細胞生存率と表現型検出
投与３～２１日後（１０日目）にマウスを安楽死させ、ＰＶＤＦチューブを取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ化学発光法を用いて細胞生存率を定量化測定し、ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と基本的な表現型をフローサイトメトリーで検出した。
投与３～２１日後（１０日目）にマウスを安楽死させ、ＰＶＤＦチューブを取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ化学発光法を用いて細胞生存率を定量化測定し、ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と基本的な表現型をフローサイトメトリーで検出した。
【0045】
４．データ分析
０日目のフローサイトメトリーＦＡＣＳスクリーニング：初期腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型同定、カプセルチューブ内の混合細胞のフローサイトメトリーデータは、ＣＤ４５－腫瘍細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ免疫細胞が約２．９１：１であり、生細胞中のＣＤ８＋％が０．８１％であることを示唆した。腫瘍内部の浸潤Ｔリンパ球はＰＤ１分子を弱く発現しているが、有意にＣＤ２７０を高発現している（図５に示す）。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：対照群の細胞の生存率の値（図６に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の違いをフローサイトメトリーにより検出した（図７に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析と統計された。
図６及び図７の実験結果に基づき、パクリタキセル、シスプラチン及びベバシズマブ併用薬物群を除いて、１０日目のカプセルチューブ内の生細胞のＣＤ４５－腫瘍細胞は少なくとも半分を占めた。対照群と比較して、ＰＤ１単剤群、或いは標的薬ベバシズマブとの併用群又は化学薬品シスプラチンとの併用群は、腫瘍組織の全体的な生存率（腫瘍細胞及び免疫細胞を含む）を有意に阻害することができ、また腫瘍の進行とともに、ＣＤ２７０＋ＰＤ１＋ダブルポジティブＴＩＬは、ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅに富み、ＰＤ１単剤群においてダウンレギュレーションの傾向を示した。実施例１のフローサイトメトリーデータタイピングと組み合わせると、ＣＤ２７０分子が固形腫瘍において効果的に発現し、免疫チェックポイント阻害剤ＰＤ１抗体治療のための積極的なバイオマーカーである可能性が高く、初期ＰＤ１発現が弱くＣＤ２７０発現が有意な患者であっても、依然として免疫療法に良好な反応を有することを明らかにした。
０日目又は１０日目の臨床サンプル中のＰＶＤＦカプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報の変化を分子生物学的方法（ＤＮＡ－ｓｅｑ、ＲＮＡ－ｓｅｑなどのオミクス技術）によって検出した。
０日目のフローサイトメトリーＦＡＣＳスクリーニング：初期腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型同定、カプセルチューブ内の混合細胞のフローサイトメトリーデータは、ＣＤ４５－腫瘍細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ免疫細胞が約２．９１：１であり、生細胞中のＣＤ８＋％が０．８１％であることを示唆した。腫瘍内部の浸潤Ｔリンパ球はＰＤ１分子を弱く発現しているが、有意にＣＤ２７０を高発現している（図５に示す）。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：対照群の細胞の生存率の値（図６に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の違いをフローサイトメトリーにより検出した（図７に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析と統計された。
図６及び図７の実験結果に基づき、パクリタキセル、シスプラチン及びベバシズマブ併用薬物群を除いて、１０日目のカプセルチューブ内の生細胞のＣＤ４５－腫瘍細胞は少なくとも半分を占めた。対照群と比較して、ＰＤ１単剤群、或いは標的薬ベバシズマブとの併用群又は化学薬品シスプラチンとの併用群は、腫瘍組織の全体的な生存率（腫瘍細胞及び免疫細胞を含む）を有意に阻害することができ、また腫瘍の進行とともに、ＣＤ２７０＋ＰＤ１＋ダブルポジティブＴＩＬは、ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅに富み、ＰＤ１単剤群においてダウンレギュレーションの傾向を示した。実施例１のフローサイトメトリーデータタイピングと組み合わせると、ＣＤ２７０分子が固形腫瘍において効果的に発現し、免疫チェックポイント阻害剤ＰＤ１抗体治療のための積極的なバイオマーカーである可能性が高く、初期ＰＤ１発現が弱くＣＤ２７０発現が有意な患者であっても、依然として免疫療法に良好な反応を有することを明らかにした。
０日目又は１０日目の臨床サンプル中のＰＶＤＦカプセルチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報の変化を分子生物学的方法（ＤＮＡ－ｓｅｑ、ＲＮＡ－ｓｅｑなどのオミクス技術）によって検出した。
【0046】
実施例３ 一例の卵巣がん患者に対する免疫療法の迅速かつ機能的なスクリーニング
１．実験動物、サンプルの採取、細胞の処理は、実施例１と同じである。
１．実験動物、サンプルの採取、細胞の処理は、実施例１と同じである。
【0047】
２．フローサイトメトリー検出とデータ分析
ＱＣ同定：精製前の患者の腫瘍組織サンプルの単一細胞懸濁液、精製後の腫瘍細胞、カラムから溶出した濃縮された免疫細胞（ＣＤ３＋Ｔを含む）をそれぞれ採取し、精製後の腫瘍細胞及び免疫細胞を所定の比率（１．５：１～１５：１）で混合した細胞懸濁液を調製し（カラムから溶出した免疫細胞の生存率が２０％未満の場合、下流の実験や操作を行うことができず、特に活性化免疫細胞が活性化誘導性アポトーシスを起こしやすいことに注意されたい）、それぞれが約０．１Ｍ～０．３Ｍであった。実験の目的に応じて各サンプルの懸濁液を複数の部分に分け、対応するフローサイトメトリー抗体混合液を添加し、直接標識などの対照とする補償実験群を設置し、遮光して２～８℃で２５～３０分間インキュベートした。卵巣がんに対する予備ＦＡＣＳパネルは以下の通りである：７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２７０、ＰＤ１、ＣＤ６８又はＣＤ２５などの抗体。
抗体標識が完了した後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳを添加し、４℃で６００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。２５０μｌの２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を含むＰＢＳを加えて細胞沈殿物を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。フローサイトメトリー検出のデータ分析は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって行われた。
ＱＣ同定：精製前の患者の腫瘍組織サンプルの単一細胞懸濁液、精製後の腫瘍細胞、カラムから溶出した濃縮された免疫細胞（ＣＤ３＋Ｔを含む）をそれぞれ採取し、精製後の腫瘍細胞及び免疫細胞を所定の比率（１．５：１～１５：１）で混合した細胞懸濁液を調製し（カラムから溶出した免疫細胞の生存率が２０％未満の場合、下流の実験や操作を行うことができず、特に活性化免疫細胞が活性化誘導性アポトーシスを起こしやすいことに注意されたい）、それぞれが約０．１Ｍ～０．３Ｍであった。実験の目的に応じて各サンプルの懸濁液を複数の部分に分け、対応するフローサイトメトリー抗体混合液を添加し、直接標識などの対照とする補償実験群を設置し、遮光して２～８℃で２５～３０分間インキュベートした。卵巣がんに対する予備ＦＡＣＳパネルは以下の通りである：７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２７０、ＰＤ１、ＣＤ６８又はＣＤ２５などの抗体。
抗体標識が完了した後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳを添加し、４℃で６００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。２５０μｌの２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を含むＰＢＳを加えて細胞沈殿物を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。フローサイトメトリー検出のデータ分析は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって行われた。
【0048】
３．セルローディングチューブ
基本的な操作ステップは、実施例１と同じである。
フローサイトメトリーステップで分析されたデータにより、同時にＣＤ８＋Ｔ細胞が全生細胞の０．５％以上を占めることを満たすように、ＣＤ４５－腫瘍細胞とＣＤ３＋Ｔ細胞を所定（１．５：１～１５：１）の比率で均一に混合した後にＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。この実施例では、精製前の腫瘍サンプルについても封管と実験を行った。
基本的な操作ステップは、実施例１と同じである。
フローサイトメトリーステップで分析されたデータにより、同時にＣＤ８＋Ｔ細胞が全生細胞の０．５％以上を占めることを満たすように、ＣＤ４５－腫瘍細胞とＣＤ３＋Ｔ細胞を所定（１．５：１～１５：１）の比率で均一に混合した後にＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。この実施例では、精製前の腫瘍サンプルについても封管と実験を行った。
【0049】
４．接種と投与
穿刺針を使用して、上記ＰＶＤＦチューブをマウスの皮下にランダムに接種し、創傷を医療用組織接着剤（３Ｍから購入）で接着し、対照群と投与群（例えば、１．パクリタキセル、シスプラチン及びベバシズマブ併用療法；２．ＰＤ１抗体；３．ＰＡＲＰ阻害剤ニラパリブと組み合わせたＰＤ１抗体；４．ＰＡＲＰ阻害剤ニラパリブ）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
穿刺針を使用して、上記ＰＶＤＦチューブをマウスの皮下にランダムに接種し、創傷を医療用組織接着剤（３Ｍから購入）で接着し、対照群と投与群（例えば、１．パクリタキセル、シスプラチン及びベバシズマブ併用療法；２．ＰＤ１抗体；３．ＰＡＲＰ阻害剤ニラパリブと組み合わせたＰＤ１抗体；４．ＰＡＲＰ阻害剤ニラパリブ）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
【0050】
５．細胞生存率と表現型検出
投与３～２１日後（１０日目）にマウスを安楽死させ、ＰＶＤＦチューブを取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ化学発光法を用いて細胞生存率を定量化測定し、ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と基本的な表現型をフローサイトメトリーで検出した。
投与３～２１日後（１０日目）にマウスを安楽死させ、ＰＶＤＦチューブを取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ化学発光法を用いて細胞生存率を定量化測定し、ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と基本的な表現型をフローサイトメトリーで検出した。
【0051】
６．データ分析
０日目のフローサイトメトリーＦＡＣＳスクリーニング：初期腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型同定により、（１）精製前の腫瘍組織において、腫瘍細胞ＣＤ４５－及びＣＤ３＋Ｔ細胞の比（Ｃ／Ｔ）＝０．３であり、ＣＤ８＋Ｔ％＝１１．５である、即ち、当該患者の腫瘍サンプルにはＴＩＬに富んでいた。（２）精製後の腫瘍組織細胞は免疫細胞を２．８４％しか含まず、そのＣ／Ｔ値＝４９．１であり、ＣＤ８＋％＝０．４４８％であった。（３）精製後の免疫細胞集団の総生存率は約４３％であり、精製前の基本的な細胞表現型を保持していた。（４）免疫細胞添加後の腫瘍組織サンプルのＣ／Ｔ値は８であり、ＣＤ８＋％＝２．４５％であった。腫瘍内部の浸潤Ｔリンパ球は、ＣＤ２７０分子を弱く発現し、ＰＤ１分子を高発現し、ＰＤ１抗体に対してより良い反応がある可能性を示した（図８に示す）。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：対照群の細胞の生存率の値（図９に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の違いをフローサイトメトリーにより検出した（図１０に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析と統計された。
図９及び図１０の実験結果に基づき、１０日目のｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅにおいて、精製前の腫瘍組織サンプル又は自己ＴＩＬを添加した腫瘍サンプルにかかわらず、ＣＤ４５－の腫瘍細胞が優勢であり、ＣＤ４５－細胞は約ＣＤ４５＋細胞の２～３倍であった（図１０）。精製前の腫瘍組織サンプルのＣＴＧデータは、臨床第一選択薬を含む治療が当該組織サンプルの全細胞の生存率を有意に低下させないことを示した。しかし、自己ＴＩＬ細胞を添加した後の腫瘍サンプルでは、臨床第一選択薬の組み合わせが当該サンプルの全体の細胞生存率を弱く低下させることができ、単剤のＰＤ１抗体もＰＡＲＰ阻害剤も腫瘍組織全体の生存率を阻害することはできないが、ＰＤ１抗体とＰＡＲＰ阻害剤との併用投与は、腫瘍組織全体の増殖と活性を有意に阻害することができる（図９）。興味深いことに、ＰＤ１抗体とＰＡＲＰ阻害剤との併用投与は、ＣＤ２７０＋ＰＤ１－Ｔ細胞サブグループの比率を有意に増加させ、ＰＤ１＋ＣＤ２７０－、ＰＤ１－ＣＤ２７０－のＴ細胞の比率を相対的に減少させることができ（図１０）、ＣＤ２７０分子がＰＤ１抗体治療の潜在的な指標バイオマーカーである可能性があることを再び示した。
０日目のフローサイトメトリーＦＡＣＳスクリーニング：初期腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型同定により、（１）精製前の腫瘍組織において、腫瘍細胞ＣＤ４５－及びＣＤ３＋Ｔ細胞の比（Ｃ／Ｔ）＝０．３であり、ＣＤ８＋Ｔ％＝１１．５である、即ち、当該患者の腫瘍サンプルにはＴＩＬに富んでいた。（２）精製後の腫瘍組織細胞は免疫細胞を２．８４％しか含まず、そのＣ／Ｔ値＝４９．１であり、ＣＤ８＋％＝０．４４８％であった。（３）精製後の免疫細胞集団の総生存率は約４３％であり、精製前の基本的な細胞表現型を保持していた。（４）免疫細胞添加後の腫瘍組織サンプルのＣ／Ｔ値は８であり、ＣＤ８＋％＝２．４５％であった。腫瘍内部の浸潤Ｔリンパ球は、ＣＤ２７０分子を弱く発現し、ＰＤ１分子を高発現し、ＰＤ１抗体に対してより良い反応がある可能性を示した（図８に示す）。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：対照群の細胞の生存率の値（図９に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１０日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の違いをフローサイトメトリーにより検出した（図１０に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析と統計された。
図９及び図１０の実験結果に基づき、１０日目のｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅにおいて、精製前の腫瘍組織サンプル又は自己ＴＩＬを添加した腫瘍サンプルにかかわらず、ＣＤ４５－の腫瘍細胞が優勢であり、ＣＤ４５－細胞は約ＣＤ４５＋細胞の２～３倍であった（図１０）。精製前の腫瘍組織サンプルのＣＴＧデータは、臨床第一選択薬を含む治療が当該組織サンプルの全細胞の生存率を有意に低下させないことを示した。しかし、自己ＴＩＬ細胞を添加した後の腫瘍サンプルでは、臨床第一選択薬の組み合わせが当該サンプルの全体の細胞生存率を弱く低下させることができ、単剤のＰＤ１抗体もＰＡＲＰ阻害剤も腫瘍組織全体の生存率を阻害することはできないが、ＰＤ１抗体とＰＡＲＰ阻害剤との併用投与は、腫瘍組織全体の増殖と活性を有意に阻害することができる（図９）。興味深いことに、ＰＤ１抗体とＰＡＲＰ阻害剤との併用投与は、ＣＤ２７０＋ＰＤ１－Ｔ細胞サブグループの比率を有意に増加させ、ＰＤ１＋ＣＤ２７０－、ＰＤ１－ＣＤ２７０－のＴ細胞の比率を相対的に減少させることができ（図１０）、ＣＤ２７０分子がＰＤ１抗体治療の潜在的な指標バイオマーカーである可能性があることを再び示した。
【0052】
実施例４ 一例の肺がん患者に対する免疫療法の迅速かつ機能的なスクリーニング
１．実験動物、サンプルの採取及び細胞の処理は、実施例１と同じである。
１．実験動物、サンプルの採取及び細胞の処理は、実施例１と同じである。
【0053】
２．フローサイトメトリー検出とデータ分析
精製前の患者の腫瘍組織サンプルの単一細胞懸濁液、精製後の腫瘍細胞、及び濃縮された免疫細胞をそれぞれ採取し、次に、異なる所定の比率（１．５：１～１５：１）の腫瘍細胞とＣＤ３＋Ｔ細胞の混合懸濁液を調製し、それぞれが約０．１Ｍ～０．３Ｍであった。実験の目的に応じて各サンプルの懸濁液を複数の部分に分け、対応するフローサイトメトリー抗体混合液を添加し、直接標識などの対照とする補償実験群を設置し、遮光して２～８℃で２５～３０分間インキュベートした。この肺がん患者に対する予備ＦＡＣＳパネルは以下の通りである：７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８など。抗体標識が完了した後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳを添加し、４℃で６００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。２５０μｌの２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を含むＰＢＳを加えて細胞沈殿物を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。フローサイトメトリー検出のデータ分析：Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって行われた。
精製前の患者の腫瘍組織サンプルの単一細胞懸濁液、精製後の腫瘍細胞、及び濃縮された免疫細胞をそれぞれ採取し、次に、異なる所定の比率（１．５：１～１５：１）の腫瘍細胞とＣＤ３＋Ｔ細胞の混合懸濁液を調製し、それぞれが約０．１Ｍ～０．３Ｍであった。実験の目的に応じて各サンプルの懸濁液を複数の部分に分け、対応するフローサイトメトリー抗体混合液を添加し、直接標識などの対照とする補償実験群を設置し、遮光して２～８℃で２５～３０分間インキュベートした。この肺がん患者に対する予備ＦＡＣＳパネルは以下の通りである：７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８など。抗体標識が完了した後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳを添加し、４℃で６００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。２５０μｌの２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を含むＰＢＳを加えて細胞沈殿物を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。フローサイトメトリー検出のデータ分析：Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって行われた。
【0054】
３．セルローディングチューブ
生物学的安全キャビネット、即ち直径１～２ｍｍのＰＶＤＦチューブからカプセル装置を取り出し、平均孔径の透過サイズは約５００ＫＤａ分子量であり、細胞懸濁液を充填する前に、ＰＶＤＦチューブに、無水エタノールによる活性化、超純水洗浄及び高圧滅菌等の処理を施した。その中の長さ１．５ｃｍのカプセルチューブを取り、細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏから購入）で繰り返し洗浄した。
フローサイトメトリーの結果により、腫瘍細胞とＣＤ３＋リンパ球を所定（１．５：１～１５：１）の比率（同時にＣＤ８＋Ｔ細胞が全生細胞の０．５％以上を占める）で均一に混合した後にＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。
生物学的安全キャビネット、即ち直径１～２ｍｍのＰＶＤＦチューブからカプセル装置を取り出し、平均孔径の透過サイズは約５００ＫＤａ分子量であり、細胞懸濁液を充填する前に、ＰＶＤＦチューブに、無水エタノールによる活性化、超純水洗浄及び高圧滅菌等の処理を施した。その中の長さ１．５ｃｍのカプセルチューブを取り、細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏから購入）で繰り返し洗浄した。
フローサイトメトリーの結果により、腫瘍細胞とＣＤ３＋リンパ球を所定（１．５：１～１５：１）の比率（同時にＣＤ８＋Ｔ細胞が全生細胞の０．５％以上を占める）で均一に混合した後にＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。
【0055】
４．接種と投与
穿刺針を使用して、上記ＰＶＤＦチューブをマウスの皮下にランダムに接種し、創傷を医療用組織接着剤（３Ｍから購入）で接着し、対照群と投与群（例えば、１．ＰＤ１抗体；２．ＨＤＡＣ阻害剤チダミドと組み合わせた抗体）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
穿刺針を使用して、上記ＰＶＤＦチューブをマウスの皮下にランダムに接種し、創傷を医療用組織接着剤（３Ｍから購入）で接着し、対照群と投与群（例えば、１．ＰＤ１抗体；２．ＨＤＡＣ阻害剤チダミドと組み合わせた抗体）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
【0056】
５．細胞生存率と表現型検出
投与３～２１日後（１４日目）にマウスを安楽死させ、ＰＶＤＦチューブを取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ化学発光法を用いて細胞生存率を定量化測定し、ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と基本的な表現型をフローサイトメトリーで検出した。
投与３～２１日後（１４日目）にマウスを安楽死させ、ＰＶＤＦチューブを取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ化学発光法を用いて細胞生存率を定量化測定し、ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と基本的な表現型をフローサイトメトリーで検出した。
【0057】
６．データ分析
０日目のフローサイトメトリーＦＡＣＳスクリーニング：初期腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型同定、カプセル内の混合細胞のフローサイトメトリーデータは、ＣＤ４５－腫瘍細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ免疫細胞は約１５：１であり、ＣＤ８＋％＝２．２％であることを示した（図１１に示す）。
１４日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：対照群の細胞の生存率の値（図１２に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
ｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の違いをフローサイトメトリーにより検出した（図１３に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。
図１２及び図１３の実験結果に基づき、１４日目のカプセルチューブ内の生細胞は依然としてＣＤ４５－腫瘍細胞が優勢であり、約６０～７５％を占めた。ＰＤ１抗体が処理された後、それはＣＤ８＋Ｔ細胞の生存を促進することができたが、腫瘍細胞及び免疫細胞の全細胞の生存率をダウンレギュレートすることができなかった。ＰＤ１抗体とＨＤＡＣ阻害剤チダミドと組み合わせた場合、全細胞の生存率（ＡＴＰ活性）を有意に低下させることができた。したがって、この肺がん患者はＰＤ１抗体単剤療法には適さず、免疫療法と化学的標的薬との併用療法が推奨されている。
０日目のフローサイトメトリーＦＡＣＳスクリーニング：初期腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型同定、カプセル内の混合細胞のフローサイトメトリーデータは、ＣＤ４５－腫瘍細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ免疫細胞は約１５：１であり、ＣＤ８＋％＝２．２％であることを示した（図１１に示す）。
１４日目のｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：対照群の細胞の生存率の値（図１２に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
ｉｎ ｖｉｖｏ実験ノード：ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の違いをフローサイトメトリーにより検出した（図１３に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。
図１２及び図１３の実験結果に基づき、１４日目のカプセルチューブ内の生細胞は依然としてＣＤ４５－腫瘍細胞が優勢であり、約６０～７５％を占めた。ＰＤ１抗体が処理された後、それはＣＤ８＋Ｔ細胞の生存を促進することができたが、腫瘍細胞及び免疫細胞の全細胞の生存率をダウンレギュレートすることができなかった。ＰＤ１抗体とＨＤＡＣ阻害剤チダミドと組み合わせた場合、全細胞の生存率（ＡＴＰ活性）を有意に低下させることができた。したがって、この肺がん患者はＰＤ１抗体単剤療法には適さず、免疫療法と化学的標的薬との併用療法が推奨されている。
【0058】
実施例５ 二つ例の急性骨髄性白血病ＡＭＬ患者に対する免疫療法の迅速かつ機能的なスクリーニングと潜在的なバイオマーカーの同定
１．実験動物とサンプルの採取
本実験では、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（をサプライヤーＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）に注文し、ＳＰＦレベルの動物ハウスで飼育し、実験開始前に少なくとも３日間動物を適応性飼育した。
二つ例のＡＭＬ患者からの新鮮な末梢血（ＡＭＬ患者急性期）サンプルを採取し、抗凝固チューブに入れ、コールドチェーン（２～８℃）で短時間で中央検査室に輸送した。
１．実験動物とサンプルの採取
本実験では、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（をサプライヤーＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）に注文し、ＳＰＦレベルの動物ハウスで飼育し、実験開始前に少なくとも３日間動物を適応性飼育した。
二つ例のＡＭＬ患者からの新鮮な末梢血（ＡＭＬ患者急性期）サンプルを採取し、抗凝固チューブに入れ、コールドチェーン（２～８℃）で短時間で中央検査室に輸送した。
【0059】
２．細胞の処理
異なる患者の末梢血サンプルを生物学的安全キャビネットに移し、密度１．０７７ｇ／ｍＬの勾配遠心分離ゲル（ＳＩＧＭＡから購入）を室温に戻した後、２つの新しい遠心分離チューブに加え、２つの患者の末梢血サンプルをそれぞれ遠心分離チューブの一つに加え、上記液体をゆっくりと遠心分離機に入れ、温度を２０～２５℃（室温）に設定し、増減速度はいずれも１又は０であり、４００ｇで２０分間であった。遠心分離後、遠心分離チューブをゆっくりと移動させ、中間層の濁った細胞層（単核細胞を多数含む）を取り、１５ｍｌのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）で洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、正常細胞懸濁液を遠心分離した。必要に応じて、３～５倍の赤血球溶解液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を加えて５分間溶解させ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去した。細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏから購入）で再懸濁し、計数した。
異なる患者の末梢血サンプルを生物学的安全キャビネットに移し、密度１．０７７ｇ／ｍＬの勾配遠心分離ゲル（ＳＩＧＭＡから購入）を室温に戻した後、２つの新しい遠心分離チューブに加え、２つの患者の末梢血サンプルをそれぞれ遠心分離チューブの一つに加え、上記液体をゆっくりと遠心分離機に入れ、温度を２０～２５℃（室温）に設定し、増減速度はいずれも１又は０であり、４００ｇで２０分間であった。遠心分離後、遠心分離チューブをゆっくりと移動させ、中間層の濁った細胞層（単核細胞を多数含む）を取り、１５ｍｌのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）で洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、正常細胞懸濁液を遠心分離した。必要に応じて、３～５倍の赤血球溶解液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を加えて５分間溶解させ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去した。細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏから購入）で再懸濁し、計数した。
【0060】
３．フローサイトメトリー検出とデータ分析
０．３Ｍの末梢血細胞をそれぞれ採取し、実験目的に応じて異なるフローサイトメトリー抗体を選択して染色及び補償設置を行い、遮光して２～８℃で２５～３０分間インキュベートして抗体標識を行い、ＡＭＬ患者に一般的に使用されるフローサイトメトリーパネルは、７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ２５又はＰＤ１である。抗体標識が完了した後、２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を含むＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を添加し、４℃で６００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。２５０μｌの２％ＦＢＳを含むＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を加えて細胞沈殿物を再懸濁し、フローサイトメトリーで検出を行った。フローサイトメトリー検出のデータ分析：フローサイトメトリー検出のデータ分析は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって行われた。
０．３Ｍの末梢血細胞をそれぞれ採取し、実験目的に応じて異なるフローサイトメトリー抗体を選択して染色及び補償設置を行い、遮光して２～８℃で２５～３０分間インキュベートして抗体標識を行い、ＡＭＬ患者に一般的に使用されるフローサイトメトリーパネルは、７ＡＡＤ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ２５又はＰＤ１である。抗体標識が完了した後、２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を含むＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を添加し、４℃で６００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。２５０μｌの２％ＦＢＳを含むＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を加えて細胞沈殿物を再懸濁し、フローサイトメトリーで検出を行った。フローサイトメトリー検出のデータ分析：フローサイトメトリー検出のデータ分析は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって行われた。
【0061】
４．セルローディングチューブ
生物学的安全キャビネット、即ち直径１～２ｍｍのＰＶＤＦチューブ（材料の平均孔径は約３００ｋＤａ～７００ｋＤａであり、高分子タンパク質などの出入りは許されるが、細胞の自由な出入りは許されない）からカプセル装置を取り出し、細胞懸濁液を充填する前に、ＰＶＤＦチューブに、無水エタノールによる活性化、超純水洗浄及び高圧滅菌等の処理を施した。その中の長さ１．５ｃｍのカプセルチューブを取り、細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏから購入）で繰り返し洗浄した。
ステップ（４）のフローサイトメトリー分析に基づき、品質管理分析を行い、ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率が少なくとも０．５％（免疫薬の作用の基本的な値）を超える要件を満たすように行い、また、腫瘍細胞（又は非ＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－Ａｌｏｗ細胞）及びＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－ＡｌｏｗＣＤ３＋Ｔリンパ球を所定の比率（１．５：１～１５：１）で均一に混合した後にＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。
生物学的安全キャビネット、即ち直径１～２ｍｍのＰＶＤＦチューブ（材料の平均孔径は約３００ｋＤａ～７００ｋＤａであり、高分子タンパク質などの出入りは許されるが、細胞の自由な出入りは許されない）からカプセル装置を取り出し、細胞懸濁液を充填する前に、ＰＶＤＦチューブに、無水エタノールによる活性化、超純水洗浄及び高圧滅菌等の処理を施した。その中の長さ１．５ｃｍのカプセルチューブを取り、細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏから購入）で繰り返し洗浄した。
ステップ（４）のフローサイトメトリー分析に基づき、品質管理分析を行い、ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率が少なくとも０．５％（免疫薬の作用の基本的な値）を超える要件を満たすように行い、また、腫瘍細胞（又は非ＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－Ａｌｏｗ細胞）及びＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－ＡｌｏｗＣＤ３＋Ｔリンパ球を所定の比率（１．５：１～１５：１）で均一に混合した後にＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。
【0062】
５．接種と投与
穿刺針を使用して、上記ＰＶＤＦチューブをマウスの皮下にランダムに接種し、創傷を医療用組織接着剤（３Ｍから購入）で接着し、対照群と異なる薬物投与群（例えば、ＰＤ１抗体、ＣＤ３８抗体Ｄａｒａ、標的薬物Ｂｃｌ２阻害剤ベネトクラクス、ＨＤＡＣ阻害剤チダミドなどの単剤又は組み合わせ）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
穿刺針を使用して、上記ＰＶＤＦチューブをマウスの皮下にランダムに接種し、創傷を医療用組織接着剤（３Ｍから購入）で接着し、対照群と異なる薬物投与群（例えば、ＰＤ１抗体、ＣＤ３８抗体Ｄａｒａ、標的薬物Ｂｃｌ２阻害剤ベネトクラクス、ＨＤＡＣ阻害剤チダミドなどの単剤又は組み合わせ）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
【0063】
６．細胞生存率と表現型検出
投与３～２１日後（例えば、１４日目）にマウスを安楽死させ、ＰＶＤＦチューブを取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ化学発光法により全細胞の生存率を定量化測定した。ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の変化をフローサイトメトリーで検出した。０日目又は１０日目の臨床サンプルのＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報の変化を分子生物学的方法（ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＤＮＡ－ｓｅｑ技術など）によって検出した。
投与３～２１日後（例えば、１４日目）にマウスを安楽死させ、ＰＶＤＦチューブを取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ化学発光法により全細胞の生存率を定量化測定した。ＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型の変化をフローサイトメトリーで検出した。０日目又は１０日目の臨床サンプルのＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の分子生物学的情報の変化を分子生物学的方法（ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＤＮＡ－ｓｅｑ技術など）によって検出した。
【0064】
７．データ分析
０日目のフローサイトメトリー分取：二つ例のＡＭＬ患者（１２３＃、１２４＃）に対する初期腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型同定（図１４に示す）。１２３＃患者のＣＤ８＋Ｔ細胞は全生細胞の０．２１％（この患者はＰＤ１抗体に感受性のない可能性があると推測された）を占め、Ｃ／Ｔ（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３３＋ＣＤ３８＋腫瘍細胞とＣＤ３＋Ｔとの比）は約１５：１（より多くのＣＤ３８－腫瘍細胞も存在した）であったが、１２４＃患者のＣＤ８＋Ｔ％は約３．４８％であり、Ｃ／Ｔ値は約６：１であった。
１４日目のＣＴＧ実験では、対照群の細胞の生存率の値（図１５に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１４日目のフローサイトメトリー検出によりＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率を検出した。薬物群と対照群の腫瘍細胞及び免疫細胞の違いを比較した（図１６に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。
上記の１４日目のＣＴＧ及びＦＡＣＳのデータ分析に基づき、１２３＃患者及び１２４＃患者は１４日目に、カプセルチューブ内の生細胞には依然としてＣＤ４５－／ｌｏｗの腫瘍細胞（例えば、ＡＭＬがん芽球）が大多数あり、約５％～１０％のＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－Ａｌｏｗのリンパ球があった（図１６のａは１２４＃を例とした）。１２４＃患者（免疫レスポンダー）は、チェックポイント阻害剤ＰＤ１抗体に対して良好な反応を示し（図１２のＣＴＧ阻害効果の半分以上）、その０日目の高レベルを持つＣＤ８＋Ｔ細胞と一致し、生細胞に占めるＡＭＬ芽球の比率を大幅に減少させ、ＣＤ３＋ＣＤ８＋の比率を相対的に増加させ（図１６のｂ）、この現象は、１２３＃（免疫ノンレスポンダー）患者では現れなかった。さらに、抗体依存性細胞傷害機能（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性マクロファージ貪食機能（ＡＤＣＰ）を有するＣＤ３８抗体もこの系である程度の反応性を取得し、ＰＤ１抗体よりも効果が比較的弱いものの、１２４＃患者のがん細胞におけるＣＤ３８抗原の高発現と密接に関連したが、ＣＤ３８－Ａｂ単剤に反応しなかった１２３＃患者では単にＣＤ３８を弱い発現し、約１０．７％であった（図１４）。したがって、ＮＫ細胞及び単核マクロファージの活性及び機能は、この系における０日目の免疫細胞の採取中にも保持され、どちらもＣＤ４５＋であった。
０日目のフローサイトメトリー分取：二つ例のＡＭＬ患者（１２３＃、１２４＃）に対する初期腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率と表現型同定（図１４に示す）。１２３＃患者のＣＤ８＋Ｔ細胞は全生細胞の０．２１％（この患者はＰＤ１抗体に感受性のない可能性があると推測された）を占め、Ｃ／Ｔ（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３３＋ＣＤ３８＋腫瘍細胞とＣＤ３＋Ｔとの比）は約１５：１（より多くのＣＤ３８－腫瘍細胞も存在した）であったが、１２４＃患者のＣＤ８＋Ｔ％は約３．４８％であり、Ｃ／Ｔ値は約６：１であった。
１４日目のＣＴＧ実験では、対照群の細胞の生存率の値（図１５に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１４日目のフローサイトメトリー検出によりＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率を検出した。薬物群と対照群の腫瘍細胞及び免疫細胞の違いを比較した（図１６に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。
上記の１４日目のＣＴＧ及びＦＡＣＳのデータ分析に基づき、１２３＃患者及び１２４＃患者は１４日目に、カプセルチューブ内の生細胞には依然としてＣＤ４５－／ｌｏｗの腫瘍細胞（例えば、ＡＭＬがん芽球）が大多数あり、約５％～１０％のＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－Ａｌｏｗのリンパ球があった（図１６のａは１２４＃を例とした）。１２４＃患者（免疫レスポンダー）は、チェックポイント阻害剤ＰＤ１抗体に対して良好な反応を示し（図１２のＣＴＧ阻害効果の半分以上）、その０日目の高レベルを持つＣＤ８＋Ｔ細胞と一致し、生細胞に占めるＡＭＬ芽球の比率を大幅に減少させ、ＣＤ３＋ＣＤ８＋の比率を相対的に増加させ（図１６のｂ）、この現象は、１２３＃（免疫ノンレスポンダー）患者では現れなかった。さらに、抗体依存性細胞傷害機能（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性マクロファージ貪食機能（ＡＤＣＰ）を有するＣＤ３８抗体もこの系である程度の反応性を取得し、ＰＤ１抗体よりも効果が比較的弱いものの、１２４＃患者のがん細胞におけるＣＤ３８抗原の高発現と密接に関連したが、ＣＤ３８－Ａｂ単剤に反応しなかった１２３＃患者では単にＣＤ３８を弱い発現し、約１０．７％であった（図１４）。したがって、ＮＫ細胞及び単核マクロファージの活性及び機能は、この系における０日目の免疫細胞の採取中にも保持され、どちらもＣＤ４５＋であった。
【0065】
８．生物学的情報分析
０日目のＰＶＤＦカプセルチューブ内の患者の腫瘍細胞及び免疫細胞の全体のバイオインフォマティクスフィンガープリントを分子生物学的方法（ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑ）によって検出し、免疫薬に対するこの患者の反応性に関連する可能性のあるバイオマーカーを見つけるために使用され、疾患の発生と発症の分子病態生理学的基盤を明らかにした。
０日目のＰＶＤＦカプセルチューブ内の患者の腫瘍細胞及び免疫細胞の全体のバイオインフォマティクスフィンガープリントを分子生物学的方法（ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑ）によって検出し、免疫薬に対するこの患者の反応性に関連する可能性のあるバイオマーカーを見つけるために使用され、疾患の発生と発症の分子病態生理学的基盤を明らかにした。
【0066】
ＲＮＡ－ｓｅｑによる二つ例の患者間のトランスクリプトーム差異の分析：
（１）差次的遺伝子シグナル伝達経路の分析：図１７のａ及びｂに示すように、＃１２３免疫非反応型患者は、腫瘍増殖活性が高く（例えば、ＣＣＤＮ１、ＰＬＫ１、ＭＣＭ２）、腫瘍微小環境のリモデリング能力も強く、新生血管関連マーカーの発現が高く（例えば、ＶＥＧＦＣ、ＡＮＧＰＴ２、ＦＬＴ１、ＶＷＦ）、同時にＴ細胞、特にエフェクターＴ細胞が低機能であった。＃１２４免疫反応型患者は、腫瘍自体の増殖と血管新生能力が低かったが、Ｔ細胞（例えば、ＩＦＮγ）及び好中球（ＥＬＡＮＥ、ＭＰＯ、ＰＲＴＮ３）のエフェクター機能が比較的強力であった。
（２）ＡＭＬ患者に対する免疫療法の潜在的な重要なバイオマーカーの発見（膜タンパク質のサブセット）：図１８に示すように、膜タンパク質の発現差異の分析により、＃１２４免疫反応型患者と比較して、＃１２３免疫非反応型患者は有意に高レベルのがん促進遺伝子又はがん感受性遺伝子（ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＬＩＭ１、ＡＤＡ、ＣＡＶＩＮ１、ＣＡＶＩＮ２、Ｃ３ｏｒｆ１４、ＴＥＣ、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ１０９など）、免疫抑制関連遺伝子（ＣＳＦ１、ＣＤ２７４／ＰＤＬ１）など腫瘍の発生と発症を促進する膜タンパク質、及びＳＬＣ９Ａ３Ｒ２（ＳＬＣ９Ａ３レギュレーター２）、ＰＩＧＷ（ホスファチジルイノシトールグリカンアンカー生合成クラスＷ）、ＣＤＨ２６（カドヘリン２６）とＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ（プロテインホスファターゼ１調節サブユニット１６Ｂ）を含むまだ報告されていない新規腫瘍標的分子を発現することがわかった。これらの４つの膜分子は、血液腫瘍のバイオマーカーであるだけでなく、広範囲の腫瘍の発生と発症の主要な潜在的なバイオマーカーでもある可能性があった。
ＤＮＡ－ｓｅｑによる二つ例のＡＭＬ患者間のゲノム差異の分析：
図１９に示すように、ＷＥＳ－ＣＮＶシグナルは大きく変化し、明らかな欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）と増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は示唆されなかった。融合遺伝子（ＡＢＬ１－ＢＣＲ、ＣＲＬＦ２、ＪＡＫ２－ＢＲＡＦ、ＮＯＴＣＨ１）、変異遺伝子（ＦＢＸＷ７、ＪＡＫ１、ＫＲＡＳ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＣＥＢＰＡ）などを含む、ＡＭＬ関連の既知のバイオマーカーは、陽性が見つからなかった。即ち、報告された遺伝子の重要な変異は、ゲノムレベルで二つ例の患者に見つからなかった。
（１）差次的遺伝子シグナル伝達経路の分析：図１７のａ及びｂに示すように、＃１２３免疫非反応型患者は、腫瘍増殖活性が高く（例えば、ＣＣＤＮ１、ＰＬＫ１、ＭＣＭ２）、腫瘍微小環境のリモデリング能力も強く、新生血管関連マーカーの発現が高く（例えば、ＶＥＧＦＣ、ＡＮＧＰＴ２、ＦＬＴ１、ＶＷＦ）、同時にＴ細胞、特にエフェクターＴ細胞が低機能であった。＃１２４免疫反応型患者は、腫瘍自体の増殖と血管新生能力が低かったが、Ｔ細胞（例えば、ＩＦＮγ）及び好中球（ＥＬＡＮＥ、ＭＰＯ、ＰＲＴＮ３）のエフェクター機能が比較的強力であった。
（２）ＡＭＬ患者に対する免疫療法の潜在的な重要なバイオマーカーの発見（膜タンパク質のサブセット）：図１８に示すように、膜タンパク質の発現差異の分析により、＃１２４免疫反応型患者と比較して、＃１２３免疫非反応型患者は有意に高レベルのがん促進遺伝子又はがん感受性遺伝子（ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＬＩＭ１、ＡＤＡ、ＣＡＶＩＮ１、ＣＡＶＩＮ２、Ｃ３ｏｒｆ１４、ＴＥＣ、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ１０９など）、免疫抑制関連遺伝子（ＣＳＦ１、ＣＤ２７４／ＰＤＬ１）など腫瘍の発生と発症を促進する膜タンパク質、及びＳＬＣ９Ａ３Ｒ２（ＳＬＣ９Ａ３レギュレーター２）、ＰＩＧＷ（ホスファチジルイノシトールグリカンアンカー生合成クラスＷ）、ＣＤＨ２６（カドヘリン２６）とＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ（プロテインホスファターゼ１調節サブユニット１６Ｂ）を含むまだ報告されていない新規腫瘍標的分子を発現することがわかった。これらの４つの膜分子は、血液腫瘍のバイオマーカーであるだけでなく、広範囲の腫瘍の発生と発症の主要な潜在的なバイオマーカーでもある可能性があった。
ＤＮＡ－ｓｅｑによる二つ例のＡＭＬ患者間のゲノム差異の分析：
図１９に示すように、ＷＥＳ－ＣＮＶシグナルは大きく変化し、明らかな欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）と増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は示唆されなかった。融合遺伝子（ＡＢＬ１－ＢＣＲ、ＣＲＬＦ２、ＪＡＫ２－ＢＲＡＦ、ＮＯＴＣＨ１）、変異遺伝子（ＦＢＸＷ７、ＪＡＫ１、ＫＲＡＳ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＣＥＢＰＡ）などを含む、ＡＭＬ関連の既知のバイオマーカーは、陽性が見つからなかった。即ち、報告された遺伝子の重要な変異は、ゲノムレベルで二つ例の患者に見つからなかった。
【0067】
実施例６ 三つ例の急性骨髄性白血病ＡＭＬ患者に対する免疫療法の迅速かつ機能的なスクリーニングと潜在的なバイオマーカーの同定
１．実験動物の準備は実施例５と同じである。
１．実験動物の準備は実施例５と同じである。
【0068】
２．サンプルの採取
三つ例のＡＭＬ患者からの新鮮な末梢血及び（又は）骨髄（ＡＭＬ患者急性期）サンプルを採取し、抗凝固チューブに入れ、コールドチェーン（２～８℃）で短時間で中央検査室に輸送した。
三つ例のＡＭＬ患者からの新鮮な末梢血及び（又は）骨髄（ＡＭＬ患者急性期）サンプルを採取し、抗凝固チューブに入れ、コールドチェーン（２～８℃）で短時間で中央検査室に輸送した。
【0069】
３．細胞の処理、フローサイトメトリー検出は、実施例５と同じである。
【0070】
４．セルローディングチューブ
実施例４と同様である。一部の患者の骨髄サンプルと血液サンプルを４：１～５：１で混合し、腫瘍組織サンプルに循環末梢血細胞が含まれることを保証し、これにより人間の微小環境の機能を最大限に模倣した。フローサイトメトリーデータに基づき、品質管理分析を行い、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞比率が少なくとも０．５％（免疫薬の作用の基本的な値）を超える要件を満たすように行い、また、腫瘍細胞（又は非ＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－Ａｌｏｗ細胞）及びＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－ＡｌｏｗＣＤ３＋Ｔリンパ球を所定の比率（Ｃ／Ｔ＝１．５：１～１５：１）で均一に混合した後にＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。
実施例４と同様である。一部の患者の骨髄サンプルと血液サンプルを４：１～５：１で混合し、腫瘍組織サンプルに循環末梢血細胞が含まれることを保証し、これにより人間の微小環境の機能を最大限に模倣した。フローサイトメトリーデータに基づき、品質管理分析を行い、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞比率が少なくとも０．５％（免疫薬の作用の基本的な値）を超える要件を満たすように行い、また、腫瘍細胞（又は非ＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－Ａｌｏｗ細胞）及びＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－ＡｌｏｗＣＤ３＋Ｔリンパ球を所定の比率（Ｃ／Ｔ＝１．５：１～１５：１）で均一に混合した後にＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。
【0071】
５．接種と投与
実施例４と同様に、対照群と異なる薬物投与群（例えば、ＣＤ３８抗体、ＰＤ１抗体と組み合わせたＣＤ３８抗体、デシタビンと組み合わせたＰＤ１抗体、ＰＤ１抗体）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
実施例４と同様に、対照群と異なる薬物投与群（例えば、ＣＤ３８抗体、ＰＤ１抗体と組み合わせたＣＤ３８抗体、デシタビンと組み合わせたＰＤ１抗体、ＰＤ１抗体）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
【0072】
６．データ分析
０日目のフローサイトメトリー分取：図２０に示すように、１２８＃患者の血液Ｃ／Ｔ（ＣＤ３８＋がん／ＣＤ３＋Ｔ）＝４であり、その骨髄と血液の混合サンプルＣ／Ｔ＝７．５であった。１２９＃患者の血液Ｃ／Ｔ＝１．１であり（より多くのがん芽球はＣＤ３８を発現しなかった、即ち、この患者のＣ／Ｔ値は実際には１．５より大きかった）、その骨髄と血液の混合サンプルＣ／Ｔ＝５．３であった。１３１＃の骨髄サンプルＣ／Ｔ＝４．５であった。これら三つ例の患者の骨髄系腫瘍細胞はすべてＣＤ３８分子を高発現し（約７０％～８０％）、またＣＤ８＋Ｔ％も１％～１０％であった。
１４日目のＣＴＧ実験では、対照群の細胞の生存率の値（図２１に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１４日目のフローサイトメトリー検出によりＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率を検出した。薬物群と対照群の腫瘍細胞及び免疫細胞の違いを比較した（図２２に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。
図２０、図２１及び図２２の結果により、三つ例の患者はすべてＣＤ３８標的タンパク質を高発現したが、１２８＃及び１２９＃患者はＣＤ３８抗体に対する反応効果をほとんど有さず（図２１は、薬物治療後も生細胞の総数が減少しないことを示唆し、図２２は、がん芽球が依然としてｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅの大部分を占めていることを示唆した）、一方、１３１＃患者は良好な反応を有することが示唆された（図１９）。さらに、三つ例の患者は骨髄及び／又は血液中のＴＩＬ細胞も豊富であったが（約５％～１７％）、１３１＃患者のみがＰＤ１抗体、特にデシタビン（５ａｚａ）と組み合わせたＰＤ１抗体に対してより良好な反応を示した。
０日目又は１４日目のＰＶＤＦカプセルチューブ内の患者の腫瘍細胞及び免疫細胞の全体のバイオインフォマティクスフィンガープリントを分子生物学的方法（ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑ）によって検出し、この患者の免疫薬に敏感で耐性のあるバイオマーカーを発見及び評価することに使用された。
０日目のフローサイトメトリー分取：図２０に示すように、１２８＃患者の血液Ｃ／Ｔ（ＣＤ３８＋がん／ＣＤ３＋Ｔ）＝４であり、その骨髄と血液の混合サンプルＣ／Ｔ＝７．５であった。１２９＃患者の血液Ｃ／Ｔ＝１．１であり（より多くのがん芽球はＣＤ３８を発現しなかった、即ち、この患者のＣ／Ｔ値は実際には１．５より大きかった）、その骨髄と血液の混合サンプルＣ／Ｔ＝５．３であった。１３１＃の骨髄サンプルＣ／Ｔ＝４．５であった。これら三つ例の患者の骨髄系腫瘍細胞はすべてＣＤ３８分子を高発現し（約７０％～８０％）、またＣＤ８＋Ｔ％も１％～１０％であった。
１４日目のＣＴＧ実験では、対照群の細胞の生存率の値（図２１に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１４日目のフローサイトメトリー検出によりＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率を検出した。薬物群と対照群の腫瘍細胞及び免疫細胞の違いを比較した（図２２に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。
図２０、図２１及び図２２の結果により、三つ例の患者はすべてＣＤ３８標的タンパク質を高発現したが、１２８＃及び１２９＃患者はＣＤ３８抗体に対する反応効果をほとんど有さず（図２１は、薬物治療後も生細胞の総数が減少しないことを示唆し、図２２は、がん芽球が依然としてｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅの大部分を占めていることを示唆した）、一方、１３１＃患者は良好な反応を有することが示唆された（図１９）。さらに、三つ例の患者は骨髄及び／又は血液中のＴＩＬ細胞も豊富であったが（約５％～１７％）、１３１＃患者のみがＰＤ１抗体、特にデシタビン（５ａｚａ）と組み合わせたＰＤ１抗体に対してより良好な反応を示した。
０日目又は１４日目のＰＶＤＦカプセルチューブ内の患者の腫瘍細胞及び免疫細胞の全体のバイオインフォマティクスフィンガープリントを分子生物学的方法（ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑ）によって検出し、この患者の免疫薬に敏感で耐性のあるバイオマーカーを発見及び評価することに使用された。
【0073】
実施例７ 一例の急性骨髄性白血病ＡＭＬ患者に対する免疫療法の迅速かつ機能的なスクリーニング
１．実験動物は実施例５と同じである。
１．実験動物は実施例５と同じである。
【0074】
２．サンプルの採取
一例のＡＭＬ患者からの新鮮な末梢血及び骨髄（ＡＭＬ患者急性期）サンプルを採取し、抗凝固チューブに入れ、コールドチェーン（２～８℃）で短時間で中央検査室に輸送した。
一例のＡＭＬ患者からの新鮮な末梢血及び骨髄（ＡＭＬ患者急性期）サンプルを採取し、抗凝固チューブに入れ、コールドチェーン（２～８℃）で短時間で中央検査室に輸送した。
【0075】
３．細胞の処理、フローサイトメトリー検出とデータ分析は、実施例５と同じである。
【0076】
４．セルローディングチューブ
実施例６と同様に、この患者の骨髄サンプルと血液サンプルを４：１～５：１で混合し、腫瘍組織サンプルに循環末梢血細胞が含まれることを保証し、これにより人間の微小環境の機能を最大限に模倣した。フローサイトメトリーデータに基づき、品質管理分析を行い、ＣＤ８＋Ｔ％＝０．４６６％（閾値０．５％に近い）であり、腫瘍細胞（ＣＤ３８＋ＣＤ３３＋腫瘍細胞）とＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－ＡｌｏｗＣＤ３＋Ｔとの比＝８（Ｃ／Ｔ＝１．５：１～１５：１の範囲に属する）であることがわかった。下流の探索的実験を行い、サンプルをＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。
実施例６と同様に、この患者の骨髄サンプルと血液サンプルを４：１～５：１で混合し、腫瘍組織サンプルに循環末梢血細胞が含まれることを保証し、これにより人間の微小環境の機能を最大限に模倣した。フローサイトメトリーデータに基づき、品質管理分析を行い、ＣＤ８＋Ｔ％＝０．４６６％（閾値０．５％に近い）であり、腫瘍細胞（ＣＤ３８＋ＣＤ３３＋腫瘍細胞）とＣＤ４５ｈｉｇｈ ＳＳＣ－ＡｌｏｗＣＤ３＋Ｔとの比＝８（Ｃ／Ｔ＝１．５：１～１５：１の範囲に属する）であることがわかった。下流の探索的実験を行い、サンプルをＰＶＤＦチューブに入れ、密封した。
【0077】
５．接種と投与
実施例４と同様に、対照群と異なる薬物投与群（例えば、ｂｃｌ２阻害剤ベネトクラクス、ＣＤ３８抗体、チダミドと組み合わせたＣＤ３８抗体、５ＡＺＡと組み合わせたＣＤ３８抗体、ベネトクラクスと組み合わせたＣＤ３８抗体、ＰＤ１抗体、５ＡＺＡと組み合わせたＰＤ１抗体など）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
実施例４と同様に、対照群と異なる薬物投与群（例えば、ｂｃｌ２阻害剤ベネトクラクス、ＣＤ３８抗体、チダミドと組み合わせたＣＤ３８抗体、５ＡＺＡと組み合わせたＣＤ３８抗体、ベネトクラクスと組み合わせたＣＤ３８抗体、ＰＤ１抗体、５ＡＺＡと組み合わせたＰＤ１抗体など）をランダムに設定し、投与群のマウスに投与した。
【0078】
６．細胞生存率と表現型検出は実施例５と同じである。
【0079】
７．データ分析
０日目のフローサイトメトリー分取：図２３に示すように、１６０＃患者の骨髄と血液の混合サンプルＣ／Ｔ＝８であり（より多くの腫瘍細胞はＣＤ３８を発現しなかった、即ち、この患者のＣ／Ｔ値は実際には８よりはるかに大きかった）、ＣＤ８＋Ｔ％＝０．４６６％であった。
１４日目のＣＴＧ実験では、対照群の細胞の生存率の値（図２４に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１４日目のフローサイトメトリー検出によりＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率を検出した。薬物群と対照群の腫瘍細胞及び免疫細胞の違いを比較した（図２５に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。
１４日目のフローサイトメトリーとＣＴＧの結果により、ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅではＣＤ４５ｌｏｗ／－腫瘍前駆体／前駆細胞は優勢であり、リンパ球集団は約２０％を占め、被験薬物のいずれも腫瘍組織集団の細胞活性を有意に阻害することはできないことが示唆された。この実験は、高いＣ／Ｔ比（＞＞８）及び低いＣＤ８＋％（＜０．５％）がこの患者の免疫療法に対する無反応をもたらす可能性があることを示唆した。
０日目のフローサイトメトリー分取：図２３に示すように、１６０＃患者の骨髄と血液の混合サンプルＣ／Ｔ＝８であり（より多くの腫瘍細胞はＣＤ３８を発現しなかった、即ち、この患者のＣ／Ｔ値は実際には８よりはるかに大きかった）、ＣＤ８＋Ｔ％＝０．４６６％であった。
１４日目のＣＴＧ実験では、対照群の細胞の生存率の値（図２４に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１４日目のフローサイトメトリー検出によりＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率を検出した。薬物群と対照群の腫瘍細胞及び免疫細胞の違いを比較した（図２５に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。
１４日目のフローサイトメトリーとＣＴＧの結果により、ｍｉｎｉ－ｃａｐｓｕｌｅではＣＤ４５ｌｏｗ／－腫瘍前駆体／前駆細胞は優勢であり、リンパ球集団は約２０％を占め、被験薬物のいずれも腫瘍組織集団の細胞活性を有意に阻害することはできないことが示唆された。この実験は、高いＣ／Ｔ比（＞＞８）及び低いＣＤ８＋％（＜０．５％）がこの患者の免疫療法に対する無反応をもたらす可能性があることを示唆した。
【0080】
実施例８ 複数（二つ例）の急性骨髄性白血病ＡＭＬ患者を同じマウスに接種した免疫療法の迅速かつ機能的なスクリーニング
１．実験動物は実施例４と同じである。
１．実験動物は実施例４と同じである。
【0081】
２．サンプルの採取
二つ例のＡＭＬ患者からの新鮮な骨髄サンプルを採取し、抗凝固チューブに入れ、コールドチェーン（２～８℃）で短時間で中央検査室に輸送した。
二つ例のＡＭＬ患者からの新鮮な骨髄サンプルを採取し、抗凝固チューブに入れ、コールドチェーン（２～８℃）で短時間で中央検査室に輸送した。
【0082】
３．細胞の処理、フローサイトメトリー検出とデータ分析、セルローディングチューブは、実施例４と同じである。
【0083】
４．接種と投与
二つ例の患者の骨髄細胞を同じマウスに接種したカプセルを設定し、それぞれマウスの背部の両側に皮下に接種し、各患者に３つずつのミニカプセルチューブ（２人の患者と１匹のマウス）を設定し、マウスをランダムに群分けし、対照群と投与群（例えば、ＣＤ３８抗体、ＰＤ１抗体）を設定し、投与群のマウスに投与した。同時に、従来の方法で独立した対照及び投与実験（１人の患者と１匹のマウス）をそれぞれ実施し、１０日目のミニカプセルチューブの一部を保持してＦＡＣＳ検出を行った。
二つ例の患者の骨髄細胞を同じマウスに接種したカプセルを設定し、それぞれマウスの背部の両側に皮下に接種し、各患者に３つずつのミニカプセルチューブ（２人の患者と１匹のマウス）を設定し、マウスをランダムに群分けし、対照群と投与群（例えば、ＣＤ３８抗体、ＰＤ１抗体）を設定し、投与群のマウスに投与した。同時に、従来の方法で独立した対照及び投与実験（１人の患者と１匹のマウス）をそれぞれ実施し、１０日目のミニカプセルチューブの一部を保持してＦＡＣＳ検出を行った。
【0084】
５．細胞生存率と表現型検出は実施例４と同じである。
【0085】
６．データ分析
０日目のフローサイトメトリー分取：図２６に示すように、２２８＃患者の骨髄Ｃ／Ｔ（ＣＤ３８＋がん／ＣＤ３＋Ｔ）＝１２であり、ＣＤ８＋％＝０．５７であった（高いＣ／Ｔ値及び低いＣＤ８＋％割合は、この患者がＴ細胞免疫療法に対して反応しない可能性があることを示唆した）。２３２＃患者の骨髄Ｃ／Ｔ＝８．５であり、ＣＤ８＋％＝０．８５％であった。二つ例の患者のＣＤ３＋Ｔの割合は低く、またＰＤ１及びＣＤ２７０マーカーの発現も非常に弱く、ＰＤ１抗体療法の有効性は良くない可能性があることが示唆された。
１０日目のＣＴＧ実験では、対照群の細胞の生存率の値（図２７に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１０日目のフローサイトメトリー検出によりＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率を検出した。薬物群と対照群の腫瘍細胞及び免疫細胞の違いを比較した（図２８に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。
１０日目のＣＴＧとＦＡＣＳの結果により、二つ例の患者のカプセルは、主にＣＤ４５－腫瘍細胞が優勢であった（図２８に示す）。＃２２８ＡＭＬ患者は、ＣＤ３８抗体療法に感受性があり、全細胞生存率が約半分に阻害され（図２７）、ＣＤ４５－腫瘍細胞とＣＤ４５＋免疫細胞の比も対照群と比較して減少したが（図２８）、＃２３２患者は、ＣＤ３８抗原の発現が高かったにもかかわらず、ＣＤ３８抗体に対して有意な反応性を有さなかった（図２６及び図２７に示すように、この反応の差異の理由は、患者のＣＤ３８腫瘍抗原の密度の違いと、骨髄系免疫細胞、例えば、ＮＫ、単球マクロファージ及び好中球のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰなどの機能の差異によって引き起こされたことを排除するものではなかった）。二つ例の患者がすべてＰＤ１抗体に反応しないことは以前の予測と一致し、患者の腫瘍微小環境におけるＰＤ１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が極めて少ないため可能であった（図２６及び２７）。また、二つ例の患者と同じマウスのモデルの薬物感受性検出は、従来の一例の患者と１匹のマウスの接種モデルのデータとも一致した（図２７）。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫薬の有効性の迅速なスクリーニングに対して、コストとリソースを節約するために、同じマウスを使用して、複数の患者のカプセルをロードして検出することができ、異なる接種部位（本実験）、又は異なるカプセルのサイズ、又は異なる色分けに従って区別及び追跡することができる。
０日目のフローサイトメトリー分取：図２６に示すように、２２８＃患者の骨髄Ｃ／Ｔ（ＣＤ３８＋がん／ＣＤ３＋Ｔ）＝１２であり、ＣＤ８＋％＝０．５７であった（高いＣ／Ｔ値及び低いＣＤ８＋％割合は、この患者がＴ細胞免疫療法に対して反応しない可能性があることを示唆した）。２３２＃患者の骨髄Ｃ／Ｔ＝８．５であり、ＣＤ８＋％＝０．８５％であった。二つ例の患者のＣＤ３＋Ｔの割合は低く、またＰＤ１及びＣＤ２７０マーカーの発現も非常に弱く、ＰＤ１抗体療法の有効性は良くない可能性があることが示唆された。
１０日目のＣＴＧ実験では、対照群の細胞の生存率の値（図２７に示す）に基づき、投与群の全ての細胞の増殖生存率を算出し、これにより被験薬物の有効性結果を算出した。
１０日目のフローサイトメトリー検出によりＰＶＤＦチューブ内の腫瘍細胞及び免疫細胞の相対比率を検出した。薬物群と対照群の腫瘍細胞及び免疫細胞の違いを比較した（図２８に示す）。検出の結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによって分析された。
１０日目のＣＴＧとＦＡＣＳの結果により、二つ例の患者のカプセルは、主にＣＤ４５－腫瘍細胞が優勢であった（図２８に示す）。＃２２８ＡＭＬ患者は、ＣＤ３８抗体療法に感受性があり、全細胞生存率が約半分に阻害され（図２７）、ＣＤ４５－腫瘍細胞とＣＤ４５＋免疫細胞の比も対照群と比較して減少したが（図２８）、＃２３２患者は、ＣＤ３８抗原の発現が高かったにもかかわらず、ＣＤ３８抗体に対して有意な反応性を有さなかった（図２６及び図２７に示すように、この反応の差異の理由は、患者のＣＤ３８腫瘍抗原の密度の違いと、骨髄系免疫細胞、例えば、ＮＫ、単球マクロファージ及び好中球のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰなどの機能の差異によって引き起こされたことを排除するものではなかった）。二つ例の患者がすべてＰＤ１抗体に反応しないことは以前の予測と一致し、患者の腫瘍微小環境におけるＰＤ１＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が極めて少ないため可能であった（図２６及び２７）。また、二つ例の患者と同じマウスのモデルの薬物感受性検出は、従来の一例の患者と１匹のマウスの接種モデルのデータとも一致した（図２７）。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫薬の有効性の迅速なスクリーニングに対して、コストとリソースを節約するために、同じマウスを使用して、複数の患者のカプセルをロードして検出することができ、異なる接種部位（本実験）、又は異なるカプセルのサイズ、又は異なる色分けに従って区別及び追跡することができる。
【0086】
ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫学的薬物機能的なスクリーニング方法の重要な意義は要約された：
（１）実施例１、実施例２、実施例３のデータは、初期ＰＤ１／ＰＤＬ１発現が弱いＴＩＬに富む卵巣がん患者の一部がＰＤ１抗体に対して良好な反応を示すことを見出すのに当該方法が良好であることを示唆した。腫瘍浸潤リンパ球のＣＤ２７０の有意な発現又は差異の変化も、ＰＤ１抗体治療のバイオマーカーである可能性が高い（現在のところ、研究は報告されていない）。ＰＤ１が腫瘍組織で豊富に発現していても、腫瘍細胞及び免疫細胞の比率と存在量が不均衡であれば、免疫治療への反応にも影響を与える可能性があり、免疫療法と標的療法の組み合わせは、単剤治療の非反応を克服する効果的な方法である可能性がある（この議論は実施例４でも支持される）。
（２）実施例５、実施例６及び実施例７のデータは、当該方法がＣＤ３８抗体又はＰＤ１抗体に対するＣＤ３８＋／ｈｉｇｈ及び（又は）ＴＩＬ ｅｎｒｉｃｈｅｄ血液腫瘍患者（例えば、ＡＭＬ）のｉｎ ｖｉｖｏでの免疫反応の差異反応を良好にスクリーニング及び区別できることを示唆した。既知の重要ながん促進／腫瘍感受性遺伝子の発見に加えて（これらの報告されたがん促進遺伝子は、分析された膜分子の全体的な差次的遺伝子の９０％以上を占め、当該モデルの信頼性を間接的に証明している）、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２（ＳＬＣ９Ａ３レギュレーター２）、ＰＩＧＷ（ホスファチジルイノシトールグリカンアンカー生合成クラスＷ）、ＣＤＨ２６（カドヘリン２６）とＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ（プロテインホスファターゼ１調節サブユニット１６Ｂ）という新しい潜在的な診断と治療標的も発見した。したがって、迅速な機能的な実験を介したオミクス分析は、新しい標的の発見と研究に有利である。
（３）実施例８は、同一マウスに同一疾患の複数の患者の腫瘍カプセルをロードすることができ、免疫学的薬物のｉｎ ｖｉｖｏでの迅速なスクリーニングを行った結果、一例の患者をロードした従来の免疫不全マウスの薬物有効性の感受性実験と一致し、コスト削減と効率向上に有益であることを示唆した。
（１）実施例１、実施例２、実施例３のデータは、初期ＰＤ１／ＰＤＬ１発現が弱いＴＩＬに富む卵巣がん患者の一部がＰＤ１抗体に対して良好な反応を示すことを見出すのに当該方法が良好であることを示唆した。腫瘍浸潤リンパ球のＣＤ２７０の有意な発現又は差異の変化も、ＰＤ１抗体治療のバイオマーカーである可能性が高い（現在のところ、研究は報告されていない）。ＰＤ１が腫瘍組織で豊富に発現していても、腫瘍細胞及び免疫細胞の比率と存在量が不均衡であれば、免疫治療への反応にも影響を与える可能性があり、免疫療法と標的療法の組み合わせは、単剤治療の非反応を克服する効果的な方法である可能性がある（この議論は実施例４でも支持される）。
（２）実施例５、実施例６及び実施例７のデータは、当該方法がＣＤ３８抗体又はＰＤ１抗体に対するＣＤ３８＋／ｈｉｇｈ及び（又は）ＴＩＬ ｅｎｒｉｃｈｅｄ血液腫瘍患者（例えば、ＡＭＬ）のｉｎ ｖｉｖｏでの免疫反応の差異反応を良好にスクリーニング及び区別できることを示唆した。既知の重要ながん促進／腫瘍感受性遺伝子の発見に加えて（これらの報告されたがん促進遺伝子は、分析された膜分子の全体的な差次的遺伝子の９０％以上を占め、当該モデルの信頼性を間接的に証明している）、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２（ＳＬＣ９Ａ３レギュレーター２）、ＰＩＧＷ（ホスファチジルイノシトールグリカンアンカー生合成クラスＷ）、ＣＤＨ２６（カドヘリン２６）とＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ（プロテインホスファターゼ１調節サブユニット１６Ｂ）という新しい潜在的な診断と治療標的も発見した。したがって、迅速な機能的な実験を介したオミクス分析は、新しい標的の発見と研究に有利である。
（３）実施例８は、同一マウスに同一疾患の複数の患者の腫瘍カプセルをロードすることができ、免疫学的薬物のｉｎ ｖｉｖｏでの迅速なスクリーニングを行った結果、一例の患者をロードした従来の免疫不全マウスの薬物有効性の感受性実験と一致し、コスト削減と効率向上に有益であることを示唆した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
