特開 2024-35303 タンパク質、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、プラズマローゲン含有組成物及びプラズマローゲンの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024035303

(43)【公開日】2024-03-14

(54)【発明の名称】タンパク質、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、プラズマローゲン含有組成物及びプラズマローゲンの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/52 20060101AFI20240307BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20240307BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240307BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240307BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240307BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240307BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240307BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240307BHJP

   C12P 7/64 20220101ALI20240307BHJP

【ＦＩ】

C12N15/52 Z

C12N9/00 ZNA

C12N15/31

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P7/64

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022139676

(22)【出願日】2022-09-02

(71)【出願人】

【識別番号】599035339

【氏名又は名称】株式会社 レオロジー機能食品研究所

(71)【出願人】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100168114

【弁理士】

【氏名又は名称】山中 生太

(74)【代理人】

【識別番号】100133592

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100162259

【弁理士】

【氏名又は名称】末富 孝典

(74)【代理人】

【識別番号】100146916

【弁理士】

【氏名又は名称】廣石 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100222922

【弁理士】

【氏名又は名称】和田 朋子

(72)【発明者】

【氏名】藤野 武彦

(72)【発明者】

【氏名】馬渡 志郎

(72)【発明者】

【氏名】土居 克実

(72)【発明者】

【氏名】本庄 雅則

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD02

4B050LL05

4B064AD85

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA08

4B064CA09

4B064CA10

4B064CA11

4B064CA19

4B064CA21

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA10

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA26X

4B065AA57X

4B065AA83

4B065AA86X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA13

4B065CA14

4B065CA27

4B065CA41

4B065CA44

(57)【要約】      （修正有）

【課題】好気的に増殖することができる細菌によってプラズマローゲンを生合成するためのタンパク質、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、プラズマローゲン含有組成物及びプラズマローゲンの製造方法を提供する。
【解決手段】タンパク質は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、プラズマローゲン合成活性を有する。（ａ）特定のアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）別の特定のアミノ酸配列、（ｄ）（ｃ）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、当該タンパク質を発現する細菌内においてプラズマローゲン合成活性を有する、タンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列

【請求項2】

請求項１に記載のタンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項4】

請求項３に記載の発現ベクターを含む、形質転換体。

【請求項5】

請求項４に記載の形質転換体又はその処理物を含む、
プラズマローゲン含有組成物。

【請求項6】

請求項４に記載の形質転換体を好気条件で培養する培養ステップと、
前記形質転換体からプラズマローゲンを得る取得ステップと、
を含む、
プラズマローゲンの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、プラズマローゲン含有組成物及びプラズマローゲンの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

プラズマローゲンは、抗酸化作用を有するリン脂質の一種で、グリセロリン脂質の一つである。プラズマローゲンは哺乳動物の全ての組織に存在し、人体のリン脂質の約１８％を占める。特に、プラズマローゲンは、脳神経、心筋、骨格筋、白血球及び精子に多いことが知られている。

【0003】

プラズマローゲンの多くは、ドコサヘキサエン酸及びアラキドン酸等の多価不飽和脂肪酸と結合しているため、多価不飽和脂肪酸の貯蔵、及びこれら多価不飽和脂肪酸から産生されるプロスタグランジン及びロイコトリエン等の細胞間シグナルの２次メッセンジャーの放出等に関与する。さらにプラズマローゲンは、細胞融合及びイオン移送等に関与している。プラズマローゲンのビニルエーテル結合（アルケニル結合）が特に酸化ストレスに敏感であるため、プラズマローゲンは細胞の抗酸化機能も果たしている。

【0004】

さらに、プラズマローゲンは神経新生の促進作用、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ）による神経炎症の抑制作用、及び脳内アミロイドβ（Ａβ）タンパクの蓄積の抑制作用等を有することが知られている。例えば、特許文献１には、プラズマローゲンを含む抗中枢神経系炎症剤が開示されている。

【0005】

プラズマローゲンは、認知症、パーキンソン病、うつ病及び統合失調症等の脳神経病の他、糖尿病、メタボリックシンドローム、虚血性心疾患、感染症及び免疫異常において減少していることが知られている。例えば、非特許文献１において、アルツハイマー病の脳でエタノールアミン型プラズマローゲンが前頭葉と海馬とで非常に有意に減少していることが報告された。さらに非特許文献２では、アルツハイマー病患者の血清でプラズマローゲンが減少していることが報告されている。非特許文献３では、虚血性心疾患の患者群において、コリン型プラズマローゲンが正常コントロール群に比べて減少していることが報告されている。

【0006】

減少しているプラズマローゲンを外的に補充することにより、それら疾患の予防及び改善効果が期待できると考えられる。したがって、今後、疾患の予防及び治療、あるいは健康維持のためにプラズマローゲンの需要が高まることが予想される。

【0007】

プラズマローゲンは、非脊椎動物及び脊椎動物には広く存在しているが、真菌及び植物細胞では確認されていない。細菌では、例えば非特許文献４に開示されたエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）及び特許文献２に開示されたビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）等のいくつかの偏性嫌気性菌によるプラズマローゲンの合成が報告されているが、通性嫌気性細菌及び好気性細菌にはプラズマローゲンは見られない（非特許文献５参照）。

【0008】

また、非特許文献４では、２種類のプラズマローゲン合成酵素遺伝子（ｐｌｓＡ、ｐｌｓＲ）が同定されており、好気的に増殖させた大腸菌においてウエルシュ菌（Clostridium perfringens）のプラズマローゲン合成酵素の発現を誘導したところ、プラズマローゲンは検出されなかったことが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開第２０１２／０３９４７２号

【特許文献2】国際公開第２０２１／０２４８７２号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Z. Guan et al, Decrease and Structural Modifications of Phosphatidylethanolamine Plasmalogen in the Brain with Alzheimer Disease, J Neuropathol Exp Neurol, 58 (7), 740-747, 1999

【非特許文献2】D. B. Goodenowe et al, Peripheral ethanolamine plasmalogen deficiency: a logical causative factor in Alzheimer's disease and dementia, J Lipid Res, 48, 2485-2498, 2007

【非特許文献3】真田竹生ら, 虚血性心疾患における血清Plasmalogenの動態, 動脈硬化, 11, 535-539, 1983

【非特許文献4】David R Jackson et al, Plasmalogen Biosynthesis by Anaerobic Bacteria: Identification of a Two-Gene Operon Responsible for Plasmalogen Production in Clostridium perfringens, ACS Chemical Biology, 11, 12, 3421-3430, 2021

【非特許文献5】Howard Goldfine, The appearance, disappearance and reappearance of plasmalogens in evolution, Progress in Lipid Research, 49, 4, 493-498, 2010

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

細菌によってプラズマローゲンを生合成できれば、細菌の培養によって容易かつ大量にプラズマローゲンを得ることができる。しかし、上述のように偏性嫌気性菌によってプラズマローゲンを生合成する場合、細菌を嫌気条件で培養する必要がある。嫌気条件での培養には酸素が入り込まない装置等を要し、特に培養の規模が大きくなると嫌気条件を維持するのが難しく煩雑となる。

【0012】

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、好気的に増殖することができる細菌によってプラズマローゲンを生合成するためのタンパク質、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、プラズマローゲン含有組成物及びプラズマローゲンの製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者は、嫌気性細菌由来のプラズマローゲン合成酵素遺伝子（ｐｌｓＡ）を好気性細菌に導入することで、好気条件でプラズマローゲンを合成することを見いだし、本発明を完成させた。

【0014】

本発明の第１の観点に係るタンパク質は、
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、当該タンパク質を発現する細菌内においてプラズマローゲン合成活性を有する。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列

【0015】

本発明の第２の観点に係るポリヌクレオチドは、
上記本発明の第１の観点に係るタンパク質をコードする塩基配列からなる。

【0016】

本発明の第３の観点に係る発現ベクターは、
上記本発明の第２の観点に係るポリヌクレオチドを含む。

【0017】

本発明の第４の観点に係る形質転換体は、
上記本発明の第３の観点に係る発現ベクターを含む。

【0018】

本発明の第５の観点に係るプラズマローゲン含有組成物は、
上記本発明の第４の観点に係る形質転換体又はその処理物を含む。

【0019】

本発明の第６の観点に係るプラズマローゲンの製造方法は、
上記本発明の第４の観点に係る形質転換体を好気条件で培養する培養ステップと、
前記形質転換体からプラズマローゲンを得る取得ステップと、
を含む。

【発明の効果】

【0020】

本発明によれば、好気的に増殖することができる細菌によってプラズマローゲンを生合成することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株由来ＰｌｓＡの構造を示す図である。

【図2】（Ａ）は実施例１におけるＣＢＢ染色像を示す図である。（Ｂ）は実施例１におけるウエスタンブロッティング像を示す図である。

【図3】（Ａ）は実施例２における対照大腸菌（ＢＬ２１）由来の試料のクロマトグラムを示す図である。（Ｂ）は実施例１で得た形質転換大腸菌由来の試料のクロマトグラムを示す図である。

【図4】（Ａ）は実施例３におけるホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）処理前の試料のクロマトグラムを示す図である。（Ｂ）は実施例３におけるＰＬＡ１処理した試料のクロマトグラムを示す図である。（Ｃ）は実施例３におけるＰＬＡ１処理後に塩酸（ＨＣｌ）処理した試料のクロマトグラムを示す図である。

【図5】（Ａ）は実施例４におけるウエスタンブロッティング像を示す図である。（Ｂ）は実施例４におけるｐＡＭＰＫ／ＡＭＰＫの相対活性を示す図である。

【図6】実施例５におけるＯｉｌＲｅｄ Ｏ染色した細胞を示す図である。

【図7】実施例６におけるウエスタンブロッティング像を示す図である。

【図8】実施例７における総脂質及びアルデヒドに係るクロマトグラムを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。

【0023】

（実施の形態１）
本実施の形態に係るタンパク質は、配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。当該タンパク質は、当該タンパク質を発現する細菌内、好ましくは好気的に増殖した細菌内において、プラズマローゲンの生合成を仲介するプラズマローゲン合成活性を有する。アミノ酸配列が配列番号１に示されるタンパク質は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株において同定された。アミノ酸配列が配列番号２に示されるタンパク質は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｉｓ亜種において同定された。

【0024】

ある２つのアミノ酸配列一致度が最大となるようにアラインメントしたときに、両方のアミノ酸配列において同一のアミノ酸が存在する部位の個数の、全長のアミノ酸の個数に対する割合を配列同一性という。また、同一のアミノ酸が存在する部位及び類似のアミノ酸が存在する部位の個数の、全長のアミノ酸の個数に対する割合を配列類似性という。

【0025】

“類似のアミノ酸”とは、物理化学的に類似の側鎖を有する別のアミノ酸である（保存的なアミノ酸置換）。物理化学的に類似する側鎖を有するアミノ酸は、例えば次のように分類される。
脂肪族側鎖：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）
脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）
アミド含有側鎖：アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）
芳香族側鎖：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）
塩基性側鎖：リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）
酸性側鎖：アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）
硫黄含有側鎖：システイン（Ｃ）及びメチオニン（Ｍ）

【0026】

また、類似のアミノ酸は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ等の配列解析ツールで用いられるＰＡＭ２５０等の類似性を定義した行列に基づくスコアが所定の閾値より大きいアミノ酸同士であってもよい。ＰＡＭ２５０を使用した場合、類似性が強いアミノ酸は、例えばアミノ酸間のスコアが０．５より大きいアミノ酸同士であって、下記のグループ１～９において同一のグループに分類されるアミノ酸同士である。
グループ１ Ｓ、Ｔ及びＡ
グループ２ Ｎ、Ｅ、Ｑ及びＫ
グループ３ Ｎ、Ｈ、Ｑ及びＫ
グループ４ Ｎ、Ｄ、Ｅ及びＱ
グループ５ Ｑ、Ｈ、Ｒ及びＫ
グループ６ Ｍ、Ｉ、Ｌ及びＶ
グループ７ Ｍ、Ｉ、Ｌ及びＦ
グループ８ Ｈ及びＹ
グループ９ Ｆ、Ｙ及びＷ

【0027】

なお、類似性を定義した行列は、公知の行列を用いればよく、ＰＡＭの他にＢＬＯＳＵＭ等を使用してもよい。

【0028】

アミノ酸配列に関する“８０％以上の配列同一性”とは、少なくとも８０％の配列同一性を意味する。当該タンパク質のアミノ酸配列は、プラズマローゲン合成活性を有する限り、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有してもよい。

【0029】

本実施の形態に係るタンパク質が配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる場合、当該プタンパク質は、上記プラズマローゲン合成活性を有する限り、翻訳の効率を向上させるためのアミノ酸配列の他、当該タンパク質の精製に利用するアミノ酸配列及びシャペロン等の発現効率を向上させるアミノ酸配列等を有してもよい。タンパク質の精製に利用するアミノ酸配列としては、例えば、ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ及びマルトース結合タンパク質等が挙げられる。翻訳の効率を向上させるためのアミノ酸配列、精製に利用するアミノ酸配列及び発現効率を向上させるアミノ酸配列は、Ｎ末端及びＣ末端の少なくとも一方に付加される。Ｎ末端又はＣ末端に付加されるアミノ酸は、例えば数個であって、好ましくは１～９個である。

【0030】

続いて、本実施の形態に係るタンパク質の製造方法について説明する。タンパク質は、そのアミノ酸配列にしたがって、固相法及び液相法等の公知の方法で化学合成できる。タンパク質は、次のように遺伝子工学及び分子生物学を利用した方法により製造するのが好ましい。

【0031】

まず、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定する。塩基配列は、アミノ酸に対応するコドンによって決定される。アミノ酸とコドンとの対応関係に基づいて、１つのアミノ酸配列から、そのアミノ酸配列をコードする多数の塩基配列が決定される。塩基配列の決定ではコンピュータを用いてもよい。当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を発現させる際に用いる宿主のコドン使用頻度等を考慮すれば、タンパク質をコードする好適な塩基配列を決定することができる。ポリヌクレオチドは、塩基配列に従って公知の方法で合成することができる。また、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株又はＢ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｉｓ亜種のｃＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって得られる増幅産物としてポリヌクレオチドを取得してもよい。

【0032】

次に、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを調製する。発現ベクターは、当該ポリヌクレオチドを発現させることができれば特に限定されない。好ましくは、発現ベクターは、組み入れたポリヌクレオチドを発現させるＲＮＡポリメラーゼが結合するプロモーター配列、オペレーター配列及びリボソーム結合サイト（ＲＢＳ）等を含む。発現ベクターでは、プロモーター配列の制御下に上記ポリヌクレオチドを配置すればよい。プロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター等の公知のプロモーター配列が利用できる。必要に応じて、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端にクローニングのための制限酵素サイトを付加してもよいし、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端にヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ等をコードする塩基配列を付加してもよい。制限酵素を用いる場合、タンパク質をコードするポリヌクレオチド内に含まれる制限酵素サイトの塩基配列を同義置換してもよい。

【0033】

上記の発現ベクターを、例えば、発現誘導剤等の存在下で上述のプロモーター配列に結合するＲＮＡポリメラーゼを発現可能な宿主に導入することによって、上記タンパク質を宿主において発現させることができる。宿主は、特に限定はされないが、好気的に増殖することができる原核細胞であることが好ましい。具体的には、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物細胞及び動物細胞等が挙げられるが、上述のポリヌクレオチドを効率的に発現させることを勘案すれば、大腸菌であることが好ましい。

【0034】

宿主として用いる大腸菌は、公知の大腸菌を採用すればよく、特に限定はされないが、発現誘導剤の存在下において、上記ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の発現を誘導できることが望ましい。発現誘導剤としては、例えばＩＰＴＧ、ラムノース又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。このような大腸菌として、例えば、発現誘導剤の存在下で当該タンパク質を発現させるＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するバクテリオファージλＤＥ３の溶原菌であるＢＬ２１（ＤＥ３）株等がある。発現ベクターは、発現誘導剤の存在下において発現するＲＮＡポリメラーゼによって、上述のポリヌクレオチドの発現を誘導できることが好ましい。発現ベクターとして、例えば、ｐＥＴベクター（例えばｐＥＴ－２１ａ（＋）及びｐＥＴ－２４ａ（＋）等）及びｐＧＥＸベクター等が挙げられる。

【0035】

続いて、上記で調製した発現ベクターを宿主に導入した形質転換体を調製する。発現ベクターを宿主に導入する方法は特には限定されず、塩化カルシウム法及び塩化ルビジウム法で調製したコンピテントセルを用いる方法、エレクトロポレーション法、並びにプロトプラスト法等がある。

【0036】

なお、上述の発現ベクターがｐＥＴ－２１ａ（＋）の場合、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換体として用いるのが好ましい。形質転換体のコロニーを、ダイレクトＰＣＲにより、又はそのＤＮＡの塩基配列を決定して確認することで目的とする形質転換体を得ることができる。

【0037】

なお、宿主のコロニーが得られない場合、発現ベクターとして、上述の発現誘導剤の存在下でタンパク質を発現させるＲＮＡポリメラーゼが結合するプロモーター配列に加えて、当該ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子と、発現誘導剤の非存在下で発現したＲＮＡポリメラーゼを阻害するリゾチームをコードする遺伝子をさらに有する発現ベクターを使用してもよい。ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子及びリゾチームをコードする遺伝子は発現ベクターに含まれていなくてもよく、形質転換される宿主が有していてもよい。この場合、発現誘導剤の存在下で発現するＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子と、発現誘導剤の非存在下で発現したＲＮＡポリメラーゼを阻害するリゾチームをコードする遺伝子を有する宿主に発現ベクターが導入されてもよい。このような宿主として、上記リゾチームをコードする遺伝子を有するプラスミドを導入した宿主、例えばＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ株等が用いられる。すなわち、形質転換体は、上記のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと当該ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質を発現させるＲＮＡポリメラーゼが結合するプロモーター配列とを有する発現ベクター、発現誘導剤の存在下で発現するＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、及び発現誘導剤の非存在下で発現したＲＮＡポリメラーゼを阻害するリゾチームをコードする遺伝子を有する。

【0038】

調製した形質転換体は、好ましくは好気条件で培養することでプラズマローゲンを合成する。好気条件とは、雰囲気中に酸素が含まれる状態をいう。好気条件には微好気条件も含まれる。特には、好気条件とは、微生物の嫌気条件での培養に使用する試薬及び装置を使わずに培養することである。

【0039】

形質転換体の培養方法は、形質転換体に適合した公知の培養方法を採用すればよい。大腸菌を形質転換体として用いる場合、例えば、ＬＢ寒天培地又はＬＢ液体培地等において培養すればよい。

【0040】

プラズマローゲンは、グリセロール骨格のｓｎ－１位にビニルエーテル結合を有し、ｓｎ－２位にエステル結合を有することで特徴づけられるグリセロリン脂質に特有のサブクラスに属する。本実施の形態におけるプラズマローゲンは、一般にプラズマローゲンに分類されるグリセロリン脂質であれば特に制限されない。プラズマローゲンとして、例えば、エタノールアミン型プラズマローゲン（Ｐｌｓ）、コリン型プラズマローゲン（ＰｌｓＣｈｏ）、イノシトール型プラズマローゲン及びセリン型プラズマローゲン等を挙げることができる。なお、Ｐｌｓはグリセロール骨格のｓｎ－３位におけるリンに結合する酸素原子に－ＣＨ_２ＣＨ_２２ＮＨ_２が結合した構造を有する。ＰｌｓＣｈｏはグリセロール骨格のｓｎ－３位におけるリンに結合する酸素原子に－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ（ＣＨ_３）_３が結合した構造を有する。本実施の形態に係る形質転換体が合成するプラズマローゲンは、ｓｎ－１位の酸素原子に結合する炭素鎖を構成する炭素数が多様で、哺乳類が有するプラズマローゲンに加え、当該炭素数が哺乳類では見られない炭素数であるプラズマローゲンも含有する。

【0041】

本実施の形態に係る形質転換体は、下記実施例に示されたように、好気条件でもプラズマローゲンを合成することができる。このため、培養の雰囲気を嫌気条件に維持する必要がなく簡便にプラズマローゲンを得ることができる。

【0042】

（実施の形態２）
本実施の形態に係るプラズマローゲン含有組成物は、上記実施の形態１に係る形質転換体又はその処理物を含む。形質転換体の宿主が細菌である場合、菌体は培養後の培養液の遠心分離による沈殿として得ることができる。

【0043】

菌体の処理物は、例えば、凍結乾燥させた菌体、アセトンで乾燥させた菌体、菌体に対して溶媒抽出処理を施した抽出物及び菌体又は乾燥菌体を超音波等で破砕した破砕物等、菌体に何らかの処理を加えて得られる菌体、菌体由来の、又は菌体の一部を含む組成物である。溶媒抽出に用いる溶媒としては、水、有機溶媒及びこれらの混合物を用いることができる。有機溶媒としては、エーテル、クロロホルム、ベンゼン、ヘキサン、メタノール、エタノール、イソプロパノール及びこれらの混合溶液等が例示される。抽出溶媒を用いて抽出された抽出物は、液状のまま、又は濃縮若しくは希釈して、液状、ゲル状あるいはペースト状の形態で用いることができる。さらに、これを乾燥した乾燥物として用いることができる。乾燥は、噴霧乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥及び流動乾燥等の公知の方法で行うことができる。

【0044】

本実施の形態に係るプラズマローゲン含有組成物は、形質転換体によって合成されたプラズマローゲンを含有する。したがって、プラズマローゲン含有組成物は、生体におけるプラズマローゲンを外的に補充するのに有用である。例えば、プラズマローゲン含有組成物は、プラズマローゲンが減少している疾患の治療及び予防に使用される。当該疾患としては、例えば、炎症性疾患、中枢神経系炎症疾患、認知症、パーキンソン病、うつ病、統合失調症、糖尿病、メタボリックシンドローム、虚血性心疾患、感染症及び免疫異常等が挙げられる。

【0045】

別の実施の形態では、プラズマローゲン含有組成物は、上記に例示したプラズマローゲンが減少している疾患の治療薬又は予防薬として使用される。また、他の実施の形態では、プラズマローゲン含有組成物は、上記に例示したプラズマローゲンが減少している疾患の治療薬又は予防薬として使用される。また、別の実施の形態では、上記実施の形態１に係る形質転換体の菌体又はその処理物を含む、プラズマローゲンが減少している疾患の治療用経口組成物が提供される。当該経口組成物としては、具体的には、サプリメント、食品組成物、飲食品、機能性食品及び食品添加剤が挙げられる。

【0046】

なお、別の実施の形態では、上記実施の形態１に係る形質転換体を使用したプラズマローゲンの製造方法が提供される。プラズマローゲンの製造方法は、培養ステップと、取得ステップと、を含む。培養ステップでは、上述のように、当該形質転換体を好気条件で培養する。取得ステップでは、当該形質転換体からプラズマローゲンを得る。取得ステップでは、上記のように溶媒抽出及び超音波等を介した破砕等で菌体を処理することでプラズマローゲンを得ることができる。取得ステップで得たプラズマローゲンを、公知の方法で精製、あるいはプラズマローゲンを単離してもよいし、精製したプラズマローゲンを濃縮してもよい。

【0047】

（実施例１．Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株由来プラズマローゲン合成酵素遺伝子の形質転換大腸菌の作製）
［Ｋ４ ｐｌｓＡのクローニング］
通性嫌気性の乳酸菌であるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株由来ｐｌｓＡ遺伝子（以下、「Ｋ４ ｐｌｓＡ」ともいう）を以下の方法により探索した。

【0048】

Ｈｉｓｅｑ（登録商標）２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いた２５０ＰＥ（ペアエンド）及びＭｉｎＩＯＮ（登録商標）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）よるＤｅ ｎｏｖｏ解析によりドラフトゲノム解析し、ＣＤＳリストを作成した。それを用いたｂｌａｓｔ解析により、ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドラターゼと推定された遺伝子（Ｋ４ ｐｌｓＡ）を１つ見出した。

【0049】

上記解析により、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株由来プラズマローゲン合成酵素タンパク質（以下、「Ｋ４ ＰｌｓＡタンパク質」ともいう）のアミノ酸配列は、配列番号１に示される１４１６アミノ酸からなる配列であり、ＮＣＢＩ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍｌ）による予測により、Ｎ末端側から順に、２５７アミノ酸からなるＮＢＤ糖キナーゼＨＳＰ７０アクチンスーパーファミリードメイン、４２９アミノ酸からなるＹｊｉＬドメイン、３５５アミノ酸と４０２アミノ酸からなる２－ヒドロキシグルタリル－ＣｏＡデヒドラターゼＤコンポーネントを含有していると考えられる（図１）。なお、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ（ゼネティックス社製）による推定分子量は１５６９９０、推定の等電点は５．７７であった。

【0050】

Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株をＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）にて３７℃、１晩培養後、ゲノムＤＮＡを得た。得られたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４に示される塩基配列をからなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐｌｓＡと推察される遺伝子の開始コドン及び終止コドンを除いたＤＮＡにおいて、５’末端にヒスチジンタグ及びＳＵＭＯタグを付加して増幅した。得られたＰＣＲ産物を、発現ベクターであるｐＥＴｉｔｅ Ｎ－ＨＩＳ ＳＵＭＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に挿入して、組換えプラスミド（ｐＥＴｉｔｅ Ｎ－ＨＩＳ ＳＵＭＯ／ｐｌｓＡ）を得た。

【0051】

得られた組換えプラスミドを大腸菌（ＨＩ－Ｃｏｎｔｒｏｌ １０Ｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））に導入し、形質転換大腸菌を得た。得られた形質転換大腸菌を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬのＬＢ培地で、３７℃にて一晩培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を回収した。菌体はＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いプラスミドを精製した。精製プラスミドを用い、ＨＩ－Ｃｏｎｔｒｏｌ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を形質転換した。

【0052】

［形質転換大腸菌におけるＫ４ ＰｌｓＡの発現］
得られた形質転換大腸菌を、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で、３０℃で一晩培養した。対照として、形質転換していない大腸菌（ＢＬ２１株）を、カナマイシンを含まないＬＢ培地で、３０℃で一晩培養した。それぞれの培養液３００μｌをＺＹＭ５０５２培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ， Ｆ．Ｗ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ４１， ２０７－２３４）に移し、嫌気条件下及び好気条件下で、３０℃で２４時間培養した。培養液を遠心分離し、ＣＢＢ染色、及び抗ヒスチジン抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。

【0053】

（結果）
図２（Ａ）及び図２（Ｂ）は、それぞれＣＢＢ染色の結果及びウエスタンブロッティングの結果を示す。「ＢＬ２１」は形質転換していない大腸菌、「ＢＬ２１＋ｐｌｓＡ」は本実施例で得られた形質転換大腸菌である。図２（Ｂ）に矢示するように、嫌気条件下及び好気条件下で培養された形質転換大腸菌のいずれもＫ４ ＰｌｓＡタンパク質を発現していることが観察された。

【0054】

（実施例２．Ｋ４ ｐｌｓＡ形質転換大腸菌におけるプラズマローゲンの産生）
［菌体からの脂質抽出及びリン脂質の検出］
実施例１で得られた形質転換大腸菌、及び対照として形質転換していない大腸菌（ＢＬ２１株）を、空気存在下で、１８時間振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離し、菌体を回収した。菌体に生理食塩水を加えて混和し、遠心分離後、上清を取り除くことで菌体を洗浄した。菌体にさらに生理食塩水を加えて再洗浄した。上清を取り除き、使用するまで－３０℃で保管した。

【0055】

解凍した菌体の総重量を測定した。１ｍＬの水を菌体に添加して混和後、３．７５ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）を添加して混和した。１０分間超音波処理し、室温に３０分間置いた。１．２５ｍＬのクロロホルムを加え、次いで１．２５ｍＬの水を加えた。遠心分離後、クロロホルム層をガラス管に移し、残った水層を２ｍＬのクロロホルムで再抽出した。合わせたクロロホルム層を窒素ガス下で乾燥し、ヘキサン／イソプロパノール（３：２、ｖ／ｖ）に、菌体濃度が１２０ｍｇ／ｍＬとなるように再懸濁し、０．４５μｍフィルターで濾過した。菌体懸濁液１０μＬを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に注入し、蒸発光散乱器（ＥＬＳＤ）で検出した。

【0056】

脂質標準試料として、ホスファチジルコリン（２５ｍｇ、クロロホルムに５ｍｇ／ｍＬ、Ａ－２９Ｂ、ＳＲＬ社製）を窒素ガスで乾固し、イソプロパノール／クロロホルム（２：１、ｖ／ｖ）を１ｍＬ加えて混和した。試料を超音波で溶解して－３０℃に脂質ストックとして保管した。脂質ストックをＨＩＰ（ヘキサン／イソプロパノール（３：２、ｖ／ｖ））で系列希釈し、脂質標準液を調製した。脂質標準液を０．４５μｍのフィルターを通した後、１０μＬをＨＰＬＣ用のサンプルとした。

【0057】

ＨＰＬＣの条件は次の通りである。
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ ＤＩＯＬ（２５０×３ｍｍ、５μｍ、メルク社製）
移動相Ａ：０．０８％トリエチルアミンを含むヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１）
移動相Ｂ：０．０８％トリエチルアミンを含むイソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１）
流量：０．８ｍＬ／分
カラム温度：５０℃
グラジエント：
０分 移動相Ａ ９６％ 移動相Ｂ ４％
２１分 移動相Ａ ６３％ 移動相Ｂ ３７％
２５分 移動相Ａ １５％ 移動相Ｂ ８５％
２６分 移動相Ａ １５％ 移動相Ｂ ８５％
２９分 移動相Ａ ９６％ 移動相Ｂ ４％
３４分 移動相Ａ ９６％ 移動相Ｂ ４％

【0058】

ＥＬＳＤの条件は次の通りである。
エバポレータ温度：６０℃
ネブライザー温度：３０℃
窒素ガス流量：１．００ ＳＬＭ

【0059】

濃度の異なる脂質標準液についてもＨＰＬＣ－ＥＬＳＤで検出した。各濃度のピーク面積で検量線を作成し、大腸菌から得られた保持時間１０～２０分のリン脂質に相当するピークの面積比からリン脂質量を算出した。

【0060】

［酸加水分解処理によるプラズマローゲンの変化］
上述のように菌体からクロロホルム／メタノールで抽出し、窒素ガスで乾燥させた脂質に０．５ｍＬの２，４－ジニトロフェニルヒドラジン－塩酸塩溶液（ＤＮＰＨ－ＨＣｌ溶液、東京化成工業社製）を添加し混和した。超音波処理により乳化させた後、室温に３０分置き、酸加水分解された脂質に０．５ｍＬの超純水を添加して混和後、１．９ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）を添加して混和した。室温に１０分間置き、０．６２５ｍＬのクロロホルムを加えて混和した。続いて０．６２５ｍＬの水を加えて混和した。室温にて３０００ｒｐｍで遠心分離後、クロロホルム層をガラス管に移し窒素ガス下で乾燥した。乾燥させた脂質をアセトニトリル１００μＬに再懸濁した後、０．４５μｍのフィルターを通した。１０μＬをＨＰＬＣ用のサンプルとして、ＨＰＬＣに注入し、波長３５６ｎｍのＵＶ（紫外線）で検出した。

【0061】

標準として使用したアルデヒド標準溶液について以下のように調製した。テトラデカノール（Ｃ_１４Ｈ_２８Ｏ、東京化成工業社製、Ｔ２６９６）、ヘキサデカノール（Ｃ_１６Ｈ_３２Ｏ、東京化成工業社製、Ｈ１２９６）、ヘプタデカノール（Ｃ_１７Ｈ_３４Ｏ、東京化成工業社製、Ｈ１２９５）及びオクタデカノール（Ｃ_１８Ｈ_３６Ｏ、東京化成工業社製、Ｏ０３６８）を別々のスピッツに取り、アセトニトリルで１ｍｇ／ｍＬとした。調製した１ｍｇ／ｍＬの溶液２００μＬ（Ｃ_１４Ｈ_２８Ｏのみ１００μＬ、２００μＬ及び４００μＬ）を別々のスピッツに取り、窒素ガスで乾固した試料にＤＮＰＨ－ＨＣｌ溶液を０．５ｍＬ加えて混和した。超音波でエマルジョン化させ、試料を３０分間室温に置いた。超純水０．５ｍＬとクロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）１．９ｍＬとを試料に加え、ボルテックス混和した。室温に１０分間置き、クロロホルム０．６２５ｍＬを加え、ボルテックスで混和した。試料に超純水０．６２５ｍＬ加え、ボルテックスで混和した。試料を５分間、室温で遠心（３０００ｒｐｍ）した。下層を別のスピッツに移し、窒素ガスで乾固し、これをアセトニトリル２ｍＬに溶解してストックアルデヒド標準液として－３０℃に保管した。

【0062】

Ｃ_１４Ｈ_２８Ｏのストックアルデヒド標準液を各濃度１２０μＬ取り、０．４５μｍフィルターで濾過し、１０μＬをＨＰＬＣに注入した。４種のアルデヒドを混合した混合アルデヒド標準溶液を調製するために、４種類のストックアルデヒド標準液を各３０μＬずつ取り混和した。得られた混合アルデヒド標準溶液を０．４５μｍフィルターで濾過し、１０μＬをＨＰＬＣに注入した。

【0063】

ＨＰＬＣの条件は次の通りである。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＡ Ｃ１８（３．０×１５０、２．５μｍ、Ｗａｔｅ
ｒｓ社製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：アセトニトリル
移動相Ｂ：水
流量：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
グラジエント：
０分 移動相Ａ ３０％ 移動相Ｂ ７０％
２５分 移動相Ａ １００％ 移動相Ｂ ０％
４０分 移動相Ａ １００％ 移動相Ｂ ０％
４０．１分 移動相Ａ ３０％ 移動相Ｂ ７０％
５０分 移動相Ａ ３０％ 移動相Ｂ ７０％

【0064】

アルデヒドの算出はリン脂質と同様に面積比で算出した。

【0065】

（結果）
図３に、波長３５６ｎｍのＵＶで検出した実施例１に係る形質転換大腸菌及び対照大腸菌の各試料のクロマトグラムを示す。図３（Ａ）及び図３（Ｂ）はそれぞれ対照大腸菌（ＢＬ２１）及び実施例１に係る形質転換大腸菌の結果である。対照大腸菌試料ではアルデヒドは検出されないが、当該形質転換大腸菌試料においてアルデヒドが検出された。プラズマローゲンは酸加水分解によってアルデヒドを生成することから、好気的に増殖した当該形質転換大腸菌においてプラズマローゲンが産生されることが示された。

【0066】

（実施例３．ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）処理及び塩酸（ＨＣｌ）処理によるプラズマローゲンの変化）
実施例１で得られた形質転換大腸菌を、ＺＹＭ５０５２培地で、アネロパックを用いて嫌気的に静置培養した。実施例２に記載された手順にしたがって菌体から脂質を抽出した。

【0067】

［ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）による全脂質の加水分解処理によるリン脂質の変化］
総脂質の一定分量をＰＬＡ１で加水分解した。ＳＩＧＭＡ社から購入したＰＬＡ１溶液０．５ｍｌを０．５ｍｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で調製し、１ｍＬの酵素溶液を総脂質抽出物に添加した。超音波浴で乳化した後、懸濁液を４５℃で６０分間インキュベートした。脂質をヘキサン／イソプロパノールで抽出し、合わせたヘキサン層を窒素ガス下で乾燥した。脂質をヘキサン／イソプロパノール（３：２、ｖ／ｖ）で再調製し、ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤに注入した。なお、ＰＬＡ１として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＰＬＡ１（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ１）（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。酵素の最小活性は、１０ＫＬＵ／Ｇ ｌｉｑｕｉｄである。

【0068】

［酸加水分解処理によるエーテルリン脂質（プラズマローゲン）の変化］
続いて、エーテルリン脂質（プラズマローゲン）を、２，４－ジニトロフェニルヒドラジン－塩酸塩溶液（ＤＮＰＨ－ＨＣｌ溶液）によって酸加水分解した。ＰＬＡ１加水分解後に、０．５ｍＬのＤＮＰＨ－ＨＣｌ溶液を乾燥エーテルリン脂質に添加した。室温で３０分後、加水分解されたエーテルリン脂質を上記のクロロホルム－メタノール法で抽出し、クロロホルム層を窒素ガス下で乾燥した。乾燥した脂質をヘキサン／イソプロパノール（３：２ ｖ／ｖ）で再調製し、一定分量をＨＰＬＣ－ＥＬＳＤに注入した。

【0069】

（結果）
図４（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれＰＬＡ１処理前の総脂質、ＰＬＡ１処理後及びＰＬＡ１処理後に塩酸処理した試料のクロマトグラムを示す。ＰＬＡ１処理によりエーテルリン脂質とスフィンゴミエリンを除くリン脂質が分解されるが、プラズマローゲンは残存し、ＰＬＡ１処理後に塩酸処理するとプラズマローゲンが選択的に分解される。したがって、これらのクロマトグラムから、嫌気的に増殖した当該形質転換大腸菌においてプラズマローゲンが産生されることが示された。

【0070】

（実施例４．精製プラズマローゲンによるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のリン酸化）
実施例１の形質転換大腸菌から精製したプラズマローゲン０．５μｇをＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁しＮＩＨ－３Ｔ３の培養液（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）に添加し、３時間後に細胞を回収した。次いで、抗ｐＡＭＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、カタログ番号２５３１）及び抗ＡＭＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、カタログ番号５８３１）を用いてウエスタンブロッティングを行った。さらにＡＭＰＫ及びリン酸化ＡＭＰＫ（ｐＡＭＰＫ）のタンパク質を定量化し、ｐＡＭＰＫ／ＡＭＰＫの相対値を求めた。

【0071】

（結果）
ウエスタンブロッティングの結果を図５（Ａ）に、ｐＡＭＰＫ／ＡＭＰＫの相対活性を図５（Ｂ）に示す。それぞれ、左側が精製プラズマローゲンを添加していない対照サンプル、右側が精製プラズマローゲンを添加したサンプルである。精製プラズマローゲンを添加したサンプルのほうがｐＡＭＰＫ／ＡＭＰＫの値が統計的に有意に大きかった（ｐ＜０．０１）。このことから、実施例１の形質転換大腸菌で合成されたプラズマローゲンがＡＭＰＫのリン酸化に寄与することが示された。ＡＭＰＫはリン酸化されることにより活性化し、糖代謝及び脂質代謝等に関わることが知られている。したがって、当該プラズマローゲンは、糖代謝又は脂質代謝等に関わる様々な疾患、例えば、２型糖尿病、脂質異常症、肥満症等の予防及び治療に効果的であることが示唆された。

【0072】

（実施例５．精製プラズマローゲンによる脂肪滴形成の抑制）
予めオレイン酸（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を４％ｄｅｆａｔ－ＢＳＡ溶液と混合し、終濃度１５０μＭのオレインサインを含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ培養液に、実施例１の形質転換大腸菌から精製したプラズマローゲン０．５μｇ／ｍｌを添加し、マウス胎児線維芽細胞（ＮＩＨ－３Ｔ３細胞）を１８時間培養した。対照としてプラズマローゲンを含まない培養液で培養した。細胞を回収、洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。次いで、６０％イソプロパノール溶液処理の後、ＯｉｌＲｅｄ Ｏ染色液（ＯｉｌＲｅｄ Ｏ（Ｓｉｇｍａ社製）を水で１．７倍希釈）で１５分染色、６０％イソプロパノールで洗浄、ヘマトキシリン溶液（ヘマトキシリン（Ｍｅｒｋ社製）を水で１０倍希釈）で３０秒染色、水で洗浄、包埋し観察した。

【0073】

（結果）
ＯｉｌＲｅｄ Ｏ染色した細胞の写真を図６に示す。精製プラズマローゲンを含まない培養液で培養した対照（プラズマローゲン－）では多数の脂肪滴が観察されるのに対し、精製プラズマローゲンを含む培養液で培養した細胞（プラズマローゲン＋）では脂肪滴がほとんど観察されなかった。このことから、実施例１の形質転換大腸菌で合成されたプラズマローゲンが脂肪形成の抑制・脂肪分解に寄与することが示され、脂質異常症及び肥満症等の予防及び治療に効果的であることが示唆された。

【0074】

（実施例６．Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｉｓ亜種由来ｐｌｓＡ人工遺伝子の形質転換大腸菌の作製）
［ｓｕｉｓ ｐｌｓＡのクローニング］
絶対嫌気性のビフィズス菌であるＢ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｉｓ亜種由来ｐｌｓＡ人工遺伝子（以下、「ｓｕｉｓ ｐｌｓＡ」ともいう）の人工合成を以下の方法により行った。

【0075】

Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｉｓ亜種の基準株ＤＳＭ２０２１１の登録ゲノム配列（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｓｕｉｓ ＤＳＭ ２０２１１ ｃｏｎｔｉｇ３， ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｏｔｇｕｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＺ＿ＪＤＵＣ０１０００００３．１）の６５６６７－７０５８６領域を選抜し、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて大腸菌発現用に最適化した塩基配列を人工合成し、これをＣＡＣＣ（一本鎖ＤＮＡ）と共にｐＥＴ１００ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のクローニング部位にライゲーションした。

【0076】

本遺伝子から翻訳されるＰｌｓＡタンパク質（以下、「ｓｕｉｓ ＰｌｓＡタンパク質」ともいう）のアミノ酸配列は、配列番号２に示される１６３９アミノ酸からなる配列であり、ＮＣＢＩ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍｌ）による予測により、Ｎ末端側から順に、２５７アミノ酸からなるＮＢＤ糖キナーゼＨＳＰ７０アクチンスーパーファミリードメイン、４２９アミノ酸からなるＹｊｉＬドメイン、３７０アミノ酸からなるＣＯＧ３５８０ドメイン及び４０１アミノ酸からなる２－ヒドロキシグルタリル－ＣｏＡ デヒダラターゼＤ－コンポーネントを含有していると考えられる。なお、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ（ゼネティックス社製）による推定分子量は１７８７１５、推定の等電点は５．９０であった。

【0077】

得られた組換えプラスミドを用い、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（ＣｈａｍｐｉｏｎＴＭ２１；ＳＭＯＢＩＯ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）に導入し、形質転換大腸菌を得た。

【0078】

得られた形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１０ｍＬのＬＢ培地で、３７℃にて一晩培養した。同培養液３ｍＬを１００ｍＬのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ Ｍｅｄｉｕｍ（メルク社製）で３７℃にて一晩培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を回収した。菌体は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁後、超音波破砕して形質転換大腸菌由来の抽出液を得た。さらに、細胞抽出液を１４，０００ｒｐｍ、１５分で遠心分離して上清を得た。

【0079】

［形質転換大腸菌によるｓｕｉｓ ＰｌｓＡタンパク質の発現］
得られた形質転換大腸菌が好気条件下で目的のｓｕｉｓ ＰｌｓＡタンパク質を発現するか確認するために、以下の３種類の方法で培養したサンプルを調製した。
培養方法１：形質転換大腸菌を、ＬＢ培地で、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とうして前培養した。その後、新しいＬＢ培地１０ｍｌに３％植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とう培養した。
培養方法２：形質転換大腸菌を、ＬＢ培地で、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とうして前培養した。その後、新しいＬＢ培地１０ｍｌに３％植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで振とう培養し、ＯＤ６６０が０．４に達したときにＩＰＴＧ誘導（０．５ｍＭ）し、その後、３７℃、１５０ｒｐｍで３時間振とう培養した。
培養方法３：形質転換大腸菌を、ＬＢ培地で、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とうして前培養した。その後、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ Ｍｅｄｉｕｍ（メルク社製）１０ｍＬに３％植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とう培養した。

【0080】

得られた培養液を遠心分離して菌体を回収した。菌体は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁後、超音波破砕して形質転換大腸菌由来の抽出液を得た。さらに、細胞抽出液を１４，０００ｒｐｍ、１５分で遠心分離して上清を得た。各サンプルに関し、体積当たりの菌体重量が同じになるように泳動バッファーに溶解し、等量を電気泳動後、抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製、６６００５－１－Ｉｇ）を用いてウエスタンブロッティングを行った。

【0081】

（結果）
ウエスタンブロッティングの結果を図７に示す。サンプル番号２、５は培養方法１のサンプル、サンプル番号１、４は培養方法２のサンプル、サンプル番号３、６は培養方法３のサンプルである。また、サンプル番号１、２、３は１０μｌ、サンプル番号４、５、６は２０μｌ泳動した。図中に矢示するように、サンプル番号３、６で目的のサイズのバンドが確認され、当該形質転換大腸菌がｓｕｉｓ ＰｌｓＡタンパク質を発現することが確認された。

【0082】

（実施例７．ｓｕｉｓ ｐｌｓＡ形質転換大腸菌におけるプラズマローゲンの産生）
実施例６で得られた形質転換大腸菌を静置培養又は振とう培養し、対象として形質転換していない大腸菌（ＢＬ２１株）を用いた。実施例２に記載された手順にしたがって、菌体からの脂質抽出、リン脂質の検出、酸加水分解処理、及びアルデヒドの検出を行った。

【0083】

(結果）
図８にＥＬＳＤで検出した各試料及びＤＮＰＨ－ＨＣｌ溶液で処理した各試料のクロマトグラムを示す。静置培養及び振とう培養のいずれでも、形質転換大腸菌においてアルデヒドが検出された。一方、形質転換していない大腸菌ではアルデヒドが検出されなかった。プラズマローゲンは酸加水分解によってアルデヒドを生成することから、形質転換大腸菌においてプラズマローゲンが産生されることが示された。したがって、ｓｕｉｓ ＰｌｓＡタンパク質は、好気的に増殖した大腸菌においてプラズマローゲン合成活性を有することが示された。

【0084】

検量線から求めた大腸菌の菌体湿重量１ｍｇあたりのリン脂質及びアルデヒドの重量を表１に示す。

【0085】

【表1】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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