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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024035693
(43)【公開日】2024-03-14
(54)【発明の名称】ＡＬＤＨ２活性向上核酸分子及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240307BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240307BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240307BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240307BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240307BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240307BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20240307BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240307BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240307BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/63 Z
A61K31/713
A61K48/00
A61K47/54
A61P3/00
A61P7/06
A61K35/12
A61K35/76
【審査請求】未請求
【請求項の数】22
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022140312
(22)【出願日】2022-09-02
(71)【出願人】
【識別番号】310015086
【氏名又は名称】株式会社ボナック
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】正山 祥生
(72)【発明者】
【氏名】内藤 浩太
(72)【発明者】
【氏名】與那嶺 孝
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C076CC14
4C076CC21
4C076CC41
4C076DD33
4C076DD60
4C076DD63
4C076EE59
4C076FF34
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA55
4C084ZC21
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA55
4C086ZC21
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087CA12
4C087CA20
4C087NA14
4C087ZA55
4C087ZC21
(57)【要約】 （修正有）
【課題】一塩基多型を特異的にノックダウンすることで野生型ＡＬＤＨ２の割合を増加させ、ＡＬＤＨ２の活性を向上させる核酸分子、および当該核酸分子を含む、ＡＬＤＨ２が関連する疾患の治療用の医薬組成物を提供する。
【解決手段】変異型ＡＬＤＨ２遺伝子における、特定のヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列中の、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列として含む、核酸分子。
【選択図】なし
【解決手段】変異型ＡＬＤＨ２遺伝子における、特定のヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列中の、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列として含む、核酸分子。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子における、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列中の、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列として含む、核酸分子。
【請求項2】
（ａ）配列番号２ｎ（ｎは１～１１から選ばれる整数）で表されるヌクレオチド配列（但し、該配列中、各ＵはＴであってもよい）中の、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列において、１個もしくは２個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列、又は
（ｃ）（ａ）のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である、
請求項１に記載の核酸分子。
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列において、１個もしくは２個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列、又は
（ｃ）（ａ）のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である、
請求項１に記載の核酸分子。
【請求項3】
前記発現抑制配列に相補的なヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項4】
前記相補的なヌクレオチド配列が、
（ｄ）配列番号２ｎ＋１（ｎは前記（ａ）と同じ）で表されるヌクレオチド配列（但し、ＧとＵとの対合は相補的とみなす）、
（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列において、１個もしくは２個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列、又は
（ｆ）（ｄ）のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である、
請求項３に記載の核酸分子。
（ｄ）配列番号２ｎ＋１（ｎは前記（ａ）と同じ）で表されるヌクレオチド配列（但し、ＧとＵとの対合は相補的とみなす）、
（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列において、１個もしくは２個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列、又は
（ｆ）（ｄ）のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である、
請求項３に記載の核酸分子。
【請求項5】
配列番号２ｎ（ｎは１～１１から選ばれる整数）で表されるヌクレオチド配列と、配列番号２ｎ＋１で表されるヌクレオチド配列とを含む、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項6】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡである、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項7】
前記ｓｉＲＮＡが、一方もしくは両方の鎖に３’－オーバーハングを有する、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項8】
配列番号２ｍ（ｍは１２～４５から選ばれる整数）で表されるヌクレオチド配列と、該配列にアニーリングした配列番号２ｍ＋１で表されるヌクレオチド配列とからなる、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項9】
下記（１）～（３４）のいずれかの構造を有する、請求項８に記載の核酸分子。
式中、
下線は一塩基多型の変異を、
イタリック体の下線はミスマッチを、
下線（波線）はヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合であることを、
枠で囲ったヌクレオチドは、２’－ＯｍｅＲＮＡであることを、
小文字で標記したヌクレオチドは、２’－Ｆ ＲＮＡであることを、
それぞれ示す。
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
式中、
下線は一塩基多型の変異を、
イタリック体の下線はミスマッチを、
下線（波線）はヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合であることを、
枠で囲ったヌクレオチドは、２’－ＯｍｅＲＮＡであることを、
小文字で標記したヌクレオチドは、２’－Ｆ ＲＮＡであることを、
それぞれ示す。
【請求項10】
下記一般式：
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２、Ｙ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基又は修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｚは（Ｘ）の糖部分の２’位若しくは５’位と（Ｙ）の糖部分の２’位若しくは３’位とを連結するリンカーであり、又は（Ｘ）の塩基部分と（Ｙ）の塩基部分とを連結するリンカーであり；
配列Ｔは請求項１又は２に記載される変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列（Ｔａ）を含むヌクレオチド配列であり、配列Ｑは該発現抑制配列Ｔａに相補的な配列（Ｑａ）を含むヌクレオチド配列であり；
ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、０～５の整数であり；及び
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して、０～５の整数である］
で示される核酸分子。
【化5】
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２、Ｙ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基又は修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｚは（Ｘ）の糖部分の２’位若しくは５’位と（Ｙ）の糖部分の２’位若しくは３’位とを連結するリンカーであり、又は（Ｘ）の塩基部分と（Ｙ）の塩基部分とを連結するリンカーであり；
配列Ｔは請求項１又は２に記載される変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列（Ｔａ）を含むヌクレオチド配列であり、配列Ｑは該発現抑制配列Ｔａに相補的な配列（Ｑａ）を含むヌクレオチド配列であり；
ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、０～５の整数であり；及び
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して、０～５の整数である］
で示される核酸分子。
【請求項11】
下記（３５）～（７４）のいずれかの構造を有する、請求項１０に記載の核酸分子。
式中、
下線は一塩基多型の変異を、
イタリック体の下線はミスマッチを、
下線（波線）はヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合であることを、
枠で囲ったヌクレオチドは、２’－ＯｍｅＲＮＡであることを、
小文字で標記したヌクレオチドは、２’－Ｆ ＲＮＡであることを、
細字の下線は、Ｗｏｂｂｌｅ ｐａｉｒを、
塩基同士を結ぶ線は、－Ｚ－に相当する部分であり、該部位で相補鎖と結合し得ることを、
それぞれ意味する。
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
式中、
下線は一塩基多型の変異を、
イタリック体の下線はミスマッチを、
下線（波線）はヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合であることを、
枠で囲ったヌクレオチドは、２’－ＯｍｅＲＮＡであることを、
小文字で標記したヌクレオチドは、２’－Ｆ ＲＮＡであることを、
細字の下線は、Ｗｏｂｂｌｅ ｐａｉｒを、
塩基同士を結ぶ線は、－Ｚ－に相当する部分であり、該部位で相補鎖と結合し得ることを、
それぞれ意味する。
【請求項12】
請求項２に記載される変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列（Ｔａ）を含むヌクレオチド配列Ｔと、該発現抑制配列Ｔａに相補的な配列（Ｑａ）を含むヌクレオチド配列Ｑとが、リンカーＬを介して、５’から３’方向又は３’から５’方向にＴ－Ｌ－Ｑの順序で、かつ発現抑制配列とそれに相補的な配列とが分子内で二重鎖を形成し得る配向で連結された、核酸分子。
【請求項13】
前記リンカーＬが、下記式で表されるプロリン誘導体リンカーである、請求項１２に記載の核酸分子。
【化10】
【請求項14】
前記配列Ｔが配列Ｔａの5’末端に付加配列Ｔbを有し、かつ前記配列Ｑが配列Ｑａの3’末端に付加配列Ｑｂを有し、配列Ｔｂと配列Ｑｂとが相補的である、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項15】
前記配列Ｔが３’－オーバーハングを有する、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項16】
下記（７５）～（７９）のいずれかの構造を有する、請求項１５に記載の核酸分子。
式中、
下線は一塩基多型の変異を、
イタリック体の下線はミスマッチを
下線（波線）はヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合であることを、
枠で囲ったヌクレオチドは、２’－ＯｍｅＲＮＡであることを、
小文字で標記したヌクレオチドは、２’－Ｆ ＲＮＡであることを、
Ｐは、プロリン誘導体リンカーを、
それぞれ示す。
【化11】
式中、
下線は一塩基多型の変異を、
イタリック体の下線はミスマッチを
下線（波線）はヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合であることを、
枠で囲ったヌクレオチドは、２’－ＯｍｅＲＮＡであることを、
小文字で標記したヌクレオチドは、２’－Ｆ ＲＮＡであることを、
Ｐは、プロリン誘導体リンカーを、
それぞれ示す。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか１項に記載の核酸分子を発現する発現ベクター。
【請求項18】
請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項１７に記載の発現ベクターを含む、医薬。
【請求項19】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子発現を抑制しＡＬＤＨ２活性を向上させる、請求項１８に記載の医薬。
【請求項20】
ＡＬＤＨ２が関連する疾患の治療または予防用である、請求項１８に記載の医薬。
【請求項21】
ＡＬＤＨ２が関連する疾患が、生後低身長・低体重、軽度の精神発達遅延、再生不良性貧血である請求項１９に記載の医薬。
【請求項22】
ＡＬＤＨ２が関連する疾患が、ＡＤＤ症候群及び／又はファンコニ貧血である請求項１９に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一塩基多型を特異的にノックダウンすることで野生型ＡＬＤＨ２の割合を増加させ、ＡＬＤＨ２の活性を向上させる核酸分子、および当該核酸分子を含む、ＡＬＤＨ２が関連する疾患の治療用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＡＬＤＨ２は２量体を活性単位とし、その活性単位が２つ配位した４量体の形で体内に存在する。ＡＬＤＨ２には遺伝子多型が多く存在するが、顕著な表現型の差異が認められるのはｒｓ６７１変異体のみである。ＡＬＤＨ２遺伝子の遺伝子型は、野生型ホモ接合体、ヘテロ接合体、及び変異型ホモ接合体の３種があり、野生型ホモ接合体のＡＬＤＨ２活性は１００％、変異型ホモ接合体のＡＬＤＨ２活性は０％となるが、ヘテロ接合体の場合、活性が５０％ではなく、理論的には１５．６％程度まで低下することが明らかにされている。ｒｓ６７１変異体が活性単位である２量体の架橋形成にかかわるアミノ酸の変異であるため、２量体中に一つでもｒｓ６７１変異体を含むと活性は消失する。そのため４量体中にｒｓ６７１変異体が一つ存在すると、４量体での活性は５０％まで低下する。また４量体中にｒｓ６７１変異体が２つ存在した場合、各活性単位にｒｓ６７１変異体が１つずつ含まれると４量体の活性は完全に消失する。そのため、ヘテロ接合体では４量体のすべての組み合わせについて、酵素活性、出現頻度、半減期を考慮すると理論的には１５．６％程度まで低下することになる。これまでに低分子化合物によるＡＬＤＨ２の活性化剤は存在するが、ＲＮＡｉ効果によって活性を向上させた報告はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明の目的は、変異型ＡＬＤＨ２を有するヒトを対象とし、ＲＮＡｉ効果によって該変異型ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡを選択的に切断することで、野生型ＡＬＤＨ２の割合を増加し、ＡＬＤＨ２活性を向上させ、ホルムアルデヒド代謝異常を改善すること、及び該作用により、ＡＬＤＨ２が関連する疾患、例えば、ＡＤＤ(Aldehyde degradation deficiency)/AMeD(Aplastic anemia, Mental retardation, and Dwarfism)症候群やファンコニ貧血の治療及び／又は予防剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＡＬＤＨ２活性減弱を引き起こす一塩基多型の変異型を特異的にノックダウンする遺伝子配列を有する核酸を見出し、本発明を完成するに至った。
【0005】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］変異型ＡＬＤＨ２遺伝子における、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列中の、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列として含む、核酸分子。
［２］前記発現抑制配列が、
（ａ）配列番号２ｎ（ｎは１～１１から選ばれる整数）で表されるヌクレオチド配列（但し、該配列中、各ＵはＴであってもよい）中の、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列において、１個もしくは２個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列、又は
（ｃ）（ａ）のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である、
好ましくは（ａ）のヌクレオチド配列である、［１］に記載の核酸分子。
［３］前記発現抑制配列に相補的なヌクレオチド配列をさらに含む、［１］又は［２］に記載の核酸分子。
［４］前記相補的なヌクレオチド配列が、
（ｄ）配列番号２ｎ＋１（ｎは前記（ａ）と同じ）で表されるヌクレオチド配列（但し、ＧとＵとの対合は相補的とみなす）、
（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列において、１個もしくは２個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列、又は
（ｆ）（ｄ）のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である、
好ましくは（ｄ）のヌクレオチド配列である、［３］に記載の核酸分子。
［５］配列番号２ｎ（ｎは１～１１から選ばれる整数）で表されるヌクレオチド配列と、配列番号２ｎ＋１で表されるヌクレオチド配列とを含む、［３］又は［４］に記載の核酸分子。
［６］変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡである、［３］～［５］のいずれかに記載の核酸分子。
［７］前記ｓｉＲＮＡが、一方もしくは両方の鎖に３’－オーバーハングを有する、［６］に記載の核酸分子。
［８］配列番号２ｍ（ｍは１２～４５から選ばれる整数）で表されるヌクレオチド配列と、該配列にアニーリングした配列番号２ｍ＋１で表されるヌクレオチド配列とからなる、［７］に記載の核酸分子。
［９］下記（１）～（３４）のいずれかの構造を有する、［８］に記載の核酸分子。
［１］変異型ＡＬＤＨ２遺伝子における、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列中の、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列として含む、核酸分子。
［２］前記発現抑制配列が、
（ａ）配列番号２ｎ（ｎは１～１１から選ばれる整数）で表されるヌクレオチド配列（但し、該配列中、各ＵはＴであってもよい）中の、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列において、１個もしくは２個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列、又は
（ｃ）（ａ）のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である、
好ましくは（ａ）のヌクレオチド配列である、［１］に記載の核酸分子。
［３］前記発現抑制配列に相補的なヌクレオチド配列をさらに含む、［１］又は［２］に記載の核酸分子。
［４］前記相補的なヌクレオチド配列が、
（ｄ）配列番号２ｎ＋１（ｎは前記（ａ）と同じ）で表されるヌクレオチド配列（但し、ＧとＵとの対合は相補的とみなす）、
（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列において、１個もしくは２個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列、又は
（ｆ）（ｄ）のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である、
好ましくは（ｄ）のヌクレオチド配列である、［３］に記載の核酸分子。
［５］配列番号２ｎ（ｎは１～１１から選ばれる整数）で表されるヌクレオチド配列と、配列番号２ｎ＋１で表されるヌクレオチド配列とを含む、［３］又は［４］に記載の核酸分子。
［６］変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡである、［３］～［５］のいずれかに記載の核酸分子。
［７］前記ｓｉＲＮＡが、一方もしくは両方の鎖に３’－オーバーハングを有する、［６］に記載の核酸分子。
［８］配列番号２ｍ（ｍは１２～４５から選ばれる整数）で表されるヌクレオチド配列と、該配列にアニーリングした配列番号２ｍ＋１で表されるヌクレオチド配列とからなる、［７］に記載の核酸分子。
［９］下記（１）～（３４）のいずれかの構造を有する、［８］に記載の核酸分子。
【0006】
【表1-1】
【0007】
【表1-2】
【0008】
【表1-3】
【0009】
[１０]下記一般式：
【0010】
【化1】
【0011】
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２、Ｙ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基又は修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｚは（Ｘ）の糖部分の２’位若しくは５’位と（Ｙ）の糖部分の２’位若しくは３’位とを連結するリンカーであり、又は（Ｘ）の塩基部分と（Ｙ）の塩基部分とを連結するリンカーであり；
配列Ｔは上記［１］又は［２］に記載される変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列（Ｔａ）を含むヌクレオチド配列であり、配列Ｑは該発現抑制配列Ｔａに相補的な配列（Ｑａ）を含むヌクレオチド配列であり；
ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、０～５の整数であり；及び
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して、０～５の整数である］
で示される核酸分子。
［１０－１］リンカーＺが、内部にアミド結合を有するアルキル鎖を有する非ヌクレオチド構造、又は（Ｘ）の塩基部分と（Ｙ）の塩基部分とを連結する構造である、［１０］に記載の核酸分子。
［１０－２］式中、リンカーＺを含む下記
Ｚは（Ｘ）の糖部分の２’位若しくは５’位と（Ｙ）の糖部分の２’位若しくは３’位とを連結するリンカーであり、又は（Ｘ）の塩基部分と（Ｙ）の塩基部分とを連結するリンカーであり；
配列Ｔは上記［１］又は［２］に記載される変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列（Ｔａ）を含むヌクレオチド配列であり、配列Ｑは該発現抑制配列Ｔａに相補的な配列（Ｑａ）を含むヌクレオチド配列であり；
ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、０～５の整数であり；及び
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して、０～５の整数である］
で示される核酸分子。
［１０－１］リンカーＺが、内部にアミド結合を有するアルキル鎖を有する非ヌクレオチド構造、又は（Ｘ）の塩基部分と（Ｙ）の塩基部分とを連結する構造である、［１０］に記載の核酸分子。
［１０－２］式中、リンカーＺを含む下記
【0012】
【化2】
【0013】
の構造が、［式１］、［式２］、［式３］又は［式４］から選ばれる［１０］又は［１０－１］に記載の核酸分子。
【0014】
【化3】
【0015】
【化4】
【0016】
【化5】
【0017】
又は
【0018】
【化6】
【0019】
［式中、Ｂ及びＢ’は、それぞれ独立して核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Ａ１およびＡ１’は、それぞれ独立して－Ｏ－、－ＮＲ１ａ－、－Ｓ－又は－ＣＲ１ａＲ１ｂ－であり（ここで、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ２およびＡ２’は、それぞれ独立して－ＣＲ２ａＲ２ｂ－、－ＣＯ－、アルキニル基、アルケニル基又は単結合であり（ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ３およびＡ３’は、それぞれ独立して－Ｏ－又は－ＮＲ３ａ－、－Ｓ－、－ＣＲ３ａＲ３ｂ－又は単結合であり（ここで、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ４およびＡ４’は、それぞれ独立して－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－、－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－環Ｄ－（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり；Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）又は単結合であり、
Ａ５およびＡ５’は、それぞれ独立して－ＮＲ５ａ－又は単結合であり（ここで、Ｒ５ａは水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ６およびＡ６’は、それぞれ独立して－（ＣＲ６ａＲ６ｂ）ｎ－又は単結合であり（ここで、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）、
Ｗ１は、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－、－ＣＯ－、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＣＯＯ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＣＯＯ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－Ｏ－（ＣＲ１Ｒ２ＣＲ１Ｒ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－環Ｄ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－又は－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＳＳ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－であり（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり；Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）、
Ｅ２およびＥ２’は、それぞれ独立して－ＣＲ２ａＲ２ｂ－、－ＣＯ－、アルキニル基、アルケニル基又は単結合であり（ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ３およびＥ３’は、それぞれ独立して－Ｏ－又は－ＮＲ３ａ－、－Ｓ－、－ＣＲ３ａＲ３ｂ－又は単結合であり（ここで、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ４およびＥ４’は、それぞれ独立して－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－、－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－環Ｄ－（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり；Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）又は単結合であり、
Ｅ５およびＥ５’は、それぞれ独立して－ＮＲ５ａ－又は単結合であり（ここで、Ｒ５ａは水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ６およびＥ６’は、それぞれ独立して－（ＣＲ６ａＲ６ｂ）ｎ－又は単結合である（ここで、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり：ｎは１～６の整数である）］。
［１０－３］式中、リンカーＺを含む下記
Ａ１およびＡ１’は、それぞれ独立して－Ｏ－、－ＮＲ１ａ－、－Ｓ－又は－ＣＲ１ａＲ１ｂ－であり（ここで、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ２およびＡ２’は、それぞれ独立して－ＣＲ２ａＲ２ｂ－、－ＣＯ－、アルキニル基、アルケニル基又は単結合であり（ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ３およびＡ３’は、それぞれ独立して－Ｏ－又は－ＮＲ３ａ－、－Ｓ－、－ＣＲ３ａＲ３ｂ－又は単結合であり（ここで、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ４およびＡ４’は、それぞれ独立して－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－、－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－環Ｄ－（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり；Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）又は単結合であり、
Ａ５およびＡ５’は、それぞれ独立して－ＮＲ５ａ－又は単結合であり（ここで、Ｒ５ａは水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ６およびＡ６’は、それぞれ独立して－（ＣＲ６ａＲ６ｂ）ｎ－又は単結合であり（ここで、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）、
Ｗ１は、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－、－ＣＯ－、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＣＯＯ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＣＯＯ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－Ｏ－（ＣＲ１Ｒ２ＣＲ１Ｒ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－環Ｄ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－又は－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＳＳ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－であり（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり；Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）、
Ｅ２およびＥ２’は、それぞれ独立して－ＣＲ２ａＲ２ｂ－、－ＣＯ－、アルキニル基、アルケニル基又は単結合であり（ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ３およびＥ３’は、それぞれ独立して－Ｏ－又は－ＮＲ３ａ－、－Ｓ－、－ＣＲ３ａＲ３ｂ－又は単結合であり（ここで、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ４およびＥ４’は、それぞれ独立して－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－、－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－環Ｄ－（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり；Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）又は単結合であり、
Ｅ５およびＥ５’は、それぞれ独立して－ＮＲ５ａ－又は単結合であり（ここで、Ｒ５ａは水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ６およびＥ６’は、それぞれ独立して－（ＣＲ６ａＲ６ｂ）ｎ－又は単結合である（ここで、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり：ｎは１～６の整数である）］。
［１０－３］式中、リンカーＺを含む下記
【0020】
【化7】
【0021】
の構造が、［式４］
【0022】
【化8】
【0023】
［式中、各記号の定義は、前記と同じである）］である、［１０］、［１０－１］又は［１０－２］に記載の核酸分子。
［１０－４］下記（３５）～（７４）のいずれかの構造を有する、［１０］、［１０―１］～［１０－３］のいずれかに記載の核酸分子。
［１０－４］下記（３５）～（７４）のいずれかの構造を有する、［１０］、［１０―１］～［１０－３］のいずれかに記載の核酸分子。
【0024】
【表2-1】
【0025】
【表2-2】
【0026】
【表2-3】
【0027】
【表2-4】
【0028】
［１１］上記［１］又は［２］に記載される変異型ALDH2遺伝子の発現抑制配列（Ｔａ）を含むヌクレオチド配列Ｔと、該発現抑制配列Ｔａに相補的な配列（Ｑａ）を含むヌクレオチド配列Ｑとが、リンカーＬを介して、５’から３’方向又は３’から５’方向にＴ－Ｌ－Ｑの順序で、かつ発現抑制配列とそれに相補的な配列とが分子内で二重鎖を形成し得る配向で連結された、核酸分子。
［１２］前記リンカーLが、下記式で表されるプロリン誘導体リンカーである、［１１］に記載の核酸分子。
［１２］前記リンカーLが、下記式で表されるプロリン誘導体リンカーである、［１１］に記載の核酸分子。
【0029】
【化9】
【0030】
［１３］前記配列Ｔが配列Ｔａの５’末端に付加配列Ｔbを有し、かつ前記配列Ｑが配列Ｑａの３’末端に付加配列Ｑｂを有し、配列Ｔｂと配列Ｑｂとが相補的である、［１１］又は［１２］に記載の核酸分子。
［１４］前記配列Ｔが３’-オーバーハングを有する、［１１］～［１３］のいずれかに記載の核酸分子。
［１５］下記（７５）～（７９）のいずれかの構造を有する、［１４］に記載の核酸分子。
［１４］前記配列Ｔが３’-オーバーハングを有する、［１１］～［１３］のいずれかに記載の核酸分子。
［１５］下記（７５）～（７９）のいずれかの構造を有する、［１４］に記載の核酸分子。
【0031】
【表3】
【0032】
［１６］［１］～［１５］及び［１０－１］～［１０－４］のいずれかに記載の核酸分子を発現する発現ベクター。
［１７］［１］～［１５］及び［１０－１］～［１０－４］のいずれかに記載の核酸分子または［１６］に記載の発現ベクターを含む、医薬。
［１８］変異型ＡＬＤＨ２遺伝子発現を抑制しＡＬＤＨ２活性を向上させる、［１７］に記載の医薬。
［１９］ＡＬＤＨ２が関連する疾患の治療または予防用である、［１７］に記載の医薬。
［２０］ＡＬＤＨ２が関連する疾患が、生後低身長・低体重、軽度の精神発達遅延、再生不良性貧血である［１９］に記載の医薬。
［２１］ＡＬＤＨ２が関連する疾患が、ＡＤＤ症候群及び／又はファンコニ貧血である［１９］に記載の医薬。
［１７］［１］～［１５］及び［１０－１］～［１０－４］のいずれかに記載の核酸分子または［１６］に記載の発現ベクターを含む、医薬。
［１８］変異型ＡＬＤＨ２遺伝子発現を抑制しＡＬＤＨ２活性を向上させる、［１７］に記載の医薬。
［１９］ＡＬＤＨ２が関連する疾患の治療または予防用である、［１７］に記載の医薬。
［２０］ＡＬＤＨ２が関連する疾患が、生後低身長・低体重、軽度の精神発達遅延、再生不良性貧血である［１９］に記載の医薬。
［２１］ＡＬＤＨ２が関連する疾患が、ＡＤＤ症候群及び／又はファンコニ貧血である［１９］に記載の医薬。
【発明の効果】
【0033】
本発明の核酸分子によって、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を抑え、それにより変異型ＡＬＤＨ２タンパクの発現を効果的に抑制することができる。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
以下に本発明で使用する用語および記号を定義する。
以下に本発明で使用する用語および記号を定義する。
【0035】
「アミノ基の保護基」とは、具体的には、アセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、N-フタルイミド等のアミド系、及び９－フルオニルメトキシカルボニル、ｔ-ブトキシカルボニル等のカルバメート系が挙げられる。
【0036】
「水酸基の保護基」とは、水酸基の反応を防ぐために導入される、当業者に公知の一般的な水酸基の保護基を意味し、例えば、Protective Groups in Organic Synthesis, published by John Wiley and Sons (1980)に記載の保護基等であり、具体的には、アセチル、ベンゾイル等のアシル系保護基、トリチル、４－メトキシトリチル、４，４’－ジメトキシトリチル、ベンジル等のアルキル系保護基、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル等のシリル系保護基が挙げられる。
【0037】
「電子求引基」とは、水素原子と比べて、結合原子側から電子をひきつけやすい基を示し、具体的には、シアノ、ニトロ、アルキルスルホニル（例、メチルスルホニル、エチルスルホニル）、ハロゲン（フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子）、アリールスルホニル（例、フェニルスルホニル、ナフチルスルホニル）、トリハロメチル（例、トリクロロメチル、トリフルオロメチル）等が挙げられる。
【0038】
「ハロゲン」としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられる。
【0039】
「アルキル基」（アルキル、アルキル鎖）とは、炭素数１～３０、好ましくは１～１２、より好ましくは１～６、特に好ましくは１～４の直鎖又は分岐鎖アルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチルおよびｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル等が挙げられる。「炭素数１～１０のアルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチルおよびｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が挙げられ、好ましくはＣ１－６アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１－エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、２－エチルブチル）が挙げられる。
【0040】
「アルケニル基」（アルケニル）とは、炭素数２～３０、好ましくは２～１２、より好ましく２～８の直鎖又は分岐鎖アルケニル基を意味し、前記アルキル基において、１個又は複数の二重結合を有するもの等が挙げられる。具体的には、ビニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１，３－ブタジエニル、３－メチル－２－ブテニル等が挙げられる。
【0041】
「アルキニル基」（アルキニル）とは、炭素数２～３０、好ましくは２～１２、より好ましく２～８の直鎖又は分岐鎖アルキニル基を意味し、前記アルキル基において、１個又は複数の三重結合を有するもの等が挙げられる。具体的には、エチニル、プロピニル、プロパルギル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等が挙げられる。該アルキニル基は、さらに１個又は複数の二重結合を有していてもよい。
【0042】
「アルコキシ基」（アルコキシ）とは、炭素数１～３０、好ましくは１～１２、より好ましくは１～６、特に好ましくは１～４の直鎖又は分岐鎖アルコキシ基を意味し、具体的には、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｔｅｒｔ－ペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、２－ペンチルオキシ、３－ペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、２－ヘキシルオキシ等が挙げられる。
【0043】
「アリール基」とは、炭素数６～２４、好ましくは６～１０のアリール基を意味し、フェニル等の単環芳香族炭化水素基、１－ナフチル、２－ナフチル、１－アントリル、２－アントリル、９－アントリル、１－フェナントリル、２－フェナントリル、３－フェナントリル、４－フェナントリル、９－フェナントリル等の多環芳香族炭化水素基が挙げられる。「炭素数６～１０のアリール基」としては、上記アリール基のうち、炭素数が６～１０のものが挙げられ、具体的にはフェニル、ナフチル等が挙げられる。
【0044】
「ヘテロシクロアルキル基」とは、炭素数６～２４、好ましくは６～１０のヘシクロアルキル基を意味する。ヘテロシクロアルキル基としては、後述のシクロアルキル基の環状構造を形成する１個若しくはそれ以上の炭素原子が、窒素原子、酸素原子、硫黄原子などで置換されたものが挙げられる。具体的には、［１，３］ジオキソラニル、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、及びテトラヒドロフリル等が挙げられる。「炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基」としては上記ヘテロシクロアルキル基のうち、炭素数が４～１０のものが挙げられ、具体的にはピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、オキセタニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、チオキセタニル、テトラヒドロチエニル、及びテトラヒドロチオピラニル基等が挙げられる。
【0045】
「アラルキル基」とは、炭素数７～３０、好ましくは７～１１のアラルキル基を意味し、具体的には、ベンジル、２－フェネチル、およびナフタレニルメチル等が挙げられる。
【0046】
「シクロアルキル基」とは、炭素数３～２４、好ましくは３～１５のシクロアルキル基を意味し、具体的には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等が挙げられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等が挙げられる。「橋かけ環式炭化水素基」としては、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノニル、１－アダマンチル、２－アダマンチル等が挙げられる。「スピロ炭化水素基」としては、スピロ［３．４］オクチル等が挙げられる。「炭素数４～１０のシクロアルキル基」としては、上記シクロアルキル基のうち、炭素数が４～１０のものが挙げられ、具体的にはシクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。
【0047】
「シクロアルケニル基」とは、少なくとも１個、好ましくは１または２個の二重結合を含む炭素数３～２４、好ましくは３～７のシクロアルケニル基を意味し、具体的には、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等が挙げられる。前記シクロアルケニル基は、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。「環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基」としては、ビシクロ［２．２．２］オクテニル、ビシクロ［３．２．１］オクテニル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプテニル等が挙げられる。「環中に不飽和結合を有するスピロ炭化水素基」としては、スピロ［３．４］オクテニル等が挙げられる。
【0048】
「シクロアルキルアルキル基」とは、前記シクロアルキル基で置換されたアルキル基（上述）を意味し、好ましくは炭素数４～３０、より好ましくは４～１１のシクロアルキルアルキル基を意味する。具体的には、シクロプロピルメチル、２－シクロブチルエチル、シクロペンチルメチル、３－シクロペンチルプロピル、シクロヘキシルメチル、２－シクロヘキシルエチル、シクロヘプチルメチル等が挙げられる。
【0049】
「アルコキシアルキル基」とは、前記アルコキシ基で置換されたアルキル基（上述）を意味し、好ましくは炭素数２～３０、より好ましくは２～１２の直鎖又は分岐鎖アルコキシアルキル基を意味する。具体的には、メトキシメチル、メトキシエチル、エトキシメチル、エトキシエチルおよびｔ－ブトキシメチル等が挙げられる。
【0050】
「アルキレン基」（アルキレン鎖）とは、炭素数１～３０、好ましくは１～１２、より好ましくは１～６、特に好ましくは１～４の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を意味し、具体的には、メチレン、エチレン、およびプロピレン等が挙げられる。
【0051】
「ヘテロアリール基」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２－フリル、３－フリル）、チエニル（例：２－チエニル、３－チエニル）、ピロリル（例：１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル）、イミダゾリル（例：１－イミダゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１－ピラゾリル、３－ピラゾリル、４－ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４－トリアゾール－１－イル、１，２，４－トリアゾール－３－イル、１，２，４－トリアゾール－４－イル）、テトラゾリル（例：１－テトラゾリル、２－テトラゾリル、５－テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、５－オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３－イソキサゾリル、４－イソキサゾリル、５－イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３－イソチアゾリル、４－イソチアゾリル、５－イソチアゾリル）、ピリジル（例：２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル）、ピリダジニル（例：３－ピリダジニル、４－ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２－ピリミジニル、４－ピリミジニル、５－ピリミジニル）、フラザニル（例：３－フラザニル）、ピラジニル（例：２－ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）、ベンゾフリル（例：２－ベンゾ［ｂ］フリル、３－ベンゾ［ｂ］フリル、４－ベンゾ［ｂ］フリル、５－ベンゾ［ｂ］フリル、６－ベンゾ［ｂ］フリル、７－ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２－ベンゾ［ｂ］チエニル、３－ベンゾ［ｂ］チエニル、４－ベンゾ［ｂ］チエニル、５－ベンゾ［ｂ］チエニル、６－ベンゾ［ｂ］チエニル、７－ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１－ベンズイミダゾリル、２－ベンズイミダゾリル、４－ベンズイミダゾリル、５－ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリニル（例：２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、６－キノキサリニル）、シンノリニル（例：３－シンノリニル、４－シンノリニル、５－シンノリニル、６－シンノリニル、７－シンノリニル、８－シンノリニル）、キナゾリニル（例：２－キナゾリニル、４－キナゾリニル、５－キナゾリニル、６－キナゾリニル、７－キナゾリニル、８－キナゾリニル）、キノリル（例：２－キノリル、３－キノリル、４－キノリル、５－キノリル、６－キノリル、７－キノリル、８－キノリル）、フタラジニル（例：１－フタラジニル、５－フタラジニル、６－フタラジニル）、イソキノリル（例：１－イソキノリル、３－イソキノリル、４－イソキノリル、５－イソキノリル、６－イソキノリル、７－イソキノリル、８－イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２－プテリジニル、４－プテリジニル、６－プテリジニル、７－プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１－アクリジニル、２－アクリジニル、３－アクリジニル、４－アクリジニル、９－アクリジニル）、インドリル（例：１－インドリル、２－インドリル、３－インドリル、４－インドリル、５－インドリル、６－インドリル、７－インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１－フェナジニル、２－フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１－フェノチアジニル、２－フェノチアジニル、３－フェノチアジニル、４－フェノチアジニル）等が挙げられる。
「炭素数２～１０のヘテロアリール基」としては上記ヘテロアリール基のうち、炭素数が２～１０のものが挙げられ、具体的にはフリル基、チエニル基、ピロリル基、オキサゾリル基、トリアゾリル基、ピリジル基、キノリニル基等が挙げられる。
「炭素数２～１０のヘテロアリール基」としては上記ヘテロアリール基のうち、炭素数が２～１０のものが挙げられ、具体的にはフリル基、チエニル基、ピロリル基、オキサゾリル基、トリアゾリル基、ピリジル基、キノリニル基等が挙げられる。
【0052】
本発明において「置換基」としては、下記置換基群Ａに記載のものが挙げられる。
置換基群Ａ
（１）ハロゲン（フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子）；
（２）アルキル基（上述）；
（３）アルコキシ基（上述）；
（４）アルケニル基（上述）；
（５）アルキニル基（上述）；
（６）ハロアルキル基（例、クロロメチル、フルオロメチル、ジクロロメチル、ジフルオロメチル、ジクロロフルオロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル等）；
（７）アリール基（上述）；
（８）ヘテロアリール基（上述）；
（９）アラルキル基（上述）
（１０）シクロアルキル基（上述）；
（１１）シクロアルケニル基（上述）；
（１２）シクロアルキルアルキル基（上述）；
（１３）シクロアルケニルアルキル基（例、シクロペンテニルエチル、シクロヘキセニルエチル、シクロヘキセニルブチル等）；
（１４）ヒドロキシアルキル基（例、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル等）；
（１５）アルコキシアルキル基（上述）；
（１６）アミノアルキル基（例、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル等）；
（１７）ヘテロシクリル基（例、１－ピロリニル、２－ピロリニル、３－ピロリニル、１－ピロリジニル、２－ピロリジニル、３－ピロリジニル、ピロリジノニル、１－イミダゾリニル、２－イミダゾリニル、４－イミダゾリニル、１－イミダゾリジニル、２－イミダゾリジニル、４－イミダゾリジニル、イミダゾリジノニル、１－ピラゾリニル、３－ピラゾリニル、４－ピラゾリニル、１－ピラゾリジニル、３－ピラゾリジニル、４－ピラゾリジニル、ピペリジノニル、ピペリジノ、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－ピペリジニル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニル、ピペラジノニル、２－モルホリニル、３－モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等）；
（１８）ヘテロシクリルアルケニル基（例、２－ピペリジニルエテニル等）；
（１９）ヘテロシクリルアルキル基（例、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等）；
（２０）ヘテロアリールアルキル基（例、ピリジルメチル、キノリン－３－イルメチル等）；
（２１）シリル基；
（２２）シリルオキシアルキル基（例、シリルオキシメチル、シリルオキシエチル等）
（２３）モノ・ジもしくはトリアルキルシリル基（例、メチルシリル、エチルシリル等）；及び
（２４）モノ・ジもしくはトリアルキルシリルオキシアルキル基（例、トリメチルシリルオキシメチル等）。
置換基群Ａ
（１）ハロゲン（フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子）；
（２）アルキル基（上述）；
（３）アルコキシ基（上述）；
（４）アルケニル基（上述）；
（５）アルキニル基（上述）；
（６）ハロアルキル基（例、クロロメチル、フルオロメチル、ジクロロメチル、ジフルオロメチル、ジクロロフルオロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル等）；
（７）アリール基（上述）；
（８）ヘテロアリール基（上述）；
（９）アラルキル基（上述）
（１０）シクロアルキル基（上述）；
（１１）シクロアルケニル基（上述）；
（１２）シクロアルキルアルキル基（上述）；
（１３）シクロアルケニルアルキル基（例、シクロペンテニルエチル、シクロヘキセニルエチル、シクロヘキセニルブチル等）；
（１４）ヒドロキシアルキル基（例、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル等）；
（１５）アルコキシアルキル基（上述）；
（１６）アミノアルキル基（例、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル等）；
（１７）ヘテロシクリル基（例、１－ピロリニル、２－ピロリニル、３－ピロリニル、１－ピロリジニル、２－ピロリジニル、３－ピロリジニル、ピロリジノニル、１－イミダゾリニル、２－イミダゾリニル、４－イミダゾリニル、１－イミダゾリジニル、２－イミダゾリジニル、４－イミダゾリジニル、イミダゾリジノニル、１－ピラゾリニル、３－ピラゾリニル、４－ピラゾリニル、１－ピラゾリジニル、３－ピラゾリジニル、４－ピラゾリジニル、ピペリジノニル、ピペリジノ、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－ピペリジニル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニル、ピペラジノニル、２－モルホリニル、３－モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等）；
（１８）ヘテロシクリルアルケニル基（例、２－ピペリジニルエテニル等）；
（１９）ヘテロシクリルアルキル基（例、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等）；
（２０）ヘテロアリールアルキル基（例、ピリジルメチル、キノリン－３－イルメチル等）；
（２１）シリル基；
（２２）シリルオキシアルキル基（例、シリルオキシメチル、シリルオキシエチル等）
（２３）モノ・ジもしくはトリアルキルシリル基（例、メチルシリル、エチルシリル等）；及び
（２４）モノ・ジもしくはトリアルキルシリルオキシアルキル基（例、トリメチルシリルオキシメチル等）。
【0053】
１．変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を抑制する核酸分子
本発明は、変異型ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡ中のヌクレオチド配列と相補的な配列を含む、変異型ＡＬＤＨ２の遺伝子発現を抑制する核酸分子（以下、「本発明の核酸分子」と記載する場合がある。）を提供する。
本発明は、変異型ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡ中のヌクレオチド配列と相補的な配列を含む、変異型ＡＬＤＨ２の遺伝子発現を抑制する核酸分子（以下、「本発明の核酸分子」と記載する場合がある。）を提供する。
【0054】
本発明の核酸分子は、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を抑制する配列として、変異型ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡの特定の部位と相補的な配列を含む。ヒトのＡＬＤＨ２のゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡのヌクレオチド配列はＮＣＢＩデータベースに、それぞれＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＧ＿０１２２５０．２及びＮＭ＿０００６９０．４として登録されている。本発明の核酸分子が標的とする変異型ＡＬＤＨ２遺伝子は、ヒトＡＬＤＨ２遺伝子において観察される一塩基多型であり、具体的には４２，０７６番目（エクソン１２の１０４番目）の塩基のグアニンがアデニンに置き換わったｒｓ６７１変異である。当該変異により前駆体ＡＬＤＨ２でいう５０４番、成熟ＡＬＤＨ２でいう４８７番アミノ酸であるグルタミン酸がリジンに置き換わる。
より詳細には、本発明の核酸分子は、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子（ｒｓ６７１変異）における、配列番号１：
より詳細には、本発明の核酸分子は、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子（ｒｓ６７１変異）における、配列番号１：
【0055】
【化10】
【0056】
で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列中の、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列として含む、核酸分子である。ここで、配列番号１で表されるヌクレオチド配列は、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子のｒｓ６７１変異箇所を含む領域の配列である。変異箇所を太字で示す。
【0057】
変異型ＡＬＤＨ２の遺伝子発現を抑制する配列（以下、単に「発現抑制配列」ともいう）は、ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡの特定の部位のヌクレオチド配列と相補的な配列である。ここで、「相補的な配列」とは、標的配列に対して完全相補的な（即ち、ミスマッチなくハイブリダイズする）配列だけでなく、哺乳動物細胞の生理的条件下で変異型ＡＬＤＨ２のＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得る限り、１ないし数ヌクレオチド、好ましくは、１又は２ヌクレオチドのミスマッチを含む配列であってもよい。例えば、変異型ＡＬＤＨ２のＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列の相補鎖配列に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列が挙げられる。本発明における「ヌクレオチド配列の同一性」は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３）にて計算することができる。また、個々の塩基における相補性は、対象となる塩基とワトソン・クリック型塩基対を形成することに限定されるものではなく、フーグスティーン型塩基対やゆらぎ塩基対(Wobble base pair)を形成することも含む。
【0058】
あるいは、「相補的なヌクレオチド配列」とは、標的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列である。ここで「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6,1999に記載される条件、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）／４５℃でのハイブリダイゼーション、次いで０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ／５０～６５℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
【0059】
発現抑制配列が標的とする変異型ＡＬＤＨ２遺伝子のヌクレオチド配列としては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下のヌクレオチド配列が挙げられる。発現抑制配列は、これらの各標的配列の全部に相補的であってもよいし、該標的配列中の一部に対して相補的であってもよいが、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子への特異性を考慮すれば、各標的配列中の連続する１５ヌクレオチド以上の配列に対して相補的であることが好ましい。また、発現抑制配列は、上記各標的配列中の連続する１５ヌクレオチド以上の配列に加えて、該標的配列に隣接する変異型ＡＬＤＨ２遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的な配列をさらに含むことができる。発現抑制配列が標的とするヌクレオチド配列の長さの上限は特に制限はないが、合成の容易さ等を考慮すれば、例えば１００ヌクレオチド以下、好ましくは５０ヌクレオチド以下、より好ましくは３０ヌクレオチド以下、さらに好ましくは２５ヌクレオチド以下の、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の連続する部分ヌクレオチド配列である。従って、発現抑制配列が標的とするヌクレオチド配列の長さは、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子のヌクレオチド配列中、好ましくは、連続する１５～３０ヌクレオチド、より好ましくは、連続する１５～２５ヌクレオチドの部分ヌクレオチド配列であり得る。
【0060】
本発明の核酸分子は、変異型ＡＬＤＨ２の遺伝子発現を抑制し得る限りＲＮＡであっても、ＤＮＡであってもよく、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、本発明の核酸分子は、変異型ＡＬＤＨ２の遺伝子発現を抑制し得る限り、二本鎖核酸であっても、一本鎖核酸であってもよい。二本鎖核酸の場合、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラとＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡキメラとのハイブリッドのいずれであってもよい。
【0061】
本発明の核酸分子が二本鎖核酸の場合、一方の鎖は変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現抑制配列、即ち、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列中の連続する１５ヌクレオチド以上の配列と相補的な配列を含み（以下、標的となる変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に結合し、遺伝子発現を抑制する配列を含む鎖を「ガイド鎖」ともいう）、他方の鎖は、少なくとも該発現抑制配列に相補的な配列を含む（以下、発現抑制配列に相補的な配列を含む鎖を「パッセンジャー鎖」ともいう）。ここで「相補的な配列」とは、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子のヌクレオチド配列に対する発現抑制配列の相補性について前記したのと同義である。
【0062】
本発明の核酸分子が一本鎖核酸の場合、上記のガイド鎖のみを有する場合と、ガイド鎖とパッセンジャー鎖とが任意のリンカーを介して連結され、分子内で変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を抑制する配列とそれに相補的な配列とがハイブリダイズして二重鎖を形成し得る場合とがある。
【0063】
本発明の核酸分子の構成単位としては、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。これらのヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていても非修飾であってもよい。本発明の核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性が向上し、安定性の改善が可能である。また、本発明の核酸分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【0064】
本発明の核酸分子において、リンカー以外の領域（ガイド鎖やパッセンジャー鎖）の構成単位は、ヌクレオチド残基であることが好ましい。各領域は、例えば、下記（１）～（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【0065】
本発明の核酸分子は、例えば、標識物質で標識化されてもよい。標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、色素としては、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。同位体としては、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられる。安定同位体は、例えば、被曝の危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。安定同位体としては、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
【0066】
ヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。リボヌクレオチド残基は、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）（チミン（Ｔ）に置き換えることもできる）を有し、デオキシリボヌクレオチド残基は、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（ｄＡ）、グアニン（ｄＧ）、シトシン（ｄＣ）およびチミン（ｄＴ）（ウラシル（ｄＵ）に置き換えることもできる）を有する。
【0067】
修飾ヌクレオチド残基は、ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されていてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または脱離、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または脱離であり得る。修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在する修飾ヌクレオチド残基であっても、人工的に修飾したヌクレオチド残基であってもよい。天然由来の修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、リンバックら(Limbach et al.、1994、Summary:the modified nucleosides of RNA、Nucleic Acids Res.22:2183-2196)を参照できる。
【0068】
ヌクレオチド残基の修飾としては、例えば、リボース－リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾があげられる。
【0069】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素原子、フッ素等のハロゲン原子又は－Ｏ－アルキル基（例、－Ｏ－Ｍｅ基）、－Ｏ－アシル基（例、－Ｏ－ＣＯＭｅ基）及びアミノ基からなる群より選ばれる原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基に置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【0070】
リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。非リボリン酸骨格は、例えば、リボリン酸骨格の非荷電体があげられる。非リボリン酸骨格に置換されたヌクレオチドの代替物としては、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、PNA（ペプチド核酸）、LNA（Locked Nucleic Acid）、ENA（2’-O，4’-C-Ethylene bridged Nucleic Acid）等があげられ、好ましくはPNAである。
【0071】
リボリン酸骨格において、リン酸基を修飾することもできる。リボリン酸骨格において、糖残基に最も隣接するリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の2つの酸素原子にわたって、均一に分布している。αリン酸基における4つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である2つの酸素原子は、以下、「非結合（non-linking）酸素」ともいう。他方、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している2つの酸素原子は、以下、「結合（linking）酸素」という。αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、非結合酸素における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【0072】
リン酸基は、例えば、非結合酸素を置換してもよい。非結合酸素は、例えば、S（硫黄）、Se（セレン）、B（ホウ素）、C（炭素）、H（水素）、N（窒素）およびOR（Rは、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Sで置換される。非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がSで置換される。このような修飾リン酸基としては、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記2つの非結合酸素が両方ともSで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【0073】
リン酸基は、例えば、結合酸素を置換してもよい。結合酸素は、例えば、S（硫黄）、C（炭素）およびN（窒素）のいずれかの原子で置換でき、このような修飾リン酸基としては、例えば、Nで置換した架橋ホスホロアミデート、Sで置換した架橋ホスホロチオエート、およびCで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。結合酸素の置換は、例えば、本発明の核酸分子の5’末端ヌクレオチド残基および3’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、5'側の場合、Cによる置換が好ましく、3’側の場合、Nによる置換が好ましい。
【0074】
リン酸基は、例えば、リン非含有のリンカーに置換してもよい。リンカーとしては、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等があげられ、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が挙げられる。
【0075】
本発明の核酸分子は、例えば、3’末端および5’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。当該修飾は前述のとおりであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。リン酸基は全体を修飾してもよいし、リン酸基における1つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【0076】
末端のヌクレオチド残基の修飾としては、例えば、他の分子の付加があげられる。他の分子としては、例えば、標識物質、保護基等の機能性分子があげられる。保護基としては、例えば、S（硫黄）、Si（ケイ素）、B（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明の核酸分子の検出等に利用できる。
【0077】
他の分子は、ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、リン酸基または糖残基に付加してもよい。スペーサーの末端原子は、例えば、リン酸基の結合酸素、または、糖残基のO、N、SもしくはCに、付加または置換できる。糖残基の結合部位は、例えば、3’位のCもしくは5’位のC、またはこれらに結合する原子が好ましい。スペーサーは、例えば、前記PNA等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【0078】
スペーサーは特に制限されず、例えば、-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等が挙げられる。前記式において、nは、正の整数であり、n＝3または6が好ましい。
【0079】
末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンC）、ポルフィリン（TPPC4、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、EDTA）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1，3-ビス-O（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1，3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-（オレオイル）リトコール酸、O3-(オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、PEG（例えば、PEG-40K）、MPEG、［MPEG］2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のEu3+複合体）等があげられる。
【0080】
本発明の核酸分子は、5’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。リン酸基は、例えば、5’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、5’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’－グアノシンキャップ（7-メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’－アデノシンキャップ（Appp）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、5’ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、5’-ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、5’-α-チオ三リン酸、5’-γ-チオ三リン酸等）、5’-ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、5’－アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Rはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、5’-アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Rはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【0081】
ヌクレオチド残基において、塩基は特に制限されない。塩基は、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【0082】
塩基としては、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（nubularine）、イソグアニシン（isoguanisine）、ツベルシジン（tubercidine）等があげられる。塩基は、例えば、2-アミノアデニン、6-メチル化プリン等のアルキル誘導体；2-プロピル化プリン等のアルキル誘導体；5-ハロウラシルおよび5-ハロシトシン；5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシン；6-アゾウラシル、6-アゾシトシンおよび6-アゾチミン；5-ウラシル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-（2-アミノプロピル）ウラシル、5-アミノアリルウラシル；8-ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の8-置換プリン；5-トリフルオロメチル化および他の5-置換ピリミジン；7-メチルグアニン；5-置換ピリミジン；6-アザピリミジン；N-2、N-6、およびO-6置換プリン（2-アミノプロピルアデニンを含む）；5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；3-デアザ－5-アザシトシン；2-アミノプリン；5-アルキルウラシル；7-アルキルグアニン；5-アルキルシトシン；7-デアザアデニン；N6，N6-ジメチルアデニン；2，6-ジアミノプリン；5-アミノ－アリル－ウラシル；N3-メチルウラシル；置換1，2，4-トリアゾール；2-ピリジノン；5-ニトロインドール；3-ニトロピロール；5-メトキシウラシル；ウラシル－5-オキシ酢酸；5-メトキシカルボニルメチルウラシル；5-メチル-2-チオウラシル；5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル；5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル；3-（3-アミノ-3-カルボキシプロピル）ウラシル；3-メチルシトシン；5-メチルシトシン；N4-アセチルシトシン；2-チオシトシン；N6-メチルアデニン；N6-イソペンチルアデニン；2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン；N-メチルグアニン；O-アルキル化塩基等であり得る。また、プリンおよびピリミジンには、例えば、米国特許第3,687,808号、「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」、858～859頁、クロシュビッツ ジェー アイ（Kroschwitz J.I.）編、John Wiley & Sons、1990、およびイングリッシュら（Englischら）、Angewandte Chemie、International Edition、1991、30巻、p.613に開示されるものが含まれる。
【0083】
修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第60/465,665号（出願日：2003年4月25日）、および国際出願第PCT/US04/07070号（出願日：2004年3月8日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【0084】
本発明の核酸分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ－ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。
【0085】
本発明の核酸分子としては、例えば、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するアンチセンス核酸等が挙げられる。また、本発明の核酸分子としては、ガイド鎖とそれに相補的なパッセンジャー鎖とが、リンカーを介して連結された二重鎖を形成し得る一本鎖核酸分子を挙げることができる。
【0086】
（ｉ）変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡとは、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子における、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列の全部もしくは一部と相補的な配列を含むガイド鎖と、それに相補的な配列を含むパッセンジャー鎖とからなる二本鎖オリゴＲＮＡであって、ＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、ガイド鎖中の変異型ＡＬＤＨ２遺伝子にコードされるｍＲＮＡに相補的な配列が当該ｍＲＮＡ中の標的配列と二重鎖を形成することで、当該ｍＲＮＡを切断し、遺伝子発現を抑制する核酸をいう。ここで「相補的な配列」とは、前記と同義である。
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡとは、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子における、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列の全部もしくは一部と相補的な配列を含むガイド鎖と、それに相補的な配列を含むパッセンジャー鎖とからなる二本鎖オリゴＲＮＡであって、ＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、ガイド鎖中の変異型ＡＬＤＨ２遺伝子にコードされるｍＲＮＡに相補的な配列が当該ｍＲＮＡ中の標的配列と二重鎖を形成することで、当該ｍＲＮＡを切断し、遺伝子発現を抑制する核酸をいう。ここで「相補的な配列」とは、前記と同義である。
【0087】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡの長さは、ガイド鎖中に、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列の全部もしくは一部と相補的な配列を含む限り特に限定されないが、ｓｉＲＮＡが標的とするヌクレオチド配列は、原則的には１５～５０ヌクレオチド、好ましくは１９～３０ヌクレオチド、更に好ましくは１９～２７ヌクレオチド、特に好ましくは１９～２１ヌクレオチドであり得る。また、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、５’または３’末端に、付加的なヌクレオチドを有していてもよい。該付加的ヌクレオチドの長さは、通常２～４ヌクレオチド程度であり、ｓｉＲＮＡの全長として１９ヌクレオチド以上である。該付加的ヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的ヌクレオチドの配列としては、例えばｕｇ－３’、ｕｕ－３’、ｔｇ－３’、ｔｔ－３’、ｇｇｇ－３’、ｇｕｕｕ－３’、ｇｔｔｔ－３’、ｔｔｔｔｔ－３’、ｕｕｕｕｕ－３’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0088】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を抑制する配列として、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列の全部もしくは一部に相補的な配列をガイド鎖中に含むが、好ましい一実施態様においては、発現抑制配列として、下記のいずれかのヌクレオチド配列（配列番号２ｎ（ｎは１～１１から選ばれる整数；但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）を含むガイド鎖と、それに相補的なパッセンジャー鎖（好ましくは配列番号２ｎ＋１（ｎは１～１１から選ばれる整数；但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）を含む）とからなる核酸分子等が挙げられる。
【0089】
【表4】
【0090】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、一方もしくは両方の鎖に３’－オーバーハングを有していてもよい。オーバーハングを有する場合、オーバーハングの長さは、特に限定されず、下限が、例えば、１塩基長であり、上限が、例えば、４塩基長、３塩基長であり、範囲が、例えば、１～４塩基長、１～３塩基長、１～２塩基長である。
【0091】
オーバーハングの配列は、特に限定されず、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれであってもよい。オーバーハングの配列は、例えば、３’側から、ＴＴ、ＵＵ、ＣＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＵＧ、ＣＧ、ＡＵ等が例示できる。前記オーバーハングは、例えば、ＴＴ、ＵＵとすることで、ＲＮＡ分解酵素に対する耐性を付加できる。
【0092】
好ましい一実施態様においては、３’－オーバーハングを有する発現抑制配列として、下記のいずれかのヌクレオチド配列（配列番号２ｍ（ｍは１２～４５の整数；但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）を含むガイド鎖と、それに相補的な、３’－オーバーハングを有するパッセンジャー鎖（好ましくは配列番号２ｍ＋１（ｍは１２～４５の整数；但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）を含む）とからなる核酸分子等が挙げられる。
【0093】
【表5-1】
【0094】
【表5-2】
【0095】
【表5-3】
【0096】
【表5-4】
【0097】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡの合成方法は、特に限定されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。合成方法としては、例えば、前記相補的な配列を含む核酸およびそれに相補的な配列の核酸をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０～約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０～約７０℃で約１～約８時間アニーリングさせることにより調製する方法等が挙げられる。また、ｓｉＲＮＡの前駆体となるｓｈＲＮＡを合成し、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）を用いてこれを切断することにより調製することもできる。ｓｉＲＮＡを構成するヌクレオチド残基もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記と同様の修飾を受けていてよい。
【0098】
（ｉｉ）変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するアンチセンス核酸
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するアンチセンス核酸とは、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子における、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列の全部もしくは一部、好ましくは該ヌクレオチド配列中、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的な配列を含み、ＡＬＤＨ２ ＲＮＡ中の標的配列と特異的な二重鎖を形成して結合することにより、遺伝子発現を抑制する作用を有する核酸をいう。ここで「相補的な配列」とは、前記と同義である。
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するアンチセンス核酸とは、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子における、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列の全部もしくは一部、好ましくは該ヌクレオチド配列中、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的な配列を含み、ＡＬＤＨ２ ＲＮＡ中の標的配列と特異的な二重鎖を形成して結合することにより、遺伝子発現を抑制する作用を有する核酸をいう。ここで「相補的な配列」とは、前記と同義である。
【0099】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するアンチセンス核酸の長さは特に限定されないが、例えば、１０～１００ヌクレオチドであり、好ましくは１５～４０ヌクレオチドであり、より好ましくは１５～３０ヌクレオチドであり得る。
【0100】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するアンチセンス核酸は、好ましい一実施態様においては、発現抑制配列として、上記配列番号２ｎ（ｎは１～１１の整数；但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）のいずれかで表されるヌクレオチド配列を含む。
【0101】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するアンチセンス核酸は、ギャップマー型であってもよい。ギャップマー型のアンチセンス核酸とは、ＤＮＡと、その両側に、修飾や架橋が導入された核酸とを有する核酸である。ＤＮＡ鎖を主鎖として、主鎖に相補的なＲＮＡがヘテロ２本鎖核酸を形成し、ＲＮＡは、ＲＮＡａｓｅ Ｈにより分解される。糖部の２’位のＯ－メチル化により、アンチセンス核酸の安定性が向上し、ターゲットへの結合親和性が増大する。また、リン酸結合をホスホロチオエート結合に置換することにより、アンチセンス核酸のヌクレアーゼ耐性が高まる。
【0102】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するアンチセンス核酸の合成方法は、特に限定されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。合成方法としては、例えば、前記相補的な配列を含む核酸をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成することにより調製する方法等が挙げられる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、従来公知の手法により、化学的に合成することができる。
【0103】
（ｉｉｉ）変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子
本発明において、「変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子」とは、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子における、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列の全部もしくは一部と相補的な配列Ｔａを含むガイド鎖配列Ｔと、Ｔａに相補的な配列Ｑａを含むパッセンジャー鎖配列Ｑとが、リンカーＬを介して、５’から３’方向又は３’から５’方向にＴ－Ｌ－Ｑの順序で、かつ配列Ｔａと配列Ｑａとが分子内で二重鎖を形成し得る配向で連結された、ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を抑制する核酸分子をいう。ここで「相補的な配列」とは、前記と同義である。
本発明において、「変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子」とは、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子における、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列の全部もしくは一部と相補的な配列Ｔａを含むガイド鎖配列Ｔと、Ｔａに相補的な配列Ｑａを含むパッセンジャー鎖配列Ｑとが、リンカーＬを介して、５’から３’方向又は３’から５’方向にＴ－Ｌ－Ｑの順序で、かつ配列Ｔａと配列Ｑａとが分子内で二重鎖を形成し得る配向で連結された、ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を抑制する核酸分子をいう。ここで「相補的な配列」とは、前記と同義である。
【0104】
配列Ｔａは、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列の全部又は一部と相補的な配列を含む限り特に限定されないが、Ｔａが標的とするヌクレオチド配列は、原則的には１５～４９ヌクレオチド、好ましくは１９～３０ヌクレオチド、更に好ましくは１９～２７ヌクレオチド、特に好ましくは１９～２１ヌクレオチドであり得る。
【0105】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子は、発現抑制配列として、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列の全部もしくは一部に相補的な配列を、配列Ｔａとしてガイド鎖配列Ｔ中に含むが、好ましい一実施態様においては、配列Ｔａとして、上記配列番号２ｎ（ｎは１～１１の整数；但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）のいずれかで表されるヌクレオチド配列を含むガイド鎖配列Ｔと、配列Ｔａに相補的な配列Ｑａ（好ましくは配列番号２ｎ＋１（ｎは１～１１の整数；但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）のいずれかで表されるヌクレオチド配列）を含むパッセンジャー鎖配列Ｑとを含む核酸分子等が挙げられる。
また、別の実施態様においては、配列Ｔａとして、配列番号２ｎ（ｎは上記と同義）で表されるヌクレオチド配列（但し、該配列中、各ＵはＴであってもよい）を含み、かつ配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列中の、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列を含むガイド鎖配列Ｔと、配列Ｔａに相補的な配列Ｑａ（好ましくは配列Ｑａに完全相補的な配列（但し、ＧとＵとの対合は相補的とみなす））を含むパッセンジャー鎖配列Ｑとを含む核酸分子等が挙げられる。
特に好ましい実施態様において、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子は、配列Ｔａとして、配列番号２ｎ（ｎは１～１１から選ばれる整数）で表されるヌクレオチド配列と、配列Ｑａとして、配列番号２ｎ＋１で表されるヌクレオチド配列とを含む。
また、別の実施態様においては、配列Ｔａとして、配列番号２ｎ（ｎは上記と同義）で表されるヌクレオチド配列（但し、該配列中、各ＵはＴであってもよい）を含み、かつ配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列中の、連続する１５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列を含むガイド鎖配列Ｔと、配列Ｔａに相補的な配列Ｑａ（好ましくは配列Ｑａに完全相補的な配列（但し、ＧとＵとの対合は相補的とみなす））を含むパッセンジャー鎖配列Ｑとを含む核酸分子等が挙げられる。
特に好ましい実施態様において、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子は、配列Ｔａとして、配列番号２ｎ（ｎは１～１１から選ばれる整数）で表されるヌクレオチド配列と、配列Ｑａとして、配列番号２ｎ＋１で表されるヌクレオチド配列とを含む。
【0106】
ガイド鎖配列Ｔは、例えば、配列Ｔａのみからなってもよいし、さらに付加配列Ｔｂを有してもよい。後者の場合、付加配列Ｔｂは変異型ＡＬＤＨ２遺伝子のヌクレオチド配列と相補的であることを要しない。付加配列Ｔｂは、Ｔａの５’末端もしくは３’末端のいずれに付加されてもよく、両端に付加されてもよい（Ｔｂ及びＴｂ’）。好ましくは、ＴａのリンカーＬと連結される側の末端に付加される。配列Ｔｂ（Ｔｂ’）の長さは、例えば、１～３５ヌクレオチドであり、好ましくは、１～２５ヌクレオチドであり、より好ましくは、１～１１ヌクレオチドであり、特に好ましくは、１、２、３、４、５又は６ヌクレオチドである。
【0107】
パッセンジャー鎖配列Ｑは、配列Ｔａに相補的な配列Ｑａを含む限り、特に限定されず、例えば、配列Ｑａのみからなってもよいし、さらに付加配列Ｑｂを有してもよい。後者の場合、付加配列Ｑｂは付加配列Ｔｂと相補的であることを要しないが、相補的であることが望ましく、特に、付加配列Ｔｂ及びＱｂが、それぞれＴａ及びＱａのリンカーＬと連結される側の末端に付加される場合、ＴｂとＱｂとは相補的であることがより望ましい。付加配列Ｑｂは、Ｑａの５’末端もしくは３’末端のいずれに付加されてもよく、両端に付加されてもよい（Ｑｂ及びＱｂ’）。好ましくは、ＱａのリンカーＬと連結される側の末端に付加される。配列Ｙｂ（Ｙｂ’）の長さは、例えば、１～３５ヌクレオチドであり、好ましくは、１～２５ヌクレオチドであり、より好ましくは、１～１１ヌクレオチドであり、特に好ましくは、１、２、３、４、５又は６ヌクレオチドである。
【0108】
ガイド鎖配列Ｔ及びパッセンジャー鎖配列Ｑは、リンカーＬに連結しない側の末端に、さらにオーバーハングを有してもよい。オーバーハングは、好ましくは、ガイド鎖配列及びパッセンジャー鎖配列のうち、その５’末端がリンカーＬに連結される方の配列の３’末端に付加される。
【0109】
オーバーハングの長さは、特に限定されず、下限が、例えば、１ヌクレオチド長であり、上限が、例えば、４ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長であり、範囲が、例えば、１～４ヌクレオチド長、１～３ヌクレオチド長、１～２ヌクレオチド長である。
【0110】
オーバーハングの配列は、特に限定されず、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれであってもよい。オーバーハングの配列は、例えば、５’側から、ＴＴ、ＵＵ、ＣＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＵＧ、ＣＧ、ＡＵ等が例示できる。オーバーハングは、例えば、ＴＴ、ＵＵとすることで、ＲＮＡ分解酵素に対する耐性を付加できる。
【0111】
好ましい一実施態様において、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子は、ヌクレオチド配列Ｔと、ヌクレオチド配列Ｑとが、リンカーＬを介して、５’から３’方向又は３’から５’方向にＴ－Ｌ－Ｑの順序で、かつ配列Ｔａと配列Ｑａとが分子内で二重鎖を形成し得る配向で連結される。リンカーＬは、例えば、ヌクレオチド残基から構成されてもよいし、非ヌクレオチド残基から構成されてもよく、ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。ヌクレオチド残基としては、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。
【0112】
リンカーＬがヌクレオチド残基から構成されている場合、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、同時にリンカーＬのヌクレオチド配列がループ構造を形成することによって、分子全体としてヘアピン型のステム－ループ構造を形成しており、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子は、ｓｈＲＮＡ(small hairpin RNAまたはshort hairpin RNA)とも言える。リンカーＬの長さは、特に限定されないが、例えば、配列Ｔａと配列Ｑａとが分子内で二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。リンカーＬの塩基数は、その下限が、例えば、１塩基、２塩基、３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基、８０塩基、５０塩基である。各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１～５０塩基、１～３０塩基、１～２０塩基、１～１０塩基、１～７塩基、１～４塩基等が例示できるが、これには限定されない。リンカーＬは、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【0113】
非ヌクレオチド残基から構成されているリンカーＬ、又はヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基から構成されているリンカーＬは、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
【0114】
【化11】
【0115】
式（Ｉ）中、例えば、Ｘ１ａおよびＸ１ｂは、共に水素原子であるか、一緒になって＝Ｏ、＝Ｓまたは＝ＮＨを形成し；Ｘ２ａおよびＸ２ｂは、共に水素原子であるか、一緒になって＝Ｏ、＝Ｓまたは＝ＮＨを形成し；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５またはＣ－６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｍＬ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、Ｌ１は、アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｎＬ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、または、Ｌ２は、アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍＬは、０～３０の範囲の整数であり；
ｎＬは、０～３０の範囲の整数であり；
環Ａは、環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
環Ａ内に、炭素－炭素二重結合または炭素－窒素二重結合を含んでもよく、
ヌクレオチド配列Ｔおよびヌクレオチド配列Ｑは、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、非ヌクレオチド構造に結合し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または式（Ｉ）の構造である。
Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５またはＣ－６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｍＬ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、Ｌ１は、アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｎＬ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、または、Ｌ２は、アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍＬは、０～３０の範囲の整数であり；
ｎＬは、０～３０の範囲の整数であり；
環Ａは、環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
環Ａ内に、炭素－炭素二重結合または炭素－窒素二重結合を含んでもよく、
ヌクレオチド配列Ｔおよびヌクレオチド配列Ｑは、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、非ヌクレオチド構造に結合し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または式（Ｉ）の構造である。
【0116】
式（Ｉ）中、Ｘ１ａおよびＸ１ｂは、例えば、共に水素原子であるか、一緒になって＝Ｏ、＝Ｓまたは＝ＮＨを形成する。Ｘ２ａおよびＸ２ｂについても同様である。
【0117】
式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【0118】
式（Ｉ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、ピロリジン骨格である。ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素－炭素二重結合または炭素－窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
【0119】
式（Ｉ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５またはＣ－６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
【0120】
置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
【0121】
Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。置換基は、上記置換基群Ａに記載のものが挙げられ、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルケニルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基であってもよい。
【0122】
保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。保護基は、例えば、文献(J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 PrenumPress, London and New York, 1973)の記載を援用できる。保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２－アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１－ （２－シアノエトキシ） エチル基（ＣＥＥ）、２－シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、シリル含有基もあげられる。以下、同様である。
【0123】
式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｍＬ個の炭素原子からなるアルキレン鎖である。アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【0124】
式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｎＬ個の炭素原子からなるアルキレン鎖である。アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【0125】
Ｌ１のｍＬおよびＬ２のｎＬは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎＬおよびｍＬは、例えば、非ヌクレオチド構造の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎＬおよびｍＬは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０～３０が好ましく、より好ましくは０～２０であり、さらに好ましくは０～１５である。ｎＬとｍＬは、同じでもよいし（ｎＬ＝ｍＬ）、異なってもよい。ｎＬ＋ｍＬは、例えば、０～３０であり、好ましくは０～２０であり、より好ましくは０～１５である。
【0126】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。置換基および保護基は、例えば、前述と同様である。
【0127】
式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【0128】
ヌクレオチド配列Ｔおよびヌクレオチド配列Ｑは、例えば、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、非ヌクレオチド構造に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または式（Ｉ）の構造である。Ｒ１および／またはＲ２がヌクレオチド残基の場合、リンカーＬの構造は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く式（Ｉ）の構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が式（Ｉ）の構造の場合、非ヌクレオチド構造は、例えば、式（Ｉ）の構造からなる非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、複数含む場合、式（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、非ヌクレオチド構造は、例えば、式（Ｉ）の構造からなる非ヌクレオチド残基のみから形成される。
【0129】
ヌクレオチド配列Ｔおよびヌクレオチド配列Ｑと、－ＯＲ１－および－ＯＲ２－との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
ヌクレオチド配列Ｔは、－ＯＲ２－を介して、ヌクレオチド配列Ｑは、－ＯＲ１－を介して、式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
ヌクレオチド配列Ｔは、－ＯＲ１－を介して、ヌクレオチド配列Ｑは、－ＯＲ２－を介して、式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（１）
ヌクレオチド配列Ｔは、－ＯＲ２－を介して、ヌクレオチド配列Ｑは、－ＯＲ１－を介して、式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
ヌクレオチド配列Ｔは、－ＯＲ１－を介して、ヌクレオチド配列Ｑは、－ＯＲ２－を介して、式（Ｉ）の構造と結合する。
【0130】
式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ－１）～式（Ｉ－９）が例示でき、下記式において、ｎＬおよびｍＬは、式（Ｉ）と同じである。下記式において、ｑは、０～１０の整数である。
【0131】
【化12】
【0132】
式（Ｉ－１）～（Ｉ－９）において、ｎＬ、ｍＬおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。
具体例として、式（Ｉ－１）において、ｎＬ＝８、式（Ｉ－２）において、ｎＬ＝３、式（Ｉ－３）において、ｎＬ＝４または８、式（Ｉ－４）において、ｎＬ＝７または８、式（Ｉ－５）において、ｎＬ＝３およびｍＬ＝４、式（Ｉ－６）において、ｎＬ＝８およびｍＬ＝４、式（Ｉ－７）において、ｎＬ＝８およびｍＬ＝４、式（Ｉ－８）において、ｎＬ＝５およびｍＬ＝４、式（Ｉ－９）において、ｑ＝１およびｍＬ＝４があげられる。式（Ｉ－４）の一例（ｎＬ＝８）を、下記式（Ｉ－４ａ）に、式（Ｉ－８）の一例（ｎＬ＝５、ｍＬ＝４）を、下記式（Ｉ－８ａ）に示す。
具体例として、式（Ｉ－１）において、ｎＬ＝８、式（Ｉ－２）において、ｎＬ＝３、式（Ｉ－３）において、ｎＬ＝４または８、式（Ｉ－４）において、ｎＬ＝７または８、式（Ｉ－５）において、ｎＬ＝３およびｍＬ＝４、式（Ｉ－６）において、ｎＬ＝８およびｍＬ＝４、式（Ｉ－７）において、ｎＬ＝８およびｍＬ＝４、式（Ｉ－８）において、ｎＬ＝５およびｍＬ＝４、式（Ｉ－９）において、ｑ＝１およびｍＬ＝４があげられる。式（Ｉ－４）の一例（ｎＬ＝８）を、下記式（Ｉ－４ａ）に、式（Ｉ－８）の一例（ｎＬ＝５、ｍＬ＝４）を、下記式（Ｉ－８ａ）に示す。
【0133】
【化13】
【0134】
また、式（Ｉ－８）の一例（ｎＬ＝５、ｍＬ＝４）である、下記式で表されるプロリン誘導体リンカーを以下に示す。
【0135】
【化14】
【0136】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子としては、例えば、下記の核酸分子を挙げることができる。Ｌは上記の構造で表されるリンカーであり、スペーサー１とスペーサー２とは相補的であることが望ましい。
【0137】
５’－（配列番号２ｎ）－（スペーサー１）－Ｌ－（スペーサー２）－（配列番号２ｎ＋１）－ＵＵ－３’（ｎは１～１１の整数。ＵＵはｔｔであってもよい）
【0138】
特に好ましい実施態様において、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子として、下記の構造を有するものが挙げられる。
【0139】
【表6】
【0140】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子として、Ｔ－Ｌ－Ｑで表されるヘアピン型核酸分子だけでなく、発現抑制配列を含むガイド鎖の両端にリンカーが付加され、各リンカーを介してガイド鎖の一部に相補的なヌクレオチド配列と、ガイド鎖の残りの部分に相補的なヌクレオチド配列とが結合した、ダンベル型の構造を有する一本鎖核酸分子（例えば、特許第４９６８８１１号、特許第４９６５７４５号等）も包含される。
【0141】
さらに、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子はＬ型構造を有する核酸分子であってもよい（Ｌ型一本鎖核酸分子）。Ｌ型一本鎖核酸分子としては、（ｉ）アンチセンス鎖及びセンス鎖の連結がヌクレオシドの糖部の２’，３’間又は２’，５’間をクロスリンクして得られたＬ型一本鎖核酸分子、（ｉｉ）リンカーとして、内部にアミド結合を有するアルキル鎖を用いたＬ型一本鎖核酸分子、（ｉｉｉ）ヌクレオシドの塩基間を直接連結したＬ型一本鎖核酸分子、及び（ｉｖ）ヌクレオシドの糖部の１’がＨで置換され且つ、アンチセンス鎖及びセンス鎖の連結がヌクレオシドの糖部の２’，２’間をクロスリンクして得られたＬ型一本鎖核酸分子が挙げられる。
Ｌ型一本鎖核酸分子としては、下式の一般式：
Ｌ型一本鎖核酸分子としては、下式の一般式：
【0142】
【化15】
【0143】
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２、Ｙ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基又は修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド残基であり、
Ｔ及びＱは、標的核酸配列に対して相補的な、連続する１４～３０個の修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基からなる配列とそれに相補的なリボヌクレオチド配列であり（一方が標的核酸配列に対して相補的な配列であれば、他方はそれに相補的な配列である）、
Ｚは（Ｘ）の糖部分の２’位若しくは５’位と（Ｙ）の糖部分の２’位若しくは３’位を連結するリンカーであり、又は（Ｘ）の塩基部分と（Ｙ）の塩基部分とを連結するリンカーであり、
ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、０～５の整数であり；
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して、０～５の整数である］
で示される核酸分子、が挙げられる。
好適な態様において本発明の核酸分子における
Ｔ及びＱは、標的核酸配列に対して相補的な、連続する１４～３０個の修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基からなる配列とそれに相補的なリボヌクレオチド配列であり（一方が標的核酸配列に対して相補的な配列であれば、他方はそれに相補的な配列である）、
Ｚは（Ｘ）の糖部分の２’位若しくは５’位と（Ｙ）の糖部分の２’位若しくは３’位を連結するリンカーであり、又は（Ｘ）の塩基部分と（Ｙ）の塩基部分とを連結するリンカーであり、
ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、０～５の整数であり；
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して、０～５の整数である］
で示される核酸分子、が挙げられる。
好適な態様において本発明の核酸分子における
【0144】
【化16】
【0145】
の構造は、
【0146】
【化17】
【0147】
【化18】
【0148】
【化19】
【0149】
【化20】
【0150】
【化21】
【0151】
又は
【0152】
【化22】
【0153】
である。
上記式において、
Ａ１およびＡ１’は、それぞれ独立して－Ｏ－、－ＮＲ１ａ－、－Ｓ－又は－ＣＲ１ａＲ１ｂ－であり（ここで、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ２およびＡ２’は、それぞれ独立して－ＣＲ２ａＲ２ｂ－、－ＣＯ－、アルキニル基、アルケニル基又は単結合であり（ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ３およびＡ３’は、それぞれ独立して－Ｏ－又は－ＮＲ３ａ－、－Ｓ－、－ＣＲ３ａＲ３ｂ－又は単結合であり（ここで、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ４およびＡ４’は、それぞれ独立して－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－、－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－環Ｄ－（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）又は単結合であり、
Ａ５およびＡ５’は、それぞれ独立して－ＮＲ５ａ－又は単結合であり（ここで、Ｒ５ａは水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ６およびＡ６’は、それぞれ独立して－（ＣＲ６ａＲ６ｂ）ｎ－又は単結合であり（ここで、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）、
Ｗ１は、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－、－ＣＯ－、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＣＯＯ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＣＯＯ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－Ｏ－（ＣＲ１Ｒ２ＣＲ１Ｒ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－環Ｄ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－又は－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＳＳ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－であり（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり；Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基でありｎは１～６の整数である）、
Ｅ２およびＥ２’は、それぞれ独立して－ＣＲ２ａＲ２ｂ－、－ＣＯ－、アルキニル基、アルケニル基又は単結合であり（ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ３およびＥ３’は、それぞれ独立して－Ｏ－又は－ＮＲ３ａ－、－Ｓ－、－ＣＲ３ａＲ３ｂ－又は単結合であり（ここで、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ４およびＥ４’は、それぞれ独立して－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－、－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－環Ｄ－（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり；Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）又は単結合であり、
Ｅ５およびＥ５’は、それぞれ独立して－ＮＲ５ａ－又は単結合であり（ここで、Ｒ５ａは水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ６およびＥ６’は、それぞれ独立して－（ＣＲ６ａＲ６ｂ）ｎ－又は単結合である（ここで、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり：ｎは１～６の整数である）。
上記式において、
Ａ１およびＡ１’は、それぞれ独立して－Ｏ－、－ＮＲ１ａ－、－Ｓ－又は－ＣＲ１ａＲ１ｂ－であり（ここで、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ２およびＡ２’は、それぞれ独立して－ＣＲ２ａＲ２ｂ－、－ＣＯ－、アルキニル基、アルケニル基又は単結合であり（ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ３およびＡ３’は、それぞれ独立して－Ｏ－又は－ＮＲ３ａ－、－Ｓ－、－ＣＲ３ａＲ３ｂ－又は単結合であり（ここで、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ４およびＡ４’は、それぞれ独立して－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－、－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－環Ｄ－（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）又は単結合であり、
Ａ５およびＡ５’は、それぞれ独立して－ＮＲ５ａ－又は単結合であり（ここで、Ｒ５ａは水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ａ６およびＡ６’は、それぞれ独立して－（ＣＲ６ａＲ６ｂ）ｎ－又は単結合であり（ここで、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）、
Ｗ１は、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－、－ＣＯ－、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＣＯＯ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＣＯＯ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－Ｏ－（ＣＲ１Ｒ２ＣＲ１Ｒ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－、－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－環Ｄ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－又は－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－ＳＳ－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－であり（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり；Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基でありｎは１～６の整数である）、
Ｅ２およびＥ２’は、それぞれ独立して－ＣＲ２ａＲ２ｂ－、－ＣＯ－、アルキニル基、アルケニル基又は単結合であり（ここで、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ３およびＥ３’は、それぞれ独立して－Ｏ－又は－ＮＲ３ａ－、－Ｓ－、－ＣＲ３ａＲ３ｂ－又は単結合であり（ここで、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ４およびＥ４’は、それぞれ独立して－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－、－（ＣＲ４ａＲ４ｂ）ｎ－環Ｄ－（ここで、環Ｄは、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１０のヘテロアリール基、炭素数４～１０のシクロアルキル基又は炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基であり；Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり；ｎは１～６の整数である）又は単結合であり、
Ｅ５およびＥ５’は、それぞれ独立して－ＮＲ５ａ－又は単結合であり（ここで、Ｒ５ａは水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基である）、
Ｅ６およびＥ６’は、それぞれ独立して－（ＣＲ６ａＲ６ｂ）ｎ－又は単結合である（ここで、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり：ｎは１～６の整数である）。
【0154】
上記式において、「炭素数１～１０のアルキル基」、「炭素数６～１０のアリール基」、「炭素数２～１０のヘテロアリール基」、「炭素数４～１０のシクロアルキル基」及び「炭素数４～１０のヘテロシクロアルキル基」は置換可能な位置で置換されていてもよく、置換基としては前述の置換基群Ａに記載のものが挙げられる。
【0155】
ここで、当該Ｌ型一本鎖核酸分子は、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を抑制する配列として、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で示される領域中の連続する２５ヌクレオチド以下の標的配列の全部もしくは一部に相補的な配列をアンチセンス鎖中に含むが、好ましい一実施態様においては、発現抑制配列として、下記のいずれかのヌクレオチド配列（配列番号２ｋ（ｋは９３～１３２から選ばれる整数；但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）を含むアンチセンス鎖と、それに相補的なセンス鎖（好ましくは配列番号２ｋ－１（ｋは９３～１３２から選ばれる整数；但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）を含む）とからなる核酸分子等が挙げられる。
【0156】
【表7-1】
【0157】
【表7-2】
【0158】
【表7-3】
【0159】
上段：センス鎖、下段：アンチセンス鎖
【0160】
特に好ましい実施態様において、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対するＬ型一本鎖核酸分子として、下記の構造を有するものが挙げられる。
【0161】
【表8-1】
【0162】
【表8-2】
【0163】
【表8-3】
【0164】
【表8-4】
【0165】
【表8-5】
【0166】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子の合成方法は、特に限定されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。合成方法としては、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ－ホスホネート法等があげられる。化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。
【0167】
変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子が、天然の非修飾リボヌクレオチド残基のみで構成される場合、該核酸分子の前駆体として、該核酸分子を発現可能な状態でコードするベクターの形態で提供することもできる。該発現ベクターは、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子に対する一本鎖核酸分子をコードするＤＮＡを標的細胞内で機能的なプロモーターの制御下に含むことを特徴とし、その他の構成は何ら制限されない。前記ＤＮＡを挿入するベクターは特に制限されず、一般的なベクターを使用することができ、例えば、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター等があげられる。非ウイルスベクターとしては、例えば、プラスミドベクターがあげられる。該発現ベクターを、自体公知の遺伝子導入法を用いて、標的細胞（変異型ＡＬＤＨ２遺伝子を発現し得る哺乳動物細胞）に導入することにより、該細胞内での変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を抑制することができる。
【0168】
２．変異型ＡＬＤＨ２遺伝子発現抑制剤・ＡＬＤＨ２が欠損して発症する疾患治療・予防剤
本発明の核酸分子は、前述のように、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を抑制することができる。したがって、本発明の核酸分子は、変異型ＡＬＤＨ２の発現を抑制することで、ＡＬＤＨ２が欠損して発症する疾患の治療及び発症予防に有効である。ＡＬＤＨ２が欠損して発症する疾患としては、生後低身長・低体重、軽度の精神発達遅延、及び再生不良性貧血等が挙げられる。また、ＡＤＤ症候群やファンコニ貧血とＡＬＤＨ２欠損との関連性も報告されている。
本発明の核酸分子は、前述のように、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を抑制することができる。したがって、本発明の核酸分子は、変異型ＡＬＤＨ２の発現を抑制することで、ＡＬＤＨ２が欠損して発症する疾患の治療及び発症予防に有効である。ＡＬＤＨ２が欠損して発症する疾患としては、生後低身長・低体重、軽度の精神発達遅延、及び再生不良性貧血等が挙げられる。また、ＡＤＤ症候群やファンコニ貧血とＡＬＤＨ２欠損との関連性も報告されている。
【0169】
本発明の医薬は、有効量の本発明の核酸分子を単独で用いてもよいし、任意の担体、例えば医薬上許容される担体とともに、医薬組成物として製剤化することもできる。
【0170】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【0171】
本発明の核酸分子の標的細胞内への導入を促進するために、本発明の医薬は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン；リポソーム；ナノパーティクル；リポフェクチン、リプフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。
【0172】
好ましい一実施態様において、本発明の医薬は、本発明の核酸分子がリポソームに封入されてなる医薬組成物であり得る。リポソームは、１以上の脂質二重層により包囲された内相を有する微細閉鎖小胞であり、通常は水溶性物質を内相に、脂溶性物質を脂質二重層内に保持することができる。本明細書において「封入」という場合には、本発明の核酸分子はリポソーム内相に保持されてもよいし、脂質二重層内に保持されてもよい。本発明に用いられるリポソームは単層膜であっても多層膜であってもよく、また、粒子径は、例えば１０～１０００ｎｍ、好ましくは５０～３００ｎｍの範囲で適宜選択できる。標的組織への送達性を考慮すると、粒子径は、例えば２００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下であり得る。
【0173】
核酸のような水溶性化合物のリポソームへの封入法としては、リピドフィルム法（ボルテックス法）、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、凍結融解法、リモートローディング法等が挙げられるが、これらに限定されず、任意の公知の方法を適宜選択することができる。
【0174】
別の好ましい一実施態様において、本発明の医薬は、本発明の核酸分子のリガンドとのコンジュゲート体として投与される医薬組成物であり得る。一例として、糖鎖の一種であるＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）が付加された核酸分子が挙げられる。ＧａｌＮＡｃは肝実質細胞の細胞表面に特異的に発現するアシアロ糖タンパク質受容体と強く結合し、エンドサイトーシスされるが、この受容体はエンドサイトーシスとエキソサイトーシスのリサイクリングが活発に行われるため、核酸分子が効率よく肝実質細胞に引き込まれる。
【0175】
本発明の医薬は、経口的にまたは非経口的に、哺乳動物（例、ヒト、ネコ、フェレット、ミンク、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル）に対して投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。
【0176】
非経口的な投与（例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
非経口的な投与に好適な別の製剤としては、噴霧剤等を挙げることが出来る。
非経口的な投与に好適な別の製剤としては、噴霧剤等を挙げることが出来る。
【0177】
医薬組成物中の本発明の核酸分子の含有量は、例えば、医薬組成物全体の約０．１ないし１００重量％である。
【0178】
本発明の医薬の投与量は、投与の目的、投与方法、対象疾患の種類、重篤度、投与対象の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、例えば、成人に全身投与する場合、通常、本発明の核酸分子の一回投与量として２ｎｍｏｌ／ｋｇ以上５０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下、局所投与する場合、１ｐｍｏｌ／ｋｇ以上１０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下が望ましい。かかる投与量を１～１０回、より好ましくは５～１０回投与することが望ましい。
【0179】
本発明の医薬は、例えば、他のＡＬＤＨ２が欠損して発症する疾患に対する治療効果が報告されている他の医薬と組み合わせて用いることができる。これらの併用薬剤は、本発明の医薬とともに製剤化して単一の製剤として投与することもできるし、あるいは、本発明の医薬とは別個に製剤化して、本発明の医薬と同一もしくは別ルートで、同時もしくは時間差をおいて投与することもできる。また、これらの併用薬剤の投与量は、該薬剤を単独投与する場合に通常用いられる量であってよく、あるいは通常用いられる量より減量することもできる。
【0180】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されない。
【実施例0181】
実施例１：二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成
表９に示すｓｉＲＮＡをホスホロアミダイト法に基づき合成した。
表９に示すｓｉＲＮＡをホスホロアミダイト法に基づき合成した。
【0182】
【表9-1】
【0183】
【表9-2】
【0184】
【表9-3】
【0185】
【表9-4】
【0186】
式中の各記号の定義は以下の通り：
下線：一塩基多型の変異
イタリック体の下線：ミスマッチ
下線（波線）：ヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合
□：２’－Ｏｍｅ ＲＮＡ
小文字：２’－Ｆ ＲＮＡ
下線：一塩基多型の変異
イタリック体の下線：ミスマッチ
下線（波線）：ヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合
□：２’－Ｏｍｅ ＲＮＡ
小文字：２’－Ｆ ＲＮＡ
【0187】
実施例２：Ｌ型一本鎖核酸分子の合成
表１０に示す核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ ３９００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、アプライドバイオシステムス）により合成した。ＲＮＡアミダイトとして、ＥＭＭアミダイト（ＷＯ／２０１３／０２７８４３）あるいはＴＢＤＭＳアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ）を用い、２’位架橋用アミダイトとしてＡＥＭアミダイトあるいはＡＥＣアミダイトを用いた。アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成した核酸分子は、ＨＰＬＣにより精製した。
表１０に示す核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ ３９００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、アプライドバイオシステムス）により合成した。ＲＮＡアミダイトとして、ＥＭＭアミダイト（ＷＯ／２０１３／０２７８４３）あるいはＴＢＤＭＳアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ）を用い、２’位架橋用アミダイトとしてＡＥＭアミダイトあるいはＡＥＣアミダイトを用いた。アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成した核酸分子は、ＨＰＬＣにより精製した。
【0188】
【表10-1】
【0189】
【表10-2】
【0190】
【表10-3】
【0191】
【表10-4】
【0192】
上段はＱ配列、下段はＴ配列
式中の各記号の定義は以下の通り：
下線：一塩基多型の変異
イタリック体の下線：ミスマッチ
下線（波線）：ヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合
□：２’－Ｏｍｅ ＲＮＡ
小文字：２’－Ｆ ＲＮＡ
細字の下線：Ｗｏｂｂｌｅ ｐａｉｒ
塩基同士を結ぶ線は、－Ｚ－に相当する部分であり、該部位で相補鎖と結合し得ることを意味する。
式中の各記号の定義は以下の通り：
下線：一塩基多型の変異
イタリック体の下線：ミスマッチ
下線（波線）：ヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合
□：２’－Ｏｍｅ ＲＮＡ
小文字：２’－Ｆ ＲＮＡ
細字の下線：Ｗｏｂｂｌｅ ｐａｉｒ
塩基同士を結ぶ線は、－Ｚ－に相当する部分であり、該部位で相補鎖と結合し得ることを意味する。
【0193】
実施例３：一本鎖核酸分子の合成
表１１に示す各一本鎖核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ ３９００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、アプライドバイオシステムス）により３’側から５’側に向かって合成した。合成には、ＲＮＡアミダイトとしてＥＭＭアミダイト（ＷＯ／２０１３／０２７８４３）を用いた。また、リンカー領域にはＬ－プロリンアミダイト（ＷＯ／２０１２／０１７９１９）を用いた。アミダイトの脱保護は、ＷＯ／２０１３／０２７８４３に記載の方法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、ＨＰＬＣにより精製した。
本発明の一本鎖核酸分子のリンカー領域には、下記Ｌ－プロリンアミダイト（以下、Ｐとする）を用いた。
表１１に示す各一本鎖核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ ３９００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、アプライドバイオシステムス）により３’側から５’側に向かって合成した。合成には、ＲＮＡアミダイトとしてＥＭＭアミダイト（ＷＯ／２０１３／０２７８４３）を用いた。また、リンカー領域にはＬ－プロリンアミダイト（ＷＯ／２０１２／０１７９１９）を用いた。アミダイトの脱保護は、ＷＯ／２０１３／０２７８４３に記載の方法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、ＨＰＬＣにより精製した。
本発明の一本鎖核酸分子のリンカー領域には、下記Ｌ－プロリンアミダイト（以下、Ｐとする）を用いた。
【0194】
【化23】
【0195】
【表11】
【0196】
式中の各記号の定義は以下の通り：
下線：一塩基多型の変異
イタリック体の下線：ミスマッチ
下線（波線）：ヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合
□：２’－Ｏｍｅ ＲＮＡ
小文字：２’－Ｆ ＲＮＡ
Ｐ：前記式で表されるプロリン誘導体リンカー
下線：一塩基多型の変異
イタリック体の下線：ミスマッチ
下線（波線）：ヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート結合
□：２’－Ｏｍｅ ＲＮＡ
小文字：２’－Ｆ ＲＮＡ
Ｐ：前記式で表されるプロリン誘導体リンカー
【0197】
実施例４：ＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡ ＫＤ活性評価（ＳＮＰ選択的ＲＴ－ｑＰＣＲ）
ＪＨＨ－７細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより分与）は、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液により培養ディッシュから剥がし、細胞数を計測した後、２．５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ Ｍｅｄｉｕｍ(Thermo Fisher Scientific) で調整した。次に、２４ウェルプレートに１ウェル当たり９８μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ(Invitrogen)に対し、１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ(Invitrogen)となるように調整した混合液を９９μＬずつ分注した。実施例１～３で調製した各核酸分子（５μＭ）を１μＬずつウェルに加え、室温にて１５分間静置した後、細胞数を調節した細胞懸濁液を４００μＬずつウェルに加え、培養を開始した。
培養２４時間後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ(QIAGEN)を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出及び精製を行った。尚、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いたｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出及び精製は、製品プロトコルに従った。回収したｔｏｔａｌ ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ(Thermo Fisher Scientific)を用い、濃度を測定した。測定後、ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、１０ｎｇ／μＬとなるように注射用水（大塚製薬）で希釈し、これを逆転写反応のテンプレートとした。逆転写反応には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(Perfect Real Time)（タカラバイオ） を用いた。表１２に従い、ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘを調整し、９６ウェル ＰＣＲプレートにｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘを５μＬずつ加え、テンプレートを５μＬずつ加えた。スピンダウンを行った後、サーマルサイクラーを用い、反応を開始した。反応条件は、表１３の通りである。
ＪＨＨ－７細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより分与）は、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液により培養ディッシュから剥がし、細胞数を計測した後、２．５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ Ｍｅｄｉｕｍ(Thermo Fisher Scientific) で調整した。次に、２４ウェルプレートに１ウェル当たり９８μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ(Invitrogen)に対し、１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ(Invitrogen)となるように調整した混合液を９９μＬずつ分注した。実施例１～３で調製した各核酸分子（５μＭ）を１μＬずつウェルに加え、室温にて１５分間静置した後、細胞数を調節した細胞懸濁液を４００μＬずつウェルに加え、培養を開始した。
培養２４時間後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ(QIAGEN)を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出及び精製を行った。尚、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いたｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出及び精製は、製品プロトコルに従った。回収したｔｏｔａｌ ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ(Thermo Fisher Scientific)を用い、濃度を測定した。測定後、ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、１０ｎｇ／μＬとなるように注射用水（大塚製薬）で希釈し、これを逆転写反応のテンプレートとした。逆転写反応には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(Perfect Real Time)（タカラバイオ） を用いた。表１２に従い、ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘを調整し、９６ウェル ＰＣＲプレートにｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘを５μＬずつ加え、テンプレートを５μＬずつ加えた。スピンダウンを行った後、サーマルサイクラーを用い、反応を開始した。反応条件は、表１３の通りである。
【0198】
【表12】
【0199】
【表13】
【0200】
反応終了後、各ウェルに１４０μＬの注射用水を加えた。攪拌した後、スピンダウンし、－３０℃で保存した。ｑＰＣＲは、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ－Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アジレント・テクノロジー）を使用した。表１４に従いｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘを調整した。尚、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒの配列は、５’－ＡＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴＡＣＧＧＧＣＴ－３’（配列番号１８２）とし、野生型ＡＬＤＨ２を検出する場合のＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒの配列は、５’－ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣ－３’（配列番号１８３）であり、変異型ＡＬＤＨ２を検出する場合のＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒの配列は、５’－ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴ－３’（配列番号１８４）であった。
【0201】
【表14】
【0202】
調整したｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘを９６ウェル ＰＣＲプレートに１４μＬずつ加え、ｃＤＮＡを６μＬずつ加えた。スピンダウンを行った後、リアルタイム定量ＰＣＲシステムを用い、反応を開始した。反応条件は、表１５の通りである。
【0203】
【表15】
【0204】
反応終了後、各サンプルのＣｔ値からΔΔＣｔ法によりＭｏｃｋに対するＡＬＤＨ２（野生型、変異型）の相対発現量を算出した。尚、相対発現量は、ＨＰＲＴ１により標準化した。
結果を表１６に示す。
結果を表１６に示す。
【0205】
実施例５：ＡＬＤＨ２酵素活性測定
ＡＬＤＨ２酵素活性の測定には、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ａｌｄｅｈｙｄｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＬＤＨ２） Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （ａｂｃａｍ）を使用した。キット内の１×Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒには、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとしてｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌを加えた。
ＪＨＨ－７細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液により培養ディッシュから剥がし、細胞数を計測した後、２．５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ Ｍｅｄｉｕｍで調整した。次に、１０ｃｍディッシュに１ディッシュ当たり１，９６０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに対し、２０ μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸとなるように調整した混合液を１，９８０μＬずつディッシュに分注した。実施例１～３で調製した各核酸分子（５μＭ）を２０μＬずつディッシュに加え、室温にて１５分間静置した後、細胞数を調節した細胞懸濁液を８ ｍＬずつディッシュに加え、培養を開始した。
培養３日後、ＪＨＨ－７細胞はトリプシン－ＥＤＴＡ溶液により培養ディッシュから剥がし、１．５ ｍＬチューブに回収し、遠心分離（１，０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）した。上清を除き、ＰＢＳ（－）で洗浄し、遠心分離（１，０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）した。再度上清を除き、ＰＢＳ（－）で洗浄し、遠心分離（１，０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）した。上清を除き、５０μＬの１×Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを加えた。氷上で２０分間静置したのち、遠心分離 （１６，０００×ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）した。上清を新たな１．５ｍＬチューブに移し、これをサンプルとした。サンプルの一部は、タンパク質定量によって総タンパク濃度を測定した。以降の操作は、製品プロトコルに従った。マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１０分毎に６０分間、計６回吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。得られた吸光度から近似曲線の傾きを算出し、これをタンパク質濃度で除することで単位タンパク質当たりのＡＬＤＨ２活性とし、Ｍｏｃｋに対する相対活性を求めた。結果を表１６に示す。
ＡＬＤＨ２酵素活性の測定には、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ａｌｄｅｈｙｄｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＬＤＨ２） Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （ａｂｃａｍ）を使用した。キット内の１×Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒには、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとしてｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌを加えた。
ＪＨＨ－７細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液により培養ディッシュから剥がし、細胞数を計測した後、２．５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ Ｍｅｄｉｕｍで調整した。次に、１０ｃｍディッシュに１ディッシュ当たり１，９６０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに対し、２０ μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸとなるように調整した混合液を１，９８０μＬずつディッシュに分注した。実施例１～３で調製した各核酸分子（５μＭ）を２０μＬずつディッシュに加え、室温にて１５分間静置した後、細胞数を調節した細胞懸濁液を８ ｍＬずつディッシュに加え、培養を開始した。
培養３日後、ＪＨＨ－７細胞はトリプシン－ＥＤＴＡ溶液により培養ディッシュから剥がし、１．５ ｍＬチューブに回収し、遠心分離（１，０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）した。上清を除き、ＰＢＳ（－）で洗浄し、遠心分離（１，０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）した。再度上清を除き、ＰＢＳ（－）で洗浄し、遠心分離（１，０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）した。上清を除き、５０μＬの１×Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを加えた。氷上で２０分間静置したのち、遠心分離 （１６，０００×ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）した。上清を新たな１．５ｍＬチューブに移し、これをサンプルとした。サンプルの一部は、タンパク質定量によって総タンパク濃度を測定した。以降の操作は、製品プロトコルに従った。マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１０分毎に６０分間、計６回吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。得られた吸光度から近似曲線の傾きを算出し、これをタンパク質濃度で除することで単位タンパク質当たりのＡＬＤＨ２活性とし、Ｍｏｃｋに対する相対活性を求めた。結果を表１６に示す。
【0206】
【表16-1】
【0207】
【表16-2】
【産業上の利用可能性】
【0208】
本発明により、変異型ＡＬＤＨ２遺伝子の発現を効果的に抑制できる核酸分子、および該核酸分子を含む医薬が提供される。該医薬は、ＡＬＤＨ２活性を向上させ、ホルムアルデヒド代謝異常を改善することにより、ＡＤＤ(Aldehyde degradation deficiency)/AMeD(Aplastic anemia, Mental retardation, and Dwarfism)症候群やファンコニ貧血の治療及び／又は予防剤として極めて有用である。
【配列表】