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特開2024-35891抗病性及び病原体遺伝子の同時検査方法並びに抗病性及び病原体遺伝子の同時検査キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024035891
(43)【公開日】2024-03-15
(54)【発明の名称】抗病性及び病原体遺伝子の同時検査方法並びに抗病性及び病原体遺伝子の同時検査キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20240308BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20240308BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALI20240308BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240308BHJP
C12N 15/33 20060101ALN20240308BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12Q1/6888 Z
C12Q1/6883 Z
C12N15/12
C12N15/33
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022140503
(22)【出願日】2022-09-05
(71)【出願人】
【識別番号】504224153
【氏名又は名称】国立大学法人 宮崎大学
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100168114
【弁理士】
【氏名又は名称】山中 生太
(74)【代理人】
【識別番号】100133592
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100162259
【弁理士】
【氏名又は名称】末富 孝典
(72)【発明者】
【氏名】関口 敏
(72)【発明者】
【氏名】野津 昂亮
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA07
4B063QA19
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS32
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】牛伝染性リンパ腫に関する抗病性及び病原体遺伝子を簡便かつ迅速に検査することができる抗病性及び病原体遺伝子の同時検査方法を提供する。
【解決手段】同時検査方法は、検査対象牛のゲノムＤＮＡと、ゲノムＤＮＡにおける牛伝染性リンパ腫に対する抗病性に関連する対立遺伝子に含まれる塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第１のプライマー対と、第１のプライマー対で増幅された塩基配列を検出するための第１のプローブと、ゲノムＤＮＡに組み込まれた牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスの遺伝子に含まれる塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第２のプライマー対と、第２のプライマー対で増幅された塩基配列を検出するための第２のプローブと、を含む反応液で増幅反応を行う反応ステップを含む。
【選択図】図２２
【解決手段】同時検査方法は、検査対象牛のゲノムＤＮＡと、ゲノムＤＮＡにおける牛伝染性リンパ腫に対する抗病性に関連する対立遺伝子に含まれる塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第１のプライマー対と、第１のプライマー対で増幅された塩基配列を検出するための第１のプローブと、ゲノムＤＮＡに組み込まれた牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスの遺伝子に含まれる塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第２のプライマー対と、第２のプライマー対で増幅された塩基配列を検出するための第２のプローブと、を含む反応液で増幅反応を行う反応ステップを含む。
【選択図】図２２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
検査対象牛のゲノムＤＮＡと、
前記ゲノムＤＮＡにおける牛伝染性リンパ腫に対する抗病性に関連する対立遺伝子に含まれる第１の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第１のプライマー対と、
第１の蛍光色素と前記第１の蛍光色素の発光を抑制する第１の消光剤とを有し、前記第１のプライマー対で増幅された前記第１の塩基配列にハイブリダイズして前記第１の消光剤による前記第１の蛍光色素の発光の抑制を解除する第１のプローブと、
前記ゲノムＤＮＡに組み込まれた牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスの遺伝子に含まれる第２の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第２のプライマー対と、
第２の蛍光色素と前記第２の蛍光色素の発光を抑制する第２の消光剤とを有し、前記第２のプライマー対で増幅された前記第２の塩基配列にハイブリダイズして前記第２の消光剤による前記第２の蛍光色素の発光の抑制を解除する第２のプローブと、
を含む反応液で増幅反応を行う反応ステップを含む、
抗病性及び病原体遺伝子の同時検査方法。
前記ゲノムＤＮＡにおける牛伝染性リンパ腫に対する抗病性に関連する対立遺伝子に含まれる第１の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第１のプライマー対と、
第１の蛍光色素と前記第１の蛍光色素の発光を抑制する第１の消光剤とを有し、前記第１のプライマー対で増幅された前記第１の塩基配列にハイブリダイズして前記第１の消光剤による前記第１の蛍光色素の発光の抑制を解除する第１のプローブと、
前記ゲノムＤＮＡに組み込まれた牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスの遺伝子に含まれる第２の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第２のプライマー対と、
第２の蛍光色素と前記第２の蛍光色素の発光を抑制する第２の消光剤とを有し、前記第２のプライマー対で増幅された前記第２の塩基配列にハイブリダイズして前記第２の消光剤による前記第２の蛍光色素の発光の抑制を解除する第２のプローブと、
を含む反応液で増幅反応を行う反応ステップを含む、
抗病性及び病原体遺伝子の同時検査方法。
【請求項2】
前記反応液は、
前記ゲノムＤＮＡにおけるハウスキーピング遺伝子に含まれる第３の塩基配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅する第３のプライマー対と、
第３の蛍光色素と前記第３の蛍光色素の発光を抑制する第３の消光剤とを有し、前記第３のプライマー対で増幅された前記第３の塩基配列にハイブリダイズして前記第３の消光剤による前記第３の蛍光色素の発光の抑制を解除する第３のプローブと、
をさらに含む、
請求項１に記載の同時検査方法。
前記ゲノムＤＮＡにおけるハウスキーピング遺伝子に含まれる第３の塩基配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅する第３のプライマー対と、
第３の蛍光色素と前記第３の蛍光色素の発光を抑制する第３の消光剤とを有し、前記第３のプライマー対で増幅された前記第３の塩基配列にハイブリダイズして前記第３の消光剤による前記第３の蛍光色素の発光の抑制を解除する第３のプローブと、
をさらに含む、
請求項１に記載の同時検査方法。
【請求項3】
前記反応ステップでは、
Ｗ／Ｏエマルションにおける前記反応液を含むドロップレット内で前記増幅反応を行う、
請求項１又は２に記載の同時検査方法。
Ｗ／Ｏエマルションにおける前記反応液を含むドロップレット内で前記増幅反応を行う、
請求項１又は２に記載の同時検査方法。
【請求項4】
前記対立遺伝子は、
牛伝染性リンパ腫ウイルス抵抗性型であるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２と、
牛伝染性リンパ腫ウイルス感受性型であるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１と、
であって、
前記反応液は、
前記第１のプライマー対として、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２に対して、塩基配列が配列番号１に示されるフォワードプライマーと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１に対して、塩基配列が配列番号２に示されるフォワードプライマーと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２及びＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１に共通の、塩基配列が配列番号３に示されるリバースプライマーと、
を含み、
前記第１のプローブとして、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するための、塩基配列が配列番号４に示されるプローブと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１を検出するための、塩基配列が配列番号５に示されるプローブと、
を含み、
前記第２のプライマー対として、
塩基配列が配列番号６に示されるフォワードプライマーと、
塩基配列が配列番号７に示されるリバースプライマーと、
を含み、
前記第２のプローブとして、
塩基配列が配列番号８に示されるプローブを含む、
請求項１又は２に記載の同時検査方法。
牛伝染性リンパ腫ウイルス抵抗性型であるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２と、
牛伝染性リンパ腫ウイルス感受性型であるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１と、
であって、
前記反応液は、
前記第１のプライマー対として、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２に対して、塩基配列が配列番号１に示されるフォワードプライマーと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１に対して、塩基配列が配列番号２に示されるフォワードプライマーと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２及びＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１に共通の、塩基配列が配列番号３に示されるリバースプライマーと、
を含み、
前記第１のプローブとして、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するための、塩基配列が配列番号４に示されるプローブと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１を検出するための、塩基配列が配列番号５に示されるプローブと、
を含み、
前記第２のプライマー対として、
塩基配列が配列番号６に示されるフォワードプライマーと、
塩基配列が配列番号７に示されるリバースプライマーと、
を含み、
前記第２のプローブとして、
塩基配列が配列番号８に示されるプローブを含む、
請求項１又は２に記載の同時検査方法。
【請求項5】
配列番号１に示される前記フォワードプライマー及び配列番号２に示される前記フォワードプライマーの３’末端の核酸は、ロック核酸である、
請求項４に記載の同時検査方法。
請求項４に記載の同時検査方法。
【請求項6】
同一の増幅反応系内におけるポリメラーゼ連鎖反応に使用される以下（ａ）～（ｄ）の試薬を備える、抗病性及び病原体遺伝子の同時検査キット。
（ａ）検査対象牛のゲノムＤＮＡにおける牛伝染性リンパ腫に対する抗病性に関連する対立遺伝子に含まれる第１の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第１のプライマー対
（ｂ）第１の蛍光色素と前記第１の蛍光色素の発光を抑制する第１の消光剤とを有し、前記第１のプライマー対で増幅された前記第１の塩基配列にハイブリダイズして前記第１の消光剤による前記第１の蛍光色素の発光の抑制を解除する第１のプローブ
（ｃ）前記ゲノムＤＮＡに組み込まれた牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスの遺伝子に含まれる第２の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第２のプライマー対
（ｄ）第２の蛍光色素と前記第２の蛍光色素の発光を抑制する第２の消光剤とを有し、前記第２のプライマー対で増幅された前記第２の塩基配列にハイブリダイズして前記第２の消光剤による前記第２の蛍光色素の発光の抑制を解除する第２のプローブ
（ａ）検査対象牛のゲノムＤＮＡにおける牛伝染性リンパ腫に対する抗病性に関連する対立遺伝子に含まれる第１の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第１のプライマー対
（ｂ）第１の蛍光色素と前記第１の蛍光色素の発光を抑制する第１の消光剤とを有し、前記第１のプライマー対で増幅された前記第１の塩基配列にハイブリダイズして前記第１の消光剤による前記第１の蛍光色素の発光の抑制を解除する第１のプローブ
（ｃ）前記ゲノムＤＮＡに組み込まれた牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスの遺伝子に含まれる第２の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第２のプライマー対
（ｄ）第２の蛍光色素と前記第２の蛍光色素の発光を抑制する第２の消光剤とを有し、前記第２のプライマー対で増幅された前記第２の塩基配列にハイブリダイズして前記第２の消光剤による前記第２の蛍光色素の発光の抑制を解除する第２のプローブ
【請求項7】
前記増幅反応系内におけるポリメラーゼ連鎖反応に使用される以下（ｅ）及び（ｆ）の試薬をさらに備える、
請求項６に記載の同時検査キット。
（ｅ）前記ゲノムＤＮＡにおけるハウスキーピング遺伝子に含まれる第３の塩基配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅する第３のプライマー対
（ｆ）第３の蛍光色素と前記第３の蛍光色素の発光を抑制する第３の消光剤とを有し、前記第３のプライマー対で増幅された前記第３の塩基配列にハイブリダイズして前記第３の消光剤による前記第３の蛍光色素の発光の抑制を解除する第３のプローブ
請求項６に記載の同時検査キット。
（ｅ）前記ゲノムＤＮＡにおけるハウスキーピング遺伝子に含まれる第３の塩基配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅する第３のプライマー対
（ｆ）第３の蛍光色素と前記第３の蛍光色素の発光を抑制する第３の消光剤とを有し、前記第３のプライマー対で増幅された前記第３の塩基配列にハイブリダイズして前記第３の消光剤による前記第３の蛍光色素の発光の抑制を解除する第３のプローブ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗病性及び病原体遺伝子の同時検査方法並びに抗病性及び病原体遺伝子の同時検査キットに関する。
【背景技術】
【0002】
家畜における感染症は畜産業に甚大な経済的損失をもたらすのみならず、人類にとっての食料の安定的な確保を脅かす。特に、エイズ、牛伝染性リンパ腫（ＥＢＬ）及びヨーネ病などの慢性難治性感染症は、年々発生数が増加しており、国際的に問題となっている。これらの感染症に罹患した個体は、病原体に生涯感染し続ける上に、有効な治療法及びワクチンが存在しない。
【0003】
感染症の問題の解決には、病原体の伝播の防止及び感染個体に対する適切な医療措置が有効である。そのために必要な情報が個体における抗病性遺伝子の有無及び病原体の量である。抗病性遺伝子は、病原体に対する感受性又は抵抗性に関連する宿主因子である。家畜において、病原体への感受性又は抵抗性と強く関連しているのが主要組織適合抗原複合体－ＤＲＢ３遺伝子の遺伝子型である。非特許文献１には、牛主要組織適合抗原複合体（ＢｏＬＡ）－ＤＲＢ３＊００９：０２という対立遺伝子を保有する牛がＥＢＬの原因である牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）感染症に対して抵抗性を示すことが報告されている。非特許文献２では、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１という対立遺伝子を保有する牛がＢＬＶ感染症に対して感受性を示すことが報告されている。
【0004】
抗病性遺伝子の検査には、シークエンス法による塩基配列の決定、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）－ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法及びアリル特異的ＰＣＲによる宿主の遺伝子のタイピングが使用されてきた。シークエンス法による塩基配列の決定は、解析に煩雑な手技と時間を要する。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲで増幅した対立遺伝子断片を制限酵素で処理し、電気泳動をしてそのバンドのパターンを確認することにより対立遺伝子を識別する方法である。
【0005】
アリル特異的ＰＣＲは、アリル特異的なＰＣＲプライマーによって増幅産物（アンプリコン）を検出する方法である。非特許文献３では、ＳＹＢＲ（商標） Ｇｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲを利用して、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２が検出されている。
【0006】
病原体の量は、病原体遺伝子の定量によって評価することができる。例えば、宿主のＤＮＡ中にプロウイルスとして組み込まれ持続感染するＢＬＶの場合は、病原体遺伝子としてプロウイルスの遺伝子を定量すればよい。病原体遺伝子の定量には、病原体特異的な遺伝子を標的としたリアルタイムＰＣＲ及びデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）が使用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｔａｋｕｍｉ ＨＡＹＡＳＨＩ、外７名、「Ｃａｔｔｌｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＢｏＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ ＤＲＢ３＊０９０２ ａｌｌｅｌｅ ｈａｖｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｂｏｖｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐｒｏｖｉｒａｌ ｌｏａｄｓ」、２０１７年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７９（９）、１５５２－１５５５
【非特許文献2】Ｔａｋｕ ＭＩＹＡＳＡＫＡ、外７名、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｂｌａｃｋ ｃａｔｔｌｅ」、２０１３年、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、８１（２）、７２－８２
【非特許文献3】Ａ．Ｆｏｒｌｅｔｔｉ、外５名、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａｌｌｅｌｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｂｏｖｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ」、２０１３年、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、９５、９９１－９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
病原体の量のみならず、抗病性遺伝子の有無を把握して個体又は集団ごとに異なる、いわばオーダーメイドの感染症対策の需要が高まっている。現状では、抗病性遺伝子の検査と病原体遺伝子の定量検査は別々に行われている。このため、検査工程の多さと煩雑さから、検査に時間を要してきた。
【0009】
本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであり、牛伝染性リンパ腫に関する抗病性及び病原体遺伝子を簡便かつ迅速に検査することができる抗病性及び病原体遺伝子の同時検査方法並びに抗病性及び病原体遺伝子の同時検査キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第１の観点に係る抗病性及び病原体遺伝子の同時検査方法は、
検査対象牛のゲノムＤＮＡと、
前記ゲノムＤＮＡにおける牛伝染性リンパ腫に対する抗病性に関連する対立遺伝子に含まれる第１の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第１のプライマー対と、
第１の蛍光色素と前記第１の蛍光色素の発光を抑制する第１の消光剤とを有し、前記第１のプライマー対で増幅された前記第１の塩基配列にハイブリダイズして前記第１の消光剤による前記第１の蛍光色素の発光の抑制を解除する第１のプローブと、
前記ゲノムＤＮＡに組み込まれた牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスの遺伝子に含まれる第２の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第２のプライマー対と、
第２の蛍光色素と前記第２の蛍光色素の発光を抑制する第２の消光剤とを有し、前記第２のプライマー対で増幅された前記第２の塩基配列にハイブリダイズして前記第２の消光剤による前記第２の蛍光色素の発光の抑制を解除する第２のプローブと、
を含む反応液で増幅反応を行う反応ステップを含む。
検査対象牛のゲノムＤＮＡと、
前記ゲノムＤＮＡにおける牛伝染性リンパ腫に対する抗病性に関連する対立遺伝子に含まれる第１の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第１のプライマー対と、
第１の蛍光色素と前記第１の蛍光色素の発光を抑制する第１の消光剤とを有し、前記第１のプライマー対で増幅された前記第１の塩基配列にハイブリダイズして前記第１の消光剤による前記第１の蛍光色素の発光の抑制を解除する第１のプローブと、
前記ゲノムＤＮＡに組み込まれた牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスの遺伝子に含まれる第２の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第２のプライマー対と、
第２の蛍光色素と前記第２の蛍光色素の発光を抑制する第２の消光剤とを有し、前記第２のプライマー対で増幅された前記第２の塩基配列にハイブリダイズして前記第２の消光剤による前記第２の蛍光色素の発光の抑制を解除する第２のプローブと、
を含む反応液で増幅反応を行う反応ステップを含む。
【0011】
前記反応液は、
前記ゲノムＤＮＡにおけるハウスキーピング遺伝子に含まれる第３の塩基配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅する第３のプライマー対と、
第３の蛍光色素と前記第３の蛍光色素の発光を抑制する第３の消光剤とを有し、前記第３のプライマー対で増幅された前記第３の塩基配列にハイブリダイズして前記第３の消光剤による前記第３の蛍光色素の発光の抑制を解除する第３のプローブと、
をさらに含む、
こととしてもよい。
前記ゲノムＤＮＡにおけるハウスキーピング遺伝子に含まれる第３の塩基配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅する第３のプライマー対と、
第３の蛍光色素と前記第３の蛍光色素の発光を抑制する第３の消光剤とを有し、前記第３のプライマー対で増幅された前記第３の塩基配列にハイブリダイズして前記第３の消光剤による前記第３の蛍光色素の発光の抑制を解除する第３のプローブと、
をさらに含む、
こととしてもよい。
【0012】
前記反応ステップでは、
Ｗ／Ｏエマルションにおける前記反応液を含むドロップレット内で前記増幅反応を行う、
こととしてもよい。
Ｗ／Ｏエマルションにおける前記反応液を含むドロップレット内で前記増幅反応を行う、
こととしてもよい。
【0013】
前記対立遺伝子は、
牛伝染性リンパ腫ウイルス抵抗性型であるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２と、
牛伝染性リンパ腫ウイルス感受性型であるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１と、
であって、
前記反応液は、
前記第１のプライマー対として、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２に対して、塩基配列が配列番号１に示されるフォワードプライマーと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１に対して、塩基配列が配列番号２に示されるフォワードプライマーと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２及びＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１に共通の、塩基配列が配列番号３に示されるリバースプライマーと、
を含み、
前記第１のプローブとして、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するための、塩基配列が配列番号４に示されるプローブと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１を検出するための、塩基配列が配列番号５に示されるプローブと、
を含み、
前記第２のプライマー対として、
塩基配列が配列番号６に示されるフォワードプライマーと、
塩基配列が配列番号７に示されるリバースプライマーと、
を含み、
前記第２のプローブとして、
塩基配列が配列番号８に示されるプローブを含む、
こととしてもよい。
牛伝染性リンパ腫ウイルス抵抗性型であるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２と、
牛伝染性リンパ腫ウイルス感受性型であるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１と、
であって、
前記反応液は、
前記第１のプライマー対として、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２に対して、塩基配列が配列番号１に示されるフォワードプライマーと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１に対して、塩基配列が配列番号２に示されるフォワードプライマーと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２及びＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１に共通の、塩基配列が配列番号３に示されるリバースプライマーと、
を含み、
前記第１のプローブとして、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するための、塩基配列が配列番号４に示されるプローブと、
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１を検出するための、塩基配列が配列番号５に示されるプローブと、
を含み、
前記第２のプライマー対として、
塩基配列が配列番号６に示されるフォワードプライマーと、
塩基配列が配列番号７に示されるリバースプライマーと、
を含み、
前記第２のプローブとして、
塩基配列が配列番号８に示されるプローブを含む、
こととしてもよい。
【0014】
配列番号１に示される前記フォワードプライマー及び配列番号２に示される前記フォワードプライマーの３’末端の核酸は、ロック核酸である、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
【0015】
本発明の第２の観点に係る抗病性及び病原体遺伝子の同時検査キットは、
同一の増幅反応系内におけるポリメラーゼ連鎖反応に使用される以下（ａ）～（ｄ）の試薬を備える。
（ａ）検査対象牛のゲノムＤＮＡにおける牛伝染性リンパ腫に対する抗病性に関連する対立遺伝子に含まれる第１の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第１のプライマー対
（ｂ）第１の蛍光色素と前記第１の蛍光色素の発光を抑制する第１の消光剤とを有し、前記第１のプライマー対で増幅された前記第１の塩基配列にハイブリダイズして前記第１の消光剤による前記第１の蛍光色素の発光の抑制を解除する第１のプローブ
（ｃ）前記ゲノムＤＮＡに組み込まれた牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスの遺伝子に含まれる第２の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第２のプライマー対
（ｄ）第２の蛍光色素と前記第２の蛍光色素の発光を抑制する第２の消光剤とを有し、前記第２のプライマー対で増幅された前記第２の塩基配列にハイブリダイズして前記第２の消光剤による前記第２の蛍光色素の発光の抑制を解除する第２のプローブ
同一の増幅反応系内におけるポリメラーゼ連鎖反応に使用される以下（ａ）～（ｄ）の試薬を備える。
（ａ）検査対象牛のゲノムＤＮＡにおける牛伝染性リンパ腫に対する抗病性に関連する対立遺伝子に含まれる第１の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第１のプライマー対
（ｂ）第１の蛍光色素と前記第１の蛍光色素の発光を抑制する第１の消光剤とを有し、前記第１のプライマー対で増幅された前記第１の塩基配列にハイブリダイズして前記第１の消光剤による前記第１の蛍光色素の発光の抑制を解除する第１のプローブ
（ｃ）前記ゲノムＤＮＡに組み込まれた牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスの遺伝子に含まれる第２の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための第２のプライマー対
（ｄ）第２の蛍光色素と前記第２の蛍光色素の発光を抑制する第２の消光剤とを有し、前記第２のプライマー対で増幅された前記第２の塩基配列にハイブリダイズして前記第２の消光剤による前記第２の蛍光色素の発光の抑制を解除する第２のプローブ
【0016】
上記本発明の第２の観点に係る抗病性及び病原体遺伝子の同時検査キットは、
前記増幅反応系内におけるポリメラーゼ連鎖反応に使用される以下（ｅ）及び（ｆ）の試薬をさらに備える、
こととしてもよい。
（ｅ）前記ゲノムＤＮＡにおけるハウスキーピング遺伝子に含まれる第３の塩基配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅する第３のプライマー対
（ｆ）第３の蛍光色素と前記第３の蛍光色素の発光を抑制する第３の消光剤とを有し、前記第３のプライマー対で増幅された前記第３の塩基配列にハイブリダイズして前記第３の消光剤による前記第３の蛍光色素の発光の抑制を解除する第３のプローブ
前記増幅反応系内におけるポリメラーゼ連鎖反応に使用される以下（ｅ）及び（ｆ）の試薬をさらに備える、
こととしてもよい。
（ｅ）前記ゲノムＤＮＡにおけるハウスキーピング遺伝子に含まれる第３の塩基配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅する第３のプライマー対
（ｆ）第３の蛍光色素と前記第３の蛍光色素の発光を抑制する第３の消光剤とを有し、前記第３のプライマー対で増幅された前記第３の塩基配列にハイブリダイズして前記第３の消光剤による前記第３の蛍光色素の発光の抑制を解除する第３のプローブ
【発明の効果】
【0017】
本発明によれば、牛伝染性リンパ腫に関する抗病性及び病原体遺伝子を簡便かつ迅速に検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】試験例１の検体１を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図2】試験例１の検体２を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図3】試験例１の検体３を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図4】試験例１の検体４を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図5】試験例２の反応液１～１５に係るドロップレットの振幅を示す図である。（Ａ）は反応液１～３に係るドロップレットの振幅を示す。（Ｂ）は反応液４～７に係るドロップレットの振幅を示す。（Ｃ）は反応液８～１２に係るドロップレットの振幅を示す。（Ｄ）は反応液１３～１５に係るドロップレットの振幅を示す。
【図6】試験例３のプライマー／プローブセットＡを含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図7】試験例３のプライマー／プローブセットＢを含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図8】試験例３のプライマー／プローブセットＣを含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図9】試験例３のプライマー／プローブセットＤを含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図10】試験例４のＭ２９由来のゲノムＤＮＡを含む反応液に係るドロップレットの振幅を示す図である。
【図11】試験例５の検体１を含む反応液に係るドロップレットの振幅を示す図である。
【図12】試験例５のＭ２９由来のゲノムＤＮＡを含む反応液に係るドロップレットの振幅を示す図である。
【図13】試験例５の検体１を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図14】試験例５の検体２を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図15】試験例５の検体３を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図16】試験例５の検体４を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図17】試験例５のＭ２９由来のゲノムＤＮＡを含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図18】Ｍ６由来のゲノムＤＮＡを含む、試験例５の組成の反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図19】試験例６のＭ６由来のゲノムＤＮＡを含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図20】試験例７の検体１を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図21】試験例７の検体２を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図22】試験例７の検体３を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図23】試験例７の検体４を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図24】試験例７の検体５を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図25】試験例７の検体６を含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図26】試験例７のＭ２９由来のゲノムＤＮＡを含む反応液に係るドロップレットの振幅の分布を示す図である。
【図27】試験例９におけるｄＰＣＲで求めたＢＬＶ感染細胞率に対する定量的ＰＣＲで求めたＢＬＶ感染細胞率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。
【0020】
（実施の形態）
本実施の形態に係る抗病性及び病原体遺伝子の同時検査方法は、反応液で増幅反応を行う反応ステップを含む。反応液は、ＤＮＡポリメラーゼと、検査対象牛のゲノムＤＮＡと、当該ゲノムＤＮＡにおけるＥＢＬに対する抗病性に関連する対立遺伝子を検出するためのプライマー対１（第１のプライマー対）及びプローブ２（第１のプローブ）と、当該ゲノムＤＮＡに組み込まれたＢＬＶのプロウイルスの遺伝子を検出するためのプライマー対３（第２のプライマー対）及びプローブ４（第２のプローブ）と、を含む。
本実施の形態に係る抗病性及び病原体遺伝子の同時検査方法は、反応液で増幅反応を行う反応ステップを含む。反応液は、ＤＮＡポリメラーゼと、検査対象牛のゲノムＤＮＡと、当該ゲノムＤＮＡにおけるＥＢＬに対する抗病性に関連する対立遺伝子を検出するためのプライマー対１（第１のプライマー対）及びプローブ２（第１のプローブ）と、当該ゲノムＤＮＡに組み込まれたＢＬＶのプロウイルスの遺伝子を検出するためのプライマー対３（第２のプライマー対）及びプローブ４（第２のプローブ）と、を含む。
【0021】
ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されず、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する市販のＤＮＡポリメラーゼが利用できる。検査対象牛は、ウシ属に属する限り特に限定されないが、例えば、家畜牛（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）及びコブ牛（Ｂｏｓ Ｉｎｄｉｃｕｓ）などである。ゲノムＤＮＡは、牛の細胞、組織及び体液、特には血液から公知の方法で取得することができる。
【0022】
プライマー対１は、ゲノムＤＮＡにおけるＥＢＬに対する抗病性に関連する対立遺伝子に含まれる塩基配列Ｓ１（第１の塩基配列）を、ＤＮＡポリメラーゼによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する。プライマー対１は、二本鎖ＤＮＡの各鎖にハイブリダイズして、５’末端から３’末端の方向に伸長されるフォワードプライマー１Ｆとリバースプライマー１Ｒとからなる。フォワードプライマー１Ｆは、塩基配列Ｓ１を含む領域の上流側の一部の塩基配列を有する。リバースプライマー１Ｒは、塩基配列Ｓ１を含む領域の下流側の一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
【0023】
ＥＢＬに対する抗病性に関連する対立遺伝子とは、例えば、ＢＬＶ抵抗性型の対立遺伝子及びＢＬＶ感受性型の対立遺伝子である。ＢＬＶ抵抗性型の対立遺伝子としては、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１１：０１及びＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０２：０１が例示される。ＢＬＶ抵抗性型の対立遺伝子は、好ましくは、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２である。ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２の塩基配列を配列番号１２に示す。ＢＬＶ感受性型の対立遺伝子としては、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００５：０２、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１５：０１及びＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１２：０１が例示される。ＢＬＶ感受性型の対立遺伝子は、好ましくは、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１である。ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊０１６：０１の塩基配列を配列番号１３に示す。以下、“ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３”を単に“ＤＲＢ３”と表す。
【0024】
ＤＲＢ３＊００９：０２を検出する場合、例えば、フォワードプライマー１Ｆ及びリバースプライマー１Ｒの塩基配列は、それぞれ配列番号１及び３に示される。ＤＲＢ３＊０１６：０１を検出する場合、例えば、フォワードプライマー１Ｆ及びリバースプライマー１Ｒの塩基配列は、それぞれ配列番号２及び３に示される。
【0025】
好ましくは、ＤＲＢ３＊００９：０２及びＤＲＢ３＊０１６：０１の双方が同時に検出される。ＤＲＢ３＊００９：０２及びＤＲＢ３＊０１６：０１を同時に検出するには、ＤＲＢ３＊００９：０２に対するフォワードプライマー１１Ｆ及リバースプライマー１１Ｒと、ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するフォワードプライマー１２Ｆ及リバースプライマー１２Ｒとを使用すればよい。この場合、リバースプライマー１１Ｒとリバースプライマー１２Ｒとは共通であってもよい。なお、以下では、フォワードプライマー１１Ｆ及リバースプライマー１１Ｒで増幅される塩基配列を塩基配列Ｓ１ａとし、フォワードプライマー１２Ｆ及リバースプライマー１２Ｒで増幅される塩基配列を塩基配列Ｓ１ｂとする。
【0026】
例えば、反応液は、プライマー対１として、ＤＲＢ３＊００９：０２に対して、塩基配列が配列番号１に示されるフォワードプライマー１１Ｆ（上記ＤＲＢ３＊００９：０２に対するフォワードプライマー１Ｆ）と、ＤＲＢ３＊０１６：０１に対して、塩基配列が配列番号２に示されるフォワードプライマー１２Ｆ（上記ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するフォワードプライマー１Ｆ）と、ＤＲＢ３＊００９：０２及びＤＲＢ３＊０１６：０１に共通のリバースプライマーである塩基配列が配列番号３に示されるリバースプライマー１Ｒと、を含む。
【0027】
なお、フォワードプライマー１Ｆ及びリバースプライマー１Ｒの少なくとも一方の３’末端の核酸が、２’－Ｏと４’－Ｃがメチレンで架橋された人工合成核酸であるロック核酸であってもよい。例えば、上述のように、フォワードプライマー１１Ｆと、フォワードプライマー１２Ｆと、リバースプライマー１Ｒとを使用する場合、フォワードプライマー１１Ｆ及びフォワードプライマー１２Ｆのそれぞれの３’末端の核酸がロック核酸であってもよい。ロック核酸を３’末端に導入することでプライマー対１の特異性を向上させることができる。
【0028】
プローブ２は、塩基配列Ｓ１を検出するために使用される。プローブ２は、１０～４０ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチドである。プローブ２は、塩基配列Ｓ１の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有し、塩基配列Ｓ１の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする。好ましくは、プローブ２の塩基配列は、可能な限り検出対象の対立遺伝子以外の対立遺伝子において増幅される塩基配列にはハイブリダイズしない塩基配列である。
【0029】
なお、ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、プローブ２が、塩基配列が相補的な核酸とはハイブリダイズするが、相補的ではない塩基配列の核酸にはハイブリダイズしないストリンジェントな条件である。ストリンジェントな条件は、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版（２００１年）などに基づき適宜決定でき、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で保温、である。
【0030】
プローブ２は、蛍光色素２１（第１の蛍光色素）と蛍光色素２１の発光を抑制する消光剤２２（第１の消光剤、クエンチャーともいう）とを有する。好ましくは、プローブ２の５’末端に蛍光色素２１が、３’末端に消光剤２２が付加されている。加水分解プローブの例としては、例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブが挙げられる。
【0031】
プローブ２はプライマー対１で増幅された塩基配列Ｓ１にハイブリダイズして消光剤２２による蛍光色素２１の発光の抑制を解除する。このようなプローブ２として加水分解プローブが使用できる。加水分解プローブであるプローブ２が増幅された塩基配列Ｓ１にハイブリダイズした状態では、蛍光色素２１と消光剤２２の物理的距離が近いため、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）が起こり、蛍光色素２１のエネルギーが消光剤２２に移転し、蛍光の発生が抑制されている。プライマー対１の伸長反応が進むと、ＤＮＡポリメラーゼが有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブ２が加水分解され、蛍光色素２１が消光剤２２と乖離する。この結果、ＦＲＥＴが起こらなくなり、蛍光が発生する。プローブ２がハイブリダイズしたＤＮＡを鋳型として塩基配列Ｓ１が増幅された場合にのみ、強い蛍光が検出される。したがって、ＰＣＲによって非特異的な断片の増幅が起こっていたり、プライマーダイマーが形成されていたりする場合には、強い蛍光は検出されない。
【0032】
プローブ２が塩基配列Ｓ１に完全にハイブリダイズしなければ、発生する蛍光強度は著しく低下する。プローブ２の塩基配列のうち、１塩基～数塩基がハイブリダイズしない場合には、融解温度（Ｔｍ）が低下し、プローブ２は塩基配列Ｓ１から遊離する。この場合、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によるプローブ２の分解が起こらず、プローブ２の５’末端及び３’末端にはそれぞれ蛍光色素２１及び消光剤２２が付加されたままの状態である。蛍光色素２１が消光剤２２から離れないため、消光剤２２により蛍光の発生が抑制される。
【0033】
蛍光色素２１としては、６－ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＴＡＭＲＡ、ＡＴＴＯ５５０、ＡＴＴＯ５６５、ＡＴＴＯ６３３、ＡＴＴＯ６４７、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ、Ｃｙ３及びＣｙ５などが例示される。使用するＰＣＲ装置に応じて検出可能な蛍光波長を有する蛍光色素２１を選択すればよい。
【0034】
消光剤２２としては、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ（商標）－１、ＢＨＱ（商標）－２、ＢＨＱ（商標）－３、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）ＲＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）ＦＱ及びＥｃｌｉｐｓｅ（商標）などが挙げられる。各消光剤により抑制できる蛍光の波長が異なるため、使用する蛍光色素２１を抑制できる消光剤２２を選択すればよい。
【0035】
また、消光剤２２にさらにマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）を付加したプローブ２を用いてもよい。ＭＧＢはＤＮＡの二重らせん構造の副溝に入り込み、プローブ２がハイブリダイズした際の二重らせん構造をさらに強固にする。このため、より高いＴｍを得ることができ、ＰＣＲにおいてアニーリング温度を高く設定することができる。この結果、プローブ２の特異性をさらに高めることができる。ＭＧＢを付加したプローブとしてはＴａｑＭａｎ（商標）ＭＧＢプローブが知られている。
【0036】
また、プローブ２にさらにもう１種類の消光剤を付加したダブルクエンチャープローブを使用してもよい。ダブルクエンチャープローブでは、塩基配列の間にＺＥＮ（商標）クエンチャー又はＴＡＯ（商標）クエンチャーなどのインターナルクエンチャーが付加されるため、プローブ２内での消光作用がより高くなり、バックグラウンドのレベルを低下させることができる。
【0037】
プローブ２の別の例としては、分子ビーコンプローブが挙げられる。分子ビーコンプローブは、塩基配列Ｓ１の一部と相補的な塩基配列を有し、さらにその両側に互いに相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。分子ビーコンプローブは、その両端に加水分解プローブと同様に、蛍光色素２１及び消光剤２２を有する。分子ビーコンプローブが塩基配列Ｓ１にハイブリダイズしていない状態では、分子ビーコンプローブの両端の相補的な塩基配列の部分がステム構造で、塩基配列Ｓ１と相補的な塩基配列の部分がループ構造となるヘアピン状のステム・ループ構造をとる。ステム・ループ構造の状態では両端の蛍光色素２１及び消光剤２２が近接しており、蛍光が抑制される。
【0038】
分子ビーコンプローブにおける蛍光の抑制は、上述の加水分解プローブとは異なり、蛍光色素２１と消光剤２２との電子軌道の重なりによって起こる衝突消光である。分子ビーコンプローブは熱変性によりステム構造が開いて直鎖状になり、その状態で塩基配列Ｓ１にハイブリダイズするため、蛍光色素２１と消光剤２２との物理的距離が遠くなる。蛍光色素２１と消光剤２２との物理的距離が遠くなることで、消光剤２２による蛍光の抑制が解除される。分子ビーコンプローブの使用によって、バックグラウンドレベルが低く特異性の高い解析が可能となる。
【0039】
ＤＲＢ３＊００９：０２及びＤＲＢ３＊０１６：０１を同時に検出する場合、プローブ２として、ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するための、すなわち塩基配列Ｓ１ａにハイブリダイズするプローブ２ａ及びＤＲＢ３＊０１６：０１を検出するための、すなわち塩基配列Ｓ１ｂにハイブリダイズするプローブ２ｂを反応液は含んでもよい。プローブ２ａの塩基配列は、配列番号４に例示される。プローブ２ｂの塩基配列は、配列番号５に例示される。プローブ２ａが有する蛍光色素２３と、プローブ２ｂが有する蛍光色素２４とは異なって（異なる波長の蛍光を発する）もよいし、同じであってもよい。同じ蛍光色素を使う場合には、反応液中のプローブ２ａの濃度と、プローブ２ｂの濃度とが異なるようにすれば、蛍光強度の大きさに基づいてＤＲＢ３＊００９：０２とＤＲＢ３＊０１６：０１とを識別して検出できる。プローブ２ａの濃度と、プローブ２ｂの濃度とが異なる場合、一方の濃度に対して他方の濃度が、例えば、１．５～６倍、２～５倍、２～４．５倍又は２～４．３倍とすればよい。
【0040】
プライマー対１及びプローブ２は、例えば、市販の自動核酸合成機等を用いて化学的に合成することができる。
【0041】
プライマー対３は、ゲノムＤＮＡに組み込まれたＢＬＶのプロウイルスの遺伝子に含まれる塩基配列Ｓ２（第２の塩基配列）を、ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲで増幅する。プライマー対３については、その塩基配列及び増幅対象となる塩基配列Ｓ２がそれぞれプライマー対１の塩基配列及び塩基配列Ｓ１と異なる点を除いて、上記プライマー対１についての説明を参照できる。
【0042】
プロウイルスの遺伝子は、牛のゲノムＤＮＡには本来含まれない、プロウイルスに特異的な遺伝子であれば任意である。プロウイルスの遺伝子としては、例えば、ｐｏｌ遺伝子及びｔａｘ遺伝子などが挙げられる。プライマー対３は、フォワードプライマー３Ｆとリバースプライマー３Ｒとからなる。ｐｏｌ遺伝子を標的とする場合、フォワードプライマー３Ｆの塩基配列及びリバースプライマー３Ｒの塩基配列として、それぞれ配列番号６に示される塩基配列及び配列番号７に示される塩基配列が例示される。ｔａｘ遺伝子を標的とする場合、フォワードプライマー３Ｆの塩基配列及びリバースプライマー３Ｒの塩基配列として、それぞれ配列番号１４に示される塩基配列及び配列番号１５に示される塩基配列が例示される。
【0043】
プローブ４は、蛍光色素４１（第２の蛍光色素）と蛍光色素４１の発光を抑制する消光剤４２（第２の消光剤）とを有する。プローブ４については、その塩基配列及びハイブリダイズの対象となる塩基配列Ｓ２がそれぞれプローブ２の塩基配列及び塩基配列Ｓ１と異なる点を除いて、上記プローブ２についての説明を参照できる。ｐｏｌ遺伝子を標的とする場合、プローブ４の塩基配列として、配列番号８に示される塩基配列が例示される。ｔａｘ遺伝子を標的とする場合、プローブ４の塩基配列として、配列番号１６に示される塩基配列が例示される。
【0044】
蛍光色素４１は、プローブ２が有する蛍光色素２１と同じであってもよいし、異なってもよい。ＤＲＢ３＊００９：０２及びＤＲＢ３＊０１６：０１を同時に検出する場合には、蛍光色素４１は、例えば、プローブ２ａが有する蛍光色素２３及びプローブ２ｂが有する蛍光色素２４の一方と同じとしてもよい。例えば、プローブ２ａの蛍光色素２３がＨＥＸで、プローブ２ｂの蛍光色素２４がＦＡＭで、プローブ４の蛍光色素４１がＦＡＭとした場合には、プローブ２ｂの濃度と、プローブ４の濃度とが異なるようにしてもよい。
【0045】
好ましくは、上記反応液は、ゲノムＤＮＡにおけるハウスキーピング遺伝子に含まれる塩基配列Ｓ３（第３の塩基配列）をＰＣＲで増幅するプライマー対５（第３のプライマー対）と、蛍光色素６１（第３の蛍光色素）と蛍光色素６１の発光を抑制する消光剤６２（第３の消光剤）とを有するプローブ６（第３のプローブ）と、をさらに含んでもよい。プライマー対５については、その塩基配列及び増幅対象となる塩基配列Ｓ３がそれぞれプライマー対１の塩基配列及び塩基配列Ｓ１と異なる点を除いて、上記プライマー対１についての説明を参照できる。
【0046】
ハウスキーピング遺伝子は、ＢＬＶのプロウイルスが有しておらず、牛に特異的であって、すべての牛が有する遺伝子であれば任意である。ハウスキーピング遺伝子としては、例えば、ＲＰＰ３０、ＲＰＰＨ１及びＧＡＰＤＨなどが挙げられる。ＲＰＰ３０を標的とする場合、プライマー対５のフォワードプライマーの塩基配列及びリバースプライマーの塩基配列として、それぞれ配列番号９に示される塩基配列及び配列番号１０に示される塩基配列が例示される。
【0047】
プローブ６については、その塩基配列及びハイブリダイズの対象となる塩基配列Ｓ３がそれぞれプローブ２の塩基配列及び塩基配列Ｓ１と異なる点を除いて、上記プローブ２についての説明を参照できる。ＲＰＰ３０を標的とする場合、プローブ６の塩基配列として、配列番号１１に示される塩基配列が例示される。
【0048】
蛍光色素６１は、プローブ２が有する蛍光色素２１と同じであってもよいし、異なってもよい。また、蛍光色素６１は、プローブ４が有する蛍光色素４１と同じであってもよいし、異なってもよい。例えば、プローブ２ａの蛍光色素２３がＨＥＸで、プローブ２ｂの蛍光色素２４がＦＡＭで、プローブ４が有する蛍光色素４１がＦＡＭとした場合、プローブ６が有する蛍光色素６１をＨＥＸとすることができる。この場合、反応液中のプローブ２ｂの濃度と、プローブ４の濃度とが異なるようにし、プローブ２ａの濃度と、プローブ６の濃度とが異なるようにすればよい。
【0049】
好ましくは、上述の反応ステップでは、増幅反応を、定量的ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）、特にはｄＰＣＲで行う。ｄＰＣＲでは、Ｗ／Ｏエマルションにおける上記反応液を含むドロップレット（微小区画）内で増幅反応を行う。ｄＰＣＲは、限界希釈（各ドロップレットにゲノムＤＮＡが１又は０となるように希釈）したゲノムＤＮＡをドロップレット内に分散させてＰＣＲを行う。これによって標的の遺伝子を含むドロップレットでは蛍光シグナルが陽性となり、標的遺伝子を含まない、又はゲノムＤＮＡを含まないドロップレットでは蛍光シグナルが陰性となる。陽性のドロップレットの数を計数することでサンプル中の標的遺伝子の濃度を絶対的に測定することができる。
ｄＰＣＲは市販の装置及び試薬によって行うことができる。
ｄＰＣＲは市販の装置及び試薬によって行うことができる。
【0050】
増幅反応を定量的ＰＣＲで行うことで、プライマー対５及びプローブ６によって、ハウスキーピング遺伝子、すなわち牛のゲノムＤＮＡを定量することができる。プライマー対３及びプローブ４によって定量したＢＬＶのプロウイルスの遺伝子の量とゲノムＤＮＡの量とからＢＬＶ感染細胞率を求めることができる。また、プライマー対１及びプローブ２によって定量した対立遺伝子の量とゲノムＤＮＡの量とから、対立遺伝子の陽性率、さらには、対立遺伝子のホモ接合体であるか、ヘテロ接合体であるかなどの情報を得ることができる。
【0051】
反応液における鋳型となるゲノムＤＮＡの量、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の量、アニーリング温度、伸長反応時間及びサイクル数等のＰＣＲのサーマルリサイクルは、使用するプライマー対１等の塩基配列及び長さ、使用するプローブ２等の塩基配列、増幅する塩基配列Ｓ１等の長さ、並びに使用するＰＣＲ装置の種類等に応じて適宜設定される。好ましくは、対立遺伝子の有無、プロウイルスの遺伝子の量が判明しているサンプルに、本実施の形態に係る同時検査方法を適用し、判定結果の精度に基づいて反応液の組成及びサーマルリサイクルの条件などを設定するのが好ましい。
【0052】
本実施の形態に係る同時検査方法は、上記反応ステップに続いて、検出ステップをさらに含む。検出ステップでは、反応ステップにおいて、プローブ２が塩基配列Ｓ１にハイブリダイズすることで消光剤２２による抑制が解除された蛍光色素２１の発光、及びプローブ４が塩基配列Ｓ２にハイブリダイズすることで消光剤４２による抑制が解除された蛍光色素４１の発光を検出する。蛍光色素２１及び蛍光色素４１の発光の検出は、市販の装置を用いて蛍光強度等を測定することで検出できる。
【0053】
検出ステップでは、プローブ６が塩基配列Ｓ３にハイブリダイズすることで消光剤６２による抑制が解除された蛍光色素６１の発光をさらに検出してもよい。
【0054】
本実施の形態に係る同時検査方法によれば、ＥＢＬに対する抗病性に関連する対立遺伝子と、ＢＬＶのプロウイルスの遺伝子とを、１反応かつ１チューブにおける増幅反応で同時に検出できる。これにより、抗病性及びプロウイルスの遺伝子を簡便かつ迅速に検査することができる。当該同時検査方法では、対立遺伝子として、ＢＬＶ抵抗性型とＢＬＶ感受性型とを検出してもよいこととした。これにより、検査対象牛の抗病性をより正確に評価することができる。また、当該同時検査方法では、牛のハウスキーピング遺伝子も１反応かつ１チューブにおける増幅反応で同時に検出できる。ハウスキーピング遺伝子を定量することで、対立遺伝子の陽性率及びＢＬＶ感染細胞率などを評価することができる。さらに、当該同時検査方法では、増幅反応をｄＰＣＲで行ってもよいこととした。ｄＰＣＲを用いることで、プロウイルスの遺伝子の量及び対立遺伝子の量を高精度に絶対定量できる。
【0055】
本実施の形態に係る同時検査方法によって判定された、ＢＬＶ感受性型の対立遺伝子を有する牛及びＢＬＶを多く有する牛を隔離又は淘汰することで、ウイルスの伝播リスクを低減することができる。また、当該同時検査方法によって判定された、ＢＬＶ抵抗性型の対立遺伝子を有し、かつＢＬＶを保有しない牛をＢＬＶ感染牛の牛舎とＢＬＶ非感染牛の牛舎との間に介在させることで、ＢＬＶ感染牛からＢＬＶ非感染牛へのウイルスの伝播リスクを低減することができる。
【0056】
別の実施の形態では、抗病性及び病原体遺伝子の同時検査キットが提供される。当該同時検査キットは、同一の増幅反応系内におけるＰＣＲに使用されるプライマー対１、プローブ２、プライマー対３及びプローブ４を備える。
【0057】
より具体的には、当該同時検査キットは、プライマー対１として、塩基配列が配列番号１に示されるフォワードプライマー１１Ｆ、塩基配列が配列番号２に示されるフォワードプライマー１２Ｆ及び塩基配列が配列番号３に示されるリバースプライマー１Ｒを備え、プローブ２として、塩基配列が配列番号４に示されるプローブ２ａ及び塩基配列が配列番号５に示されるプローブ２ｂを備え、プライマー対３として、塩基配列が配列番号６に示されるフォワードプライマー３Ｆ及び塩基配列が配列番号７に示されるリバースプライマー３Ｒを備え、塩基配列が配列番号８に示されるプローブ４を備えてもよい。
【0058】
なお、上記同時検査キットは、上記増幅反応系内におけるＰＣＲに使用されるプライマー対５及びプローブ６をさらに備えてもよい。より詳細には、上記同時検査キットは、プライマー対５として、塩基配列が配列番号９に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号１０に示されるリバースプライマーを備え、塩基配列が配列番号１１に示されるプローブ６を備えてもよい。
【0059】
塩基配列が配列番号１に示されるフォワードプライマー１１Ｆ、塩基配列が配列番号２に示されるフォワードプライマー１２Ｆ、塩基配列が配列番号３に示されるリバースプライマー１Ｒ、塩基配列が配列番号４に示されるプローブ２ａ、塩基配列が配列番号５に示されるプローブ２ｂ、塩基配列が配列番号６に示されるフォワードプライマー３Ｆ、塩基配列が配列番号７に示されるリバースプライマー３Ｒ及び塩基配列が配列番号８に示されるプローブ４を含む反応液でのＰＣＲにおけるアニーリング温度は、例えば５５℃～６０℃、好ましくは５８℃である。当該アニーリング温度は、塩基配列が配列番号９に示されるフォワードプライマー、塩基配列が配列番号１０に示されるリバースプライマー及び塩基配列が配列番号１１に示されるプローブ６をさらに含む反応液にも適用できる。
【0060】
なお、上記同時検査キットは、ＰＣＲ、特にはｄＰＣＲに必要な緩衝液及び上述の試薬以外の試薬を備えてもよい。
【0061】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例0062】
（試験例１：ＤＲＢ３＊００９：０２、ＢＬＶ ｔａｘ遺伝子及びＲＰＰ３０の同時検出の検討）
ＤＲＢ３＊００９：０２、ＢＬＶ ｔａｘ遺伝子及び牛のハウスキーピング遺伝子ＲＰＰ３０（アクセッションナンバー：ＮＣ＿０３７３５３．１）をｄＰＣＲで同時に検出できるか検討した。下記表１に示す試薬を含む反応液をｄＰＣＲに供した。検体１として、ＢＬＶ感受性遺伝子保有（ＤＲＢ３＊０１６：０１と０１５：０１のヘテロ）、かつＢＬＶの高プロウイルスを有する牛のゲノムＤＮＡを使用した。検体２として、ＢＬＶ抵抗性遺伝子保有（ＤＲＢ３＊００９：０２と０１５：０１のヘテロ）牛のゲノムＤＮＡを使用した。検体３として、検体１と検体２とを混合した検体を使用した。検体３は、ＤＲＢ３＊０１６：０１と００９：０２のヘテロで、プロウイルスが検出される牛を想定している。検体４として水を使用した。牛の血液からｍａｇＬＥＡＤ １２ｇＣ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを水で１０倍希釈し、テンプレートとした。
ＤＲＢ３＊００９：０２、ＢＬＶ ｔａｘ遺伝子及び牛のハウスキーピング遺伝子ＲＰＰ３０（アクセッションナンバー：ＮＣ＿０３７３５３．１）をｄＰＣＲで同時に検出できるか検討した。下記表１に示す試薬を含む反応液をｄＰＣＲに供した。検体１として、ＢＬＶ感受性遺伝子保有（ＤＲＢ３＊０１６：０１と０１５：０１のヘテロ）、かつＢＬＶの高プロウイルスを有する牛のゲノムＤＮＡを使用した。検体２として、ＢＬＶ抵抗性遺伝子保有（ＤＲＢ３＊００９：０２と０１５：０１のヘテロ）牛のゲノムＤＮＡを使用した。検体３として、検体１と検体２とを混合した検体を使用した。検体３は、ＤＲＢ３＊０１６：０１と００９：０２のヘテロで、プロウイルスが検出される牛を想定している。検体４として水を使用した。牛の血液からｍａｇＬＥＡＤ １２ｇＣ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを水で１０倍希釈し、テンプレートとした。
【0063】
【表1】
【0064】
ＤＲＢ３＊００９：０２ジェノタイピングプローブ及びＲＰＰ３０＿２５２３６＿プローブの各５’末端はＨＥＸで標識され、各３’末端はＭＧＢ－Ｅｃｌｉｐｓｅを有する。また、ＢＬＶ ｔａｘ ７４５４プローブの５’末端はＦＡＭで標識され、３’末端はＭＧＢ－Ｅｃｌｉｐｓｅを有する。
【0065】
ドロップレットは、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒオイルｆｏｒ Ｐｒｏｂｅ（１８６４１１０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を使用して、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）にて調製した。ＰＣＲには、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈサーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製、１８５１１９６ＪＡ）を使用した。ＰＣＲのサーマルリサイクルは、９５℃を１０分の初期変性の後、９４℃で３０秒と６５℃で２分とからなるサイクルを４０サイクルに続いて９８℃を１０分、８℃で維持とした。
【0066】
ＰＣＲ後、Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒオイル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製、１８６３００４）を使用して、ＱＸ２００（商標） ｄｒｏｐｌｅｔ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製、１８６４００３ＪＡ）にてドロップレットの発光強度として、発光強度に比例する励起波長の振幅を測定した。振幅の解析には、解析ソフトウェアＱｕａｎｔａＳｏｆｔ又はＱＸ Ｍａｎａｇｅｒ １．２ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（どちらもＢｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いた。
【0067】
（結果）
検体１では、図１に示すようにＢＬＶ ｔａｘ遺伝子（ＦＡＭ）とＲＰＰ３０（ＨＥＸ）とが検出された。ＤＲＢ３＊００９：０２及びＲＰＰ３０は同じＨＥＸの振幅に基づいて検出されるが、表１に示すように、ＤＲＢ３＊００９：０２ジェノタイピングプローブをＲＰＰ３０＿２５２３６＿プローブよりも低濃度で使用している。よって、検体２では、図２に示すようにＤＲＢ３＊００９：０２陽性ドロップレットが“ＨＥＸ ｌｏｗ”として検出され、ＲＰＰ３０陽性ドロップレットが“ＨＥＸ ｈｉｇｈ”として検出された。また、ＤＲＢ３＊００９：０２及びＲＰＰ３０の両方が陽性のドロップレット“Ｈｅｘ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ”として検出された。検体３では、図３に示すようにＢＬＶ ｔａｘ遺伝子と、ＤＲＢ３＊００９：０２と、ＲＰＰ３０とが検出された。検体４では、図４に示すように、陽性のドロップレットは検出されなかった。本試験例において、標的とする３個の遺伝子を同時に検出できた。
検体１では、図１に示すようにＢＬＶ ｔａｘ遺伝子（ＦＡＭ）とＲＰＰ３０（ＨＥＸ）とが検出された。ＤＲＢ３＊００９：０２及びＲＰＰ３０は同じＨＥＸの振幅に基づいて検出されるが、表１に示すように、ＤＲＢ３＊００９：０２ジェノタイピングプローブをＲＰＰ３０＿２５２３６＿プローブよりも低濃度で使用している。よって、検体２では、図２に示すようにＤＲＢ３＊００９：０２陽性ドロップレットが“ＨＥＸ ｌｏｗ”として検出され、ＲＰＰ３０陽性ドロップレットが“ＨＥＸ ｈｉｇｈ”として検出された。また、ＤＲＢ３＊００９：０２及びＲＰＰ３０の両方が陽性のドロップレット“Ｈｅｘ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ”として検出された。検体３では、図３に示すようにＢＬＶ ｔａｘ遺伝子と、ＤＲＢ３＊００９：０２と、ＲＰＰ３０とが検出された。検体４では、図４に示すように、陽性のドロップレットは検出されなかった。本試験例において、標的とする３個の遺伝子を同時に検出できた。
【0068】
（試験例２：プローブの濃度の検討）
試験例１の結果において、ＨＥＸ ｌｏｗ陽性ドロップレット、ＨＥＸ ｈｉｇｈ陽性ドロップレット及びＨＥＸ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ陽性ドロップレットの分布をさらに明確に分離するために、プローブの濃度を検討した。表１に示す反応液におけるＢＬＶ ｔａｘ ７４５４プローブ、ＤＲＢ３＊００９：０２ジェノタイピングプローブ及びＲＰＰ３０＿２５２３６＿プローブの量をそれぞれＸ、Ｙ及びＺとして、表２に示すＸ、Ｙ及びＺの反応液１～１５を調整した。テンプレートには検体３由来のゲノムＤＮＡを使用した。反応液１～１５について、試験例１と同様にＰＣＲを行い、振幅を解析した。
試験例１の結果において、ＨＥＸ ｌｏｗ陽性ドロップレット、ＨＥＸ ｈｉｇｈ陽性ドロップレット及びＨＥＸ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ陽性ドロップレットの分布をさらに明確に分離するために、プローブの濃度を検討した。表１に示す反応液におけるＢＬＶ ｔａｘ ７４５４プローブ、ＤＲＢ３＊００９：０２ジェノタイピングプローブ及びＲＰＰ３０＿２５２３６＿プローブの量をそれぞれＸ、Ｙ及びＺとして、表２に示すＸ、Ｙ及びＺの反応液１～１５を調整した。テンプレートには検体３由来のゲノムＤＮＡを使用した。反応液１～１５について、試験例１と同様にＰＣＲを行い、振幅を解析した。
【0069】
【表2】
【0070】
（結果）
反応液１～３、反応液４～７、反応液８～１２及び反応液１３～１５のＨＥＸの振幅をそれぞれ図５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す。ＤＲＢ３＊００９：０２ジェノタイピングプローブ０．４μＬとＲＰＰ３０＿２５２３６＿プローブ０．８μＬとを含む反応液１０及び反応液１５において、ＨＥＸ ｌｏｗ陽性ドロップレット、ＨＥＸ ｈｉｇｈ陽性ドロップレット及びＨＥＸ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ陽性ドロップレットが最も明確に互いに分離されて検出された。
反応液１～３、反応液４～７、反応液８～１２及び反応液１３～１５のＨＥＸの振幅をそれぞれ図５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す。ＤＲＢ３＊００９：０２ジェノタイピングプローブ０．４μＬとＲＰＰ３０＿２５２３６＿プローブ０．８μＬとを含む反応液１０及び反応液１５において、ＨＥＸ ｌｏｗ陽性ドロップレット、ＨＥＸ ｈｉｇｈ陽性ドロップレット及びＨＥＸ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ陽性ドロップレットが最も明確に互いに分離されて検出された。
【0071】
（試験例３：ＢＬＶプロウイルスの遺伝子の検出の検討）
ＢＬＶプロウイルスの遺伝子の検出能をさらに高めるために、株間において塩基配列の保存性が高いｐｏｌ遺伝子に対してプライマー及びプローブを設計した。ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベース上に登録されているＢＬＶの各株のｐｏｌ遺伝子の塩基配列をアライメントし、ｐｏｌ遺伝子の保存領域を調べ、保存領域に対して表３に示すプライマー／プローブセットＡ、プライマー／プローブセットＢ、プライマー／プローブセットＣ及びプライマー／プローブセットＤを設計した。なお、ＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４６３９ プローブ、ＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４５６０ プローブ及びＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４６３５ プローブの各５’末端はＦＡＭで標識されている。また、ＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４６３９ プローブ、ＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４５６０ プローブ及びＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４６３５ プローブの各３’末端はＢＨＱ－１を有する。ＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４６３５ プローブの３’末端はＢＨＱ－１を有する。表４に示す組成の反応液について試験例１と同様にｄＰＣＲを行った。表４におけるＢＬＶ＿ｐｏｌ フォワードプライマー、ＢＬＶ＿ｐｏｌ リバースプライマー及びＢＬＶ＿ｐｏｌ プローブとして、プライマー／プローブセットＡ、プライマー／プローブセットＢ、プライマー／プローブセットＣ又はプライマー／プローブセットＤを使用した。テンプレートには検体３由来のゲノムＤＮＡを使用した。
ＢＬＶプロウイルスの遺伝子の検出能をさらに高めるために、株間において塩基配列の保存性が高いｐｏｌ遺伝子に対してプライマー及びプローブを設計した。ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベース上に登録されているＢＬＶの各株のｐｏｌ遺伝子の塩基配列をアライメントし、ｐｏｌ遺伝子の保存領域を調べ、保存領域に対して表３に示すプライマー／プローブセットＡ、プライマー／プローブセットＢ、プライマー／プローブセットＣ及びプライマー／プローブセットＤを設計した。なお、ＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４６３９ プローブ、ＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４５６０ プローブ及びＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４６３５ プローブの各５’末端はＦＡＭで標識されている。また、ＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４６３９ プローブ、ＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４５６０ プローブ及びＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４６３５ プローブの各３’末端はＢＨＱ－１を有する。ＢＬＶ＿ｐｏｌ＿４６３５ プローブの３’末端はＢＨＱ－１を有する。表４に示す組成の反応液について試験例１と同様にｄＰＣＲを行った。表４におけるＢＬＶ＿ｐｏｌ フォワードプライマー、ＢＬＶ＿ｐｏｌ リバースプライマー及びＢＬＶ＿ｐｏｌ プローブとして、プライマー／プローブセットＡ、プライマー／プローブセットＢ、プライマー／プローブセットＣ又はプライマー／プローブセットＤを使用した。テンプレートには検体３由来のゲノムＤＮＡを使用した。
【0072】
【表3】
【0073】
【表4】
【0074】
（結果）
図６、図７、図８及び図９は、それぞれプライマー／プローブセットＡ、プライマー／プローブセットＢ、プライマー／プローブセットＣ及びプライマー／プローブセットＤを使用した反応液について解析したドロップレットの振幅の分布を示す。プライマー／プローブセットＢ及びプライマー／プローブセットＣを使用した反応液において、ＦＡＭ陽性ドロップレットとＦＡＭ陰性ドロップレットとがより明確に分離して検出された。
図６、図７、図８及び図９は、それぞれプライマー／プローブセットＡ、プライマー／プローブセットＢ、プライマー／プローブセットＣ及びプライマー／プローブセットＤを使用した反応液について解析したドロップレットの振幅の分布を示す。プライマー／プローブセットＢ及びプライマー／プローブセットＣを使用した反応液において、ＦＡＭ陽性ドロップレットとＦＡＭ陰性ドロップレットとがより明確に分離して検出された。
【0075】
（試験例４：ＰＣＲの条件検討）
試験例３において、プライマー／プローブセットＢを使用した場合に、ＦＡＭ陽性ドロップレットの蛍光強度が低い検体（ＢＬＶ感染牛；Ｍ２９）が見られた。これは、プローブの塩基配列とＢＬＶプロウイルスのｐｏｌ遺伝子の塩基配列との間にミスマッチがあり、プローブが十分にハイブリダイズできなかったことを示す。そこでＰＣＲの温度条件及び増幅時間を検討した。
試験例３において、プライマー／プローブセットＢを使用した場合に、ＦＡＭ陽性ドロップレットの蛍光強度が低い検体（ＢＬＶ感染牛；Ｍ２９）が見られた。これは、プローブの塩基配列とＢＬＶプロウイルスのｐｏｌ遺伝子の塩基配列との間にミスマッチがあり、プローブが十分にハイブリダイズできなかったことを示す。そこでＰＣＲの温度条件及び増幅時間を検討した。
【0076】
上記表４に示す組成において、ＢＬＶ＿ｐｏｌ フォワードプライマー、ＢＬＶ＿ｐｏｌ リバースプライマー及びＢＬＶ＿ｐｏｌ プローブとしてプライマー／プローブセットＢを使用した反応液について、ＰＣＲのサーマルリサイクル以外は試験例１と同様にｄＰＣＲを行った。本試験例でのＰＣＲのサーマルリサイクルは、９５℃を１０分の初期変性の後、９４℃で３０秒とＤ℃で２分とからなるサイクルを６０サイクルに続いて９８℃を１０分、８℃で維持とした（Ｄは６５、６４．６、６３．７、６２．４、６０．８、５９．５、５８．６又は５８である）。テンプレートには試験例１の検体１～４に加え、Ｍ２９由来のゲノムＤＮＡを使用した。
【0077】
（結果）
Ｍ２９由来のゲノムＤＮＡをテンプレートとして含む反応液のＦＡＭ（ＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子）の振幅を図１０に示す。５８℃の場合に、陽性ドロップレットと陰性ドロップレットとが最も分離して検出された。なお、検体１～４については、すべてのＤにおいて検出能を維持した。
Ｍ２９由来のゲノムＤＮＡをテンプレートとして含む反応液のＦＡＭ（ＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子）の振幅を図１０に示す。５８℃の場合に、陽性ドロップレットと陰性ドロップレットとが最も分離して検出された。なお、検体１～４については、すべてのＤにおいて検出能を維持した。
【0078】
（試験例５：ＤＲＢ３＊００９：０２、ＤＲＢ３＊０１６：０１、ＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子及びＲＰＰ３０の同時検出の検討）
ＤＲＢ３＊００９：０２、ＤＲＢ３＊０１６：０１、ＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子及びＲＰＰ３０に加えて、対立遺伝子ＤＲＢ３＊０１６：０１の同時検出を検討した。ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するリバースプライマーはＤＲＢ３＊００９：０２に対するリバースプライマーと同じとし（“共通リバースプライマー”ともいう）、ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するフォワードプライマーとプローブとを設計した。非特異的なシグナルを検出しないように、ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するフォワードプライマーと共通リバースプライマーとによって増幅される塩基配列にＤＲＢ３＊００９：０２に対するプローブがハイブリダイズしない位置に、表５に示すＤＲＢ３＊０１６：０１に対するフォワードプライマーとプローブとを設計した。なお、ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するプローブの５’末端はＦＡＭで標識され、３’末端はＭＧＢ－Ｅｃｌｉｐｓｅを有する。
ＤＲＢ３＊００９：０２、ＤＲＢ３＊０１６：０１、ＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子及びＲＰＰ３０に加えて、対立遺伝子ＤＲＢ３＊０１６：０１の同時検出を検討した。ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するリバースプライマーはＤＲＢ３＊００９：０２に対するリバースプライマーと同じとし（“共通リバースプライマー”ともいう）、ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するフォワードプライマーとプローブとを設計した。非特異的なシグナルを検出しないように、ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するフォワードプライマーと共通リバースプライマーとによって増幅される塩基配列にＤＲＢ３＊００９：０２に対するプローブがハイブリダイズしない位置に、表５に示すＤＲＢ３＊０１６：０１に対するフォワードプライマーとプローブとを設計した。なお、ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するプローブの５’末端はＦＡＭで標識され、３’末端はＭＧＢ－Ｅｃｌｉｐｓｅを有する。
【0079】
【表5】
【0080】
表６に示す組成の反応液について、ＰＣＲのサーマルリサイクル以外は試験例１と同様にｄＰＣＲを行った。表６中のＭは、０．２５、０．２、０．１５、０．１とした。本試験例でのＰＣＲのサーマルリサイクルは、９５℃を１０分の初期変性の後、９４℃で３０秒と５８℃で２分とからなるサイクルを６０サイクルに続いて９８℃を１０分、８℃で維持とした。テンプレートには試験例１の検体１～４及びＭ２９由来のゲノムＤＮＡを使用した。
【0081】
【表6】
【0082】
（結果）
図１１及び図１２は、それぞれ検体１及びＭ２９由来のゲノムＤＮＡを含む反応液のＦＡＭの振幅を示す。プローブの添加量が０．１５μＬの場合にＦＡＭ ｌｏｗ陽性ドロップレット、ＦＡＭ ｈｉｇｈ陽性ドロップレット及びＨＥＸ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ陽性ドロップレットが最も明確に互いに分離されて検出された。
図１１及び図１２は、それぞれ検体１及びＭ２９由来のゲノムＤＮＡを含む反応液のＦＡＭの振幅を示す。プローブの添加量が０．１５μＬの場合にＦＡＭ ｌｏｗ陽性ドロップレット、ＦＡＭ ｈｉｇｈ陽性ドロップレット及びＨＥＸ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ陽性ドロップレットが最も明確に互いに分離されて検出された。
【0083】
Ｍが０．１５μＬの反応液で測定した検体１についてのＦＡＭ及びＨＥＸの振幅の分布を図１３に示す。ＢＬＶ感受性遺伝子及び高プロウイルスを保有する検体１では、ＲＢ３＊０１６：０１、ＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子及びＲＰＰ３０において陽性のドロップレットが検出された。Ｍが０．１５μＬの反応液で測定した検体２についてのＦＡＭ及びＨＥＸの振幅の分布を図１４に示す。ＢＬＶ抵抗性遺伝子を保有する検体２では、ＲＢ３＊００９：０２及びＲＰＰ３０において陽性のドロップレットが検出された。Ｍが０．１５μＬの反応液で測定した検体３についてのＦＡＭ及びＨＥＸの振幅の分布を図１５に示す。ＢＬＶ抵抗性遺伝子、ＢＬＶ抵抗性遺伝子及び高プロウイルスを保有する検体３では、ＲＢ３＊０１６：０１、ＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子、ＲＢ３＊００９：０２及びＲＰＰ３０において陽性のドロップレットが検出された。Ｍが０．１５μＬの反応液で測定した検体４についてのＦＡＭ及びＨＥＸの振幅の分布を図１６に示す。陰性対照の検体４では、陽性のドロップレットは検出されなかった。Ｍが０．１５μＬの反応液で測定したＭ２９についてのＦＡＭ及びＨＥＸの振幅の分布を図１７に示す。高プロウイルスを保有するＭ２９では、ＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子及びＲＰＰ３０において陽性のドロップレットが検出された。
【0084】
（試験例６：ロック核酸による特異性の向上の検討）
上記試験例５におけるＭが０．１５μＬの反応液で野外検体について測定した場合に、非特異反応を示す検体Ｍ６が見られた。Ｍ６は、ＢＬＶ非感染牛で、ＤＲＢ３＊０１８：０１と＊０２８：０１とヘテロアリルであった。非特異反応の原因として、ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するフォワードプライマーと他のプライマーの交差反応が考えられることから、各プライマーの特異性の向上を検討した。
上記試験例５におけるＭが０．１５μＬの反応液で野外検体について測定した場合に、非特異反応を示す検体Ｍ６が見られた。Ｍ６は、ＢＬＶ非感染牛で、ＤＲＢ３＊０１８：０１と＊０２８：０１とヘテロアリルであった。非特異反応の原因として、ＤＲＢ３＊０１６：０１に対するフォワードプライマーと他のプライマーの交差反応が考えられることから、各プライマーの特異性の向上を検討した。
【0085】
特異性を向上させるために、２’－Ｏと４’－Ｃがメチレンで架橋された人工合成核酸であるロック核酸を３’末端に導入し、塩基配列のＲＢ３＊００９：０２に対するプライマー（ＲＢ３＊００９：０２ ＬＦ１）及びＤＲＢ３＊０１６：０１に対するプライマー（ＤＲＢ３＊０１６：０１ ＬＦ１）を設計した。ＲＢ３＊００９：０２ ＬＦ１及びＤＲＢ３＊０１６：０１ ＬＦ１の塩基配列を表７に示す。
【0086】
【表7】
【0087】
表８に示す組成の反応液について、試験例５と同様にｄＰＣＲを行った。テンプレートにはＭ６由来のゲノムＤＮＡを使用した。
【0088】
【表8】
【0089】
（結果）
比較のために、上記試験例５におけるＭが０．１５μＬの反応液を用いて測定したＭ６についてのＦＡＭ及びＨＥＸの振幅の分布を図１８に示す。図１９は本試験例に係るＭ６についてのＦＡＭ及びＨＥＸの振幅の分布を示す。図１８の分布に現れた非特異反応による陽性ドロップレットを、ロック核酸を含むフォワードプライマーを使用することで抑制することができた。
比較のために、上記試験例５におけるＭが０．１５μＬの反応液を用いて測定したＭ６についてのＦＡＭ及びＨＥＸの振幅の分布を図１８に示す。図１９は本試験例に係るＭ６についてのＦＡＭ及びＨＥＸの振幅の分布を示す。図１８の分布に現れた非特異反応による陽性ドロップレットを、ロック核酸を含むフォワードプライマーを使用することで抑制することができた。
【0090】
（試験例７：ロック核酸を有するプライマーを用いる検査方法の調整）
表９に示す組成の反応液について、試験例５と同様にｄＰＣＲを行った。テンプレートには検体１～４及びＭ２９に加え、ＤＲＢ３＊０１６：０１及びＤＲＢ３＊００９：０２を有していないＢＬＶ感染牛（検体５）、ＤＲＢ３＊０１６：０１及びＤＲＢ３＊００９：０２を有していないＢＬＶ非感染牛（検体６）由来のゲノムＤＮＡを使用した。
表９に示す組成の反応液について、試験例５と同様にｄＰＣＲを行った。テンプレートには検体１～４及びＭ２９に加え、ＤＲＢ３＊０１６：０１及びＤＲＢ３＊００９：０２を有していないＢＬＶ感染牛（検体５）、ＤＲＢ３＊０１６：０１及びＤＲＢ３＊００９：０２を有していないＢＬＶ非感染牛（検体６）由来のゲノムＤＮＡを使用した。
【0091】
【表9】
【0092】
（結果）
検体１～６及びＭ２９における振幅の分布を、それぞれ図２０～２５及び図２６に示す。検体１～６及びＭ２９の抗病性に関連する対立遺伝子及びＢＬＶの感染有無を正しく反映した陽性ドロップレットを検出することができた。
検体１～６及びＭ２９における振幅の分布を、それぞれ図２０～２５及び図２６に示す。検体１～６及びＭ２９の抗病性に関連する対立遺伝子及びＢＬＶの感染有無を正しく反映した陽性ドロップレットを検出することができた。
【0093】
上記試験例におけるｄＰＣＲでは、ＢＬＶ感染細胞率がＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子陽性ドロップレット数をＲＰＰ３０陽性ドロップレット数の１／２で除した値として算出できる。ＤＲＢ３＊０１６：０１陽性率がＤＲＢ３＊０１６：０１陽性ドロップレット数をＲＰＰ３０陽性ドロップレット数で除した値として算出できる。ＤＲＢ３＊００９：０２陽性率がＤＲＢ３＊００９：０２陽性ドロップレット数をＲＰＰ３０陽性ドロップレット数で除した値として算出できる。ＤＲＢ３＊０１６：０１陽性率が約１の場合、ＤＲＢ３＊０１６：０１のホモ接合体であって、約０．５の場合、ＤＲＢ３＊０１６：０１と他のアリルとのヘテロ接合体であることを示す。同様に、ＤＲＢ３＊００９：０２陽性率が約１の場合、ＤＲＢ３＊００９：０２のホモ接合体であって、約０．５の場合、ＤＲＢ３＊００９：０２と他のアリルとのヘテロ接合体であることを示す。
【0094】
（試験例８：アリルタイピングの感度及び特異度の分析）
牛のゲノムＤＮＡ５８検体について、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ及びシークエンス法で塩基配列を決定した。一方で、上記表９に示す組成の反応液を用いて、試験例５と同様にｄＰＣＲを行った。
牛のゲノムＤＮＡ５８検体について、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ及びシークエンス法で塩基配列を決定した。一方で、上記表９に示す組成の反応液を用いて、試験例５と同様にｄＰＣＲを行った。
【0095】
ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法は、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（ＲＲ００６Ａ、タカラバイオ社製）を使用して以下のように行った。制限酵素（いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）として、Ｒｓａ Ｉ（Ｒ０１６７Ｓ）、Ｈａｅ ＩＩＩ（Ｒ０１０８Ｓ）及びＢｓｔＹ Ｉ（Ｒ０５２３Ｓ）を使用し、反応液にはＮＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ ｖｅｒ ２．１及びＣｕｔＳｍａｒｔ（いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）を使用した。テンプレートを牛血液由来ＤＮＡ（１００～２００ｎｇ／μＬ）とした。
【0096】
まず、ＤＲＢ３ エクソン２を標的としたセミネステッドＰＣＲを行った。第１ラウンドのＰＣＲの反応ミックスの組成はＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １４．８μＬ、１０×バッファー（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加） ２．０μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ） １．６μＬ、プライマーＨＬ０３０（１０μＭ） ０．２μＬ、プライマーＨＬ０３１（１０μＭ） ０．２μＬ、及びＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（５Ｕ／μＬ） ０．２μＬとした。プライマーＨＬ０３０及びプライマーＨＬ０３１の塩基配列をそれぞれ配列番号２６及び２７に示す。
【0097】
上記の反応ミックスにサンプルＤＮＡを１μＬ入れて、ＰＣＲを行った。反応条件は、９８℃で２分間保持した後、９８℃で１０秒間と、６０℃で１５秒間と、７２℃で３０秒と、からなるサイクルを１０サイクル繰り返し、７２℃で７分間保持し、１０℃とした。
【0098】
第２ラウンドのＰＣＲの反応ミックスの組成はＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ３０．２μＬ、１０×バッファー（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加） ４．０μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ） ３．２μＬ、プライマーＨＬ０３０（１０μＭ） ０．２μＬ、プライマーＨＬ０３２（１０μＭ） ０．２μＬ、及びＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（５Ｕ／μＬ） ０．２μＬとした。プライマーＨＬ０３２の塩基配列をそれぞれ配列番号２８に示す。
【0099】
上記の反応ミックスに第１ラウンドのＰＣＲ産物を２μＬ入れて、ＰＣＲを行った。反応条件は、９８℃で２分間保持した後、９８℃で１０秒間と、６０℃で１５秒間と、７２℃で３０秒と、からなるサイクルを３５サイクル繰り返し、７２℃で７分間保持し、１０℃とした。
【0100】
続いて、第２ラウンドのＰＣＲで得たＰＣＲ産物をＢｓｔＹ Ｉ、Ｒｓａ Ｉ及び Ｈａｅ ＩＩＩで切断処理した。ＢｓｔＹ Ｉの反応の反応ミックスの組成は、蒸留水 ３．０μＬ、１０×ＮＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ及びＢｓｔＹ Ｉ（１０Ｕ／μＬ） ０．５μＬとした。当該反応ミックスに、ＰＣＲ産物を１０μＬ加え、６０℃で５時間インキュベートした。
【0101】
Ｒｓａ Ｉ及び Ｈａｅ ＩＩＩの反応の反応ミックスの組成は、蒸留水 ３．０μＬ、１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ及びＲｓａ Ｉ又はＨａｅ ＩＩＩ（１０Ｕ／μＬ） ０．５μＬとした。当該反応ミックスに、ＰＣＲ産物を１０μＬ加え、３７℃で６時間インキュベートした。
【0102】
ポリアクリルアミドゲルの組成は、１×Ｔｒｉｓ－Ｂｏｒａｔｅ－ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＥ緩衝液、Ｔ９１２１、タカラバイオ社製） １６．３ｍＬ、アクリルアミド液（４０ｗ／ｖ％－アクリルアミド／ビス混合液（１９：１）、０６１４０－４５、ナカライテスク社製） ３．５ｍＬ、１０％ ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム、１６１０７００、ＢＩＯＲＡＤ社製） ２００μＬ及びＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン、１６１０８００、ＢＩＯＲＡＤ社製） １４μＬとした。ポリアクリルアミドゲルを電気泳動装置に固定後、１×ＴＢＥ緩衝液を装置に入れて、６×ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒと混ぜたサンプルを１５μＬずつ各ウェルに入れた。１４０Ｖで２８分間、電気泳動を行った。蒸留水 ４０ｍＬとＧｅｌＲｅｄ（４１００２、コスモ・バイオ社製） ２μＬとの混合液にゲルを入れ、２０分間撹拌した。紫外線下でゲルを撮影し、バンドパターンにより牛ＭＨＣ クラスＩＩアリルのタイピングを行った。
【0103】
さらにシークエンス法により、これらの全検体のＤＮＡ配列を決定した。シークエンス法は、ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（４３３７４５６、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したサンガー法にて行い、プライマーとしてＨＬ０３０及びＨＬ０３２を使用した。もし検体の対立遺伝子がヘテロ接合体で、シークエンシングにおいて異なる対立遺伝子のベースコーリング波形が重なった所見が得られた場合、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法のバンドパターンと併せて対立遺伝子の遺伝子型を決定した。
【0104】
（結果）
ｄＰＣＲで得られた振幅の分布からＤＲＢ３＊０１６：０１が陽性と判定された検体数と、塩基配列から判明した対立遺伝子との比較を表１０に示す。ｄＰＣＲで得られた振幅の分布からＤＲＢ３＊００９：０２が陽性と判定された検体数と、塩基配列から判明した対立遺伝子との比較を表１１に示す。ｄＰＣＲによる対立遺伝子の判定は、塩基配列から判明した対立遺伝子と完全に一致した。
ｄＰＣＲで得られた振幅の分布からＤＲＢ３＊０１６：０１が陽性と判定された検体数と、塩基配列から判明した対立遺伝子との比較を表１０に示す。ｄＰＣＲで得られた振幅の分布からＤＲＢ３＊００９：０２が陽性と判定された検体数と、塩基配列から判明した対立遺伝子との比較を表１１に示す。ｄＰＣＲによる対立遺伝子の判定は、塩基配列から判明した対立遺伝子と完全に一致した。
【0105】
【表10】
【0106】
【表11】
【0107】
（試験例９：プロウイルスの定量性能の評価）
牛のゲノムＤＮＡ４０検体について、上記表９に示す組成の反応液を用いて、試験例５と同様にｄＰＣＲを行った。ＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子陽性ドロップレット数及びＲＰＰ３０陽性ドロップレット数からＢＬＶ感染細胞率として求め、ｑＰＣＲによって定量したＢＬＶ感染細胞率と比較した。
牛のゲノムＤＮＡ４０検体について、上記表９に示す組成の反応液を用いて、試験例５と同様にｄＰＣＲを行った。ＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子陽性ドロップレット数及びＲＰＰ３０陽性ドロップレット数からＢＬＶ感染細胞率として求め、ｑＰＣＲによって定量したＢＬＶ感染細胞率と比較した。
【0108】
リアルタイムＰＣＲによるＢＬＶの感染細胞率（プロウイルスのコピー数÷（０．５×ハウスキーピング遺伝子のコピー数）×１００)は、ウシ白血病ウイルス検出キット（ｗｉｔｈ ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ、タカラバイオ社製）を用いて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で測定した。
【0109】
（結果）
ｄＰＣＲで求めたＢＬＶ感染細胞率に対するｑＰＣＲで求めたＢＬＶ感染細胞率を図２７に示す。本試験例に係るｄＰＣＲは、ｑＰＣＲと同等の精度でウイルスを定量できることが示された。
ｄＰＣＲで求めたＢＬＶ感染細胞率に対するｑＰＣＲで求めたＢＬＶ感染細胞率を図２７に示す。本試験例に係るｄＰＣＲは、ｑＰＣＲと同等の精度でウイルスを定量できることが示された。
【0110】
（試験例１０：プロウイルスの検出限界の評価）
ＢＬＶ感染牛（感染細胞率１．５％）の血液を非感染牛の血液で系列希釈した。系列希釈したサンプルからゲノムＤＮＡを抽出し（ｎ＝３）、試験例９と同様に、ｄＰＣＲ及びｑＰＣＲを行った。
ＢＬＶ感染牛（感染細胞率１．５％）の血液を非感染牛の血液で系列希釈した。系列希釈したサンプルからゲノムＤＮＡを抽出し（ｎ＝３）、試験例９と同様に、ｄＰＣＲ及びｑＰＣＲを行った。
【0111】
（結果）
表１２に示すように、本試験例に係るｄＰＣＲによるウイルス検出限界は、ｑＰＣＲと同等であることが示された。
表１２に示すように、本試験例に係るｄＰＣＲによるウイルス検出限界は、ｑＰＣＲと同等であることが示された。
【0112】
【表12】
【0113】
（試験例１１：ＥＬＩＳＡによるＢＬＶ感染牛の検出能力との比較）
牛のゲノムＤＮＡ６５検体について、上記表９に示す組成の反応液を用いて、試験例５と同様にｄＰＣＲを行い、各検体のＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子の陽性又陰性を判定した。一方、ＢＬＶに対する抗体を検出するＥＬＩＳＡキット（ニッポンジーン社製）を用いて、抗体の陽性又は陰性を判定した。
牛のゲノムＤＮＡ６５検体について、上記表９に示す組成の反応液を用いて、試験例５と同様にｄＰＣＲを行い、各検体のＢＬＶ ｐｏｌ遺伝子の陽性又陰性を判定した。一方、ＢＬＶに対する抗体を検出するＥＬＩＳＡキット（ニッポンジーン社製）を用いて、抗体の陽性又は陰性を判定した。
【0114】
（結果）
表１２に示すように、本試験例に係るｄＰＣＲによる感染牛の判定結果は、ＥＬＩＳＡによる判定結果と高い一致度を示した。ｄＰＣＲが陽性でＥＬＩＳＡが陰性の検体は、初期感染牛であると考えられる。ｄＰＣＲが陰性でＥＬＩＳＡが陽性の検体は、ＢＬＶに対して抵抗性のある個体である可能性が高い。ｄＰＣＲが陰性でＥＬＩＳＡが陽性の検体の内、１検体は、ＢＬＶ抵抗性遺伝子ＤＲＢ３＊００９：０２が陽性であった。
表１２に示すように、本試験例に係るｄＰＣＲによる感染牛の判定結果は、ＥＬＩＳＡによる判定結果と高い一致度を示した。ｄＰＣＲが陽性でＥＬＩＳＡが陰性の検体は、初期感染牛であると考えられる。ｄＰＣＲが陰性でＥＬＩＳＡが陽性の検体は、ＢＬＶに対して抵抗性のある個体である可能性が高い。ｄＰＣＲが陰性でＥＬＩＳＡが陽性の検体の内、１検体は、ＢＬＶ抵抗性遺伝子ＤＲＢ３＊００９：０２が陽性であった。
【0115】
【表13】
【0116】
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【0117】
本発明は、ＥＢＬの予防に好適である。
【符号の説明】
【0118】
１，３，５ プライマー対、２，２ａ，２ｂ，４，６ プローブ、１Ｆ，１１Ｆ，１２Ｆ フォワードプライマー、１Ｒ，１１Ｒ，１２Ｒ リバースプライマー、２１，２３，２４，４１，６１ 蛍光色素、２２，４２，６２ 消光剤、Ｓ１，Ｓ１ａ，Ｓ１ｂ，Ｓ２，Ｓ３ 塩基配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】