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▶ ハーバー・バイオメド・（シャンハイ）・カンパニー・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024036342
(43)【公開日】2024-03-15
(54)【発明の名称】ＣＤ３を標的とする抗体、二重特異性抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240308BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240308BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240308BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240308BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240308BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240308BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240308BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240308BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240308BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240308BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/13 ZNA
C12N15/85 Z
C07K16/46
C07K16/28
C12N5/10
A61P35/00
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61K48/00
A61K35/12
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024000181
(22)【出願日】2024-01-04
(62)【分割の表示】P 2022520343の分割
【原出願日】2020-09-29
(31)【優先権主張番号】201910941328.6
(32)【優先日】2019-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】520223321
【氏名又は名称】ハーバー・バイオメド・（シャンハイ）・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＲＢＯＵＲ ＢＩＯＭＥＤ （ＳＨＡＮＧＨＡＩ） ＣＯ．， ＬＴＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】何 云
(72)【発明者】
【氏名】石 磊
(57)【要約】
【課題】１つには、霊長類ＣＤ３と結合でき、適切なＣＤ３結合能力を有し、しかも安定的な単鎖ｓｃＦｖ構造を有するＣＤ３抗体を提供すること。
【解決手段】ＣＤ３を標的とする抗体、二重特異性抗体及びその使用を開示する。前記ＣＤ３を標的とする抗体は軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、前記ＶＬは配列番号５６に示すアミノ酸配列又はそのバリアントであり、前記ＶＨは配列番号４２に示すアミノ酸配列に変異が起こり、前記変異は３０位、７３位、７６位、７８位、９３位及び９４位のアミノ酸残基の一つ又は複数の部位から選ばれる。前記二重特異性抗体は第１タンパク質ドメインと第２タンパク質ドメインとを含み、前記第１タンパク質ドメインは前記ＣＤ３を標的とする抗体を含む。本発明のＣＤ３を標的とする抗体はサイトカイン放出症候群によって引き起こされる毒性が低減され、それを用いて製造された二重特異性抗体は安定的でＴ細胞結合能力を有し、生産の難易度が下がる。
【選択図】図１１
【解決手段】ＣＤ３を標的とする抗体、二重特異性抗体及びその使用を開示する。前記ＣＤ３を標的とする抗体は軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、前記ＶＬは配列番号５６に示すアミノ酸配列又はそのバリアントであり、前記ＶＨは配列番号４２に示すアミノ酸配列に変異が起こり、前記変異は３０位、７３位、７６位、７８位、９３位及び９４位のアミノ酸残基の一つ又は複数の部位から選ばれる。前記二重特異性抗体は第１タンパク質ドメインと第２タンパク質ドメインとを含み、前記第１タンパク質ドメインは前記ＣＤ３を標的とする抗体を含む。本発明のＣＤ３を標的とする抗体はサイトカイン放出症候群によって引き起こされる毒性が低減され、それを用いて製造された二重特異性抗体は安定的でＴ細胞結合能力を有し、生産の難易度が下がる。
【選択図】図１１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、前記ＶＬは配列番号５６に示すアミノ酸配列又はそのバリアントであり、前記ＶＨは配列番号４２に示すアミノ酸配列に変異が起こり、前記変異は３０位、７３位、７６位、７８位、９３位及び９４位のアミノ酸残基の１つ又は複数の部位から選ばれ、前記部位にはＣｈｏｔｈｉａ番号付け方式の位置番号を使用することを特徴とするＣＤ３を標的とする抗体。
【請求項2】
前記ＶＨに起こる変異は以下の組み合わせから選ばれることを特徴とする請求項１に記載のＣＤ３を標的とする抗体。
（ａ）３０位、
（ｂ）３０位、７３位及び７６位、
（ｃ）３０位、９３位及び９４位、
（ｄ）３０位、７３位及び９３位、
（ｅ）３０位、９３位、
（ｆ）３０位、７６位及び７８位、
（ｇ）７３位、７６位、９３位及び９４位、
（ｈ）７６位、７８位及び９３位、
（ｉ）３０位、７３位、７６位、９３位及び９４位、
（ｊ）３０位、７６位、７８位及び９３位。
（ａ）３０位、
（ｂ）３０位、７３位及び７６位、
（ｃ）３０位、９３位及び９４位、
（ｄ）３０位、７３位及び９３位、
（ｅ）３０位、９３位、
（ｆ）３０位、７６位及び７８位、
（ｇ）７３位、７６位、９３位及び９４位、
（ｈ）７６位、７８位及び９３位、
（ｉ）３０位、７３位、７６位、９３位及び９４位、
（ｊ）３０位、７６位、７８位及び９３位。
【請求項3】
前記ＶＨに起こる変異は以下の組み合わせから選ばれることを特徴とする請求項１に記載のＣＤ３を標的とする抗体。
（ａ）Ｎ３０Ｓ、
（ｂ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ及びＳ７６Ｎ、
（ｃ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｄ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ及びＶ９３Ａ、
（ｅ）Ｎ３０Ｓ及びＶ９３Ｔ、
（ｆ）Ｎ３０Ｓ、Ｓ７６Ｎ及びＬ７８Ａ、
（ｇ）Ｄ７３Ｎ、Ｓ７６Ｎ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｈ）Ｓ７６Ｎ、Ｌ７８Ａ及びＶ９３Ｔ、
（ｉ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ、Ｓ７６Ｎ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｊ）Ｎ３０Ｓ、Ｓ７６Ｎ、Ｌ７８Ａ及びＶ９３Ｔ。
（ａ）Ｎ３０Ｓ、
（ｂ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ及びＳ７６Ｎ、
（ｃ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｄ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ及びＶ９３Ａ、
（ｅ）Ｎ３０Ｓ及びＶ９３Ｔ、
（ｆ）Ｎ３０Ｓ、Ｓ７６Ｎ及びＬ７８Ａ、
（ｇ）Ｄ７３Ｎ、Ｓ７６Ｎ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｈ）Ｓ７６Ｎ、Ｌ７８Ａ及びＶ９３Ｔ、
（ｉ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ、Ｓ７６Ｎ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｊ）Ｎ３０Ｓ、Ｓ７６Ｎ、Ｌ７８Ａ及びＶ９３Ｔ。
【請求項4】
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３～５５のいずれか一つの配列に示すとおりであり、且つ／又は、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７～６０のいずれか一つの配列に示すとおりであることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ３を標的とする抗体。
【請求項5】
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５２に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５０に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４８に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４９に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５９に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５９に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４６に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであることを特徴とする請求項４に記載のＣＤ３を標的とする抗体。
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５２に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５０に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４８に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４９に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５９に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５９に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４６に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであることを特徴とする請求項４に記載のＣＤ３を標的とする抗体。
【請求項6】
ＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ、又はＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬである一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、
好ましくは、前記Ｌｉｎｋｅｒは（Ｇ４Ｓ）ｎ又はそのバリアントであり、ここで、ｎは０以外の自然数で、好ましくは１～２０であり、より好ましくは配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７に示すアミノ酸配列であり、
より好ましくは、前記ｓｃＦｖのアミノ酸配列は配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号７９又は配列番号８０に示すとおりであり、
さらに好ましくは、ヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）によってｓｃＦｖに接続されるＦｃをさらに含むことを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
好ましくは、前記Ｌｉｎｋｅｒは（Ｇ４Ｓ）ｎ又はそのバリアントであり、ここで、ｎは０以外の自然数で、好ましくは１～２０であり、より好ましくは配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７に示すアミノ酸配列であり、
より好ましくは、前記ｓｃＦｖのアミノ酸配列は配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号７９又は配列番号８０に示すとおりであり、
さらに好ましくは、ヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）によってｓｃＦｖに接続されるＦｃをさらに含むことを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
定常領域、好ましくはヒト定常領域をさらに含み、
好ましくは、前記ヒト定常領域はヒト軽鎖定常領域とヒト重鎖定常領域とを含み、前記ヒト軽鎖定常領域は配列番号６１に示すヒトκ軽鎖定常領域又は配列番号６２に示すヒトλ軽鎖定常領域であることが好ましく、
より好ましくは、前記ヒト重鎖定常領域はｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４又はその変異であり、好ましくは配列番号６３又は配列番号６４に示す重鎖定常領域であることを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
好ましくは、前記ヒト定常領域はヒト軽鎖定常領域とヒト重鎖定常領域とを含み、前記ヒト軽鎖定常領域は配列番号６１に示すヒトκ軽鎖定常領域又は配列番号６２に示すヒトλ軽鎖定常領域であることが好ましく、
より好ましくは、前記ヒト重鎖定常領域はｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４又はその変異であり、好ましくは配列番号６３又は配列番号６４に示す重鎖定常領域であることを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＤ３を標的とする抗体を含む第１タンパク質ドメインと、第２タンパク質ドメインとを含む二重特異性抗体。
【請求項9】
（１）第１タンパク質ドメインのＶＬ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）又はＶＨ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）と、（２）第２タンパク質ドメインのＶＨ２－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｈｏｌｅ）と、（３）第２タンパク質ドメインのＶＬ２－ＣＬの３つの鎖を含み、前記第２タンパク質ドメインはＣＤ３以外を標的とする抗体であり、好ましくはＢ７Ｈ４を標的とする抗体又はＲＯＲ１を標的とする抗体であり、前記Ｌｉｎｋｅｒは（Ｇ４Ｓ）ｎであることが好ましく、ここでｎは０以外の自然数で、好ましくは１～２０であり、より好ましくは配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７に示すアミノ酸配列であることを特徴とする請求項８に記載の二重特異性抗体。
【請求項10】
配列番号８８に示すＶＬ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）と、配列番号８６に示すＶＨ２－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｈｏｌｅ）と、配列番号８３に示すＶＬ２－ＣＬと、又は、配列番号８８に示すＶＬ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）と、配列番号８７に示すＶＨ２－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｈｏｌｅ）と、配列番号８５に示すＶＬ２－ＣＬとを含むことを特徴とする請求項９に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＤ３を標的とする抗体又は請求項８～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする、分離された核酸。
【請求項12】
請求項１１に記載の分離された核酸を含み、好ましくは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターから選ばれる発現ベクター。
【請求項13】
請求項１２に記載の発現ベクターがトランスフェクトされ、好ましくは、真核細胞であることを特徴とする遺伝子修飾細胞。
【請求項14】
請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＤ３を標的とする抗体、請求項８～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１３に記載の遺伝子修飾細胞、及び薬学的に許容される担体とを含み、好ましくは、免疫チェックポイント抗体をさらに含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項15】
腫瘍を治療する薬物を製造するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＤ３を標的とする抗体、請求項８～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１１に記載の分離された核酸、請求項１２に記載の発現ベクター、請求項１３に記載の遺伝子修飾細胞、又は請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願には出願日が２０１９年９月３０日の中国特許出願第２０１９１０９４１３２８６号の優先権が主張され、前記中国特許出願の全文が引用される。
【0002】
本発明は、バイオ医薬品分野に関し、特に、ＣＤ３を標的とする抗体、二重特異性抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
Ｔ細胞は適応免疫応答に関与する重要な細胞クラスであり、Ｔ細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって抗原を認識する。ＴＣＲは抗原表面のエピトープを直接的に認識できず、その代わりに抗原提示細胞（ＡＰＣ）又は標的細胞の表面に提示される抗原ペプチド－ＭＨＣ分子複合体（ｐＭＨＣ）を特異的に認識する。Ｔ細胞応答の特異性は、ＴＣＲとＣＤ３の分子複合体によるｐＭＨＣの認識によって媒介される。ＴＣＲは２つの異なる膜貫通型ポリペプチド鎖で構成されるヘテロダイマーであり、ペプチド鎖にはα、β、γ、δの４種類があり、ペプチド鎖の組み合わせによって、ＴＣＲはＴＣＲαβ、ＴＣＲγδに分けられる。ＣＤ３はγ、δ、ε、ζと異なる膜貫通型ポリペプチド鎖を有し、これらのペプチド鎖が互いに作用して形成させたホモダイマー又はヘテロダイマーは、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体の一部になる。例えば、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体はＴＣＲαβダイマー、ＣＤ３γεダイマー、ＣＤ３δεダイマー、ＣＤ３ζζダイマーを含む。ＴＣＲペプチド鎖の細胞質領域が非常に短いため、ＴＣＲの抗原認識によって生成された活性化シグナルはＣＤ３ペプチド鎖によってＴ細胞に伝達されると一般的に考えられている。
【0004】
免疫応答を開始させるＣＤ３の重要な役割により、ＴＣＲ－ＣＤ３シグナル伝達を標的とする、特にＣＤ３に対するモノクローナル抗体は免疫プロセスを調節し、炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療に使用できる効果的な薬物であると考えられている。実際、抗ＣＤ３抗体、オルソクローンＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３）は最初に承認された治療用抗体である。ＯＫＴ３は最初に１９８５年に米ＦＤＡによって臓器移植後の急性拒絶反応の治療薬として承認されていた。ＯＫＴ３の反復投与による免疫抑制能力は腎移植後の拒絶反応への効果的な治療として認められていたが、初期の毒性用量反応症候群によりその使用が制限されており、当該症候群はＯＫＴ３が媒介するＴ細胞活性化とサイトカインの放出に関連していると考えられる。その後、深刻なサイトカインストームとマウス抗体に起因する免疫原性や他の問題が原因で、ＯＫＴ３は２０１０年に市場から姿を消した。
【0005】
ＣＤ３抗体のもう１つの問題は多くのＣＤ３抗体が種特異的であるということで、例えば、ＯＫＴ３はチンパンジーＣＤ３と反応するが、アカゲザルなどの他の霊長類のＣＤ３ホモログ、又はマウスＣＤ３ホモログとは反応しない。ＣＤ３モノクローナル抗体の種特異性は、ヒトの疾患を治療する抗体薬として開発する上で大きな妨げとなる。候補薬をヒトを対象とする臨床試験に使用するには、厳格な前臨床検証を行わなければならない。前臨床試験の目的は候補薬が所定の活性を有すること、そして最も重要なこととして、その安全性を確認することである。前臨床安全性試験では、候補薬を対象種に、好ましくは非ヒト霊長類（Ｎｏｎ－Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ）に投与する。しかし高等霊長類、特にチンパンジーは絶滅危惧種であり、それを使用して医薬品安全性試験を行うことは厳しく制限されている。本分野で安全性評価試験に好適な種としてはアカゲザル、特にカニクイザルが挙げられる。しかし、霊長類種特異的交差反応が生じないＣＤ３抗体では効果的な前臨床安全性評価データを提供できない。ヒトＣＤ３と結合する既知の抗体の中で、ＳＰ３４は複数種の霊長類ＣＤ３（例えば、ヒト及びカニクイザルＣＤ３）と結合できる有数の抗体の１つである（Ｓａｌｍｅｒｏｎ，Ａ．，ｅｔ．ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７（１９９１）３０４７－３０５２、Ｃｏｎｒａｄ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ．ａｌ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ ７１（２００７）９２５～９３３参照）。
【0006】
ＣＤ３モノクローナル抗体は特定の疾患に有効であることが既に臨床的に証明されているが、近年ではＣＤ３抗体が主に二重特異性抗体薬の開発に使用されている。現在、世界で臨床段階又は前臨床段階にある二重特異性抗体プロジェクトのうち、ＣＤ３に基づく二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｓＴＣＥ、Ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）プロジェクトは半分以上を占めている。ＣＤ３二重特異性抗体ＢｓＴＣＥはＣＡＲ－Ｔ細胞療法のように強力な効果を示すだけでなく、従来のモノクローナル抗体のように生産と商品化することができる。今のところ世界で承認されている二重特異性抗体薬のうち、最初に販売されたカツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）（２００９年に欧州ＥＭＡによって承認され、２０１３年に米国で廃止された）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（２０１４年に米ＦＤＡによって承認された）はいずれもＢｓＴＣＥである。ＣＤ３抗体はＢｓＴＣＥを構築するための重要な部分である。ＢｓＴＣＥ二重特異性抗体は２つの標的と同時に結合でき、一方の側は腫瘍細胞の表面の腫瘍関連抗原分子（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＡＡ）を認識することができ、他側はＴ細胞上のＣＤ３分子と結合できる。腫瘍細胞の存在下で、ＢｓＴＣＥ二重特異性抗体は腫瘍細胞の表面に結合した後、腫瘍細胞の近くのＴ細胞を動員してそれを活性化させて、腫瘍細胞を殺すことができる。ＢｓＴＣＥ二重特異性抗体の様々な構造を設計、構築する際は、ＣＤ３抗体の選択と最適化が特に重要である。第１に、ＣＤ３モノクローナル抗体の種特異性、特にサルの交差反応は非常に重要である。第２に、ＣＤ３抗体のＣＤ３複合体に対する親和性も重要なことで、親和性が高すぎるＣＤ３抗体は抗体を脾臓などの部位に制限して、腫瘍との接触を難しくする可能性がある。また、親和性が高すぎるとＴ細胞が必要以上に刺激されて高レベルのサイトカイン放出がもたらされる。第３に、ＣＤ３抗体結合価が大きな影響を与え、多価型のＣＤ３二重特異性抗体は腫瘍関連抗原と結合せずにＴ細胞を活性化して副作用を引き起こすことが判明しているため、開発中のＣＤ３二重特異性抗体の殆どは一価ＣＤ３である。
【0007】
ＣＤ３抗体だけでなく、ＢｓＴＣＥ二重特異性抗体の構造設計も重要な事項である。ＢｓＴＣＥ二重特異性抗体の構造は様々で、主にはＦｃを含むＩｇＧ様構造とＦｃを含まない抗体フラグメント構造の２つのカテゴリーに分けられる。例えば、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）は２つの単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）が直列に接続された単一のポリペプチド鎖構造であり、しかしこのような構造は半減期が非常に短く、継続的な静脈内注射が必要であるため、使用しにくい。そのため、ＢｓＴＣＥ二重特異性抗体の多くには分子の安定性と薬物動態特性を改善するためにＦｃを含む構造が採用される。しかし、ＢｓＴＣＥでは一般にＣＤ３結合ドメインを一価の形態と必要があるため、Ｆｃを含む構造は非対称となることが多い。このようなＦｃを含む非対称構造には克服すべき多くの技術的課題があり、例えば、非対称構造における重鎖のホモ二量体化の問題、軽鎖のミスマッチの問題、Ｆｃγ受容体が引き起こす分子架橋とＡＤＣＣ又はＣＤＣなどのエフェクター機能などである。抗ＴＡＡ ＩｇＧ抗体と抗ＣＤ３ ＩｇＧ抗体（図１６の（Ａ））からＢｓＴＣＥ二重特異性抗体を構築する場合は異なる非対称構造を選択することができ、その１つの構造は２つの独立したＦａｂドメインを保持したＩｇＧ様構造で、このような構造が４つの異なるポリペプチド鎖（２つの異なる重鎖と２つの異なる軽鎖で、図１６の（Ｂ）に示す構造）を含み、従来のモノクローナル抗体と分子量が近い。しかし、このような構造は複数の異なるポリペプチド鎖を含むため、様々な組み合わせの副生成物をもたらす可能性があり、これは抗体の発現精製と生産プロセスにとって大きな課題となる。ＣＤ３抗体のＦａｂをｓｃＦｖ構造に変えれば、「４本鎖」構造が「３本鎖」構造（図１６の（Ｃ）に示す構造）になり、副生成物の組み合わせの数が減るため、その生産の複雑さが下がる。本発明者はＢｓＴＣＥ二重特異性抗体を構築するために、ＳＰ３４マウス抗体ＩｇＧをｓｃＦｖに変えることを試みたが、しかしどのような（ＶＨ／ＶＬ）配置形態であろうと接続ペプチドの長さを変えようと、安定的なｓｃＦｖは得られず、そのため本分野では安定的な抗ＣＤ３モノクローナル抗体、特にその安定的なｓｃＦｖ構造が要望される。
【0008】
上記の内容から分かるように、本分野では霊長類ＣＤ３と結合でき、適切なＣＤ３結合能力を有し、しかも安定的な単鎖ｓｃＦｖ構造を有するＣＤ３抗体が要望される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
低抗原性で効果的かつ安全な抗ＣＤ３抗体と二重特異性抗体の非対称構造が欠如するという本分野の技術的課題を解決するために、本発明はＣＤ３を標的とする抗体、二重特異性抗体及びその使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上記の技術的課題を解決するための本発明の第１態様の技術的解決手段は次のとおりである。ＣＤ３を標的とする抗体を提供し、前記ＣＤ３を標的とする抗体は軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、前記ＶＬは配列番号５６に示すアミノ酸配列又はそのバリアントであり、前記ＶＨは配列番号４２に示すアミノ酸配列に変異が起こり、前記変異は３０位、７３位、７６位、７８位、９３位及び９４位のアミノ酸残基の１つ又は複数の部位から選ばれ（前記部位にはＣｈｏｔｈｉａ番号付け方式の位置番号を使用する）。前記変異とは初期のアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸残基が追加、削除又は置換されたものである。本発明のＣＤ３を標的とする抗体はＴ細胞との結合能力が変えられ、サイトカインの放出レベルが低減されるため、サイトカイン放出症候群によって引き起こされる毒性の低減が予想される。
【0011】
特定の好ましい実施例で、前記ＶＨに起こる変異は以下の組み合わせから選ばれる。
（ａ）３０位、
（ｂ）３０位、７３位及び７６位、
（ｃ）３０位、９３位及び９４位、
（ｄ）３０位、７３位及び９３位、
（ｅ）３０位、９３位、
（ｆ）３０位、７６位及び７８位、
（ｇ）７３位、７６位、９３位及び９４位、
（ｈ）７６位、７８位及び９３位、
（ｉ）３０位、７３位、７６位、９３位及び９４位、
（ｊ）３０位、７６位、７８位及び９３位。
（ａ）３０位、
（ｂ）３０位、７３位及び７６位、
（ｃ）３０位、９３位及び９４位、
（ｄ）３０位、７３位及び９３位、
（ｅ）３０位、９３位、
（ｆ）３０位、７６位及び７８位、
（ｇ）７３位、７６位、９３位及び９４位、
（ｈ）７６位、７８位及び９３位、
（ｉ）３０位、７３位、７６位、９３位及び９４位、
（ｊ）３０位、７６位、７８位及び９３位。
【0012】
特定の好ましい実施例で、前記ＶＨに起こる変異は以下の組み合わせから選ばれる。
（ａ）Ｎ３０Ｓ、
（ｂ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ及びＳ７６Ｎ、
（ｃ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｄ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ及びＶ９３Ａ、
（ｅ）Ｎ３０Ｓ及びＶ９３Ｔ、
（ｆ）Ｎ３０Ｓ、Ｓ７６Ｎ及びＬ７８Ａ、
（ｇ）Ｄ７３Ｎ、Ｓ７６Ｎ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｈ）Ｓ７６Ｎ、Ｌ７８Ａ及びＶ９３Ｔ、
（ｉ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ、Ｓ７６Ｎ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｊ）Ｎ３０Ｓ、Ｓ７６Ｎ、Ｌ７８Ａ及びＶ９３Ｔ。
（ａ）Ｎ３０Ｓ、
（ｂ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ及びＳ７６Ｎ、
（ｃ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｄ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ及びＶ９３Ａ、
（ｅ）Ｎ３０Ｓ及びＶ９３Ｔ、
（ｆ）Ｎ３０Ｓ、Ｓ７６Ｎ及びＬ７８Ａ、
（ｇ）Ｄ７３Ｎ、Ｓ７６Ｎ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｈ）Ｓ７６Ｎ、Ｌ７８Ａ及びＶ９３Ｔ、
（ｉ）Ｎ３０Ｓ、Ｄ７３Ｎ、Ｓ７６Ｎ、Ｖ９３Ａ及びＲ９４Ｋ、
（ｊ）Ｎ３０Ｓ、Ｓ７６Ｎ、Ｌ７８Ａ及びＶ９３Ｔ。
【0013】
抗体のＶＨに上述した変異がある本発明の抗体にはさらに、配列番号５６に示すアミノ酸配列のＶＬに、又は配列番号４２に示すアミノ酸配列のＶＨに変異が起こり、これによって変異後のアミノ酸配列は初期のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、また抗体の機能を保持又は改善させているアミノ酸配列も本発明の保護範囲に含まれる。
【0014】
特定の好ましい実施例で、前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３～５５のいずれかの配列に示すとおりであり、且つ／又は、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７～６０のいずれかの配列に示すとおりである。
【0015】
特定の好ましい実施例で、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５２に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５０に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４８に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４９に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５９に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５９に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４６に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりである。
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５２に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５０に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４８に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４９に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５９に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５９に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５１に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４６に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりである。
【0016】
特定の好ましい実施例で、前記抗体はＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ、又はＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬである単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）を含む。好ましくは、前記Ｌｉｎｋｅｒ（即ち、接続ペプチド）は（ＧＧＧＧＳ）ｎ［略記（Ｇ４Ｓ）ｎ］又はそのバリアントであり、ここでｎは０以外の自然数で、好ましくは１－２０であり、より好ましくは配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７に示すアミノ酸配列である。より好ましくは、前記ｓｃＦｖのアミノ酸配列は配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号７９又は配列番号８０に示すとおりである。さらに好ましくは、前記抗体は結晶化可能なフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）をさらに含み、前記Ｆｃはヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）によってｓｃＦｖに接続される。
【0017】
特定の好ましい実施例で、前記抗体は定常領域、好ましくはヒト定常領域をさらに含む。好ましくは、前記ヒト定常領域はヒト軽鎖定常領域とヒト重鎖定常領域とを含み、前記ヒト軽鎖定常領域は配列番号６１に示すヒトκ軽鎖定常領域又は配列番号６２に示すヒトλ軽鎖定常領域であることが好ましい。より好ましくは、前記ヒト重鎖定常領域はｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４又はそのバリアントであり、好ましくは配列番号６３又は配列番号６４に示す重鎖定常領域である。
【0018】
上記の技術的課題を解決するための本発明の第２態様の技術的解決手段は次のとおりである。二重特異性抗体を提供する。本発明の二重特異性抗体は３本鎖構造であり、副生成物の組み合わせの数が低減されるため、その生産の複雑さが下がる。一方でその開発は従来の抗体を少し改変させるだけのことではない。背景技術で述べられたように、本発明者はＢｓＴＣＥ二重特異性抗体を構築するために、ＳＰ３４マウス抗体ＩｇＧをｓｃＦｖに変えることを試みたが、しかしどのような（ＶＨ／ＶＬ）配置形態であろうと接続ペプチドの長さを変えようと、安定的なｓｃＦｖは得られない。本発明者が変異設計と検証を繰り返したところ、一部の変異のみがｓｃＦｖの構造を安定的に保持できることを発見した。本発明の二重特異性抗体は第１タンパク質ドメインと第２タンパク質ドメインとを含み、前記第１タンパク質ドメインは本発明の第１態様に記載のＣＤ３を標的とする抗体を含み、好ましくは、前記二重特異性抗体は（１）第１タンパク質ドメインのＶＬ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）又はＶＨ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）と、（２）第２タンパク質ドメインのＶＨ２－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｈｏｌｅ）と、（３）第２タンパク質ドメインのＶＬ２－ＣＬの３つの鎖を含み、前記第２タンパク質ドメインは別の標的を標的とする抗体で、好ましくはＢ７Ｈ４を標的とする抗体又はＲＯＲ１を標的とする抗体であり、前記Ｌｉｎｋｅｒは（Ｇ４Ｓ）ｎであることが好ましく、ここでｎは０以外の自然数で、好ましくは１－２０であり、より好ましくは配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７に示すアミノ酸配列であり、より好ましくは、前記二重特異性抗体は配列番号８８に示すＶＬ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）と、配列番号８６に示すＶＨ２－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｈｏｌｅ）と、配列番号８３に示すＶＬ２－ＣＬと、又は、配列番号８８に示すＶＬ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）と、配列番号８７に示すＶＨ２－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｈｏｌｅ）と、配列番号８５に示すＶＬ２－ＣＬとを含む。本発明の二重特異性抗体はＣＤ３を標的とする一本鎖抗体アームの不安定性の欠点を克服しており、安定的で且つＴ細胞結合能力を有する。３つの鎖だけを含む二重特異性抗体は製造しやすく、生産の難易度が下がる。
【0019】
上記の技術的課題を解決するための本発明の第３態様の技術的解決手段は次のとおりである。本発明の第１態様に記載のＣＤ３を標的とする抗体又は本発明の第２態様に記載の二重特異性抗体をコードする、分離された核酸を提供する。
【0020】
上記の技術的課題を解決するための本発明の第４態様の技術的解決手段は次のとおりである。本発明の第３態様に記載の分離された核酸を含む発現ベクターを提供し、好ましくは、前記発現ベクターはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターから選ばれる。
【0021】
上記の技術的課題を解決するための本発明の第５態様の技術的解決手段は次のとおりである。本発明の第４態様に記載の発現ベクターがトランスフェクトされた遺伝子修飾細胞を提供し、好ましくは、前記遺伝子修飾細胞は真核細胞である。
【0022】
上記の技術的課題を解決するための本発明の第６態様の技術的解決手段は次のとおりである。本発明の第１態様に記載のＣＤ３を標的とする抗体、本発明の第２態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第５態様に記載の遺伝子修飾細胞、及び薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供し、好ましくは、前記医薬組成物は免疫チェックポイント抗体をさらに含む。
【0023】
上記の技術的課題を解決するための本発明の第７態様の技術的解決手段は次のとおりである。腫瘍を治療する薬物を製造するための、本発明の第１態様に記載のＣＤ３を標的とする抗体、本発明の第２態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第３態様に記載の分離された核酸、本発明の第４態様に記載の発現ベクター、本発明の第５態様に記載の遺伝子修飾細胞、又は本発明の第６態様に記載の医薬組成物の使用を提供する。
【0024】
さらに、上記の技術的課題を解決するための本発明の第８態様の技術的解決手段は次のとおりである。キットＡとキットＢとを含むキットの組み合わせを提供し、前記キットＡは本発明の第１態様に記載のＣＤ３を標的とする抗体、第２態様に記載の二重特異性抗体、第５態様に記載の遺伝子修飾細胞、又は第６態様に記載の医薬組成物を含み、前記キットＢは他の抗体、二重特異性抗体、遺伝子修飾細胞、又は医薬組成物を含み、前記他の抗体、二重特異性抗体、遺伝子修飾細胞、又は医薬組成物はＣＤ３、Ｂ７Ｈ４、ＲＯＲ１、又は他の標的を標的とする。前記キットＡとキットＢの使用は順番が決まらず、まずキットＡ、次にキットＢを使用してもよいし、又はまずキットＢ、次にキットＡを使用してもよい。前記キットＡの薬物は注射可能な形態、例えば、注射剤として存在し、前記キットＢの薬物は注射可能な形態、例えば、注射剤として存在し、又は飲み込み可能な形態、例えば、錠剤又はピルとして存在する。
【0025】
本発明の第１態様に記載のＣＤ３を標的とする抗体、第２態様に記載の二重特異性抗体、第５態様に記載の遺伝子修飾細胞、第６態様に記載の医薬組成物、又は第８態様に記載のキットの組み合わせは腫瘍の治療のために、患者に投与することができる。
【0026】
本分野の常識に矛盾しない限り、前記各好ましい条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好ましい実施例を得ることができる。
【0027】
本発明で使用する試薬と原料はいずれも市販品であってもよい。
【0028】
本発明の有益な効果は次のとおりである。
１．本発明のモノクローナル抗体はＴ細胞との結合能力が変えられ、サイトカインの放出レベルが低減されるため、サイトカイン放出症候群によって引き起こされる毒性の低減が予想される。
２．それを用いて製造された二重特異性抗体はＣＤ３を標的とする一本鎖抗体アームの不安定性の欠点を克服しており、安定的で且つＴ細胞結合能力を有する。
３． ３つの鎖だけを含む二重特異性抗体は製造しやすく、生産の難易度が下がる。
１．本発明のモノクローナル抗体はＴ細胞との結合能力が変えられ、サイトカインの放出レベルが低減されるため、サイトカイン放出症候群によって引き起こされる毒性の低減が予想される。
２．それを用いて製造された二重特異性抗体はＣＤ３を標的とする一本鎖抗体アームの不安定性の欠点を克服しており、安定的で且つＴ細胞結合能力を有する。
３． ３つの鎖だけを含む二重特異性抗体は製造しやすく、生産の難易度が下がる。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図7-1】図７はＣＤ３抗体のヒトＴ細胞との結合能力であり、結合曲線及びＭＦＩ相対強度（特定の濃度の抗体がヒトＴ細胞と結合する蛍光強度ＭＦＩ、及び初期抗体ＰＲ０００２６０（ＳＰ３４）に対する比）又はＭＦＩ最大値を含み、（Ａ）はＰＲ０００５１１、ＰＲ０００５１２、ＰＲ０００５１３、ＰＲ０００５１４及びＰＲ０００２６０のヒトＴ細胞との結合、（Ｂ）はＰＲ００１８４８、ＰＲ００１８４９及びＰＲ０００２６０のヒトＴ細胞との結合、（Ｃ）はＰＲ００２４６７、ＰＲ００２４６８、ＰＲ００２４６９、ＰＲ００２４７０、ＰＲ００２４７１、ＰＲ００２４７２、ＰＲ００１８４８及びＰＲ０００２６０のヒトＴ細胞との結合、（Ｄ）はＰＲ００１８４８、ＰＲ００２７４２、ＰＲ００２７４３及びＰＲ０００２６０のヒトＴ細胞との結合、（Ｅ）はＰＲ００２８３３、ＰＲ００２８３４、ＰＲ００２８３５、ＰＲ００２８３６、ＰＲ００２８３７、ＰＲ００２７４２、ＰＲ００１８４８、ＰＲ００２４６９及びＰＲ０００２６０のヒトＴ細胞との結合、（Ｆ）はＰＲ００３８８６、ＰＲ００１８４８及びＰＲ００２７４２のヒトＴ細胞との結合、（Ｇ）はＰＲ００１８４８、ＰＲ００２４６９及びＰＲ００４６１６のヒトＴ細胞との結合である。
【図8】図８はＣＤ３一本鎖抗体のヒトＴ細胞との結合能力であり、結合曲線及びＭＦＩ相対強度（特定の濃度の抗体がヒトＴ細胞と結合する蛍光強度ＭＦＩ、及び初期抗体ＰＲ０００２６０（ＳＰ３４）に対する比）を含み、（Ａ）はＰＲ０００５１０、ＰＲ０００６２４、ＰＲ０００６２７及びＰＲ０００２６０のヒトＴ細胞との結合、（Ｂ）はＰＲ００１８５０及びＰＲ０００２６０のヒトＴ細胞との結合である。
【図10-1】図１０はＣＤ３抗体がヒトＴ細胞を活性化してサイトカインＩＦＮ－γを生成させる能力であり、（Ａ）はＰＲ０００５１１、ＰＲ０００５１２、ＰＲ０００５１３、ＰＲ０００５１４及びＰＲ０００２６０によるＴ細胞の活性化、（Ｂ）はＰＲ００１８４８、ＰＲ００１８４９及びＰＲ０００２６０によるＴ細胞の活性化、（Ｃ）はＰＲ００２４６８、ＰＲ００２４６９、ＰＲ００２４７１及びＰＲ００１８４８によるＴ細胞の活性化、（Ｄ）はＰＲ００２７４２、ＰＲ００１８４８及びＰＲ０００２６０によるＴ細胞の活性化、（Ｅ）はＰＲ００２８３３、ＰＲ００２８３４、ＰＲ００２８３５、ＰＲ００２８３６、ＰＲ００２８３７及びＰＲ０００２６０によるＴ細胞の活性化、（Ｆ）はＰＲ００３８８６、ＰＲ００１８４８及びＰＲ００２７４２によるＴ細胞の活性化、（Ｇ）はＰＲ００１８４８、ＰＲ００２４６９及びＰＲ００４６１６によるＴ細胞の活性化である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
以下、実施例によって本発明を一層説明し、本発明はこれらの実施例の範囲に限定されない。下記の実施例で条件を詳しく記載していない実験方法は、通常の方法と条件で行われ、又は商品の取扱説明書に基づいて選択する。
【0031】
本願では、用語「抗体」は一般に抗原と結合する部分を含むタンパク質、及び任意選択で抗原と結合する部分に抗体と抗原の結合を促進するコンフォメーションを採用してもよい足場又は骨格部分を指す。典型的には抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）又はその両方を含んでもよい。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、それらはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に分けられてもよい。ＶＨ及びＶＬのそれぞれは、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲ領域から構成されてもよい。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の例は、抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ及び／又はｄＡｂ）、免疫複合体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体アナログ又は融合タンパク質などを含み、ただしそれらに限定されず、所望の抗原結合活性を示すものであればよい。
【0032】
本願では、用語「可変」とは一般に、抗体の可変ドメインの配列の特定の部分が大きく変化し、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合と特異性に寄与することを指す。しかし、可変性は抗体の可変領域全体に均等に分布するのではない。それは軽鎖及び重鎖可変領域の、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインで高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、殆どは３つのＣＤＲによって接続されてループを形成させるβシート構造であるが、場合によってはβシート構造の一部として形成される。各鎖でＣＤＲはＦＲ領域によって緊密に結合され、しかも別の鎖からのＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位を形成し、定常領域は抗体と抗原の結合に直接的に関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害に関与するなど、様々なエフェクター機能を示す。本分野では、例えば、配列可変性に基づくＫａｂａｔ定義方式（Ｋａｂａｔ，ｅｔ．ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ（１９９１）参照）、構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａ定義方式（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ，ｅｔ．ａｌ，ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－４８，１９９７参照）など様々な方式で抗体のＣＤＲを定義することができる。本願では、さらに、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義を組み合わせた（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ）定義方式を採用して可変ドメイン配列及び全長抗体配列のアミノ酸残基を決定している（表１）。
【表1】
【0033】
ここで、Ｌａａ－Ｌｂｂとは抗体軽鎖のＮ末端からのａａ位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）からｂｂ位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）までのアミノ酸配列を指してもよく、Ｈａａ－Ｈｂｂとは抗体重鎖のＮ末端からのａａ位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）からｂｂ位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）までのアミノ酸配列を指してもよい。例えば、Ｌ２４－Ｌ３４とは抗体軽鎖Ｎ末端から、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式による２４位から３４位までのアミノ酸配列を指してもよく、Ｈ２６－Ｈ３２とは抗体重鎖Ｎ末端から、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式による２６位から３２位までのアミノ酸配列を指してもよい。
【0034】
ＡＤＣＣやＣＤＣなどの抗体のＦｃドメインによって媒介されるエフェクター機能も、非常に重要な生物学的機能を有し、ＩｇＧサブタイプによってＡＤＣＣ又はＣＤＣ機能が異なり、例えば、ＩｇＧ１とＩｇＧ３はＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果が強く、ＩｇＧ２とＩｇＧ４は効果が弱い。また、アミノ酸の変異又は修飾でＦｃのＦｃ受容体との結合能力を変えることでＦｃの本来のエフェクター機能を調節することができる。例えば、ＩｇＧ１の「ＬＡＬＡ」二重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）はＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）との親和性を明らかに低下させて、ＡＤＣＣ効果を低減させることができる。また、Ｐ３２９Ｇ変異は様々なＦｃγ受容体との結合を明らかに低下させることができる（Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ Ｔ，Ｈｅｒｔｅｒ Ｓ，Ｋｏｌｌｅｒ ＣＦ，ｅｔ．ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１６ Ｏｃｔ；２９（１０）：４５７－４６６参照）。本願では、ＣＤ３抗体のＦｃγ受容体との結合を低下させるために、これらのＣＤ３抗体のＦｃには「ＬＡＬＡ」二重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）又は「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）が導入されている。
【0035】
実施例１：組換え抗体の製造と特性評価分析
１．１ ＩｇＧ組換え抗体の製造
抗体分子の軽鎖、重鎖可変ドメインをコードする配列を得た後、通常の組換えＤＮＡ技術を採用して、軽鎖、重鎖可変ドメイン配列と対応するヒト抗体の軽鎖、重鎖定常ドメイン配列の融合発現を行って、組換え抗体分子を得ることができる。本実施例では、抗体重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）を遺伝的に合成しヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常ドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングすることによってＩｇＧ１抗体を生成する全長重鎖をコードし、且つ当該ＩｇＧ１重鎖定常領域に「ＬＡＬＡ」二重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）（配列番号６３）又は「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）（配列番号６４）を導入して抗体とＦｃγ受容体の結合を低下させる。抗体軽鎖可変ドメイン配列（ＶＬ）を遺伝的に合成しヒト抗体κ軽鎖定常ドメイン配列（配列番号６１）をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングすることによって抗体を生成する全長κ軽鎖をコードし、又は、ＶＬを遺伝的に合成しヒト抗体λ軽鎖定常ドメイン配列（配列番号６２）をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングすることによって抗体を生成する全長λ軽鎖をコードする。
１．１ ＩｇＧ組換え抗体の製造
抗体分子の軽鎖、重鎖可変ドメインをコードする配列を得た後、通常の組換えＤＮＡ技術を採用して、軽鎖、重鎖可変ドメイン配列と対応するヒト抗体の軽鎖、重鎖定常ドメイン配列の融合発現を行って、組換え抗体分子を得ることができる。本実施例では、抗体重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）を遺伝的に合成しヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常ドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングすることによってＩｇＧ１抗体を生成する全長重鎖をコードし、且つ当該ＩｇＧ１重鎖定常領域に「ＬＡＬＡ」二重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）（配列番号６３）又は「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）（配列番号６４）を導入して抗体とＦｃγ受容体の結合を低下させる。抗体軽鎖可変ドメイン配列（ＶＬ）を遺伝的に合成しヒト抗体κ軽鎖定常ドメイン配列（配列番号６１）をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングすることによって抗体を生成する全長κ軽鎖をコードし、又は、ＶＬを遺伝的に合成しヒト抗体λ軽鎖定常ドメイン配列（配列番号６２）をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングすることによって抗体を生成する全長λ軽鎖をコードする。
【0036】
抗体重鎖をコードするプラスミドと抗体軽鎖をコードするプラスミドの両方で哺乳動物宿主細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３）をトランスフェクトし、通常の組換えタンパク質の発現と精製技術を利用して、軽鎖と重鎖が正しくペアリングして組み立てられた精製組換え抗体を得ることができる。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｔｈｅｒｍｏ＃Ａ１３８３５０４）において拡大培養した。一過性トランスフェクションを始める前に、細胞濃度を６～８×１０５細胞／ｍＬに調整し、３７℃と８％ＣＯ２でシェーカーにおいて２４時間培養し、細胞濃度は１．２×１０６細胞／ｍＬであった。培養細胞を３０ｍＬ用意した。前記抗体重鎖をコードするプラスミドと抗体軽鎖をコードするプラスミドを比率２：３で混合し合計で３０μｇのプラスミドを１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ＃３１９８５０８８）に溶解し、０．２２μｍメンブレンフィルターで濾過して除菌した。さらに１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを１ｍｇ／ｍＬ ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ＃２３９６６－２）１２０μＬに溶解し、５分間静置した。ＰＥＩをゆっくりとプラスミドに加えて、室温下で１０分間インキュベートし、培養フラスコを振りながらゆっくりとプラスミドとＰＥＩの混合溶液を滴加し、３７℃と８％ＣＯ２でシェーカーにおいて５日間培養した。５日後に細胞生存率を計測した。培養物を回収し、３３００ｇで１０分間遠心分離した後に上清を得、次に、高速遠心分離で上清から不純物を除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＃７１－５０２０－９１ ＡＥ）を含む重力流カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃７３１１５５０）を平衡化し、カラム２～５個分の体積で洗い流した。上清サンプルをカラムに通し、カラム５～１０個分の体積のＰＢＳでカラムを洗い流し、さらにｐＨ３．５の０．１Ｍグリシンで目的タンパク質を溶出し、その後、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌで中性に調整し、最後に限外濾過遠心管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＵＦＣ９０１０２４）で濃縮してＰＢＳバッファーに交換して、精製組換え抗体溶液を得た。最後にＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｏｎｅ）で濃度を測定し、分注して、保管しておく。
【0037】
１．２ 一価ｓｃＦｖ－ｈｉｓ組換え抗体の製造
抗体のＶＨ配列とＶＬ配列をフレキシブルなペプチドセグメント（Ｌｉｎｋｅｒ）によって接続させてＶＨとＶＬの両方をコードする単一のポリペプチド鎖、即ち単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を得た。適切な長さの接続ペプチド、例えば（Ｇ４Ｓ）３（配列番号６５）又は（Ｇ４Ｓ）４（配列番号６６）を選択すれば、ＶＨとＶＬが正しく折り畳まれて機能的な抗体に組み立てられる。ＶＨ、ＶＬの配置と接続ペプチドによって、異なるｓｃＦｖ構造（ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ、又はＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ）を構築することができる。単一のｓｃＦｖはＶＨとＶＬのペアからなる抗原結合領域を含み、一般に１つの抗原分子としか結合できなため、一価結合分子と呼ばれる。
抗体のＶＨ配列とＶＬ配列をフレキシブルなペプチドセグメント（Ｌｉｎｋｅｒ）によって接続させてＶＨとＶＬの両方をコードする単一のポリペプチド鎖、即ち単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を得た。適切な長さの接続ペプチド、例えば（Ｇ４Ｓ）３（配列番号６５）又は（Ｇ４Ｓ）４（配列番号６６）を選択すれば、ＶＨとＶＬが正しく折り畳まれて機能的な抗体に組み立てられる。ＶＨ、ＶＬの配置と接続ペプチドによって、異なるｓｃＦｖ構造（ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ、又はＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ）を構築することができる。単一のｓｃＦｖはＶＨとＶＬのペアからなる抗原結合領域を含み、一般に１つの抗原分子としか結合できなため、一価結合分子と呼ばれる。
【0038】
本実施例では、精製しやすいように、ｓｃＦｖのＣ末端には６つのヒスチジンからなるＨｉｓタグが融合されている。ｓｃＦｖとＨｉｓタグをコードするポリペプチド配列を遺伝的に合成し哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングすることによってｓｃＦｖ－ｈｉｓをコードするプラスミドを得て哺乳動物宿主細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３）をトランスフェクトし、通常の組換えタンパク質の発現と精製技術を利用して、精製組換えタンパク質を得ることができる。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｔｈｅｒｍｏ＃Ａ１３８３５０４）において拡大培養した。一過性トランスフェクションを始める前に、細胞濃度を６～８×１０５細胞／ｍＬに調整し、３７℃と８％ＣＯ２でシェーカーにおいて２４時間培養し、細胞濃度は１．２×１０６細胞／ｍＬであった。培養細胞を３０ｍＬ用意した。前記プラスミド３０μｇを１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ＃３１９８５０８８）に溶解し、０．２２μｍメンブレンフィルターで濾過して除菌した。さらに１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを１ｍｇ／ｍＬ ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ＃２３９６６－２）１２０μＬに溶解し、５分間静置した。ＰＥＩをゆっくりとプラスミドに加えて、室温下で１０分間インキュベートし、培養フラスコを振りながらゆっくりとプラスミドとＰＥＩの混合溶液を滴加し、３７℃と８％ＣＯ２でシェーカーにおいて５日間培養した。５日後に細胞生存率を計測した。培養物を回収し、３３００ｇで１０分間遠心分離した後に上清を得、次に、高速遠心分離で上清から不純物を除去した。ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を用いて、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｅｘｃｅｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＃１７－３７１２－０１）を含む重力流カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃７３１１５５０）を平衡化し、カラム２～５個分の体積で洗い流した。上清サンプルをカラムに通し、カラム５～１０個分の体積のＰＢＳでカラムを洗い流し、まずバッファーＡ（２０ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭリン酸塩を含有、ｐＨ８．０）で非特異的に吸着した不純物タンパク質を溶出し、次にバッファーＢ（５００ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭリン酸塩を含有、ｐＨ８．０）で目的タンパク質を溶出し、最後に限外濾過遠心管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＵＦＣ９０１０２４）で濃縮してＰＢＳバッファーに交換して、精製組換え抗体溶液を得た。最後にＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｏｎｅ）で濃度を測定し、分注して、保管しておく。
【0039】
１．３ 二価ｓｃＦｖ－Ｆｃ組換え抗体の製造
本実施例では、ｓｃＦｖのＣ末端にヒトＩｇＧ１定常領域Ｆｃ配列（Ｇｌｕ２１６－Ｌｙｓ４４７、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含有）を融合させてｓｃＦｖ－Ｆｃ組換え分子を構築し、Ｆｃのホモ二量体化を利用して、２つの抗原分子と同時に結合できる二価ｓｃＦｖ－Ｆｃダイマー分子を得た。且つＦｃに「ＬＡＬＡ」二重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）又は「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）を導入して抗体とＦｃγ受容体の結合を低下させる。ｓｃＦｖ－Ｆｃをコードするポリペプチド配列を遺伝的に合成し哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングすることによってｓｃＦｖ－Ｆｃをコードするプラスミドを得て哺乳動物宿主細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３）をトランスフェクトし、次に、実施例１．１に記載のタンパク質発現精製方法を利用して精製組換えタンパク質を得た。
本実施例では、ｓｃＦｖのＣ末端にヒトＩｇＧ１定常領域Ｆｃ配列（Ｇｌｕ２１６－Ｌｙｓ４４７、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含有）を融合させてｓｃＦｖ－Ｆｃ組換え分子を構築し、Ｆｃのホモ二量体化を利用して、２つの抗原分子と同時に結合できる二価ｓｃＦｖ－Ｆｃダイマー分子を得た。且つＦｃに「ＬＡＬＡ」二重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）又は「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）を導入して抗体とＦｃγ受容体の結合を低下させる。ｓｃＦｖ－Ｆｃをコードするポリペプチド配列を遺伝的に合成し哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングすることによってｓｃＦｖ－Ｆｃをコードするプラスミドを得て哺乳動物宿主細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３）をトランスフェクトし、次に、実施例１．１に記載のタンパク質発現精製方法を利用して精製組換えタンパク質を得た。
【0040】
１．４ ＨＰＬＣ－ＳＥＣによるタンパク質純度分析
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を利用してタンパク質サンプルの純度と多量体の形態を分析した。分析カラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃０８５４１、５μｍ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）に接続させて、ＰＢＳバッファーを用いて室温下で少なくとも１時間平衡化した。０．２２μｍメンブレンフィルターで適量のタンパク質サンプル（少なくとも１０μｇ）を濾過して系に注入し、ＨＰＬＣプログラムを次のとおりに設定した。ＰＢＳバッファーを使用してサンプルを１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速でカラムに通し、最大時間は２０分間であった。ＨＰＬＣでは、サンプル内の異なる分子サイズの成分の保持時間を報告する分析レポートを生成した。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を利用してタンパク質サンプルの純度と多量体の形態を分析した。分析カラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃０８５４１、５μｍ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）に接続させて、ＰＢＳバッファーを用いて室温下で少なくとも１時間平衡化した。０．２２μｍメンブレンフィルターで適量のタンパク質サンプル（少なくとも１０μｇ）を濾過して系に注入し、ＨＰＬＣプログラムを次のとおりに設定した。ＰＢＳバッファーを使用してサンプルを１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速でカラムに通し、最大時間は２０分間であった。ＨＰＬＣでは、サンプル内の異なる分子サイズの成分の保持時間を報告する分析レポートを生成した。
【0041】
実施例２：ＣＤ３抗体ＳＰ３４のマウス－ヒトキメラ抗体の組換え発現
ＳＰ３４は様々な霊長類ＣＤ３と結合でき、Ｔ細胞を活性化させる機能を持つマウス由来の抗ヒトＣＤ３ｅ抗体である。ＳＰ３４の可変領域配列ＶＨ及びＶＬはＷＯ２０１６０７１００４Ａ１に開示されている。本願では、ＳＰ３４のＶＨのアミノ酸配列は配列番号４２で、その対応するマウス生殖細胞系列Ｖ遺伝子はＩＧＨＶ１０－１であり、ＳＰ３４のＶＬのアミノ酸配列は配列番号５６で、その対応するマウス生殖細胞系列Ｖ遺伝子はＩＧＬＶ１である。本実施例では、ＳＰ３４のＶＨ配列と「ＬＡＬＡ」二重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を含むヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常ドメイン配列（配列番号６３）を融合させてＳＰ３４マウス－ヒトキメラＩｇＧ１抗体の全長重鎖を生成し、ＳＰ３４のＶＬのアミノ酸配列とヒト抗体λ軽鎖定常ドメイン配列（配列番号６２）を融合させてＳＰ３４マウス－ヒトキメラ抗体の全長λ軽鎖を生成させた。
ＳＰ３４は様々な霊長類ＣＤ３と結合でき、Ｔ細胞を活性化させる機能を持つマウス由来の抗ヒトＣＤ３ｅ抗体である。ＳＰ３４の可変領域配列ＶＨ及びＶＬはＷＯ２０１６０７１００４Ａ１に開示されている。本願では、ＳＰ３４のＶＨのアミノ酸配列は配列番号４２で、その対応するマウス生殖細胞系列Ｖ遺伝子はＩＧＨＶ１０－１であり、ＳＰ３４のＶＬのアミノ酸配列は配列番号５６で、その対応するマウス生殖細胞系列Ｖ遺伝子はＩＧＬＶ１である。本実施例では、ＳＰ３４のＶＨ配列と「ＬＡＬＡ」二重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を含むヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常ドメイン配列（配列番号６３）を融合させてＳＰ３４マウス－ヒトキメラＩｇＧ１抗体の全長重鎖を生成し、ＳＰ３４のＶＬのアミノ酸配列とヒト抗体λ軽鎖定常ドメイン配列（配列番号６２）を融合させてＳＰ３４マウス－ヒトキメラ抗体の全長λ軽鎖を生成させた。
【0042】
実施例１．１の方法でＳＰ３４マウス－ヒトキメラ組換え抗体ＰＲ０００２６０を製造した。表２はＰＲ０００２６０の組換え発現データである。
【表2】
【0043】
実施例３：ＣＤ３抗体であるＳＰ３４マウス抗体の組換えｓｃＦｖ抗体への変換
ＳＰ３４のＶＨ配列（配列番号４２）とＶＬ配列（配列番号５６）をフレキシブルなペプチドセグメント（Ｌｉｎｋｅｒ）によって接続させてＶＨとＶＬの両方をコードする単一のポリペプチド鎖、即ち単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を得た。ＶＨ、ＶＬの配置と異なる長さの接続ペプチド（配列番号６５、配列番号６６）によって、異なるｓｃＦｖ構造を構築することができ、しかもｓｃＦｖのＣ末端には精製しやすいように６つのヒスチジンからなるＨｉｓタグが融合されている。配列番号６７に示す接続ペプチドも本願のｓｃＦｖの構築に使用することがきる。
ＳＰ３４のＶＨ配列（配列番号４２）とＶＬ配列（配列番号５６）をフレキシブルなペプチドセグメント（Ｌｉｎｋｅｒ）によって接続させてＶＨとＶＬの両方をコードする単一のポリペプチド鎖、即ち単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を得た。ＶＨ、ＶＬの配置と異なる長さの接続ペプチド（配列番号６５、配列番号６６）によって、異なるｓｃＦｖ構造を構築することができ、しかもｓｃＦｖのＣ末端には精製しやすいように６つのヒスチジンからなるＨｉｓタグが融合されている。配列番号６７に示す接続ペプチドも本願のｓｃＦｖの構築に使用することがきる。
【0044】
本実施例では実施例１．２の方法に基づいて４つの組換えｓｃＦｖ抗体分子（ＰＲ０００２７５、ＰＲ０００２７６、ＰＲ０００３０７、ＰＲ０００３０８）を製造した。表３には当該４つの組換えｓｃＦｖ抗体分子の配列番号が示され、表４は当該４つの分子の組換え発現データである。図１は当該４つの分子のワンステップ精製後のＨＰＬＣ－ＳＥＣ結果であり、（Ａ）はＰＲ０００２７５、（Ｂ）はＰＲ０００２７６、（Ｃ）はＰＲ０００３０７、（Ｄ）はＰＲ０００３０８である。図示したように、ＳＰ３４のＶＨとＶＬ配列を利用してｓｃＦｖを構築する場合、どのような（ＶＨ／ＶＬ）配置形態であろうと接続ペプチドの長さを変えようと、安定的なｓｃＦｖは得られない。
【表3】
【表4】
【0045】
実施例４：ＳＰ３４の配列最適化
４．１ 可変領域配列のヒト化とフレームワーク領域変異
本実施例では「ＣＤＲグラフト化」の方法で配列のヒト化を行う。マウス抗体のＶＨのＣＤＲをヒト抗体ＶＨのフレームワーク領域にグラフトし、マウス抗体のＶＬのＣＤＲをヒト抗体ＶＬのフレームワーク領域にグラフトする。ヒト抗体ＶＨ又はＶＬのフレームワーク領域の配列はヒト生殖細胞系列遺伝子配列又はＶ（Ｄ）Ｊの再配列後の抗体配列又はヒト抗体の特定のＶＨもしくはＶＬ遺伝子ファミリーのコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列に由来するものであってもよい。本実施例ではヒト生殖細胞系列遺伝子配列から提供されるフレームワーク領域配列をヒト化テンプレート配列として使用し、即ち、ヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントはフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３の配列を提供し、ヒト生殖細胞系列Ｊ遺伝子フラグメントはフレームワーク領域ＦＲ４の配列を提供する。最終的には（ヒト）ＦＲ１－（マウス）ＣＤＲ１－（ヒト）ＦＲ２－（マウス）ＣＤＲ２－（ヒト）ＦＲ３－（マウス）ＣＤＲ３－（ヒト）ＦＲ４の配置形態でヒト化可変領域（ＶＨ又はＶＬ）配列を構築する。
４．１ 可変領域配列のヒト化とフレームワーク領域変異
本実施例では「ＣＤＲグラフト化」の方法で配列のヒト化を行う。マウス抗体のＶＨのＣＤＲをヒト抗体ＶＨのフレームワーク領域にグラフトし、マウス抗体のＶＬのＣＤＲをヒト抗体ＶＬのフレームワーク領域にグラフトする。ヒト抗体ＶＨ又はＶＬのフレームワーク領域の配列はヒト生殖細胞系列遺伝子配列又はＶ（Ｄ）Ｊの再配列後の抗体配列又はヒト抗体の特定のＶＨもしくはＶＬ遺伝子ファミリーのコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列に由来するものであってもよい。本実施例ではヒト生殖細胞系列遺伝子配列から提供されるフレームワーク領域配列をヒト化テンプレート配列として使用し、即ち、ヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントはフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３の配列を提供し、ヒト生殖細胞系列Ｊ遺伝子フラグメントはフレームワーク領域ＦＲ４の配列を提供する。最終的には（ヒト）ＦＲ１－（マウス）ＣＤＲ１－（ヒト）ＦＲ２－（マウス）ＣＤＲ２－（ヒト）ＦＲ３－（マウス）ＣＤＲ３－（ヒト）ＦＲ４の配置形態でヒト化可変領域（ＶＨ又はＶＬ）配列を構築する。
【0046】
本実施例ではヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントＩＧＨＶ３－７３＊０１又はヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントＩＧＨＶ３－２３＊０１がヒト生殖細胞系列Ｊ遺伝子フラグメントＩＧＨＪ１＊０１に結合した配列をヒト化テンプレートとしてフレームワーク領域配列を提供する。且つ３０位、７３位、７６位、７８位、９３位又は９４位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）に１つ又は複数の部位のアミノ酸変異を導入して、複数の異なるＶＨバリアント配列を得た。
【0047】
本実施例ではヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントＩＧＬＶ７－４６＊０２がヒト生殖細胞系列Ｊ遺伝子フラグメントＩＧＬＪ２＊０１に結合した配列又はヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントＩＧＫＶ１－３９＊０１がヒト生殖細胞系列Ｊ遺伝子フラグメントＩＧＫＪ４＊０１に結合した配列をヒト化テンプレートとしてフレームワーク領域配列を提供する。且つ２位、３６位、４６位、４９位、６６位、６９位、７１位又は８７位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）にゼロ又は複数の部位のアミノ酸変異を導入して、複数の異なるＶＬバリアント配列を得た。
【0048】
表５には抗体可変領域及び最適化バリアント配列（ＦＶ）のＣｈｏｔｈｉａ定義のＣＤＲ、ＦＲ領域配列の配列番号が示される。
【表5】
【0049】
図２にはＶＨバリアント配列の比較が示される。図３にはＶＬバリアント配列の比較が示される。図４の（Ａ）と（Ｂ）にはそれぞれＶＨバリアント配列とＶＬバリアント配列の重要な部位の違いが示される。図２－図４から分かるように、本発明に係る抗体のＶＨに起こる変異は配列番号４２に示すアミノ酸配列の３０位、７３位、７６位、７８位、９３位及び９４位の１つ又は複数の部位にアミノ酸残基の変異が起こったものである。前記ＶＬに起こる変異は配列番号５６に示す配列の２位、３６位、４６位、４９位、６６位、６９位、７１位及び／又は８７位のアミノ酸残基の変異である。変異についてのより詳細な情報は表５のＶＨ３７３０、ＶＨ３７３１、ＶＨ３７３２、ＶＨ３７３３、ＶＨ３７３４、ＶＨ３７３５、ＶＨ３２３０、ＶＨ３２３１、ＶＨ３２３２、ＶＨ３２３３、ＶＨ３２３４、ＶＨ３２３５、ＶＨ３２３６、ＶＬ７４６０、ＶＬ７４６１、ＶＫ１３９２及びＶＫ１３９３配列の詳細を参照する。
【0050】
４．２ 配列最適化バリアントによる組換え抗体分子
実施例４．１で得たＶＨバリアント配列とＶＬバリアント配列をペアリングして組み合わせて、実施例１．１の方法に従ってＩｇＧ組換え抗体を構築し、且つＩｇＧ１重鎖定常領域に「ＬＡＬＡ」二重変異体又は「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体を導入してＦｃエフェクター機能を低下させる。表６には配列最適化を経た組換え抗体分子の配列表が示される。表７には組換え抗体の発現データが示される。ＶＨバリアントＶＨ３２３０で構築した３つのＩｇＧ分子の発現産量が非常に低いが、他のＩｇＧ分子はいずれも発現産量が合理的であった。
実施例４．１で得たＶＨバリアント配列とＶＬバリアント配列をペアリングして組み合わせて、実施例１．１の方法に従ってＩｇＧ組換え抗体を構築し、且つＩｇＧ１重鎖定常領域に「ＬＡＬＡ」二重変異体又は「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体を導入してＦｃエフェクター機能を低下させる。表６には配列最適化を経た組換え抗体分子の配列表が示される。表７には組換え抗体の発現データが示される。ＶＨバリアントＶＨ３２３０で構築した３つのＩｇＧ分子の発現産量が非常に低いが、他のＩｇＧ分子はいずれも発現産量が合理的であった。
【表6】
【表7】
【0051】
４．３ 配列最適化バリアントによる組換えｓｃＦｖ分子
実施例４．１で得たＶＨバリアント配列とＶＬバリアント配列をペアリングして組み合わせて、実施例１．３の方法に従って複数の組換え二価ｓｃＦｖ抗体分子を製造した。表８、表９にはそれぞれｓｃＦｖの配列情報とタンパク質発現状況がが示される。表９から分かるように、特にＰＲ０００５１０及びＰＲ０００６２７の方は発現状況が良好で安定的な分子を得る。図５にはＰＲ０００５１０の（Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、（Ｂ）ＨＰＬＣ－ＳＥＣ結果が示され、モノマー純度が良好で、明確な多量体はないことが分かった。
実施例４．１で得たＶＨバリアント配列とＶＬバリアント配列をペアリングして組み合わせて、実施例１．３の方法に従って複数の組換え二価ｓｃＦｖ抗体分子を製造した。表８、表９にはそれぞれｓｃＦｖの配列情報とタンパク質発現状況がが示される。表９から分かるように、特にＰＲ０００５１０及びＰＲ０００６２７の方は発現状況が良好で安定的な分子を得る。図５にはＰＲ０００５１０の（Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、（Ｂ）ＨＰＬＣ－ＳＥＣ結果が示され、モノマー純度が良好で、明確な多量体はないことが分かった。
【表8】
【表9】
【0052】
実施例５：ＣＤ３を発現する細胞に対するＣＤ３抗体の結合能力のＦＡＣＳによる測定
フローサイトメトリー－ＦＡＣＳを利用して、ＣＤ３を発現する細胞に対するＣＤ３抗体の結合状況を分析し、ＣＤ３を発現する細胞としては、ヒトＣＤ３を過剰発現するＣＨＯＫ１細胞又はＨＥＫ２９３細胞（ヒトＴＣＲ／ＣＤ３複合体構造を発現する安定細胞株を構築するために、ヒトＣＤ３のγ、δ、ε、ζ鎖ＯＲＦをコードするプラスミドとヒトＴＣＲのα、β鎖ＯＲＦをコードするプラスミドの両方で宿主細胞ＣＨＯＫ１（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）又はＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５７３）をトランスフェクトしたもの）、カニクイザルＣＤ３を過剰発現するＣＨＯＫ１又はＨＥＫ２９３細胞、ヒトｐａｎ－Ｔ細胞（ヒトｐａｎ－Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０－０９６－５３５）を用いてＰＢＭＣから分離したもの）、カニクイザルｐａｎ－Ｔ細胞であってもよい。具体的には、回収した細胞を２％ＦＢＳを含むＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）で２回洗浄して、ＦＡＣＳバッファーを加えて再懸濁させ、各ウェル１×１０５細胞で９６ウェルプレートに分注し、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、予め勾配希釈したＣＤ３抗体１００μＬを加え、室温下で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄して、ＦＡＣＳバッファーで希釈した二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－５４５－０９８）を加えて細胞を再懸濁させ、室温下、暗所で３０分間インキュベートして、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、さらにＦＡＣＳバッファー２００μＬで再懸濁させた。フローサイトメータ（ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩ又はＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を使用して蛍光発光シグナル値を読み取り、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）でデータを処理及び分析した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を用いてデータ処理とグラフ作成分析を行って、４パラメーターの非線形フィッティングによって、結合曲線、ＥＣ５０などのパラメーターを得た。
フローサイトメトリー－ＦＡＣＳを利用して、ＣＤ３を発現する細胞に対するＣＤ３抗体の結合状況を分析し、ＣＤ３を発現する細胞としては、ヒトＣＤ３を過剰発現するＣＨＯＫ１細胞又はＨＥＫ２９３細胞（ヒトＴＣＲ／ＣＤ３複合体構造を発現する安定細胞株を構築するために、ヒトＣＤ３のγ、δ、ε、ζ鎖ＯＲＦをコードするプラスミドとヒトＴＣＲのα、β鎖ＯＲＦをコードするプラスミドの両方で宿主細胞ＣＨＯＫ１（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）又はＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５７３）をトランスフェクトしたもの）、カニクイザルＣＤ３を過剰発現するＣＨＯＫ１又はＨＥＫ２９３細胞、ヒトｐａｎ－Ｔ細胞（ヒトｐａｎ－Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０－０９６－５３５）を用いてＰＢＭＣから分離したもの）、カニクイザルｐａｎ－Ｔ細胞であってもよい。具体的には、回収した細胞を２％ＦＢＳを含むＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）で２回洗浄して、ＦＡＣＳバッファーを加えて再懸濁させ、各ウェル１×１０５細胞で９６ウェルプレートに分注し、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、予め勾配希釈したＣＤ３抗体１００μＬを加え、室温下で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄して、ＦＡＣＳバッファーで希釈した二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－５４５－０９８）を加えて細胞を再懸濁させ、室温下、暗所で３０分間インキュベートして、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、さらにＦＡＣＳバッファー２００μＬで再懸濁させた。フローサイトメータ（ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩ又はＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を使用して蛍光発光シグナル値を読み取り、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）でデータを処理及び分析した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を用いてデータ処理とグラフ作成分析を行って、４パラメーターの非線形フィッティングによって、結合曲線、ＥＣ５０などのパラメーターを得た。
【0053】
図６は実施例２で得たＣＤ３抗体の、ヒトＣＤ３を過剰発現する組換えＣＨＯＫ１細胞（図６（Ａ））及びカニクイザルＣＤ３を過剰発現する組換えＣＨＯＫ１細胞との結合能力（図６（Ｂ））を示す。結果ではＳＰ３４キメラ抗体ＰＲ０００２６０がヒトＣＤ３、カニクイザルＣＤ３のいずれにも高い結合能力を有することが示されている。
【0054】
図７の（Ａ）－（Ｇ）にはそれぞれ実施例４．２で得たＣＤ３抗体（ＰＲ０００２６０とそのバリアントを含む）のヒトｐａｎ－Ｔ細胞との結合能力が示され、また抗体濃度が７．４又は１０μｇ／ｍＬである時にＣＤ３抗体がヒトｐａｎ－Ｔ細胞と結合する蛍光強度ＭＦＩ及び初期抗体ＰＲ０００２６０に対する比が算出されている。具体的には、ＳＰ３４ ＩｇＧ抗体配列を最適化した後、ＰＲ０００５１２、ＰＲ０００５１３、ＰＲ００１８４９、ＰＲ００２８３７はＰＲ０００２６０（即ちＳＰ３４キメラ抗体）と同等な結合能力を有し、ＰＲ０００５１４はＰＲ０００２６０より結合能力がわずかに高く、ＰＲ０００５１１、ＰＲ００１８４８、ＰＲ００２４６９、ＰＲ００２４７２、ＰＲ００２７４２、ＰＲ００２８３３、ＰＲ００２８３４、ＰＲ００２８３５、ＰＲ００２８３６、ＰＲ００３８８６及びＰＲ００４６１６はＴ細胞結合能力が低く、ＰＲ００２４６７、ＰＲ００２４６８、ＰＲ００２４７０、ＰＲ００２４７１、ＰＲ００２７４３はほぼＴ細胞と結合しなかった（現行の抗体濃度では信号が検出されなかった）。上記の結果からは、本発明ではＣＤ３抗体の配列最適化により複数の新規抗体が得られ、それらがヒトＴ細胞と異なる結合能力を有し、異なる適用シナリオに使用できることが分かった。
【0055】
図８の（Ａ）及び（Ｂ）には実施例４．３で得た抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ一本鎖抗体のヒトｐａｎ－Ｔ細胞との結合能力が示され、また抗体濃度が７．４又は１０μｇ／ｍＬである時にＣＤ３抗体がヒトｐａｎ－Ｔ細胞と結合する蛍光強度ＭＦＩ及び初期抗体ＰＲ０００２６０に対する比が算出されている。具体的には、ＳＰ３４ ｓｃＦｖ抗体をヒト化による最適化した後、ＰＲ０００６２４はＰＲ０００２６０と結合能力が同等で又はわずかに高く、ＰＲ０００５１０、ＰＲ０００６２７はＰＲ０００２６０と結合能力が同等で又はわずかに低く、ＰＲ００１８５０のＴ細胞結合能力はＰＲ０００２６０より明らかに低かった。上記の結果から、本発明ではＣＤ３抗体の配列最適化によりいくつかの安定的なｓｃＦｖ形態の一本鎖抗体が得られ、それらはヒトＴ細胞と結合できるため、二重特異性抗体の構築などの適用シナリオに使用できることが分かった。
【0056】
図９は実施例４．２で得たいくつかのＣＤ３抗体のカニクイザルｐａｎ－Ｔ細胞との結合能力を示す。図示したように、分子によってカニクイザルｐａｎ－Ｔ細胞との結合能力が異なり、しかもヒトｐａｎ－Ｔ細胞との結合能力と正の相関であり、つまり、ヒトｐａｎ－Ｔ細胞と強く結合する分子はカニクイザルｐａｎ－Ｔ細胞との結合能力が高く、その逆も同様である。
【0057】
実施例６：ヒトＴ細胞に対するＣＤ３抗体の活性化効果の測定
勾配希釈したＣＤ３抗体（例えば、５０、１０、５、１、０．５、０．０５μｇ／ｍＬ）を、各濃度を３つのウェルで繰り返して９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに５０μＬで、４℃下で一晩コーティングした。ヒトＰＢＭＣ（妙通生物）又はヒトｐａｎ－Ｔ細胞（ヒトｐａｎ－Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０－０９６－５３５）を用いてＰＢＭＣから分離したもの）の細胞密度を７．５×１０５／ｍＬに調整し、ヒトＣＤ２８抗体を加えて濃度を１μｇ／ｍＬとし、さらに各ウェルに２００μＬで細胞培養プレートに加え、ＣＯ２インキュベータに置いて培養した。７２時間培養した後、上清を得、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ＃８８－７３１６－７７）を用いて上清のＩＦＮ－γ含有量を測定した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてデータ分析とグラフ作成を行った。
勾配希釈したＣＤ３抗体（例えば、５０、１０、５、１、０．５、０．０５μｇ／ｍＬ）を、各濃度を３つのウェルで繰り返して９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに５０μＬで、４℃下で一晩コーティングした。ヒトＰＢＭＣ（妙通生物）又はヒトｐａｎ－Ｔ細胞（ヒトｐａｎ－Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０－０９６－５３５）を用いてＰＢＭＣから分離したもの）の細胞密度を７．５×１０５／ｍＬに調整し、ヒトＣＤ２８抗体を加えて濃度を１μｇ／ｍＬとし、さらに各ウェルに２００μＬで細胞培養プレートに加え、ＣＯ２インキュベータに置いて培養した。７２時間培養した後、上清を得、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ＃８８－７３１６－７７）を用いて上清のＩＦＮ－γ含有量を測定した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてデータ分析とグラフ作成を行った。
【0058】
図１０の（Ａ）－（Ｇ）にはそれぞれ実施例４．２で得た各ＣＤ３抗体（ＳＰ３４キメラ抗体を含む）のヒトＴ細胞活性化能力が示される。抗体濃度が１μｇ／ｍＬである時に、ＰＲ０００５１１、ＰＲ０００５１２、ＰＲ０００５１３、ＰＲ０００５１４がＴ細胞を活性化して生成させるＩＦＮ－γのレベルはＰＲ０００２６０より明らかに低く、抗体濃度が１０μｇ／ｍＬである時に、ＰＲ０００５１２、ＰＲ０００５１３、ＰＲ０００５１４の活性化によるＩＦＮ－γレベルはＰＲ０００２６０（図１０（Ａ））よりわずかに低かった。抗体濃度が０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬである時に、ＰＲ００１８４８の活性化によるＩＦＮ－γレベルはＰＲ０００２６０（図１０（Ｂ））より明らかに低かった。さらに、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬの抗体ＰＲ００２４６８、ＰＲ００２４６９、ＰＲ００２４７１、ＰＲ００２７４２、ＰＲ００２８３３、ＰＲ００２８３４、ＰＲ００２８３５、ＰＲ００２８３６、ＰＲ００２８３７、ＰＲ００１８４８、ＰＲ００３８８６及びＰＲ００４６１６などのＴ細胞活性化効果（図１０の（Ｃ）－（Ｇ））を検出し、その結果からこれらの抗体がＴ細胞を活性化して生成させるＩＦＮ－γのレベルはＰＲ０００２６０よりはるかに低いことが分かり、ＰＲ００２４６８及びＰＲ００２４７１についてはＩＦＮ－γの放出が検出されず、ＰＲ００２４６９とＰＲ００２８３５は５０μｇ／ｍＬである時だけ、わずかなＩＦＮ－γレベルが検出され、ＰＲ００２７４２とＰＲ００３８８６は同等で、ＰＲ００１８４８よりわずかに弱く、ＰＲ００２４６９とＰＲ００４６１６は同等で、ＰＲ００１８４８より明らかに弱かった。上記の結果からは、本発明ではＣＤ３抗体の配列最適化により複数の新規抗体が得られ、それらはヒトＴ細胞の活性化能力が異なり、サイトカインの異なる放出レベルを得られるため、異なる適用シナリオに使用できることが分かった。
【0059】
図１１は実施例４．３で得た抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体のヒトＴ細胞活性化能力を示す。濃度が１μｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬのＰＲ０００５１０、ＰＲ０００６２３、ＰＲ０００６２４及びＰＲ０００６２７はいずれもＰＲ０００２６０より低くアイソタイプのコントロール抗体よりもＩＦＮ－γレベルが高いことから、当該４つの分子はＴ細胞の活性化レベルを調節することによってサイトカインの放出を制限することが示された。上記の結果からは、本発明ではＣＤ３抗体の配列最適化によりいくつかの安定的なｓｃＦｖ形態の一本鎖抗体が得られ、それらはヒトＴ細胞の活性化能力が弱く、サイトカインの放出レベルが低いため、二重特異性抗体の構築などの適用シナリオに使用できることが分かった。
【0060】
実施例７：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ抗体を含みＢ７Ｈ４を標的とする二重特異性抗体
Ｂ７Ｈ４はＢ７ファミリー膜貫通型タンパク質のメンバーで、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がんなどの様々な固形腫瘍組織に高発現されるが、正常な組織では発現されず又はわずかなだけ発現されるため、Ｂ７Ｈ４は特異性に優れた腫瘍関連標的抗原である。Ｂ７Ｈ４とＣＤ３の両方を標的とする二重特異性抗体分子を構築するのは、腫瘍細胞の表面のＢ７Ｈ４を標的にして結合することで腫瘍細胞の近くのＴ細胞を選択的に活性化して、腫瘍細胞を特異的に殺傷することができる。
Ｂ７Ｈ４はＢ７ファミリー膜貫通型タンパク質のメンバーで、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がんなどの様々な固形腫瘍組織に高発現されるが、正常な組織では発現されず又はわずかなだけ発現されるため、Ｂ７Ｈ４は特異性に優れた腫瘍関連標的抗原である。Ｂ７Ｈ４とＣＤ３の両方を標的とする二重特異性抗体分子を構築するのは、腫瘍細胞の表面のＢ７Ｈ４を標的にして結合することで腫瘍細胞の近くのＴ細胞を選択的に活性化して、腫瘍細胞を特異的に殺傷することができる。
【0061】
７．１ Ｂ７Ｈ４抗体の製造
Ｂ７Ｈ４抗体の可変領域配列はＷＯ２０１６０４０７２４に準拠し、実施例１．１の方法に従ってＢ７Ｈ４に対する組換えＩｇＧ抗体ＰＲ００００１４を構築する。表１０にはＢ７Ｈ４抗体ＰＲ００００１４の配列情報が示される。
Ｂ７Ｈ４抗体の可変領域配列はＷＯ２０１６０４０７２４に準拠し、実施例１．１の方法に従ってＢ７Ｈ４に対する組換えＩｇＧ抗体ＰＲ００００１４を構築する。表１０にはＢ７Ｈ４抗体ＰＲ００００１４の配列情報が示される。
【表10】
【0062】
７．２ 抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ抗体を含みＢ７Ｈ４を標的とする二重特異性抗体の製造
実施例７．１で得たＢ７Ｈ４抗体ＰＲ００００１４の配列と実施例４．３で得たＣＤ３一本鎖抗体ＰＲ０００６２７の配列からＢ７Ｈ４×ＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子ＰＲ００２８８３を構築し、それはＣＤ３一本鎖抗体ｓｃＦｖを含む重鎖（配列番号８８）、Ｂ７Ｈ４抗体ＶＨを含む重鎖（配列番号８６）、Ｂ７Ｈ４抗体ＶＬを含む軽鎖（配列番号８３）の３つのポリペプチド鎖を含む。その構造は図１６の（Ｃ）に示すとおりである。当該分子が特別な非対称構造を有するため、相同重鎖ダイマーの生成を減らすために、２つの重鎖の定常領域に異なるアミノ酸変異を導入している。また、Ｆｃγ受容体の結合が引き起こす架橋を防ぎエフェクター機能を低下させるために、重鎖定常領域に「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）を導入している。
実施例７．１で得たＢ７Ｈ４抗体ＰＲ００００１４の配列と実施例４．３で得たＣＤ３一本鎖抗体ＰＲ０００６２７の配列からＢ７Ｈ４×ＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子ＰＲ００２８８３を構築し、それはＣＤ３一本鎖抗体ｓｃＦｖを含む重鎖（配列番号８８）、Ｂ７Ｈ４抗体ＶＨを含む重鎖（配列番号８６）、Ｂ７Ｈ４抗体ＶＬを含む軽鎖（配列番号８３）の３つのポリペプチド鎖を含む。その構造は図１６の（Ｃ）に示すとおりである。当該分子が特別な非対称構造を有するため、相同重鎖ダイマーの生成を減らすために、２つの重鎖の定常領域に異なるアミノ酸変異を導入している。また、Ｆｃγ受容体の結合が引き起こす架橋を防ぎエフェクター機能を低下させるために、重鎖定常領域に「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）を導入している。
【0063】
実施例１．１に記載の方法にプラスミド配合（例えば、１：１：１又は他の比率）を組み合わせて、ワンステップアフィニティー精製を行って二重特異性抗体ＰＲ００２８８３の組換えタンパク質を製造する。表１１には二重特異性抗体ＰＲ００２８８３の配列表が、表１２には当該二重特異性抗体の発現状況が示される。
【表11】
【表12】
【0064】
図１２の（Ａ）は二重特異性抗体ＰＲ００２８８３のワンステップ精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す。主な副生成物は不完全に組み立てられた分子で、ポリマー成分が少ないことが分かり、精製ステップの最適化又はプラスミドのトランスフェクション比の最適化で副生成物を減らすことができる。
【0065】
７．３ Ｂ７Ｈ４を発現する腫瘍細胞との結合
本実施例では、二重特異性抗体のヒトＢ７Ｈ４を発現する腫瘍細胞ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－３０）と結合する能力を検討する。具体的には、ＳＫ－ＢＲ－３細胞懸濁液を回収し、細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８９４）に播種し、その後、１００μＬ／ウェル体積で最終濃度の２倍となる３倍濃度勾配希釈した被検抗体を加えた。４℃下で静置して暗所で２時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回リンスし、５００ｇと４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－５４５－０９８）を加えて、４℃下で暗所で１時間インキュベートした。さらに１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離して上清を捨てた。最後に、２００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を再懸濁させた。フローサイトメータ（ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩ又はＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を使用して蛍光発光シグナル値を読み取り、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）でデータを処理及び分析した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を用いてデータ処理とグラフ作成分析を行って、４パラメーターの非線形フィッティングによって、結合曲線、ＥＣ５０などのパラメーターを得た。
本実施例では、二重特異性抗体のヒトＢ７Ｈ４を発現する腫瘍細胞ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－３０）と結合する能力を検討する。具体的には、ＳＫ－ＢＲ－３細胞懸濁液を回収し、細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８９４）に播種し、その後、１００μＬ／ウェル体積で最終濃度の２倍となる３倍濃度勾配希釈した被検抗体を加えた。４℃下で静置して暗所で２時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回リンスし、５００ｇと４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－５４５－０９８）を加えて、４℃下で暗所で１時間インキュベートした。さらに１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離して上清を捨てた。最後に、２００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を再懸濁させた。フローサイトメータ（ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩ又はＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を使用して蛍光発光シグナル値を読み取り、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）でデータを処理及び分析した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を用いてデータ処理とグラフ作成分析を行って、４パラメーターの非線形フィッティングによって、結合曲線、ＥＣ５０などのパラメーターを得た。
【0066】
図１３の（Ａ）は実施例７．１で得たモノクローナル抗体及び実施例７．２で得た二重特異性抗体のＳＫ－ＢＲ－３細胞との結合能力を示す。二重特異性抗体ＰＲ００２８８３はモノクローナル抗体ＰＲ００００１４と同等な又はそれ以上の結合能力を有することが分かった。
【0067】
７．４ ヒトＴ細胞との結合
実施例５に記載の方法で二重特異性抗体ＰＲ００２８８３のヒトｐａｎ－Ｔ細胞との結合能力を検出する。図１３の（Ｂ）に示すように、ＰＲ００２８８３はヒトｐａｎ－Ｔ細胞と結合できる。
実施例５に記載の方法で二重特異性抗体ＰＲ００２８８３のヒトｐａｎ－Ｔ細胞との結合能力を検出する。図１３の（Ｂ）に示すように、ＰＲ００２８８３はヒトｐａｎ－Ｔ細胞と結合できる。
【0068】
７．５ Ｂ７Ｈ４を高発現する細胞株ＳＫ－ＢＲ－３に対する二重特異性抗体のインビトロ殺傷及びサイトカインの放出
Ｂ７Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体がインビトロで媒介する標的細胞殺傷能力を研究するために、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用し、Ｂ７Ｈ４を高発現する細胞株ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－３０）を標的細胞としてインビトロ殺傷実験を行いサイトカインの放出を検出した。具体的には、Ｅプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．＃０５２３２３６８００１）の各ウェルに５０μＬのＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地を加えて、３７℃と５％ＣＯ２インキュベータに静置して３０分間平衡化し、次に、Ｅプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）を装置ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に入れて正常かどうかを確認する。ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地でＳＫ－ＢＲ－３の密度を０．４×１０６細胞／ｍＬに調整し、５０μＬ細胞／ウェルでＥプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）に播種し、次に、Ｅプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡにかけて一晩でセルインデックス（ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘ）を検出した。ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地でＰＢＭＣの密度を４×１０６細胞／ｍＬに調整して、５０μＬ細胞／ウェルでＥプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）に播種し、その後、最終濃度の４倍となる５倍濃度勾配希釈した被検抗体を５０μＬ／ウェルで加え、抗体の最高最終濃度は０．２ｎＭで、各抗体は合計で７つの濃度とし、エフェクター細胞と標的細胞の最終的な比率は１０：１であり、２回繰り返す。さらに、プレートにはブランクコントロールとして、ＳＫＢＲ３＋ＰＢＭＣ＋ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地を設置し、Ｅプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）を３７℃と５％ＣＯ２のインキュベータに置いて２４時間インキュベートした。インキュベートが完了した後、Ｅプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）を装置ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡに入れてセルインデックスを検出した。
Ｂ７Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体がインビトロで媒介する標的細胞殺傷能力を研究するために、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用し、Ｂ７Ｈ４を高発現する細胞株ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－３０）を標的細胞としてインビトロ殺傷実験を行いサイトカインの放出を検出した。具体的には、Ｅプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．＃０５２３２３６８００１）の各ウェルに５０μＬのＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地を加えて、３７℃と５％ＣＯ２インキュベータに静置して３０分間平衡化し、次に、Ｅプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）を装置ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に入れて正常かどうかを確認する。ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地でＳＫ－ＢＲ－３の密度を０．４×１０６細胞／ｍＬに調整し、５０μＬ細胞／ウェルでＥプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）に播種し、次に、Ｅプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡにかけて一晩でセルインデックス（ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘ）を検出した。ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地でＰＢＭＣの密度を４×１０６細胞／ｍＬに調整して、５０μＬ細胞／ウェルでＥプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）に播種し、その後、最終濃度の４倍となる５倍濃度勾配希釈した被検抗体を５０μＬ／ウェルで加え、抗体の最高最終濃度は０．２ｎＭで、各抗体は合計で７つの濃度とし、エフェクター細胞と標的細胞の最終的な比率は１０：１であり、２回繰り返す。さらに、プレートにはブランクコントロールとして、ＳＫＢＲ３＋ＰＢＭＣ＋ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地を設置し、Ｅプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）を３７℃と５％ＣＯ２のインキュベータに置いて２４時間インキュベートした。インキュベートが完了した後、Ｅプレート（Ｅ－ｐｌａｔｅ）を装置ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡに入れてセルインデックスを検出した。
【0069】
検出したセルインデックスから次の算式で細胞に対する抗体の特異性殺傷を計算する。
細胞殺傷％＝（１－検出サンプル／ブランクコントロール）×１００％。
細胞殺傷％＝（１－検出サンプル／ブランクコントロール）×１００％。
【0070】
サイトカインＩＦＮ－γの放出を検出するために、細胞培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡ検出方法はＩＦＮ－γキット（ＩＦＮ ｇａｍｍａ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ＃８８－７３１６－７７）の説明を参照する。
【0071】
図１４の（Ａ）と（Ｂ）に示すように、二重特異性抗体ＰＲ００２８８３はＴ細胞を活性化してサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）を放出させ、腫瘍細胞ＳＫ－ＢＲ－３を効果的に殺傷することができる。二重特異性抗体の濃度が０．０１μｇ／ｍＬである時に、ほぼ１００％の腫瘍細胞が殺される（図１４（Ａ））。
【0072】
実施例８：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ抗体を含みＲＯＲ１を標的とする二重特異性抗体
ＲＯＲ１は不活性なチロシンプロテインキナーゼ膜貫通型タンパク質で、多くの腫瘍で過剰発現されるが、正常な組織ではほぼ発現されない。ＲＯＲ１が受容体としてＷｎｔ５ａと相互作用すると、Ｗｎｔシグナル伝達経路を伝達することで、慢性リンパ性白血病では細胞の増殖と遊走に寄与し、固形腫瘍では上皮間葉転換（ＥＭＴ）に寄与する。ＲＯＲ１はその腫瘍特異的発現により治療薬の開発に適する腫瘍関連抗原標的となる。ＲＯＲ１とＣＤ３の両方を標的とする二重特異性抗体分子を構築するのは、腫瘍細胞の表面のＲＯＲ１を標的にして結合することで腫瘍細胞の近くのＴ細胞を選択的に活性化して、腫瘍細胞を特異的に殺傷することができる。
ＲＯＲ１は不活性なチロシンプロテインキナーゼ膜貫通型タンパク質で、多くの腫瘍で過剰発現されるが、正常な組織ではほぼ発現されない。ＲＯＲ１が受容体としてＷｎｔ５ａと相互作用すると、Ｗｎｔシグナル伝達経路を伝達することで、慢性リンパ性白血病では細胞の増殖と遊走に寄与し、固形腫瘍では上皮間葉転換（ＥＭＴ）に寄与する。ＲＯＲ１はその腫瘍特異的発現により治療薬の開発に適する腫瘍関連抗原標的となる。ＲＯＲ１とＣＤ３の両方を標的とする二重特異性抗体分子を構築するのは、腫瘍細胞の表面のＲＯＲ１を標的にして結合することで腫瘍細胞の近くのＴ細胞を選択的に活性化して、腫瘍細胞を特異的に殺傷することができる。
【0073】
８．１ ＲＯＲ１抗体の製造
ＲＯＲ１抗体の可変領域配列はＷＯ２０１６０９４８７３に準拠し、実施例１．１の方法に従ってＲＯＲ１に対する組換えＩｇＧ抗体ＰＲ０００３７４を構築する。表１３にはＲＯＲ１抗体ＰＲ０００３７４の配列表が示される。
ＲＯＲ１抗体の可変領域配列はＷＯ２０１６０９４８７３に準拠し、実施例１．１の方法に従ってＲＯＲ１に対する組換えＩｇＧ抗体ＰＲ０００３７４を構築する。表１３にはＲＯＲ１抗体ＰＲ０００３７４の配列表が示される。
【表13】
【0074】
８．２ 抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ抗体を含みＲＯＲ１を標的とする二重特異性抗体の製造
実施例８．１で得たＲＯＲ１抗体ＰＲ０００３７４の配列と実施例４．３で得たＣＤ３一本鎖抗体ＰＲ０００６２７の配列からＲＯＲ１×ＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子ＰＲ００２８８５を構築し、それはＣＤ３一本鎖抗体ｓｃＦｖを含む重鎖（配列番号８８）、ＲＯＲ１抗体ＶＨを含む重鎖（配列番号８７）、ＲＯＲ１抗体ＶＬを含む軽鎖（配列番号８５）の３つのポリペプチド鎖を含む。その構造は図１６の（Ｃ）に示すとおりである。当該分子が特別な非対称構造を有するため、相同重鎖ダイマーの生成を減らすために、２つの重鎖の定常領域に異なるアミノ酸変異を導入している。また、Ｆｃγ受容体の結合が引き起こす架橋を防ぎエフェクター機能を低下させるために、重鎖定常領域に「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）を導入している。
実施例８．１で得たＲＯＲ１抗体ＰＲ０００３７４の配列と実施例４．３で得たＣＤ３一本鎖抗体ＰＲ０００６２７の配列からＲＯＲ１×ＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子ＰＲ００２８８５を構築し、それはＣＤ３一本鎖抗体ｓｃＦｖを含む重鎖（配列番号８８）、ＲＯＲ１抗体ＶＨを含む重鎖（配列番号８７）、ＲＯＲ１抗体ＶＬを含む軽鎖（配列番号８５）の３つのポリペプチド鎖を含む。その構造は図１６の（Ｃ）に示すとおりである。当該分子が特別な非対称構造を有するため、相同重鎖ダイマーの生成を減らすために、２つの重鎖の定常領域に異なるアミノ酸変異を導入している。また、Ｆｃγ受容体の結合が引き起こす架橋を防ぎエフェクター機能を低下させるために、重鎖定常領域に「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）を導入している。
【0075】
実施例１．１に記載の方法にプラスミド配合（例えば、１：１：１又は他の比率）を組み合わせて、ワンステップアフィニティー精製を行って二重特異性抗体ＰＲ００２８８５の組換えタンパク質を製造する。表１４には二重特異性抗体ＰＲ００２８８５の配列情報が、表１５には当該二重特異性抗体の発現状況が示される。
【表14】
【表15】
【0076】
図１２の（Ｂ）は二重特異性抗体ＰＲ００２８８５のワンステップ精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す。主な副生成物は不完全に組み立てられた分子で、ポリマー成分が少ないことが分かり、精製ステップの最適化又はプラスミドのトランスフェクション比の最適化で副生成物を減らすことができる。
【0077】
８．３ ＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞との結合
本実施例では、二重特異性抗体のヒトＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞Ｐａｎｃ－１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１４６９）と結合する能力を検討する。具体的には、Ｐａｎｃ－１細胞懸濁液を回収し、細胞密度をそれぞれ１×１０６／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８９４）に播種し、その後、１００μＬ／ウェル体積で最終濃度の２倍となる３倍濃度勾配希釈した被検抗体を加えた。４℃下で静置して暗所で２時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回リンスし、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－５４５－０９８）を加えて、４℃下で暗所で１時間インキュベートした。さらに１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、２００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を再懸濁させた。フローサイトメータ（ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩ又はＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を使用して蛍光発光シグナル値を読み取り、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）でデータを処理及び分析した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を用いてデータ処理とグラフ作成分析を行って、４パラメーターの非線形フィッティングによって、結合曲線、ＥＣ５０などのパラメーターを得た。
本実施例では、二重特異性抗体のヒトＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞Ｐａｎｃ－１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１４６９）と結合する能力を検討する。具体的には、Ｐａｎｃ－１細胞懸濁液を回収し、細胞密度をそれぞれ１×１０６／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８９４）に播種し、その後、１００μＬ／ウェル体積で最終濃度の２倍となる３倍濃度勾配希釈した被検抗体を加えた。４℃下で静置して暗所で２時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回リンスし、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－５４５－０９８）を加えて、４℃下で暗所で１時間インキュベートした。さらに１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、２００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を再懸濁させた。フローサイトメータ（ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩ又はＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を使用して蛍光発光シグナル値を読み取り、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）でデータを処理及び分析した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を用いてデータ処理とグラフ作成分析を行って、４パラメーターの非線形フィッティングによって、結合曲線、ＥＣ５０などのパラメーターを得た。
【0078】
図１５の（Ａ）は実施例８．１で得たモノクローナル抗体及び実施例８．２で得た二重特異性抗体のＰａｎｃ－１細胞との結合能力を示す。二重特異性抗体ＰＲ００２８８５とモノクローナル抗体ＰＲ０００３７４はいずれもＰａｎｃ－１と結合できる。
【0079】
８．４ ヒトＴ細胞との結合
実施例５に記載の方法で二重特異性抗体ＰＲ００２８８５のヒトｐａｎ－Ｔ細胞との結合能力を検出する。図１５の（Ｂ）に示すように、ＰＲ００２８８５はヒトｐａｎ－Ｔ細胞と結合できる。
実施例５に記載の方法で二重特異性抗体ＰＲ００２８８５のヒトｐａｎ－Ｔ細胞との結合能力を検出する。図１５の（Ｂ）に示すように、ＰＲ００２８８５はヒトｐａｎ－Ｔ細胞と結合できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含むＣＤ３を標的とする抗体であって、
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５０に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４８に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４９に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５９に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４６に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであることを特徴とする、ＣＤ３を標的とする抗体。
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５０に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４８に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４９に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５３に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４４に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５９に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５５に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、又は
前記ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４６に示すとおりであり、前記ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであることを特徴とする、ＣＤ３を標的とする抗体。
【請求項2】
前記抗体が、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、前記ｓｃＦｖのアミノ酸配列が、配列番号７３又は配列番号７８に示すとおりであることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体が、ヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）によって前記ｓｃＦｖに接続されるＦｃを含むことを特徴とする、請求項２に記載の抗体。
【請求項4】
前記抗体が、ヒト定常領域をさらに含み、
前記ヒト定常領域が、ヒト軽鎖定常領域とヒト重鎖定常領域とを含み、
前記ヒト重鎖定常領域が、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４又はその変異であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
前記ヒト定常領域が、ヒト軽鎖定常領域とヒト重鎖定常領域とを含み、
前記ヒト重鎖定常領域が、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４又はその変異であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項5】
前記ヒト重鎖定常領域が、配列番号６３又は配列番号６４に示す重鎖定常領域であり、前記ヒト軽鎖定常領域が、配列番号６１に示すヒトκ軽鎖定常領域又は配列番号６２に示すヒトλ軽鎖定常領域であることを特徴とする、請求項４に記載の抗体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＤ３を標的とする抗体を含む第１タンパク質ドメインと、第２タンパク質ドメインとを含む二重特異性抗体。
【請求項7】
前記二重特異性抗体が、（１）前記第１タンパク質ドメインのＶＬ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）又はＶＨ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）と、（２）前記第２タンパク質ドメインのＶＨ２－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｈｏｌｅ）と、（３）前記第２タンパク質ドメインのＶＬ２－ＣＬの３つの鎖を含み、前記第２タンパク質ドメインが、ＣＤ３以外を標的とする抗体であることを特徴とする、請求項６に記載の二重特異性抗体。
【請求項8】
前記第２タンパク質ドメインが、Ｂ７Ｈ４を標的とする抗体又はＲＯＲ１を標的とする抗体であり、前記Ｌｉｎｋｅｒが、（Ｇ
４
Ｓ）
ｎ
であり、ｎが、１～２０であることを特徴とする、請求項７に記載の二重特異性抗体。
【請求項9】
前記Ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列が、配列番号６５、配列番号６６又は配列番号６７に示すとおりであることを特徴とする、請求項７又は８に記載の二重特異性抗体。
【請求項10】
前記二重特異性抗体が、配列番号８８に示すＶＬ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）と、配列番号８６に示すＶＨ２－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｈｏｌｅ）と、配列番号８３に示すＶＬ２－ＣＬと、又は、配列番号８８に示すＶＬ１－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｋｎｏｂ）と、配列番号８７に示すＶＨ２－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｈｏｌｅ）と、配列番号８５に示すＶＬ２－ＣＬとを含むことを特徴とする、請求項９に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＤ３を標的とする抗体又は請求項６～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする、分離された核酸。
【請求項12】
請求項１１に記載の分離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項13】
請求項１２に記載の発現ベクターがトランスフェクトされた遺伝子修飾細胞。
【請求項14】
請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＤ３を標的とする抗体、請求項６～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１３に記載の遺伝子修飾細胞、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項15】
腫瘍を治療する薬物を製造するための、請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＤ３を標的とする抗体、請求項６～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１１に記載の分離された核酸、請求項１２に記載の発現ベクター、請求項１３に記載の遺伝子修飾細胞、又は請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【外国語明細書】